JP3205331B2

JP3205331B2 - アクロモバクタープロテアーゼｉ類遺伝子及びその遺伝子産物

Info

Publication number: JP3205331B2
Application number: JP05972689A
Authority: JP
Inventors: 文夫崎山; 篤男中田
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1989-03-14
Filing date: 1989-03-14
Publication date: 2001-09-04
Anticipated expiration: 2016-09-04
Also published as: EP0387646A1; GR3020790T3; ES2088911T3; DK0387646T3; EP0387646B1; DE69027466D1; ATE139568T1; DE69027466T2; JPH02242686A; CA2011378C; CA2011378A1; US5248599A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明はアクロモバクタープロテアーゼＩ（Achrom
obactor protease I、以下APIと呼ぶ）およびAPIと同様
の活性を有するAPI類をコードするDNAをクローニング
し、それを使用してAPI類を遺伝子工学的手法を用いて
効率よく生産する方法に関する。

従来の技術 APIはアクロモバクターリティカス（Achromobactor
lyticus）M497−１菌から生産されるセリンプロテアー
ゼで、蛋白質およびペプチドのリジン残基のカルボニル
基側のペプチド結合（−Lys−Ｘ−）を特異的に切断す
る酵素であり、リシルエンドペプチダーゼ（EC3.4.21.5
0）とも呼ばれている。本酵素はLys−Pro結合を含めた
全てのLys−Ｘ結合を切断するので、蛋白質やペプチド
の一次構造解析のための断片化やペプチドマップの作
成、−Lys−Ｘ−化合物の合成に極めて有用である。

一方、あるの細胞が分泌する蛋白質、ポリペプチドの
単離精製は、その操作が煩雑でまた生産量が少ないよう
な場合には、非常に難かしいのが常であり、この困難性
を解決するために種、遺伝子工学的手法を用いることが
最近では行なわれることもある。

発明が解決しようとする課題上記のAPIの取得はアクロモバクターリティカスか
らの生産に頼っていたが、この天然の生産量は非常に少
なく、大量に生産し得る方法の開発が望まれていた。そ
こでこの種のものを大量に生産し得る遺伝子工学的手法
を適用することが課題となっていた。

課題を解決するための手段本発明者等はAPIの遺伝子工学的手法による生産を行
う方法を提供すべく研究を重ね、APIをコードするDNAの
クローニング、およびこれを用いたに遺伝子工学的手法
によるAPIの生産に成功したものである。

すなわち本発明は、（ｉ）API類をコードするDNAを含
有するDNA、（ii）該DNAを発現用ベクターに、API類を
発現させるように構築した組み換えDNA、（iii）該組み
換えDNAを保持する形質転換体、（iv）該形質転換体を
培養し、培養物中にAPI類を生成蓄積せしめ、これを採
取することを特徴とするAPI類の製造法、および（ｖ）A
PI類蛋白質に関するものである。

本発明者はAPIをクローニングするに当って第１図に
示す１〜2414位のDNA配列のものを得たが、この内、387
〜2348位が蛋白質発現部位（プレプロ体）、387〜449位
（若しくは387〜470位）がシグナル配列、1002〜1805位
が成熟蛋白質部位であり、この成熟蛋白質部位と同様の
活性を有するものとして1002位〜2348位が広義の成熟蛋
白質部位と呼べるものである。そして今回の遺伝子工学
的手法によるAPI類の生産における発現系の構築に当っ
ては、354〜2414位の塩基配列を組み込んでいるが、こ
の塩基配列に包含されるこれより短いものであっても、
API類を発現し得るものであれば用いることができる。

このDNA配列から推定されるアミノ酸配列を第１図に
併せて示しているが、このアミノ酸配列において、１〜
268位が成熟蛋白質部位、１〜269位ないし448位が同様
の活性を有する広義の成熟蛋白質部位の相当し、また−
205位から448位が蛋白質発現部位（プレプロ体）に相当
するものである。

本発明においては、このアミノ酸配列の１〜268位の
成熟蛋白質部位（API）および該成熟蛋白質部位と同様
の活性を有する１〜269位ないし448位に相当する広義の
成熟蛋白質部位を含めてAPI類と総称する。

