ES2531551T3 - Métodos para construir bibliotecas de presentación de paquetes genéticos para miembros de una familia diversa de péptido - Google Patents
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Abstract
Un método para obtener una biblioteca que presenta una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas en la superficie de un paquete genético, comprendiendo el método las etapas de: (i) escindir un ácido nucleico en una localización deseada mediante un método que comprende las etapas de: (a) poner en contacto un ácido nucleico monocatenario con un oligonucleótido monocatenario, siendo el oligonucleótido monocatenario complementario del ácido nucleico monocatenario en la región en la que se desea la escisión; en el que el ácido nucleico monocatenario y el oligonucleótido monocatenario se asocian para formar una región localmente bicatenaria del ácido nucleico monocatenario, en el que la región localmente bicatenaria comprende un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción; y (b) escindir el ácido nucleico en el sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción, en el que la escisión comprende poner en contacto una endonucleasa de restricción con la región localmente bicatenaria, en el que la endonucleasa de restricción es específica del sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción; realizándose las etapas de puesta en contacto y escisión a una temperatura entre 45ºC y 75ºC, en la que el ácido nucleico monocatenario y el oligonucleótido monocatenario se asocian para formar una región localmente bicatenaria del ácido nucleico monocatenario, en la que el resto del ácido nucleico monocatenario es monocatenario, y en la que la endonucleasa de restricción está activa a la temperatura; y (ii) presentar un miembro de la familia de péptidos, polipéptidos o proteínas codificada por el ácido nucleico escindido en la superficie de un paquete genético y presentar colectivamente al menos una porción de la diversidad de la familia.
Description
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Otro ejemplo de selección de un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción apropiado implica escisión en FR1 de la cadena ligera lambda humana. La Tabla 400 muestra las 31 secuencias de genes de línea germinal de FR1 lambda humana conocidas. La Tabla 405 muestra sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción hallados en genes de la línea germinal de FR1 lambda humana. HinfI y DdeI son las endonucleasas de restricción más preferidas para cortar cadenas lambda humanas en FR1.
Después de que se seleccione el sitio o los sitios apropiados para escisión, se preparan uno o más oligonucleótidos cortos para complementar funcionalmente, solos o en combinación, el sitio de reconocimiento seleccionado. Los oligonucleótidos también incluyen secuencias que flanquean el sitio de reconocimiento en la mayoría de los genes amplificados. Esta región flanqueante permite que la secuencia se hibride con el ADN monocatenario suficientemente para permitir la escisión por la endonucleasa de restricción específica del sitio escogido.
La longitud y secuencia reales del oligonucleótido depende del sitio de reconocimiento y las condiciones que se usen para la puesta en contacto y la escisión. La longitud debe ser suficiente para que el oligonucleótido sea funcionalmente complementario del ADN monocatenario a lo largo de una región suficientemente grande para permitir que las dos hebras se asocien, de modo que se produzca escisión a la temperatura escogida y solamente en la localización deseada.
Típicamente, los oligonucleótidos de este método preferido de la invención tienen alrededor de 17 a alrededor de 30 nucleótidos de longitud. Por debajo de alrededor de 17 bases, la hibridación es demasiado débil, y por encima de 30 bases puede haber una pérdida de especificidad. Una longitud preferida es 18 a 24 bases.
Los oligonucleótidos de esta longitud no necesitan ser complementos idénticos de los genes de línea germinal. En su lugar, pueden tolerarse unos pocos emparejamientos erróneos tomados. Preferiblemente, sin embargo, no se permiten más de 1-3 emparejamientos erróneos. Algunos emparejamientos erróneos no afectan de forma adversa a la hibridación del oligonucleótido con el ADN monocatenario. Por lo tanto, se dice que los dos ADN son funcionalmente complementarios.
El segundo método para manipular los ADN monocatenarios amplificados de esta invención para clonación comprende las etapas de:
- (i)
- poner en contacto el ácido nucleico monocatenario con un oligonucleótido parcialmente bicatenario, siendo la región monocatenaria del oligonucleótido complementaria del ácido nucleico monocatenario en la región en la que se desea escisión, y teniendo la región bicatenaria del oligonucleótido un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción Tipo II-S, cuyo sitio de escisión se localiza a una distancia conocida del sitio de reconocimiento; y
- (ii)
- escindir el ácido nucleico solamente en el sitio de escisión formado por la complementación del ácido nucleico y la región monocatenaria del oligonucleótido;
realizándose las etapas de puesta en contacto y escisión a una temperatura suficiente para mantener el ácido nucleico en forma sustancialmente monocatenaria, siendo el oligonucleótido funcionalmente complementario del ácido nucleico a lo largo de una región suficientemente grande para permitir que las dos hebras se asocien de modo que pueda producirse escisión a la temperatura escogida y en la localización deseada, y llevándose a cabo la escisión usando una endonucleasa de restricción que es activa a la temperatura seleccionada.
