ES2400302T3 - Nuevos métodos para construir bibliotecas de paquetes génicos que presentan de forma colectiva los miembros de una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas - Google Patents

Abstract

Un método para preparar ácidos nucleicos, comprendiendo el método las etapas de: (i) amplificar un ácido nucleico usando un cebador complementario de al menos parte de una secuenciasintética localizada en el extremo 5' de la secuencia de ácido nucleico; (ii) hacer el ácido nucleico amplificado monocatenario; (iii) poner en contacto el ácido nucleico monocatenario amplificado con un oligonucleótido monocatenario,siendo el oligonucleótido monocatenario complementario del ácido nucleico monocatenario en una región en la quese desea escisión, en el que el ácido nucleico monocatenario y el oligonucleótido monocatenario se asocian paraformar una región localmente bicatenaria del ácido nucleico monocatenario, en el que la región localmentebicatenaria comprende un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción, y (iv) escindir el ácido nucleico en el sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción, en el que la escisióncomprende poner en contacto una endonucleasa de restricción con la región localmente bicatenaria, en la que laendonucleasa de restricción es específica del sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción, y en el que laescisión elimina todos los nucleótidos 5' no deseados del ácido nucleico; realizándose las etapas de contacto y escisión a una temperatura entre 45 ºC y 75 ºC, en el que el ácido nucleicomonocatenario y el oligonucleótido monocatenario se asocian para formar una región localmente bicatenaria delácido nucleico monocatenario y en el que la endonucleasa de restricción está activa a la temperatura seleccionadaentre 45 ºC y 75 ºC.

Description

Nuevos métodos para construir bibliotecas de paquetes genéticos que presentan de forma colectiva los miembros de una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas

La presente descripción está relacionada con construcción de bibliotecas de paquetes genéticos que presentan un miembro de una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas y presentan colectivamente al menos una parte de la diversidad de la familia. En una realización preferida, los polipéptidos presentados son Fab humanos.

Más específicamente, la descripción se refiere a los métodos de escindir ácidos nucleicos monocatenarios en localizaciones seleccionadas, codificando los ácidos nucleicos escindidos, al menos en parte, a los péptidos, polipéptidos o proteínas presentados en los paquetes genéticos de las bibliotecas de la descripción. En una realización preferida, los paquetes genéticos son fagos o fagémidos filamentosos.

La presente descripción está relacionada además con métodos para explorar las bibliotecas de paquetes genéticos que presentan péptidos, polipéptidos y proteínas útiles y a los péptidos, polipéptidos y proteínas identificados por dicha exploración.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Es ahora práctica habitual en la técnica preparar bibliotecas de paquetes genéticos que presentan un miembro de una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas y presentan colectivamente al menos una parte de la diversidad de la familia. En muchas bibliotecas comunes, los péptidos, polipéptidos o proteínas presentados están relacionados con anticuerpos. Con frecuencia, son Fab o anticuerpos de cadena sencilla. En general, los ADN que codifican miembros de las familias para presentar deben amplificarse antes de que se clonen y se usen para presentar el miembro deseado de la superficie de un paquete genético. Dicha amplificación típicamente hace uso de cebadores directos e inversos.

Tales cebadores pueden ser complementarios de secuencias nativas del ADN para amplificar o complementarios de oligonucleótidos unidos en los extremos 5’ o 3’ de ese ADN. Los cebadores que son complementarios de secuencias nativas del ADN para amplificar tienen la desventaja de que dan preferencia a los miembros de las familias para presentar. Se amplificarán solamente los miembros que contengan una secuencia en el ADN nativo que sea sustancialmente complementaria del cebador. Los que no, estarán ausentes de la familia. Para los miembros que se amplifican, se suprimirá cualquier diversidad dentro de la región del cebador.

Por ejemplo, la patente Europea 368.684 B1, el cebador que se usa está en el extremo 5’ de la región VH de un gen de anticuerpo. Hibrida con una región de secuencia en el ADN nativo que se dice que está “suficientemente bien conservada” dentro de una especie sencilla. Tal cebador tendrá preferencia por los miembros amplificados frente a los que tengan esta región “conservada”. Se extingue cualquier diversidad dentro de esta región.

Se acepta generalmente que los genes de anticuerpos humanos surgen a través de un procedimiento que implica una selección combinatoria de V y J o V, D y J seguido de mutaciones somáticas. Aunque la mayor diversidad se produce en las regiones determinantes de complementariedad (CDR), también se produce diversidad en las regiones flanqueantes (FR) más conservadas y al menos parte de esta diversidad confiere o potencia la unión específica con antígenos (Ag).Como consecuencia, las bibliotecas deberían contener tanta diversidad de CDR y FR como sea posible.

Para clonar los ADN amplificados para presentación en un paquete genético de los péptidos, polipéptidos o proteínas que codifican, los ADN deben escindirse, para producir extremos apropiados para ligación con un vector. Dicha escisión generalmente se efectúa usando sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción portados en los cebadores. Cuando los cebadores están en el extremo 5’ de ADN producido a partir de transcripción inversa de ARN, dicha restricción deja regiones no traducidas 5’ deletéreas en el ADN amplificado. Estas regiones interfieren con la expresión de los agentes clonados y por lo tanto con la presentación de los péptidos, polipéptidos y proteínas codificados por ellas.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención está relacionada con las realizaciones como se define en las reivindicaciones.

Es un objeto de la presente descripción proporcionar nuevos métodos para construir bibliotecas de paquetes genéticos que presenten un miembro de una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas y presenten de forma colectiva al menos una parte de la diversidad de la familia. Estos métodos no tienen preferencia por ADN que contengan secuencias nativas que sean complementarias de los cebadores usados para amplificación. También permiten que cualquier secuencia que pueda ser deletérea para la expresión se elimine del ADN amplificado antes de clonación y presentación.

Es otro objeto de la presente descripción proporcionar un método para escindir secuencias de ácido nucleico monocatenarias en una localización deseada, comprendiendo el método las etapas de:

(i) poner en contacto el ácido nucleico con un oligonucleótido monocatenario, siendo el oligonucleótido

funcionalmente complementario del ácido nucleico en la región en la que se desea escisión e incluyendo una secuencia que con su complemento en el ácido nucleico forma un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción que en la restricción da como resultado escisión del ácido nucleico en la localización deseada; y

5 (ii) escindir el ácido nucleico solamente en el sitio de reconocimiento formado por la complementación del ácido nucleico y el oligonucleótido;

realizándose las etapas de contacto y escisión a una temperatura suficiente para mantener el ácido nucleico en forma sustancialmente monocatenaria, siendo el oligonucleótido funcionalmente complementario del ácido nucleico sobre una región suficientemente grande para permitir que las dos hebras se asocien de modo que pueda

10 producirse escisión a la temperatura seleccionada y en la localización deseada, y llevándose a cabo la escisión usando una endonucleasa de restricción que es activa a la temperatura seleccionada.

Es un objeto adicional de la presente descripción proporcionar un procedimiento alternativo para escindir secuencias de ácido nucleico monocatenarias en una localización deseada, comprendiendo el método las etapas de:

(i) poner en contacto el ácido nucleico con un oligonucleótido parcialmente bicatenario, siendo la región

15 monocatenaria del oligonucleótido funcionalmente complementaria del ácido nucleico en la región en la que se desea escisión, y la región bicatenaria del oligonucleótido que tiene un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de Tipo II-S, cuyo sitio de escisión se localiza a una distancia conocida del sitio de reconocimiento; y

(ii) escindir el ácido nucleico solamente en el sitio de escisión formado por la complementación del ácido 20 nucleico y la región monocatenaria del oligonucleótido;

realizándose las etapas de contacto y escisión a una temperatura suficiente para mantener el ácido nucleico en forma sustancialmente monocatenaria, siendo el oligonucleótido funcionalmente complementario del ácido nucleico sobre una región suficientemente grande para permitir que las dos hebras se asocien de modo que pueda producirse escisión a la temperatura seleccionada y en la localización deseada, y llevándose a cabo la escisión

25 usando una endonucleasa de restricción que esté activa a la temperatura deseada.

Es otro objetivo de la presente descripción proporcionar un método para capturar moléculas de ADN que comprenden un miembro de una familia diversa de ADN y comprenden colectivamente al menos una parte de la diversidad de la familia. Estas moléculas de ADN en forma monocatenaria se han escindido por uno de los métodos de la presente descripción. Este método implica ligar los miembros de ADN monocatenarios individuales de la familia

30 con un complejo de ADN parcialmente bicatenario. El método comprende las etapas de:

(i) poner en contacto una secuencia de ácido nucleico monocatenaria que se ha escindido con una endonucleasa de restricción con un oligonucleótido parcialmente bicatenario, siendo la región monocatenaria del oligonucleótido funcionalmente complementaria del ácido nucleico en la región que permanece después de la escisión, incluyendo la región bicatenaria del oligonucleótido cualquier secuencia

35 necesaria para devolver las secuencias que permanecen después de la escisión a la fase de lectura apropiada para expresión y conteniendo un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción 5’ de esas secuencias; y

(ii) escindir la secuencia oligonucleotídica parcialmente bicatenaria solamente en el sitio de reconocimiento

de endonucleasa de restricción contenido dentro de la región bicatenaria del oligonucleótido parcialmente 40 bicatenario.

Es otro objeto de la presente descripción preparar bibliotecas, que presentan una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas y presentan colectivamente al menos parte de la diversidad de la familia, usando los métodos y ADN descritos anteriormente.

Es un objeto de la presente descripción explorar esas bibliotecas para identificar péptidos, polipéptidos y proteínas 45 útiles y usar esas sustancias en terapia humana.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1 es un esquema de diversos métodos que pueden emplearse para amplificar genes VH sin usar cebadores específicos de secuencias VH.

La FIG. 2 es un esquema de diversos métodos que pueden emplearse para amplificar genes VL sin usar secuencias 50 VL.

La FIG. 3 representa análisis en gel de ADN kappa escindido del Ejemplo 2.

La FIG. 4 representa análisis en gel de ADN kappa escindido del Ejemplo 2.

La FIG. 5 representa análisis en gel de ADN kappa amplificado del Ejemplo 2.

La FIG. 6 representa ADN kappa amplificado purificado en gel del Ejemplo 2. TÉRMINOS

En la presente solicitud, se usan los siguientes términos y abreviaturas:

Hebra sentido La hebra superior de ADN bc como se escribe habitualmente. En la hebra

sentido, 5’-ATG-3’ codifica Met.

Hebra antisentido La hebra inferior de ADN bc como se escribe habitualmente. En la hebra antisentido, 3’-TAC-5’ correspondería con un codón de Met en la hebra sentido.

Cebador directo: Un cebador “directo” es complementario de una parte de la hebra sentido y actúa como cebador para la síntesis de una nueva molécula de hebra antisentido. “Cebador directo” y “cebador de hebra inferior” son equivalentes.

Cebador inverso: Un cebador “inverso” es complementario de una parte de la hebra antisentido y actúa como cebador para síntesis de una nueva molécula de hebra sentido. “Cebador inverso” y “cebador de hebra superior” son equivalentes.

Bases: Las bases se especifican por su posición en un vector o gen como su posición dentro de un gen por codón y base. Por ejemplo, “89.1” es la

primera base del codón 89, 89.2 es la segunda base del codón 89.

Sv Estreptavidina

Ap Ampicilina

apR Un gen que confiere resistencia a ampicilina

ER Endonucleasa de restricción

ERU Endonucleasa de restricción universal

Funcionalmente Dos secuencias son suficientemente complementarias para que hibriden en

complementario las condiciones seleccionadas SRER Sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción AA Aminoácido PCR Reacción en cadena de polimerización GLG Genes de línea germinal Ab Anticuerpo: una inmunoglobulina. El término también abarca cualquier

proteína que tenga un dominio de unión que sea homólogo de un dominio de unión de inmunoglobulina. Unos pocos ejemplos de anticuerpos dentro de esta definición son, entre otros, isotipos de inmunoglobulina y los fragmentos Fab, F(ab1)2, ScFv, Fv, dAb y Fd.