本発明は次の事を特徴とするものである。

（１）アクロモバクタープロテアーゼＩ類をコードす
る第１図の1002〜1805位である以下のDNA配列を含有す
るDNA。

（２）アクロモバクタープロテアーゼＩ類をコードす
るDNA配列が第１図の1002〜2348位の以下のものである
請求項１記載のDNA。

（３）アクロモバクタープロテアーゼＩ類をコードす
るDNA配列が第１図の387〜2348位の以下のものである請
求項１記載のDNA。

（４）アクロモバクタープロテアーゼＩ類をコードす
るDNA配列が第１図の354〜2414位の以下のものである請
求項１記載のDNA。

（５）アクロモバクタープロテアーゼＩ類をコードす
るDNAがアクロモバクターリティカスM497−１の染色
体DNA由来のDNAである、請求項１、２、３または４記載
のDNA。

（６）請求項１、２、３、４または５記載のDNAを、ア
クロモバクタープロテアーゼＩ類を発現させるよう
に、発現用ベクターに構築した組み換えDNA。

（７）請求項６記載のDNAを保持する形質転換体。

（８）形質転換体の宿主が大腸菌である請求項７記載の
形質転換体。

（９）請求項７または８記載の形質転換体を培養し、培
養物中にアクロモバクタープロテアーゼＩ類を生成蓄
積せしめ、これを採取することを特徴とする、該アクロ
モバクタープロテアーゼＩ類の製造法。

（10）部位特異的変異により改変した請求項９記載のア
クロモバクタープロテアーゼＩ類の製造法。

（11）第１図の１〜268のアミノ酸配列である以下のア
ミノ酸配列で表わされるアクロモバクタープロテアー
ゼＩ蛋白質。

（12）第１図のアミノ酸配列１〜448に相当する以下の
アミノ酸配列における１〜269位乃至１〜448位で表わさ
れるアクロモバクタープロテアーゼＩ類蛋白質。この
蛋白質は１〜269位、１〜270位、…１〜448位のように
以下のアミノ酸配列中、１〜269位から始まってそのＣ
末端に一つずつアミノ酸が増えていく蛋白質の１群から
選ばれる任意の１種を表すものである。

本発明におけるAPI類をコードする塩基配列を有するD
NAを含有する発現型ベクターは、例えば、（ｉ）API類
産生細胞、例えばアクロモバクターリティカス M497
−１からの全ゲノムDNAを制限酵素で消化し、（ii）該D
NA断片をファージまたはプラスミドに組み込み、（ii
i）得られた組み換えファージまたはプラスミドで宿主
を形質転換し、（iv）得られた形質転換体を培養後、形
質転換体から適当な方法、例えばAPI類の一部をコード
するDNAプローブとのハイブリダイゼーションにより目
的とするDNAを含有するファージあるいはプラスミドを
単離し、（ｖ）その組み換えDNAから目的とするクロー
ン化DNAを切り出し、（vi）該クローン化DNAまたはその
一部を発現ベクター中のプロモーターの下流に連結す
る、ことにより製造することができる。

API類をコードするDNAについては、全合成あるいは半
合成によっても製造することができ、この際、第１図に
示したような配列に基いて合成することができる。

API類の全ゲノムDNAの制限酵素による消化に当って
は、EcoR I、Sal I、BamH I等の制限酵素が用いられ
る。

消化されて得られたDNA断片を組み込むプラスミドと
しては、たとえば大腸菌由来のpACYC177,pACYC184,pUC
8,pUC9,pBR322,pIN3A1,pKK233−２などが挙げられる
が、その他のものであっても、宿主内で複製増殖される
ものであれば、いずれをも用いることができる。またDN
A断片を組み込むファージベクターとしては、たとえばM
13ファージmp9,M13ファージmp8,λgt11,λEMBL3,Charon
4などが挙げられるが、その他のものであっても宿主内
で増殖できるものであれば用いることができる。

DNA断片を組み込んだプラスミドまたはファージベク
ターは適当な宿主たとえばエシェリキア（Escherichi
a）属菌（大腸菌），バチルス（Bacillus）属菌（枯草
菌），ストレプトマイセス（Streptomyces）属菌（放線
菌），サッカロマイセス（Saccharomyces）属菌（酵母
菌），および動物細胞たるmonkey COS cellなどに導入
する。

