PT2308982E - Métodos para construir bibliotecas de pacotes genéticos que representam os membros de uma família diversificada de péptidos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"MÉTODOS PARA CONSTRUIR BIBLIOTECAS DE PACOTES GENÉTICOS QUE REPRESENTAM OS MEMBROS DE UMA FAMÍLIA DIVERSIFICADA DE PÉPTIDOS" A presente invenção refere-se a métodos, tal como definido nas reivindicações, para a construção de bibliotecas de pacotes genéticos que apresentam um membro de uma família diversa de péptidos, polipéptidos ou proteínas e que coletivamente exibem, pelo menos, uma parte da diversidade da família. Numa forma de realização preferida, os polipéptidos indicados são Fab humanos.

Mais especificamente, os métodos da invenção referem-se à clivagem dos ácidos nucleicos de cadeia simples em locais escolhidos, codificando os ácidos nucleicos clivados, pelo menos em parte, os péptidos, polipéptidos ou proteínas apresentados nos pacotes genéticos das bibliotecas da invenção. Numa forma de realização preferida, os pacotes genéticos são fagos filamentosos ou fagemídeos. A presente especificação descreve métodos de seleção de bibliotecas de pacotes genéticos que apresentam péptidos úteis, polipéptidos e proteínas e os péptidos, polipéptidos e proteínas identificadas por tal seleção.

Antecedentes da Invenção

Atualmente, é prática corrente na técnica de preparar bibliotecas de pacotes genéticos que apresentam um membro de uma família diversa de péptidos, polipéptidos ou proteínas e que coletivamente apresentam, pelo menos, uma porção da diversidade da família. Em muitas bibliotecas comuns, os péptidos, polipéptidos ou proteínas estão relacionadas com anticorpos. Frequentemente, eles são Fab ou anticorpos de cadeia simples.

Em geral, os DNAs que codificam membros das famílias a serem apresentados devem ser amplificados antes de serem clonados e usados para apresentar o membro desejado na superfície de um pacote genético. Tal amplificação tipicamente faz uso de primers diretos e inversos.

Tais primers podem ser complementares a sequências nativas do DNA a ser amplificado ou complementares a oligonucleótidos ligados nas extremidades 5' ou 3' desse DNA. Os primers que são complementares às sequências nativas ao DNA a ser amplificado têm a desvantagem de darem preferência aos membros das famílias a serem apresentados. Serão amplificados apenas os membros que contêm uma sequência no DNA nativo que é substancialmente complementar ao primer. Aqueles que não vão estar ausentes da família. Para os membros que são amplificados, qualquer diversidade dentro da região do primer será suprimida.

Por exemplo, na patente Europeia 368, 684 Bl, o primer que é utilizado encontra-se na extremidade 5' da região VH de um gene de anticorpo. Ele liga-se a uma região da sequência de DNA nativa que é considerada "suficientemente bem conservada" dentro de uma única espécie. Esse primer terá preferência para com os membros amplificados em relação aos que possuem esta região "conservada". Qualquer diversidade dentro desta região é eliminada. É geralmente aceite que os genes de anticorpos humanos surgem através de um processo que envolve uma seleção combinatória de V e J ou V, D e J, seguido por mutações somáticas. Embora a maior diversidade ocorre nas regiões determinantes de complementaridade (CDRs, do inglês Complementary Determinant Regions), esta diversidade também ocorre nas regiões estruturais mais conservadas (FRs, Framework Regions) e, pelo menos, alguma desta diversidade confere ou potência a ligação especifica de antigénios (Ag) . Como consequência, as bibliotecas devem conter a maior diversidade de CDRs e FRs que seja possível.

Para clonar os DNAs amplificados para a apresentação num pacote genético dos péptidos, polipéptidos ou proteínas que eles codificam, os DNAs deve ser clivados de modo a originar extremidades adequadas para ligação a um vetor. Esta clivagem é geralmente efetuada utilizando locais de reconhecimento de endonucleases de restrição inseridos nos primers. Quando os primers se encontram na extremidade 5' do DNA produzido a partir da transcrição reversa do RNA, tal restrição produz efeitos deletérios nas regiões 5' não traduzidas do DNA amplificado. Estas regiões interferem com a expressão dos genes clonados e, assim, a apresentação dos péptidos, polipéptidos e proteínas codificadas por eles.

Zhu D., Analytical Biochemistry, Vol. 177 (1), 1989, páginas 120-124, descreve a clivagem direcionada por oligodesoxinucleótido e a reparação de um vetor de cadeia simples, um método de mutagénese específica de um lócus.

Thielking V et ai., Biochemistry, Vol. 29 (19), 1990, páginas 4682-4691, descreve a precisão da ligação endonuclease de restrição ECO-RI e os estudos de clivagem com substratos oligodesoxinucleotídos contendo sequências de reconhecimento degeneradas.

Alves Juergen et ai., Biochemistry, Vol. 34 (35), 1995, páginas 11191-11197, descreve a precisão da endonuclease de restrição de EcoRV em estudos de ligação e de clivagem com substratos oligodesoxinucleótidos que contêm sequências de reconhecimento degeneradas.

Kim S. C. et ai., Science, Vol. 240, No. 4851, 1988, páginas 504-506, descreve clivagem do DNA em qualquer local pré-determinado usando um primer-adaptador e as enzimas de restrição da classe IIS.

Podhajska A.J. W. & Szybalski, Gene, Vol. 40 (2-3), 1985, páginas 175-182, descreve a conversão dos locais da endonuclease FOK-I para uma clivagem de uma enzima de restrição universal no DNA do fago M-13-MP-7 em locais predeterminados. O documento WO 97/20923 descreve a preparação de uma biblioteca combinatória de vários vetores de expressão de genes de anticorpos. O documento WO 97/49809 descreve polipéptidos capazes de formar estruturas de ligação ao antigénio com especificidade para os antigénios Rhesus D, o DNA que os codifica e o processo para a sua preparação e utilização.

Sumário da Invenção É objetivo da presente invenção disponibilizar novos métodos para a construção de bibliotecas de pacotes genéticos que apresentam um membro de uma família diversa de péptidos, polipéptidos ou proteínas e apresentar de forma coletiva, pelo menos, uma parte da diversidade desta família. Estes métodos não têm preferência para DNA que contêm sequências nativas que são complementares aos primers utilizados para amplificação. Estes também permitem que quaisquer sequências que podem ser prejudiciais para a expressão sejam removidas do DNA amplificado antes da clonagem e apresentação. A descrição apresenta um método para a clivagem de sequências de cadeia simples de ácidos nucleicos num local desejado, compreendendo o método as etapas de: (i) colocar em contacto o ácido nucleico com um oligonucleótido de cadeia simples, o oligonucleótido ser funcionalmente complementar ao ácido nucleico na região em que a clivagem é desejada e incluir uma sequência que sendo complementar ao ácido nucleico constitui um local de reconhecimento para a endonuclease de restrição e que com a restrição resulta na clivagem do ácido nucleico no local desejado; e (ii) clivar o ácido nucleico apenas no local de reconhecimento formado pela complementaridade do ácido nucleico e do oligonucleótido; realizando-se as etapas de contacto e de clivagem a uma temperatura suficiente para manter o ácido nucleico substancialmente na forma de cadeia simples, sendo o oligonucleótido funcionalmente complementar ao ácido nucleico ao longo de uma região suficientemente grande para permitir que as duas cadeias se associem de modo a permitir que a clivagem ocorra à temperatura escolhida e no local desejado, e a clivagem seja efetuada usando uma endonuclease de restrição que é ativa à temperatura escolhida. A descrição apresenta um método alternativo para a clivagem de sequências de ácidos nucleicos de cadeia simples num local desejado, compreendendo o método as etapas de: (i) contacto do ácido nucleico com um oligonucleótido parcialmente de cadeia dupla, a região de cadeia simples do oligonucleótido ser funcionalmente complementar ao ácido nucleico na região em que a clivagem é desejado, e a região de cadeia dupla do oligonucleótido ter um local de reconhecimento para uma endonuclease de restrição de Tipo IIS, cujo local de clivagem situa-se a uma distância conhecida do local de reconhecimento; e (ii) clivagem do ácido nucleico apenas no local de clivagem formado pela complementaridade do ácido nucleico e a região de cadeia simples do oligonucleótido; realizando-se as etapas de contacto e de clivagem a uma temperatura suficiente para manter o ácido nucleico na forma substancialmente em cadeia simples, o oligonucleótido ser funcionalmente complementar ao ácido nucleico ao longo de uma região grande o suficiente para permitir que as duas cadeias se associem de modo a permitir que a clivagem possa ocorrer à temperatura escolhida e no local desejado, e a clivagem seja efetuada usando uma endonuclease de restrição que é ativa à temperatura escolhida. A descrição apresenta um método de captura de moléculas de DNA que abrange um membro de uma família diversificada de DNAs e que coletivamente abrange pelo menos uma parte da diversidade da família. Estas moléculas de DNA, na forma de cadeia simples, foram clivadas por um dos métodos da presente invenção. Este método involve a ligação do DNA de cadeia simples dos membros individuais da família com um complexo de DNA parcialmente em cadeia dupla. 0 método compreende as etapas de: (i) contacto de uma sequência de ácido nucleico de cadeia simples que foi clivado com uma endonuclease de restrição com um oligonucleótido parcialmente de cadeia dupla, sendo a região de cadeia simples do oligonucleótido funcionalmente complementar ao ácido nucleico na região que permanece depois clivagem, a região de cadeia dupla do oligonucleótido incluindo quaisquer sequências necessárias para devolver as sequências que permanecem após a clivagem numa grelha de leitura correta para expressão e que contêm um local 5' de reconhecimento da endonuclease de restrição destas sequências; e (ii) clivagem da sequência do oligonucleótido parcialmente de cadeia dupla apenas no local de reconhecimento da endonuclease de restrição contido dentro da região de cadeia dupla do oligonucleótido parcialmente de cadeia dupla.

Outro objetivo da presente invenção é preparar bibliotecas que exibam uma família diversa de péptidos, polipéptidos ou proteínas e apresentar coletivamente, pelo menos, parte da diversidade da família, utilizando os métodos e DNAs descritos acima, tal como definido na reivindicações. É um objetivo da presente invenção pesquisar essas bibliotecas para identificar péptidos, polipéptidos e proteínas úteis e a utilização destas substâncias na terapia humana.

Descrição Breve das Figuras A FIG. 1 é uma representação esquemática dos vários métodos que podem ser utilizados para amplificar genes VH sem utilização de primers específicos para as sequências VH. A FIG. 2 é uma representação esquemática dos vários métodos que podem ser utilizados para amplificar os genes VL sem o uso de sequências VL. A FIG. 3 representa a análise em gel do DNA kappa clivado do Exemplo 2. A FIG. 4 representa a análise em gel do DNA kappa clivado do Exemplo 2. A FIG. 5 representa a análise em gel do DNA kappa amplificado do Exemplo 2. A FIG. 6 representa em gel o DNA kappa amplificado depois de purificado do Exemplo 2.

Termos

Nesta aplicação, os seguintes termos e abreviações são usadas:

Cadeia sense A cadeia superior do dsDNA como geralmente se escreve. Na cadeia sense, 5'-ATG-3' codifica Met.

Cadeia anti- A cadeia inferior de dsDNA como geralmente sense se escreve. Na cadeia anti-sense, 3'-TAC-5' corresponderia a um codão Met na cadeia sense.

Primer direto Um primer "direto" é complementar a uma parte da cadeia sense e prepara a síntese de uma nova molécula de cadeia anti-sense. "Primer direto" e "primer cadeia inferior" são equivalentes.

Primer inverso Um primer "inverso" é complementar a uma parte da cadeia anti-sense e prepara para a síntese de uma nova molécula de cadeia sense. "Primer inverso" e "primer cadeia superior" são equivalentes.

Bases Bases são especificadas pela sua posição num vetor ou gene, assim como pela sua posição dentro de um gene, por codão e base. Por exemplo, "89.1" é a primeira base do codão 89, e 89.2 é a segunda base do codão 89.

Sv Estreptavidina

Ap Ampicilina apr Um gene que confere resistência à ampicilina. RE Endonuclease de restrição URE Endonuclease de restrição universal

Funcionalmente Duas sequências são suficientemente complementares complementares de modo a hibridar sob as condições escolhidas. RERS Local de reconhecimento de endonuclease de restrição AA Aminoácido PCR Reação em cadeia da polimerase GLGs Genes da linha germinal

Ab Anticorpo: uma imunoglobulina. 0 termo também abrange qualquer proteína que tem um domínio de ligação que é homólogo a um domínio de ligação da imunoglobulina. Alguns exemplos de anticorpos dentro desta definição são, entre outros, isotipos de imunoglobulinas e os fragmentos Fab, F(ab1)2, ScFv, Fv, dAb e Fd.

Fab Molécula de duas cadeias que inclui uma cadeia leve e parte de uma cadeia pesada de Ab. scFv Cadeia única de Ab que inclui VH:: linker::VL ou VL:: linker:: VH w.t. Do inglês, wild-type HC Cadeia pesada(do inglês, Heavy Chain) LC Cadeia leve (do inglês, Light Chain) VK Domínio variável de uma cadeia leve Kappa VH Domínio variável de uma cadeia pesada VL Domínio variável de uma cadeia leve lambda.

Descrição Detalhada das Formas de Realização Preferidas

As sequências de ácidos nucleicos que são úteis nos métodos da presente invenção, isto é, aquelas que codificam, pelo menos em parte, os péptidos individuais, polipéptidos e proteínas apresentados nos pacotes genéticos da presente invenção, podendo ser de origem natural, sintéticas ou uma combinação dos mesmos. As sequências podem ser mRNA, DNA ou cDNA. Na forma de realização preferida, os ácidos nucleicos codificam anticorpos. Preferencialmente, eles codificam Fabs.

Os ácidos nucleicos úteis na presente invenção podem apresentar diversidade natural, pode-se introduzir diversidade sintética nos membros com diversidade natural, ou a diversidade pode ser totalmente sintética. Por exemplo, pode-se introduzir diversidade sintética em uma ou mais CDRs de genes de anticorpos. A diversidade sintética pode ser criada, por exemplo, através do uso de tecnologia TRIM (U.S.5,869,644). A tecnologia TRIM permite o controle sobre exatamente quais tipos de aminoácidos são permitidos em posições variadas e em que proporções. Na tecnologia TRIM, os codões para serem diversificados são sintetizados utilizando misturas de trinucleótidos. Isto permite que incluir qualquer conjunto de tipos de aminoácidos, em qualquer proporção.

Outra alternativa que pode usada para gerar DNA diversificado é a síntese de oligonucleótidos mistos. Com a tecnologia TRIM pode ser permitida Ala e Trp. Com a síntese de oligonucleótidos mistos, uma mistura que inclui Ala e

Trp também inclui necessariamente Ser e Gly. Os tipos de aminoácidos permitidos nas posições variadas são selecionados com base na estrutura dos anticorpos, noutros péptidos, polipéptidos ou proteínas da família, na diversidade observada em genes da linha germinal, nas mutações somáticas observadas frequentemente, e nas áreas e tipos de variação desejadas.

Numa forma de realização preferida da presente invenção, as sequências de ácidos nucleicos para pelo menos uma CDR ou outra região dos péptidos, polipéptidos ou proteínas da família, são cDNAs produzidos por transcrição reversa a partir de mRNA. Mais preferencialmente, os mRNAs são obtidos a partir de células de sangue periférico, células de medula óssea, células do baço ou células dos nódulos linfáticos (tais como os linfócitos B ou células do plasma) que expressam membros de conjuntos de genes relacionados naturalmente diversos. Mais preferencialmente, os mRNA codificam uma família diversa de anticorpos. Mais preferencialmente, os mRNA são obtidos a partir de pacientes que sofrem de, pelo menos, uma doença autoimune ou de cancro. Preferencialmente, os mRNA usados contêm uma elevada diversidade de doenças autoimunes, tais como lúpus eritematoso sistémico, esclerose sistémica, artrite reumatoide, síndroma antifosfolípidico e vasculite.

Numa forma de realização preferida da presente invenção, os cDNA são produzidos a partir de mRNA utilizando a transcrição reversa. Nesta forma de realização preferida, os mRNA são separados da célula e degradados usando métodos padrão, de tal modo que apenas permanecem os mRNA de comprimento total (isto é, com a estrutura protetora de revestimento, "Cap"). A estrutura de revestimento é então removida e a transcrição reversa é usada para produzir os cDNA. A transcrição reversa da primeira cadeia (anti-sense) pode ser feita de qualquer forma com qualquer primer adequado. Ver, por exemplo, HJ de Haard et ai., Journal of Biological Chemistry, 274 (26):18218-30 (1999). Na forma de realização preferida da presente invenção em que os mRNA codificam anticorpos podem ser usados os primers que são complementares para as regiões constantes de genes de anticorpos. Esses primers são úteis porque eles não geram preferência por subclasses de anticorpos. Numa outra forma de realização, pode ser usado primers poli-dT (e podem ser preferidos para os genes das cadeias pesadas). Como alternativa, as sequências complementares ao primer podem ser ligadas aos extremos da cadeia anti-sense.

Numa forma de realização preferida da presente invenção, o primer da transcrição reversa pode ser biotinilado, permitindo assim que o cDNA resultante possa ser imobilizado em esferas de estreptavidina (Sv). A imobilização pode também ser efetuada utilizando um primer marcado na extremidade 5' com um a) grupo amina livre, b) tiol, c) o ácido carboxilico, ou d) outro grupo não encontrado no DNA que pode reagir para formar uma ligação forte com um conhecido parceiro em meio insolúvel. Se, por exemplo, uma amina livre (de preferência, uma amina primária) é colocada na extremidade 5' de um primer de DNA, esta amina pode reagir com os grupos de ácido carboxilico numa esfera de polímero utilizando química padrão de formação de amida. Se tal imobilização preferida é utilizado durante a transcrição reversa, a cadeia superior do RNA é degradada usando enzimas bem conhecidas, tais como uma combinação de RNAseH e RNAseA, quer antes ou após a imobilização.

As sequências de ácidos nucleicos úteis nos métodos da presente invenção são geralmente amplificadas antes de serem utilizadas para apresentar os péptidos, polipéptidos ou proteínas que codificam. Antes da amplificação, os DNA de cadeia simples podem ser clivados utilizando um dos métodos descritos anteriormente. Em alternativa, os DNA de cadeia simples podem ser amplificados e, em seguida, clivados utilizando um desses métodos.

Podem ser utilizados qualquer um dos métodos bem conhecidos para a amplificação de sequências de ácidos nucleicos para a dita amplificação. Os métodos que maximizem a diversidade, e não estabeleçam preferências, são os eleitos. Numa forma de realização preferida desta invenção, onde as sequências de ácidos nucleicos são derivadas a partir de genes de anticorpos, a presente invenção utiliza preferencialmente os primers das regiões constantes dos genes das cadeias pesadas e leves e primers de sequência sintética que estão ligados na extremidade 5' da cadeia sense. 0 uso destes primers com sequência sintética evita a utilização de sequências dentro das regiões variáveis dos genes de anticorpos. Essas regiões variáveis de priming podem gerar preferências para os genes V que, ou são de subclasses raras, ou foram mutados nos locais de priming. Esta preferência é em parte devida à supressão da diversidade dentro da região do primer, e em parte devido à falta de primer quando muitas mutações estão presentes na região complementar ao primer. Os métodos descritos na presente invenção têm a vantagem de não dar preferência nos resultados da amplificação de genes de anticorpos para tipos específicos do gene V.

As sequências sintéticas pode ser ligadas à extremidade 5' da cadeia de DNA por vários métodos bem conhecidos para a ligação de sequências de DNA entre si. Um método preferido é RT CapExtention.

No RT CapExtention (derivado do Smart PCR (™) ) , uma curta hibridização (5'-...GGG-3' no primer da cadeia superior (USP-GGG) complementa 3'-CCC....5' na cadeia inferior) e a transcriptase reversa são usadas de modo que o complementar inverso do primer da cadeia superior está ligado à cadeia inferior.

Numa forma de realização preferida da presente invenção, o primer da cadeia superior, ou da cadeia inferior, pode ser também biotinilado ou marcado na extremidade 5' com um a) grupo amina livre, b) tiol, c) ácido carboxilico e d) outro grupo não encontrado no DNA que pode reagir para formar uma ligação forte com um conhecido parceiro em meio insolúvel. Estes podem então ser utilizados para imobilizar a cadeia marcada após a amplificação. 0 DNA imobilizado pode ser de cadeia simples ou dupla. A FIG. 1 mostra uma representação esquemática da amplificação de genes VH. A FIG. 1, Painel A mostra um primer especifico para a região poli-dT da síntese, com primers 3' UTR da primeira cadeia inferior. Os primers que se ligam na região constante também são adequados. 0 Painel B mostra a cadeia inferior extendida na sua extremidade 3' por três C que não são complementares ao mRNA. 0 Painel C mostra o resultado da hibridização do extremo de um primer sintético de cadeia superior com três GGGs que hibridam com CCC do terminal 3' e estendendo-se a transcrição reversa que estende a cadeia inferior pelo complemento inverso da sequência do primer sintético. 0 painel D mostra o resultado da amplificação por PCR utilizando um primer de cadeia superior sintético biotinilado em 5' que reproduz a extremidade 5' do primer sintético do painel C e um primer de cadeia inferior complementar a uma parte do domínio constante. 0 Painel E mostra DNA de cadeia dupla (dsDNA) imobilizado obtido através de um primer de cadeia superior biotinilado em 5'. A FIG. 2 mostra um esquema semelhante para a amplificação de genes VL. A FIG. 2, Painel A mostra um primer especifico para a região constante que se liga na extremidade 3' e que leva à síntese da primeira cadeia inferior. Os primers que se ligam à região poli-dT são também adequados. 0 Painel B mostra a cadeia inferior extendida na sua extremidade 3' por três C que não são complementares ao mRNA. 0 Painel C mostra o resultado da hibridização de um primer sintético de cadeia superior que termina em três GGGs que hibridam com CCC do terminal 3' e estendendo-se a transcrição reversa que estende a cadeia inferior pelo complemento inverso da sequência do primer sintético. 0 painel D mostra o resultado da amplificação por PCR utilizando um primer de cadeia superior sintético biotinilado em 5' que reproduz a extremidade 5' do primer sintético do painel C e um primer de cadeia inferior complementar a uma parte do domínio constante. 0 primer de cadeia inferior também contém um sítio útil de restrição de endonucleases, tal como AscT. Painel E mostra ds cDNA imobilizado obtido através de um primer de cadeia superior biotinilado em 5'.

Nas Fig. 1 e 2, cada um dos genes V consiste em uma região 5' não traduzida (UTR) e um sinal de secreção, seguida da região variável, seguida de uma região constante, seguida por uma região 3' não traduzida (que tipicamente termina em poli-A). Um primer para a iniciação da transcrição reversa pode ser complementar da região constante ou do segmento de poli-A na 3'-UTR. Para os genes da cadeia pesada humana é preferível um primer de 15 T. As transcriptases reversas unem vários resíduos de C com a extremidade 3' do DNA recém-sintetizado. A RT CapExtention explora esta característica. A reação de transcrição reversa é executada pela primeira vez apenas com um primer de cadeia inferior. Após cerca de 1 hora, um primer com terminação GGG (USP-GGG) e mais RTase são adicionados. Isso faz com que o cDNA de cadeia inferior seja extendido pelo complementar inverso do USP-GGG até ao GGG final. Utilizando um primer idêntico a uma parte, ou a sequência sintética acoplada, e um segundo primer complementar a uma região de sequência conhecida na extremidade 3' ou a cadeia sense, todos os genes V são amplificados independentemente da sua subclasse.

