JPH03219892A - タンパク質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はプラスミノーゲンのクリングル１　（以下に１
と略称する）を含む融合タンパク質を用いたＫｌおよび
タンパク質の製造法に関する。

従来の技術 （１）Ｋｌの存在と生化学的、物理化学的性質クリング
ルはプラスミノーゲンなどの部分構造でアミノ酸７０−
９０残基からなり、その分子量は約１万である。プラス
ミノーゲンではアミノ酸配列上用同性の高い５個のクリ
ングル構造が連結して存在する〔エル・ソ７トラップセ
ンセン（Ｌ、　５ｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ）ら、プ
ログレス・イン・ケミカル・フィブリツリシス・アンド
・トロンポリシス　（Ｐｒｏｇ、Ｃｈｅｍ、　Ｆｉｂｒ
ｉｎｏｌｙｓｉｓＴｈｒｏｍｂｏｌｙｓ＋ｓ）３．　１
９１−２０９（１９７８）　′、。この５個のクリング
ルの主たる役割は血栓の本体であるフィブリンへの結合
にあると言われる〔ニス・トルセン（Ｓ、　Ｔｈｏｒｓ
ｅｎ）ら、ハイオヒミカ・ハイ牙フイジカ°アクタ（Ｂ
ｉｏｃｈｉｍ＋ｃａ　ｅｔ　ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃ
ｔａ）　６６８．３７７−３８７（１９８１＞二ととも
に、アルファ２アンチアラスミンとの相互作用を媒介す
るきも考えろれているニヒ゛−・ウイマ７　（Ｂ、　Ｌ
’ｌ　ｉｍａｎ）ら、バイオヒミカ・バイオフィジカ・
アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓ
ｉｃａ　Ａｃｔａ）　５７９　、　１４２１５４＜１９
７９）　〕。フィブリンへの結合はリジンあるいはリジ
ンアナログにより競争的に阻害されることから、クリン
グル中にあるリジン結合部位がフィブリンへの結合を媒
介していると考えられる〔ニス・トルセン（Ｓ、　Ｔｈ
ｏｒｓｅｎ）　　ら、バイオヒミカ・ハイオフィジカ・
アクタ（Ｂｉｏｃｈｉ制Ｃａｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ
ａ　Ａｃｔａ＞　６６８　、３７７−３８７（１９８１
）　Ｌ　。

プラスミノーゲンの５個のクリングルの中でも、Ｎ末端
側のＫｌは最も強いリジン結合能を有する〔ピー・ジー
・リーチ（Ｐ、　Ｇ、　Ｌｅｒｃｈ）　　ら、ヨーロピ
アン・シアーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ
ｏｐｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）１［１７７−１３（１９８０）　、”。この
リジン結合能は結合するリジンのイプシロン−アミノ基
のみならずアルファーカルボキシル基も関与しておりク
エイ・モッタ（八、λｌｏｔシａ）　　ろ、バイオケミ
ストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２６．３８２７
−３８３６（１９８７）Ｅ　、その結合定数はリジンア
ナログのイプシロン−アミツカプロン酸では９マイクロ
モルにもなり〔シ・マーカス（Ｇ、　Ｍａｒｋｕｓ）ら
、ザ・ジャーｆルーオブ・バイオロンカル・ケミストリ
ー（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２Ｆｉ３７２７−７３
２（１９７６）　〕、一般に１ミリモル前後である酵素
反応のミカエリスメンテン定数と比較するとかなり強い
結合である。

（２）Ｋｌの利用 血栓溶解剤にＫｌを導入することにより血栓溶解剤の血
栓親和性を向上させようよし）う試みよなされている〔
シェイムス・シェイ・デブリン（Ｊａｍｅｓ−Ｊ、　Ｄ
ｅｖｌｉｎ）ら、バイオテクノロン＜Ｂ［０／ＴＥＣＩ
（ＮＯＬＯＧＹ＞　７　、２８６（１９８９）　：　、
　Ｋ　１単独でリジン、またはリジンアナログをＣ末端
に有するペプチドを吸着するタンパク質として利用する
報告はない。

（３１Ｋｌの製造方法 現在知られている天然型の立体構造を有するに１の製造
方法としては、人血漿より精製したプラスミノーゲンを
タンパク質分解酵素：こより切断後さらに精製する方法
〔エル・ソノトラソプ−ヤンセン（Ｌ、　５ｏｔｔｒｕ
ｐ−Ｊｅｎｓｅｎ）ら、プログレス・イン・ケミカル・
フィブリツリシス・アンド・トロンポリシス（Ｐｒｏｇ
、　　Ｃｈｅｍ、　　ＦｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓＴｈｒ
ｏｍｂｏｌｙｓｉｓ）　　３．　１９１−２０９（１９
７８）　、エイ・モンタ（Ａ、　！、１ｏｔｔａ）ら、
す・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ
　［：ｈｅｍｉｓｔｒｙ）　２６１　、　１３６８４−
１３６９２（１９８６）　）が知られている。人血漿を
用いる方法は原料供給が限られていることから高価につ
き、工業的に不利である。

遺伝子組換え技術を用いてこのような分子量１万以下の
タンパク質を融合タンパク質として効率よく発現、生産
させることは公知であり、特公平１−２３１１８などに
記載されている。遺伝子組換え技術によるタンパク質生
産法において、工業的規模での分離精製工程の簡便化を
目的に、種々の工夫がなされている。プロテインＡのＢ
ドメイン中２残基に置換を入れた２領域との融合タンパ
ク質として少量後、その特異性を利用して免疫グロブリ
ンＧカラムを用いて精製する方法（特開昭６２−１９０
０８７）　、ヒスチジンを含むアミノ酸配列を導入し、
金属キレート担体を利用して精製する方法（特開昭６１
−１４８１９７、特開昭６３−２５１０９５）、βグル
コシダーセ特異的阻害剤のアフィニティーカラムを利用
して精製する方法（特開昭６４−２００９４）などが知
ろれてし）る。Ｋ１を含む融合タンパク質も遺伝子組換
え技術により発現されてし）る：ジェイムス・ジエイ・
デブリン（Ｊａｍｅｓ　Ｊ、口ｅｖｌｉｎ＞ろ、バイオ
テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＩハロＬＯＧＹ）　７　
。

２８６　＜１９８９）Ｊ、　Ｌかしながら、融合タンパ
ク質としての発現効率、融合タンパク質の安価かつ回収
の良し）切断方法、効率的精製法すべてを満足する方法
は未だ開示されていな−）。

゛・１）Ｃ末端アミノ酸残基特異的なペプチドの分別方
法 ペプチド混合物からＣｔ端に特定のアミノ酸残基を有す
るペプチドをＣ末端のアミノ酸残基特異的に分別する技
術は、ペプチド精製、特：二タンパク質のペプチド分析
におけるＣ末端ペプチドの分離同定に有効であり、石井
ら〔ニス・インイ（Ｓ、　１ｓｈｉ　ｉ）ら、バイオロ
ジカル・アンド・バイオケミカル・リサーチ・コミュニ
ケーションズ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌ　ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｉｎｍｕｎｉ
ｃａｔｉｏｎｓ）　７２．　１４４３＜１９７６：ｌお
よびジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ　ｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＞　８１．６４
７＜１９７７）−はトリブ／ン活性品位を化学修飾し、
クロマト担体に固定化することによりＣ末端にリジンあ
るいはアルギニンを有するペプチドを特異的：こ吸着す
る方法を報告している。この化学修飾が不十分な場合、
プロテアーセ活性が残存しペプチドを切断することがあ
るため化学修飾されたプロテアーセのみを分別し固定化
する方法がより好ましいことも知られている（特開昭６
：ｌ−２３３７８８＞。

化学修飾され、固定化されるプロテアーセとしてリジル
エンドベブチダーセを用′、）リジンをＣ末端（＝有す
るペプチドを特異的に吸着する方法も知られて、）ろ（
特開昭６：ｌ−２′ｉ３−、８８）　、　−〇方法は酵
素の基質結合部位を利用しているために１を用いる場合
に比べ結合力は弱く、またタンパク質の酵素分解液を負
荷すると、化学修飾され固定化された吸着用酵素が通塔
液中の酵素により切断され、このフラグメントが溶出液
に回収されてしまい、さらに結合能も劣化するという問
題点を残している。

発明が解決しようとする課題 本発明はに１を含む融合タンパク質を利用し、天然型の
立体構造を有するＫｌおよびタンパク質を容易に製造す
る方法を提供するとともに、Ｋ１含有組成物を利用した
、ペプチドおよびペプチド誘導体の分別方法を提供する
。

課題を解決するた狛の手段 本発明者らはタンパク質（Ｘ）とに１の融合タンパク質
を遺伝子組換えの技術を用いて微生物または動物細胞に
より大量生産させ、化学的または酵素的切断と、タンパ
ク質（Ｘ）または天然型の立体構造を有するに１に特異
的なカラムクロフトグラフィーを組合せることにより、
天然型の立体構造を有するＫｌを容易に製造できること
を見いだした。さらにに１を従来公知の方法によりクロ
マト担体に固定化することによりリジンまたはリジンア
ナログをＣ；４ｉ：端に有するペプチドを吸着し分別す
る方法を確立し、本発明を完成するに至った。

（１）融合タンパク質の構成 本発明に用いられる融合タンパク質は〔１）Ｋ１と融合
するタンパク質（Ｘ）のアミノ酸配列、（２）Ｋｌのア
ミノ酸配列および（３）必要に応じて向配列の間に挿入
される切断部位のアミノ酸配列（Ｙ）から構成される。