上記エシェリキア属菌の例としては、E.coli UT481
株,JM103株,JM83株,JM109株,NM522株,MV1304株、バチル
ス属菌の例としてはバチルスサティリス（Bacillus s
ubtilis），ストレプトマイセス属菌の例としてはスト
レプトマイセスコェリカラー（Streptomyces coelico
lor），サッカロマイセス属菌の例としてはサッカロマ
イセスセレビシェ（Saccharomyces cerevisiae）など
が挙げられる。

このようにして得られた形質転換体から、目的とする
DNAを含有するファージあるいはプラスミドを単離する
方法としては、例えばAPI類の一部をコードするオリゴ
ヌクレオチドをプローブとして用いたコロニーハイブリ
ダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション等に
よるハイブリダイゼーションにより行われる。

本発明のAPI類遺伝子のクローニングの概要は、第２
図のフローチャートに示され、〔Ａ〕API類遺伝子類似
配列を有するDNA断片のクローニングとその塩基配列の
決定〔（１）→（２）〕、〔Ｂ〕API類遺伝子のクロー
ニングとその塩基配列の決定（３）、〔Ｃ〕API類遺伝
子５′領域のクローニングとその塩基配列の決定
〔（４）→（５）〕および〔Ｄ〕API類全長遺伝子の構
築、といった経路をたどり、API類遺伝子をコードする
正確な領域を決めたものである。

このようにしてクローン化されたAPI類をコードするD
NAの塩基配列を、適当な制限サイトがある場合はそれを
利用して、ない場合はDnase Iを用いた欠除体（deletio
n体）を調製しM13ファージを用いたダイデオキシ法によ
るなどして、決定する。このダイデオキシ法で決定した
DNAの塩基配列と、その塩基配列から判明したアミノ酸
配列を第１図に示す。

上記のようにしてクローン化されたAPI類をコードす
るDNAは目的によりそのまま、または所望により制限酵
素で消化して使用することが出来る。

クローン化されたDNAから発現させたい領域を切り出
し、発現に適したビークル（ベクター）中のプロモータ
ーの下流に連結して発現型ベクターを得ることができ
る。

該DNAはその５′末端に翻訳開始コドンとしてのATGを
有し、また３′末端には翻訳終止コドンとしてのTAA,TG
AまたはTAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コド
ンや翻訳終止コドンは、適当な合成DNAアダプターを用
いて付加することもできる。さらに該DNAを発現させる
にはその上流にプロモーターを接続する。

ベクターとしては、上記のエシェリキア属菌由来のプ
ラスミド（例、pACYC184,pUC9,pKK233−2,pACYC177,pAC
YC184,pUC8,pBR322,pIN3A1），バチルス属菌由来のプラ
スミドpHY300PLK,サッカロマイセス属菌由来のプラスミ
ドpBTI−1,ストレプトマイセス属菌のプラスミドPIJ61,
モンキーCOS細胞のプラスミドpSVLなどが挙げられる。

本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の
発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれ
ばいかなるものでもよい。

形質転換する際の宿主がエシェリキア属菌である場合
はlac,tac,trp,lpp,phoS等のプロモーター、バチルス属
菌の場合はSP02,αアミラーゼ等のプロモーター、サッ
カロマイセス属菌の場合はP_ACD1（アルコールデヒド
ロゲナーゼプロモーター）、P_CYC1（チトクロームＣ
プロモーター）、monkey COS細胞の場合はSV40アーリー
およびレイトプロモーターなどが、その例として挙げら
れる。

このようにして構築されたAPIをコードするDNAを含有
するベクターを用いて、形質転換体を製造する。

宿主としては、たとえばエシェリキア属菌、バチルス
属菌、ストレプトマイセス属菌、サッカロマイセス属
菌、monkey COS細胞などが挙げられる。

上記エシェリキア属菌、バチルス属菌、ストレプトマ
イセス属菌、サッカロマイセス属菌、monkey COS細胞の
具体例としては、前記したものと同様のものが挙げられ
る。

このようにして、API類をコードするDNAを含有する発
現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。