Fab Molécula de dos cadenas que comprende una cadena ligera Ab y parte de una cadena pesada.

scFv Un Ab de cadena sencilla que comprende VH::enlazador::VL o VL::enlazador::VH

w.t. Tipo silvestre HC Cadena pesada LC Cadena ligera VK Un dominio variable de una cadena ligera kappa VH Un dominio variable de una cadena pesada VL Un dominio variable de una cadena ligera lambda

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS

Las secuencias de ácido nucleico que son útiles en los métodos de la presente descripción, es decir, las que codifican al menos en parte los péptidos individuales, polipéptidos y proteínas individuales presentados en los paquetes genéticos de la presente descripción, pueden ser de origen natural, sintéticos o una combinación de los mismos. Pueden ser ARNm, ADN o ADNc. En la realización preferida, los ácidos nucleicos codifican anticuerpos. Más preferentemente, codifican Fab.

Los ácidos nucleicos útiles en la presente descripción pueden ser de forma natural diversos, puede introducirse diversidad sintética en los miembros diversos de forma natural, o la diversidad puede ser completamente sintética. Por ejemplo, puede introducirse diversidad sintética en una o más CDR de genes de anticuerpos.

La diversidad sintética puede crearse, por ejemplo, a través del uso de tecnología TRIM (Documento U.S. 5.869.644). La tecnología TRIM permite control sobre exactamente qué tipos de aminoácidos se permiten en posiciones abigarradas y en qué proporciones. En la tecnología TRIM, los codones para diversificar se sintetizan usando mezclas de trinucleótidos. Esto permite que se incluya cualquier conjunto de tipos de aminoácidos en cualquier proporción.

Otra alternativa que puede usarse para generar ADN diversificado es síntesis de oligonucleótido mixto. Con tecnología TRIM, se puede permitir Ala y Trp. Con síntesis de oligonucleótidos mixta, una mezcla que incluyera Ala y Trp también incluiría necesariamente Ser y Gly. Los tipos de aminoácidos permitidos en las posiciones abigarradas se seleccionan con referencia a la estructura de los anticuerpos, u otros péptidos, polipéptidos o proteínas de la familia, la diversidad observada en genes de línea germinal, las mutaciones somáticas observadas frecuentemente, y las áreas y tipos deseados de abigarramiento.

En una realización preferida de la presente descripción, las secuencias de ácido nucleico para al menos una CDR u otra región de los péptidos, polipéptidos o proteínas de la familia son ADNc producidos por transcripción inversa de ARNm. Más preferentemente, los ARNm se obtienen de células de sangre periférica, células de médula ósea, células del bazo o células de ganglios linfáticos (tales como linfocitos B o células plasmáticas) que expresan miembros de conjuntos diversos de forma natural de genes relacionados. Más preferentemente, los ARNm codifican una familia diversa de anticuerpos. Más preferentemente, los ARNm se obtienen de pacientes que padecen al menos un trastorno autoinmune o cáncer. Preferentemente, se usan ARNm que contengan una alta diversidad de enfermedades autoinmunes, tales como lupus eritematoso sistémico, esclerosis sistémica, artritis reumatoide, síndrome antifosfolipídico y vasculitis.

En una realización preferida de la presente descripción, los ADNc se producen a partir de los ARNm usando transcripción inversa. En esta realización preferida, los ARNm se separan de la célula y se degradan usando métodos convencionales, de modo que solamente permanezcan los ARNm de longitud completa (es decir, con extremos cubiertos). El recubrimiento se retira después y se usa de la transcripción inversa para producir los ADNc.

La transcripción inversa de la primera hebra (antisentido) puede realizarse de cualquier manera con cualquier cebador adecuado. Véase, por ejemplo, HJ de Haard et al., Journal of Biological Chemistry, 274 (26):18218-30 (1999). En la realización preferida de la presente descripción en la que los ARNm codifican anticuerpos, pueden usarse cebadores que son complementarios de las regiones constantes de genes de anticuerpos. Esos cebadores son útiles debido a que no generan preferencia por subclases de anticuerpos. En otra realización, pueden usarse cebadores poli-dT (y pueden preferirse para los genes de cadena pesada). Como alternativa, pueden unirse secuencias complementarias del cebador en los extremos de la hebra antisentido.

En una realización preferida de la presente descripción, el cebador de transcriptasa inversa puede estar biotinilado, permitiendo de este modo que el producto de ADNc se inmovilice en perlas de estreptavidina (Sv). La inmovilización también puede efectuarse usando un cebador marcado en el extremo 5’ con uno de a) grupo de amina libre, b) tiol, c) ácido carboxílico o d) otro grupo no hallado en ADN que puede reaccionar para formar un enlace fuerte con un compañero conocido en un medio insoluble. Si, por ejemplo, se proporciona una amina libre (preferentemente amina primaria) en el extremo 5’ de un cebador de ADN, esta amina puede hacerse reaccionar con grupos de ácido carboxílico en una perla polimérica usando química formadora de amida convencional. Si dicha inmovilización preferida se usa durante la transcripción inversa, el ARN de hebra superior se degrada usando enzimas bien conocidas, tal como una combinación de RNAsaH y RNAsaA, antes o después de la inmovilización.

Las secuencias de ácido nucleico útiles en los métodos de la presente descripción se amplifican generalmente antes de usarse para presentar los péptidos, polipéptidos o proteínas que codifican. Antes de la amplificación, los ADN monocatenarios pueden escindirse usando uno de los métodos descritos anteriormente. Como alternativa, los ADN monocatenarios pueden amplificarse y después escindirse usando uno de esos métodos.

Puede usarse cualquiera de los métodos bien conocidos para amplificar secuencias de ácido nucleico para dicha amplificación. Se prefieren métodos que maximicen, y no tengan preferencia por, la diversidad. En una realización preferida de la presente descripción en la que las secuencias de ácido nucleico derivan de genes de anticuerpo, la presente descripción utiliza preferentemente cebadores en las regiones constantes de los genes de cadena pesada y ligera y cebadores de una secuencia sintética que se unen en el extremo 5’ de la hebra sentido. El uso de cebadores en dicha secuencia sintética evita el uso de secuencias dentro de las regiones variables de los genes de

anticuerpos. Esos sitios de situación de cebadores de región variable generan preferencia contra genes V que son de subclases poco comunes o que se han mutado en los sitios de situación de cebadores. Esta preferencia se debe parcialmente a la supresión de la diversidad dentro de la región del cebador y parcialmente debido a falta de cebadores cuando están presentes muchas mutaciones en la región complementaria del cebador. Los métodos descritos tienen la ventaja de no dar preferencia en la población de genes de anticuerpos amplificados a tipos de genes V particulares.

Las secuencias sintéticas pueden unirse al extremo 5’ de la cadena de ADN por diversos métodos bien conocidos para ligar secuencias de ADN entre sí. Un método preferido es RT CapExtention.

En RT CapExtention (derivada de Smart PCR (TM), se usa un solapamiento corto (5’-... GGG-3’ en el cebador de hebra superior (USP-GGG) complementa 3'-CCC... 5’ en la hebra inferior) y transcriptasas inversas de modo que el complemento inverso del cebador de la hebra superior se una con la hebra inferior.

En una realización preferida de la presente descripción, el cebador de hebra superior o hebra inferior también puede estar biotinilado o marcado en el extremo 5’ con uno de a) grupo amino libre, b) tiol, c) ácido carboxílico y d) otro grupo no hallado en ADN que pueda reaccionar para formar un enlace fuerte con un compañero conocido como un medio insoluble. Estos pueden usarse después para inmovilizar la cadena marcada después de amplificación. El ADN inmovilizado puede ser mono o bicatenario.

La FIG. 1 muestra un esquema de la amplificación de genes VH. La fig. 1, Panel A muestra un cebador específico de la región poli-dT de la síntesis con cebadores 3’ UTR de la primera hebra inferior. También son adecuados cebadores que se unen en la región constante. El panel B muestra la hebra inferior extendida en su extremo 3’ por tres C que no son complementarias del ARNm. El panel C muestra el resultado de hibridar un extremo de cebador de hebra superior sintético en tres GGG que hibridan con los CCC del extremo 3’ y extender la transcripción inversa que extiende la hebra inferior por el complemento inverso de la secuencia de cebador sintético. El panel D muestra el resultado de amplificación por PCR usando un cebador de hebra superior sintético biotinilado 5’ que replica el extremo 5’ del cebador sintético de panel C y un cebador de hebra inferior complementario de parte del dominio constante. El panel E muestra ADNc bicatenario (bc) inmovilizado obtenido usando un cebador de hebra superior biotinilado 5’.

La FIG. 2 muestra un esquema similar para amplificación de genes VL. La FIG. 2, panel A muestra un cebador específico de la región constante en o cerca del extremo 3’ que actúa como cebador de la síntesis de la primera hebra inferior. También son adecuados cebadores que se unen en la región poli-dT. El panel B muestra la hebra inferior extendida en su extremo 3’ por tres C que no son complementarias del ARNm. El panel C muestra el resultado de hibridar un cebador de hebra superior sintético que termina en tres GGG que hibridan con las CCC terminales 3’ y extender la transcripción inversa que extiende la hebra inferior por el complemento inverso de la secuencia de cebador sintético. El panel D muestra el resultado de la amplificación por PCR usando un cebador de hebra superior sintética biotinilada 5’ que duplica el extremo 5’ del cebador sintético de panel C y un cebador de hebra inferior complementario de parte del dominio constante. El cebador de hebra inferior también contiene un sitio de endonucleasa de restricción útil, tal como AscI. El panel E muestra ADNc bc inmovilizado obtenido usando un cebador de hebra superior biotinilado 5’.

Las FIG. 1 y 2, cada gen V consiste en una región 5’ no traducida (UTR) y una señal de secreción, seguida de la región variable, seguida de una región constante, seguida de una región 3’ no traducida (que típicamente termina en poli-A). Un cebador inicial para la transcripción inversa puede ser complementario de la región constante o del segmento poli A del 3’-UTR. Para genes de cadena pesada humana, se prefiere un cebador de 15 T. Las transcriptasas inversas unen varios restos C en el extremo 3’ del ADN de nueva síntesis. RT CapExtention aprovecha esta característica. La reacción de transcripción inversa se ejecuta en primer lugar solamente con un cebador de hebra inferior. Después de aproximadamente 1 hora, se añade un cebador que acaba en GGG (USP-GGG) y más RTasa. Esto provoca que el ADNc de hebra inferior se extienda por el complemento inverso del USP-GGG hasta el GGG final. Usando un cebador idéntico a parte de la secuencia sintética unida y un segundo cebador complementario de una región de secuencia conocida en el extremo 3’ de la hebra sentido, todos los genes V se amplifican independientemente de su subclase del gen V.

Después de amplificación, los ADN de esta descripción se hacen monocatenarios. Por ejemplo, las hebras pueden separarse usando cebador biotinilado, capturando el producto biotinilado en perlas de estreptavidina, desnaturalizando el ADN y retirando por lavado la hebra complementaria. Dependiendo de qué extremo del ADN capturado se desee, se puede elegir movilizar la hebra superior (sentido) o la hebra inferior (antisentido).

Para preparar los ADN amplificados monocatenarios para clonación en paquetes genéticos para efectuar la presentación de los péptidos, polipéptidos o proteínas codificados, al menos en parte, por esos ADN, estos deben manipularse para proporcionar extremos adecuados para clonación y expresión. En particular, cualquier región no traducida 5’ y secuencias señal de mamíferos deben retirarse y reemplazarse, en fase, por una secuencia señal adecuada que actúe en el hospedador de presentación. Adicionalmente, pueden retirarse partes de los dominios variables (en genes de anticuerpos) y reemplazarse por segmentos sintéticos que contienen diversidad sintética. La diversidad de otras familias génicas puede expandirse de modo similar con diversidad sintética.