以下各配列を詳細に説明する。

（１，）Ｋｌと融合するタンパク質（Ｘ）の配列に１と
融合するタンパク質は、Ｋ１の天然型の立体構造の構築
を阻害せず、融合タンパク質が微生物または動物細胞に
より発現する限界値（通常１０．０００と言われるが融
合タンパク質の性質によって変動する）以上の分子量の
ものが用いられる。好ましくはアフィニティークロマト
グラフィーに応用できるよう、選択された担体になんら
かの親和性を有するもので、融合タンパク質の微生物ま
たは動物細胞による発現に必要である以上に分子量が大
きくなく、Ｋ１との間に化学的または酵素的切断部位を
挿入でき、アミノ末端側に結合している場合は高発現を
誘導できるものが用いられる。プロティンＡのＢドメイ
ン、プロティンＡのＢドメインにアミノ酸置換により金
明結合部位を導入した誘導体は上記の条件を満たす。

プロティンＡのＢドメイン誘導体としては、金属キレー
ト担体との親和性を付与するためｉこ１〜１０個のヒス
チジンをアミノ酸置換により導入したものが用いられる
。アミノ酸置換の位置はとくに限定されないが、好まし
くは少なくとも２個のヒスチジンが２〜３個のヒスチジ
ンまたはその他のアミノ酸を挟んで存在する部分配列（
金属キレート担体とりわけ亜鉛キレート担体との特異的
親和性を有するとされる配列〔イー・スルコツスキ （Ｅ、Ｓｕｌｋｏｗｓｋｉ）、　）レンド・イン・バイ
オテクノロジー（Ｔｒｅｎｄ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ）　３．１（１９８５）　〕を有するように
置換する。

（２１Ｋｌ配列 に１配列としては、下記式で表わされるものが用いられ
る。

ＹＬＳＥＣＫＴＧＮＧＫＮＹＲＧＴＭＳＫＴＫＮＧ　Ｉ
ＴＣＱＫＷＳＳＴＳＰＨＲＰＲＦＳＰＡＴＨＰＳＥＧＬ
ＥＥＮＹＣＲＮＰＤＮＤＰＱＧＰＷＣＹＴＴＤＰＥＫＲ
ＹＤＹＣＤｒＬＥｃＥＥＥ　（ここでアミノ酸表示は１
文字表示であり、Ａ　アラニン、Ｃニジスティン、Ｄ：
アスパラギン酸、Ｅ　グルタミン酸、Ｆ：フェニルアラ
ニン、Ｇニゲリシン、Ｈ：フェニルアラニン、Ｇ：イソ
ロイシン、Ｋ”リシン、Ｌ：ロイノン、Ｍ：メチオニン
、Ｎ：アスパラギン、Ｐニブロリン、Ｑ：グルタミン、
Ｒアルギニン、Ｓ：セリン、Ｔ：トレオニン、Ｗ、トリ
プトファン、Ｙ：チロノン）。但しＮ末端のＹＬＳＥＳ
Ｃ末端のＥＥＥは必ずしも必要ではなくこれらの一部ま
たは全部を欠く配列でもよい。

（３）必要に応じて両配列の間に挿入される切断部位の
配列 化学的または酵素的切断を特異的に受けるペプチド結合
が知られている〔日本生化学全編、続生化学実験講座２
、タンパク質の化学上　東京化学同人ρ、　２６０　（
１９８７）、日本生化学全編、生化学実験講座１、タン
パク質の化学■　東京化学同人ｐ、　２３４　（１９７
６）、酵素ノ飄ンドブソク、丸尾文治、田宮信雄監修、
朝食書店ρ、５４４〜５５０（１９８２）　］。

切断部位の配列は、上記の公知のいずれの配列も利用出
来るが、切断部位のアミノ酸としてはＲ／、に／、Ｅ／
、Ｄ／、Ｍ／、Ｗ／／Ｃ，Ｎ／Ｇ、Ｄ／Ｐ、　ＡＰＲ／
、ＰＲ／。

ｌ　ＥＧＲ／、ＶＰＲ／　（ここで／は切断位置を示す
）が好ましい。必要に応じて、タンパク質（Ｘ）の配列
とに１の配列の間に切断部位を挿入する。タンパク質（
Ｘ）の配列とに１の配列を直接接続することによって切
断部位を形成することが好ましい。タンパク質（Ｘ）の
配列中の切断部位付近に変異を加え切断部位を形成する
こともできる。

上記２種のいずれもの切断部位形成が困難な場合にはに
１の機能を損なわない範囲でに１の配列中のＮ末端（Ｙ
ＬＳＥ）またはＣ末端（ＥＥＥ）に変異を加え切断部位
を形成する。

（ＩＩ）化学的または酵素的切断と、特異的親和性を有
するタンパク質（Ｘ）および天然型の立体構造を有する
に１に特異的なカラムクロマトクラフィーを組合せるこ
とによる、天伊型の立体構造を有するに１の製造方法 本発閂における天然型の立体構造を有するに１の製造方
法は、（１）特異的親和性を有するタンパク質（Ｘ）と
に１の融合タンパク質を遺伝子組換えの技術を用いて微
生物または動物細胞により大量生産させ、（２）菌体破
砕液または培養上清から粗精製画分を得、（３）タンパ
ク質（Ｘ）に特異的なカラムクロマトグラフィー後、（
４）ジスルフィド結合形成を含む天然型の立体構造の構
築を行い、（５）化学的または酵素的切断後、（６）Ｋ
ｌに特異的なカラムクロマトグラフィーにより天然型の
立体構造を有するＫｌを精製することからなる。但、し
工程の組立は上記の順序に限定されるものではなく例え
ば（３）と（４）の入れ替えや、（６）の（４）と（５
）の間への挿入なども可能である。

（ＩＩＩ）Ｋｌの固定化方法 に１は、タンパク質の担体への固定化方法を用いること
で行なわれる。担体としては例えばＣＮＢｒ活性化セフ
ァ０−ス４　Ｂ、　Ｔｒｅｓｙｌ活性化セファロース４
Ｂ（ファルマシア社Ｍ）、Ｔｒｅｓｙｌ−５Ｐ　Ｗ　（
東ソー社製）などがある。

Ｋ１を固定化する手段としては、Ｋｌ単独のみならず上
述のタンパク質＜Ｘ）とに１の融合タンパク質を固定化
する方法を用いてもよい。

（ｒＶ）Ｋｌ固定化担体を利用したリジンまたはリジン
アナログをＣ末端に有するペプチドの分別方法 に１はリジンまたはリジンアナログに特異性が高いので
、リジンまたはリジンアナログをＣ末端に有するペプチ
ドは、Ｋ１に吸着させ、他の物質と分別することができ
る。ここでリジンアナログとはに１に特異的に吸着する
アミノ酸であればとくに限定されないが、たとえば、シ
スティンをエチレンイミンで化学修飾したＳ−アミノエ
チルシスティンでもよい。また、リジンまたはリジンア
ナログをＣ末端に有するペプチドの残基数はとくに限定
されない。Ｋ１固定化担体の利用分野としては、遺伝子
工学、タンパク質工学、生化学、臨床診断などの分野に
おけるタンパク質のプロテアーゼ分解物の特異的を二分
離、精製があげられる。とくにタンパク質をリジルエン
ドペプチダーゼで切断したときに発生する、Ｃ末端にリ
ジンまたはリジンアナログを有するペプチドと、Ｃ末端
にリジンまたはリシンアナログを持たないペプチドとを
分別する方法としてを効である。リジンまたはリジンア
ナログをＣ末端に有するペプチドに対するに１の結合力
は固定化化学修飾酵素より強く、またＫｌはプロテアー
セ分解液に存在するプロテアーセにも安定であるのでＫ
ｌ固定化担体を用いるこの分別方法は非常ｉこ有利であ
る。

（Ｖ）各工程の詳細な説明 タンパク質（Ｘ）とに１の融合タンパク質の遺伝子組換
えの技術を用いた宿主細胞内ての大量生産 タンパク質（Ｘ）とに１の融合タンパク質をコードする
Ｕ）ＮＡ＠片を該ＤＮＡの発現機能をもつ適当なプラス
ミドに組み込んで得られる組換え体プラスミドを宿主細
胞に挿入し、得られる形質転換細胞を培養することによ
り該融合タンパク質を製造することができる。

宿主細り包としては、大腸菌や動物細胞が用いられる。

Ｋ１と融合させるタンパク質（Ｘ）をコードするＤＮＡ
としては上記に示した性質を有するタンパク質（Ｘ）を
コードしているＤＮＡであればいかなるものも用いるこ
とができるが、具体的にはプロティンＡのＢドメインを
コードするＤＮＡがあげられる。Ｂドメインをコードす
るＤＮＡを有するプラスミドとしてはｐＰｒＡｓｌやｐ
ＰｒＡｌ（特開昭６１２１４１９５）　　［斎藤暁子ら
・プロティンエンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎεｎｇ
ｉｎｅｅｒｉｎｇ）　２　、４８１４８７（１９８９）
　３を用いることができる。また、プロティンＡのＢド
メインに金属キレート結合部位を導入した誘導体をコー
ドするプラスミド（例えば実施例１ｊこ示すｐＰｒＡＺ
ｌ＞を用いるこ吉ができる。