Após a amplificação, os DNA da presente invenção são tornados de cadeia simples. Por exemplo, as cadeias podem ser separadas usando um primer biotinilado, capturando o produto biotinilado em esferas de estreptavidina, seguido de desnaturação do DNA, e lavagem da cadeia complementar. Dependendo que extremidade do DNA capturado se deseja, pode-se escolher imobilizar a cadeia superior (sense) ou a cadeia inferior (anti-sense).

Para preparar os DNA amplificados de cadeia simples para clonagem em pacotes genéticos, de modo a efetuar a apresentação dos péptidos, polipéptidos ou proteínas codificados, pelo menos em parte, pelos referidos DNA, eles devem ser manipuladas para proporcionar terminais adequados para clonagem e expressão. Em particular, quaisquer regiões não traduzidas 5' e as sequências de sinal de mamífero deve ser removida e substituídas, na estrutura, por uma sequência de sinal adequada, que funciona no hospedeiro da apresentação. Adicionalmente, partes dos domínios variáveis (em genes de anticorpos) podem ser removidos e substituídos por segmentos sintéticos contendo diversidade sintética. A diversidade de outras famílias de genes pode também ser expandida de modo semelhante usando diversidade sintética.

De acordo com os métodos desta invenção, existem duas formas de manipular os DNA amplificados de cadeia simples para a clonagem, como é definido nas reivindicações. 0 primeiro método compreende as etapas de: (i) colocar em contacto o ácido nucleico de cadeia simples com um oligonucleótido de cadeia simples, sendo o oligonucleótido complementar ao ácido nucleico de cadeia simples na região em gue a clivagem é desejada e incluindo uma seguência gue com o seu complemento no ácido nucleico forma um local de reconhecimento para a endonuclease de restrição, gue na restrição resulta em clivagem do ácido nucleico no local desejado; e (ii) clivar o ácido nucleico apenas no local de reconhecimento formado pela complementaridade do ácido nucleico e do oligonucleótido; as etapas de contacto e da clivagem realizam-se a uma temperatura suficiente para manter o ácido nucleico substancialmente na forma de cadeia simples, sendo o oligonucleótido funcionalmente complementar ao ácido nucleico ao longo de uma região suficientemente grande para permitir gue as duas cadeias hibridem e gue a clivagem possa ocorrer à temperatura escolhida e no local desejado, e gue a clivagem seja efetuada usando uma endonuclease de restrição gue é ativa à temperatura escolhida.

Neste primeiro método, hibridam-se os oligonucleótidos curtos com o DNA de cadeia simples de modo a gue os locais de reconhecimento para endonucleases de restrição formados dentro das regiões agora localmente de DNA cadeia dupla possam ser clivados. Em particular, um local de reconhecimento gue ocorre na mesma posição em uma fração substancial dos DNA de cadeia simples é idêntico.

Para genes de anticorpo, este pode ser feito usando um catálogo de sequências da linha germinal. Veja-se, por exemplo, "http://www.mrc-cpe. cam.ac.uk/imt-doc/restricted/ok.html". As atualizações podem ser obtidas neste site sob o titulo "Amino acid and nucleotide sequence aligments". Para outras famílias existem comparações semelhantes e podem usar-se para selecionar regiões apropriadas para a clivagem e para manter a diversidade.

Por exemplo, a Tabela 195 apresenta as sequências de DNA das regiões FR3 dos 51 genes VH da linha germinal humana que são conhecidos. Nesta região, os genes contêm locais de reconhecimento para endonuclease de restrição mostrados na Tabela 200. São preferidas as endonucleases de restrição que clivam uma grande fração de genes da linha germinal no mesmo local quando comparadas com as endonucleases que cortam uma variedade de sítios. Além disso, é preferível que haja apenas um local para as endonucleases de restrição dentro da região, na qual o oligonucleótido curto se liga ao DNA de cadeia simples, por exemplo, cerca de 10 bases de cada lado do local de reconhecimento da endonuclease de restrição.

Uma enzima que cliva após FR3 também é preferível uma vez que capta menos mutações na estrutura. Isto pode ser vantajoso é alguns casos. No entanto, é bem sabido que existem mutações estruturais que conferem e melhoraram a ligação do anticorpo. A presente invenção, por escolha do sítio de restrição adequado, permite que seja capturada toda ou parte da diversidade de FR3. Assim, o método também permite capturar uma grande diversidade.

Finalmente, nos métodos desta invenção são usadas endonucleases de restrição que são ativas entre aproximadamente 45° e aproximadament 75°C. De preferência são usadas as enzimas que são ativas acima de 50°C, e mais preferencialmente quando ativas a cerca de 55°C. Tais temperaturas mantêm a sequência de ácido nucleico a ser clivada substancialmente na forma de cadeia simples.

As enzimas apresentadas na Tabela 200 que cortam muitos dos genes FR3 da linha germinal da cadeia pesada numa única posição incluem: MaelII (24 em 4), Tsp45l (21 em 4), Hphl (44 em 5), BsaJI (23 em 65 ), Alui (23 em 47), BlpI (21 em 48), DdeI (29 em 58), BglII (10 em 61), Ms II (44 em 72), BsiEI (23 em 74), Bael (23 em 74) , BagI (23 em 74), BaelII (25 em 75), Bst4CI (51 em 36), BpyCH4lII (51 em 86), Hinfl (38 em 2), Mlyl (18 em 2), Piei (18 em 2), Mnll (31 em 67), BpyCH4V (21 em 44), BsmAI (16 em 11), Bpml (19 em 12), Xmnl (12 em 30), e Saci (11 em 51). (A notação utilizada significa, por exemplo, que a BsmAI cliva 16 dos genes FR3 da linha germinal começando o local de reconhecimento da endonuclease de restrição na base 11 do FR3).

Para a clivagem de cadeias pesadas humanos em FR3, as enzimas de restrição preferidas são: Bst4CI (ou TaaI ou BpyCH4lII), BlpI, BpyCH4V e Msl I. Uma vez que ACNGT (o local de reconhecimento de endonuclease de restrição para Bst4CI, Taal, e BpyCH4lII) se encontra num local consistente em todos os genes FR3 da linha germinal humana, uma dessas enzimas é a mais preferida para a captura da diversidade de CDR3 de cadeia pesada. BlpI e BpyCH4V são complementares. BlpI corta a maioria dos membros das famílias VHl e VH4 enquanto HpyCH4V corta a maioria dos membros das famílias VH3, VH5, VH6 e VH7. Nenhuma enzima corta VH2, mas esta é uma família muito pequena contendo apenas três membros. Assim, estas enzimas também podem ser utilizadas em formas de realização preferidas dos métodos da presente invenção.

As endonucleases de restrição fípyCH4lII, Bst4CI e Taa I reconhecem a sequência 5'- ACnGT-3' e clivam o DNA da cadeia superior após n e o DNA da cadeia inferior antes da base complementar ao n. Este é o local de reconhecimento de endonuclease de restrição mais preferido para este método em cadeias pesadas humanas porque este é encontrado em todos os genes da linha germinal. Além disso, a região de reconhecimento da endonuclease de restrição (ACnGT) coincide com as segunda e terceira bases de um codão da tirosina (tay) e do codão de cisteina (tgy) seguinte, como é mostrado na Tabela 206. Estes codões estão altamente conservados, especialmente a cisteina, em genes de anticorpos maduros. A Tabela 250 E mostra os vários oligonucleotideos com 22 bases de comprimento (exceto o último que tem 20 bases de comprimento). A Tabela 255 C mostra a análise de 1617 genes de anticorpos de cadeia pesada reais. Destes, 1511 têm o local e correspondem a um dos oligonucleótidos candidato a 4 desemparelhamentos. Oito oligonucleotidos responsáveis pela maior parte das correspondências ("matches") são apresentados na Tabela 250 F.l. Os oito oligonucleotideos são muito semelhantes de modo que é provável que uma clivagem satisfatória seja conseguida com apenas um oligonucleótido (tal como H43.77.97.1-02#1) por ajuste da temperatura, pH, salinidade, e semelhantes. Um ou dois oligonucleotideos podem igualmente bastar sempre que as sequências genéticas da linha germinal difiram muito pouco e, especialmente, se elas diferirem muito pouco perto da região reconhecimento da endonuclease de restrição a ser clivada. Tabela 255 D mostra uma análise de repetição de 1617 genes de anticorpos de cadeia pesada reais usando apenas os oito oligonucleotídeos selecionados. Esta análise mostra que 1463 das sequências correspondem a pelo menos um dos oligonucleótidos com até 4 desemparelhamentos e têm o sitio como esperado. Apenas 7 sequências têm uma segunda região de restrição de reconhecimento da endonuclease i7pyCH4lII nesta região.

Outra ilustração da seleção de um local apropriado de reconhecimento das endonuclease de restrição envolve a clivagem em FRl de cadeias pesadas humanas. A clivagem em FRl permite a captura de toda a diversidade de CDRs da cadeia pesada.

Os genes FRl da linha germinal de cadeia pesada humana estão apresentados na Tabela 217. A Tabela 220 mostra os locais de reconhecimento de endonucleases de restrição encontrados em genes FRl da linha germinal humana. Os locais preferenciais são Bsg I (GTGCAG; 39 em 4), BsoFI (GCngc; 43 em 6, 11 em 9, 2 em 3, 1 em 12), Tsel (Gcwgc; 43 em 6, 11 em 9, 2 em 3, 1 em 12), MspAlI (CMGckg; 46 em 7, 2 em 1), RvuII (CAGctg; 46 em 7, 2 em 1), Alui (AGct; 48 em 82 em 2), DdeI (Ctnag; 22 em 52, 9 em 48), Hphl (tcacc; 22 em 80), BssKI (Nccngg; 35 em 39, 2 em 40), BsaJI (Ccnngg; 32 em 40, 2 em 41), BstNI (CCwgg; 33 em 40), ScrFI (CCngg; 35 em 40, 2 em 41), EcoO109l (RGgnccy; 22 em 46, 11 em 43), Sau96l (Ggncc; 23 em 47,11 em 44), Avail (Ggwcc; 23 em 47, 4 em 44), RpuMI (RGgwccy; 22 em 46, 4 em 43), BsmFI (gtccc; 20 em 48), Hinfl (Gantc; 34 em 16, 21 em 56, 21 em 77),

TfiI (21 em 77), Myli (GAGTC; 34 em 16), Mlyl (gactc; 21 em 56) , e AlwNI (CAGnnnctg; 22 em 68) . Os locais mais preferidos são MspAI e FvuII. MspAI e RvuII têm 46 locais em 7-12 e 2 em 1-6. Para evitar a clivagem em ambos os locais, oligonucleotídeos usados não incluem totalmente o local em 1-6. Assim, o DNA não será clivado nesse local.

Mostrámos que o DNA que se estende 3, 4, ou 5 bases para além de um local IVuII pode ser clivado de forma eficiente.

Outro exemplo da seleção de um local apropriado de reconhecimento de endonuclease de restrição envolve a clivagem em FRl de cadeias leves kappa humanas. A Tabela 300 mostra os genes FRl kappa da linha germinal humana e a Tabela 302 mostra os locais de reconhecimento de endonucleases de restrição que são encontrados em um número substancial de genes FRl kappa da linha germinal humana em locais consistentes. Dos locais de reconhecimento de endonucleases de restrição indicadas, BsmAI e PflFI são as enzimas mais preferidos. Os locais BsmAI são encontrados na base de 18, em 35 dos 40 genes da linha germinal. Os locais Pfl FI são encontrados em 35 de 40 genes da linha germinal na base 12.

Um outro exemplo da seleção de um local de reconhecimento da endonuclease de restrição adequado envolve a clivagem em FRl da cadeia leve lambda humana. Tabela 400 mostra as sequências de 31 genes FRl lambda da linha germinal humana. A Tabela 405 mostra locais de reconhecimento de endonucleases de restrição encontrados em genes FRl lambda da linha germinal humana. Hinfl e Ddel são as endonuclease de restrição preferidas para o corte de cadeias lambda humanas em FRl.

Após a seleção do local ou locais de clivagem apropriados, um ou mais oligonucleótidos curtos são preparadas de modo a complementar funcionalmente, sozinhos ou em combinação, o local de reconhecimento escolhido. Os oligonucleótidos também incluem sequências que flanqueiam o local de reconhecimento na maioria dos genes amplificados. Esta região flanqueadora permite hibridar a sequência com o DNA de cadeia simples o suficiente para permitir a clivagem pela endonuclease de restrição especifica para o local selecionado. 0 comprimento e a sequência real do oligonucleótido depende do local de reconhecimento e das condições para hibridização e clivagem. 0 comprimento deve ser suficiente para que o oligonucleótido seja funcionalmente complementar ao DNA de cadeia simples ao longo de uma região grande o suficiente para permitir a hibridização das duas cadeias e a clivagem à temperatura selecionada e exclusivamente no local desejado.

Tipicamente, os oligonucleótidos deste método preferido da presente invenção são de aproximadamente 17 a aproximadamente 30 nucleótidos de comprimento. Abaixo de aproximadamente 17 bases o reconhecimento é muito fraco e acima de 30 bases pode haver uma perda de especificidade. O comprimento preferido é de 18 a 24 bases.

Os oligonucleótidos com este comprimento não precisam de ser completamente idênticos aos genes da linha germinal. Pelo contrário, podem ser tolerados alguns desemparelhamentos. No entanto, de preferência, não são permitidos mais do que 1-3 desemparelhamentos. A hibridização do oligonucleótido com o DNA de cadeia simples não é afetada de forma adversa por alguns desemparelhamentos. Assim, os dois DNAs são considerados funcionalmente complementares. O segundo método para manipular os DNAs de cadeia simples amplificados da presente invenção para clonagem compreende as etapas (tal como definido nas reivindicações) de: (i) pôr em contacto o ácido nucleico de cadeia simples com um oligonucleótido parcialmente de cadeia dupla, sendo que a região de cadeia simples do oligonucleótido é complementar para o ácido nucleico de cadeia simples na região em que a clivagem é desejada, e tendo a região de cadeia dupla do oligonucleótido um local de reconhecimento de uma endonuclease de restrição de Tipo II-S, cujo local de clivagem situa-se a uma distância conhecida do local de reconhecimento; e (ii)clivar o ácido nucleico apenas no local de clivagem formado pela complementaidade do ácido nucleico e a região de cadeia simples do oligonucleótido; a hibridização e a clivagem devem ser realizadas a uma temperatura suficiente para manter o ácido nucleico substancialmente na forma de cadeia simples, o oligonucleótido ser funcionalmente complementar ao ácido nucleico ao longo de uma região grande o suficiente para permitir a hibridização das duas cadeias, a clivagem pode ocorrer à temperatura escolhida e no local desejado, e sendo a clivagem realizada utilizando uma endonuclease de restrição que é ativa à temperatura escolhida.

Este segundo método emprega endonucleases de restrição Universais ("URE", do inglês Universal Restriction Endonucleases) . As URE são oligonucleótidos parcialmente de cadeia dupla. A zona de cadeia simples ou hibridização das URE consiste num adaptador de DNA que é funcionalmente complementar à sequência a ser clivada no DNA de cadeia simples. A zona de cadeia dupla consiste em um local de reconhecimento de endonuclease de restrição de Tipo II-S. 0 método URE da presente invenção é especifica e precisa e pode tolerar alguns desemparelhamentos (por exemplo, 1-3) nas regiões complementares, ou seja, é funcionalmente complementar à região. Além disso, as condições sob as quais as URE são utilizadas podem ser ajustadas de modo a que a maioria dos genes que são amplificados podem ser clivados, reduzindo a preferência na biblioteca produzida a partir desses genes. A sequência do adaptador de DNA de cadeia simples, ou a zona de hibridização da URE, consiste tipicamente em cerca de 14-22 bases. No entanto, podem ser utilizados adaptadores mais longos ou mais curtos. 0 tamanho depende da capacidade do adaptador para hibridar com o seu complemento funcional no DNA de cadeia simples e a temperatura usada para a hibridização da URE e do DNA de cadeia simples à temperatura utilizada para a clivagem do DNA com a enzima tipo II-S. 0 adaptador deve ser funcionalmente complementar ao DNA de cadeia simples ao longo de uma região grande o suficiente para permitir que as duas cadeias hibridem de modo que a clivagem possa ocorrer à temperatura escolhida e no local desejado. Os inventores preferem regiões de cadeia simples ou hibridização de 14-17 bases de comprimento, e mais preferencialmente de 18-20 bases de comprimento. O local selecionado para a clivagem utilizando as URE é de preferência um que é substancialmente conservado na família dos DNA amplificados. Em comparação com o primeiro método de clivagem da presente invenção, estes locais não precisam ser sítios de reconhecimento de endonucleases. No entanto, como no primeiro método, os sítios selecionados podem ser sintéticos em vez de existirem no DNA nativo. Estes locais podem ser selecionados por referências às sequências de anticorpos conhecidos ou de outras famílias de genes. Por exemplo, as sequências de vários genes da linha germinal são apresentados no http ://www.mrc-cpe. cam.ac.uk/imt-doc/restricted/ok.html. Por exemplo, um local preferido ocorre perto do final da FR3, codão 89 até à segunda base do codão 93. A CDR3 começa no codão 95.

As sequências de 79 genes de cadeia pesada humanos também estão disponíveis em http://www.ncbi.nlm.nih. gov/entre2/nucleotide.html. Este sítio de internet pode ser utilizado para identificar sequências adequadas para a clivagem com URE de acordo com os métodos da presente invenção. Ver, por exemplo, Tabela 8B.

Mais preferencialmente, uma ou mais sequências são identificadas usando estes locais ou outra informação disponível das sequências. Estas sequências em conjunto representam uma fração substancial dos DNA amplificados. Por exemplo, múltiplas sequências poderiam ser usados para permitir a diversidade conhecida em genes da linha germinal ou para mutações somáticas frequentes. Também poderão ser utilizados sequências degeneradas sintéticas. De preferência, seleciona-se uma sequência, ou sequências, que ocorre em pelo menos 65% dos genes analisados, com não mais do que 2-3 desemparelhamentos.

Adaptadores ou a hibridização dos URE de cadeia simples são, então, complementares com as regiões selecionadas.

As condições de utilização das URE são determinadas empiricamente. Estas condições devem permitir a clivagem do DNA que contém as sequências funcionalmente complementares com não mais do que 2 ou 3 desemparelhamentos, mas que não permitem a clivagem do DNA que não apresentam tais sequências.

Como descrito anteriormente, as regiões de cadeia dupla das URE incluem um local de reconhecimento de endonuclease de

Tipo II-S. Pode ser usada qualquer enzima Tipo II-S que é ativa a uma temperatura necessária para manter o DNA de cadeia simples substancialmente nessa forma e para permitir que a região do adaptador de DNA de cadeia simples das URE hibride o tempo suficiente com o DNA de cadeia simples para permitir a clivagem no local desejado.

As enzimas de Tipo II-S preferidas para utilização nos métodos URE da presente invenção proporcionam a clivagem assimétrica do DNA de cadeia simples. Entre estas estão as enzimas listadas na Tabela 800. A enzima de Tipo II-S mais preferida é a FokI.

Quando a URE preferida Fok I é usada, várias condições preferenciais são usadas para efetuar a clivagem: 1) Excesso da URE em relação ao DNA alvo deve estar presente para ativar a enzima. A presença da URE apenas em quantidades equimolares para com o DNA alvo levaria a uma clivagem de ssDNA escassa, uma vez que a quantidade de enzima ativa disponível seria limitante. 2) Um ativador pode ser usado para ativar parte da enzima Fok I a dimerizar sem causar clivagem. Exemplos de ativadores adequados são apresentados na Tabela 510. 3) A reação de clivagem é realizada a uma temperatura entre 45°C e 75°C, de preferência acima de 50°C e mais preferivelmente acima de 55°C.

As URE utilizados na técnica anterior continham um segmento de cadeia simples de 14 bases, uma haste de 10 bases (contendo um local Fokl), seguido do palindroma da haste de 10 bases. Embora tais URE podem ser utilizados nos métodos da presente invenção, as URE preferidos desta invenção também incluem um segmento de três a oito bases (alça) entre os segmentos que contêm sítios de reconhecimento da endonuclease de restrição Fokl. Na forma de realização preferida, a haste (contendo o local Fokl) e os seus palindromas possuem mais do que 10 bases de comprimento. De preferência, apresentam um comprimento de 10-14 bases. Exemplos destes adaptadores URE "lollipop" são mostrados na Tabela 5.

Um exemplo do uso de um URE para clivar um DNA de cadeia simples envolve a região FR3 da cadeia pesada humana. Tabela 508 mostra uma análise de 840 cadeias pesadas humanas maduras de tamanho completo com as sequências de reconhecimento URE representadas. A grande maioria (718/840 = 0,85) será reconhecida com 2 ou menos desemparelhamentos utilizando cinco URE (VHS881-1.1, VHS881-1.2, VHS881-2.1, VHS881-4.1 e VHS881-9.1). Cada uma tem uma sequência adaptador de 20 bases para complementar o gene da linha germinal, um segmento haste de dez bases contendo um local Fokl, uma alça de cinco bases, e o complemento inverso do primeiro segmento da haste. A hibridização desses adaptadores, sozinhos ou em combinação, com o DNA anti-sense de cadeia simples da cadeia pesada e o tratamento com Fokl na presença de, por exemplo, o ativador FOKIact, levará à clivagem da cadeia anti-sense na posição indicada.

Um outro exemplo de utilização de uma ou várias URE para clivar um DNA de cadeia simples envolve a região FRl das cadeias leves kapa humanas. A Tabela 512 mostra uma análise de 182 cadeias kappa humanas de comprimento total para correspondência com as quatro sequências de sondas de 19 bases mostradas. Noventa e seis por cento das sequências correspondem a uma das sondas com 2 ou menos desemparelhamentos. Os adaptadores URE apresentados na Tabela 512 são para a clivagem da cadeia sense de cadeias kappa. Assim, as sequências dos adaptadores são o complemento inverso das sequências de genes da linha germinal. A URE consiste em uma haste de dez base, uma alça de cinco bases, o complemento inverso da haste e a sequência de complementação. A alça mostrada aqui é TTGTT, mas poderiam ser usadas outras sequências. A sua função é a de interromper o palindrome das hastes de modo que se favoreça a formação de um monómero de tipo "lollypop" em relação à dimerização. A Tabela 512 também mostra onde é clivada a cadeia sense.

Um outro exemplo de utilização de uma URE para clivar um DNA de cadeia simples envolve a cadeia leve lambda humana. A Tabela 515 mostra uma análise de 128 cadeias leves lambda humanas para corresponder à hibridização com as quatro sondas de 19 bases mostradas. Com três ou menos desemparelhamentos, 88 de 128 (69%) das cadeias hibridam com uma das sondas. A Tabela 515 mostra também adaptadores URE correspondentes a estas sondas. A hibridização destes adaptadores com ssDNA de cadeia superior de cadeias lambda e tratamento com FokI na presença de FOKIact a uma temperatura igual ou acima de 45°C irá conduzir à clivagem especifica e precisa das cadeias.