De acuerdo con los métodos de la presente descripción, hay dos formas de manipular los ADN amplificados

monocatenarios para clonación. El primer método comprende las etapas de:

(i)

poner en contacto el ácido nucleico con un oligonucleótido monocatenario, siendo el oligonucleótido funcionalmente complementario del ácido nucleico en la región en la que se desea escisión e incluyendo una secuencia que con su complemento en el ácido nucleico forma un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción que en la restricción da como resultado escisión del ácido nucleico de la localización deseada; y

(ii)

escindir el ácido nucleico solamente en el sitio de reconocimiento formado por la complementación del ácido nucleico y el oligonucleótido;

las etapas de contacto y escisión que se realiza a una temperatura suficiente para mantener el ácido nucleico en forma sustancialmente monocatenaria, siendo el oligonucleótido funcionalmente complementario del ácido nucleico sobre una región suficientemente grande para permitir que las dos hebras se asocien de modo que pueda producirse escisión a la temperatura seleccionada y en la localización deseada, y llevándose a cabo la escisión usando una endonucleasa de restricción que es activa a la temperatura seleccionada.

En este primer método, se hibridan oligonucleótidos cortos con el ADN monocatenario de modo que puedan escindirse sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción formados dentro de las regiones ahora localmente bicatenarias del ADN. En particular, un sitio de reconocimiento que aparece en la misma posición en una fracción sustancial de los ADN monocatenarios es idéntico.

Para genes de anticuerpo, esto puede realizarse usando un catálogo de secuencias de línea germinal. Véase, por ejemplo, “http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/restricted/ok.html”. Pueden obtenerse actualizaciones de este sitio bajo el encabezamiento “Amino acid and nucleotide sequence aligments”. Para otras familias, existen comparaciones similares y pueden usarse para seleccionar regiones apropiadas para escisión y para mantener la diversidad.

Por ejemplo, la Tabla 195 representa las secuencias de ADN de las regiones FR3 de los 51 genes de línea germinal VH humanos conocidos. En esta región, los genes contienen sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción mostrados en la Tabla 200. Se prefieren endonucleasas de restricción que escinden una gran fracción de genes de línea germinal en el mismo sitio frente a endonucleasas que cortan en una diversidad de sitios. Además, se prefiere que haya solamente un solo sitio para las endonucleasas de restricción dentro de la región con la que se une el oligonucleótido corto en el ADN monocatenario, por ejemplo, aproximadamente 10 bases en cada lado del sitio de reconocimiento de endonucleasas de restricción.

Una enzima que escinda cadena abajo en FR3 también es más preferible debido a que captura menos mutaciones en el armazón. Esto puede ser ventajoso en algunos casos. Sin embargo, se sabe bien que existen mutaciones del armazón y confieren y potencian la unión de anticuerpos. La presente descripción, por selección del sitio de restricción apropiado, permite que se capture toda o parte de la diversidad de FR3. Por lo tanto, el método también permite que se capture diversidad extensiva.

Finalmente, en los métodos de la presente descripción se usan endonucleasas de restricción que están activas entre aproximadamente 45 º y aproximadamente 75 ºC. Preferentemente se usan enzimas que están activas por encima de 50 ºC, y más preferentemente activas a aproximadamente 55 ºC. Tales temperaturas mantienen la secuencia de ácido nucleico para escindir en forma sustancialmente monocatenaria.

Las enzimas mostradas en la Tabla 200 que cortan muchos de los genes de línea germinal de FR3 de cadena pesada en una posición sencilla incluyen: MaeIII (24 en 4), Tsp45I (21 en 4), HphI (44 en 5), BsaJT (23 en 65 ), AluI (23 en 47), BlpI (21 en 48), DdeI (29 en 58), BglTI (10 en 61), MsLI (44 en 72), BsiEI (23 en 74), EaeI (23 en 74), EagI (23 en 74), HaeIII (25 en 75), Bst4CI (51 en 86), HpyCH41II (51 en 86), HinfI (38 en 2), MlyI (18 en 2), PleI (18 en 2), MnlI (31 en 67), HpyCH4V (21 en 44), BsmAI (16 en 11), BpmI (19 en 12), XmnI (12 en 30), y SacI (11 en 51). (La notación usada significa, por ejemplo, que BsmAI corta 16 de los genes de línea germinal de FR3 comenzando un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción en la base 11 de FR3).

Para escisión de cadenas pesadas humanas en FR3, las endonucleasas de restricción preferidas son: Bst4CI (o TaaI o HpyCH4III), BlpI, HpyCH4V y MslI. Debido a que ACNGT (el sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción para Bst4CI, TaaI y HpyCH4III) se encuentra en un sitio uniforme en todos los genes de línea germinal de FR3 humana, una de esas enzimas es la más preferida para captura de diversidad de CDR3 de cadena pesada. BlpI y HpyCH4V son complementarios. BlpI corta la mayoría de los miembros de las familias VH1 y VH4 mientras que HpyCH4V corta la mayoría de los miembros de las familias VH3, VH5, VH6 y VH7. Ninguna enzima corta VH2, pero esta es una familia muy pequeña, que contiene solamente tres miembros. Por lo tanto, estas enzimas también pueden usarse en realizaciones preferidas de los métodos de la presente descripción.

Las endonucleasas de restricción HpyCH4III, Bst4CI y TaaI reconocen todas 5’-ACnGT-3’ y cortan ADN de hebra superior después de n y ADN de hebra inferior antes de la base complementaria a n. Este es el sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción más preferido para este método en cadenas pesadas humanas debido a que se encuentra en todos los genes de línea germinal. Por lo tanto, la región de reconocimiento de endonucleasa de restricción (ACnGT) coincide con la segunda y tercera bases de un codón de tirosina (tay) y el

siguiente codón de cisteína (tgy) como se muestra en la Tabla 206. Estos codones están altamente conservados, especialmente la cisteína en genes de anticuerpos maduros.

La Tabla 250 E muestra los distintos oligonucleótidos de 22 bases de longitud (excepto el último que es de 20 bases de longitud). La Tabla 255 C muestra el análisis de 1617 genes de anticuerpo de cadena pesada reales. De estos, 1511 tienen el sitio y coinciden con uno de los oligonucleótidos candidatos con hasta 4 emparejamientos erróneos. Ocho oligonucleótidos representan la mayoría de las coincidencias y se proporcionan en la Tabla 250 F.1. Los 8 oligonucleótidos son muy similares de modo que es probable que se consiga escisión satisfactoria con solamente un oligonucleótido (tal como H43.77.97.1-02 Nº 1) ajustando la temperatura, pH, salinidad, y similares. Uno o dos oligonucleótidos pueden ser de forma similar suficientes siempre que las secuencias génicas de línea germinal difieran muy poco y especialmente si difieren muy poco cerca de la región de reconocimiento de endonucleasa de restricción para escindir. La Tabla 255 D muestra un análisis de repetición de 1617 genes de anticuerpo de cadena pesada reales usando solamente los 8 oligonucleótidos seleccionados. Esto muestra que 1463 de las secuencias coinciden con al menos uno de los oligonucleótidos con hasta 4 emparejamientos erróneos y tienen el sitio como se esperaba. Sólo 7 secuencias tienen una segunda región de reconocimiento de endonucleasa de restricción HpyCH4III en esta región.

Otra ilustración de la selección de un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción apropiado implica escisión en FR1 de cadenas pesadas humanas. La escisión en FR1 permite la captura de la diversidad de CDR completa de la cadena pesada.

Los genes de línea germinal para FR1 de cadena pesada humana se muestran en la Tabla 217. La Tabla 220 muestra los sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción hallados en FR1 de genes de línea germinal humana. Los sitios preferidos son BsgI (GTGCAG; 39 en 4), BsoFI (GCngc, 43 en 6, 11 en 9, 2 en 3, 1 en 12), TseI (Gcwgc, 43 en 6, 11 en 9, 2 en 3, 1 en 12), MspA1I (CMGckg, 46 en 7, 2 en 1), PvuII (CAGctg, 46 en 7, 2 en 1), AluI (AGct, 48 en 82 en 2), DdeI (Ctnag; 22 en 52, 9 en 48), HphI (tcacc; 22 en 80), BssKI (Nccngg; 35 en 39, 2 en 40), BsaJI (Ccnngg; 32 en 40, 2 en 41), BstNI (CCwgg; 33 en 40), ScrFI (CCngg; 35 en 40, 2 en 41), EcoO109I (RGgnccy; 22 en 46, 11 en 43), Sau96I (Ggncc; 23 en 47, 11 en 44), AvaII (Ggwcc; 23 en 47, 4 en 44), PpuMI (RGgwccy; 22 en 46,4 en 43), BsmFI (gtccc; 20 en 48), HinfI (Gantc, 34 en, 16 en 21 en 56, 21 en 77), TfiT (21 en 77), MlyI (GAGTC, 34 en 16), MlyI (gactc; 21 en 56), y AlwNI (CAGnnnctg, 22 en 68). Los sitios más preferidos son MspAI y PvuII. MspAI y PvuII tienen 46 sitios en 7-12 y 2 en 1-6. Para evitar escisión en ambos sitios, se usan oligonucleótidos que no abarcan completamente el sitio en 1-6. Por lo tanto, el ADN no se escindirá en ese sitio. Los inventores han mostrado que el ADN que se extiende 3, 4 ó 5 bases más allá de un sitio de PvuII puede escindirse eficazmente.

Otra ilustración de la selección de un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción apropiado implica escisión en FR1 de cadenas ligeras kappa humanas. La Tabla 300 muestra los genes de línea germinal de FR1 kappa humana y la Tabla 302 muestra sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción que se encuentran en un número sustancial de genes de línea germinal FR1 kappa humana en localizaciones uniformes. De los sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción enumerados, BsmAI y PflFI son las enzimas más preferidas. Se encuentran sitios BsmAI en la base 18 en 35 de 40 genes de línea germinal. Se encuentran sitios PflFI en 35 de 40 genes de línea germinal en la base 12.

Otro ejemplo de selección de un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción apropiado implica escisión en FR1 de la cadena ligera lambda humana. La Tabla 400 muestra las 31 secuencias de genes de línea germinal de FR1 lambda humana conocidas. La Tabla 405 muestra sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción hallados en genes de la línea germinal de FR1 lambda humana. HinfI y DdeI son las endonucleasas de restricción más preferidas para cortar cadenas lambda humanas en FR1.

Después de que se seleccione el sitio o los sitios apropiados para escisión, se preparan uno o más oligonucleótidos cortos para complementar funcionalmente, solos o en combinación, el sitio de reconocimiento seleccionado. Los oligonucleótidos también incluyen secuencias que flanquean el sitio de reconocimiento en la mayoría de los genes amplificados. Esta región flanqueante permite que la secuencia hibride con el ADN monocatenario suficientemente para permitir la escisión por la endonucleasa de restricción específica del sitio seleccionado.

La longitud y secuencia reales del oligonucleótido depende del sitio de reconocimiento y las condiciones que se usen para contacto y escisión. La longitud debe ser suficiente para que el oligonucleótido sea funcionalmente complementario del ADN monocatenario sobre una región suficientemente grande para permitir que las dos hebras se asocien de modo que se produzca escisión a la temperatura seleccionada y solamente en la localización deseada.

Típicamente, los oligonucleótidos de este método preferido de la descripción son de aproximadamente 17 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. Por debajo de aproximadamente 17 bases, la hibridación es demasiado débil y por encima de 30 bases puede haber una pérdida de especificidad. Una longitud preferida es de 18 a 24 bases.