ＫｌをコードするＤＮＡは、ヒトプラスミノーゲンをコ
ードするメツセンジャーＲＮＡから組換えＤＮＡ技術で
逆転写して得られるｃＤＮＡまたは染色体ＤＮＡから得
られるヒトプラスミノーゲンをコードするＤＮＡなどか
らに１部分をコードするＤＮＡを制限酵素により切り出
すことによって得られる。Ｋ１をコードするＤＮＡを複
数本の合成りＮＡから再構築することも可能である。上
記融合タンパク質を組込むプラスミドとしては、大腸菌
または動物細胞で該ＤＮＡが発現できるものなる、し）
かなるプラスミドも用いることができる。好ましくは、
大腸菌内でタンパク質（Ｘ）とに１の融合タンパク質を
発現させるた狛には、適当−；プロモーター、例えばｔ
ｒｐ系、ｌａｃ系のプロモーターの下流：こ外来ＤＮＡ
を挿入することができ、しかもシアインーダルガーノ配
列（以下ＳＤ配列と略記する）と開始コドン（ＡＴＧ）
の間を適当な距離、例えば６〜１８塩基に調整したプラ
スミドを用も）ることができる。具体的に好適で」プラ
スミドとしては、本発明者らによって造成されたｐＫＹ
Ｐｌｏ（特開昭５８−１１０６００）プロティンＡのＢ
ドメインを発現するプラスミドｐＰｒＡｓ１　（特開昭
６３−２１．４１９５）　ｉ；どがあげられる。

以下：こ、ブチイン、へのＢドメインをコードするプラ
スミドとしてｐ’Ｐｒ、へＳｌとｐＰｒＡ！（特開昭６
３−２１４１９５）を、またに１をコードするＤＮＡ断
片として化学合成した１２種のＤＮＡを結合することに
よって得られるＤＮＡ断片を用いてプロティンＡのＢド
メインあるいはその誘導体とに１の融合タンパク質を発
現する組換え体プラスミドを造成する例を示す。

まず、Ｋ１をコードするＤＮＡ断片の構築に必要な１２
種の合成りＮＡ　（塩基配列は第１図に示す）を化学合
成し、これらの５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキ吉−
セによりリン酸化する。一方、ｐＰｒＡｓｌをＮａｒＩ
とＮｃｏｌで切断した後、約３．　ＯＫ　ｂのＤＮＡ断
片を精製する。このようにして得られた１２種の５′リ
ン酸化された合成りＮＡとＤＮＡ断片とをＴ　４　Ｄ　
ＮＡリガーセにより結合し、プロティンへのＢドメイン
とＫｌの融合タンパク質を発現するプラスミドｐＰｒＫ
Ｔ１を得る（第１図）。

次いで、第３図に示したようにして、ρＰ、ｒ　Ａ　Ｓ
　１をＸｍｎ１による部分消化およびＰｓｔ　ｌによる
完全消化に洪した後、約１．１５　Ｋ　ｂのＤ　Ｎ　Ａ
断片を精製する。一方、ｐＰｒＡｌをＰｓｔｌによる完
全消化およびＢｇｉＮによる部分消化に供した後、約１
．８５ＫｂのＤＮＡ断片を精製する。これらとは別に第
３図に示す２種の合成りＮＡを調製し、これらの５′末
端をＴ４ボリヌクレオチドキナーセによりリン酸化する
。このようにして得られた２種のＤＮＡ断片と２種の５
′リン酸化された合成りＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼによ
り結合し、プロティンＡとＢドメインに金属キレート結
合部位を導入した誘導体を発現するプラスミドｐＰｒＡ
Ｚ１を得る。

次に第４図Ｊこ示したようにして、ｐＰｒＫＴｌをＥｃ
ｏＲＩと７１１Ｖａ　ｒで切断した後、約２．５　Ｋｂ
のＥｃｏＲｒ−Ａｖａｌ断片と約０．３　ＫｂのＡｖａ
ｌΔｖａＩ断片を精製する。一方、ｐＰｒＡＺｌをＥｃ
ｏＲＩとＡｖａｌで切断した後、約０．５　Ｋ　ｂのＤ
ＮＡ断片を精製する。このようにして得られた３種のＤ
ＮＡ断片をＴ４ＤＮＡＩＪガーゼにより結合し、プロテ
ィンＡのＢドメインに金属キレート結合部位を導入した
誘導体とＫｌの融合タンパク質（ＰＺＫＩ）を発現する
プラスミドｐＰ２ＫＴ１を得る。

上記組換え技法における反応の条件は、−船釣に下記の
通りである。

ＤＮＡの制限酵素による消化反応は通常０．１〜２０μ
ｇのＤＮＡを２〜２００ｍ！、ｌ　（好ましくは１０〜
４０ｍＭ）のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６，０〜９．５好
ましくはｐＨ７，０〜８．０）　、Ｏ〜２００ｍＭのＮ
ａＣｊ！１２〜２０ｍＭ（好ましくは５〜１０　ｍＭ）
のＭ　ｇ　Ｃ１２を含む反応液中で、制限酵素０１〜１
００単位（好ましくはｌμｇのＤＮＡに対して１〜３単
位）を用い、２０〜７０℃（至適温度は用いる制限酵素
により異なる）において、１５分間〜２４時間行う。反
応の停止は、通常５５〜７５℃で５〜３０分間加熱する
ことによるが、フェノールまたはジエチルピロカーボネ
ートなどの試薬により制限酵素を失活させる方法も用い
ることができる。

制限酵素消化によって生じたＤＮＡ断片は、低融点了ガ
０−スゲル電気泳動法［エル・ウィスランダ−（Ｌ、ｌ
１ｉｉｅｓｌａｎｄｅｒ）　：アナリティカ）Ｌｉ−パ
イ、ｔケミストリイー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　９８゜３０５　（１９７９）　
’３あるいはＤＮＡ断片を含むアゴ０スゲルをＮａＩ溶
液で溶解した後、ガラスパウダを用いてＤ　Ｎ　Ａ断片
を精製する方法〔この方法は旭硝子−などからキット化
された製品が販売されており、この製品を用いると便利
である〕などにより精製する。

ＤＮＡ断片の結合反応は、２〜２００ｍ！、！＜好まし
くは１０〜４０ＩＴ１１４）のＴ　ｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣ
ｌ　（ｐ１４６．１〜９．５、好ましくはｐＨ７，０〜
８．０）　、２〜２０ｍ！Ｊ（好ましくは５〜ｌＯｍ〜
１）のＭ　ｇ　Ｃｊ！　２．０．１〜１０　ｍ！、！　
（好ましくは０．５〜２．０　ｍ！υのＡＴＰ、１〜５
０ｍ！、Ｉ（好ましくは５〜１０ｍＭ）のジチオスレイ
トール（以下ＤＴＴともし）う）を含む反応液中で、Ｔ
４ＤＮＡリガーセ０．３〜１０単位を用い、１〜３７℃
（好ましくは３〜２０℃）で１５分間〜７２時間（好ま
しくは２〜２０時間）行う。

結合反応によって生じた組換え体プラスミドＤＮＡは、
必要によりコーエンらの形質転換法ニエス・エヌ・コー
エン（Ｓ、＼、　Ｃｏｈｅｎ）　ラ：　’７’口シーデ
ィング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サ
イエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、
）、ＵＳＡ、　６９　２１１０（１９７２）２あるいは
ハナハンの形質転換法［Ｈａｎａｈａ口　、ジャーナル
書オブーモレキュラー・バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏｌ、
日ｉｏ１．）　１６６　、５５７（１９８３）　］を用
いて、大腸菌に導入する。

組換え体プラスミドＤＮＡを持つ大腸菌から該ＤＮＡの
単離は、バーンボイムらの方法〔エイチ・シー・ハーン
ボイム（１１，Ｃ，Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）ら；ヌクレイツ
ク・アンソド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ
　Ｒｅｓ、＞７、１５１３（１９７９）二などを用いて
行う。

本発胡で使用するデオキシオリゴヌクレオチドは、リン
酸アミダイト法による固相合成法Ｃ９，ＬＢｅａｕｃａ
ｇｅら：テトラへドロン・Ｌ／ターズ（Ｔｅｔｒａｈｅ
ｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、＞　２２．１８５９（１９８１）
３　、およびり、　ＪＢｃＢｒｉｅら二同２４．２４５
（１９８３）二に従い、アプライド・バイオシステムズ
社３８〇八・ＤＮＡ合成機〔Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、
　ＣＡ９４４（１４　Ｅを用いて合成することができる
。合成されたデオキシオリゴヌクレオチドを他のＤＮＡ
断片と結合させる反応に用いる場合には、約２０ピコモ
ル（ｐｍｏｌｅｓ＞のデオキシオリゴヌクレオチドを２
０ｕＱのＴ４キナーゼ緩衝液Ｃ３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｊｉ！　（ｐ）１７．６）、１０１Ｔ＋Ｍ　　ＭｇＣ
β２．５ｎ＋Ｍ　　ＤＴＴ、０．１　ｍＭＥ　Ｄ　Ｔ　
Ａ、０．５ｍＭ　ＡＴＰ’、中で、５単位のＴ４ＤＮＡ
キナーゼを加えることにより、５′−リン酸化する。ハ
イブリダイセーション用のプローブとして用し）る場合
には、上記のＴ４キナーゼ緩衝液の中の０．５ｍ！Ｊ　
　ＡＴＰの代わりに２０〜５０μ口の５ｒ　　ｆ　Ｔ３
２　Ｐ″、Ａ　Ｔ　Ｐ　（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ア
マ−ジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、　八ｒｌｉｎｇｔｏｎ
　Ｈｅｉｇｈｔｓ、　ＩＴ）を用いて、その５′末端を
放射能標識する。

プラスミドＤＮＡの構造解析については、プラスミドＤ
ＮＡを１〜１０種類の制限酵素で消化後アガロースゲル
電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り切断部位を調べる。さらにＤＮＡの塩基配列を決定す
る必要があるときはＭ１３ファージを用いｔニテ゛イデ
オキシ・シーフェンス（ｄｉｄｅｏｘｙ　５ｅｑｕｅｎ
ｃｅ）法によって決定する。