Este segundo método emplea endonucleasas de restricción universales (“ERU”). Las ERU son oligonucleótidos parcialmente bicatenarios. La porción monocatenaria o solapamiento de las ERU consiste en un adaptador de ADN que es funcionalmente complementario de la secuencia a escindir en el ADN monocatenario. La porción bicatenaria consiste en un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de tipo II-S.
El método de ERU de esta invención es específico y preciso, y puede tolerar algunos (por ejemplo, 1-3) emparejamientos erróneos en las regiones complementarias, es decir, es funcionalmente complementario de esa región. Además, las condiciones en las que se usa la ERU pueden ajustarse, de modo que la mayoría de los genes que se amplifiquen puedan cortarse, reduciendo la preferencia en la biblioteca producida a partir de esos genes.
La secuencia del adaptador de ADN monocatenario o porción solapante de la ERU típicamente consiste en alrededor de 14-22 bases. Sin embargo, pueden usarse adaptadores más largos o más cortos. El tamaño depende de la capacidad del adaptador para asociarse con su complemento funcional en el ADN monocatenario y la temperatura usada para poner en contacto la ERU y el ADN monocatenario a la temperatura usada para escindir el ADN con la enzima de tipo II-S. El adaptador debe ser funcionalmente complementario del ADN monocatenario a lo largo de una región suficientemente grande para permitir que las dos hebras se asocien de modo que pueda producirse escisión a la temperatura seleccionada y en la localización deseada. Se prefieren porciones monocatenarias o solapantes de 14-17 bases de longitud, y más preferiblemente 18-20 bases de longitud.
El sitio seleccionado para escisión usando la ERU es preferiblemente uno que se conserva sustancialmente en la familia de ADN amplificados. En comparación con el primer método de escisión de esta invención, estos sitios no necesitan ser sitios de reconocimiento de endonucleasa. Sin embargo, al igual que el primer método, los sitios
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La porción monocatenaria del adaptador es complementaria de la región de la escisión en el ADN monocatenario. El solapamiento puede ser de alrededor de 2 bases a alrededor de 15 bases. Cuanto más largo sea el solapamiento, más eficaz será probablemente la ligación. Una longitud preferida para el solapamiento es 7 a 10. Esto permite algunos emparejamientos erróneos en la región, de modo que pueda capturarse diversidad en esta región.
La región monocatenaria o solapamiento del adaptador parcialmente bicatenario es ventajosa debido a que permite que se capture ADN escindido en el sitio seleccionado, pero no otros fragmentos. Tales fragmentos contaminarían la biblioteca con genes que codifican secuencias que no se plegarán en anticuerpos apropiados y probablemente son adhesivos de forma no específica.
Una ilustración del uso de un adaptador parcialmente bicatenario en los métodos de esta invención implica ligar dicho adaptador con una región FR3 humana que se ha escindido, como se ha descrito anteriormente, a 5’-ACnGT3’ usando HpyCH4lll, Bst4CI o Taal.
La Tabla 250 F.2 muestra la hebra inferior de la porción bicatenaria del adaptador para ligación con el ADN de hebra inferior escindido. Puesto que el sitio de HpyCH4lll está tan lejos a la derecha (como se muestra en la Tabla 206), puede añadirse una secuencia que incluya el sitio AflII así como el XbaI. Esta porción de hebra inferior del adaptador parcialmente bicatenario, H43.XAExt, incorpora sitios tanto XbaI como AflII. La hebra superior de la porción bicatenaria del adaptador no tiene sitio (debido a emparejamientos erróneos planeados en los segmentos opuestos a los sitios XbaIy AflII de H43.XAExt), pero se hibridará de forma muy estrecha con H43.XAExt. H43AExt contiene solamente el sitio AflII y se va a usar con las hebras superiores H43.ABr1 y H43.ABr2 (que tienen alteraciones intencionadas para destruir el sitio AflII).
Después de la ligación, el ADN capturado deseado puede amplificarse de nuevo por PCR, si se desea, usando en la realización preferida un cebador para la región constante en dirección 3’ del gen de anticuerpo, y un cebador para parte de la región bicatenaria del adaptador. Los cebadores también pueden portar sitios de endonucleasas de restricción para su uso en la clonación del ADN amplificado.