Los oligonucleótidos de esta longitud no necesitan ser complementos idénticos de los genes de línea germinal. En su lugar, pueden tolerarse varios emparejamientos erróneos tomados. Preferentemente, sin embargo, no se permiten más de 1-3 emparejamientos erróneos. Algunos emparejamientos erróneos no afectan de forma adversa a

la hibridación del oligonucleótido con el ADN monocatenario. Por lo tanto, se dice que los dos ADN son funcionalmente complementarios.

El segundo método para manipular los ADN monocatenarios amplificados de la presente descripción para clonación comprende las etapas de:

(i)

poner en contacto el ácido nucleico con un oligonucleótido parcialmente bicatenario, siendo la región monocatenaria del oligonucleótido funcionalmente complementaria del ácido nucleico en la región en la que se desea escisión, y teniendo la región bicatenaria del oligonucleótido un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción Tipo II-S, cuyo sitio de escisión se localiza a una distancia conocida del sitio de reconocimiento; y

(ii)

escindir el ácido nucleico solamente en el sitio de escisión formado por la complementación del ácido nucleico y la región monocatenaria del oligonucleótido;

realizándose las etapas de contacto y escisión a una temperatura suficiente para mantener el ácido nucleico en forma sustancialmente monocatenaria, siendo el oligonucleótido funcionalmente complementario del ácido nucleico sobre una región suficientemente grande para permitir que las dos hebras se asocien de modo que pueda producirse escisión a la temperatura seleccionada y en la localización deseada, y llevándose a cabo la escisión usando una endonucleasa de restricción que es activa a la temperatura seleccionada.

Este segundo método emplea endonucleasas de restricción universales (“ERU”). Las ERU son oligonucleótidos parcialmente bicatenarios. La parte monocatenaria o solapamiento de las ERU consiste en un adaptador de ADN que es funcionalmente complementario de la secuencia para escindir en el ADN monocatenario. La parte bicatenaria consiste en un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de tipo II-S.

El método de ERU de la presente descripción es específico y preciso y puede tolerar algunos (por ejemplo, 1-3) emparejamientos erróneos en las regiones complementarias, es decir, es funcionalmente complementario de esa región. Además, las condiciones en las que se usa la ERU pueden ajustarse, de modo que la mayoría de los genes que se amplifiquen puedan cortarse, reduciendo la preferencia en la biblioteca producida a partir de esos genes.

La secuencia del adaptador de ADN monocatenario o parte solapante de la ERU típicamente consiste en aproximadamente 14-22 bases. Sin embargo, pueden usarse adaptadores más largos o más cortos. El tamaño depende de la capacidad del adaptador para asociarse con su complemento funcional en el ADN monocatenario y la temperatura usada para poner en contacto la ERU y el ADN monocatenario a la temperatura usada para escindir el ADN con la enzima de tipo II-S. El adaptador debe ser funcionalmente complementario del ADN monocatenario sobre una región suficientemente grande para permitir que las dos hebras se asocien de modo que pueda producirse escisión a la temperatura seleccionada y en la localización deseada. Los inventores prefieren partes monocatenarias o solapantes de 14-17 bases de longitud, y más preferentemente 18-20 bases de longitud.

El sitio seleccionado para escisión usando la ERU es preferentemente uno que se conserve sustancialmente en la familia de ADN amplificados. En comparación con el primer método de escisión de esta descripción, estos sitios no necesitan ser sitios de reconocimiento de endonucleasa. Sin embargo, como el primer método, los sitios seleccionados pueden ser sintéticos en lugar de existir en el ADN nativo. Tales sitios pueden seleccionarse por referencias a las secuencias de anticuerpos conocidos u otras familias de genes. Por ejemplo, las secuencias de muchos genes de línea germinal se presentan en http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/restricted/ok.html. Por ejemplo, un sitio preferido aparece cerca del extremo de FR3, codón 89 hasta la segunda base del codón 93. La CDR3 comienza en el codón 95.

Las secuencias de 79 genes de cadena pesada humana también están disponibles en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entre2/nucleotide.html. Este sitio puede usarse para identificar secuencias apropiadas para escisión con ERU de acuerdo con los métodos de la presente descripción. Véase, por ejemplo, la Tabla 8B.

Más preferentemente, se identifican una o más secuencias usando estos sitios u otra información de secuencia disponible. Estas secuencias juntas se presentan en una fracción sustancial de los ADN amplificados. Por ejemplo, podrían usarse múltiples secuencias para permitir diversidad conocida en genes de línea germinal o para mutaciones somáticas frecuentes. También podrían usarse secuencias degeneradas sintéticas. Preferentemente, se selecciona una secuencia o secuencias que aparecen en al menos 65% de genes examinados con no más de 2-3 emparejamientos erróneos.

Se hace después que los adaptadores o solapamientos monocatenarios de ERU sean complementarios con las regiones seleccionadas. Las condiciones para usar las ERU se determinan de forma empírica. Estas condiciones deberían permitir escisión de ADN que contiene las secuencias funcionalmente complementarias con no más de 2 ó 3 emparejamientos erróneos pero que no permitiría la escisión de ADN sin tales secuencias.

Como se ha descrito anteriormente, la parte bicatenaria de la ERU incluye un sitio de reconocimiento de endonucleasa tipo II-S. Puede usarse cualquier enzima de tipo II-S que esté activa a una temperatura necesaria para mantener el ADN monocatenario sustancialmente en esa forma y para permitir que la parte adaptadora de ADN monocatenario de la ERU hibride durante suficiente tiempo con el ADN monocatenario para permitir escisión en el

sitio deseado.

Las enzimas de tipo II-S preferidas para su uso en los métodos de ERU de la presente descripción proporcionan escisión asimétrica del ADN monocatenario. Entre estas están las enzimas enumeradas en la Tabla 800. La enzima tipo II-S más preferida es FokI.

Cuando se usa la FokI preferida que contiene ERU, se usan preferentemente varias condiciones para efectuar escisión:

1) Debería estar presente exceso de la ERU frente a ADN diana para activar la enzima. ERU presente solamente en cantidades equimolares con el ADN diana produciría escasa escisión de ADNmc debido a que la cantidad de enzima activa disponible sería limitante.

2) puede usarse un activador para activar parte de la enzima FokI para dimerizar sin provocar escisión. Se muestran ejemplos de activadores apropiados en la Tabla 510.

3) La reacción de escisión se realiza a una temperatura entre 45 ºC y 75 ºC, preferentemente por encima de 50 ºC y más preferentemente por encima de 55ºC.

Las ERU usadas en la técnica anterior contenían un segmento monocatenario de 14 bases, un tallo de 10 bases (que contenían un sitio de FokI), seguido del palíndromo del tallo de 10 bases. Aunque pueden usarse tales ERU en los métodos de la presente descripción, las ERU preferidas de la presente descripción también incluyen un segmento de tres a ocho bases (un bucle) entre los segmentos que contienen sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción FokI. En la realización preferida, el tallo (que contiene el sitio FokI) y su palíndromo también son de más de 10 bases de longitud. Preferentemente, son de 10-14 bases de longitud. Se muestran ejemplos de estos adaptadores de ERU de tipo “piruleta” en la Tabla 5.

Un ejemplo de uso de una ERU para escindir un ADN monocatenario implica la región FR3 de cadena pesada humana. La Tabla 508 muestra un análisis de 840 cadenas pesadas humanas maduras de longitud completa con las secuencias de reconocimiento de ERU mostradas. La amplia mayoría (718/840 = 0,85) se reconocerán con 2 o menos emparejamientos erróneos usando cinco ERU (VHS881-1.1, VHS881-1.2, VHS881-2.1, VHS881-4.1, y VHS881 9.1). Cada una tiene una secuencia adaptadora de 20 bases para complementar el gen de línea germinal, un segmento de tallo de diez bases que contiene un sitio FokI, un bucle de cinco bases, y el complemento inverso del primer segmento de tallo. La hibridación de esos adaptadores, solos o en combinación, con ADN de cadena pesada antisentido monocatenario y el tratamiento con FokI en presencia de, por ejemplo, el activador FOKIact, conducirán a escisión de la hebra antisentido en la posición indicada.

Otro ejemplo de uso de una o varias ERU para escindir un ADN monocatenario implica la región FR1 de las cadenas ligeras kappa humanas. La Tabla 512 muestra un análisis de 182 cadenas kappa humanas de longitud completa con respecto a coincidencia por las cuatro secuencias sonda de 19 bases mostradas. Noventa y seis por ciento de las secuencias coinciden con una de las sondas con 2 o menos emparejamientos erróneos. Los adaptadores de ERU mostrados en la Tabla 512 son para escisión de la hebra sentido de cadenas kappa. Por lo tanto, las secuencias adaptadoras son el complemento inverso de las secuencias de genes de línea germinal. La ERU consiste en un tallo de diez bases, un bucle de cinco bases, el complemento inverso del tallo y la secuencia de complementación. El bucle mostrado aquí es TTGTT, pero podrían usarse otras secuencias. Su función es interrumpir el palíndromo de los tallos de modo que se favorezca la formación de un monómero de tipo piruleta frente a dimerización. La Tabla 512 también muestra donde se escinde la hebra sentido.

Otro ejemplo de uso de una ERU para escindir un ADN monocatenario implica la cadena ligera lambda humana. La tabla 515 muestra análisis de 128 cadenas ligeras lambda humanas con respecto a coincidencia con las cuatro sondas de 19 bases mostradas. Con tres o menos emparejamientos erróneos, 88 de 128 (69%) de las cadenas coinciden con una de las sondas. La tabla 515 también muestra adaptadores de ERU correspondientes a estas sondas. La hibridación de estos adaptadores con ADNmc de hebra superior de cadenas lambda y tratamiento con Fokl en presencia de FOKIact a una temperatura de o por encima de 45 ºC conducirá a escisión específica y precisa de las cadenas.

Las condiciones en las que las secuencias oligonucleotídicas cortas del primer método y las ERU del segundo método se ponen en contacto con los ADN monocatenarios pueden determinarse empíricamente. Las condiciones deben ser tales que el ADN monocatenario permanezca en forma sustancialmente monocatenaria. Más particularmente, las condiciones deben ser tales que el ADN monocatenario no forme bucles que pueden interferir con su asociación con la secuencia oligonucleotídica o la ERU o que puedan en sí mismas proporcionar sitios para escisión por la endonucleasa de restricción seleccionada.

La eficacia y especificidad de oligonucleótidos cortos (primer método) y ERU (segundo método) pueden ajustarse controlando las concentraciones de los oligonucleótidos/adaptadores de ERU y ADN de sustrato, la temperatura, el pH, la concentración de iones metálicos, la fuerza iónica, la concentración de caótropos (tales como urea y formamida), la concentración de la endonucleasa de restricción (por ejemplo, Fokl), y el momento de la digestión. Estas condiciones pueden utilizarse con oligonucleótidos sintéticos que tienen: 1) secuencias génicas de línea germinal diana, 2) secuencias génicas diana mutadas o 3) secuencias no diana algo relacionadas. El objetivo es

escindir la mayoría de las secuencias diana y cantidades mínimas de no dianas.

En la realización preferida de la presente descripción, el ADN monocatenario se mantiene sustancialmente en esa forma usando una temperatura entre 45 ºC y 75 ºC. Más preferentemente, se usa una temperatura entre 50 ºC y 60 ºC, más preferentemente entre 55 ºC y 60 ºC. Estas temperaturas se emplean tanto cuando se pone en contacto el ADN con el oligonucleótido o ERU como cuando se escinde el ADN usando los métodos de la presente descripción.

Los dos métodos de escisión de la presente descripción tienen varias ventajas. El primer método permite que los miembros individuales de la familia de ADN monocatenario se escindan solamente en un sitio de reconocimiento de endonucleasa sustancialmente conservado. El método tampoco requiere que se construya un sitio de reconocimiento de endonucleasa en los cebadores de amplificación o transcripción inversa. Puede usarse cualquier sitio nativo o sintético en la familia.