本発明の融合タンパク質は大腸菌を宿主とじて用いるこ
とにより、以下のように製造することができる。

（１）プラスミド（例えばｐＰＺＫＴｌ）を用いて大腸
菌に一１２Ｃ６００ＳＦ８株を形質転換させ、アンピシ
リン耐性（Ａｐ’以下同じ）のコロニーの中からｐＰＺ
ＫＴｌを有する大腸菌を選びだす。ｐＰＺＫＴｌを有す
る大腸菌を培地に培養することにより培養物中に目的の
タンパク質を生成させることができる。

ここで用いる培地としては大腸菌の生育ならびに目的の
タンパク質の生産に好適なものならば合成培地、天然培
地のいずれも使用できる。

炭素源としては、グルコース、フラクトース、ラクトー
ス、グリセロール、マンニトール、ソルビトールなどが
、窒素源としては、Ｎ）１．Ｃｆ　。

（ＮＨ，）　２ＳＯ，、カザミノ酸、酵母エキス、ポリ
ペプトン、肉エキス、バタトトリブトン、コーン・ステ
イープ・リカーなどが、その他の栄養源としてはに２Ｈ
ＰＯ，、ＫＨ２ＰＤ、、ＮａＣ！、ＪＳＯ＜、ビタミン
Ｂ＋　、ＭｇＣｆ、などが使用できる。

培養はｐｌ（５，５〜８５、温度１８〜４０℃で通気攪
拌培養により行われる。

（２）粗ｆｉ！ｆ製両分の調製 融合タンパク質が顆粒として産生された場合は特開昭６
０−２４４２５９に示される方法にしたがって顆粒を取
得し、変性剤（好ましくは４Ｍ以上の尿素または３Ｍ以
上のグアニジン塩酸）を含む緩（ｊ１液（好ましくはｐ
Ｈ５〜１２）に可溶化後、緩衝液（好ましくはｐＨ５〜
１０）に５〜ＩＣｌ０倍希釈し粗精製画分譜する。

融合タンパク質が可溶性画分に生産された場合は特願昭
６１−１６３４１３に示される方法にしたがって菌体破
砕後、硫安分画を行い、緩衝液（好ましくはｐＨ５〜１
０）に溶解させ粗精製画分とする。

融合タンパク質が培養上清に生産された場合Ｊ遠心分離
操作により培養上清を：ＪＩ製し、粗精製画分とする。

（３）タンパク質（Ｘ）　ｊこ特異的なカラムクロマト
グラフィ （３）−１プロティンＡのＢドメインに特異的なカラム
クロマトグラフィー プロティンＡのＢドメインは免疫グロブリンＧに特異性
が高く、免疫グロブリンＧカラムを用いて精製できる。

本工程はプロティンＡのＢドメインとＫｌの融合タンパ
ク質を免疫グロブリンＧカラムに吸着させ、洗浄剤によ
り不純物を除去後、溶出液により該融合タンパク質を溶
出させ、該タンパク質を精製するものであり、その手法
は公知１：ＴｇＧセファロース　６フアースト・フロー
（ファルマシア・ファインケミカル社製）添付の冊子〕
の方法に従えばよい。

免疫グロブリンＧ担体はとくに限定されないが、例えば
ＩｇＧセファロース　６フアースト・フロー（ファルマ
ンア・ファインケミカル社製）を用いればよい。

吸着方法としてはｐＨ６〜１０１好ましくはｐＨ７〜８
の緩衝液で平衡化した免疫グロブリンＧ担体にｐＨ６〜
１０、好ましくはｐｔ１７〜８に調整したプロティンＡ
のＢドメインとＫｌからなる融合タンパク質をカラム方
式あるいはバッチ方式にて吸着させる方法が用いられる
。

洗浄方法としてはｐＨ６〜１０．好ましくはｐｌ（７〜
８の緩衝液を用い１次洗浄後、ｐＨ４〜６好ましくはｐ
ｉ−１５の緩衝液にて２次洗浄を行う。

溶出方法としてはｐＨ２，５〜４、好ましくはｐＨ３，
２〜３．６の緩衝液を用いて溶出する。

使用された免疫グロブリンＧ担体は使用後、ｐ）１６〜
１０、好ましくはｐＨ７〜８の緩衝液に置換し、繰り返
し使用できる。

（３）−２プロテインＡのＢドメイン誘導体に特異的な
カラムクロマトグラフィー 本工程はプロティンへ〇Ｂドメイン誘導体とに１の融合
タンパク質を含む溶液を銅（（：Ｕ）、亜鉛（２ｎ）、
コバル）　（Ｃｏ）、およびニッケル（！ｌｉ）からな
る群から選ばれる少なくとも一つの遷移金属をキレート
化させたキレート基結（アガロース） 合担体と接触させ、該担体に該融合タンパク質を吸着さ
せた後、溶出液を用いて該融合タンパク質を溶出させ、
該融合タンパク質を精製するものである。

キレート基結合担体としては、キレート化能を有する交
換基、例えばビスカルボキシメチルイミノ基Ｃ−Ｎ　（
ＣＨ，Ｃ００Ｈ）２：１が結合したキレート基を有する
不溶性多糖系担体または三次元架橋したポリオレフィン
系担体などがあげられる。好ましくはビスカルボキシメ
チルイミノ基を有する不溶性多糖類系担体、例えば、エ
ポキシ活性化セファロースから誘導され、下記の化学構
造を持つものが用いられる。〔シェイ・ポラス（、Ｊ、
　ＰｏｒａＬｈ）ら：ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）２５
８　、５９８（１９７５）　〕。

［Ｈ，［：００ ０−ＣＬ−ＣＨ［］１１−［：ｌ−１２−０（ＣＩ−１
２）　、−０（Ｈ２−Ｃ８−ＣＩ−１２−＼ＯＨＣＨ，
Ｃｏ。

（Ｍｅ−遷移金属） 遷移金属としては銅（Ｃｕ）、亜鉛（Ｚｎ）、Ｍｅ” コバルト（Ｃｏ）、およびニッケル（Ｎｉ）からなる群
から選ばれる少なくとも一つの遷移金属があげられる。

遷移金属キレート担体はジエイ・ポラス（Ｊ、　Ｐｏｒ
ａｔｈ）らの方法に準じて調製することができる〔ジエ
イ・ポラス（Ｊ、　Ｐｏｒａｔｈ）ら：２．イチャー（
Ｎａｔｕｒｅ）　２５８．５９８（１９７５）　〕。

吸着方法としてはｐＨ５〜ｌＯ１好ましくはｐＨ７〜８
の緩衝液で平衡化した遷移金属キレート担体にｐＨ５〜
ＩＯ１好ましくはｐＨ７〜８に調整した融合タンパク質
をカラム方式あるいはバッチ方式にて吸着させる方法が
用いられる。

溶出方法には、溶出液のｐＩ（を酸性（ｐｔｔ３〜６）
にして溶出する方法および溶出液にキレート剤を用いて
溶出する方法とがある。溶出液のｐｈを酸性にして溶出
する方法においては、融合タンパク質が不可逆的な変性
をしなし）範囲でいかなる酸を用いてもよいが通常酢酸
緩衝液を用いて行う。また、溶出液にキレート化剤を用
いる方法においてはキレート化剤として、遷移金属に対
してキレート能を有する物質、例えば、エチレンシアミ
ン四酢酸、ヒスチジン、ＳＨ化合物、イミノジ酢酸を５
ｍＭ〜ＩＭの範囲で用い、好ましくはヒスチジンが用い
られる。

融合タンパク質を遷移金属キレート担体に吸着させた後
、融合タンパク質を溶出する前に、キレート担体に吸着
した不純物を除去するために洗浄剤で洗浄することが好
ましい。

洗浄剤としては、溶出方法により異なるが、溶出液に用
いることができるものはすべて用いることができる。溶
出液のＰｔｌを酸性：こして溶出する方法では、溶出液
よりもｐＨが中性に近い（ｐＨ４〜７）緩衝液を用い、
溶出液にキレート化剤を用いる方法では、溶出液よりも
濃度の低い溶液を用いる。

使用された遷移金属キレート担体は使用後、０、ＩＭ　
　ＮａＯＨに置換し、不純物を除去するとともに滅菌し
、ついで遷移金属キレートを形成させることにより繰り
返し使用できる。

（４）　　ジスルフィド結合形成を含む天然型の立体構
造の構築 融合タンパク質が顆粒として生産された場合は顆粒の可
溶化液を希釈した段階で、可溶性画分に生産された場合
は生産された時点で、ジスルフィド結合以外の立体構造
は構築されてし）る。本工程ではジスルフィド結合形成
を完結する。またジスルフィド結合の形成は前工程中に
も一部進行している。

ジスルフィド結合の形成のための酸化方法はとくに限定
されないが自然酸化による方法以外に溶存酸素による酸
化を酸素又は空気を該融合タンパク質の水溶液に通気す
ることによって促進する方法、溶存酸素による酸化を該
融合タンパク質の水溶液に二価の銅イオンを添加するこ
とによって行う方法、該水溶液にＯ−ヨードソ安息香酸
、酸化型グルタチオン、酸化型グルタチオンと還元型グ
ルタチオンの混合物、シスチンまたはシスチンとシスナ
インの混合物などの弱い酸化剤を添加することによって
酸化する方法がある。ｐＨによって、酸化速度を制御す
ることも可能である。

また、酸化時のタンパク質濃度は、低いことが望ましく
、タンパク質の種類によって異なるが通常０．１〜２０
００μｇ／−である。反応時間および反応温度はとくに
限定されないが、好ましくは５分〜１０時間で、凍結し
ない範囲で１０℃以下が望ましい。この酸化反応により
、高頻度で天然型のジスルフィド結合に相当する位置に
ジスルフィド結合を持つタンパク質が形成される。