As condições sob as quais as sequências de oligonucleótidos curtos do primeiro método e as URE do segundo método hibridam com os DNAs de cadeia simples pode ser determinada empiricamente. As condições devem ser tais que o DNA de cadeia simples permanece substancialmente em forma de cadeia simples. Mais particularmente, as condições devem ser tais que o DNA de cadeia simples não deve formar alças que podem interferir com a sua hibridização com a sequência do oligonucleótido ou a URE ou que possam proporcionar locais para a clivagem pela endonuclease de restrição escolhida. A eficácia e especificidade de oligonucleótidos curtos (primeiro método) e URE (segundo método) pode ser ajustada através do controlo das concentrações dos adaptadores de URE/oligonucleótidos e DNA substrato/molde, a temperatura, o pH, a concentração de iões metálicos, o força iónica, a concentração de agentes caotrópicos (tais como ureia e formamida), a concentração da endonuclease de restrição (por exemplo, FokI) e a duração da digestão. Estas condições podem ser otimizados com oligonucleotideos sintéticos que têm: 1) sequências de genes da linha germinal como alvo, 2) sequências de genes alvo mutadas, ou 3) sequências não-alvo pouco relacionadas. 0 objetivo é o de clivar a maior parte das sequências alvo e quantidades mínimas de não-alvo.

Na presente invenção, o DNA de cadeia simples é mantido substancialmente nessa forma usando uma temperatura entre 45°C a 75°C. De preferência, é utilizada uma temperatura entre 50°C e 60°C, e mais preferivelmente entre 55°C e 60°C. Estas temperaturas são utilizadas quando se híbrida o DNA com o oligonucleótido ou a URE e quando da clivagem do DNA utilizando os métodos da presente invenção.

Os dois métodos de clivagem da presente invenção têm várias vantagens. 0 primeiro método permite que os membros individuais da família de DNA de cadeia simples sejam clivados unicamente em um sítio de reconhecimento de endonuclease substancialmente conservado. 0 método também não requer a contrução de um local de reconhecimento de endonuclease com a transcrição reversa ou com os primers da amplificação. Qualquer local nativo ou sintético na família pode ser utilizado. 0 segundo método tem ambas estas vantagens. Além disso, o método das URE permite que os DNA de cadeia simples sejam clivados em posições em que nenhum sítio de reconhecimento de endonuclease ocorre naturalmente ou que tenha sido construído sinteticamente.

Mais importante ainda, ambos os métodos de clivagem permitem a utilização de primers 5' e 3' de modo a maximizar a diversidade e, em seguida, a clivagem para remover sequências não desejadas ou deletérias antes de clonagem e da apresentação.

Após a clivagem dos DNA amplificados utilizando um dos métodos da presente invenção, o DNA foi preparado para clonagem. Isto é feito usando um adaptador de DNA sintético parcialmente de cadeia dupla, cuja sequência terminal se baseia no local de clivagem específico no qual o DNA amplificado foi clivada. 0 DNA sintético foi desenhado de modo a que quando se liga ao DNA de cadeia simples clivado permite que o DNA seja expresso na grelha de leitura correta de modo a apresentar o péptido, polipéptido ou proteína desejada na superfície do pacote genético. De preferência, a região de cadeia dupla do adaptador inclui a sequência de vários codões que codificam a sequência de aminoácidos característica da família de péptidos, polipéptidos ou proteínas até ao local de clivagem. Para as cadeias pesadas humanas, os aminoácidos da estrutura 3-23 são de preferência utilizados para fornecer as sequências necessárias para a expressão do DNA clivado.

De preferência, a porção de cadeia dupla do adaptador é de aproximadamente 12 a 100 bases de comprimento. Mais preferencialmente, são usadas aproximadamente 20 a 100. A região de cadeia dupla do adaptador também contém de preferência pelo menos um local de reconhecimento de endonuclease útil para a clonagem do DNA num vetor de apresentação adequado (ou um vetor recetor usado para arquivar a diversidade). Este sitio de restrição de endonuclease pode ser nativo das sequências do gene da linha germinal utilizadas para prolongar a sequência de DNA. Pode também ser construído utilizando sequências degeneradas das sequências nativas do gene da linha germinal. Ou, pode ser totalmente sintético. A região de cadeia simples do adaptador é complementar à região da clivagem no DNA de cadeia simples. A hibridização pode ser de aproximadamente 2 bases até cerca de 15 bases. Quanto mais longa for a hibridização, mais eficaz é provavelmente a ligação. Um comprimento preferido para a hibridização é de 7 a 10. Isto permite que alguns desemparelhamentos na região de modo a que possa ser capturada diversidade nesta região. A região em cadeia simples ou a hibridização do adaptador parcialmente de cadeia dupla é vantajosa porque permite capturar DNA limpo no local escolhido, mas não outros fragmentos. Tais fragmentos contaminariam a biblioteca com os genes que codificam sequências que resultam num mau enrolamento ("fold") dos anticorpos e provavelmente as extremidades pegajosas não serão específicas.

Um exemplo do uso de um adaptador parcialmente de cadeia dupla nos métodos da presente invenção envolve a ligação tal adaptador a uma região humana FR3 que foi clivada, como descrito acima, no 5'-ACnGT-3' usando HpyCHÍIII, Bst4CI ou Taal. A Tabela F.2 250 mostra a cadeia inferior da região de cadeia dupla do adaptador para ligação ao DNA de cadeia inferior clivado. Uma vez que o local HpyCB4lII é tão longe para a direita (conforme apresentado na Tabela 206), pode ser adicionada uma sequência que inclui o local AflII, bem como o local de Xfoal. Esta região de cadeia inferior do adaptador parcialmente de cadeia dupla, H43.XAExt, incorpora tanto locais Xfoal como Aflll. A cadeia superior da região de cadeia dupla do adaptador não tem local (devido ao desemparelhamento previsto nos segmentos opostos aos locais Xfoal e Afl II de H43.XAExt), mas vai hibridar fortemente com H43.XAExt. H43AExt contém apenas o local AflII e deve ser usado com as cadeias superiores H43.ABrl e H43.ABr2 (que têm alterações intencionais para destruir o local AflII) .

Após da ligação, o desejado DNA capturado pode ser novamente amplificados por PCR, se pretendido, usando, na realização preferida, um primer para a região constante após o gene do anticorpo e um primer para a zona da região de cadeia dupla do adaptador. Os primers também podem incluir locais de endonucleases de restrição para utilização na clonagem do DNA amplificado.

Após a ligação, e talvez a amplificação do adaptador parcialmente em cadeia dupla com o DNA amplificado de cadeia simples, o DNA resultante é clivado em locais de reconhecimento de endonucleases 5' e 3' selecionados.

Os locais de clivagem úteis para a clonagem dependem do fago ou fagemideo em que a cassete é inserida e os locais disponíveis nos genes de anticorpos. A Tabela 1 apresenta dados de endonucleases de restrição para 75 cadeias leves humanas. A Tabela 2 apresenta os dados correspondentes de 79 cadeias pesadas humanas. Em cada Tabela as endonucleases são ordenados por frequência crescente de corte. Nessas tabelas, Nch é o número de cadeias clivadas pela enzima e Ns é o número de locais (alguns cadeias têm mais de um local). A partir desta análise, são bastante adequadas SflI, NotI, AflII, ApaLI e Ascl. Sfi I e Notl são preferencialmente utilizados em pCESI para inserir o segmento de apresentação da cadeia pesada. ApaLI e Ascl são preferencialmente utilizados em pCESI para inserir o segmento de apresentação da cadeia leve.

Os locais BstEII ocorrem em 97% dos genes JH da linha germinal. Em genes V rearranjados, apenas 54/79 (68%) dos genes de cadeia pesada contém um local BstEII e 7/61 destes contêm os dois locais. Assim, 47/79 (59%) conter um único local BstEII. Uma alternativa à utilização de BstEII é a clivagem através das URE no final de JH e a ligação a um oligonucleótido sintético que codifica parte de CHI.

Um exemplo de preparação de uma família de sequências de DNA utilizando os métodos da presente invenção envolve a captura da diversidade de CDR 3 humana. Como descrito anteriormente, os mRNAs de vários doentes autoimunes é transcrito reversamente em cDNA de cadeia inferior. Após a degradação do RNA da cadeia superior, a cadeia inferior é imobilizada e um oligonucleótido curto é utilizado para clivar o cDNA após o CDR3. Um adaptador de DNA sintético parcialmente de cadeia dupla é então hibridado com o DNA e o DNA é amplificado utilizando um primer para o adaptador e um primer para a região constante (após a FR4) . 0 DNA é então clivado usando BstEII (em FR4) e uma endonuclease de restrição apropriada para o adaptador parcialmente em cadeia dupla (por exemplo, Xba I e AflII (em FR3)). 0 DNA é depois ligado a um esqueleto de VH sintético tal como 3-23.

Um exemplo de preparação de um DNA de cadeia simples que foi clivado utilizando o método URE envolve a cadeia Kappa humana. 0 local de clivagem na cadeia sense desta cadeia está representado na Tabela 512. 0 oligonucleótido kapextURE é hibridado com os oligonucleótidos (kaBROlUR, kaBR02UR, kaBR03UR, e ka3R04UR) para formar um DNA parcialmente de cadeia dupla. Este DNA é então ligado às cadeias kappa solúveis clivadas. 0 produto de ligação é então amplificado utilizando primers kapextUREPCR e CKForeAsc (que introduz um local Asei após o final do C Kappa). Este produto é em seguida clivado com ApaLI e Ascl e ligado ao vetor recetor cortado de forma semelhante.

Um outro exemplo envolve a clivagem ilustrada na Tabela 515. Após clivagem, a hibridização de um extensor (ON_LamExl33) e quatro oligonucleótidos ponte (0N_LAMB1-133, ON LamB2-133, ON LamBS-133, e ON LamB4-133) leva à formação de um DNA de cadeia dupla parcial. Esse DNA é ligado às cadeias sense da cadeia lambda clivada. Depois da ligação, o DNA é amplificado com ON_Laml33PCR e um primer direto especifico para o domínio constante lambda, tal como CL2ForeAsc ou CL7ForeAsc (Tabela 130).

Em cadeias pesadas humanas, pode-se clivar quase todos os genes em FR4 (a jusante, isto é, em direção à extremidade 3' da cadeia sense, de CDR3) num local BstEII que aparece numa posição constante numa fração muito grande de genes V de cadeia pesada humana. Em seguida é necessário um local em FR3 que apenas deve capturar a diversidade de CDR3, em FR2, se a diversidade de CDR2 ou CDR3, ou em FRl, se toda a diversidade de CDRS é procurada. Estes locais são, de preferência, inseridos como parte do adaptador parcialmente de cadeia dupla. O procedimento preferido da presente invenção é proporcionar vetores recetores que possuem locais que permitem a clonagem das cadeias leves ou pesadas. Tais vetores são bem conhecidos e amplamente utilizados ns técnica. Um vetor de apresentação de fago preferido de acordo com esta invenção é o fago MALIA3. Este encontra-se no gene III. A sequência do fago MALIA3 é mostrada na Tabela 120A (anotado) e Tabela 120B (condensado). 0 DNA que codifica as regiões selecionadas das cadeias leves ou pesadas pode ser transferido para os vetores utilizando endonucleases que cortam cadeias leves ou pesadas muito raramente. Por exemplo, as cadeias leves podem ser capturadas com ApaLI e Ascl. Os genes de cadeia pesada são de preferência clonados num vetor recetor que tem locais SfiI, Ncol, Xbal, Afill, BstEli, Apal, e NotI. As cadeias leves são preferencialmente movidas para a biblioteca como fragmentos ApaLI-AscI. As cadeias pesadas são de preferência movidas para a biblioteca como fragmentos Sfil-NotI.

Mais preferivelmente, a apresentação é realizada na superfície de um derivado do fago M13. 0 vetor mais preferencial contém todos os genes de M13, um gene de resistência a antibiótico, e a cassete de apresentação. 0 vetor preferido é fornecido com locais de restrição que permitem a introdução e a excisão dos membros da família diversa de genes, como cassetes. 0 vetor preferido é estável a rearranjos nas condições de crescimento utilizadas para amplificar o fago.

Numa outra forma de realização da presente invenção, a diversidade capturada pelos modos da presente invenção pode ser apresentada em um vetor fagemídeo (por exemplo, pCESl) que apresenta o péptido, polipéptido ou proteína na proteína III. Estes vetores também podem ser utilizados para armazenar a diversidade para subsequente apresentação utilizando outros vetores ou fagos.

Numa outra forma de realização, o modo de apresentação pode ser através de um linker curto com três possíveis domínios de âncora. Um domínio de âncora sendo a porção final M13 III ("11Istump"), uma segunda âncora sendo o comprimento total da proteína madura III, e a terceira sendo a proteína madura M13 VIII. 0 fragmento IIIstump contém suficiente M13 III para a montagem do fago, mas não os domínios envolvidos na mediação da infeciosidade. Porque o w.t. das proteínas III e VIII está presente, é improvável que o fago exclua os genes de anticorpos e o fago que exclua esses segmentos receber apenas uma vantagem muito pequena de crescimento. Para cada um dos domínios de âncora, o DNA codifica a sequência de AA w.t., mas difere da sequência de DNA w.t. numa extensão elevada. Isto irá reduzir bastante o potencial para a recombinação homóloga entre a âncora de apresentação e o gene w.t. que também está presente.

Mais preferencialmente, a presente invenção utiliza um fago completo que transporta um gene de resistência a antibióticos (tal como um gene de resistência à ampicilina) e a cassete de apresentação. Devido à presença dos genes w.t. iii e viii, também estão presentes as proteínas w.t.. A cassete de apresentação é transcrita a partir de um promotor regulável (por exemplo, Plagz) · A utilização de um promotor regulável permite o controlo da proporção entre o gene de apresentação de fusão e a correspondendo proteína w.t. de revestimento. Esta proporção determina o número médio cópias de apresentação de fusão por partícula de fagos (ou fagemídeo). A descrição especifica um método de apresentação de péptidos, polipéptidos ou proteínas (e em particular os Fab) em fagos filamentosos. Na forma de realização mais preferida, este método apresenta FAB e inclui: a) obtenção de uma cassete de captura de uma diversidade de segmentos de DNA que codifica os elementos:

Preg: : RBS1: : SSI: : VL : : CL : :stop: :RBS2: : SS2 : : VH: : CHI: : lin ker::âncora::stop:: onde Preg é um promotor regulável, RBS1 é um primeiro sítio de ligação ao ribossoma, SS1 é uma sequência de sinal operável na estirpe hospedeira, VL é um membro de um conjunto diverso de regiões variáveis de cadeia leve, CL é uma região constante de cadeia leve, stop é um ou mais codões de paragem, RBS2 é um segundo sítio de ligação ao ribossoma, SS2 uma segunda sequência de sinal operável na estirpe hospedeira, VH é um membro de um conjunto diversificado de regiões variáveis de cadeia pesada, CHI é o primeiro domínio constante de cadeia pesada de anticorpo, linker é uma sequência de aminoácidos de um a cerca de 50 resíduos, âncora é uma proteína que vai montar na partícula de fago filamentoso e stop é um segundo exemplo de um ou mais codões de paragem; e b) posicionamento dessa cassete dentro do genoma do fago para maximizar a viabilidade do fago e para minimizar o potencial para a deleção da cassete ou suas partes. O DNA que codifica a proteína âncora na cassete preferida anterior deve ser desenhado para codificar a mesma sequência de aminoácidos (ou uma infimamente relacionada) que é encontrada em uma das proteínas de revestimento do fago, mas com uma sequência de DNA distintas. Isto é para evitar a recombinação homóloga não desejada com o gene w.t.. Além disso, a cassete deve ser colocado nas regiões intergénicas. 0 posicionamento e orientação da cassete de apresentação pode influenciar o comportamento do fago.

Um terminador da transcrição pode ser colocado após o segundo stop da cassete de apresentação anterior (por exemplo, Trp). Isto irá reduzir a interação entre a cassete de apresentação e de outros genes no vetor de apresentação de anticorpos em fagos (PADV).

Numa outra forma de realização da descrição, o fago ou fagemideo pode exibir outras proteínas de Fab, substituindo as porções Fab indicados anteriormente, com outros genes de proteínas. Vários hospedeiros pode ser utilizada para o crescimento dos fagos ou fagemídeos de apresentação. Tais hospedeiros são bem conhecidos na técnica. Na realização preferida, em que se apresentam Fab, o hospedeiro preferido deve crescer a 30°C e ser RecA“ (para reduzir a recombinação genética indesejada) e EndA- (para fazer a recuperação do DNA RF mais facilmente). É também preferido que a estirpe hospedeira seja facilmente transformada por eletroporação. A XLI-Blue MRF' satisfaz a maioria dessas preferências, mas não se desenvolve bem a 30 ° C. XLI-Blue MRF' cresce lentamente a 38°C e, portanto, é um hospedeiro aceitável. TG-1 também é um hospedeiro aceitável embora seja RecA+ e EndA+. A XLI-Blue MRF' é mais preferida para o hospedeiro intermediário utilizado para acumular diversidade antes da construção final da biblioteca.

Após a apresentação, as bibliotecas da presente invenção, podem ser pesquisados utilizando técnicas bem conhecidas e usadas convencionalmente. Os péptidos, polipéptidos ou proteínas selecionados podem então ser usados para tratar a doença. Geralmente, os péptidos, polipéptidos ou proteínas para utilização em terapia ou em composições farmacêuticas são produzidas por isolamento do DNA que codifica o péptido, polipéptido ou proteína desejada a partir do membro da biblioteca selecionada. Esse DNA é usado depois em métodos convencionais para produzir os péptidos, polipéptidos ou proteína que ele codifica em células hospedeiras adequadas, de preferência células hospedeiras de mamífero, por exemplo, células CHO. Após o isolamento, o péptido, polipéptido ou proteína é utilizado sozinho ou com composições farmaceuticamente aceitáveis em terapias para tratar a doença.

Exemplos

Exemplo 1: Capturar cadelas kappa com BsmAI:

Preparou-se uma lista de mRNA de cadeia kappa humano tratando o RNA total ou o poli(a+) RNA isolado a partir de um conjunto de pacientes com várias doenças autoimunes com fosfatase intestinal de vitelo para remover o fosfato 5' de todas as moléculas que o tenham, tal como RNA ribossomal, mRNA fragmentado, tRNA e DNA genómico. 0 mRNA de comprimento total (que contêm uma estrutura protetora de revestimento 7-metilo) não é afetado. 0 RNA é então tratado com pirofosfatase ácida de tabaco para retirar a estrutura protetora de revestimento a partir do mRNA de comprimento total deixando um grupo 5'-monofosfato. 0 mRNA de comprimento total foi modificado com um adaptador na extremidade 5' e, em seguida, transcrito de forma reversa e amplificado utilizando o método e o kit GeneRACE™ (Invitrogen). Utilizou-se um primer biotinilado em 5' complementar do adaptador e um primer 3' complementar a uma parte da região de construção.

Foram imobilizados aproximadamente 2 microgramas (yg) de material RACE do gene da cadeia capa humana (Igkappa) com biotina ligada ao extremo 5' da cadeia superior em 200 microlitros (yL) de esferas magnéticas Seradyn. A cadeia inferior foi removida por lavagem do DNA com 2 aliquotas de 200 yL de NaOH 0,1 M (pH 13) durante 3 minutos para a primeira alíquota seguida de 30 segundos para a segunda alíquota. As esferas foram neutralizadas com 200 yL de Tris 10 mM (pH 7,5) NaCl 100 mM. Os oligonucleótidos curtos mostrados na Tabela 525 foram adicionados em excesso molar de 40 vezes em 100 yL de tampão NEB 2 (NaCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, MgC12 10 mM, ditiotreitol ImM pH 7,9) às pérolas secas. A mistura foi incubada a 95 °C durante 5 minutos e depois arrefeceu-se até 55°C ao longo de 30 minutos. O excesso de oligonucleótido foi lavado com duas lavagens de tampão NEB 3 (NaCl 100 mM, Tris-HCl 50 mM, MgC12 10 mM, ditiotreitol 1 mM pH 7,9). Foram adicionadas dez unidades de BsmAI (NEB) em tampão NEB 3 e incubaram durante 1 hora a 55°C. O DNA clivado a jusante foi recolhido e purificado sobre uma coluna de purificação de PCR da Qiagen (FIGs. 3 e 4) .

Foi preparado um adaptador parcialmente de cadeia dupla utilizando o oligonucleótido apresentado na Tabela 525. O adaptador foi adicionado ao DNA de cadeia simples em excesso molar de 100 vezes, juntamente com 1000 unidades de DNA ligase T4 (NEB) e incubado durante a noite a 16°C. O excesso de oligonucleótido foi removido com uma coluna de purificação de PCR da Qiagen. O material ligado foi amplificado por PCR utilizando os primers kapPCRtl e os kapfor apresentados na Tabela 525, durante 10 ciclos com o programa da Tabela 530. O produto de PCR solúvel foi processado num gel e apresentou uma banda de, aproximadamente, 700 n, como esperado (FIG. 5 e 6) . O DNA foi clivado com as enzimas de ApaLI e As cl, purificado em gel e ligado ao vetor pCESl clivado de modo semelhante. A presença da inserção de tamanho correto foi verificada por PCR, em vários clones, como mostrado na FIG. 15. A Tabela 500 mostra a sequência de DNA de uma cadeia leve kapa, capturada por este processo. Tabela 501 mostra uma segunda sequência capturada por este processo. A sequência de ponte mais próxima era complementar à sequência 5'-agccacc-3', mas a sequência 5'-capturado lê Tgccacc-3', que mostra que algum desemparelhamento na região sobreposta é tolerado.

Exemplo 2: Construção de diversidade CDR1 e CDR2 sintética na estrutura V-3-23 VH

Contrução de uma diversidade de Regiões Determinante de Complementaridade (CDR, do inglês Complementary Determinant Region) 1 e 2 sintéticas na estrutura VH 3-23 num processo em duas etapas: em primeiro lugar, um vetor contendo a estrutura 3-23 VH foi construído, e, em seguida, uma CDR 1 e 2 sintética foi montado e clonado neste vetor.

Para a construção da estrutura V3-23, foram desenhados 8 oligonucleotídos e dois primers de PCR (oligonucleotídos longos: TOPFRlA, BOTFRlB, BOTFR2, BOTFR3, F06, BOTFR4, ON-vgCl, e ON-vgC2 e primers: SFPRMET e BOTPCRPRIM, mostrados na Tabela 600) que se sobrepõem e que foram concebidos com base na sequência de Genebank V323 VH. 0 desenho incorporou pelo menos um sitio de restrição útil em cada região de estrutura, como mostrado na Tabela 600. Na Tabela 600, os segmentos que foram sintetizados são apresentados em negrito, as regiões de hibridização são sublinhados e as regiões dos primers de PCR em cada extremidade estão sublinhados. Uma mistura destes oito oligos foram combinados numa concentração final de 2,5 μΜ numa reação de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) de 20 pL. A mistura de PCR continha dNTPs 200 μΜ, MgC12 2,5 mM, DNA polimerase Pfu Turbo™ 0,02U, DNA polimerase Taq HotStart Quiagen 1U e tampão de PCR Quiagen IX. O programa de PCR consistiu em 10 ciclos de 94°C durante 30s, 55°C durante 30s e 72°C durante 30s. A sequência de DNA da estrutura V3-23 foi depois amplificado, utilizando 2,5uL de uma diluição de 10 vezes a partir da reação de PCR inicial numa reação de PCR de 100 pL. A reação de PCR continha dNTP 200 pm, MgC12 2,5 mM, DNA polimerase Pfu Turbo™ 0,02 U, DNA polimerase Taq HotStart Quiagen 1U, tampão de PCR Qiagen IX e 2 primers externos (SFPRMET e BOTPCRPRIM) a uma concentração de ΙμΜ. O programa de PCR consistiu em 23 ciclos a 94°C durante 30s, 55°C durante 30s e 72°C durante 60s. A sequência de DNA VH V3-23 foi digerida e clonada em pCESl (vetor fagemideo), utilizando os locais de endonucleases de restrição SfiI e BstEII (Todas as enzimas de restrição aqui referidas foram fornecidas por New England BioLabs, Bererly, MA e utilizado de acordo com as instruções do fabricante).