El segundo método tiene ambas de estas ventajas. Además, el método de ERU permite que los ADN monocatenarios se escindan en posiciones en las que ningún sitio de reconocimiento de endonucleasas aparece de forma natural o se ha construido de forma sintética.

Resulta más importante que ambos métodos de escisión permiten el uso de cebadores 5’ y 3’ para maximizar la diversidad y después escisión para eliminar secuencias no deseadas o deletéreas antes de clonación y presentación.

Después de escindir los ADN amplificados usando uno de los métodos de la presente invención, el ADN se prepara para clonación. Esto se realiza usando un adaptador de ADN sintético parcialmente bicatenario, cuya secuencia terminal se basa en el sitio de escisión específico en el que se ha escindido el ADN amplificado.

El ADN sintético se diseña de modo que cuando se liga con el ADN monocatenario escindido, permite que el ADN se exprese en la fase de lectura correcta para presentar el péptido, polipéptido o proteína deseado en la superficie de paquete genético. Preferentemente, la parte bicatenaria del adaptador comprende la secuencia de varios codones que codifican la secuencia de aminoácidos característica de la familia de péptidos, polipéptidos o proteínas hasta el sitio de escisión. Para cadenas pesadas humanas, se usan preferentemente los aminoácidos del armazón 3-23 para proporcionar las secuencias requeridas para expresión del ADN escindido.

Preferentemente, la parte bicatenaria del adaptador es de aproximadamente 12 a 100 bases de longitud. Más preferentemente, se usan aproximadamente 20 a 100 bases. La región bicatenaria del adaptador también contiene preferentemente al menos un sitio de reconocimiento de endonucleasas útil para clonación del ADN en un vector de presentación adecuado (o un vector receptor usado para archivar la diversidad). Este sitio de restricción de endonucleasas puede ser nativo de las secuencias génicas de línea germinal usadas para extender la secuencia de ADN. También puede construirse usando secuencias degeneradas de las secuencias génicas de línea germinal nativas. O puede ser completamente sintético.

La parte monocatenaria del adaptador es complementaria de la región de la escisión en el ADN monocatenario. El solapamiento puede ser de aproximadamente 2 bases hasta aproximadamente 15 bases. Cuanto más largo sea el solapamiento, más eficaz es probablemente la ligación. Una longitud preferida para solapamiento es de 7 a 10. Esto permite algunos emparejamientos erróneos en la región de modo que pueda capturarse diversidad en esta región.

La región monocatenaria o solapamiento del adaptador parcialmente bicatenario es ventajosa debido a que permite que se capture ADN escindido en el sitio seleccionado, pero no otros fragmentos. Tales fragmentos contaminarían la biblioteca con genes que codifican secuencias que no se pliegan en anticuerpos apropiados y probablemente son adhesivos de forma no específica.

Una ilustración del uso de un adaptador parcialmente bicatenario en los métodos de la presente descripción implica ligar dicho adaptador con una región FR3 humana que se ha escindido, como se ha descrito anteriormente, a 5’ACnGT-3’ usando HpyCH4III, Bst4CI o Taal.

La tabla 250 F.2 muestra la hebra inferior de la parte bicatenaria del adaptador para ligación con el ADN de hebra inferior escindido. Puesto que el sitio de HpyCH4III está tan lejos a la derecha (como se muestra en la Tabla 206), puede añadirse una secuencia que incluya el sitio Afill así como el Xbal. Esta parte de hebra inferior del adaptador parcialmente bicatenario, H43.XAExt, incorpora sitios tanto Xbal como Afill. La hebra superior de la parte bicatenaria del adaptador no tiene sitio (debido a emparejamientos erróneos planeados en los segmentos opuestos a los sitios Xbaly Afill de H43.XAExt), pero hibridará de forma muy estrecha con H43.XAExt. H43AExt contiene solamente el sitio Afill y debe usarse con las hebras superiores H43.ABrl y H43.ABr2 (que tienen alteraciones intencionadas para destruir el sitio Afill).

Después de la ligación, el ADN capturado deseado puede amplificarse por PCR de nuevo, si se desea, usando en la realización preferida un cebador para la región constante cadena abajo del gen de anticuerpo y un cebador para parte de la región bicatenaria del adaptador. Los cebadores también pueden portar sitios de endonucleasa de restricción para su uso en la clonación del ADN amplificado.

Después de ligación, y quizás amplificación, del adaptador parcialmente bicatenario con el ADN amplificado monocatenario, el ADN compuesto se escinde en sitios de reconocimiento de endonucleasa 5’ y 3’ seleccionados.

Los sitios de escisión útiles para clonación dependen del fago o fagémido en el que el casete se inserte y los sitios disponibles en los genes de anticuerpo. La Tabla 1 proporciona datos de endonucleasa de restricción para 75 cadenas ligeras humanas. La Tabla 2 muestra datos correspondientes para 79 cadenas pesadas humanas. En cada tabla, las endonucleasas se ordenan por frecuencia creciente de corte. En estas tablas Nch es el número de cadenas cortadas por la enzima y Ns es el número de sitios (algunas cadenas tienen más de un sitio).

A partir de este análisis, son muy adecuados Sfll, NotI, Aflll, ApaLI, y AscI. Sfily NotI se usan preferentemente en pCESl para insertar el segmento de presentación de cadena pesada. ApaLI y AscI se usan preferentemente en pCESl para insertar el segmento de presentación de cadena ligera.

Aparecen sitios BstEII en 97% de genes JH de línea germinal. En genes V reordenados, solo 54/79 (68%) de los genes de cadena pesada contienen un sitio BstEII y 7/61 de estos contienen dos sitios. Por lo tanto, 47/79 (59%) contienen un sitio BstEII sencillo. Una alternativa a usar BstEII es escindir mediante ERU al final de JH y ligar con un oligonucleótido sintético que codifica parte de CH1.

Un ejemplo de preparación de una familia de secuencias de ADN usando los métodos de la presente descripción implica capturar diversidad de CDR 3 humana. Como se ha descrito anteriormente, los ARNm de diversos pacientes autoinmunes se transcriben de forma inversa en ADNc de hebra inferior. Después de que se degrade el ARN de hebra superior, la hebra inferior se inmoviliza y se usa un oligonucleótido corto para escindir el ADNc cadena arriba de CDR 3. Se hibrida después un adaptador de ADN sintético parcialmente bicatenario con el ADN y el ADN se amplifica usando un cebador para el adaptador y un cebador para la región constante (después de FR4). El ADN se escinde después usando BstEII (en FR4) y una endonucleasa de restricción apropiada para el adaptador parcialmente bicatenario (por ejemplo Xba I y Aflll (en FR3)). El ADN se liga después en un esqueleto de VH sintético tal como 3-23.

Un ejemplo de preparación de un ADN monocatenario que se escindió usando el método de ERU implica la cadena Kappa humana. El sitio de escisión en la hebra sentido de esta cadena se representa en la Tabla 512. El oligonucleótido kapextURE se hibrida con los oligonucleótidos (kaBROlUR, kaBR02UR, kaBR03UR y kaBR04UR) para formar un ADN parcialmente bicatenario. Este ADN se liga después con las cadenas kappa solubles escindidas. El producto de ligación se amplifica después usando cebadores kapextUREPCR y CKForeAsc (que inserta un sitio AscI después del extremo de C kappa). Este producto se escinde después con ApaLI y AscI y se liga con vector receptor cortado de forma similar.

Otro ejemplo implica la escisión ilustrada en la Tabla 515. Después de la escisión, se hibridan un prolongador (ON_LamExi33) y cuatro oligonucleótidos puente (ON_LamBi-133, ON_LamB2-133, ON_LamB3-133 y ON_LamB4133) para formar un ADN parcialmente bicatenario. Ese ADN se liga con las hebras sentido de cadena lambda escindidas. Después de la ligación, el ADN se amplifica con ON_Lami33PCR y un cebador directo específico para el dominio constante lambda, tal como CL2ForeAsc o CL7ForeAsc (Tabla 130).

En cadenas pesadas humanas, se pueden escindir casi todos los genes en FR4 (cadena abajo, es decir, hacia el extremo 3’ de la hebra sentido, de CDR3) en un sitio BstEII que aparece en una posición constante en una fracción muy grande de genes V de cadena pesada humana. Se necesita después un sitio en FR3, si solamente debe capturarse diversidad de CDR3, en FR2, si se quiere diversidad de CDR2 y CDR3 o en FR1, si se quiere diversidad en todas las CDR. Estos sitios se insertan preferentemente como parte del adaptador parcialmente bicatenario.

El procedimiento preferido de la presente descripción es proporcionar vectores receptores que tengan sitios que permitan clonación de cadenas pesadas o ligeras. Tales vectores se conocen bien y se usan ampliamente en la técnica. Un vector de presentación de fagos preferido de acuerdo con la presente descripción es el fago MALIA3. Este se presenta en el gen III. La secuencia del fago MALIA3 se muestra en la Tabla 120A (anotada) y Tabla 120B (condensada).

El ADN que codifica las regiones seleccionadas de las cadenas ligeras o pesadas puede transferirse a los vectores usando endonucleasas que cortan cadenas ligeras o pesadas solamente de forma muy poco común. Por ejemplo, pueden capturarse cadenas ligeras con ApaLI y Ascl. Se clonan preferentemente genes de cadena pesada en un vector receptor que tenga sitios Sfil, Ncol, Xbal, Aflll, BstEII, Apal, y NotI. Las cadenas ligeras se mueven preferentemente a la biblioteca como fragmentos ApaLI-AscI. Las cadenas pesadas se mueven preferentemente a la biblioteca como fragmentos Sfil-NotI.

Más preferentemente, la presentación se realiza en la superficie de un derivado de fago M13. El vector más preferido contiene todos los genes de M13, un gen de resistencia a antibióticos, y el casete de presentación. El vector preferido se proporciona con sitios de restricción que permiten la introducción y escisión de miembros de la familia diversa de genes, como casetes. El vector preferido es estable frente a reordenamiento en las condiciones de crecimiento usadas para amplificar fagos.

En otra realización de la presente descripción, la diversidad capturada por los métodos de la presente descripción puede presentarse en un vector fagémido (por ejemplo, pCESl) que presenta el péptido, polipéptido o proteína en la proteína III. Tales vectores también pueden usarse para almacenar la diversidad con respecto a presentación posterior usando otros vectores o fagos.

En otra realización, el modo de presentación puede ser a través de un enlazador corto con tres posibles dominios de anclaje, siendo un dominio de anclaje la parte final de M13 III (“lllstump”), siendo un segundo anclaje la proteína madura de longitud completa III, y siendo el tercero la proteína madura M13 VIII.

El fragmento IIIstump contiene suficiente M13 III para ensamblarse en un fago pero no los dominios implicados en la mediación de infectividad. Debido a que las proteínas III y VIII de w.t. están presentes, el fago probablemente no suprima los genes de anticuerpo y el fago que sí suprime estos segmentos recibe solamente una ventaja de crecimiento muy pequeña. Para cada uno de los dominios de anclaje, el ADN codifica la secuencia de aminoácidos w.t., pero difieren de la secuencia de ADN w.t. en un grado muy alto. Esto reducirá en gran medida el potencial de recombinación homóloga entre el anclaje de presentación y el gen w.t. que también está presente.

Más preferentemente, la presente descripción usa un fago completo que porta un gen de resistencia a antibióticos (tal como un gen de resistencia a ampicilina) y el casete de presentación. Debido a que los genes III y VIII w.t. están presentes, también están presentes las proteínas w.t. El casete de presentación se transcribe a partir de un promotor regulable (por ejemplo, PLACZ). El uso de un promotor regulable permite el control de la relación del gen de presentación de fusión con la proteína de recubrimiento w.t. correspondiente. Esta relación determina el número medio de copias de la fusión de presentación por partícula de fago (o fagémido).