融合タンパク質が動物細胞によって発現された場合は通
常ジスルフィド結合形成工程を必要としない。

（５）化学的または酵素的切断 融合タンパク質の他の部位を切断せず、意図する部分の
みの切断が望まれることから特異性の高い切断方法が好
ましい。

化学的切断では切断を受けるペプチド結合のＮ末端側の
アミノ酸またはＣ末端側のアミノ酸あるいは両方のアミ
ノ酸に特異的な切断方法が知られている〔日本生化学全
編、続生化学実験講座２、タンパク質の化学　上　東京
化学同人ｐ、２７０　（１９８７）、日本生化学全編、
生化学実験講座１、タンパク質の化学　■東京化学同人
ｐ、２３４　（１９７６）］。化学的切断方法としては
上記記載のいずれの方法も利用できるが、好ましくは臭
化ンアン、２−（２ニトロフエニルスルフエニル）−３
−メチル３ブロモインドール（ＢＮＦＳ−スカトール）
、２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸く〜ＴＣＢ）、
ヒドロキシルアミン、またはギ酸を用いる方法が好まし
い。化学的切断では切断部位以外に切断部位と同じアミ
ノ酸あるいはアミノ酸配列があるとほぼ定量的に切断さ
れるので、同じアミノ酸あるいはアミノ酸配列がある切
断部位の選定は避けねばなるない。

酵素的切断では切断を受けるペプチド結合のＮ末端側の
アミノ酸またはＣ末端側のアミノ酸あるいは両側のアミ
ノ酸１〜４残基に特異的な切断方法が知られている〔日
本生化学全編、続生化学実験講座２、タンパク質の化学
上東京化学同人ｐ、２６０（１９８７）　、日本生化学
全編、生化学実験講座１、タンパク質の化学■　東京化
学同人ρ、２５５（１９７６）　、酵素ハンドブック　
丸尾文治、田宮信雄監修、朝食書店ｐ、　５４４〜５５
０（１９８２）　］。酵酵素的切断法としては、上記記
載のいずれの方法も利用できるが、好ましくは、トリプ
シン、リジルエンドペプチダーセ、ｖ８プロテアーゼ、
カリクレイン、キモトリプシン、血液凝固因子Ｘａまた
はトロンビンを用いる方法が好ましい。ただし化学的切
断とは異なり、同じアミノ酸あるいはアミノ酸配列でも
融合タンパク質の立体構造中の位置によりタンパク質分
解酵素が近づき切断できるかどうかで切断が決定される
。

よって切断部位以外に同じアミノ酸あるいはアミノ酸配
列が存在してもタンパク質分解酵素と融合タンパク質の
比（１：　１０００００〜１：１０）、反応時間（０，
５〜５０時間）と反応温度（１０〜５０℃）を変化させ
ることにより特異的な切断を誘導できる。

（６）Ｋｌに特異的なカラムクロマトグラフィーに１は
リジンに特異性が高く、リジンカラムを用いて精製でき
る。本工程はに１あるいはＫｌと融合するタンパク質（
Ｘ＞からなる融合タンパク質をリジンカラムに吸着させ
、洗浄剤により不純物を除去後、溶出液により該融合タ
ンパク質を溶出させ、該タンパク質を精製するものであ
る。

リジン担体はリジンがアルファーアミノ基を介して担体
と共有結合したもので、イプシロン−アミノ基とアルフ
ァーカルボキシル基は遊離状態で残されているものであ
ればとくに限定されないが、例えばリジンセファロス　
４Ｂ（ファルマシア・ファインケミカル社製）がある。

吸着方法としてはｐＨ３〜１０．好ましくはｐＨ７〜８
の緩衝液で平衡化したりジン担体にｐＨ３〜１０、好ま
しくはｐｉ（７〜８に調製したＫｌあるいはに１と融合
するタンパク質（Ｘ）からなる融合タンパク質をカラム
方式あるいはバッチ方式にて吸着させる方法が用いられ
る。

洗浄方法としてはｐｌ（３〜１０、好ましくはｐＨ７〜
８の緩衝液を用い１次洗浄後、０．０５〜ＩＭ好ましく
は０．５Ｍ　　ＮａＣ１などの塩を含む同緩衝液にて２
次洗浄を行う。

溶出方法としてはリジンまたはリジンアナログ溶液、好
ましくは０．０５〜ＩＭのリジンまたはりシンアナログ
溶液を用いて溶出する。

リジンアナログは溶出効果があればとくに限定されない
が、好ましくは４−了ミノブタノン酸、５−γミノペン
タノン酸、６−アミノヘキサノン酸（イプシロン−アミ
ノカプロン酸）およびトランス−４−（アミノメチル）
シクロヘキサンカルボキシル酸の群から選よれる少なく
とも一つのりシンアナログが用いられる。

使用されたりジン担体は使用後、１．０　ＭＮａＣｌ、
０．２Ｍ　　６−アミノヘキサノン酸（イプシロン−了
ミノカプロン酸）を含む０．０５Ｍ　　燐酸緩衝液（ｐ
）１７．５　’）に置換し、不純物を除去することによ
り繰り返し使用できる。

（７）Ｋｌの固定化方法 に１また；まタンパク質（Ｘ）とに１の融合タンパク質
を固定化する担体と方法はとくに限定されなし）が、市
販の担体を従来公知の方法に従い活性化するか、簡便に
は市販の活性化担体を利用し、所定の使用方法〔冊子ア
フィニティークロマトグラフィー（ファルマシア社発行
）ｐ１５〜２０、など〕に従って固定化する。具体的に
はＣＮＢｒ活性化セファロスを用いる場合、下記の操作
を４℃にて行う。

凍結乾燥された担体を１ｇ当り２００ｄの１ｍＭ塩酸で
膨潤、洗浄し、カップリング緩衝液（００５〜ＩＭのＮ
ａＣβなどの塩を含み、アミノ基を含まないｐＨ７〜９
の緩衝液）に置換後、膨潤担体１−当り５〜１．ｏｍｇ
のに１またはタンパク質（Ｘ）とに１の融合タンパク質
を加え、約２０時間振盪し、カンブリング緩衝液で洗浄
後、１Ｍエタノールアミンなどのアミン基を有する化合
物溶液中でさらに約２０時間振盪し残存する活性化基を
ブロックし、カンプリング緩衝液と０．０５〜ｌ　ＭＮ
ａＣｆなどの塩を含む０．１　Ｍ酢酸緩衝液（ｐｌ＋４
．０　）とて交互に洗浄後、最終的に０．０５％　：’
ｉ　ａ　Ｎ　：１などの静菌剤４含むカップリンク緩衝
液にて保存する。

（８）固定化に１担体を利用したリジンあるいはりシン
アナログをＣ末端に有するペプチドの分別方法 上述のように調製した固定化に１担体をカラムにつめ、
平衡化緩衝液（０，０５〜ＩＭのＮａＣｊ２などの塩を
含むｐＨ３〜１０好ましくよｐＨ７〜８の緩衝液）を用
し）平衡化後、ｐＨ３〜１０好ましくはρ１（７〜８に
ｊｌＷ整したりシンまたはリジンアナログをＣ末端に有
するペブチドと他の物質の混合溶液を負荷し、平衡化緩
衝液で１次洗浄後、００５〜ＩＭ好ましくは０．５Ｍ　
　ＮａＣＲなどの塩を含む平衡化緩衝液で２次洗浄する
と、他の物質は素通り画分に回収される。Ｋ１とリジン
の結合を競合的に阻害するイプシロン−アミノカプロン
酸などの試薬や、塩酸グアニジンやチオシアン酸カリな
どのＫｌとりシンまたはりシンアナｒ］りをＣ末端に有
するペプチドの親和性を弱める試襲を含む平衡化緩衝液
、ｐＨ２〜４の緩衝液などを通塔することによりリジン
またはりシンアナロクをＣ末端にするペプチドは溶出さ
れる。カラムは平衡化緩衝液で再度平衡化することによ
り繰り返し使用できる。

以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが
、これらの実施例は本発胡の範囲を制限するものではな
い。また、実施例中のＰＡＫＩ、ＰＺＫＩおよびＫＩの
同定および定量は次のように行った。

○ＰＡＫＩ、ＰＺＫＩ、Ｋｌの同定：Ｍ元状態でのラウ
リル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）およびそれに続く、クマシーブＩＪ　ＩＪア
ントブルー染色において、各タンパク質の標品と同じ位
置にバンドを示すことをもって同定した。

０ＰＡＫＩ、ＰＺＫｌ、Ｋ１の定量ニアミノ酸分析によ
り定量した各タンパク質の標品と各工程サンプルを還元
状態での５Ｏ５ＰＡＧＥにかけ、ダマシーブリリアン トブルー染色後バンドをデンシトメータで走査し、各標
品のバンドの発色強度とタンパク質量との検量線を作成
し、各工程サンプル中の各タンパク質を定量した。

実施例１ プロティンＡのＢドメインに金属キレート結合部位を導
入した誘導体とＫｌとの融合蛋白質（Ｐ２に１）を発現
するプラスミドｐＰＺＫＴ１の構築：（１）　　プロテ
ィンＡのＢドメインとに１の融合タンパク質を発現する
プラスミドｐＰｒＫＴ１の造に１をコードする遺伝子は
以下に示す１２本の合成りＮ、へを用いて構築した。

４４塩基 上記１２種類の合成りＮＡをアプライド・バイオシステ
ムズ社３８０Ａ、ＤＮＡ合成機を用いて合成し、それぞ
れを別々に５′末端をリン酸化した。リン酸化は合成り
ＮＡ　２０ピコモル（ｐｍｏｌｅｓ）を２０ｕＱの５０
ｍ！、Ｉ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，６）　、
ｌ　Ｏｄ　　ＭｇＣＬ　、５ｍＭ　　ＤＴＴ。