Después de ligación, y quizás de la amplificación, del adaptador parcialmente bicatenario con el ADN amplificado monocatenario, el ADN compuesto se escinde en sitios de reconocimiento de endonucleasas 5’ y 3’ seleccionados.
Los sitios de escisión útiles para la clonación dependen del fago o fagómido en el que el casete se insertará, y los sitios disponibles en los genes de anticuerpo. La Tabla 1 proporciona datos de endonucleasas de restricción para 75 cadenas ligeras humanas. La Tabla 2 muestra datos correspondientes para 79 cadenas pesadas humanas. En cada Tabla, las endonucleasas se ordenan por frecuencia creciente de corte. En estas Tablas, Nch es el número de cadenas cortadas por la enzima, y Ns es el número de sitios (algunas cadenas tienen más de un sitio).
A partir de este análisis, son muy adecuados Sfll, NotI, AflII, ApaLI, y Ascl. Sfil y NotI se usan preferiblemente en pCES1 para insertar el segmento de presentación de cadena pesada. ApaLI, y Ascl se usan preferiblemente en pCES1 para insertar el segmento de presentación de cadena ligera.
Aparecen sitios BstEII en 97% de genes JH de línea germinal. En genes V reordenados, solo 54/79 (68%) de los genes de cadena pesada contienen un sitio BstEII, y 7/61 de éstos contienen dos sitios. De este modo, 47/79 (59%) contienen un único sitio BstEII. Una alternativa al uso de BstEII es escindir mediante ERU el final de JH y ligarlo a un oligonucleótido sintético que codifica parte de CH1.
Un ejemplo de preparación de una familia de secuencias de ADN usando los métodos de esta invención implica capturar diversidad de CDR 3 humana. Como se ha descrito anteriormente, los ARNm de diversos pacientes autoinmunes se transcriben de forma inversa en ADNc de hebra inferior. Después de que se degrada el ARN de hebra superior, la hebra inferior se inmoviliza y se usa un oligonucleótido corto para escindir el ADNc en dirección 5’ de CDR 3. Después se hibrida un adaptador de ADN sintético parcialmente bicatenario con el ADN, y el ADN se amplifica usando un cebador para el adaptador y un cebador para la región constante (después de FR4). El ADN se escinde después usando BstEII (en FR4) y una endonucleasa de restricción apropiada para el adaptador parcialmente bicatenario (por ejemplo Xba I y Aflll (en FR3)). El ADN se liga después en un esqueleto de VH sintético tal como 3-23.
Un ejemplo de preparación de un ADN monocatenario que se escindió usando el método de ERU implica la cadena kappa humana. El sitio de escisión en la hebra sentido de esta cadena se representa en la Tabla 512. El oligonucleótido kapextURE se hibrida con los oligonucleótidos (kaBR01UR, kaBR02UR, kaBR03UR y kaBR04UR) para formar un ADN parcialmente bicatenario. Este ADN se liga después con las cadenas kappa solubles escindidas. El producto de ligación se amplifica después usando cebadores kapextUREPCR y CKForeAsc (que inserta un sitio AscI después del extremo de C kappa). Este producto se escinde después con ApaLI y Ascl y se liga con vector receptor cortado de forma similar.
Otro ejemplo implica la escisión ilustrada en la Tabla 515. Después de la escisión, se hibridan un alargador (ON_LamEx133) y cuatro oligonucleótidos puente (ON_LamB1-133, ON_LamB2-133, ON_LamB3-133 y ON_LamB4-133) para formar un ADN parcialmente bicatenario. Ese ADN se liga con las hebras sentido de cadena
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El producto de PCR soluble se procesó en un gel y mostró una banda de aproximadamente 700 n, como se esperaba (FIGURAS 5 y 6). El ADN se escindió con enzimas ApaLI y AscI, se purificó en gel y se ligó con vector pCES1 escindido de forma similar. La presencia del inserto de tamaño correcto se comprobó mediante PCR en varios clones como se muestra en la FIGURA 15.
La Tabla 500 muestra la secuencia de ADN de una cadena ligera kappa capturada por este procedimiento. La Tabla 501 muestra una segunda secuencia capturada por este procedimiento. La secuencia puente más cercana fue complementaria de la secuencia 5’-agccacc-3’, pero la secuencia capturada es 5’-Tgccacc-3’, lo que muestra que se tolera cierto emparejamiento erróneo en la región solapada.