Otro aspecto de la descripción es un método de presentación de péptidos, polipéptidos o proteínas (y particularmente Fab) en fago filamentoso. En la realización más preferida este método presenta FAB y comprende:

a)obtener un casete que captura una diversidad de segmentos de ADN que codifican los elementos:

Preg::RBS1::SS1::VL::CL::parada::RBS2::SS2::VH::CH1::enlazador::anclaje::parada::,

en el que Preg es un promotor regulable, RBS1 es un primer sitio de unión a ribosomas, SSI es una secuencia señal operativa en la cepa hospedadora, VL es un miembro de un conjunto diverso de regiones variables de cadena ligera, CL es una región constante de cadena ligera, parada es uno o más codones de parada, RBS2 es un segundo sitio de unión a ribosoma, SS2 es una segunda secuencia señal operativa en la cepa hospedadora, VH es un miembro de un conjunto diverso de regiones variables de cadena pesada, CH1 es un primer dominio constante de cadena pesada de anticuerpo, enlazador es una secuencia de aminoácidos de uno a aproximadamente 50 restos, anclaje es una proteína que se ensamblará en la partícula de fago filamentoso y parada es un segundo ejemplo de uno o más codones de parada; y

b)posicionar ese casete dentro del genoma del fago para maximizar la viabilidad del fago y minimizar el potencial de deleción de la casete o partes de la misma.

El ADN que codifica la proteína de anclaje en el casete preferido anterior debería diseñarse para codificar la misma secuencia de aminoácidos (o una cercanamente relacionada) como se encuentra en una de las proteínas de recubrimiento del fago, pero con una secuencia de ADN distinta. Esto es para evitar recombinación homóloga no deseada con el gen w.t. Además, el casete debería situarse en la región intergénica. El posicionamiento y orientación del casete de presentación pueden influir en el comportamiento del fago.

En una realización de la descripción, puede situarse un terminador de la transcripción después de la segunda parada del casete de presentación anterior (por ejemplo, Trp). Esto reducirá la interacción entre el casete de presentación y otros genes en el vector de presentación de anticuerpos en fagos (PADV).

En otra realización de los métodos de la presente descripción, el fago o fagémido puede presentar proteínas distintas de Fab, reemplazando las partes de Fab indicadas anteriormente, con otros genes de proteínas.

Pueden usarse diversos hospedadores para el crecimiento del fago o fagémidos de presentación de la presente descripción. Tales hospedadores se conocen bien en la técnica. En la realización preferida, en la que se presentan Fab, el hospedador preferido debería crecer a 30 ºC y ser RecA-(para reducir recombinación genética no deseada) y EndA- (para hacer la recuperación de ADN RF más fácil). También debería preferirse que la cepa hospedadora se transforme fácilmente por electroporación.

XLl-Blue MRF’ satisface la mayoría de estas preferencias, pero no crece bien a 30 ºC. XLl-Blue MRF’ crece lentamente a 38 ºC y por lo tanto es un hospedador aceptable. TG-1 también es un hospedador aceptable aunque es RecA+ y EndA+. XL1-Blue MRF’ se prefiere más para el hospedador intermedio usado para acumular diversidad antes de la construcción final de la biblioteca.

Después de la presentación, las bibliotecas de la presente descripción pueden explorarse usando técnicas bien conocidas y usadas convencionalmente. Los péptidos, polipéptidos o proteínas seleccionados pueden usarse después para tratar enfermedad. Generalmente, los péptidos, polipéptidos o proteínas para su uso en terapia o en composiciones farmacéuticas se producen aislando el ADN que codifica el péptido, polipéptido o proteína deseado del miembro de la biblioteca seleccionado. Ese ADN se usa después en métodos convencionales para producir el péptido, polipéptidos o proteína que codifica en células hospedadoras apropiadas, preferentemente células hospedadoras de mamífero, por ejemplo, células CHO. Después de aislamiento, el péptido, polipéptido o proteína se usa solo o con composiciones farmacéuticamente aceptables en terapia para tratar enfermedad.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Captura de cadenas kappa con BsmAI:

Se preparó un repertorio de ARNm de cadena kappa humana tratando ARN total o poli(A+) aislado de una colección de pacientes que tienen diversas enfermedades autoinmunes con fosfatasa intestinal de ternero para retirar el fosfato 5’ de todas las moléculas que los tengan, tales como ARN ribosomal, ARNm fragmentado, ARNt y ADN genómico. El ARNm de longitud completa (que contiene una estructura de recubrimiento de 7-metilo protectora) no se ve afectado. El ARN se trata después con pirofosfatasa ácida de tabaco para retirar la estructura de recubrimiento de ARNm de longitud completa dejando un grupo 5’ monofosfato.

Los ARNm de longitud completa se modificaron con un adaptador en el extremo 5’ y después se transcribieron de forma inversa y se amplificaron usando el método y kit GeneRACE™ (Invitrogen). Se usó un cebador biotinilado 5’ complementario del adaptador y un cebador 3’ complementario de una parte de la región de la construcción.

Se inmovilizaron aproximadamente 2 microgramos (!g) de material RACE de gen de cadena kappa humana (Igkappa) con biotina unida en el extremo 5’ de la cadena superior en 200 microlitros (!l) de perlas magnéticas Seradyn. La hebra inferior se eliminó lavando el ADN con 2 alícuotas de 200 !l de NaOH 0,1 M (pH 13) durante 3 minutos para la primera alícuota seguido de 30 segundos para la segunda alícuota. Las perlas se neutralizaron con 200 !l de Tris 10 mM (pH 7,5) NaCl 100 mM. Los oligonucleótidos cortos mostrados en la Tabla 525 se añadieron en un exceso molar de 40 veces en 100 !l de tampón NEB 2 (NaCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, MgCl2 10 mM, ditiotreitol 1 mM pH 7,9) a las perlas secas. La mezcla se incubó a 95 ºC durante 5 minutos y después se enfrió a 55 ºC durante 30 minutos. Se retiró por lavado el exceso de oligonucleótidos con 2 lavados de tampón NEB 3 (NaCl 100 mM, Tris-HCl 50 mM, MgCl2 10 mM, ditiotreitol 1 mM pH 7,9). Se añadieron diez unidades de BsmAI (NEB) en tampón NEB 3 y se incubaron durante 1 hora a 55 ºC. El ADN cadena abajo escindido se recogió y purificó sobre una columna de purificación de PCR Qiagen (FIGURAS 3 y 4).

Se preparó un adaptador parcialmente bicatenario usando el oligonucleótido mostrado en la Tabla 525. El adaptador se añadió al ADN monocatenario en exceso molar de 100 veces junto con 1000 unidades de ADN ligasa T4 (NEB) y se incubó durante una noche a 16 ºC. El oligonucleótido en exceso se retiró con una columna de purificación de PCR Qiagen. El material ligado se amplificó por PCR usando los cebadores kapPCRtl y kapfor mostrados en la Tabla 525 durante 10 ciclos con el programa mostrado en la Tabla 530.

El producto de PCR soluble se procesó en un gel y mostró una banda de aproximadamente 700 n, como se esperaba (FIGURAS 5 y 6). El ADN se escindió con enzimas ApaLI y AscI, se purificó en gel y se ligó con vector pCESl escindido de forma similar. La presencia del inserto de tamaño correcto se comprobó mediante PCR en varios clones como se muestra en la FIGURA 15.

La Tabla 500 muestra la secuencia de ADN de una cadena ligera kappa capturada por este procedimiento. La Tabla 501 muestra una segunda secuencia capturada por este procedimiento. La secuencia puente más cercana era complementaria de la secuencia 5’-agccacc-3’, pero la secuencia capturada es 5’-Tgccacc-3’, lo que muestra que se tolera algún emparejamiento erróneo en la región solapada.

Ejemplo 2: Construcción de Diversidad de CDR1 y CDR2 sintética en armazón V-3-23 VH

Se construyó una diversidad de Región Determinante de Complementariedad (CDR) 1 y 2 sintética en el armazón VH 3-23 en un procedimiento de dos etapas: en primer lugar, se construyó un vector que contenía el armazón VH 323, y después, se ensambló una CDR 1 y 2 sintética y se clonó en este vector.

Para construcción del armazón V3-23, se diseñaron 8 oligonucleótidos y dos cebadores de PCR (oligonucleótidos largos: TOPFR1A, BOTFR1B, BOTFR2, BOTFR3, F06, BOTFR4, ON-vgCl, y ON-vgc2 y cebadores: SFPRMET y BOTPCRPRIM, mostrados en la Tabla 600) que solapan basándose en la secuencia de Genebank de VH V323. El diseño incorporó al menos un sitio de restricción útil en cada región flanqueante, como se muestra en la Tabla 600. En la Tabla 600, los segmentos que se sintetizaron se muestran en negrita, las regiones solapantes están subrayadas, y las regiones de cebadores de PCR en cada extremo están subrayadas. Se combinó una mezcla de estos ocho oligonucleótidos a una concentración final de 2,5 !M en una Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) de 20 !l. La mezcla de PCR contenía dNTP 200 !M, MgCl2 2,5 mM, ADN Polimerasa Pfu Turbo™ 0,02 U, ADN Polimerasa Taq HotStart Qiagen 1U y tampón de PCR Qiagen 1X. El programa de PCR consistía en 10 ciclos de 94 ºC durante 30 segundos, 55 ºC durante 30 segundos y 72 ºC durante 30 segundos. La secuencia de ADN ensamblada V3-23 se amplificó después, usando 2,5 !l de una dilución 10 veces de la PCR inicial en reacción de PCR de 100 !l. La reacción de PCR contenía dNTP 200 !M, MgCl2 2,5 mM, ADN Polimerasa Pfu Turbo™ 0,02 U, ADN Polimerasa Taq HotStart Qiagen 1U, tampón de PCR Qiagen 1X y 2 cebadores externos (SFPRMET y BOTPCRPRIM) a una concentración de 1 !M. El programa de PCR consistió en 23 ciclos a 94 ºC durante 30 segundos, 55 ºC durante 30 segundos y 72 ºC durante 60 segundos. La secuencia de ADN VH V3-23 se digirió y se clonó en pCES1 (vector fagémido) usando los sitios de endonucleasas de restricción Sfily BstEII (Todas las enzimas de restricción mencionadas en la presente memoria se proporcionaron por New England BioLabs, Beverly, MA y se usaron según las instrucciones del fabricante).

Se introdujeron secuencias de relleno (mostradas en la Tabla 610 y Tabla 620) en pCES1 para reemplazar

secuencias CDR1/CDR2 (900 bases entre sitios de ER BspEI y Xbal) y secuencias de CDR3 (358 bases entre Aflll y BstEII), antes de clonar la diversidad de CDR1/CDR2. El nuevo vector es pCES5 y su secuencia se proporciona en la Tabla 620. Tener rellenos en lugar de las CDR evita el riesgo de que una secuencia parental esté sobrerrepresentada en la biblioteca. El relleno de CDR1-2 contiene sitios de restricción para Bglll, Bsu36I, Bell, Xcml,

5 Mlul, PwII, Hpal, y HincII, siendo los sitios subrayados únicos dentro del vector pCES5. El relleno que reemplaza CDR3 contiene el sitio de endonucleasa de restricción único RsrII. Las secuencias de relleno son fragmentos del gen de penicilasa de E. coli.