Sequências "stuffer" (mostrada na Tabela 610 e Tabela 620) foram introduzidos no pCESl para substituir as sequências CDR1/CDR2 (900 bases entre os locais RE BspEI e Xfoal) e CDR3 (358 bases entre AflII e BstEII), antes da clonagem da diversidade CDR1/CDR2. O novo vetor é pCES5 e a sua sequência é apresentada na Tabela 620. Tendo stuffers em lugar das CDRs evita o risco de que uma sequência parental estar sobre-representada na biblioteca. 0 stutter CDRl-2 contém sítios de restrição para BglII, Bsu36l, Bell, Xcml, MluI, PVuII, HpaI, e Hindi, os sítios sublinhados únicos dentro do pCES5 vetor. 0 stuffer que substitui CDR3 contém o sítio de restrição de endonuclease único Rsrll. As sequências stuffer são fragmentos do gene penicilinase de E. coli.

Para a construção da diversidade de CDRl e CDR2, foram concebidos 4 oligonucleótidos sobrepostos (ON-vgCl, 0N_Brl2, 0N_CD2Xba, e 0N-vgC2, mostrados na Tabela Tabela 600 e 630) que codifica CDRl/2, para além de regiões flanqueadoras. Uma mistura desses oligos 4 foi feita a uma concentração final de 2,5 μΜ numa reação de PCR 40 pL. Dois dos quatro oligonucleótidos continham sequências variegadas posicionados na CDRl e CDR2. A mistura de PCR continha dNTPs 200 μΜ, DNA polimerase Pwo 2,5U (Roche) e IX Pwo PCR buffer com MgSCú 2 mM. O programa de PCR consistiu em 10 ciclos a 94°C durante 30s, 60°C durante 30s e 72°C durante 60s. Esta sequência estrutural de DNA de CDRl/2 foi amplificada, utilizando 2,5 pL da mistura numa reação de PCR de 100 pL. A reação de PCR continha dNTPs 200 μΜ, DNA Polimerase Pwo 2,5U, IX Tampão de PCR Pwo com MgSCú 2 mM e 2 primers externos a uma concentração de 1 μΜ. O programa de PCR consistiu em 10 ciclos a 94°C durante 30s, 60°C durante 30s e 72°C durante 60s. Estas sequências foram variegadas foram digeridas e clonadas no estrutura V3-23 em lugar da CDRl/2 stuffer.

Foram obtidos aproximadamente 7 X 107 transformantes independentes. Dentro dessa diversidade, os inventores poderam clonar diversidade de CDR3 a partir tanto de populações de dadores ou a partir de DNA sintético.

Além disso, a presente invenção refere-se aos seguintes artigos: 1. Um método para a clivagem de sequências de ácidos nucleicos de cadeia simples num local desejado, compreendendo o métodos as etapas de: (i) colocar em contacto o ácido nucleico com um oligonucleótido de cadeia simples, sendo o oligonucleótido funcionalmente complementar ao ácido nucleico na região em que a clivagem é desejada, e que inclui a sequência que com o seu complemento no ácido nucleico constitui um local de reconhecimento da endonuclease de restrição que com a restrição resulta em clivagem do ácido nucleico no local desejado; e (ii) clivar o ácido nucleico apenas no local de reconhecimento formado pela complementaridade do ácido nucleico e do oligonucleótido; realizando-se as etapas de contacto e os passos de clivagem a uma temperatura suficiente para manter o ácido nucleico substancialmente na forma de cadeia simples, o oligonucleótido ser funcionalmente complementar ao ácido nucleico ao longo de uma região grande o suficiente para permitir que as duas cadeias hibridem de modo que a clivagem possa ocorrer à temperatura selecionada e no local desejado, e a clivagem ser efetuada usando uma endonuclease de restrição que é ativa à temperatura selecionada. 2. Um método para a clivagem de sequências de cadeia simples de ácido nucleico num local desejado, incluindo o método as etapas de: (i) colocar em contacto o ácido nucleico com um oligonucleótido parcialmente de cadeia dupla, a região de cadeia simples do oligonucleótido ser funcionalmente complementar ao ácido nucleico na região em que a clivagem é desejado, e a região de cadeia dupla do oligonucleótido possuir um local de reconhecimento de endonuclease de restrição de Tipo II-S, cujo local de clivagem situa-se a uma distância conhecida do local de reconhecimento; e (ii) clivar o ácido nucleico unicamente no local de clivagem do Tipo II-S formado pela complementaridade do ácido nucleico e da região de cadeia simples do oligonucleótido; realizando-se as etapas de contacto e os passos de clivagem a uma temperatura suficiente para manter o ácido nucleico substancialmente na forma de cadeia simples, o oligonucleótido ser funcionalmente complementar ao ácido nucleico ao longo de uma região grande o suficiente para permitir que as duas cadeias hibridem de modo que a clivagem possa ocorrer à temperatura selecionada e no local desejado, e a clivagem ser efetuada usando uma endonuclease de restrição que é ativa à temperatura selecionada. 3. Um método para a apresentação de um membro de uma família diversificada de péptidos, polipéptidos ou proteínas à superfície de um pacote genético e apresentar coletivamente pelo menos uma parte da diversidade da família, sendo caracterizado o aperfeiçoamento porque pelo menos uma parte do péptido, polipéptido ou proteína apresentado é codificado, pelo menos em parte, por um ácido nucleico que foi clivado num local desejado por um método que inclui as etapas de: (i) colocar em contacto o ácido nucleico com um oligonucleótido de cadeia simples, sendo o oligonucleótido funcionalmente complementar ao ácido nucleico na região em que a clivagem é desejada, e que inclui a sequência que com o seu complemento no ácido nucleico constitui um local de reconhecimento da endonuclease de restrição que com a restrição resulta em clivagem do ácido nucleico no local desejado; e (ii) clivar o ácido nucleico apenas no local de reconhecimento formado pela complementaridade do ácido nucleico e do oligonucleótido; realizando-se as etapas de contacto e os passos de clivagem a uma temperatura suficiente para manter o ácido nucleico substancialmente na forma de cadeia simples, o oligonucleótido ser funcionalmente complementar ao ácido nucleico ao longo de uma região grande o suficiente para permitir que as duas cadeias hibridem de modo que a clivagem possa ocorrer à temperatura selecionada e no local desejado, e a clivagem ser efetuada usando uma endonuclease de restrição que é ativa à temperatura selecionada. 4. Um método para a apresentação de um membro de uma família diversificada de péptidos, polipéptidos ou proteínas à superfície de um pacote genético e coletivamente apresentar, pelo menos, uma parte da diversidade da família, sendo caracterizado o aperfeiçoamento porque pelo menos uma parte do péptido, polipéptido ou proteína apresentado é codificado, pelo menos em parte, por um ácido nucleico que foi clivado num local desejado pelo (i) o contacto do ácido nucleico com um oligonucleótido parcialmente de cadeia dupla, sendo que a região de cadeia simples do oligonucleótido é funcionalmente complementar ao ácido nucleico na região em que a clivagem é desejada, e a região de cadeia dupla do oligonucleótido tem um local de reconhecimento de uma endonuclease de restrição de Tipo II-S, cujo local de clivagem situa-se a uma distância conhecida do local de reconhecimento; e (ii) a clivagem do ácido nucleico apenas no local de clivagem de Tipo II-S formado pela complementaridade do ácido nucleico com a região de cadeia simples do oligonucleótido; realizando-se as etapas de contacto e os passos de clivagem a uma temperatura suficiente para manter o ácido nucleico substancialmente na forma de cadeia simples, o oligonucleótido ser funcionalmente complementar ao ácido nucleico ao longo de uma região grande o suficiente para permitir que as duas cadeias hibridem de modo que a clivagem possa ocorrer à temperatura selecionada e no local desejado, e a clivagem ser efetuada usando uma endonuclease de restrição que é ativa à temperatura selecionada. 5. Um método de apresentação de um membro de uma família diversificada de péptidos, polipéptidos ou proteínas à superfície de um pacote genético e apresentar coletivamente, pelo menos, uma parte da diversidade da família, incluindo o método as etapas de: (i) preparação de um conjunto de ácidos nucleicos que codificam pelo menos em parte, para os membros da família diversa; (ii) fazer os ácidos nucleicos de cadeia simples; (iii) clivar dos ácidos nucleicos de cadeia simples num local desejado por um método compreendendo as etapas de; (a) colocar em contacto o ácido nucleico com um oligonucleótido de cadeia simples, sendo o oligonucleótido funcionalmente complementar ao ácido nucleico na região em que a clivagem é desejada, e que inclui a sequência que com o seu complemento no ácido nucleico constitui um local de reconhecimento da endonuclease de restrição que com a restrição resulta em clivagem do ácido nucleico no local desejado; e (b) clivar o ácido nucleico apenas no local de reconhecimento formado pela complementaridade do ácido nucleico e o oligonucleótido; realizando-se as etapas de contacto e os passos de clivagem a uma temperatura suficiente para manter o ácido nucleico substancialmente na forma de cadeia simples, o oligonucleótido ser funcionalmente complementar ao ácido nucleico ao longo de uma região grande o suficiente para permitir que as duas cadeias hibridem de modo que a clivagem possa ocorrer à temperatura selecionada e no local desejado, e a clivagem ser efetuada usando uma endonuclease de restrição que é ativa à temperatura selecionada. (iv) apresentar um membro da família de péptidos, polipéptidos ou proteínas codificado, pelo menos em parte, pelos ácidos nucleicos clivadas na superfície dos pacotes genética e que apresentam coletivamente, pelo menos, uma parte da diversidade da família. 6. Um método de apresentação de um membro de uma família diversificada de péptidos, polipéptidos ou proteínas à superfície de um pacote genético e apresentar coletivamente, pelo menos, uma porção da diversidade da família, incluindo o método as etapas de: (i) preparação de uma coleção de ácidos nucleicos que codifica, pelo menos em parte, para os membros da família diversa; (ii) tornar os ácidos nucleicos de cadeia simples; (iii) clivar os ácidos nucleicos de cadeia simples numa localização desejada por um método que inclui as etapas de: (a) contacto do ácido nucleico com um oligonucleótido parcialmente de cadeia dupla, sendo que a região de cadeia simples do oligonucleótido é funcionalmente complementar ao ácido nucleico na região em que a clivagem é desejada, e a região de cadeia dupla do oligonucleótido tem um local de reconhecimento de uma endonuclease de restrição de Tipo II-S, cujo local de clivagem situa-se a uma distância conhecida do local de reconhecimento; e (b) clivagem do ácido nucleico apenas no local de clivagem de Tipo II-S formado pela complementaridade do ácido nucleico com a região de cadeia simples do oligonucleótido; realizando-se as etapas de contacto e os passos de clivagem a uma temperatura suficiente para manter o ácido nucleico substancialmente na forma de cadeia simples, o oligonucleótido ser funcionalmente complementar ao ácido nucleico ao longo de uma região grande o suficiente para permitir que as duas cadeias hibridem de modo que a clivagem possa ocorrer à temperatura selecionada e no local desejado, e a clivagem ser efetuada usando uma endonuclease de restrição que é ativa à temperatura selecionada; e (iv) apresentar um membro da família de péptidos, polipéptidos ou proteínas codificado, pelo menos em parte, pelos ácidos nucleicos clivadas na superfície dos pacotes genética e que apresentam coletivamente, pelo menos, uma parte da diversidade da família. 7. Uma biblioteca inclui uma coleção de pacotes genéticos que apresentam um membro de uma família diversa de péptidos, polipéptidos ou proteínas e que apresenta de forma coletiva, pelo menos, uma parte da diversidade da família, sendo a biblioteca produzida utilizando os métodos dos artigos 3, 4, 5 ou 6. 8. Uma biblioteca que inclui uma coleção de pacotes genéticos que apresentam um membro de uma família diversa de péptidos, polipéptidos ou proteínas e que apresenta coletivamente, pelo menos, uma parte da família, sendo apresentados os péptidos, polipéptidos ou proteínas, codificados por sequências de DNA que incluem, pelo menos, sequências produzidas por clivagem das sequências de ácidos nucleicos de cadeia simples num local desejado por um método que inclui as etapas de: (i) pôr em contacto o ácido nucleico com um oligonucleótido de cadeia simples, sendo o oligonucleótido funcionalmente complementar ao ácido nucleico na região em que a clivagem é desejada, e que inclui a sequência que com o seu complemento no ácido nucleico constitui um local de reconhecimento da endonuclease de restrição que com a restrição resulta em clivagem do ácido nucleico no local desejado; e (ii)clivar o ácido nucleico apenas no local de reconhecimento formado pela complementaridade do ácido nucleico e o oligonucleótido; realizando-se as etapas de contacto e os passos de clivagem a uma temperatura suficiente para manter o ácido nucleico substancialmente na forma de cadeia simples, o oligonucleótido ser funcionalmente complementar ao ácido nucleico ao longo de uma região grande o suficiente para permitir que as duas cadeias hibridem de modo que a clivagem possa ocorrer à temperatura selecionada e no local desejado, e a clivagem ser efetuada usando uma endonuclease de restrição que é ativa à temperatura selecionada. 9. Uma biblioteca que inclui uma coleção de pacotes genéticos que apresentam um membro de uma família diversificada de péptidos, polipéptidos ou proteínas e que apresentam de forma coletiva, pelo menos, uma porção da diversidade da família dos péptidos, polipéptidos ou proteínas apresentados que são codificados por sequências de DNA que abrangem, pelo menos em parte, sequências produzidas pela clivagem de sequências de ácido nucleicos de cadeia simples num local desejado por um método que inclui as etapas de: (i)contacto do ácido nucleico com um oligonucleótido parcialmente de cadeia dupla, sendo que a região de cadeia simples do oligonucleótido é funcionalmente complementar ao ácido nucleico na região em que a clivagem é desejada, e a região de cadeia dupla do oligonucleótido tem um local de reconhecimento de uma endonuclease de restrição de Tipo II-S, cujo local de clivagem situa-se a uma distância conhecida do local de reconhecimento; e (b)clivagem do ácido nucleico apenas no local de clivagem de Tipo II-S formado pela complementaridade do ácido nucleico com a região de cadeia simples do oligonucleótido; realizando-se as etapas de contacto e os passos de clivagem a uma temperatura suficiente para manter o ácido nucleico substancialmente na forma de cadeia simples, o oligonucleótido ser funcionalmente complementar ao ácido nucleico ao longo de uma região grande o suficiente para permitir que as duas cadeias hibridem de modo que a clivagem possa ocorrer à temperatura selecionada e no local desejado, e a clivagem ser efetuada usando uma endonuclease de restrição que é ativa à temperatura selecionada. 10. Os métodos de acordo com qualquer um dos artigos 1 a 9, em que os ácidos nucleicos codificam pelo menos uma parte de uma imunoglobulina. 11. Os métodos de acordo com o artigo 10, em que a imunoglobulina inclui Fab ou Fv de cadeia simples. 12. Os métodos de acordo com os artigos 10 ou 11, em que a imunoglobulina inclui, pelo menos, parte de uma cadeia pesada. 13. Os métodos de acordo com o artigo 12, em que pelo menos uma porção da cadeia pesada é humana. 14. Os métodos de acordo com os artigos 10 ou 11, em que a imunoglobulina inclui pelo menos uma parte de FRl. 15. Os métodos de acordo com o artigo 14, em que pelo menos uma parte de FRl é humana. 16. Os métodos de acordo com o artigo 10 ou 11, em que a imunoglobulina inclui, pelo menos, uma parte de uma cadeia leve. 17. Os métodos de acordo com o artigo 16, em que pelo menos uma parte da cadeia leve é humana. 18. Os métodos de acordo com qualquer um dos artigos 1 a 9, em que as sequências de ácidos nucleicos tenham origem, pelo menos em parte, em pacientes que sofrem de, pelo menos, uma doença autoimune e/ou cancro. 19. Os métodos de acordo com o artigo 18, em que a doença autoimune é selecionada a partir do grupo que compreende o lúpus eritematoso, esclerose sistémica, artrite reumatoide, a sindrome antifosfolipidico ou vasculite. 20. Os métodos de acordo com o artigo 18 em que os ácidos nucleicos são, pelo menos em parte, isolados a partir do grupo que compreende células de sangue periférico, células de medula óssea células do baço ou de células nódulos linfáticos. 21. Os métodos de acordo com o artigo 5 ou 6 que incluem ainda um passo de amplificação de ácido nucleico entre os passos (i) e (ii), entre os passos (ii) e (iii) ou entre os passos (iii) e (iv). 22. Os métodos de acordo com o artigo 21, em que no pprocesso de amplificação se usa geneRACE™. 23. Os métodos de acordo com qualquer um dos artigos 1 a 9, em que a temperatura está entre 45°C e 75°C. 24. Os métodos de acordo com o artigo 23, em que a temperatura está entre 50°C e 60 °C. 25. Os métodos de acordo com o artigo 24, em que a temperatura está entre 55°C e 60°C. 26. Os métodos de acordo com o artigo 1, 3, 5 ou 8, em que o comprimento do oligonucleótido de cadeia simples está entre 17 e 30 bases. 27. Os métodos de acordo com o artigo 26, em que o comprimento do oligonucleótido de cadeia simples está entre 18 e 24 base. 28. Os métodos de acordo com o artigo 1, 3, 5 ou 8, em que a endonuclease de restrição é selecionada a partir do grupo que inclui: MaelII, Tsp45l, Hphl, BsaJI, Alui, BlpI, DdeI, BglII, MslI, BsiEI, EaeI, EagI , BaelI,

Bst4CI, BpyCH4lII, Hinfl, Mlyl, Piei, Mnll, BpyCH4V, BsmAI, Bpml, XmnI, ou Saci. 29. Os métodos de acordo com o artigo 28, em que a endonuclease de restrição é selecionada a partir do grupo que compreende Bst4CI, Taal, fípyCH4lII, BlpI, íípyCH4V ou MsII. 30. Os métodos de acordo com o artigo 2, 4, 6 ou 9, em que o comprimento da região de cadeia simples do oligonucleótido parcialmente de cadeia dupla é entre 14 e 22 bases. 31. Os métodos de acordo com o artigo 30, em que o comprimento da região de cadeia simples do oligonucleótido parcialmente de cadeia dupla é entre 14 e 17 bases. 32. Os métodos de acordo com o artigo 31, em que o comprimento da região de cadeia simples do oligonucleótido é entre 18 e 20 bases. 33. Os métodos de acordo com o artigo 2 4, 6 ou 9, em que o comprimento da região de cadeia dupla do oligonucleótido parcialmente de cadeia dupla é entre 10 e 14 pares de bases formados por uma haste e seu palindroma. 34. Os métodos de acordo com o artigo 33, em que o oligonucleótido parcialmente de cadeia dupla compreende uma alça de 3 a 8 bases entre a haste e o palindroma. 35. Os métodos de acordo com o artigo 2, 4, 6 ou 9, em que as endonuclease de restrição do Tipo II-S são selecionadas a partir do grupo que compreende AarICAC, AcelII, Bbr7I, Bbvl, BbvII, Bce83l, BceAI, Bcefl, BciVI, Bfil , BinI, BscAI, BseRI, BsmFI, BspMI, Ecil, Eco571, Faul, Fokl, Gsul, Hgal, Hphl, MboII, Mlyl,

Mmel, MnlI, Plel, RleAI, SfaNI, SspD5l, Sthl32l, StsI, TaqII, Tthlllll, ou UbaPI. 36. Os métodos de acordo com o artigo 35, em que a endonuclease de restrição de Tipo II-S é a FokI. 37. Um método para a preparação de ácidos nucleicos de cadeia simples por clonagem num vetor, incluindo ο método as etapas de: (i) pôr em contacto uma sequência de ácido nucleico de cadeia simples que foi clivado com uma endonuclease de restrição com um oligonucleótido parcialmente de cadeia dupla, sendo que a região de cadeia simples do oligonucleótido é funcionalmente complementar ao ácido nucleico na região que permanece depois da clivagem, a região de cadeia dupla do oligonucleótido, incluindo quaisquer sequências necessárias para devolver as sequências que permanecem após a clivagem na forma correta e original da grelha de leitura para expressão e que contêm um local de reconhecimento da endonuclease de restrição 5' dessas sequências; e (ii) clivam a sequência do oligonucleótido parcialmente de cadeia dupla apenas no local de reconhecimento de endonuclease de restrição contido dentro da região de cadeia dupla do oligonucleótido parcialmente de cadeia dupla. 38. 0 método de acordo com o artigo 37, em que o comprimento da zona de cadeia simples do oligonucleótido parcialmente de cadeia dupla é entre 2 e 15 bases. 39. 0 método de acordo com o artigo 38, em que o comprimento da zona de cadeia simples do oligonucleótido parcialmente de cadeia dupla está entre 7 e 10 bases. 40. O método de acordo com o artigo 37, em que o comprimento da zona de cadeia dupla do oligonucleótido parcialmente de cadeia dupla é entre 12 e 100 pares de bases. 41. O método de acordo com o artigo 40, em que o comprimento da zona de cadeia dupla do oligonucleótido parcialmente de cadeia dupla é entre 20 e 100 pares de bases.

