JPH0244510B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、土壌から分離された細菌、アクロモ
バクターリテイカス（achromobacter lyticus）
によつて産生され、リジル結合に特異性を有する
新規なアルカリプロテアーゼに関するものであ
る。本細菌は溶菌酵素およびアルカリプロテアー
ゼを産生し、溶菌酵素については特公昭46−
42953に記載があり、又アルカリプロテアーゼは、
本発明者らにより発見され、アグリカルチユラ
ル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー42巻
1442頁（1978年）において、アクロモバクター・
プロテアーゼと命名されている。 本発明者らは、更にアクロモバクター・リテイ
カスの産生する酵素系、特にプロテアーゼ系につ
いて詳細に研究の結果、PH3.5〜10のアンフオラ
イト（LKB社商品名）による等電点焦点電気泳
動の分画により、プロテアーゼと明らかに異な
るプロテアーゼが存在することを見出した。更に
この区分から新規なプロテアーゼを単離すること
に成功しプロテアーゼａと命名した（以下、本
発明の新規なアルカリプロテアーゼをプロテアー
ゼIaと称する。） 本発明者らは本酵素の取得法、および諸性質な
らびに利用法について研究を重ね本発明を完成す
るに至つた。 即ち、本発明は、下記の特性を有するプロテア
ーゼ、 (i) 分子量：30000（Sephadex Ｇ−75によるゲル
過法）、 (ii) 等電点：5.3、 (iii) PH作用性：エステラーゼ活性はPH8.5に、ま
たアミダーゼ活性はPH9.0にそれぞれ作用至適
PHを有する、 (iv) 基質作用性：Ｌ−リジンのカルボキシル基に
おけるエステル結合およびアミド結合を選択特
異的に水解する、 (v) 阻害剤：ジイソプロピルフオスフオフロリ
ド、トシル−Ｌ−リジンクロロメチルケトン及
びフエニルメチルスルホニルフロリドにより阻
害を受ける、好ましくはアクロモバクター属に
より産生されるプロテアーゼ、である。 以下に本発明の内容について詳細に述べる。 本酵素の生産性が高いアクロモバクター・リテ
イカスM497−１は財団法人発酵研究所、アメリ
カン タイプ カルチヤーコレクシヨンならびに
工業技術院微生物工業技術研究所にそれぞれ
IFO12725、ATCC21456、微工研寄託受理番号
4420の番号で寄託されている。本酵素の生産は、
アクロモバクター属に属する新プロテアーゼの生
産菌を培地に培養することにより行なわれる。培
地としては固体でも液体でもよく、培養は静置で
もよいが、通常は液体培地を用い、振盪培養また
は通気撹拌培養など、好気的条件下に行なうのが
より有利である。培地組成としては、本菌の生育
およびプロテアーゼIaの生産を促すものであれば
どのようなものを加えてもよい。すなわち炭素源
としてはたとえばグルエース、サツカロース、デ
キストリンなどの糖類、窒素源としてはペプト
ン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、大豆粉、
カゼイン、カザミノ酸、アミノ酸類、アンモニウ
ム塩などの有機または無機窒素含有化合物が用い
られる。無機塩としてはナトリウム、カリウム、
カルシウム、マグネシウムなどの金属を、リン酸
塩、硫酸塩、炭酸塩、塩化物などの形で加えても
よい。場合によつては、菌の生育およびプロテア
ーゼIaの生産を促進する目的で、ビタミン類、核
酸およびそれらの関連化合物などを添加してもよ
い。 培地の液性、培養温度、通気量、培養時間など
の培養条件は、使用する菌株、培地組成などによ
つて一定しないが、要は目的とするプロテアーゼ
Iaの蓄積量が最大となるように適宜選択調節され
る。多くの場合、培地の液性は中性付近、培養温
度は20〜35℃、好ましくは25〜30℃通気量は培地
１当り毎分約0.5〜1.5、培養時間はおよそ１
〜２日間の条件が選ばれる。 このようにして、プロテアーゼIaの生産菌が培
養され、その培養液中にプロテアーゼIaが分泌蓄
積される。 本酵素の取得には、公知の分離精製手段を適宜
に利用し、任意純度の標品に導きうる。即ち遠心
分離又は過などの方法によつて菌体を除去した
上清液や液に硫酸アンモニウムのような塩を加
えて塩析したり、あるいはアルコール類、アセト