Para la construcción de la diversidad de CDR1 y CDR2, se diseñaron 4 oligonucleótidos solapantes (ON-vgCl, ON_Brl2, ON__CD2Xba y ON-vgC2, mostrados en la Tabla 600 y Tabla 630) que codifican CDR1/2, más regiones 10 flanqueantes. Se combinó una mezcla de esos 4 oligonucleótidos a una concentración final de 2,5 !M en una reacción de PCR de 40 !l. Dos de los 4 oligonucleótidos contenían secuencias abigarradas posicionadas en la CDR1 y la CDR2. La mezcla de PCR contenía dNTP 200 !M, ADN Polimerasa Pwo 2,5 U (Roche) y tampón de PCR Pwo 1X con MgSO4 2 mM. El programa de PCR consistía en 10 ciclos a 94 ºC durante 30 segundos, 60 ºC durante 30 segundos, y 72 ºC durante 60 segundos. Esta secuencia de ADN de CDR1/2 ensamblada se amplificó, usando

15 2,5 !l de la mezcla en reacción de PCR de 100 !l. La reacción de PCR contenía dNTP 200 !M, ADN Polimerasa Pwo 2,5 U, tampón de PCR Pwo 1X con MgSO4 2 mM y 2 cebadores externos a una concentración de 1 !M. El programa de PCR consistía en 10 ciclos a 94 ºC durante 30 segundos, 60 ºC durante 30 segundos, y 72 ºC durante 60 segundos. Estas secuencias abigarradas se digirieron y clonaron en el armazón de V3-23 en lugar del relleno de CDR1/2.

20 Los inventores obtuvieron aproximadamente 7 X 107 transformantes independientes. En esta diversidad, los inventores pueden clonar diversidad de CDR3 a partir de poblaciones donantes o de ADN sintético.

Se entenderá que lo anterior es solamente ilustrativo de los principios de la presente descripción y que pueden realizarse diversas modificaciones por los expertos en la materia sin alejarse del alcance y el espíritu de la descripción.

Claims (23)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para preparar ácidos nucleicos, comprendiendo el método las etapas de:

   (i)

   amplificar un ácido nucleico usando un cebador complementario de al menos parte de una secuencia sintética localizada en el extremo 5’ de la secuencia de ácido nucleico;

   (ii)

   hacer el ácido nucleico amplificado monocatenario;

   (iii) poner en contacto el ácido nucleico monocatenario amplificado con un oligonucleótido monocatenario, siendo el oligonucleótido monocatenario complementario del ácido nucleico monocatenario en una región en la que se desea escisión, en el que el ácido nucleico monocatenario y el oligonucleótido monocatenario se asocian para formar una región localmente bicatenaria del ácido nucleico monocatenario, en el que la región localmente bicatenaria comprende un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción, y

   (iv) escindir el ácido nucleico en el sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción, en el que la escisión comprende poner en contacto una endonucleasa de restricción con la región localmente bicatenaria, en la que la endonucleasa de restricción es específica del sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción, y en el que la escisión elimina todos los nucleótidos 5’ no deseados del ácido nucleico;

   realizándose las etapas de contacto y escisión a una temperatura entre 45 ºC y 75 ºC, en el que el ácido nucleico monocatenario y el oligonucleótido monocatenario se asocian para formar una región localmente bicatenaria del ácido nucleico monocatenario y en el que la endonucleasa de restricción está activa a la temperatura seleccionada entre 45 ºC y 75 ºC.
2. 2.Un método para preparar ácidos nucleicos, comprendiendo el método las etapas de:

   (i)

   hacer un ácido nucleico monocatenario;

   (ii)

   poner en contacto la secuencia de ácido nucleico monocatenario con un oligonucleótido monocatenario, siendo el oligonucleótido monocatenario complementario del ácido nucleico monocatenario en una región en la que se desea escisión, en el que el ácido nucleico monocatenario y el oligonucleótido monocatenario se asocian para formar una región localmente bicatenaria del ácido nucleico monocatenario, en el que la región localmente bicatenaria comprende un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción; y

   (iii) escindir el ácido nucleico en el sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción, en el que la escisión comprende poner en contacto una endonucleasa de restricción con la región localmente bicatenaria, en la que la endonucleasa de restricción es específica para el sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción, y en el que la escisión elimina todos los nucleótidos 5’ no deseados del ácido nucleico;

   realizándose las etapas de contacto y escisión a una temperatura entre 45 ºC y 75 ºC en el que el ácido nucleico monocatenario y el oligonucleótido monocatenario se asocian para formar una región localmente bicatenaria del ácido nucleico monocatenario y en el que la endonucleasa de restricción es activa a la temperatura seleccionada entre 45 ºC y 75 ºC.
3. 3.Un método para preparar ácidos nucleicos, comprendiendo el método las etapas de:

   (i)

   amplificar una secuencia de ácido nucleico usando un cebador complementario de al menos parte de una secuencia sintética localizada en el extremos 5’ de la secuencia de ácido nucleico;

   (ii)

   hacer el ácido nucleico amplificado monocatenario;

   (iii) poner en contacto el ácido nucleico monocatenario amplificado con un oligonucleótido parcialmente bicatenario, en el que una región monocatenaria del oligonucleótido es complementaria del ácido nucleico en una región en la que se desea escisión y una región bicatenaria del oligonucleótido comprende un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción Tipo II-S, cuyo sitio de escisión se localiza a una distancia conocida del sitio de reconocimiento en el que se desea la escisión del ácido nucleico, en el que el ácido nucleico monocatenario y la región monocatenaria del oligonucleótido parcialmente bicatenario se asocian para formar una región localmente bicatenaria, en la que la región localmente bicatenaria comprende un sitio de escisión de endonucleasa de restricción; y

   (iv) escindir el ácido nucleico en el sitio de escisión Tipo II-S en el que la escisión comprende poner en contacto una endonucleasa de restricción con el sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción en la región bicatenaria del oligonucleótido, en el que la endonucleasa de restricción es específica del sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción y en el que la escisión elimina todos los nucleótidos 5’ no deseados del ácido nucleico;

   realizándose las etapas de contacto y escisión a una temperatura entre 45 ºC y 75 ºC, en el que el ácido nucleico monocatenario y la parte monocatenaria del oligonucleótido parcialmente bicatenario se asocian para formar una región localmente bicatenaria del ácido nucleico monocatenario, y en el que la endonucleasa de restricción es activa a la temperatura seleccionada entre 45 ºC y 75 ºC.
4. 4.Un método para preparar ácidos nucleicos, comprendiendo el método las etapas de:

   (i)

   hacer una secuencia de ácido nucleico monocatenaria;

   (ii)

   poner en contacto el ácido nucleico monocatenario con un oligonucleótido parcialmente bicatenario, en el que una región monocatenaria del oligonucleótido es complementaria del ácido nucleico en una región en la que se desea escisión, y una región bicatenaria del oligonucleótido que tiene un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de Tipo II-S, cuyo sitio de escisión se localiza a una distancia conocida del sitio de reconocimiento en el que se desea la escisión del ácido nucleico, en el que el ácido nucleico monocatenario y la región monocatenaria del oligonucleótido parcialmente bicatenario se asocia para formar una región localmente bicatenaria, en la que la región localmente bicatenaria comprende un sitio de escisión de endonucleasa de restricción; y

   (iii) escindir el ácido nucleico en la escisión de Tipo II-S en la que la escisión comprende poner en contacto una endonucleasa de restricción con la región bicatenaria del oligonucleótido, en el que la endonucleasa de restricción es específica para el sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción, y en el que la escisión elimina todos los nucleótidos 5’ no deseados del ácido nucleico;

   realizándose las etapas de contacto y escisión a una temperatura entre 45 ºC y 75 ºC en el que el ácido nucleico monocatenario y el oligonucleótido monocatenario se asocian para formar una región localmente bicatenaria del ácido nucleico monocatenario, y en el que la endonucleasa de restricción es activa a la temperatura seleccionada entre 45 ºC y 75 ºC.
5. 5.Un método para realizar una biblioteca que comprende las siguientes etapas:

   (a)

   preparación de una colección de ácidos nucleicos que codifican al menos en parte miembros de la familia diversa, comprendiendo la preparación las siguientes etapas:

   (i)

   amplificar una recogida de secuencias de ácido nucleico usando un cebador complementario de al menos parte de una secuencia sintética localizada en el extremo 5’ de la secuencia de ácido nucleico;

   (ii) hacer los ácidos nucleicos amplificados monocatenarios;

   (iii) poner en contacto los ácidos nucleicos monocatenarios amplificados con un oligonucleótido monocatenario, siendo el oligonucleótido monocatenario complementario de los ácidos nucleicos monocatenarios en una región en la que se desea escisión, en la que los ácidos nucleicos monocatenarios y el oligonucleótido monocatenario se asocian para formar una región localmente bicatenaria de los ácidos nucleicos monocatenarios, en la que la región localmente bicatenaria comprende un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción, y

   (iv)

   escindir los ácidos nucleicos en el reconocimiento de endonucleasa de restricción, en el que la escisión comprende poner en contacto una endonucleasa de restricción con la región localmente bicatenaria, en la que la endonucleasa de restricción es específica para el sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción, y en el que la escisión elimina todos los nucleótidos 5’ no deseados de los ácidos nucleicos;

   realizándose las etapas de contacto y escisión a una temperatura entre 45 ºC y 75 ºC en el que los ácidos nucleicos monocatenarios y el oligonucleótido monocatenario se asocian para formar una región localmente bicatenaria del ácido nucleico monocatenario, y en el que la endonucleasa de restricción está activa a la temperatura seleccionada entre 45 ºC y 75 ºC; y

   (b)

   expresión de la colección de ácidos nucleicos de la etapa (a) por una colección de paquetes genéticos que presentan un miembro de una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas y que presentan colectivamente al menos una parte de la familia, en la que los péptidos, polipéptidos o proteínas presentados se codifican al menos en parte por los ácidos nucleicos escindidos en la superficie del paquete genético y presentan colectivamente al menos una parte de la diversidad de la familia.

6. 6.Un método para preparar una biblioteca que comprende las siguientes etapas:

   (a)

   preparación de una colección de ácidos nucleicos que codifican, al menos en parte, miembros de la familia diversa, comprendiendo la preparación las siguientes etapas:

   (i)

   amplificar una colección de secuencias de ácido nucleico usando un cebador complementario de al menos parte de una secuencia sintética localizada en el extremo 5’ de las secuencias de ácido nucleico;

   (ii) hacer los ácidos nucleicos amplificados monocatenarios;

   (iii) poner en contacto los ácidos nucleicos monocatenarios amplificados con un oligonucleótido parcialmente bicatenario, en el que una región monocatenaria del oligonucleótido es complementaria de los ácidos nucleicos en una región en la que se desea escisión, y una región bicatenaria del oligonucleótido comprende un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de Tipo II-S, cuyo sitio de escisión se localiza a una distancia conocida del sitio de reconocimiento en el que se desea escisión de los ácidos nucleicos, en el que los ácidos nucleicos monocatenarios y la región monocatenaria del oligonucleótido parcialmente bicatenario se asocian para

   formar una región localmente bicatenaria, en la que la región localmente bicatenaria comprende un sitio de escisión de endonucleasa de restricción; y

   (iv)

   escindir los ácidos nucleicos en el sitio de escisión de Tipo II-S en el que la escisión comprende poner en contacto una endonucleasa de restricción con el sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción en la región bicatenaria del oligonucleótido, en el que la endonucleasa de restricción es específica para el sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción, y en el que la escisión retira todos los nucleótidos 5’ no deseados de los ácidos nucleicos;

   realizándose las etapas de contacto y escisión a una temperatura entre 45 ºC y 75 ºC, en el que los ácidos nucleicos monocatenarios y el oligonucleótido monocatenario se asocian para formar una región localmente bicatenaria de los ácidos nucleicos monocatenarios, y en el que la endonucleasa de restricción está activa a la temperatura seleccionada entre 45 ºC y 75 ºC; y

   (b)

   expresar la colección de ácidos nucleicos de la etapa (a) por una colección de paquetes genéticos que presentan un miembro de una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas y que presentan colectivamente al menos una parte de la familia, en la que los péptidos, polipéptidos o proteínas presentados se codifican al menos en parte por los ácidos nucleicos escindidos en la superficie del paquete genético y que presentan colectivamente al menos una parte de la diversidad de la familia.