本発明において形質転換体を培養する際、培養に使用
される培地としては、通常のものでよいが、LB培地、M9
培地、Ｔ培地などが挙げられる。

培地のpHは約６〜９、好ましくは７前後である。

培養時間、温度、培養方法等は適宜選択できるが、振
盪培養、培養温度25℃前後、好ましくは25℃より若干低
めがよく、特に好ましい組合せとしては、25℃、24時
間、IPTG 1mMを含むLB培地（pH7.2）での振盪培養が挙
げられる。

上記培養物からAPI類を分離精製するには、例えば下
記の方法により行なうことができる。

API類を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際して
は、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、こ
れを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、オスモティック
ショック、リゾチームおよび／または凍結融解などによ
って菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過
によりAPIの前駆体たんぱくや成熟ペプチドの粗抽出液
を得る方法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や塩
酸グアニジンなどのたんぱく変性剤や、トリトンＸ−10
0などの界面活性剤が含まれていてもよい。

培養液中に前駆体たんぱくや成熟ペプチドが分泌され
る場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あ
るいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このよう
にして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる
前駆体たんぱくや成熟ペプチドは、自体公知の分離・精
製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これら
の公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法など
の溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ
過法、およびSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換
クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、ア
フィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を
利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの
疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等
電点の差を利用する方法などが挙げられる。

作用・効果本発明のDNAでDNA感染または形質転換した菌体や細胞
では、大量のAPI前駆体たんぱくや成熟たんぱくを大量
に生産、精製することができる。

API類は先に述べたように、蛋白質およびペプチドの
リジン残基のカルボニル基側のペプチド結合（−Lys−
Ｘ−）を特異的に切断する酵素であり、Lys−Pro結合を
含めた全てのLys−Ｘ結合を切断するので、蛋白質やペ
プチドの一次構造解析のための断片化やペプチドマップ
の作成、−Lys−Ｘ−化合物の合成に極めて有用であ
る。

本発明明細書および図面において、塩基やアミノ酸な
どを略号で表示する場合、IUPAC−IUB Commision on Bi
ochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野に
おける慣用略号に基づくものであり、その例を下記す
る。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、
特に明示しなければＬ−体を示すものとする。

DNA :デオキシリボ核酸 cDNA:相補的デオキシリボ核酸 A :アデニン T :チミン G :グアニン C :シトシン I :イノシン RNA:リボ核酸 mRNA:メッセンジャーリボ核酸 dATP:デオキシアデノシン三リン酸 dTTP:デオキシチミジン三リン酸 dGTP:デオキシグアノシン三リン酸 dCTP:デオキシシチジン三リン酸 ATP :アデノシン三リン酸 GlyまたはG:グリシン AlaまたはA:アラニン ValまたはV:バリン LeuまたはL:ロイシン IleまたはI:イソロイシン SerまたはS:セリン ThrまたはT:スレオニン CysまたはC:システイン MetまたはM:メチオニン GluまたはE:グルタミン酸 AspまたはD:アスパラギン酸 LysまたはK:リジン ArgまたはR:アルギニン HisまたはH:ヒスチジン PheまたはF:フェニールアラニン TyrまたはY:チロシン TrpまたはW:トリプトファン ProまたはP:プロリン AsnまたはN:アスパラギン GlnまたはQ:グルタミンなお、本発明のAPI類においては、同様の活性がある
限り、そのアミノ酸配列の一部が修飾（付加、除去、そ
の他のアミノ酸への置換など）されていてもよい。

実施例以下の実施例により本発明をより具体的に説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。

以下の実施例において、用いられた材料、操作は以下
の通りである。

（ｉ）制限酵素、修飾酵素及び塩基配列決定キットは宝
酒造製品を、DNase Iはシグマ製品、DNAポリメラーゼＩ
はニューイングランドバイオラボ製品、ニトロセルロー
ス膜はシュライヒャーアンドシュール（Schleicher
＆ Schuell）社BA85を³²P放射性ヌクレオチドはアマー
シャムレディオケミカルズ製のものを夫々使用した。

（ii）発現の際、用いたNco IリンカーとpKK233−２ベ
クターはピーエルバイオケミカルズ（P.L.Biochemi
cals）社製品を用いた。又、本実験で用いた大腸菌株の
ゲノタイプは次に示される。