Ejemplo 2: Construcción de Diversidad de CDR1 y CDR2 sintética en armazón V-3-23 VH
Se construyó una diversidad de Región Determinante de Complementariedad (CDR) 1 y 2 sintética en el armazón VH 3-23 en un procedimiento de dos etapas: en primer lugar, se construyó un vector que contenía el armazón VH 323, y después, se ensambló una CDR 1 y 2 sintética y se clonó en este vector.
Para la construcción del armazón V3-23, se diseñaron 8 oligonucleótidos y dos cebadores de PCR (oligonucleótidos largos: TOPFR1A, BOTFR1B, BOTFR2, BOTFR3, F06, BOTFR4, ON-vgC1, y ON-vgC2 y cebadores: SFPRMET y BOTPCRPRIM, mostrados en la Tabla 600) que solapan, basándose en la secuencia de Genebank de VH V323. El diseño incorporó al menos un sitio de restricción útil en cada región del armazón, como se muestra en la Tabla 600. En la Tabla 600, los segmentos que se sintetizaron se muestran en negrita, las regiones solapantes están subrayadas, y las regiones de cebado de PCR en cada extremo están subrayadas. Se combinó una mezcla de estos 8 oligonucleótidos a una concentración final de 2,5 uM en una Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) de 20 ul. La mezcla de PCR contenía dNTP 200 uM, MgCI2 2,5 mM, ADN Polimerasa Pfu Turbo™ 0,02 U, ADN Polimerasa Taq HotStart Qiagen 1U y tampón de PCR Qiagen 1X. El programa de PCR consistía en 10 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 30 segundos. La secuencia de ADN ensamblada V3-23 se amplificó después, usando 2,5 ul de una dilución 10 veces de la PCR inicial en reacción de PCR de 100 ul. La reacción de PCR contenía dNTP 200 uM, MgCI2 2,5 mM, ADN Polimerasa Pfu Turbo™ 0,02 U, ADN Polimerasa Taq HotStart Qiagen 1U, tampón de PCR Qiagen 1X, y 2 cebadores externos (SFPRMET y BOTPCRPRIM) a una concentración de 1 uM. El programa de PCR consistió en 23 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 60 segundos. La secuencia de ADN de VH V3-23 se digirió y se clonó en pCESI (vector fagómido) usando los sitios de endonucleasas de restricción Sfil y BstEII (Todas las enzimas de restricción mencionadas en la presente memoria fueron proporcionadas por New England BioLabs, Beverly, MA, y se usaron según las instrucciones del fabricante).
Se introdujeron secuencias de relleno (mostradas en la Tabla 610 y Tabla 620) en pCES1 para reemplazar secuencias de CDR1/CDR2 (900 bases entre sitios de ER BspEI y XbaI) y secuencias de CDR3 (358 bases entre AflII y BstEII), antes de clonar la diversidad de CDR1/CDR2. El nuevo vector es pCES5, y su secuencia se da en la Tabla 620. Tener rellenos en lugar de las CDRs evita el riesgo de que una secuencia parental esté sobrerrepresentada en la biblioteca. El relleno de CDR1-2 contiene sitios de restricción para BglII, Bsu36I, BclI, XcmI, MluI, PvuII, HpaI, y HincII, siendo los sitios subrayados únicos dentro del vector pCES5. El relleno que reemplaza CDR3 contiene el sitio de endonucleasa de restricción único RsrII. Las secuencias de relleno son fragmentos del gen de penicilasa de E. coli.
Para la construcción de la diversidad de CDR1 y CDR2, se diseñaron 4 oligonucleótidos solapantes (ON-vgC1, ON_Br12, ON_CD2Xba y ON-vgC2, mostrados en la Tabla 600 y Tabla 630) que codifican CDR1/2, más regiones flanqueantes. Se combinó una mezcla de esos 4 oligonucleótidos a una concentración final de 2,5 uM en una reacción de PCR de 40 ul. Dos de los 4 oligonucleótidos contenían secuencias variegadas posicionadas en la CDR1 y la CDR2. La mezcla de PCR contenía dNTP 200 uM, ADN Polimerasa Pwo 2,5 U (Roche) y tampón de PCR Pwo 1X con MgSO4 2 mM. El programa de PCR consistió en 10 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 60 segundos. Esta secuencia de ADN de CDR1/2 ensamblada se amplificó, usando 2,5 ul de la mezcla en reacción de PCR de 100 ul. La reacción de PCR contenía dNTP 200 uM, ADN Polimerasa Pwo 2,5 U, tampón de PCR Pwo 1X con MgSO4 2 mM, y 2 cebadores externos a una concentración de 1 uM. El programa de PCR consistía en 10 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 60 segundos. Estas secuencias variegadas se digirieron y clonaron en el armazón de V3-23 en lugar del relleno de CDR1/2.