7. 7.El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que los ácidos nucleicos codifican al menos una parte de una inmunoglobulina.
8. 8.El método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la inmunoglobulina comprende un Fab o un Fv de cadena sencilla.
9. 9.El método de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en el que la inmunoglobulina comprende al menos una parte de una cadena pesada.
10. 10.El método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que al menos una parte de la cadena pesada es humana.
11. 11.El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que la inmunoglobulina comprende al menos una parte de FR1.
12. 12.El método de acuerdo con la reivindicación 11, en el que al menos una parte de la FR1 es humana.
13. 13.El método de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en el que la inmunoglobulina comprende al menos una parte de una cadena ligera.
14. 14.El método de acuerdo con la reivindicación 13, en el que al menos una parte de la cadena ligera es humana.
15. 15.El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que las secuencias de ácido nucleico derivan al menos en parte de pacientes que padecen al menos una enfermedad autoinmune o cáncer.
16. 16.El método de acuerdo con la reivindicación 15, en el que la enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que consiste en lupus eritematoso, esclerosis sistémica, artritis reumatoide, síndrome antifosfolipídico o vasculitis.
17. 17.El método de acuerdo con la reivindicación 15, en el que los ácidos nucleicos se aíslan al menos en parte del grupo que comprende células de sangre periférica, células de médula ósea, células del bazo o células de ganglios linfáticos.
18. 18.El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la temperatura está entre 55 ºC y 60 ºC.
19. 19.El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 5, en el que la longitud del oligonucleótido monocatenario está entre 17 y 30 bases.
20. 20.El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 5, en el que la endonucleasa de restricción se selecciona del grupo que comprende: Maelll, Tsp451, Hphl, BsaJI, Alul, Dlpl, Ddel, Bglll, MslI, BsiEl, Eael, Eagl, Haelll, Bst4CI, HpyCH4IIl, Hinfl, Mlyl, Plel, MalI, HpyCH4V, Bsm AI, Bpml, Xmnl, o SacI.
21. 21.El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 y 6, en el que la longitud de la región monocatenaria del oligonucleótido parcialmente bicatenario está entre 14 y 22 bases.
22. 22.El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 y 6, en el que la longitud de la parte bicatenaria del oligonucleótido parcialmente bicatenario está entre 10 y 14 pares de bases formados por un tallo y su palíndromo.
23. 23.El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 y 6, en el que la endonucleasa de restricción de Tipo II-S se selecciona del grupo que comprende AarlCAC, Acelll, Bbr7I, Bbvl, BbvII, Bce83I, BceAI, Bcefl, BciVI, Bfil, BinI, BscAI, BseRI, BsmFI, BspMI, Ecil, Eco57I, Raul, Fokl, Gsul, Hgal, Hphl, MboII, Mlyl, Mmel,

    Mnli, Plel, RleAI, SfaNI, SspD5I, Sthl32I, StsI, Taqll, Tthl 1 HI, o UbaPI.

    Tabla 1: Escisión de 75 cadenas ligeras humanas

    * La escisión se produce en la hebra superior después de la última base en mayúsculas. Para ER que cortan secuencias palidrómicas, la hebra inferior se corta en el sitio simétrico.

    Tabla 2: Escisión de 79 cadenas pesadas humanas

    Tabla 5: Uso de Fokl como una "enzima de restricción universal"

    Tabla 8: Coincidencias con adaptadores de FR3 de ERU en 79 HC humanas

    A. Lista de genes de cadenas pesadas de los que se han tomado muestras

    Tabla 8B. Ensayo de todos los GLG distintos de bases 89.1 a 93.2 del dominio variable pesado

    Tabla 8C Secuencias de reconocimiento de ERU más importantes en FR3 pesada

    Tabla 8D, ensayo de 79 genes de V HC humanos con cuatro sondas Número de secuencias ……………………….79 Nümero de bases…………………………..29143

    Número de emparejamiento erróneos

    Una secuencia tiene cinco emparejamientos erróneos con secuencias 2, 4 y 9; se puntuó como mejor para 2.

    Id es el número de adaptador.

    Mejor es el número de secuencia para el que el adaptador identificado era el mejor disponible.

    El resto de la tabla muestra lo bien que las secuencias coinciden con los adaptadores. Por ejemplo, hay 11 secuencias que coinciden con VHSzy1 (Id=1) con 2 emparejamientos erróneos y son peores para todos los demás adaptadores. En esta muestra, 90% quedan a una distancia de dos bases de uno de los cuatro adaptadores.

    Tabla 130: Cebadores de PCR para amplificación de genes Ab humanos

    Tabla 195: Secuencias FR3 GLG humanas

    Tabla 250: Adaptadores de ER, prolongadores y puentes usados para escisión y captura de cadenas pesadas humanas en FR3.

    A: Sondas de HpyCH4V de genes HC humanos reales !HpyCH4V en FR3 de HC humana, bases 35-56; solo los que tienes sitio TGca TGca;10 reconocimiento de ER: tgca de longitud 4 se espera en 10

    B: HpyCH4V adaptadores de ER, prolongadores y puentes

    B.1. Adaptadores de ER

    ! Corte hebra inferior HC: ! TmKeller para NaCl 100 mM, formamida cero

    B.2 Segmento de gen 3-23 sintético en el que debe clonarse CDR3 capturada

    B.3 Prolongador y puentes

    ! Prolongador (hebra inferior)

    ! Puentes (hebra superior, solapamiento de 9 bases):

    C. Sondas de BlpI de GLG HC humanos

    D: BlpI adaptadores de ER, extensores y puentes

    D.1. Adaptadores de ER

    D.2 Segmento de gen 3-23 sintético en el que debe clonarse CDR3 capturada

    D.3 Prolongador y puentes

    ! Puentes

    ! Prolongador

    E. HpyCH4III Secuencias GLG distintas que rodean el sitio, bases 77-98

    F. HpyCH4III adaptadores de ER, prolongadores y puentes

    F. 1. Adaptadores de ER

    ! ON para escisión de HC (inferior) en FR3 (bases 77-97) ! Para escisión con HpyCH4III, Bst4CI o TaaI ! La escisión es en la cadena inferior antes de la base 88.

    F.2 Prolongador y puentes

    ! Se añaden sitios XbaI y AflIII en puentes

    ! Se añaden sitios XbaI y AflIII en puentes

    Tabla 510

    Tabla 600: Armazón VH V3-23 con codones abigarrados mostrados

    Tabla 800 (nueva) La siguiente lista de enzimas se tomó de http://rebase.neb.com/cgi-bin/asymmlist. Se han eliminado las enzimas que a) cortan dentro del reconocimiento, b) cortan en ambos lados del reconocimiento

    o c) tienen menos de 2 bases entre el sitio de reconocimiento y el sitio de corte más cercano. Enzimas REBASE 13/04/2001 Enzimas de restricción de tipo II con secuencias de reconocimiento asimétricas

    La anotación es ^ significa corte de la hebra superior y _ corte de la hebra inferior. Si la hebra superior e inferior se cortan en el mismo lugar, entonces solamente aparece ^.

    Tabla 120: MALIA3, anotada

    ! De BstEII en adelante, pV323 es igual que pCES1, excepto como se observa. ! Los sitios BstEII pueden aparecer en cadenas ligeras; probablemente no sean únicos en el ! vector final.

    AUSENTE EN EL MOMENTO DE PUBLICACIÓN

    Tabla 120B: Secuencia de MALIA3, condensada

    Tabla 200: Enzimas que cortan 15 o más GLG humanos o tienen reconocimiento de +5 bases en FR3 Entrada típica: Reconocimiento de nombre de ER #sitios

    Tabla 206: FR3 3-23 sintética de cadenas pesadas humanas que muestran posiciones de posibles sitios de escisión ! Los sitios introducidos por ingeniería genética en el gen sintético se muestran en ADN en ! mayúsculas con el nombre de la ER entre barras verticales (como en ∀ XbaI ∀) ! Las RER frecuentemente halladas en GLG se muestran debajo de la secuencia sintética ! con el nombre a la derecha (como en gtn ac = MaeIII (24), que indica que ! 24 de los 51 GLG contiene el sitio).

    Tabla 217: Secuencias FR1 de GLG HC humanas Exón VH - Alineamientos de secuencias de nucleótidos

    Tabla 220: Sitios SRER en FR1 de GLG HC humanas en las que hay al menos 20 GLG cortados

    Tabla 255: Análisis de frecuencia de adaptadores de ER coincidentes en genes V reales

    HpyCH4V en HC en las bases 35-56 A: Secuencias con el sitio ER esperado solamente ………………..1004

    (Se cuentan solamente casos con 4 o menos emparejamientos erróneos)Secuencias con solamente un sitio inesperado …………………...…0Secuencias con tanto esperados como inesperados ………………48

    (Se cuentan solamente casos con 4 o menos emparejamientos erróneos)Secuencias sin sitios …………………………………………………….0

    Secuencias con el sitio ER esperado solamente ………….. 597 (contando secuencias con 4 o menos emparejamiento erróneos)Secuencias con solamente un sitio inesperado……………….2Secuencias con tanto esperados como inesperados…………2Secuencias sin sitios…………………………………………..686

    HpyCH4III, Bst4CI o Taal en HCC:

    En la puntuación de si está presente el sitio ER de interés solo se cuentan ON que tengan 4 o menos emparejamientos erróneosNúmero de secuencias ………………………1617

    Secuencias con el sitio ER esperado solamente ………….1511 Secuencias con solamente un sitio inesperado………………..0

    Tabla 255B Secuencias con tanto esperadas como inesperadas …..8 Secuencias sin sitios……………………………………………0 Análisis repetido usando solamente los 8 mejores adaptadores de ER

    Secuencias con el sitio ER esperado solamente ………….. 1463/1617 Secuencias con solamente un sitio inesperado………………….0 Secuencias con tanto esperados como inesperados …………..7 Secuencias sin sitios ……………………………………………….0

    Tabla 300: GLG FR1 kappa

    Tabla 302: Sitios SRER hallados en GLG FR1 kappa humanos, continuación

    AUSENTE EN EL MOMENTO DE PUBLICACIÓN

    Tabla 500: h3401-h2 capturado mediante CJ con BsmAI Tabla 501: H3401-d8 KAPPA capturado con CJ y BsmAI

    Tabla 508: Bases de cadenas pesadas humanas 88.1 a 94.2Número de secuencias ……….840

    Tabla 512: Kappa, bases 12-30

    Tabla 512: Kappa, bases 12-30

    Tabla 515: Bases de adaptadores de ERU lambda 13.3 a 19.3! Número de secuencias ………………..128!

    Lo que sucede en la hebra superior

    Tabla 525 ON usados en la captura de cadenas ligeras kappa usando método CJ y BsmAI Todos los ON se escriben en 5' a 3'

    Adaptadores de ER (6)

    Puentes (6)

    Prolongador (biotinilado 5')

    Cebadores

    Tabla 530Programa de PCR para amplificación de ADN kappa95ºC 5 minutos 95ºC 15 segundos 65ºC 30 segundos 72ºC 1 minuto 72ºC 17 minutos 4ºC mantenimiento

    Reactivos (reacciones 100 !l)

    Molde 50 ng Tampón de PCr turbo 10x 1x turbo Pfu 4U dNTP 200 !M cada uno kaPCRt1 300 nM kapfor 300 nM

    Tabla 620: Secuencia de ADN de pCES5! 6680 bases de pCES5 = pCes4 con rellenos en CDR1-2 y CDR3 13.12.2000!! Ngen = 6680! ER útiles (cortan MAnoLI menos de 3 veces) 05.06.2000

    Tabla 630: Oligonucleótidos usados para clonar diversidad de CDR1/2Todas las secuencias son 5' a 3'

    Final de tablas