０．１ｍ！、ｌ　　ＥＤＴＡ、０．５ｍ！、Ｉ　　ＡＴ
Ｐを含む溶液（以下、“Ｔ４キナーゼ緩衝液゛′と略記
する）に入れ、５単位のＴ４ポリヌタレオチドキナセ（
宝酒造社製）を加え、３７℃で３０分間反応させること
により行った。

大腸菌トリプトファン（ｔ　ｒ　ｐ）プロモータの制御
でプロティンＡのＢドメインを発現するプラスミドｐＰ
ｒ、へＳｌ［特開昭６３−２１４１９５Ｅ〔斉藤暁子ら
ニブロチイン・エンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ　　
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）　　　２　、　　４　８　１
　−　４　８　７（１９８９）：］のＤＮＡ約２■を１
０　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＩＪ（ＦＩ８７．５）　、７
ｍＭ　　ＭｇＣｊ！２．６ｍｌ１ｌ　　２−メルカプト
エタノールを含む溶液（以下、“ＹＯ緩衝液”と略記す
る）３０μＱに溶かし、１２３′ ４２塩基 単位の制限酵素Ｎ　ａ　ｒ　Ｉ　　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ
ａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加え、３７℃で２時間
消化反応を行った後、１　ｕＱの２ＭＮａＣＡと１０単
位のＮｃｏＩ　（宝酒造社製：以下制限酵素については
特記しない限りすべて宝酒造社製）を加え、さらに３７
℃で２時間消化反応を行った。Ｏ５８％アガロースゲル
を用いてプラスミドＤＮＡ断片を分離した後、３．０　
ＫｂのＤＮＡ断片を旭硝子■が開発したガラスパウダー
を利用するキットＤＮＡ　　ＰＲＥＰによるＤ　Ｎ　Ａ
　ｌ’ｉ＃製法（以下、ガラスパウダー法と略記する）
を用いて精製した。

このようにして得られたｐＰｒＡ５１由来のＤＮＡ断片
０１μｇと５′末端をリン酸化した４種類の合成りＮＡ
　（ａ、ｆ、ｇ、ｆ）各々１ピコモルずつを全量２０ｕ
Ｑの２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ｔｌｃｆ（ｐＨ７，６）　
、１０ｍＭ　　ＭｇＣｊ！２．１０ｍＭ　ＤＴＴおよび
ｌ　ｍＭＡ　Ｔ　Ｐを含む緩衝液（以下、“Ｔ４リガー
セ緩衝液”と略記する）に溶かし、Ｔ４ＤＮＡＩＪガー
セ（宝酒造社製）１００単位を加え、１６℃で１時間結
合反応を行った。

これとは別に、５′末端をリン酸化した８種類の合成り
ＮＡ　（ｂ、　　ｃ、　　ｄ、　　ｅ、　　ｈ、　　ｉ
、　　ｊ。

ｋ）各々２ピコモルずつを全量２０頭のＴ　４　ｔＪガ
ーセ緩衝液に溶かし、６５℃で５分間、５０ｔで５分間
、３７℃で３０分間、２５℃で３０分間、０℃で３０分
間放置した後、２００単位のＴ４ＤＮＡＩＪガーセを加
え、１６℃で１時間結合反応を行った。

これ、：）２つのＤＮＡ結合反応液２０μρずつを混合
し、さらに１００単位のＴ４ＤＮＡ’Ｊガーセを加え、
４℃で１８８時間結反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
ＭＭ２９，１１株１：Ｆ−ｈｓｄＲ−ｈｓｄＬｌ”ｅｎ
ｄｏｌ−ｔｈｉ　ｉ　　〔ＡＴｃｃ３１４４６　、Ｋ、
Ｂａｃｋｍａｎら：　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ、、　ＬＩＳＡ　７３．４１７４（１９７６
）の論文中の大腸菌２９４株と同一菌株である。〕を形
質転換し、アンピシリン（以下、Ａｐと略記する）耐性
株を得た。この形質転換株からプラスミドＤＮＡを単離
し、制限酵素消化による構造解析およびＭ１３デイデオ
キシ・シーフェンス法による塩基配列決定を行ったとこ
ろ、目的の構造を有することを確認した。このプラスミ
ドをｐＰｒＫＴｌと称する。ρＰｒにＴ１の造成工程お
よびｐＰｒＫＴｌのに１部分の塩基配列をそれぞれ第１
図と第２図に示す。

プラスミドｐＰｒＫＴ１を含む大腸菌菌株はＥｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　　ＥＰ　ｒＫＴ　ｌ　　（Ｆ
ＥＲＭＢＰ−２６７３）としてブダペスト条約の条件で
、１９８９年１２月５日付で工業技術院微生物工業技術
研究所（微工研〉に寄託しである。

（２）　　プロティンＡのＢドメインに金属キレート結
合部位を導入した誘導体を発現するプラスミドｐＰｒ、
へＺｌの造成： ｐＰｒＡｓｌプラスミドＤＮＡ約２■を全量３０μＱの
Ｙ−０緩１１液に溶かし、２単位の制限酵素Ｘｍｎ１（
Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加え
、３７℃で１時間消化反応を行った。１，５μＱの２Ｍ
　　ＮａＣｊ？と１０単位のＰｓｔｌを加え、さらに３
７℃で１時間消化反応を行った。この反応により、ＤＮ
ＡはＰｓｔＩで完全に、Ｘｍｎ１で部分的に消化された
。６５℃で１０分間の熱処理後アガロースゲル電気泳動
に供し、ガラスパウダー法を用いて約１．　Ｉ　５　Ｋ
ｂのＤＮＡ断片を精製した。

方、プロティンへ〇Ｂドメインをコードする遺伝子を有
するプラスミドｐＰｒＡＩ　　Ｃ特開昭６３−２１４１
９５３　１斉藤暁子ら、プロティン・エンジニアリング
（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ＞２、４８
１−４８７＜１９８９）二のＤＮＡ約２μｇをＩＯｍ！
、ｌ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｆｆｌ　（ｐＨ７，５）　
、１００ｍＭＮａＣＲ，７ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．６ｍＭ
　　２−メルカプトエタノールを含む溶液（以下、“Ｙ
−１００緩衝液°°と略称する）３０μｇに溶かし、Ｉ
Ｏ単位のＰｓｔＴと０．５単位のＢｇＲ］Ｉを加え、３
７℃で２時間消化反応を行った。この反応により、ＤＮ
ＡハＰ　ｓ　ｔ　Ｔ　テ完全ニ、Ｂｇｌ、Ｕ”’ＱＢ分
的に消化された。６５℃、１０分間の熱処理後、アガロ
ースゲル電気泳動に供し、ガラスパウダ法を用いて、約
１．８５　ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。

これらとは別に、下記に示す２種の合成りＮＡ（１０塩
基と１４塩基）をアプライド・パイオンステムズ社３８
０Ａ、ＤＮＡ合成機を用いて合成した。

５’−ＣＡＴＴＴ［ＡＣＧＡ　−３’　　　　＜　１０
塩基）３’−ＧＴＡＡＡＧＴＧ［：ＴＣＴ、届−５′　
（１４塩基）これらの合成りＮＡを２０ピコモルずつ別
々こ、上で述べた方法に従い、合成りＮＡの５′末端の
リン酸化を行った。

このようにして（尋られたｐＰｒＡ５１由来の約１．１
５　ＫｂのＤＮＡ断片（約０．０５　ｇｇ）　、ｐＰｒ
Ａ１山来の約１．８５　ＫｂのＤＮＡ断片（約０．０５
μｇ）および５′リン酸化された２種の合成りＮＡ　（
１ピコモルずつ）を全＠２ＤｔｉρのＴｌ１１，１ガー
セ媛衝液に忍かし、３００単位のＴ４ＤＮＡＩＪがセを
加え、４℃で１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
〜ｒＭ２９４株を形質転接し、Δｐ耐性株を得た。この
形質転換株からプラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素消
化による構造解析およびＭ１３デイデオキシ・シーフェ
ンス法による塩基配列決定を行ったところ、目的の構造
を有することを確認した。このプラスミドをｐＰｒＡＺ
ｌと称する。（第３図参照）。

（３）プロティンＡのＢドメイン誘導体とＫｌの融合タ
ンパク質（ＰＺＫＩ）を発現するプラスミドｐＰＺＫＴ
ｌの造成・ 実施例１で得られたｐＰｒＫＴ１プラスミドＤＮＡ約２
μｇを１０ｍ！、ｌ　　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣＲ（ｐ
Ｈ７，５）　、５０ｍＭ　　ＮａＣｊｉ、７ｍＭ　　Ｍ
ｇＣｊ！ｚ、６ｍＭ２−メルカプトエタノール（以下、
”Ｙ−５０緩衝液”と略記する）３０μＱに溶かし、１
０単位のＥｃｏＲｒと１０単位のＡｖａＩを加え、３７
ｔで２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱処
理を行い、アガロースゲル電気泳動に供した後、ガラス
パウダー法を用いて、約２．５ＫｂのＥｃ　ｏＲＴ−Ａ
ｖ　ａ　Ｉ断片と約０、３　ＫｂのＡｖａＩ−Ａｖａｌ
断片を精製した。

一方、上で得られたｐＰｒＡＺ１プラスミドＤＮＡ約２
ｕｇを３０ｕＱのＹ−５０緩衝液に溶がし、ＩＯｉ位の
ＥｃｏＲＩと１０単位の、Ａ　ｖａ　１を加え、３７℃
で２時間消化反応を行ったｃ６５℃、１０分間の熱処理
を行い、アガロースゲル電気泳動に供した後、ガラスパ
ウダー法を用いて約０．５　ＫｂのＤＮＡ断片を精製し
た。