Se obtuvieron aproximadamente 7 X 107 transformantes independientes. En esta diversidad, se pueden clonar diversidad de CDR3 a partir de poblaciones donantes o de ADN sintético.
Además, la presente solicitud describe los siguientes apartados:
1. Un método para escindir secuencias de ácido nucleico monocatenarias en una localización deseada, comprendiendo el método las etapas de:
(i) poner en contacto el ácido nucleico con un oligonucleótido monocatenario, siendo el oligonucleótido monocatenario funcionalmente complementario del ácido nucleico en la región en la que se desea la escisión, e incluyendo una secuencia que con su complemento en el ácido nucleico forma un sitio de reconocimiento
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(ii) escindir el ácido nucleico solamente en el sitio de reconocimiento formado por la complementación del ácido nucleico y el oligonucleótido;
realizándose las etapas de puesta en contacto y escisión a una temperatura suficiente para mantener el ácido nucleico en forma sustancialmente monocatenaria, siendo el oligonucleótido funcionalmente complementario del ácido nucleico a lo largo de una región suficientemente grande para permitir que las dos hebras se asocien de modo que pueda producirse la escisión a la temperatura escogida y en la localización deseada, y llevándose a cabo la escisión usando una endonucleasa de restricción que está activa a la temperatura escogida.
2. Un método para escindir secuencias de ácido nucleico monocatenarias en una localización deseada, comprendiendo el método las etapas de:
- (i)
- poner en contacto el ácido nucleico con un oligonucleótido parcialmente bicatenario, siendo la región monocatenaria del oligonucleótido funcionalmente complementaria del ácido nucleico en la región en la que se desea la escisión, y teniendo la región bicatenaria del oligonucleótido un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de Tipo II-S, cuyo sitio de escisión se localiza a una distancia conocida del sitio de reconocimiento; y
- (ii)
- escindir el ácido nucleico solamente en el sitio de escisión de Tipo II-S formado por la complementación del ácido nucleico y la región monocatenaria del oligonucleótido;
realizándose las etapas de puesta en contacto y escisión a una temperatura suficiente para mantener el ácido nucleico en forma sustancialmente monocatenaria, siendo el oligonucleótido funcionalmente complementario del ácido nucleico a lo largo de una región suficientemente grande para permitir que las dos hebras se asocien de modo que pueda producirse la escisión a la temperatura escogida y en la localización deseada, y llevándose a cabo la escisión usando una endonucleasa de restricción que está activa a la temperatura escogida.
3. En un método para presentar un miembro de una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas en la superficie de un paquete genético y presentar colectivamente al menos una parte de la diversidad de la familia, caracterizándose la mejora porque la al menos una parte de péptido, polipéptido o proteína presentada está codificada al menos en parte por un ácido nucleico que se ha escindido en una localización deseada por un método que comprende las etapas de:
- (i)
- poner en contacto el ácido nucleico con un oligonucleótido monocatenario, siendo el oligonucleótido funcionalmente complementario del ácido nucleico en la región en la que se desea la escisión, e incluyendo una secuencia que con su complemento en el ácido nucleico forma un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción que con la restricción da como resultado escisión del ácido nucleico en la localización deseada; y
- (ii)
- escindir el ácido nucleico solamente en el sitio de reconocimiento formado por la complementación del ácido nucleico y el oligonucleótido;
realizándose las etapas de puesta en contacto y escisión a una temperatura suficiente para mantener el ácido nucleico en forma sustancialmente monocatenaria, siendo el oligonucleótido funcionalmente complementario del ácido nucleico a lo largo de una región suficientemente grande para permitir que las dos hebras se asocien de modo que pueda producirse la escisión a la temperatura escogida y en la localización deseada, y llevándose a cabo la escisión usando una endonucleasa de restricción que está activa a la temperatura escogida.