Listagem de Sequências

<110> DYAX CORPORATION

<120> MÉTODOS PARA CONSTRUIR BIBLIOTECAS DE PACOTES

GENÉTICOS QUE REPRESENTAM OS MEMBROS DE UMA FAMÍLIA DIVERSIFICADA DE PÉPTIDOS <130> DYAX/002 <140> PCT/US01/12 4 54 <141> 2001-04-17 <150> 60/198,069 <151> 2000-04-17 <160> 428 <170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 1 catgtgtatt actgtgc 17

<210> 2 <211> 44 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 2 cacatccgtg cttcttgcac ggatgtggca cagtaataca catg 44

<210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 3 gtgtattaga ctgctgcc 18

<210> 4 <211> 43 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4Ο0> 4 ggcagcagtc taatacacca catccgtgtt cttcacggat gtg 43

<210> 5 <211> 47 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 5 cacatccgtg tttgttacac ggatgtggtg tcttacagtc cattctg 47

<210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 6 cagaatggac tgtaagacac 20

<210> 7 <211> 43 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 7 atcgagtctc actgagccac atccgtggtt ttccacggat gtg 43

<210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 8 gctcagtgag actcgat 17

<210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 9 atgaccgaat tgctacaag 19

<210> 10 <211> 46 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 10 gactcctcag cttcttgctg aggagtcctt gtagcaattc ggtcat 46 <210> 11 <211> 30

<212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 11 acctcactgg cttccggatt cactttctct 30

<210> 12 <211> 42 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 12 agaaacccac tccaaacctt taccaggagc ttggcgaacc ca 42

<210> 13 <211> 51 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 13 ggaaggcagt gatctagaga tagtgaagcg acctttaacg gagtcagcat a 51

<210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Sequência Artificial <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <22 0> <4 0 0> 14 ggaaggcagt gatctagaga tag 23

<210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <22 0> <221> base_modifiçada <222> (11)..(24) <223> a, t, c, g, outro ou desconhecido <4 0 0> 15 cacggatgtg nnnnnnnnnn nnnn 24

<210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <22 0> <221> base_modifiçada <222> (1)..(14) <223> a, t, c, g, outro ou desconhecido <4 Ο 0> 16 ηηηηηηηηηη nnnncacatc cgtg 24

<210> 17 <211> 14 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 17 gtgtattact gtgc 14

<210> 18 <211> 34 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 18 cacatccgtg cacggatgtg gcacagtaat acac 34

<210> 19 <211> 14 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 19 gtgtattaga ctgc 14

<210> 20 <211> 34 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 20 gcagtctaat acaccacatc cgtgcacgga tgtg 34

<210> 21 <211> 34 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 21 cacatccgtg cacggatgtg gtgtcttaca gtcc 34

<210> 22 <211> 14 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 22 ggactgtaag acac 14 <210> 23 <211> 34

<212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 23 gagtctcact gagccacatc cgtgcacgga tgtg 34

<210> 24 <211> 14 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 24 gctcagtgag actc 14

<210> 25 <211> 14 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 25 gtgtattact gtgc 14

<210> 26 <211> 14 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 26 gtatattact gtgc 14

<210> 27 <211> 14 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 27 gtgtattact gtaa 14

<210> 28 <211> 14 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 28 gtgtattact gtac 14

<210> 29 <211> 14 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4Ο0> 29 ttgtattact gtgc 14

<210> 30 <211> 14 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 30 ttgtatcact gtgc 14

<210> 31 <211> 14 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 31 acatattact gtgc 14

<210> 32 <211> 14 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 32 acgtattact gtgc 14

<210> 33 <211> 14 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 33 atgtattact gtgc 14

<210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: "Primer" <400> 34 tggaagaggc acgttctttt cttt 24

<210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: "Primer" <400> 35 aaagaaaaga acgtgcctct tcca 24

<210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: "Primer" <400> 36 acactctccc ctgttgaagc tctt 24

<210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: "Primer" <400> 37 tgaacattct gtaggggcca ctg 23

<210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: "Primer" <400> 38 agagcattct gcaggggcca ctg 23 <210> 39 <211> 51 <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: "Primer" <400> 39 accgcctcca ccgggcgcgc cttattaaca ctctcccctg ttgaagctct t 51

<210> 40 <211> 50 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: "Primer" <400> 40 accgcctcca ccgggcgcgc cttattatga acattctgta ggggccactg 50

<210> 41 <211> 50 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: "Primer" <400> 41 accgcctcca ccgggcgcgc cttattaaga gcattctgca ggggccactg 50 <210> 42 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 agggtcacca tgaccaggga cacgtccatc agcacagcct acatggagct gagcaggctg 60 agatctgacg acacggccgt gtattactgt gcgagaga 98 <210> 43 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <4Ο0> 43 agagtcacca ttaccaggga cacatccgcg agcacagcct acatggagct gagcagcctg 6 0 agatctgaag acacggctgt gtattactgt gcgagaga 98 <210> 44 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 agagtcacca tgaccaggaa cacctccata agcacagcct acatggagct gagcagcctg 60 agatctgagg acacggccgt gtattactgt gcgagagg 98 <210> 45 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45

agagtcacca tgaccacaga cacatccacg agcacagcct acatggagct gaggagcctg 60 agatctgacg acacggccgt gtattactgt gcgagaga 9B <210> 46 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 6 agagtcacca tgaccgagga cacatctaca gacacagcct acatggagct gagcagcctg 60 agatctgagg acacggccgt gtattactgt gcaacaga 98 <210> 47 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 agagtcacca ttaccaggga caggtctatg agcacagcct acatggagct gagcagcctg 60 agatctgagg acacagccat gtattactgt gcaagata 98 <210> 48 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 48 agagtcacca tgaccaggga cacgtccacg agcacagtct acatggagct gagcagcctg 60 agatctgagg acacggccgt gtattactgt gcgagaga 98 <210> 49 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 49 agagtcacca ttaccaggga catgtccaca agcacagcct acatggagct gagcagcctg 60 agatccgagg acacggccgt gtattactgt gcggcaga 98 <210> 50 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 50 agagtcacga ttaccgcgga cgaatccacg agcacagcct acatggagct gagcagcctg 60 agatctgagg acacggccgt gtattactgt gcgagaga 98 <210> 51 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 51 agagtcacga ttaccgcgga caaatccacg agcacagcct acatggagct gagcagcctg 60 agatctgagg acacggccgt gtattactgt gcgagaga 98 <210> 52 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 52 agagtcacca taaccgcgga cacgtctaca gacacagcct acatggagct gagcagcctg 60 agatctgagg acacggccgt gtattactgt gcaacaga 98 <210> 53 <211> 100

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 53 aggctcacca tcaccaagga cacctccaaa aaccaggtgg tccttacaat gaccaacatg 60 gaccctgtgg acacagccac atatcactgt gcacacagac 100 <210> 54 <211> 100

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 54 aggctcacca tctccaagga cacctccaaa agccaggtgg tccttaccat gaccaacatg 60 gaccctgtgg acacagccac atattactgt gcacggatac 100 <210> 55 <211> 100

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 55 aggctcacca tctccaagga cacctccaaa aaccaggtgg tccttacaat gaccaacatg 60 gaccctgtgg acacagccac gtattactgt gcacggatac 100 <210> 56 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 56 cgattcacca tctccagaga caacgccaag aactcactgt atctgcaaat gaacagcctg 60 agagccgagg acacggctgt gtattactgt gcgagaga 98 <210> 57 <211> 100

<212> DNA <213> Homo sapiens <4Ο0> 57 cgattcacca tctccagaga caacgccaag aactccctgt atctgcaaat gaacagtctg 60 agagctgagg acacggcctt gtattactgt gcaaaagata 100 <210> 58 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 58 cgattcacca tctccaggga caacgccaag aactcactgt atctgcaaat gaacagcctg 60 agagccgagg acacggccgt gtattactgt gcgagaga 98 <210> 59 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 59 cgattcacca tctccagaga aaatgccaag aactccttgt atcttcaaat gaacagcctg 60 agagccgggg acacggctgt gtattactgt gcaagaga 98 <210> 60 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 60 agattcacca tctcaagaga tgattcaaaa aacacgctgt atctgcaaat gaacagcctg 60 aaaaccgagg acacagccgt gtattactgt accacaga 98 <210> 61 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 61 cgattcacca tctccagaga caacgccaag aactccctgt atctgcaaat gaacagtctg 60 agagccgagg acacggcctt gtatcactgt gcgagaga 98 <210> 62 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 62 cgattcacca tctccagaga caacgccaag aactcactgt atctgcaaat gaacagcctg 60 agagccgagg acacggctgt gtattactgt gcgagaga 98 <210> 63 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 63 cggttcacca tctccagaga caattccaag aacacgctgt atctgcaaat gaacagcctg 60 agagccgagg acacggccgt atattactgt gcgaaaga 98 <210> 64 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 64 cgattcacca tctccagaga caattccaag aacacgctgt atctgcaaat gaacagcctg 60 agagctgagg acacggctgt gtattactgt gcgaaaga 98 <210> 65 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 65 cgattcacca tctccagaga caattccaag aacacgctgt atctgcaaat gaacagcctg 60 agagctgagg acacggctgt gtattactgt gcgagaga 98 <210> 66 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 6 cgattcacca tctccagaga caattccaag aacacgctgt atctgcaaat gaacagcctg 60 agagctgagg acacggctgt gtattactgt gcgaaaga 93 <210> 67 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 67 cgattcacca tctccagaga caattccaag aacacgctgt atctgcaaat gaacagcctg 60 agagccgagg acacggctgt gtattactgt gcgagaga 98 <210> 68 <211> 100

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 68 cgattcacca tctccagaga caacagcaaa aactccctgt atctgcaaat gaacagtctg 60 agaactgagg acaccgcctt gtattactgt gcaaaagata 100 <210> 69 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 9 cgattcacca tctccagaga caatgccaag aactcactgt atctgcaaat gaacagcctg 60 agagacgagg acacggctgt gtattactgt gcgagaga 98 <210> 70 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 70 agattcacca tctcaagaga tggttccaaa agcatcgcct atctgcaaat gaacagcctg 60 aaaaccgagg acacagccgt gtattactgt actagaga 98 <210> 71 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <4Ο0> 71 cgattcacca tctccagaga caattccaag aacacgctgt atcttcaaat gaacagcctg 60 agagccgagg acacggccgt gtattactgt gcgagaga 98 <210> 72 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 72 agattcacca tctccagaga caattccaag aacacgctgt atcttcaaat gggcagcctg 60 agagctgagg acatggctgt gtattactgt gcgagaga 98 <210> 73 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 73 agattcacca tctccagaga caattccaag aacacgctgt atcttcaaat gaacagcctg 60 agagctgagg acacggctgt gtattactgt gcgagaga 98 <210> 74 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 74 agattcacca tctcaagaga tgattcaaag aactcactgt atctgcaaat gaacagcctg 60 aaaaccgagg acacggccgt gtattactgt gctagaga 98 <210> 75 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <210> 76 <211> 98 <400> 75 aggttcacca tctccagaga tgattcaaag aacacggcgt atctgcaaat gaacagcctg 60 aaaaccgagg acacggccgt gtattactgt actagaca 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 76 cgattcacca tctccagaga caacgccaag aacacgctgt atctgcaaat gaacagtctg 60 agagccgagg acacggctgt gtattactgt gcaagaga 98 <210> 77 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 77 agattcacca tctccagaga caattccaag aacacgctgc atcttcaaat gaacagcctg 60 agagctgagg acacggctgt gtattactgt aagaaaga 98 <210> 78 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 78 cgagtcacca tatcagtaga caagtccaag aaccagttct ccctgaagct gagctctgtg 60 accgccgcgg acacggccgt gtattactgt gcgagaga 98 <210> 79 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 79 cgagtcacca tgtcagtaga cacgtccaag aaccagttct ccctgaagct gagctctgtg 60 accgccgtgg acacggccgt gtattactgt gcgagaaa 98 <210> 80 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 80 cgagttacca tatcagtaga cacgtctaag aaccagttct ccctgaagct gagctctgtg 60 actgccgcgg acacggccgt gtattactgt gcgagaga 98 <210> 81 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 81

cgagtcacca tatcagtaga caggtccaag aaccagttct ccctgaagct gagctctgtg 60 accgccgcgg acacggccgt gtattactgt gccagaga 9B <210> 82 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 82 cgagttacca tatcagtaga cacgtccaag aaccagttct ccctgaagct gagctctgtg 60 actgccgcag acacggccgt gtattactgt gccagaga 98 <210> 83 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 83

cgagttacca tatcagtaga cacgtctaag aaccagttct ccctgaagct gagctctgtg 60 actgccgcgg acacggccgt gtattactgt gcgagaga 9B <210> 84 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 84 cgagtcacca tatcagtaga cacgtccaag aaccagttct ccctgaagct gagctctgtg 60 accgccgcgg acacggctgt gtattactgt gcgagaga 98 <210> 85 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <4Ο0> 85 cgagtcacca tatccgtaga cacgtccaag aaccagttct ccctgaagct gagctctgtg 60 accgccgcag acacggctgt gtattactgt gcgagaca 98 <210> 86 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 86 cgagtcacca tatcagtaga cacgtccaag aaccagttct ccctgaagct gagctctgtg 60 accgctgcgg acacggccgt gtattactgt gcgagaga 98 <210> 87 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 87 cgagtcacca tatcagtaga cacgtccaag aaccagttct ccctgaagct gagctctgtg 60 accgctgcgg acacggccgt gtattactgt gcgagaga 98 <210> 88 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 88

cgagtcacca tatcagtaga cacgtccaag aaccagttct ccctgaagct gagctctgtg 60 accgccgcag acacggccgt gtattactgt gcgagaga 9B <210> 89 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <210> 90 <211> 96 <400> 89 caggtcacca tctcagccga caagtccatc agcaccgcct acctgcagtg gagcagcctg 60 aaggcctcgg acaccgccat gtattactgt gcgagaca 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 90 cacgtcacca tctcagctga caagtccatc agcactgcct acctgcagtg gagcagcctg 60 aaggcctcgg acaccgccat gtattactgt gcgaga 96 <210> 91 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 91 cgaataacca tcaacccaga cacatccaag aaccagttct ccctgcagct gaactctgtg 60 actcccgagg acacggctgt gtattactgt gcaagaga 98 <210> 92 <211> 98

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 92 cggtttgtct tctccttgga cacctctgtc agcacggcat atctgcagat ctgcagccta 60 aaggctgagg acactgccgt gtattactgt gcgagaga 98

<210> 93 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda <400> 93 agttctccct gcagctgaac tc 22

<210> 94 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda <400> 94 cactgtatct gcaaatgaac ag 22

<210> 95 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda <400> 95 ccctgtatct gcaaatgaac ag 22

<210> 96 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda <400> 9 6 ccgcctacct gcagtggagc ag 22

<210> 97 <211> 22 <212> DNA < 213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda <400> 97 cgctgtatct gcaaatgaac ag 22

<210> 98 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda <400> 98 cggcatatct gcagatctgc ag 22

<210> 99 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda <400> 99 cggcgtatct gcaaatgaac ag 22

<210> 100 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda <4 0 0> 100 ctgcctacct gcagtggagc ag 22

<210> 101 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda <4 0 0> 101 tcgcctatct gcaaatgaac ag 22

<210> 102 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucledtido sintético <4 0 0> 102 agttctccct gcagctgaac tc 22

<210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucledtido sintético <4 0 0> 103 ttctccctgc agctgaactc 20

<210> 104 <211> 18 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucledtido sintético <4 Ο 0> 104 ttctccctgc agctgaac 18

<210> 105 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 105 cgctgtatct gcaaatgaac ag 22

<210> 106 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 106 ctgtatctgc aaatgaacag 20

<210> 107 <211> 18 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 107 ctgtatctgc aaatgaac 18

<210> 108 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 108 cactgtatct gcaaatgaac ag 22

<210> 109 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 109 ccgcctacct gcagtggagc ag 22

<210> 110 <211> 42 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 110 cgcttcacta agtctagaga caactctaag aatactctct ac 42 <210> 111 <211> 21

<212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 111 ttgcagatga acagcttaag g 21

<210> 112 <211> 45 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 112 caagtagaga gtattcttag agttgtctct agacttagtg aagcg 45

<210> 113 <211> 54 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 113 cgcttcacta agtctagaga caactctaag aatactctct acttgcagct gaac 54

<210> 114 <211> 54 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 114 cgcttcacta agtctagaga caactctaag aatactctct acttgcaaat gaac 54

<210> 115 <211> 54 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 115 cgcttcacta agtctagaga caactctaag aatactctct acttgcagtg gagc 54

<210> 116 <211> 21 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 116 cgcttcacta agtctagaga c 21

<210> 117 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda <4 0 0> 117 acatggagct gagcagcctg ag 22

<210> 118 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda <4 0 0> 118 acatggagct gagcaggctg ag 22

<210> 119 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda <4 0 0> 119 acatggagct gaggagcctg ag 22

<210> 120 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda <4 0 0> 120 acctgcagtg gagcagcctg aa 22

<210> 121 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda <4 0 0> 121 atctgcaaat gaacagcctg aa 22

<210> 122 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda <4 0 0> 122 atctgcaaat gaacagcctg ag 22

<210> 123 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda <4 0 0> 123 atctgcaaat gaacagtctg ag 22

<210> 124 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda <4 0 0> 124 atctgcagat ctgcagccta aa 22

<210> 125 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda <4 0 0> 125 atcttcaaat gaacagcctg ag 22

<210> 126 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda <4 0 0> 126 atcttcaaat gggcagcctg ag 22

<210> 127 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda <4 0 0> 127 ccctgaagct gagctctgtg ac 22

<210> 128 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda <4 0 0> 128 ccctgcagct gaactctgtg ac 22

<210> 129 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda <4 0 0> 129 tccttacaat gaccaacatg ga 22

<210> 130 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda <4 0 0> 130 tccttaccat gaccaacatg ga 22

<210> 131 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 131 acatggagct gagcagcctg ag 22

<210> 132 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 132 ccctgaagct gagctctgtg ac 22

<210> 133 <211> 54 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 133 cgcttcacta agtctagaga caactctaag aatactctct acttgcagat gaac 54

<210> 134 <211> 60 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 134 cgcttcactc agtctagaga taacagtaaa aatactttgt acttgcagct gagcagcctg 60

<210> 135 <211> 60 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 135 cgcttcactc agtctagaga taacagtaaa aatactttgt acttgcagct gagctctgtg 60

<210> 136 <211> 52 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 136 tcagctgcaa gtacaaagta tttttactgt tatctctaga ctgagtgaag cg 52

<210> 137 <211> 24 <212> DNA <213> Sequência Artificial <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <22 0> <4 0 0> 137 cgcttcactc agtctagaga taac 24

<210> 138 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 138 ccgtgtatta ctgtgcgaga ga 22

<210> 139 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 139 ctgtgtatta ctgtgcgaga ga 22

<210> 140 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 Ο 0> 140 ccgtgtatta ctgtgcgaga gg 22

<210> 141 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 141 ccgtgtatta ctgtgcaaca ga 22

<210> 142 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 142 ccatgtatta ctgtgcaaga ta 22

<210> 143 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 143 ccgtgtatta ctgtgcggca ga 22

<210> 144 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 144 ccacatatta ctgtgcacac ag 22

<210> 145 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 145 ccacatatta ctgtgcacgg at 22

<210> 146 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 146 ccacgtatta ctgtgcacgg at 22 <210> 147 <211> 22

<212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 147 ccttgtatta ctgtgcaaaa ga 22

<210> 148 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 148 ctgtgtatta ctgtgcaaga ga 22

<210> 149 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 149 ccgtgtatta ctgtaccaca ga 22

<210> 150 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <22 0> <4 0 0> 150 ccttgtatca ctgtgcgaga ga 22

<210> 151 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 151 ccgtatatta ctgtgcgaaa ga 22

<210> 152 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 152 ctgtgtatta ctgtgcgaaa ga 22

<210> 153 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 Ο 0> 153 ccgtgtatta ctgtactaga ga 22

<210> 154 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 154 ccgtgtatta ctgtgctaga ga 22

<210> 155 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 155 ccgtgtatta ctgtactaga ca 22

<210> 156 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 156 ctgtgtatta ctgtaagaaa ga 22

<210> 157 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 157 ccgtgtatta ctgtgcgaga aa 22

<210> 158 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 158 ccgtgtatta ctgtgccaga ga 22

<210> 159 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 159 ctgtgtatta ctgtgcgaga ca 22 <210> 160 <211> 22

<212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 160 ccatgtatta ctgtgcgaga ca 22

<210> 161 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 161 ccatgtatta ctgtgcgaga 20

<210> 162 <211> 21 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 162 ccgtgtatta ctgtgcgaga g 21

<210> 163 <211> 21 <212> DNA <213> Sequência Artificial <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <22 0> <4 0 0> 163 ctgtgtatta ctgtgcgaga g 21

<210> 164 <211> 21 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 164 ccgtgtatta ctgtgcgaga g 21

<210> 165 <211> 21 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 165 ccgtatatta ctgtgcgaaa g 21

<210> 166 <211> 21 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 Ο 0> 166 ctgtgtatta ctgtgcgaaa g 21

<210> 167 <211> 21 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 167 ctgtgtatta ctgtgcgaga c 21

<210> 168 <211> 21 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 168 ccatgtatta ctgtgcgaga c 21

<210> 169 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 169 ccatgtatta ctgtgcgaga 20

<210> 170 <211> 94 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 170 ggtgtagtga tctagtgaca actctaagaa tactctctac ttgcagatga acagctttag 60 ggctgaggac actgcagtct actattgtgc gaga 94

<210> 171 <211> 94 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 171 ggtgtagtga tctagtgaca actctaagaa tactctctac ttgcagatga acagctttag 60 ggctgaggac actgcagtct actattgtgc gaaa 94

<210> 172 <211> 85 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 172 atagtagact gcagtgtcct cagcccttaa gctgttcatc tgcaagtaga gagtattctt 60 agagttgtct ctagatcact acacc 85 <210> 173 <211> 22

<212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 173 ggtgtagtga tctagagaca ac 22

<210> 174 <211> 55 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 174 ggtgtagtga aacagcttta gggctgagga cactgcagtc tactattgtg cgaga 55 <210> 175 <211> 55

<212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 175 ggtgtagtga aacagcttta gggctgagga cactgcagtc tactattgtg cgaaa 55

<210> 176 <211> 46 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 176 atagtagact gcagtgtcct cagcccttaa gctgtttcac tacacc 46

<210> 177 <211> 26 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 177 ggtgtagtga aacagcttaa gggctg 26

<210> 178 <211> 25 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 178 cacatccgtg ttgttcacgg atgtg 25

<210> 179 <211> 88 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 179 aatagtagac tgcagtgtcc tcagccctta agctgttcat ctgcaagtag agagtattct 60 tagagttgtc tctagactta gtgaagcg 88

<210> 180 <211> 95 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 180 cgcttcacta agtctagaga caactctaag aatactctct acttgcagat gaacagctta 60 agggctgagg acactgcagt ctactattgt gcgag 93

<210> 181 <211> 95 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 181 cgcttcacta agtctagaga caactctaag aatactctcr acttgcagat gaacagctta 60 agggctgagg acactgcagt ctactattgt acgag 95

<210> 182 <211> 24 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 182 cgcttcacta agtctagaga caac 24

<210> 183 <211> 419 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: V3-23 <4 0 0> 183 ctgtctgaac ggcccagccg gccatggccg aagttcaatt gttagagtct ggtggcggtc 60 ttgttcagcc tggtggttct ttacgtcttt cttgcgctgc ttccggattc actttctctt 120 cgtacgctat gtcttgggtt cgccaagctc ctggtaaagg tttggagtgg gtttctgcta 180 tctctggttc tggtggcagt acttactatg ctgactccgt taaaggtcgc ttcactatct 240 ctagagacaa ctctaagaat actctctact tgcagatgaa cagcttaagg gctgaggaca 300 ctgcagtcta ctattgcgct aaagactatg aaggtactgg ttatgctttc gacatatggg 360 gtcaaggtac tatggtcacc gtctctagtg cctccaccaa gggcccatcg gtcttcccc 419

<210> 184 <211> 136 <212> PRT <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: V3-23 <4 0 0> 184

Ala Gin Pro Ala Met Ala Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly 15 10 15

Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 30

Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly 35 40 45

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr 50 55 50

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn 65 70 75 SO

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 85 90 95

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Tyr Glu Gly Thr Gly Tyr Ala 100 105 110

Phe Asp He Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 130 135

<210> 185 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 185 ctgtctgaac ggcccagccg 20

<210> 186 <211> 83 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 186 ctgtctgaac ggcccagccg gccatggccg aagttcaatt gttagagtct ggtggcggtc 60 ttgttcagcc tggtggttct tta 83

<210> 187 <211> 54 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 187 gaaagtgaat ccggaagcag cgcaagaaag acgtaaagaa ccaccaggct gaac 54

<210> 188 <211> 42 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 188 agaaacccac tccaaacctt taccaggagc ttggcgaacc ca 42

<210> 189 <211> 94 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 189 agtgtcctca gcccttaagc tgttcatctg caagtagaga gtattcttag agttgtctct 60 agagatagtg aagcgacctt taacggagtc agca 94

<210> 190 <211> 81 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 190 gcttaagggc tgaggacact gcagtctact attgcgctaa agactatgaa ggtactggtt 60 atgctttcga catatggggt c 81

<210> 191 <211> 75 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 191 ggggaagacc gatgggccct tggtggaggc actagagacg gtgaccatag taccttgacc 60 ccatatgtcg aaagc 75

<210> 192 <211> 47 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 192 gcttccggat tcactttctc ttacatgtgg gttcgccaag ctcctgg 47

<210> 193 <211> 53 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4 0 0> 193 ggtttggagt gggtttctat ctctggtggc acttatgctg actccgttaa agg 53