このようにして得られたｐＰｒＫＴ１由来の約２．５　
ＫｂノＤ　Ｎ　、Ａ、Ｗｔ片（約０．　Ｌ　μｇ）　ト
約０．３　ＫｂのＤＮＡ断片（約０．０２ｇｇ）とｐ　
Ｐ　ｒ　Ａ２１由来の約０．５ＫｂのＤＮＡ断片（約０
．０３μｇ）とを全量２０μＱのＴ４１Ｊガーセ緩衝液
に溶がし、１００単位の７４　Ｄ　Ｎ　、ヘリガーセを
加え、４℃で１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
Ｃ’６００３Ｆ８株丁カメロン（Ｃａｍｅｒｏｎ）プロ
ンーテ゛インク・オフ゛・す・ナンヨナル・了カテ゛ミ
イ・オフ゛・サイエンス（Ｐｒｏｃ　　＼ａｔ＾ｃａｄ
、　Ｓｃ＋、、ＩＪｓＡ　　７２．３４１６＜１９７５
）：を形質転換し、Ａｐ耐性株（ＥＰＺＫＴ１４ｔ：Ｉ
を得た。二の形質転換株からプラスミドＤＮＡを単離し
、制限酵素消化による構ゐ解析を行ったところ、目的の
構造を有することを確認した。このプラスミドをｐＰＺ
ＫＴｌと称する（第４図参照）。

プラスミドｐＰＺＫＴ１を含む大腸菌菌株はＥｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　　ＥＰＺＫＴＩ　　（ＦＥＲＭ
ＢＰ−２６７２）としてブダペスト条約の条件で１９８
９年１２月５日付で微工研に寄託しである。

実施例２ プロティンＡのＢドメイン誘導体とに１の融合タンパク
質（ＰＺＫＩ）の太陽閑による生産実施例１で得ろれた
ＰＺＫ１発現プラスミドｐＰＺＫＴｌを持つ大腸菌ＥＰ
ＺＫＴＩ株を１０証のＬＧ培地〔ハタトドリプトン１０
ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｎ　５ｇ、クルコース１ｇ
を水１１ｊこ３客かし、ＮａＯＨにてｐＨを７０とする
。二で３７℃、１８時間培養し、この培養液２．５証を
２５μｇ／ｄのトリプトファンと５０μｇ／ｍｌのアン
ビンリンを含むＭＣＧ培地’−Ｍ　ａ　２　ＨＰ　（１
４０．６％、Ｋ８２Ｐ０．０．３％、ＮａＣｆ　　Ｏ，
５％、カサミノ酸０．５％、Ｍｇ　Ｓ　０，１　ｍＡＩ
、ビタミンＢｔ４μｇ／証、ｐ）１７．２１４００ｍに
接種し、３［）ｔで４〜８時間培養後、トリプトファン
の誘導物質である３β〜インドールアクリル酸（３β−
１ｎｄｏｌｅａｃｒｙｌ　１ｃａｃｉｄ以下ＩＡ、Ａと
略す）をＩＯμｇ／ｍｅ加え、さらに２〜１２時間培養
を続け、プロティンＡのＢドメイン誘導体とに１の融合
タンパク質ＰＺＫ　１を生産させた。

なお、ＰＺＫ　ｔの生産量は約２ｍｇ／ｍであった。

実施例３゜ プロティンＡのＢドメインとに１の融合タンバタ質（Ｐ
ＡＫＩ）の大腸菌による生産：実施例１で得られたＰＡ
Ｋ　１発現プラスミドｐＰｒＫＴ１を持つ大腸［ｍＥＰ
ＲＫＴｌを１０ｄのＬＧ培地で３７℃、１８時間培養し
た。この培養液２．５　ｍｅを２５μｇ／ｍｌのトリプ
トファンと５０μｇ／ｄのアンピシリンを含むＭＣＧ培
地４００Ｈに接種し、３０℃で４〜８時間培養後、ｒＡ
Ａを１０μｇ／ｄ加え、さらに２〜１２時間培養を続け
、プロティンＡのＢドメインとに１の融合タンパク質（
ＰＡＫｌ）を生産させた。なお、ＰＡＫＩの生産量は約
２　ｍｇ　／　ｍｌ、であった。

実施例４゜ 大腸菌によって産生されたプロティンＡのＢドメイン誘
導体とに１の融合タンパク質（ＰＺＫＩ）粗精製画分の
調製 実施例２によって得られた培養液を８、Ｑ　００　ｒｐ
ｍ、４０分間遠心して集菌し、３０ｍＩＪＮａＣ１！、
３０１ｒｌＩ、ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ緩衝液（ｐ）１７
．５　）で洗浄する。得られた洗浄菌体２．４ｇ（湿重
量）を上記緩衝液２Ｇ−に懸濁し、４■のりゾチーム、
０．２５ＭＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢酸）をＯ，
１ｍｌ’加えて２時間４℃に放置した後、４℃で水冷下
超音波破砕Ｃブランソン・ソニック・パワー・カンパニ
ー（ＢＲＡ）ｌｓ［］ＮＳ［ｌ’ｌ［：　Ｐ（］讐■（
：［］ＭＰ八ＮＹへ社製ソニフィアー・セル・デイスラ
ブター（ＳＯＮＩＦＩＥＲＣＥＬＬＤ［５ＩｌｆｌＰＴ
ＯＲ）　２００、出力レベル２．１０秒間５回〕処理し
た。発現されたＰＺＫＩは太陽菌内に顆粒を形成せず可
溶性画分に産生された。菌体破砕液を１８．０００ｒρ
ｍ、２０分間遠心して上清を得、上清に４０％飽和濃度
となるように硫酸アンモニウムを添加し、４℃にて１６
時間放置後、１８．０００ｒｐｍ。

２０分間遠心し、沈澱画分をＩＭＮａＣＩを含む２０ｍ
！、！　　燐酸緩衝液（ｐＨ７，４＞　　２０ｍ１．に
溶解してプロティンＡのＢドメイン誘導体とに１の融合
タンパク質（ＰＺＫＩ）粗精製画分とした。工程収率は
９３％であった。

実施例５ 亜鉛キレートカラムを用し）た、プロティン７へのＢド
メイン誘導体とに１の融合タンパク質（Ｐ２Ｋｌ）の粗
精製画分からの＠製： 実施例４によって得られたＰＺＫＩ粗精製画分を、ＩＭ
ＮａＣｌを含む２０ｍ！、１　　燐酸緩衝液（ｐＨ７，
４）で平衡化された亜鉛キレ−トコキレ−ティングセフ
了ロース６Ｂ（ファルマシア・ファインケミカル社製）
：カラム（１，５ｘ　５．７　ｃｍ）に５ｍ１．７時の
流速で通塔した。次゛、１で上記緩衝液３０ｍ１を用い
５顎／時の流速で洗浄後、ＩＭＮａＣｌを含む５０ｍ！
、！　　酢酸緩Ｉｊｒ液（ｐＨ４，０）　　３０ｍｆを
用′、）５ｍｌ／時の流速で溶出し、溶出液を５ｍｌず
つ分画した。溶出第２．３画分１こＰＺＫＩは回収され
、工程収率は６２％であった。

実施例６ プロテインＡのＢドメイン誘導体とに１の融合タンパク
質（ＰＺＫＩ）の酸化： 実施例５によって得られたＰＺＫＩ亜鉛キレート溶出液
１０ｍ１？に５０ｍ！Ｊ燐酸緩衝液１０ｍｆを添加し、
さらにＩＮ　　ＮａＯＨを滴下し、ｐＨを８０に調整し
た。次いで還元型グルタチオン、酸化型グルタチオンを
最終濃度がそれぞれ０．１　ｍ！、ｌ、　０．２　ｍＭ
となるように添加後、４℃にて２０時間放置しジスルフ
ィド結合を形成した。

実施例７ リジンカラムを用いた、プロティンＡのＢドメイン誘導
体と天然型の立体構過を有するに１の融合タンパク質（
ＰＺＫＩ）のＭ製・ 実施例６によって得られた酸化後のＰＺＫ　１、容液を
１．ＭＨＣ＋を用いｐＨを７．５に調整し、５０ｍ）、
１　　燐酸緩衝液（ｐＨ７，５＞で平衡化されたリジン
セファロース４Ｂ（ファルマシア・ファインケミカル社
製）カラム（１，５ｘ５．７ｃｍ）に５−７時の流速で
通塔した。次５）で上記緩衝液３０ｍ１と０．５Ｍ　　
ＮａＣｌを含む上記緩衝液３０ｄとを用い５ｍｌ／時の
流速で洗浄後、０．２Ｍ　イプシロン−アミノカプロン
酸溶液３Ｍを用ｕ）５　ｄ／時の流速で溶出し、溶出液
を５−ずつ分画した。溶出第２．３画分ｊこＰＺＫ　１
は回収され、工程収率は５６％であった。

実施例８．ＰＺＫｌのトリプシン切断 実施例７で得らた溶出画分に等１云の１００ｍシ１１’
ｒｉｓ−ＨＣｊ２緩衝液（ｐｔ１８．０　＞を添加し、
さらに基質、酵素比１００：１となるようにトリフシン
を添加後、３７℃、１６時間保温し、反応後燐酸を添加
しｐＨ３とした。反応物を逆相１（Ｐ　Ｌ　Ｃにより分
析した店ころ、反応終了後にはプロティン１へのＢドメ
イン誘導体とに１各々のピークのみが得られたことから
、ＰＺＫＩが完全に切断され、副生物もなく、はぼ定量
的に切断反応が進行したことが解った。

実施例９　天然型の立体構造を有するに１の精製：実施
例８で得られた反応溶液を５０ｍＭ　　燐酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，５）で平衡化された脱塩用カラムＰＤ１０　（フ
ァルマシア・ファインケミカル社製）を用いて脱塩後、
実施例６と同様の操作によりに１を溶出第２．３画分に
精製した。実施例４〜９の精製収率を第１表に示す。