ンのような親水性有機溶剤を添加して、目的物を
分画沈澱させることが出来る。更に、例えば、ア
ルミナ、ベントナイト、リン酸カルシウムゲル、
活性炭などによる吸着および脱着、各種のイオン
交換体を用いるクロマトグラフ法、セフアデツク
ス、バイオゲル等を用いる分子節法などを単独ま
たは適宜に組み合わせて行なうことにより精製度
を高めることが出来る。この他、等電点沈澱法、
透析法、電気泳動法、重金属イオンによる沈澱法
なども場合に応じて用いらる。このようにして、
任意の純度のプロテアーゼIaを分離することが出
来る。本酵素の取得法については、後記実施例を
もつて更に具体的に説明する。なおアミダーゼ活
性およびエステラーゼ活性の力価は次のような方
法で単位が定められる。 アミダーゼ活性の測定法および単位 0.2M2−アミノ−２−メチル−１，３−プロパ
ンジオール緩衝液（PH9.5）1.3mlに、2.5ｍＭベン
ゾイル−DL−リジン−ｐ−ニトロアニリド（以
下Bz−1ys−ｐ−NAと略称する。）水溶液0.15ml
を加え、30℃にて予備加温後、酵素液0.05mlを添
加し正確に25分間反応させた。反応後45％（Ｖ／
Ｖ）酢酸水溶液0.5mlを加えて反応を停止させ、
次いでその反応液を405nｍにて比色測定し、そ
の吸光度を求める。酵素単位としては、30℃にお
いて１分間当り1μmoleのｐニトロアニリンを生
成する酵素量を１単位（1u）とする。酵素力価
の算出方法は、次式に従つた。 活性（ｕ／ml）＝△OD／min×１／9.62×2.0／0.05 ×希釈倍率 エステラーゼ活性の測定法および単位 １ｍＭトシル−Ｌ−リシンメチルエステル
（TLMEと略称する。）含有40ｍＭトリス−塩酸
緩衝液（PH8.0）3.mlを30℃にて予備加温後、酵
素溶液0.2mlを加え、30℃における47nｍの吸光度
変化（△〇Ｄ）を測定する。PH8.0、30℃におい
て１分間当り1μmoleのTLMEを加水分解する酵
素量を１単位とする。酵素力価の算出方法は、次
式に従つた。 活性（ｕ／ml）＝△〇Ｄ／mix×１／0.96×3.2／0.2 ×希釈倍率 次に本発明のプロテアーゼIaの酵素化学的特性
について述べる。 (i) 分子量：30000（Sephadex Ｇ−75によるゲル
過法）。 (ii) 等電点（アンフオライン等電分画法によ
る）：PH5.3。 (iii) PH作用性：Bz−Lys−ｐ−NAに対するアミ
ダーゼ活性はPH9.0に（第１図参照。）、TLME
に対するエステラーゼ活性はPH8.5に（第２図
参照。）、それぞれ作用至適PHを有する。 (iv) PH安定性：第３図に示すように、低温におい
てはPH5.0〜11.0の広いPH範囲で安定である
（４℃、20時間処理。）。 (v) 温度安定性：PH9.0で、15分間加温では、40
℃まで安定である（第４図参照。）。 (vi) 基本作用性：Bz−Lys−ｐ−NA、Ｎ−ベン
ゾイル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド
（以下Bz−Arg−ｐ−NAと略称する。）、Ｌ−
リジン−ｐ−ニトロアニリド（以下、Lys−ｐ
−NAと略称する。）及びＬ−アルギニン−ｐ
−ニトロアニリド（以下、Arg−ｐ−NAと略
称する。）に対するアミダーゼ作用並びに
TLME、Ｎ−トシル−Ｌ−アルギニンメチル
エステル（以下、TAMEと略称する。）に対す
るエステラーゼ作用をPH８〜9.5、30℃で測定
して各基質に対する酵素のミカエリ定数（Km）
と分子活性（Kcat）とを求め、表−１に示す
結果を得た。この表−１から明らかなように、
本酵素はきわめて高い基質特異性を有し、Ｌ−
リジン又はＬ−アルギニンのカルボキシル基に
おけるアミド結合は、リジンに対しては作用す
るが、アルギニンは水解しなかつた。リジン又
はアルギニンのカルボキシル基におけるエステ
ル結合を水解するが、その作用はリジンに対し
て強く働くが、一方アルギニンに対しては極め
てわずかしか作用しなかつた。

【表】 (vi) 阻害剤及び各種金属塩の影響 Bz−Lys−ｐ−NAに対するアミダー活性に
及ぼす各種阻害剤の影響を表−２に示した。又
各種金属イオンが、Bz−Lys−ｐ−NAに対す
るアミダーゼ活性に及ぼす影響を表−３に示し
た。

【表】 表−２に示されるように、本酵素はジイソプロ
ピルフオスフオロライド、フツ化フエニルメチル