<210> 194 <211> 9472 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: MALIA3 <4 0 0> 194 aatgctacta ctattagtag aattgatgcc accttttcag ctcgcgcccc aaatgaaaat 60 atagctaaac aggttattga ccatttgcga aatgtatcta atggtcaaac taaatctact 120 cgttcgcaga attgggaatc aactgttaca tggaatgaaa cttccagaca ccgtacttta 180 gttgcatatt taaaacatgt tgagctacag caccagattc agcaattaag ctctaagcca 240 tccgcaaaaa tgacctctta tcaaaaggag caattaaagg tactctctaa tcctgacctg 300 tctttcgggc ttcctcttaa tctttttgat gcaatccgct ttgcttctga ctataatagt 360 cagggtaaag acctgatttt tgatttatgg tcattctcgt tttctgaact gtttaaagca 420 tttgaggggg attcaatgaa tatttatgac gattccgcag Cattggacgc tatccagtct 480 aaacatttta ctattacccc ctctggcaaa acttctcttg caaaagcctc tcgctatttt 540 ggtttttatc gtcgtctggt aaacgagggt tatgatagtg ttgctcttac tatgcctcgt 600 aattcctttt ggcgttatgt atctgcatta gttgaatgtg gtattcctaa atctcaactg 660 atgaatcttt ctacctgtaa taatgttgtt ccgttagttc gttttattaa cgtagatttt 720 tcttcccaac gtcctgactg gtataatgag ccagttctta aaatcgcata aggtaattca 780 caatgattaa agttgaaatt aaaccatctc aagcccaatC tactactcgt tctggtgttt 840 ctcgtcaggg caagccttat tcactgaatg agcagctttg Ctacgttgat ttgggtaatg 900 aatatccggt tcttgtcaag attactcttg atgaaggtca gccagcctat gcgcctggtc 960 tgtacaccgt tcatctgtcc tctttcaaag ttggtcagtt cggttccctt atgattgacc 1020 gtctgcgcct cgttccggct aagtaacatg gagcaggtcg cggatttcga cacaatttat 1080 caggcgatga tacaaatctc cgttgtactt tgtttcgcgc ttggtataat cgctgggggt 1140 caaagatgag tgttttagtg tattctttcg cctctttcgt tttaggttgg tgccttcgta 1200 gtggcattac gtattttacc cgtttaatgg aaacttcctc angaaaaagt ctttagtcct 1260 caaagcctct gtagccgttg ctaccctcgt tccgatgctg tctttcgctg ctgagggtga 1320 cgatcccgca aaagcggcct ttaactccct gcaagcctca gcgaccgaat atatcggtta 1360 tgcgtgggcg atggttgttg tcattgtcgg cgcaactatc ggtatcaagc tgtttaagaa 1440 attcacctcg aaagcaagct gataaaccga tacaattaaa ggctcctttt ggagcctttt 1500 tttttggaga ttttcaacgt gaaaaaatta ttattcgcaa ttcctttagt tgttcctttc 1560 tattctcaca gtgcacagtc tgtcgtgacg cagccgccct cagtgtctgg ggccccaggg 1620 cagagggtca ccatctcctg cactgggagc agctccaaca tcggggcagg ttatgatgta 1680 cactggtacc agcagcttcc aggaacagcc cccaaactcc tcatctatgg taacagcaat 1740 cggccctcag gggtccctga ccgattctct ggctccaagt ctggcacctc agcctccctg 1800 gccaCcactg ggctccaggc tgaggatgag gctgattatt actgccagtc ctatgacagc 1860 agcctgagtg gcctttatgt cttcggaact gggaccaagg tcaccgtcct aggtcagccc 1920 aaggccaacc ccactgtcac tctgttcccg ccctcctctg aggagctcca agccaacaag 1980 gccacactag tgtgtctgat cagtgacttc tacccgggag ctgtgacagt ggcctggaag 2040 gcagatagca gccccgtcaa ggcgggagtg gagaccacca caccctccaa acaaagcaac 2100 aacaagtacg cggccagcag ctatctgagc ctgacgcctg agcagtggaa gtcccacaga 2160 agctacagct gccaggtcac gcatgaaggg agcaccgtgg agaagacagt ggcccctaca 2220 gaatgttcat aataaaccgc ctccaccggg cgcgccaatt ctatttcaag gagacagtca 2280 taatgaaata cctattgcct acggcagccg ctggattgtt attactcgcg gcccagccgg 2340 ccatggccga agttcaattg ttagagcctg gtggcggtct tgttcagcct ggtggttctt 2400 tacgtctttc ttgcgctgct tccggattca ctttctcttc gtacgctatg tcttgggttc 2460 gccaagctcc tggtaaaggt ttggagtggg tttctgctat ctctggttct ggtggcagta 2520 cttactatgc tgactccgtt aaaggtcgct tcactatctc tagagacaac tctaagaata 2580 ctctctactt gcagatgaac agcttaaggg ctgaggacac tgcagtctac tattgcgcta 2640 aagactatga aggtactggt tatgotttcg acatatgggg tcaaggtact atggtcaccg 2700 tctctagtgc ctccaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca 2760 cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga 2820 cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtcca caccttcccg gctgtcctac 2880 agtctagcgg actctactcc ctcagcagcg tagtgaccgt gccctcttct agcttgggca 2940 cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag 3000 ttgagcccaa atcttgtgcg gccgctcatc accaccatca tcactctgct gaacaaaaac 3060 tcatctcaga agaggatctg aatggtgccg cagatatcaa cgatgatcgt atggctggcg 3120 ccgctgaaac tgttgaaagt tgtttagcaa aaccccatac agaaaattca tttactaacg 3180 tctggaaaga cgacaaaact ttagatcgtt acgctaacta tgagggttgt ctgtggaatg 3240 ctacaggcgt tgtagtttgt actggtgacg aaactcagtg ttacggtaca tgggttccta 3300 ttgggcttgc tatccctgaa aatgagggtg gtggctctga gggtggcggt tctgagggtg 3360 gcggttctga gggtggcggt actaaacctc ctgagtacgg tgatacacct attccgggct 3420 atacttatat caaccctctc gacggcactt atccgcctgg tactgagcaa aaccccgcta 3480 atcctaatcc ttctcttgag gagtctcagc ctcttaatac tttcatgttt cagaataata 3540 ggttccgaaa taggcagggg gcattaactg tttatacggg cactgttact caaggcactg 3600 accccgttaa aacttattac cagtacactc ctgtatcatc aaaagccatg tatgacgctt 3660 actggaacgg taaattcaga gactgcgctt tccattctgg ctttaatgaa gatccattcg 3720 tttgtgaata tcaaggccaa tcgtctgacc tgcctcaacc tcctgtcaat gctggcggcg 3780 gctctggtgg tggttctggt ggcggctctg agggtggtgg ctctgagggt ggcggttctg 3840 agggtggcgg ctctgaggga ggcggttccg gtggtggctc tggttccggt gattttgatt 3900 atgaaaagat ggcaaacgct aataaggggg ctatgaccga aaatgccgat gaaaacgcgc 3960 tacagtctga cgctaaaggc aaactcgatt ctgtcgctac tgattacggt gctgctatcg 4020 atggtttcat tggtgacgtt tccggccttg ctaatggtaa tggtgctact ggtgattttg 4080 ctggctctaa ttcçcaaatg gctçaagtçg gtgaçggtga taattcacct ttaatgaata 4140 atttccgtca atatttacct tccctccctc aatcggttga atgtcgccct tttgtcttta 4200 gcgctggtaa accatacgaa ttttctattg attgtgacaa aataaactta ttccgtggtg 4260 tctttgcgtt tcttttatat gttgccacct ttatgtatgt attttctacg tttgctaaca 4320 tactgcgtaa taaggagtct taatcatgcc agttcttttg ggtattccgt tattattgcg 4380 tttcctcggt ttccttctgg taactttgtt cggctatctg cttacttttc ttaaaaaggg 4440 cttcggtaag atagctattg ctatttcatt gtttcttgct cttattattg ggcttaactc 4500 aattcttgtg ggttatctct ctgatattag cgctcaatta ccctctgact ttgctcaggg 4560 tgttcagtta attctcccgt ctaatgcgct tccctgtttt tatgttattc tctctgtaaa 4620 ggctgctatt ttcatttttg acgttaaaca aaaaatcgtt tcttatttgg attgggataa 4680 ataatatggc tgtttatttt gtaactggca aattaggctc tggaaagacg ctcgtcagcg 4740 ttggtaagat tcaggataaa attgtagctg ggtgcaaaat agcaactaat cttgatttaa 4800 ggcttcaaaa cctcccgcaa gtcgggaggt tcgctaaaac gcctcgcgtt cttagaatac 4860 cggataagcc ttctatatct gattCgcttg ctattgggcg cggtaatgat tcctacgatg 4920 aaaataaaaa cggcttgcCt gttctcgatg agtgcggtac ttggtttaat acccgttctt 4980 ggaatgataa ggaaagacag ccgattattg attggtttct acatgctcgt aaattaggat 5040 gggatattat ttttcttgtt caggacttat ctattgttga taaacaggcg cgttctgcat 5100 tagctgaaca tgttgtttat tgtcgtcgtc tggacagaat tactttacct tttgtcggta 5160 ctttatattc tcttattact ggctcgaaaa tgcctctgcc taaattacat gttggcgttg 5220 tcaaatatgg cgattctcaa ttaagcccta ctgttgagcg ttggctttat actggtaaga 5280 atttgtataa cgcatatgat actaaacagg ctttttccag taattatgat tccggtgttt 5340 attcttattt aacgccttat ttatcacacg gtcggtattt caaaccatta aatttaggtc 5400 agaagatgaa attaactaaa atatatttga aaaagttttc tcgcgttctt tgtcttgcga 5460 ttggatttgc atcagcattt acatatagtt atataaccca acctaagccg gaggttaaaa 5520 aggtagtctc tcagacctat gattttgata aattcactat tgactcttct cagcgtctta S580 atctaagcta tcgctatgtt ttcaaggatt ctaagggaaa attaattaat agcgacgatt 5640 tacagaagca aggttattca ctcacatata ttgatttatg tactgtttcc attaaaaaag 5700 gtaattcaaa tgaaattgtt aaatgtaatt aattttgttt tcttgatgtt tgtttcatca 5760 tcttcttttg ctcaggtaat tgaaatgaat aattcgcctc tgcgcgattt tgtaacttgg 5820 tattcaaagc aatcaggcga atccgttatt gtttctcccg atgtaaaagg tactgttact 5880 gtatattcat ctgacgttaa acctgaaaat ctacgcaatt tctttatttc tgttttacgt 5940 gctaataatt ttgatatggt tggttcaatt ccttccataa ttcagaagta taatccaaac 6000 aatcaggaCt atattgatga attgccatca tctgataacc aggaatatga tgataattcc 6060 gctccttctg gtggtttctt tgttccgcaa aatgataatg ttactcaaac ttttaaaatt £120 aataacgttc gggcaaagga tttaatacga gttgtcgaat tgtttgtaaa gtctaatact 6180 tctaaatcct caaatgtatt atctattgac ggctctaatc tattagttgt ttctgcacct 6240 aaagatattt tagataacct tcctcaattc ctttctactg ttgatttgcc aactgaccag 6300 atattgattg agggtttgat atttgaggtt cagcaaggtg atgctttaga tttttcattt 6360 gctgctggct ctcagcgtgg caçtgttgca ggcggtgtta atactgaccg cctcacctct 6420 gttttatctt ctgctggtgg ttcgttcggt atttttaatg gcgatgtttt agggctatca 6480 gttcgcgcat taaagactaa tagccattca aaaatattgt ctgtgccacg tattcttacg 6540 ctttcaggtc agaagggttc tatctctgtt ggccagaatg tcccttttat tactggtcgt 6600 gtgactggtg aatctgccaa tgtaaataat ccatttcaga cgattgagcg tcaaaatgta 6660 ggtatttcca tgagcgtttt tcctgtcgca atggctggcg gtaatattgt tctggatatt 6720 accagcaagg ccgatagttt gagttcttct actcaggcaa gtgatgttat tactaatcaa 6780 agaagtattg ctacaacggt taatttgcgt gatggacaga ctcttttact cggtggcctc 6840 actgattata aaaacacttc tcaagattct ggcgtaccgt tcctgtctaa aatcccttta 6900 atcggcctcc tgtttagctc ccgctctgat tccaacgagg aaagcacgtt atacgtgctc 6960 gtcaaagcaa ccatagtacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt 7020 tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt 7080 ccCttcCttt CtcgCcacgt tCgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc 7140 tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaactcg atttgggtga 7200 tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc 7260 cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggg 7320 ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggaa ccaccatcaa acaggatttt 7380 cgcctgctgg ggcaaaccag cgtggaccgc ttgctgcaac tctctcaggg ccaggcggtg 7440 aagggcaatc agctgttgcc cgtctcactg gtgaaaagaa aaaccaccct ggatccaagc 7500 ttgcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa 7560 tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt 7620 gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg 7680 cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag 7740 atcagttggg cgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg 7800 agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtc 7860 atacactatt atcccgtatt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgg gcgcggtatt 7920 ctcagaatga cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga 7980 cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac 8040 ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc B100 atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc 8160 gtgacaccac gatgcctgta gcaatgccaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac 8220 tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag 8280 gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg 8340 gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta 8400 tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg 8460 ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata 8520 tactttagat tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt 8580 ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactgt acgtaagacc 8640 cccaagcttg tcgactgaat ggcgaatggc gctttgcctg gtttocggca ccagaagcgg 8700

Cgccggaaag ctggctggag tgcgatcttc ctgaggccga tactgtcgtc gtcccctcaa 8760 actggcagat gcacggttac gatgcgccca tctacaccaa cgtaacctat cccattacgg BB20 tcaatccgcc gtttgttccc acggagaatc cgacgggttg ttactcgctc acatttaatg 8880 ttgatgaaag ctggctacag gaaggccaga cgcgaattat ttttgatggc gttcctatcg 8940 gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgtt 9000 tacaatttaa atatttgctt atacaatctt cctgtttttg gggcttttct gattatcaac 9060 cggggtacat atgattgaca tgctagtttt acgattaccg ttcatcgatt ctcttgtttg 9120 ctccagactc tcaggcaatg acctgatagc ctttgtagat ctctcaaaaa tagctaccct 91B0 ctccggcatg aatttatcag ctagaacggt tgaatatcat attgatggtg atttgactgt 9240 ctccggcctt tctcaccctt ttgaatcttt acctacacat tactcaggca ttgcatttaa 9300 aatatatgag ggttctaaaa atttttatcc ttgcgttgaa ataaaggctt ctcccgcaaa 9360 agtattacag ggtcataatg tttttggtac aaccgattta gctttatgct ctgaggcttt 9420 attgcttaat tttgctaatt ctttgccttg cctgtatgat ttattggatg tc 9472

<210> 195 <211> 20 <212> PRT <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: MALIA3 <4 0 0> 195

Met Lys Lys Leu Leu Phe Ala lie Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ser 15 10 15

His Ser Ala Gin 20

<210> 196 <211> 368 <212> PRT <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: MALIA3 <4 Ο 0> 196

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 15 10 15

Ala Gin Pro Ala Met Ala Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly 20 25 30

Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 35 40 45

Pile Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly 50 55 60

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr 65 70 75 80

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn 85 90 95

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 100 105 110

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Tyr Glu Gly Thr Gly Tyr Ala 115 120 125

Phe Asp lie Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 145 150 155 160

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 155 170 175

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 1B0 185 190

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 195 200 205

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie 210 215 220

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 225 230 235 240

Glu Pro Lys Ser Cys Ala Ala Ala His His His His His His Ser Ala 245 250 255

Glu Gin Lys Leu lie Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala Asp lie 260 265 270

Asn Asp Asp Arg Met Ala Ser Gly Ala Ala Glu Thr Val Glu Ser Cys 275 280 285

Leu Ala Lys Pro His Thr Glu lie Ser Phe Thr Asn Val Trp Lys Asp 290 295 300

Asp Lys Thr Leu Asp Arg Tyr Ala Asn Tyr Glu Gly Cys Leu Trp Asn 305 310 315 320

Ala Thr Gly Val Val Val Cys Thr Gly Asp Glu Thr Gin Cys Tyr Gly 325 330 335

Thr Trp Val Pro lie Gly Leu Ala lie Pro Glu Asn Glu Gly Gly Gly 340 345 350

Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Thr 355 360 365

<210> 197 <211> 152 <212> PRT <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: MALIA3 <4 0 0> 197

Ser Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys Gly Ala 15 10 15

Met Thr Glu Asn Ala Asp Glu Asn Ala Leu Gin Ser Asp Ala Lys Gly 20 25 30

Lys Leu Asp Ser Val Ala Thr Asp Tyr Gly Ala Ala lie Asp Gly Phe 35 40 45 lie Gly Asp Val Ser Gly Leu Ala Asn Gly Asn Gly Ala Thr Gly Asp 50 55 60

Phe Ala Gly Ser Asn Ser Gin Met Ala Gin Val Gly Asp Gly Asp Asn 65 70 75 80

Ser Pro Leu Met Asn Asn Phe Arg Gin Tyr Leu Pro Ser Leu Pro Gin 85 90 95

Ser Val Glu Cys Arg Pro Phe Val Phe Ser Ala Gly Lys Pro Tyr Glu 100 105 110

Phe Ser lie Asp Cys Asp Lys lie Asn Leu Phe Arg Gly Val Phe Ala 115 120 125

Phe Leu Leu Tyr Val Ala Thr Phe Met Tyr Val Phe Ser Thr Phe Ala 130 135 140

Asn lie Leu Arg Asn Lys Glu Ser 145 150

<210> 198 <211> 15 <212> PRT <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: MALIA3 <4 Ο 0> 198

Met Pro Val Leu Leu Gly lie Pro Leu Leu Leu Arg Phe Leu Gly 15 10 15

<210> 199 <211> 335 <212> PRT <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: MALIA3 <4 Ο Ο > 199

Lys Thr Leu Vai Ser Vai Gly Lys lie Gin Asp Lys Ile Vai Ala Gly 15 10 15

Cys Lys lie Ala Thr Asn Leu Asp Leu Arg Leu Gin Asn Leu Pro Gin 20 25 30

Vai Gly Arg Phe Ala Lys Thr Pro Arg Vai Leu Arg lie Pro Asp Lys 35 40 45

Pro Ser lie Ser Asp Leu Leu Ala lie Gly Arg Gly Asn Asp Ser Tyr 50 55 60

Asp Glu Asn Lys Asn Gly Leu Leu Vai Leu Asp Glu Cys Gly Thr Trp 65 70 75 80

Phe Asn Thr Arg Ser Trp Asn Asp Lys Glu Arg Gin Pro lie Ile Asp 85 90 95

Trp Phe Leu His Ala Arg Lys Leu Gly Trp Asp Ile Ile Phe Leu Val 100 105 110

Gin Asp Leu Ser lie Val Asp Lys Gin Ala Arg Ser Ala Leu Ala Glu 115 120 125

His Val Val Tyr Cys Arg Arg Leu Asp Arg Ile Thr Leu Pro Phe Val 130 135 140

Gly Thr Leu Tyr Ser Leu Ile Thr Gly Ser Lys Met Pro Leu Pro Lys 145 150 155 160

Leu His Val Gly Val Val Lys Tyr Gly Asp Ser Gin Leu Ser Pro Thr 165 170 175

Val Glu Arg Trp Leu Tyr Thr Gly Lys Asn Leu Tyr Asn Ala Tyr Asp 180 185 190

Thr Lys Gin Ala Phe Ser Ser Asn Tyr Asp Ser Gly Val Tyr Ser Tyr 195 200 205

Leu Thr Pro Tyr Leu Ser His Gly Arg Tyr Phe Lys Pro Leu Asn Leu 210 215 220

Gly Gin Lys Met Lys Leu Thr Lys lie Tyr Leu Lys Lys Phe Ser Arg 225 230 235 240

Val Leu Cys Leu Ala Ile Gly Phe Ala Ser Ala Phe Thr Tyr Ser Tyr 245 250 255 lie Thr Gin Pro Lys Pro Glu Val Lys Lys Val Val Ser Gin Thr Tyr 260 265 270

Asp Phe Asp Lys Phe Thr Ile Asp Ser Ser Gin Arg Leu Asn Leu Ser 275 280 285

Tyr Arg Tyr Val Phe Lys Asp Ser Lys Gly Lys Leu lie Asn Ser Asp 290 295 300

Asp Leu Gin Lys Gin Gly Tyr Ser Leu Thr Tyr lie Asp Leu Cys Thr 305 310 315 320

Val Ser Ile Lys Lys Gly Asn Ser Asn Glu Ile Val Lys Cys Asn 325 330 335

<210> 200 <211> 10 <212> PRT <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: MALIA3 <400> 200

Met Lys Leu Leu Asn Val lie Asn Phe Val 15 10 <210> 201 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 201 actatctcta gagacaaetc taagaatact ctctacttgc agatgaacag cttaagggct 60 gaggacactg cagtctacta ttgcgctaaa 90

<210> 202 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 202

Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn 15 10 15

Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys 20 25 30

<210> 203 <211> 90 <212> DNA <213> Sequência consenso <22 0> <221> base_modificada <222> (3) <223> a, t, c, g, outro ou desconhecido <22 0> <221> base_modificada <222> (9) <223> a, t, c, g, outro ou desconhecido <22 0> <221> base_modificada <222> (12) <223> a, t, c, g, outro ou desconhecido <22 0> <221> base_modificada <222> (21) <223> a, t, c, g, outro ou desconhecido <22 0> <221> base_modificada <222> (30) <223> a, t, c, g, outro ou desconhecido <22 0> <221> base_modificada <222> (51) <223> a, t, c, g, outro ou desconhecido <22 0> <221> base_modificada <222> (57) <223> a, t, c, g, outro ou desconhecido <22 0> <221> base_modificada <222> (60) <223> a, t, c, g, outro ou desconhecido <22 0> <221> base modificada <222> (69) <223> a, t, c, g, outro ou desconhecido <22 0> <221> base_modificada <222> (72) <223> a, t, c, g, outro ou desconhecido <22 0> <221> base_modificada <222> (75) <223> a, t, c, g, outro ou desconhecido <22 0> <221> base_modificada <222> (87) <223> a, t, c, g, outro ou desconhecido <400> 203 acnathtcnc gngayaaytc naaraayacn ttrtayttrc aratgaaytc nttrcgngcn 60 gargayacng cngtntayta ytgygcnaar 90 <210> 204 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 204 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc 90 <210> 205 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 205 caggtccagc ttgtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcact 90 <210> 206 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 206 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc 90 <210> 207 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 207 caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc 90 <210> 208 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 208 caggtccagc tggtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg tttccggata caccctcact 90 <210> 209 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 209 cagatgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaaga ctgggtcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg cttccggata caccttcacc 90 <210> 210 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <4Ο0> 210 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggata caccttcacc 90 <210> 211 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 211 caaatgcagc tggtgcagtc tgggcctgag gtgaagaagc ctgggacctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggatt cacctttact 90 <210> 212 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 212 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc 90 <210> 213 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 213 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc 90 <210> 214 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 214 gaggtccagc tggtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggctac agtgaaaatc 60 tcctgcaagg tttctggata caccttcacc 90 <210> 215 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 215 cagatcacct Cgaaggagtc tggtcctacg ctggtgaaac ccacacagac cctcacgctg 60 acctgcacct tctctgggtt ctcactcagc 90 <210> 216 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 216 caggtcacct tgaaggagtc tggtcctgtg ctggtgaaac ccacagagac cctcacgctg 60 acctgcaccg tctctgggtt ctcactcagc 90 <210> 217 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 217 caggtcacct tgaaggagtc tggtcctgcg ctggtgaaac ccacacagac cctcacactg 60 acctgcacct tctctgggtt ctcactcagc 90 <210> 218 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 218 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt 90 <210> 219 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 219 gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat 90 <210> 220 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 220 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt 90 <210> 221 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 221 gaggtgcage tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt 90 <210> 222 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 222 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt 90 <210> 223 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 223 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggt gtggtacggc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat 90 <210> 224 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <4Ο0> 224 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt 90 <210> 225 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 225 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc 90 <210> 226 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 226 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt 90 <210> 227 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 227 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt 90 <210> 228 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 228 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt 90 <210> 229 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 229 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt 90 <210> 230 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 230 gaagtgcagc tggtggagtc tgggggagtc gtggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat 90 <210> 231 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 231 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt 90 <210> 232 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 232 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc cagggcggtc cctgagactc 60 tcctgtacag cttctggatt cacctttggt 90 <210> 233 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 233 gaggtgcagc tggtggagac tggaggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctgggtt caccgtcagt 90 <210> 234 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 234