4. En un método para presentar un miembro de una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas en la superficie de un paquete genético y presentar colectivamente al menos una parte de la diversidad de la familia, caracterizándose la mejora porque el péptido, polipéptido o proteína presentado está codificado por una secuencia de ADN que comprende un ácido nucleico que se ha escindido en una localización deseada
- (i)
- poniendo en contacto el ácido nucleico con un oligonucleótido parcialmente bicatenario, siendo la región monocatenaria del oligonucleótido funcionalmente complementaria del ácido nucleico en la región en la que se desea la escisión, y teniendo la región bicatenaria del oligonucleótido un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de Tipo II-S, cuyo sitio de escisión se localiza a una distancia conocida del sitio de reconocimiento; y
- (ii)
- escindiendo el ácido nucleico solamente en el sitio de escisión de Tipo II-S formado por la complementación del ácido nucleico y la región monocatenaria del oligonucleótido;
realizándose las etapas de puesta en contacto y escisión a una temperatura suficiente para mantener el ácido nucleico en forma sustancialmente monocatenaria, siendo el oligonucleótido funcionalmente complementario del ácido nucleico a lo largo de una región suficientemente grande para permitir que las dos hebras se asocien de
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modo que pueda producirse la escisión a la temperatura escogida y en la localización deseada, y llevándose a cabo la escisión usando una endonucleasa de restricción que está activa a la temperatura escogida.
5. Un método para presentar un miembro de una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas en la superficie de un paquete genético y presentar colectivamente al menos una parte de la diversidad de la familia, comprendiendo el método las etapas de:
- (i)
- preparar una colección de ácidos nucleicos que codifican al menos en parte miembros de la familia diversa,
- (ii)
- hacer monocatenarios a los ácidos nucleicos;
(iii) escindir los ácidos nucleicos monocatenarios en una localización deseada mediante un método que comprende las etapas de:
- (a)
- poner en contacto el ácido nucleico con un oligonucleótido monocatenario, siendo el oligonucleótido funcionalmente complementario del ácido nucleico en la región en la que se desea la escisión e incluyendo una secuencia que con su complemento en el ácido nucleico forma un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción que con la restricción da como resultado escisión del ácido nucleico en la localización deseada, y
- (b)
- escindir el ácido nucleico solamente en el sitio de reconocimiento formado por la complementación del ácido nucleico y el oligonucleótido;
realizándose las etapas de puesta en contacto y escisión a una temperatura suficiente para mantener el ácido nucleico en forma sustancialmente monocatenaria, siendo el oligonucleótido funcionalmente complementario del ácido nucleico a lo largo de una región suficientemente grande para permitir que las dos hebras se asocien de modo que pueda producirse la escisión a la temperatura escogida y en la localización deseada, y llevándose a cabo la escisión usando una endonucleasa de restricción que está activa a la temperatura escogida; y
(iv) presentar un miembro de la familia de péptidos, polipéptidos o proteínas codificados, al menos en parte, por los ácidos nucleicos escindidos en la superficie del paquete genético y presentar colectivamente al menos una porción de la diversidad de la familia.
6. Un método para presentar un miembro de una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas en la superficie de un paquete genético y presentar colectivamente al menos una porción de la diversidad de la familia, comprendiendo el método las etapas de:
- (i)
- preparar una colección de ácidos nucleicos que codifican al menos en parte, miembros de la familia diversa,
- (ii)
- hacer monocatenarios a los ácidos nucleicos;
(iii) escindir los ácidos nucleicos monocatenarios en una localización deseada mediante un método que comprende las etapas de:
- (a)
- poner en contacto el ácido nucleico con un oligonucleótido monocatenario, siendo la región monocatenaria del oligonucleótido funcionalmente complementaria del ácido nucleico en la región en la que se desea la escisión, y teniendo la región bicatenaria del oligonucleótido un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de Tipo II-S, cuyo sitio de escisión se localiza a una distancia conocida del sitio de reconocimiento; y
- (b)
- escindir el ácido nucleico solamente en el sitio de escisión de Tipo II-S formado por la complementación del ácido nucleico y la región monocatenaria del oligonucleótido;
realizándose las etapas de puesta en contacto y escisión a una temperatura suficiente para mantener el ácido nucleico en forma sustancialmente monocatenaria, siendo el oligonucleótido funcionalmente complementario del ácido nucleico a lo largo de una región suficientemente grande para permitir que las dos hebras se asocien de modo que pueda producirse la escisión a la temperatura escogida y en la localización deseada, y llevándose a cabo la escisión usando una endonucleasa de restricción que está activa a la temperatura escogida; y
(iv) presentar un miembro de la familia de péptidos, polipéptidos o proteínas codificados, al menos en parte, por los ácidos nucleicos escindidos en la superficie del paquete genético y presentar colectivamente al menos una porción de la diversidad de la familia.
7. Una biblioteca que comprende una colección de paquetes genéticos que presenta un miembro de una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas y presenta de forma colectiva al menos una porción de la diversidad de la familia, produciéndose la biblioteca usando los métodos de los apartados 3, 4, 5 ó 6.