スルホニル及びトシル−Ｌ−リジンクロロメチル
ケトンによつて阻害を受ける一種のセリンプロテ
アーゼである。

【表】 表−３から明らかなように、本酵素は亜鉛イオ
ンにより阻害される。 前述のように、本酵素はＬ−リジンのカルボキ
シル基におけるアミド結合およびエステル結合を
特異的に水解する性質を有する為、食品化学、医
薬品、臨床化学及び生化学などの分野への応用が
期待され、利用することができる。 本酵素の使用に当つては本酵素モノマーの溶液
をそのまゝ使用しても良く、又、グルタルアルデ
ヒド、ジイソシアナート等の架橋剤により本酵素
を架橋し、水溶性又は水不溶性プロテアーゼIaポ
リマーとしても良く、あるいは水不溶性の担体
へ、共有結合させたり、又はイオン結合させた
り、又は包括させて水に不溶性な状態となし固定
化酵素として、それぞれの用途や目的にかなつた
型態で、適宜、便利に使用出来ることはいうまで
もない。本発明により得られた新規酵素は、リシ
ンのカルボキシ基側のペプチド結合のみ特異的に
作用し、これを加水分解するという特徴ある基質
異性を有しているため具体的にはアミノ酸配列順
序決定の際のペプチドあるいはプロテインの酵素
分解、並びにリシルペプチドの分解および合成の
目的に利用出来る。 具体的な本酵素の利用例としてブタインスリン
からヒトインスリンを合成する例が挙げられる。
即ち、ブタインスリンとヒトインスリンの違いは
30位のアミノ酸が前者においてアラニン、後者に
おいてスレオニンであることで、その他のアミノ
酸配列は全く共通であり、しかも30位に隣接する
29位のアミノ酸はリジンである。このことから本
酵素とブタインスリンをPH８〜９でインキユベー
トし、リジル結合を切断して、30位アラニンを除
去したデイアラニンインスリン（DAI）を作製
し、更にDAIをスレオニン又はスレオニン誘導体
（例えばスレオニンブトキサイド）を本酵素によ
り縮合してインスリン誘導体へ導く、この様にし
て得たインスリン誘導体の場合は常法により修飾
基を除去して最終的にヒトインスリンとすること
が可能である。 以下に参考例と実施例を挙げて更に詳細な説明
するが、これらの参考例及び実施例は本発明を何
ら限定するものではない。 参考例 ペプトン１％、ミルクカゼイン0.5％、サツカ
ロース1.0％、K₂HPO₄0.01％、MgSO₄・
7H₂O0.01％を含む液体培地（PH7.2）を、500ml
容坂口フラスコに100mlずつ分注、減菌したち、
アクロモバクター・リテイクスM497−１を接種
し、28℃で24時間培養して種培養液を調製した。
この種培養液1.5を同じ培地組成30を仕込ん
だ発酵タンクに移植し、28℃で毎分15の空気を
送りながら通気撹拌培養を４日間行なつた。得ら
れた培養液30を約15℃まで冷却後、遠心分離機
を用いて除菌し、上清液約26を得た。この上清
液に、４％ベンザルコニウムクロライド溶液260
mlをゆるく撹拌しながら、徐々に適下し、４℃に
１時間放置後、生じた沈澱を遠心分離機を用いて
除き、約25.5の上清液を得た。こゝに得られた
上清液（４℃）に、ゆるく撹拌しながら−５℃に
冷却したアセトン80徐々に加え、さらに冷所に
一夜放置後、生じた沈澱を遠心分離機を用いて採
取、冷アセトンで洗浄して湿沈澱約40ｇを得た。
この湿沈澱を風乾したのち、シリカゲルを敷いた
デシケーター中、減圧下で２日間乾燥し、灰白色
粉末状の粗酵素標品を約14ｇ得た。この粗酵素標
品の、Bz−Lys−ｐ−NAに対するアミダーゼ活
性は、１ｇ当り21.6単位であつた。このアセトン
粉末10ｇを10ｍＭトリス一塩酸緩衝液（PH8.0）
に溶解し、得られた粗酵素液500mlに、前もつて
10ｍＭトリスー塩酸緩衝液（PH8.0）で平衡化し
たカルボキシメチルセルロース（ブラウン社製）
200ｇ（湿重量）を加えて、４℃にて、おだやか
に約１時間撹拌後、ガラスフイルターを用いて
過した。フイルター上のイオン交換セルロースは
適当量の同緩衝液で洗浄し、先の液と一緒にし
酵素液725mlを得た。次に得られた酵素液725ml
に、あらかじめ同緩衝液で平衡化したジエチルア
ミノエチルセルロース（ブラウン社製）460ｇ、
（湿重量）を加えて、４℃にて１時間撹拌後、上
記と同様に、過洗浄を行なつた。得られた液
をダイアフローメンブレンUM−10を用いて濃縮
後、４℃で２ｍＭトリス塩酸緩衝液（PH8.0）に
対して充分透析し、酵素液492mlを得た。この酵