第１表　ＰＺＫＩからのに１の精製 （ｉｆ”）　　　　　　（ｍｇ／ｍ）　　　　（ｍｇ）
　　　　　（％）培養液　　　１６．４　　　　０．８
１　　　１３．３　　１００硫安沈澱　　２０　　　　
　０．６２　　　１２．４　　　９３亜鉛キレート　　
　　１　０　　　　　　　　　　０．　７　７　　　　
　　　　７．　７　　　　　　　５　８酸化　　　　２
０．５　　　　０．３８　　　　７．７　　　５８リシ
ン　　　１０　　　　　０．４３　　　　４．３　　　
３２トリプシン　消化　　１２　　　　　　　　　　０
．３ＩＩ４．１　　　　　　　３１リジン　　　１０　
　　　　０．４０　　　　４．０　　　３０＊トリプシ
ン消化より前の工程ではＰＺＫＩ中のに１邪分の質量と
して算出。

実施例ＩＯ 大腸菌によって産生されたプロティンへのＢドメインと
に１の融合タンパク質（ＰＡＫＩ）を用いたプロティン
ＡのＢドメインの製造方法：実施例３によって得られた
培養液から実施例４の方法にしたがってプロティンＡの
ＢドメインとＫｌの融合タンパク質（ＰＡＫＩ）の粗精
製画分を調製し、４℃にて４日間放置しジスルフィド結
合を形成後、１Ｍ　水酸化す）　ＩＪウムを用いｐＨ７
６：こ調整し、Ｄ　ＯｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｊ！
緩衝液（ｐ　Ｈ７，６）で平衡化された免疫グロブリン
Ｇセファロース６フアースト・フロー（ファルマシア・
ファインケミカル社製）カラム（１，５Ｘ　５．７　ｃ
ｍ）に１０証／時の流速で通塔した。次いで上記緩衝液
３０証と５ｍＭ　　酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５，
０＞２０祿とを用；１２０ｄ／時の流速で洗浄後、０．
５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ３，４）　　３０ｍ
を用い１０ｍ／時の流速で溶出し、溶出液を５証ずつ分
画した。、溶出第２．３国分にＰＡＫ　Ｉは回収され、
工（Ｖ収率は８５％であった。さらに実施例８の方法に
したがってプロティンＡのＢドメインとＫｌとに切断後
、実施例７と同様の操作により精製した。ＰＡＫＩから
のＫｌの精製収率を第２表に示す。

第２表　ＰＡＫＩからのＫｌの精製 培養液　　　１６．４　　　　０．９０　　　１４．８
硫安沈殿　　２０　　　　　０．６９　　　１３．８免
疫グロブリ″７　　　１０　　　　　　　　　　　Ｌ、
１７　　　　　　　１１．７酸化　　　　２０．５　　
　　０．５７　　　１１．７トリブシン　消化　　　１
　２　　　　　　　　　　　０．　４　６　　　　　　
　　　５．　５リジン　　　１０　　　　　０．５２　
　　　５．２＊トリプシン消化より前の工程ではＰＺＫ
　ｌ中のに１部分の質量として算出。

実施例１１．に１の固定化 ＣＮＢｒ活性化セファロースを用い、下記の操作を４℃
にて行った。凍結乾燥された担体０．２　ｇを４０ｄの
１ｍＭ塩酸でガラスフィルター上で膨潤、洗浄し、カッ
プリング緩衝液（０，５Ｍの食塩を含む、０，１Ｍ炭酸
水素ナトリウム緩衝液ｐＨ８，５）　１．４−に置換後
、実施例９で得られたに１を４ｍｇ加え、１６時間振盪
した。カップリング緩衝液で洗浄後、１Ｍエタノールア
ミン１．４ｍｌ中でさらに１６時間振盪し残存する活性
化基をブロックした。カンプリング緩衝液と０．５Ｍの
食塩を含む０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４，０とで交互に数
回洗浄後、最終的に００５％ＮａＮ３の静菌剤を含むカ
ップリング緩衝液にて保存した。

実施例１２゜ 固定化Ｋｌカラムを用いたペプチドの分離：実施例１）
で得られた固定化Ｋｌ担体をカラム（０，７５Ｘ　Ｌ、
　６ｃｍ）につ杓、平衡化緩衝液［５０ｍＭ燐酸緩衝液
（ｐＨ７，５）　］を用い平衡化（０，７ｍ１．／時）
Ｌ　ロイシン−エンケファリン（ＹＧＧＦＬ、シグマ社
製）とロイシン−エンケファリン−リジン（ＹＧＧＦＬ
Ｋ、シグマ社製）各０．０５　ｍｇを０５−の平衡化緩
衝液に溶解した混合溶液を負荷（０，５ｄ／時）した。

平衡化緩衝液５祿で１次洗浄（１ｍｆ／時）すると、ロ
インンーエンケファリンは素通り画分に回収された。０
．５Ｍ食塩を含む平衡化緩衝液５−で２次洗浄後（１ｍ
ｌＺ時）、５Ｍ塩酸グアニジンを含む平衡化緩衝液１０
−を通塔することによりロイシン−エンケファリン−リ
ジンが溶出（０，５ｄ／時）された。素通り画分、溶出
画分に回収されたペプチドは逆相ＨＰＬＣ［ＴＳＫ−Ｏ
ＤＳ　　１２０Ｔ　（東ソー社製）〕により同定された
。

発明の効果 本発明によりプラスミノーゲンのクリングル１（Ｋｌ）
とタンパク質との融合タンパク質を介してに１とタンパ
ク質とを容易に回収する方法が提供される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プロテインＡのＢドメインとに１との融合タ
ンパク質を発現するプラスミドｐＰｒＫＴｌの造成工程
を示す。 第２図は、プラスミドｐＰｒＫＴ１のＫｌｉ分の塩基配
列およびそれに相当するアミノ酸配列を示す。 第３図は、プラスミドｐＰ　ｒＡＺ　１の造成工程を示
す。 第４図は、プラスミドｐＰｒＺＫＴ１の造成工程を示す
。

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）プラスミノーゲンのクリングル１（以下Ｋ１と略
   称する）とタンパク質とが、必要に応じて酵素的または
   化学的に切断可能なアミノ酸またはペプチドを介して結
   合されてなる融合タンパク質を酵素的または化学的に処
   理して、Ｋ１と該タンパク質に分離し、Ｋ１と該タンパ
   ク質を採取することからなるＫ１および／またはタンパ
   ク質の製造法。
2. （２）Ｋ１が下記アミノ酸配列を有するものである請求
   項１記載の製造法。 【遺伝子配列があります】 （但しアミノ酸表示は下記に示す１文字 表示である。Ａ：アラニン、Ｃ：システイン、Ｄ：アス
   パラギン酸、Ｅ：グルタミン酸、Ｆ：フェニルアラニン
   、Ｇ：グリシン、Ｈ：ヒスチジン、Ｉ：イソロイシン、
   Ｋ：リジン、Ｌ：ロイシン、Ｍ：メチオニン、Ｎ：アス
   パラギン、Ｐ：プロリン、Ｑ：グルタミン、Ｒ：アルギ
   ニン、Ｓ：セリン、Ｔ：トレオニン、Ｗ：トリプトファ
   ン、Ｙ：チロシン）
3. （３）タンパク質がスタフィロコッカス・アウレウス（
   Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）の生産す
   るプロテインＡである請求項１記載の製造法。
4. （４）タンパク質が下記の配列を有するプロテインＡの
   Ｂドメインである請求項３記載の製造法。 【遺伝子配列があります】（但し、 アミノ酸表示法は第２項と同じ）
5. （５）酵素的または化学的に切断可能なアミノ酸がＲ／
   、Ｋ／、Ｅ／、Ｄ／、Ｗ／、Ｙ／、Ｆ／、Ｍ／、／Ｃ（
   但し、／は切断位置を示し、アミノ酸表示法は第２項と
   同じ）から選ばれるものである請求項１記載の製造法。
6. （６）酵素的または化学的に切断可能なペプチドがＮ／
   Ｇ、Ｄ／Ｐ、ＡＰＲ／、ＦＲ／、ＩＥＧＲ／、ＶＰＲ／
   （但し、／は切断位置を示し、アミノ酸表示法はＶがバ
   リンであり、他は第２項と同じ）から選ばれるものであ
   る請求項１記載の製造法。
7. （７）タンパク質がアミノ酸置換により金属キレート結
   合部位を導入したものである請求項１記載の製造法。
8. （８）アミノ酸置換がヒスチジン以外のアミノ酸をヒス
   チジンに置換したものである請求項７記載の製造法。
9. （９）融合タンパク質が、該融合タンパク質をコードす
   るＤＮＡを含む組換えプラスミドを担持する宿主細胞を
   培地に培養し、培養物中に該融合タンパク質を生成蓄積
   させ、該培養物から採取することによって得られたもの
   である請求項１記載の製造法。
10. （１０）組換えプラスミドがｐＰｒＫＴ１と称し、その
    制限酵素地図が第１図に示されるものである請求項９記
    載の製造法。
11. （１１）プラスミドｐＰＺＫＴ１と称し、その制限酵素
    地図が第４図に示されるものである請求項９記載の製造
    法。
12. （１２）宿主細胞が、微生物または動物細胞である請求
    項９記載の製造法。
13. （１３）Ｋ１とタンパク質を採取するに際し、リジン結
    合能を利用するアフィニティークロマトグラフィを用い
    る請求項１記載の製造法。
14. （１４）リジンまたはリジンアナログをＣ末端に有する
    ペプチドとＫ１の固定化物とを接触させ、該タンパク質
    をＫ１に吸着させ、さらに溶出剤により該タンパク質を
    溶離させ、採取することによるリジンまたはリジンアナ
    ログをＣ末端に有するペプチドの回収方法。