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8. Una biblioteca que comprende una colección de paquetes genéticos que presenta un miembro de una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas y que presenta de forma colectiva al menos una porción de la familia, siendo codificados los péptidos, polipéptidos o proteínas presentados por secuencias de ADN que comprenden al menos en parte secuencias producidas escindiendo secuencias de ácido nucleico monocatenarias en una localización deseada mediante un método que comprende las etapas de:
- (i)
- poner en contacto el ácido nucleico con un oligonucleótido monocatenario, siendo el oligonucleótido funcionalmente complementario del ácido nucleico en la región en la que se desea la escisión, e incluyendo una secuencia que con su complemento en el ácido nucleico forma un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción que con la restricción da como resultado la escisión del ácido nucleico en la localización deseada; y
- (ii)
- escindir el ácido nucleico solamente en el sitio de reconocimiento formado por la complementación del ácido nucleico y el oligonucleótido;
realizándose las etapas de puesta en contacto y escisión a una temperatura suficiente para mantener el ácido nucleico en forma sustancialmente monocatenaria, siendo el oligonucleótido funcionalmente complementario del ácido nucleico a lo largo de una región suficientemente grande para permitir que las dos hebras se asocien de modo que pueda producirse la escisión a la temperatura escogida y en la localización deseada, y llevándose a cabo la escisión usando una endonucleasa de restricción que está activa a la temperatura escogida.
9. Una biblioteca que comprende una colección de paquetes genéticos que presenta un miembro de una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas y que presenta de forma colectiva al menos una porción de la diversidad de la familia de los péptidos, polipéptidos o proteínas presentados que es codificada por secuencias de ADN que comprenden al menos en parte secuencias producidas escindiendo secuencias de ácido nucleico monocatenarias en una localización deseada mediante un método que comprende las etapas de:
- (i)
- poner en contacto el ácido nucleico con un oligonucleótido parcialmente bicatenario, siendo la región monocatenaria del oligonucleótido funcionalmente complementaria del ácido nucleico en la región en la que se desea la escisión, y teniendo la región bicatenaria del oligonucleótido un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de Tipo II-S, cuyo sitio de escisión se localiza a una distancia conocida del sitio de reconocimiento en el que se desea la escisión del ácido nucleico; y
- (ii)
- escindir el ácido nucleico solamente en el sitio de escisión de Tipo II-S formado por la complementación del ácido nucleico y la región monocatenaria del oligonucleótido;
realizándose las etapas de puesta en contacto y escisión a una temperatura suficiente para mantener el ácido nucleico en forma sustancialmente monocatenaria, siendo el oligonucleótido funcionalmente complementario del ácido nucleico a lo largo de una región suficientemente grande para permitir que las dos hebras se asocien de modo que pueda producirse la escisión a la temperatura escogida y en la localización deseada, y llevándose a cabo la escisión usando una endonucleasa de restricción que está activa a la temperatura escogida.
- 10.
- Los métodos de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 1 a 9, en los que los ácidos nucleicos codifican al menos una porción de una inmunoglobulina.
- 11.
- Los métodos de acuerdo con el apartado 10, en los que la inmunoglobulina comprende un Fab o Fv monocatenario.
- 12.
- Los métodos de acuerdo con el apartado 10 u 11, en los que la inmunoglobulina comprende al menos una porción de una cadena pesada.
- 13.
- Los métodos de acuerdo con el apartado 12, en los que al menos una porción de la cadena pesada es humana.
- 14.
- Los métodos de acuerdo con el apartado 10 u 11, en los que la inmunoglobulina comprende al menos una porción de FR1.
- 15.
- Los métodos de acuerdo con el apartado 14, en el que al menos una porción de la FR1 es humana.
- 16.
- Los métodos de acuerdo con el apartado 10 u 11, en los que la inmunoglobulina comprende al menos una porción de una cadena ligera.
- 17.
- Los métodos de acuerdo con el apartado 16, en los que al menos una porción de la cadena ligera es humana.
- 18.
- Los métodos de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 1 a 9, en los que las secuencias de ácido nucleico derivan al menos en parte de pacientes que padecen al menos una enfermedad autoinmune y/o cáncer.
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- 19.
- Los métodos de acuerdo con el apartado 18, en los que la enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que comprende lupus eritematoso, esclerosis sistémica, artritis reumatoide, síndrome antifosfolipídico o vasculitis.
- 20.