素液を、２ｍＭトリス塩酸緩衝液（PH8.0）で平
衡化したAH−セフアロース4B（フアルマシア社
製）カラム（φ4×21cm）に添加吸着させ、充分
同緩衝液で洗浄後、食塩濃度を０から1Mまで直
線的に上昇させた同緩衝液２で溶出を行なつ
た。食塩濃度約0.3Mから0.5M付近で溶出される
アミダーゼ活性部分を採取した。本酵素液を２ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液（PH8.0）で充分透析後、ダ
イヤフローメンブレンUM−10を用いて濃縮し、
濃縮液10mlを得た。この濃縮液は、プロテアーゼ
Iaの他に、プロテアーゼＩを含む、この液のアミ
ダーゼ活性は１ml当り14.4単位であつた。 実施例 １ 参考例で得られた酵素液10mlを、PH3.5〜10の
アンフオライト（LKB社製）を充填した焦点電
気泳動装置（内容積10ml）に注入し４℃にて
600Vで48時間、等電点分画に付した。電気泳動
完了後、1.6mlずつ分画し、各分画のアミダーゼ
活性を測定し第５図に示すような結果が得られ
た。第５図から明らかなように、アミダーゼ活性
のピークが２つ存在する。その内、後の大きなア
ミダーゼ活性ピークはプロテアーゼＩに相当する
ものである。溶出分画数で約46番目に最大のアミ
ダーゼ活性を有するピーク即ち２つの活性ピーク
の内、前のピークは決して無視出来ないピークで
ある事が判る。目的とする酵素は、このピーク部
分に含まれており、この区分12.6mlをプールし
た。アミダーゼ活性18.9u、比活性（ｕ／OD280）
1.29、収率8.7％（アセトン粉末より） 実施例 ２ 実施例１で得られた酵素液を２ｍＭトリス、塩
酸緩衝液（PH8.0）で透析後、濃縮を行ない、な
お微量に存在する不純タンパクを除去するため
に、アンフオライン（PH４〜６）を用いて実施例
１と同じ条件下で電気泳動を繰り返し、第６図に
示す結果を得た。分画番号65〜76に相当する画分
を集め、この酵素液に共存するアンフオライトを
除くために、２ｍＭトリス塩酸緩衝液（PH8.0）
で平衡化したセフアデツクスＧ−50カラム（φ2
×50cm）に付し、アミダーゼ活性画分を採取後、
濃縮を行ない精製酵素溶液5.4mlを得た。アミダ
ーゼ活性16.1単位。比活性（ｕ／OD280）2.24、
収率7.4％（アセトン粉末より）。このようにして
精製された本発明のプロテアーゼIaはデイスク電
気泳動法による解析で単一の蛋白質として泳動さ
れた。 なお、本細菌アクロモバクター・リテイカス
M497−１は工業技術院微生物工業技術研究所に
保管を委託致しました。その寄託番号は、微工研
菌寄第6718号（FMRM Ｐ−6718）であり、その
事実を証明する書面（受託証）を願書に添化致し
ます。

【図面の簡単な説明】

第１図は、アミダーゼ活性に及ぼすPH変化の影
響を示すグラフ、第２図は、エステラーゼ活性に
及ぼすPH変化の影響を示すグラフ、第３図は、PH
安定性を示すグラフである。第３図において、−
Γ−は0.1M酢酸ナトリウム buffer −・−は
0.1M tris HCl buffer、−△−は0.1M diol−Hcl
buffer、−▲−は0.1Mリン酸二ナトリウム−
NaoH bufferを用いて行なつたものである。第
４図は、熱安定性を示すグラフ、第５図は、１回
目焦点電気泳動 アンフオライン（PH3.5〜10）
を示すグラフ、第６図は、２回目焦点電気泳動
アンフオライン（PH４〜６）を示すグラフであ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の特性を有するプロテアーゼ。 (i) 分子量：30000（Sephadex Ｇ−75によるゲル
   過法） (ii) 等電点：5.3 (iii) PH作用性：エステラーゼ活性はPH8.5に、ま
   たアミダーゼ活性はPH9.0にそれぞれ作用至適
   PHを有する。 (iv) 基質作用性：Ｌ−リジンのカルボキシル基に
   おけるエステル結合およびアミド結合を選択特
   異的に水解する。 (v) 阻害剤：ジイソプロピルフオスフオフロリ
   ド、トシル−Ｌ−リジンクロロメチルケトン及
   びフエニルメチルスルホニルフロリドにより阻
   害を受ける。 ２ アクロモバクター属により産生される特許請
   求の範囲第１項記載のプロテアーゼ。