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc SO tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt 90 <210> 235 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 235 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccgtcagt 90 <210> 236 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 236 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt 90 <210> 237 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 237 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctgggtt caccttcagt 90 <210> 238 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <4Ο0> 238 gaggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc ttagttcagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt 90 <210> 239 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 239 gaggtgcagc tggtggagtc tcggggagtc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccgtcagt 90 <210> 240 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 240 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggggac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctctggtgg ctccatcagc 90 <210> 241 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 241 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggacac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctctggtta ctccatcagc 90 <210> 242 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <210> 243 <211> 90 <400> 242 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 243 cagctgcagc tgcaggagtc cggctcagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctctggtgg ctccatcagc 90 <210> 244 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 244 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc 90 <210> 245 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 245 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc 90 <210> 246 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 246 caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt 90 <210> 247 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 247 cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc 90 <210> 248 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 248 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt 90 <210> 249 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 249 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccgtcagc 90 <210> 250 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 250 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctctggtta ctccatcagc 90 <210> 251 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 251 gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gttctggata cagctttacc 90 <210> 252 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens gaagtgcage tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaggatc 60 tcctgtaagg gttctggata cagctttacc 90 <4Ο0> 252 <210> 253 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 253 caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60 acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct 90 <210> 254 <211> 90

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 254 caggtgcagc tggtgcaatc tgggtctgag ttgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg cttctggata cacettcacL 90

<210> 255 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda <400> 255 agttctccct gcagctgaac tc 22

<210> 256 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda <4Ο0> 256 cactgtatct gcaaatgaac ag 22

<210> 257 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda <400> 257 ccctgtatct gcaaatgaac ag 22

<210> 258 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda <400> 258 ccgcctacct gcagtggagc ag 22

<210> 259 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda <400> 259 cgctgtatct gcaaatgaac ag 22 <210> 260 <211> 22

<212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda <400> 260 cggcatatct gcagatctgc ag 22

<210> 261 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda <400> 261 cggcgtatct gcaaatgaac ag 22

<210> 262 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda <400> 262 ctgcctacct gcagtggagc ag 22

<210> 263 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sonda <4Ο0> 263 tcgcctatct gcaaatgaac ag 22

<210> 264 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 264 acatggagct gagcagcctg ag 22

<210> 265 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 265 acatggagct gagcaggctg ag 22

<210> 266 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 266 acatggagct gaggagcctg ag 22

<210> 267 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 267 acctgcagtg gagcagcctg aa 22

<210> 268 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 268 atctgcaaat gaacagcctg aa 22

<210> 269 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 269 atctgcaaat gaacagcctg ag 22 <210> 270 <211> 22

<212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 270 atctgcaaat gaacagtctg ag 22

<210> 271 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 271 atctgcagat ctgcagccta aa 22

<210> 272 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 272 atcttcaaat gaacagcctg ag 22

<210> 273 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 273 atcttcaaat gggcagcctg ag 22

<210> 274 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 274 ccctgaagct gagctctgtg ac 22

<210> 275 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 275 ccctgcagct gaactctgtg ac 22

<210> 276 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4Ο0> 276 tccttacaat gaccaacatg ga 22

<210> 277 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 277 tccttaccat gaccaacatg ga 22

<210> 278 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 278 ccgtgtatta ctgtgcgaga ga 22

<210> 279 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 279 ctgtgtatta ctgtgcgaga ga 22

<210> 280 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 280 ccgtgtatta ctgtgcgaga gg 22

<210> 281 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 281 ccgtgtatta ctgtgcaaca ga 22

<210> 282 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 282 ccatgtatta ctgtgcaaga ta 22 <210> 283 <211> 22

<212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 283 ccgtgtatta ctgtgcggca ga 22

<210> 284 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 284 ccacatatta ctgtgcacac ag 22

<210> 285 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 285 ccacatatta ctgtgcacgg at 22

<210> 286 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 286 ccacgtatta ctgtgcacgg at 22

<210> 287 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 287 ccttgtatta ctgtgcaaaa ga 22

<210> 288 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 288 ctgtgtatta ctgtgcaaga ga 22

<210> 289 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4Ο0> 289 ccgtgtatta ctgtaccaca ga 22

<210> 290 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 290 ccttgtatca ctgtgcgaga ga 22

<210> 291 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 291 ccgtatatta ctgtgcgaaa ga 22

<210> 292 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 292 ctgtgtatta ctgtgcgaaa ga 22

<210> 293 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 293 ccgtgtatta ctgtactaga ga 22

<210> 294 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 294 ccgtgtatta ctgtgctaga ga 22

<210> 295 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 295 ccgtgtatta ctgtactaga ca 22 <210> 296 <211> 22

<212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 296 ctgtgtatta ctgtaagaaa ga 22

<210> 297 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 297 ccgtgtatta ctgtgcgaga aa 22

<210> 298 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 298 ccgtgtatta ctgtgccaga ga 22

<210> 299 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <22 0> <400> 299 ctgtgtatta ctgtgcgaga ca 22

<210> 300 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 300 ccatgtatta ctgtgcgaga ca 22

<210> 301 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 301 ccatgtatta ctgtgcgaga aa 22

<210> 302 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgc 69 <4Ο0> 302

<210> 303 <211> 66 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0>

<223> Descrição do Organismo Desconhecido: Sequência Lambda FRl GLG <400> 303 cagtctgtgc tgactcagcc accctcggtg tctgaagccc ccaggcagag ggtcaccatc 60 tcctgt 66

<210> 304 <211> 668 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: h3401-h2 <400> 304 agtgcacaag acatccagat gacccagtct ccagccaccc tgtctgtgtc tccaggggaa 60 agggccaccc tctcctgcag ggccagtcag agtgttagta acaacttagc ctggtaccag 120 cagaaacctg gccaggttcc caggctcctc atctatggtg catccaccag ggccactgat 180 atcccagcca ggttcagtgg cagtgggtct gggacagact tcactctcac catcagcaga 240 ctggagcctg aagattttgc agtgtattac tgtcagcggt acggtagctc accggggtgg 300 acgttcggcc aagggaccaa ggtggaaatc aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc 360 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600 acccatcagg gcctgagctc gcctgtcaca aagagcttca acaaaggaga gtgtaagggc 660 gaattcgc 668

<210> 305 <211> 223 <212> PRT <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: h3401-h2 <400> 305

Ser Ala Gin Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val 15 10 15

Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val 20 25 30

Ser Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Val Pro Arg 35 40 45

Leu Leu lie Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Asp lie Pro Ala Arg 50 55 SO

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg 65 70 75 80

Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Arg Tyr Gly Ser 85 90 95

Ser Pro Gly Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser 145 150 155 160

Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Lys Gly Glu Cys Lys Gly Glu Phe Ala 210 215 220

<210> 306 <211> 700 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0>

<223> Descrição do Organismo Desconhecido: h3401-d8 KAPPA <4Ο0> 306

agtgcacaag acatccagat gaccoagtct cctgccaccc tgtctgtgtc tccaggtgaa SO agagccaccc tctcctgcag ggccagtcag gtgtotcoag gggaaagagc caccctctcc 120 tgcaatcttc tcagcaactt agcctggtac cagcagaaac ctggccaggc tcccaggctc 180 ctcatctatg gtgcttccac cggggccatt ggtatcccag ccaggttcag tggcagtggg 240 cctgggacag agttcactct caccatcagc agcctgcagt ctgaagattt tgcagtgtat 300 ttctgtcagc agtatggtac ctcaccgccc actttcggcg gagggaccaa ggtggagatc 360 aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa 420 tctggaactg cctctgttgt gtgcccgctg aataacttct atcccagaga gqccaaagta 480 cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt caeagagcag 540 gacaacaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga cgctgagcaa agtagactac 600 gagaaacacg aagtctacgc ctgcgaagtc acccatcagg gccttagctc gcccgtcacg 660 aagagcttca acaggggaga gtgtaagaaa gaattcgttt 700 <210> 307

<211> 222 <212> PRT <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: h3401-d8 KAPPA <400> 307

Ser Ala Gin Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val 15 10 15

Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Asn Leu 20 25 30

Leu Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg 35 40 45

Leu Leu lie Tyr Gly Ala Ser Thr Gly Ala lie Gly lie Pro Ala Arg 50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser 65 70 75 80

Leu Gin Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Gly Thr 85 90 95

Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lye Arg Thr 100 105 110

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu 115 120 125

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Pro Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140

Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly 145 150 155 160

Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Asn Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Val Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190

Glu Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Lys Lys Glu Phe Val 210 215 220

<210> 308 <211> 45 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 308 gctgtgtatt actgtgcgag cacatccgtg ttgttcacgg atgtg 45 <210> 309 < 211> 45

< 212> DNA < 213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4Ο0> 309 gccgtgtatt actgtgcgag cacatccgtg ttgttcacgg atgtg 45

<210> 310 <211> 45 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 310 gccgtatatt actgtgcgag cacatccgtg ttgttcacgg atgtg 45

<210> 311 <211> 45 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 311 gccgtgtatt actgtacgag cacatccgtg ttgttcacgg atgtg 45

<210> 312 <211> 45 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 312 gccatgtatt actgtgcgag cacatccgtg ttgttcacgg atgtg 45

<210> 313 <211> 88 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 313 aatagtagac tgcagtgtcc tcagccctta agctgttcat ctgcaagtag agagtattct 60 tagagttgtc tctagactta gtgaagcg 88

<210> 314 <211> 95 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 314 cgcttcacta agtctagaga caactctaag aatactctct acttgcagat gaacagctta 60 agggctgagg acactgcagt ctactattgt gcgag 95

<210> 315 <211> 95 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <210> 316 <211> 24 <400> 315 cgcttcacta agtctagaga caactctaag aatactctct acttgcagat gaacagctta 60 agggctgagg acactgcagt ctactattgt acgag 95

<212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 316 cgcttcacta agtctagaga caac 24

<210> 317 <211> 44 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 317 cacatccgtg ttgttcacgg atgtgggagg atggagactg ggtc 44

<210> 318 <211> 44 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 318 cacatccgtg ttgttcacgg atgtgggaga gtggagactg agtc 44

<210> 319 <211> 44 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 319 cacatccgtg ttgttcacgg atgtgggtgc ctggagactg cgtc 44

<210> 320 <211> 44 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 320 cacatccgtg ttgttcacgg atgtgggtgg ctggagactg cgtc 44

<210> 321 <211> 34 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 321 cctctactct tgtcacagtg cacaagacat ccag 34

<210> 322 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4Ο0> 322 cctctactct tgtcacagtg 20

<210> 323 <211> 44 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 323 ggaggatgga ctggatgtct tgtgcactgt gacaagagta gagg 44

<210> 324 <211> 44 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 324 ggagagtgga ctggatgtct tgtgcactgt gacaagagta gagg 44

<210> 325 <211> 44 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 325 ggtgcctgga ctggatgtct tgtgcactgt gacaagagta gagg 44

<210> 326 <211> 44 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 326 ggtggctgga ctggatgtct tgtgcactgt gacaagagta gagg 44

<210> 327 <211> 44 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 327 cacatccgtg ttgttcacgg atgtggatcg actgtccagg agac 44

<210> 328 <211> 44 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 328 cacatccgtg ttgttcacgg atgtggactg tctgtcccaa ggcc 44 <210> 329 <211> 44

<212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 329 cacatccgtg ttgttcacgg atgtggactg actgtccagg agac 44

<210> 330 <211> 44 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 330 cacatccgtg ttgttcacgg atgtggaccc tctgccctgg ggcc 44

<210> 331 <211> 59 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 331 cctctgactg agtgcacaga gtgctttaac ccaaccggct agtgttagcg gttccccgg 59

<210> 332 <211> 69 <212> DNA <213> Sequência Artificial <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <22 0> <400> 332 cctctgactg agtgcacaga gtgctttaac ccaaccggct agtgttagcg gttccccggg 60 acagtcgat 69

<210> 333 <211> 69 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 333 cctctgactg agtgcacaga gtgctttaac ccaaccggct agtgttagcg gttccccggg 60 acagacagt 69

<210> 334 <211> 69 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 334 cctctgactg agtgcacaga gtgctttaac ccaaccggct agtgttagcg gttccccggg 60 acagtcagt 69

<210> 335 <211> 70 <212> DNA <213> Sequência Artificial <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <22 0> <400> 335 cctctgactg agtgcacaga gtgctttaac ccaaccggct agtgttagcg gtstccccgg 60 ggcagagggt 70

<210> 336 <211> 24 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 336 cctctgactg agtgcacaga gtgc 24

<210> 337 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 337 gggaggatgg agactgggtc 20

<210> 338 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <22 0> <400> 338 gggaagatgg agactgggtc 20

<210> 339 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 339 gggagagtgg agactgagtc 20 <210> 340 <211> 20

< 212> DNA < 213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 340 gggtgcctgg agactgcgtc 20

<210> 341 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4Ο0> 341 gggtggctgg agactgcgtc 20

<210> 342 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 342 gggagtctgg agactgggtc 20

<210> 343 <211> 50 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 343 gggaggatgg agactgggtc atctggatgt cttgtgcact gtgacagagg 50

<210> 344 <211> 50 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4Ο0> 344 gggaagatgg agactgggtc atctggatgt cttgtgcact gtgacagagg 50

<210> 345 <211> 50 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 345 gggagagtgg agactgggtc atctggatgt cttgtgcact gtgacagagg 50

<210> 346 <211> 50 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 346 gggtgcctgg agactgggtc atctggatgt cttgtgcact gtgacagagg 50

<210> 347 <211> 50 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4Ο0> 347 gggtggctgg agactgggtc atctggatgt cttgtgcact gtgacagagg 50

<210> 348 <211> 50 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 348 gggagtctgg agactgggtc atctggatgt cttgtgcact gtgacagagg 50

<210> 349 <211> 42 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 349 cctctgtcac agtgcacaag acatccagat gacccagtct cc 42

<210> 350 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <4Ο0> 350 cctctgtcac agtgcacaag ac 22

<210> 351 <211> 24 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 351 acactctccc ctgttgaagc tctt 24

<210> 352 <211> 912 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 352 tccggagctt cagatctgtt tgcctttttg tggggtggtg cagatcgcgt tacggagatc 60 gaccgactgc ttgagcaaaa gccacgctta actgctgatc aggcatggga tgttattcgc 120 caaaccagtc gtcaggatct taacctgagg ctttttttac ctactctgca agcagcgaca 180 tctggtttga cacagagcga tccgcgtcgt cagttggtag aaacattaac acgttgggat 240 ggcatcaatt tgcttaatga tgatggtaaa acctggcagc agccaggctc tgccatcctg 300 aacgtttggc tgaccagtat gttgaagcgt accgtagtgg ctgccgtacc tatgccattt 360 gataagtggt acagcgccag tggctacgaa acaacccagg acggcccaac tggttcgctg 420 aatataagtg ttggagcaaa aattttgtat gaggcggtgc agggagacaa atcaccaatc 480 ccacaggcgg ttgatctgtt tgctgggaaa ccacagcagg aggttgtgtt ggctgcgctg 540 gaagatacct gggagactct ttccaaacgc tatggcaata atgtgagtaa ctggaaaaca 600 cctgcaatgg ccttaacgtt ccgggcaaat aatttctttg gtgtaccgca ggccgcagcg 660 gaagaaacgc gtcatcaggc ggagtatcaa aaccgtggaa cagaaaacga tatgattgtt 720 ttctcaccaa cgacaagcga tcgtcctgtg cttgcctggg atgtggtcgc acccggtcag 780 agtgggttta ttgctcccga tggaacagtt gataagcact atgaagatca gctgaaaatg 840 tacgaaaatt ttggccgtaa gtcgctctgg ttaacgaagc aggatgtgga ggcgcataag 900 gagtcgtcta ga 912 <210> 353 <211> 6680

<212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: pCES5 <400> 353 gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60 cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120 tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180 aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240 ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300 ctgaagatca gtcgggtgcc cgagtgggct acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360 tcottgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420 tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480 actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540 gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600 acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660 gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720 acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780 gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggacaaag 840 ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900 gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960 cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020 agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080 catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc caggtgaaga 1140 tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cctaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200 cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260 gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320 taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aaCactgtcc 13B0 ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440 tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500 ggttggactc aagacgafcag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560 cgtgcataca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagacac ctacagcgtg 1620 agcattgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680 gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740 atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800 99999c99a9 cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860 gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920 ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980 cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040 cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agCgagcgca 2100 acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160 cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220 accatgatta cgccaagctt tggagccttt tttttggaga ttttcaacgt gaaaaaatca 2280 ttattcgcaa ttcctttagt tgttcctttc tattctcaca gtgcacaggt ccaactgcag 2340 gtcgacctcg agatcaaacg tggaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 2400 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 2460 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 2520 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 2580 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 2640 ctgagttcac cggdgacaaa gagcttcaac aggggagagt gttaataagg cgcgccaatt 2700 ctatttcaag gagacagtca taatgaaata cctattgcct acggcagccg ctggattgtt 2760 attactcgcg gcccagccgg ccatggccga agttcaactg ttagagtctg gtggcggtct 2820 tgttcagcct ggtggttctt tacgtctttc ttgcgctgct tccggagctt cagatctgtt 2880 tgcctttttg tggggtggtg cagatcgcgt tacggagatc gaccgactgc ttgagcaaaa 2940 gccacgctta actgctgatc aggcatggga tgttattcgc caaaccagtc gtcaggatct 3000 taacctgagg ctttttttac ctactctgca agcagcgaca tctggtttga cacagagcga 3060 tccgcgtcgt cagttggtag aaacattaac acgttgggat ggcatcaatt tgcttaatga 3120 tgatggtaaa acctggcagc agccaggctc tgccatcctg aacgtttggc tgaccagtat 3180 gttgaagcgt accgtagtgg ctgccgtacc tatgccattt gataagtggt acagcgccag 3240 tggctacgaa acaacccagg acggcccaac tggttcgctg aatataagtg ttggagcaaa 3300 aattttgtat gaggcggtgc agggagacaa atcaccaatc ccacaggcgg ttgatctgtt 3360 tgctgggaaa ccacagcagg aggttgtgtt ggctgcgctg gaagatacct gggagactct 3420 ttccaaacgc tatggcaata atgtgagtaa ctggaaaaca cctgcaatgg ccttaacgtt 3480 ccgggcaaat aatttctttg gtgtaccgca ggccgcagcg gaagaaacgc gtcatcaggc 3540 ggagtatcaa aaccgtggaa cagaaaacga tatgattgtt ttctcaccaa cgacaagcga 3600 tcgtcccgtg cttgcctggg atgtggtcgc acccggtcag agtgggttta ttgctcccga 3660 tggaacagtt gataagcact atgaagatca gctgaaaatg tacgaaaatt ttggccgtaa 3720 gtcgctctgg ttaacgaagc aggatgtgga ggcgcataag gagtcgtcta gagacaactc 3780 taagaatact ctctacttgc agatgaacag cttaagtctg agcattcggt ccgggcaaca 3840 ttctccaaac tgaccagacg acacaaacgg cttacgctaa atcccgcgca tgggatggta 3900 aagaggtggc gtctttgctg gcctggactc atcagatgaa ggccaaaaat tggcaggagt 3960 ggacacagca ggcagcgaaa caagcactga ccatcaactg gtactatgct gatgtaaacg 4020 gcaatattgg ttatgttcat actggtgctt atccagatcg tcaatcaggc catgatccgc 4080 gattacccgt tcctggtacg ggaaaatggg actggaaagg gctattgcct tttgaaatga 4140 accctaaggt gtataacccc cagaagctag cctgcggctt cggtcaccgt ctcaagcgcc 4200 tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 4260 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 4320 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtccac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 4380 ctctactccc tcagcagcgt agtgaccgtg ccctccagca gctcgggcac ccagacctac 4440 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 4500 tcttgtgcgg ccgcacatca tcatçacçat cacggggccg cagaacaaaa actcatctca 4560 gaagaggatc tgaatggggc cgcatagact gttgaaagtt gtttagcaaa acctcataca 4620 gaaaattcat ttactaacgt ctggaaagac gacaaaactt tagatcgtta cgctaactat 4680 gagggctgtc tgtggaatgc tacaggcgCt gtggtttgta ctggtgacga aactcagtgt 4740 tacggtacat gggttcctat tgggcttgct atccctgaaa atgagggtgg tggctctgag 4800 ggtggcggtt ctgagggtgg cggttctgag ggtggcggta ctaaacctcc tgagtacggt 4860 gatacaccta ttccgggcta tacttatatc aaccctctcg acggcactta tccgcctggt 4920 actgagcaaa accccgctaa tcctaatcct tctcttgagg agtctcagcc tcttaatact 4980 ttcatgtttc agaataatag gttccgaaat aggcagggtg cattaactgt ttatacgggc 5040 actgttactc aaggcactga ccccgttaaa acttattacc agtacactcc tgtatcatca 5100 aaagccatgt atgacgctta ctggaacggt aaattcagag actgcgcttt ccattctggc 5160 tttaatgagg atccattcgt ttgtgaatat caaggccaat cgtctgacct gcctcaacct 5220 cctgtcaatg ctggcggcgg Ctctggtggt ggttctggtg gcggctctga gggtggcggc 5280 tctgagggtg gcggttctga gggtggcggc tctgagggtg gcggttccgg tggcggctcc 5340 ggttccggtg attttgatta tgaaaaaatg gcaaacgcta ataagggggc tatgaccgaa 5400 aatgccgatg aaaacgcgct acagtctgac gctaaaggca aacttgattc tgtcgctact 5460 gattacggtg ctgctatcga tggtttcatt ggtgacgttt ccggccttgc taatggtaat 5520 ggtgctactg gtgattttgc tggctctaat tcccaaatgg ctcaagtcgg tgacggtgat 5580 aattcacctt taatgaataa tttccgtcaa tatttacctt ctttgcctca gtcggttgaa 5640 tgtcgccctt atgtctttgg cgctggtaaa ccatatgaat tttctattga ttgtgacaaa 5700 ataaacttat tccgtggtgt ctttgcgttt cttttatatg ttgccacctt tatgtatgta 5760 ttttcgacgt ttgctaacat actgcgtaat aaggagtctt aataagaatt cactggccgt 5820 cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc 5880 acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca 5940 acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct 6000 gtgcggtatt tcacaccgca tataaattgt aaacgttaat attttgttaa aattcgcgtt 6060 aaatttttgt taaatcagct cattttttaa ccaataggcc gaaatcggca aaatccctta 6120 taaatcaaaa gaatagcccg agatagggtt gagtgttgtt ccagtttgga acaagagtcc 6180 actattaaag aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa accgtctacc agggcgatgg 6240 cccactacgt gaaccatcac ccaaatcaag ttttttgggg tcgaggtgcc gtaaagcact 6300 aaatcggaac cctaaaggga gcccccgatt tagagcttga cggggaaagc cggcgaacgt 6360 ggcgagaaag gaagggaaga aagcgaaagg agcgggcgct agggcgctgg caagtgtagc 6420 ggtcacgctg cgcgtaacca ccacacccgc cgcgcttaat gcgccgctac agggcgcgta 6460 ctatggttgc tttgacgggt gcagtctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag 6540 ccagccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc 6600 atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc 6660 gtcatcaccg aaacgcgcga 6680