- Los métodos de acuerdo con el apartado 18, en los que los ácidos nucleicos se aislan al menos en parte del grupo que comprende células de sangre periférica, células de médula ósea, células del bazo o células de ganglios linfáticos.
- 21.
- Los métodos de acuerdo con el apartado 5 ó 6, que comprenden además una etapa de amplificación de ácido nucleico entre las etapas (i) y (ii), entre las etapas (ii) y (iii) o entre las etapas (iii) y (iv).
- 22.
- Los métodos de acuerdo con el apartado 21, en los que la etapa de amplificación usa geneRACE™.
- 23.
- Los métodos de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 1 a 9, en los que la temperatura está entre 45ºC y 75ºC.
- 24.
- Los métodos de acuerdo con el apartado 23, en los que la temperatura está entre 50ºC y 60ºC.
- 25.
- Los métodos de acuerdo con el apartado 24, en los que la temperatura está entre 55ºC y 60ºC.
- 26.
- Los métodos de acuerdo con el apartado 1, 3, 5 u 8, en los que la longitud del oligonucleótido monocatenario está entre 17 y 30 bases.
- 27.
- Los métodos de acuerdo con el apartado 26, en los que la longitud del oligonucleótido monocatenario está entre 18 y 24 bases.
- 28.
- Los métodos de acuerdo con el apartado 1, 3, 5 u 8, en los que la endonucleasa de restricción se selecciona del grupo que comprende: MaeIII, Tsp45I, HphI, BsaJI, AluI, BlpI, DdeI, BglII, MslI, BsiEI, EaeI, EagI, HaeIlI, Bst4CI, HpyCH4III, HinfI, MlyI, PleI, MnlI, HpyCH4V, BsmAI, BpmI, XmnI, o SacI.
- 29.
- Los métodos de acuerdo con el apartado 28, en los que la endonucleasa de restricción se selecciona del grupo que comprende Bst4CI, TaaI, HpyCH4III, BlpI, HpyCH4V o MslI.
- 30.
- Los métodos de acuerdo con el apartado 2, 4, 6 ó 9, en los que la longitud de la región monocatenaria del oligonucleótido parcialmente bicatenario está entre 14 y 22 bases.
- 31.
- Los métodos de acuerdo con el apartado 30, en los que la longitud de la región monocatenaria del oligonucleótido parcialmente bicatenario está entre 14 y 17 bases.
- 32.
- Los métodos de acuerdo con el apartado 31, en los que la longitud de la región monocatenaria del oligonucleótido está entre 18 y 20 bases.
- 33.
- Los métodos de acuerdo con el apartado 2, 4, 6 ó 9, en los que la longitud de la región bicatenaria del oligonucleótido parcialmente bicatenario está entre 10 y 14 pares de bases formada por un tallo y su palíndromo.
- 34.
- Los métodos de acuerdo con el apartado 33, en los que el oligonucleótido parcialmente bicatenario comprende un bucle de 3 a 8 bases entre el tallo y el palíndromo.
- 35.
- Los métodos de acuerdo con los apartados 2, 4, 6 ó 9, en los que la endonucleasa de restricción de Tipo II-S se selecciona del grupo que comprende AarICAC, AceIII, Ebr7I, BbvI, BbvII, Bce83I, BceAI, BcefI, BciVI, BfiI, BinI, BscAI, BseRI, BsmFI, BspMI, EciI, Eco57I, FauI, FokI, GsuI, HgaI, HphI, MboII, MlyI, MmeI, MnlI, PleI, RleAI, SfaNI, SspD5I, Sth132I, StsI, TaqII, Tth111II, or UbaPI.
- 36.
- Los métodos de acuerdo con el apartado 35, en los que la endonucleasa de restricción de Tipo II-S es Fokl.
- 37.
- Un método para preparar ácidos nucleicos monocatenarios para clonar en un vector, comprendiendo el método las etapas de:
- (i)
- poner en contacto una secuencia de ácido nucleico monocatenario que se ha escindido con una endonucleasa de restricción con un oligonucleótido parcialmente bicatenario, siendo la región monocatenaria del oligonucleótido funcionalmente complementaria del ácido nucleico en la región que permanece después de la escisión, incluyendo la región bicatenaria del oligonucleótido cualesquiera secuencias necesarias para devolver las secuencias que permanecen después de la escisión al marco de lectura apropiado y original para expresión y conteniendo un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de 5’ de esas secuencias; y
- (ii)
- escindir la secuencia oligonucleotídica parcialmente bicatenaria solamente en el sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción contenido dentro de la región bicatenaria del oligonucleótido parcialmente bicatenario.
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-
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