<210> 354 <211> 286 <212> PRT <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: pCES5 <400> 354

Met Ser lie Gin His Phe Arg Val Ala Leu lie Pro Phe Phe Ala Ala 15 10 15

Phe Cys Leu Pro Val Phe Ala His Pro Glu Thr Leu Val Lys Val Lys 20 25 30

Asp Ala Glu Asp Gin Leu Gly Ala Arg Val Gly Tyr lie Glu Leu Asp 35 40 45

Leu Asn Ser Gly Lys lie Leu Glu Ser Phe Arg Pro Glu Glu Arg Phe 50 55 60

Pro Met Met Ser Thr Phe Lys Val Leu Leu Cys Gly Ala Val Leu Ser 65 70 75 B0

Arg lie Asp Ala Gly Gin Glu Gin Leu Gly Arg Arg lie His Tyr Ser 85 90 95

Gin Asn Asp Leu Val Glu Tyr Ser Pro Val Thr Glu Lys His Leu Thr 1O0 105 110

Asp Gly Met Thr Val Arg Glu Leu Cys Ser Ala Ala lie Thr Met Ser 115 120 125

Asp Asn Thr Ala Ala Asn Leu Leu Leu Thr Thr lie Gly Gly Pro Lys 130 135 140

Glu Leu Thr Ala Phe Leu His Asn Met Gly Asp His Val Thr Arg Leu 145 150 155 160

Asp Arg Trp Glu Pro Glu Leu Asn Glu Ala lie Pro Asn Asp Glu Arg 165 170 175

Asp Thr Thr Met Pro Val Ala Met Ala Thr Thr Leu Arg Lys Leu Leu 180 185 190

Thr Gly Glu Leu Leu Thr Leu Ala Ser Arg Gin Gin Leu lie Asp Trp 195 200 205

Met Glu Ala Asp Lys Val Ala Gly Pro Leu Leu Arg Ser Ala Leu Pro 210 215 220

Ala Gly Trp Phe lie Ala Asp Lys Ser Gly Ala Gly Glu Arg Gly Ser 225 230 235 240

Arg Gly lie lie Ala Ala Leu Gly Pro Asp Gly Lys Pro Ser Arg lie 245 250 255

Val Val He Tyr Thr Thr Gly Ser Gin Ala Thr Met Asp Glu Arg Asn 260 265 270

Arg Gin He Ala Glu lie Gly Ala Ser Leu lie Lys His Trp 275 280 2ΒΞ

<210> 355 <211> 138 <212> PRT <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: pCES5 <400> 355

Met Lys Lys Leu Leu Phe Ala lie Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ser 15 10 15

His Ser Ala Gin Val Gin Leu Gin Val Asp Leu Glu lie Lys Arg Gly 20 25 30

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 35 40 45

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 50 55 60

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser 65 70 75 80

Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 85 90 95

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 100 105 110

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 115 120 125

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 130 135

<210> 356 <211> 48 <212> PRT <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: pCES5 <400> 356

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 15 10 15

Ala Gin Pro Ala Met Ala Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly 20 25 30

Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 35 40 45

<210> 357 <211> 28 <212> PRT <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: pCES5 <400> 357

Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu 15 10 15

Ser Leu Ser lie Arg Ser Gly Gin His Ser Pro Thr 20 25

<210> 358 <211> 129 <212> PRT <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: pCES5 <4Ο0> 358

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80

Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Ala Ala Ala His His His His His His 100 105 110

Gly Ala Ala Glu Gin Lys Leu lie Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala 115 120 125

Ala

<210> 359 <211> 404 <212> PRT <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: pCES5 <4Ο0> 359

Thr Vai Glu Ser Cys Leu Ala Lys Pro His Thr Glu Asn Ser Phe Thr 15 10 15

Asn Vai Trp Lys Asp Asp Lys Thr Leu Asp Arg Tyr Ala Asn Tyr Glu 20 25 30

Gly Cys Leu Trp Asn Ala Thr Gly Vai Vai Vai Cys Thr Gly Asp Glu 35 40 45

Thr Gin Cys Tyr Gly Thr Trp Vai Pro lie Gly Leu Ala lie Pro Glu 50 55 60

Asn Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser 65 70 75 80

Glu Gly Gly Gly Thr Lys Pro Pro Glu Tyr Gly Asp Thr Pro lie Pro 85 90 95

Gly Tyr Thr Tyr lie Asn Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Pro Pro Gly Thr 100 105 110

Glu Gin Asn Pro Ala Asn Pro Asn Pro Ser Leu Glu Glu Ser Gin Pro 115 120 125

Leu Asn Thr Phe Met Phe Gin Asn Asn Arg Phe Arg Asn Arg Gin Gly 130 135 140

Ala Leu Thr Vai Tyr Thr Gly Thr Vai Thr Gin Gly Thr Asp Pro Vai 145 150 155 160

Lys Thr Tyr Tyr Gin Tyr Thr Pro Vai Ser Ser Lys Ala Met Tyr Asp 165 170 175

Ala Tyr Trp Asn Gly Lys Phe Arg Asp Cys Ala Phe His Ser Gly Phe 180 185 190

Asn Glu Asp Pro Phe Vai Cys Glu Tyr Gin Gly Gin Ser Ser Asp Leu 195 200 20Ξ

Pro Gin Pro Pro Val Asn Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glv 210 215 220

Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly 225 230 235 240

Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Asp Phe 245 250 255

Asp Tyr Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys Gly Ala Met Thr Glu Asn 260 265 270

Ala Asp Glu Asn Ala Leu Gin Ser Asp Ala Lys Gly Lys Leu Asp Ser 275 280 285

Val Ala Thr Asp Tyr Gly Ala Ala lie Asp Gly Phe lie Gly Asp Val 290 295 300

Ser Gly Leu Ala Asn Gly Asn Gly Ala Thr Gly Asp Phe Ala Gly Ser 305 310 315 320

Asn Ser Gin Met Ala Gin Val Gly Asp Gly Asp Asn Ser Pro Leu Met 325 330 335

Asn Asn Phe Arg Gin Tyr Leu Pro Ser Leu Pro Gin Ser Val Glu Cys 340 345 350

Arg Pro Tyr Val Phe Gly Ala Gly Lys Pro Tyr Glu Phe Ser lie Asp 355 360 365

Cys Asp Lys lie Asn Leu Phe Arg Gly Val Phe Ala Phe Leu Leu Tyr 370 375 380

Val Ala Thr Phe Met Tyr Val Phe Ser Thr Phe Ala Asn lie Leu Arg 385 390 395 400

Asn Lys Glu Ser

<210> 360 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 360 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgc 69

<210> 361 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 361 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgc 69

<210> 362 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 362 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgc 69

<210> 363 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 363 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgc 69

<210> 364 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 364

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgc 6S

<210> 365 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 365 aacatccaga tgacccagtc tccatctgcc atgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgt 69

<210> 366 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 366 gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgt 69

<210> 367 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 367 gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgt 69

<210> 368 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 368 gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgc 69

<210> 369 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 369 gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgc 69

<210> 370 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 370 gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgt 69

<210> 371 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 371 gacatccaga tgacccagtc tccatcttct gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgt 69

<210> 372 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 372 gacatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc SO atcacttgc 69

<210> 373 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 373 gccatccgga tgacccagtc tccattctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgc G9

<210> 374 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 374 gccatccgga tgacccagtc tccatcctca ttctctgcat ctacaggaga cagagtcacc 60 atcacttgt 69

<210> 375 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 375 gtcatctgga tgacccagtc tccatcctta ctctctgcat ctacaggaga cagagtcacc 60 atcagttgt 69

<210> 376 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 376 gccatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgc 69

<210> 377 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 377 gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgc 69

<210> 378 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 378 gatattgtga tgacccagac tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgc 69

<210> 379 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 379 gatattgtga tgacccagac tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgc 69

<210> 380 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 380 gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc 60 atctcctgc 69

<210> 381 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 381 gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc 60 atctcctgc 69

<210> 382 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 382 gatattgtga tgacccagac tccactctct ctgtccgtca cccctggaca gccggcctcc 60 atctcctgc 69

<210> 383 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 383 gatattgtga tgacccagac tccactctct ctgtccgtca cccctggaca gccggcctcc 60 atctcctgc 69

<210> 384 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 384 gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgc 69

<210> 385 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 385 gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgc 69

<210> 386 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 386 gatattgtga tgacccagac tccactctcc tcacctgtca cccttggaca gccggcctcc 60 atctcctgc 69

<210> 387 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 387 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgc 69

<210> 388 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 388 gaaattgtgt tgacgcagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgc 69

<210> 389 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 389 gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgc 69

<210> 390 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 390 gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgc 69

<210> 391 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 391 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgc 69

<210> 392 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 392 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgc 69

<210> 393 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 393 gaaattgtaa tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgc 69

<210> 394 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 394 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgc 69

<210> 395 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 395 gaaacgacac tcacgcagtc tccagcattc atgtcagcga ctccaggaga caaagtcaac 60 atctcctgc 69

<210> 396 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 396 gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc 60 atcacctgc 69

<210> 397 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 397 gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc 60 atcacctgc 69

<210> 398 <211> 69 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Kappa FRl GLGs <400> 398 gatgttgtga tgacacagtc tccagctttc ctctctgtga ctccagggga gaaagtcacc 60 atcacctgc 69

<210> 399 <211> 66 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Sequência Lambda

FRl GLG <4Ο0> 399 cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgc 66

<210> 400 <211> 66 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0>

<223> Descrição do Organismo Desconhecido: Sequência Lambda FRl GLG <400> 400 cagcctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgt 66

<210> 401 <211> 66 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0>

<223> Descrição do Organismo Desconhecido: Sequência Lambda FRl GLG <400> 401 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgt 66

<210> 402 <211> 66 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Sequência Lambda

FRl GLG cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60 tcctgc 66 <4Ο0> 402

<210> 403 <211> 66 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0>

<223> Descrição do Organismo Desconhecido: Sequência Lambda FRl GLG <400> 403 cagtctgccc tgactcagcc tccctccgcg tccgggtctc ctggacagtc agtcaccatc 60 tcctgc 66

<210> 404 <211> 66 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0>

<223> Descrição do Organismo Desconhecido: Sequência Lambda FRl GLG <400> 404 cagtctgccc tgactcagcc tcgctcagtg tccgggtctc ctggacagtc agtcaccatc 60 tcctgc 66

<210> 405 <211> 66 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Sequência Lambda

FRl GLG <4Ο0> 405 cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60 tcctgc 66

<210> 406 <211> 66 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0>

<223> Descrição do Organismo Desconhecido: Sequência Lambda FRl GLG <400> 406 cagtctgccc tgactcagcc tccctccgtg tccgggtctc ctggacagtc agtcaccatc 60 tcctgc 66

<210> 407 <211> 66 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0>

<223> Descrição do Organismo Desconhecido: Sequência Lambda FRl GLG <400> 407 cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60 tcctgc 66

<210> 408 <211> 66 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Sequência Lambda

FRl GLG <4Ο0> 408 tcctatgagc tgactcagcc accctcagtg tccgtgtccc caggacagac agccagcatc 60 acctgc 66

<210> 409 <211> 66 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0>

<223> Descrição do Organismo Desconhecido: Sequência Lambda FRl GLG <400> 409 tcctatgagc tgactcagcc actctcagtg tcagtggccc tgggacagac ggccaggatt 60 acctgt 66

<210> 410 <211> 66 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0>

<223> Descrição do Organismo Desconhecido: Sequência Lambda FRl GLG <400> 410 tcctatgagc tgacacagcc accctcggtg tcagtgtccc caggacaaac ggccaggatc 60 acctgc 66

<210> 411 <211> 66 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Sequência Lambda

FRl GLG tcctatgagc tgacacagcc accctcggtg tcagtgtccc taggacagat ggccaggatc 60 acctgc 66 <4Ο0> 411

<210> 412 <211> 66 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0>

<223> Descrição do Organismo Desconhecido: Sequência Lambda FRl GLG <400> 412 tcttctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcaggatc 60 acatgc 66

<210> 413 <211> 66 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0>

<223> Descrição do Organismo Desconhecido: Sequência Lambda FRl GLG <400> 413 tcctatgtgc tgactcagcc accctcagtg tcagtggccc caggaaagac ggccagqatt 60 acctgt 66

<210> 414 <211> 66 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Sequência Lambda

FRl GLG tcctatgagc tgacacagct accctcggtg tcagtgtccc caggacagac agccaggatc 60

acctgc 6S <4Ο0> 414

<210> 415 <211> 66 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0>

<223> Descrição do Organismo Desconhecido: Sequência Lambda FRl GLG <400> 415 tcctatgagc tgatgcagcc accctcggtg tcagtgtccc caggacagac ggccaggatc 60 acctgc 66

<210> 416 <211> 66 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0>

<223> Descrição do Organismo Desconhecido: Sequência Lambda FRl GLG <400> 416 tcctatgagc tgacacagcc atcctcagtg tcagtgtctc cgggacagac agccaggatc 60 acctgc 66

<210> 417 <211> 66 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Sequência Lambda

FRl GLG <4Ο0> 417 ctgcctgtgc tgactcagcc cccgtctgca tctgccttgc tgggagcctc gatcaagctc 60 acctgc 66

<210> 418 <211> 66 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0>

<223> Descrição do Organismo Desconhecido: Sequência Lambda FRl GLG <400> 418 cagcctgtgc tgactcaatc atcctctgcc tctgcttccc tgggatcctc ggtcaagctc 60 acctgc 66

<210> 419 <211> 66 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0>

<223> Descrição do Organismo Desconhecido: Sequência Lambda FRl GLG <400> 419 cagcttgtgc tgactcaatc gccctctgcc tctgcctccc tgggagcctc ggtcaagctc 60 acctgc 66

<210> 420 <211> 66 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Sequência Lambda

FRl GLG <4Ο0> 420 cagcctgtgc tgactcagcc accttcctcc tccgcatctc ctggagaatc cgccagactc 60 acctgc 66

<210> 421 <211> 66 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0>

<223> Descrição do Organismo Desconhecido: Sequência Lambda FRl GLG <400> 421 caggctgtgc tgactcagcc ggcttccctc tctgcatctc ctggagcatc agccagtctc 60 acctgc 66

<210> 422 <211> 66 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0>

<223> Descrição do Organismo Desconhecido: Sequência Lambda FRl GLG <400> 422 cagcctgtgc tgactcagcc atcttcccat tctgcatctt ctggagcatc agtcagactc SO acctgc 66

<210> 423 <211> 66 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Sequência Lambda

FRl GLG <4Ο0> 423 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgc 66

<210> 424 <211> 66 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> < 223> Descrição do Organismo Desconhecido: Lambda FRl GLG sequence <400> 424 cagactgtgg tgactcagga gccctcactg actgtgtccc caggagggac agtcactctc 60 acctgt 66

<210> 425 <211> 66 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0>

<223> Descrição do Organismo Desconhecido: Sequência Lambda FRl GLG <400> 425 caggctgtgg tgactcagga gccctcactg actgtgtccc caggagggac agtcactctc 60 acctgt 66

<210> 426 <211> 66 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0> <223> Descrição do Organismo Desconhecido: Sequência Lambda

FRl GLG <4Ο0> 426 cagactgtgg tgacccagga gccatcgttc tcagtgtccc ctggagggac agtcacactc 60 acttgt 66

<210> 427 <211> 66 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0>

<223> Descrição do Organismo Desconhecido: Sequência Lambda FRl GLG <400> 427 cagcctgtgc tgactcagcc accttctgca tcagcctccc tgggagcctc ggtcacactc 60 acctgc 66

<210> 428 <211> 66 <212> DNA <213> Organismo Desconhecido <22 0>

<223> Descrição do Organismo Desconhecido: Sequência Lambda FRl GLG <400> 428 caggcagggc tgactcagcc accctcggtg tccaagggct tgagacagac cgccacactc 60 acctgc 66

Lisboa, 25 de Fevereiro de 2015

Claims (20)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um método para a contrução de uma biblioteca que apresente uma família diversificada de péptidos, polipéptidos ou proteínas à superfície de um pacote genético, método que inclui as etapas de: (i) clivagem de um ácido nucleico num local desejado por um método inclui as etapas de: (a) contacto do ácido nucleico de cadeia simples com um oligonucleótido de cadeia simples, o oligonucleótido de cadeia simples é complementar ao ácido nucleico de cadeia simples na região em que a clivagem é desejada; em que o ácido nucleico de cadeia simples e o oligonucleótido de cadeia simples hibridam para formar uma região localmente em cadeia dupla do ácido nucleico de cadeia simples, em que a região localmente em cadeia dupla compreende um local de reconhecimento da endonuclease de restrição; e (b) clivagem do ácido nucleico no sítio de reconhecimento da endonuclease de restrição, em que a clivagem compreende o contacto de uma endonuclease de restrição para a região localmente em cadeia dupla, em que a endonuclease de restrição é específica para o local de reconhecimento da endonuclease de restrição; os passos de contacto e clivagem a serem realizados a uma temperatura entre 45°C e 75°C, em que o ácido nucleico de cadeia simples e o oligonucleótido cadeia simples hibridam para formar uma região localmente em cadeia dupla do ácido nucleico de cadeia simples, e em que o restante ácido nucleico de cadeia simples é de cadeia simples e em que a endonuclease de restrição é ativa na temperatura; e (ii) apresentando um membro da família de péptidos, polipéptidos ou proteínas codificadas pelo ácido nucleico clivado na superfície de um pacote genético e coletivamente apresentando, pelo menos, uma porção da diversidade da família.
2. 2. Um método para produzir uma biblioteca que apresenta uma família diversificada de péptidos, polipéptidos ou proteínas à superfície de um pacote genético, o método inclui as etapas de: (i) clivagem de um ácido nucleico num local desejado por um método que inclui as etapas de: (a) contacto de um ácido nucleico de cadeia simples com um oligonucleótido parcialmente de cadeia dupla, a região de cadeia simples do oligonucleótido é complementar ao ácido nucleico de cadeia simples na região em que a clivagem é desejada, e a região de cadeia dupla do oligonucleótido possui um local de reconhecimento de endonuclease de restrição de Tipo II-S; em que o ácido nucleico de cadeia simples e a região de cadeia simples do oligonucleótido hibridam e formam uma região localmente em cadeia dupla do ácido nucleico de cadeia simples, em que a região localmente em cadeia dupla compreende um local de clivagem de Tipo II-S; e (b) a clivagem do ácido nucleico no local de clivagem de Tipo II-S, em que a clivagem inclui o contacto da endonuclease de restrição de Tipo II-S com a região localmente em cadeia dupla do ácido nucleico de cadeia simples, em que a endonuclease de restrição de Tipo II-S é específica para o local de reconhecimento da endonuclease de restrição do Tipo II-S; os passos de contacto e são realizados a uma temperatura entre 45°C e 75°C, em que o ácido nucleico de cadeia simples e a região de cadeia simples do oligonucleótido associado formam uma região localmente em cadeia dupla no ácido nucleico de cadeia simples, em que o restante do ácido nucleico de cadeia simples é de cadeia simples e em que a endonuclease de Tipo II-S é ativa na temperatura; e (ii) exibindo um membro da família de péptidos, polipéptidos ou proteínas codificado pelos ácidos nucleicos clivadas na superfície da pacotes genéticos e apresentando coletivamente, pelo menos, uma porção da diversidade da família.
3. 3. 0 método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que os ácidos nucleicos codificam pelo menos uma parte de uma imunoglobulina.
4. 4. 0 método de acordo com a reivindicação 3, em que a imunoglobulina inclui Fab ou Fv de cadeia simples.
5. 5. 0 método de acordo com a reivindicação 3 ou 4, em que a imunoglobulina inclui pelo menos parte de uma cadeia pesada, ou pelo menos parte de uma cadeia leve.
6. 6. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, em que as sequências de ácidos nucleicos são, pelo menos em parte, originárias de pacientes que sofrem de, pelo menos, uma doença autoimune ou cancro.
7. 7. Os métodos de acordo com a reivindicação 1 ou 2, incluem ainda um passo de amplificação de ácidos nucleicos antes do passo (i) ou entre os passos (i) e (ii) .
8. 8. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que a endonuclease de restrição é selecionada a partir do grupo que compreende MaelII, Tsp45l, Hphl, BsaJI, Alui, BlpI, Dde1, BglII, Ms 11, BsiEI, EaeI, EagI, HaeIII, Bst 4CI, 7ípyCH4HI, Hinfl, Mlyl, Piei, Mnll, fípyCH4V, BsmAl, Bpml, XmnI, e Saci.
9. 9. 0 método de acordo com a reivindicação 5, em que pelo menos uma parte da cadeia pesada e/ou leve é humana.
10. 10. O método de acordo com a reivindicação 3 ou 4, em que a imunoglobulina inclui pelo menos uma região de FRl.
11. 11. O método de acordo com a reivindicação 10, em que pelo menos uma porção de FRl é humano.
12. 12. O método de acordo com a reivindicação 6, em que a doença autoimune é selecionada a partir do grupo que consiste em lúpus eritematoso, esclerose sistémica, artrite reumatoide, síndroma antifosfilipíco e vasculite.
13. 13. 0 método de acordo com a reivindicação 12, em que os ácidos nucleicos são, pelo menos em parte, isolados a partir do grupo que consiste em células de sangue periférico, células de medula óssea, células do baço e células de nódulos linfáticos.
14. 14. 0 método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, que inclui ainda a ligação de um adaptador de DNA sintético parcialmente de cadeia dupla ao ácido nucleico de cadeia simples clivado e clonagem do ácido nucleico num vetor.
15. 15. 0 método de acordo com a reivindicação 14, em que o adaptador de DNA sintético parcialmente de cadeia dupla inclui uma região de cadeia dupla de 12-100 nucleótidos.
16. 16. O método de acordo com a reivindicação 14, em que o adaptador de DNA sintético parcialmente de cadeia dupla inclui um local de restrição por endonuclease.
17. 17. O método de acordo com a reivindicação 14, em que o adaptador de DNA sintético parcialmente de cadeia dupla inclui uma região de cadeia simples de 2-15 bases.
18. 18. O método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, que inclui ainda a preparação de uma coleção de ácidos nucleicos que codificam, pelo menos em parte, para os membros da família diversificada.
19. 19. O método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, que inclui ainda um outro ácido nucleico de cadeia simples.
20. 20. O método de acordo com a reivindicação 2, em que as endonucleases de restrição de Tipo II-S de são selecionada a partir do grupo constituído por AarlCAC, AcelII, Bbrll, BbvI, BbvII, Bce83l, BceAI, Bcefl, BcíVI, BfiI, BinI, BscAI, BseRI, BsmFI, BspMI, Eci I, Bco57l, Raul, Fokl, Gsul, Hgal, Hphl, MboII, Mlyl, Mme I, Mnl I, Pie I, Rl eAI, Sfam, SspO5l, Sthl32l, Stsl, Taqll, TthlllII, ou UbaPI. Lisboa, 25 de Fevereiro de 2015