UT481 lonΔ（lac,pro）thy A met sup D r m/F' traD3
6 proAB lac I^q ZΔM15 JM103Δ（lac,pro）thi strA supE endA sbcB15hsdR4/
F' traD36 proAB la c^qI ZΔM15 （iii）ラベリングについては、15pmolのオリゴヌクレ
オチド混合物を100μCiの〔γ−³²P〕ATP（＞5000Ci/mm
ol）でT₄ポリヌクレオチドキナーゼを用いてラベルし
た。0.5〜１μｇのDNA断片は50μCiの〔α−³²P〕dCTP
（＞3000Ci/mmol）でニックトランスレーションにより
ラベルされた。

（iv）ハイブリダイゼーションコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリ
ダイゼーショ、サザンハイブリダイゼーションにおい
て、その過程でニトロセルロース膜に移されたDNAとプ
ローブとのハイブリダイゼーションは次のようにして行
われた。

＊オリゴヌクレオチドを用いた場合５×デンハルツ溶液（Denhardt's solution）,0.1％S
DS,10％ソジウムデキストランスルフェート,19.8mM
Tris・HCl pH8.0,6.0mM EDTA,0.9M NaClを含む溶液中
で42℃で１時間膜を保った後、同じ溶液中へ標識プロー
ブを加え、室温下に24時間保った。膜は６×SSCで室温
下に３回、30分間洗浄し、その後40℃で５分間洗浄し、
増感紙の存在下−80℃で24時間オートラジオグラフィー
を行なった。

＊ニックトランスレーションで標識されたDNA断片を用
いた場合５×SSC,50％ホルムアミド、５×デンハルツ溶液,50m
Mリン酸ナトリウム緩衝液,pH6.5,1mg/ml超音波処理した
サケ精子DNAを含む溶液中で42℃で２時間保った後、５
×SSC,50％ホルムアミド、１×デンハルツ溶液,10％ソ
ジウムデキストランスフェート,20mMリン酸ナトリウム
緩衝液,1mg/ml超音波処理したサケ精子DNAを含む溶液中
へ膜を移し、標識プローブを加え、42℃で24時間保っ
た。膜は２×SSC,0.1％SDSの溶液で室温下に３回30分間
洗い、次に0.1×SSC,0.1％SDSの溶液で55℃で３回30分
間洗浄した。オートラジオグラフィーは上と同様に行な
った。

（ｖ）スクリーニングについては次のように行なう。

＊全ゲノムDNAを用いた場合クロモゾーマルDNA250μｇを制限酵素で消化した後、
プラスミドへ挿入しこれによる形質転換体をライブラリ
ーとし、コロニーハイブリダイゼーションを行なった。

＊DNA断片からのサブクローニングの場合 DNA断片20μｇを制限酵素で消化した後、プラスミド
又はファージDNAに挿入し、これによる形質転換体をラ
イブラリーとし、コロニーハイブリダイゼーション、あ
るいはプラークハイブリダイゼーションを行なった。

＊サイズ選択DNAの場合クロモゾーマルDNA250μｇを制限酵素で消化した後、
0.8％アガロースゲル電気泳動を行ない、これに対しサ
ザンハイブリダイゼーションを行いポジティブなバンド
に相当する領域を同様に泳動したゲルより切り出し、そ
れよりDNA断片を溶出する。溶出したDNAをプラスミドに
挿入し、これによって得られた形質転換体をライブラリ
ーとし、コロニーハイブリダイゼーションを行なった。

（vi）DNA塩基配列決定クローニングされたDNA断片は適当な制限サイトのあ
る場合はそれを利用して、ない場合はDNase Iを用いた
欠除体を調製しM13ファージを用いたダイデオキシ法に
より決定した。

以上、遺伝子操作方法に関してはマニアティス，ティ
ー（Maniatis,T）等、モレキュラークローニング（Mo
lecular Cloning）：アラボラトリーマニュアル，
コールドスプリング、ハーバーラボラトリー,NYに
準じて行なった。

実施例１（第２図参照）〔Ａ〕API遺伝子類似配列を有するDNA断片のクローニン
グとその塩基配列の決定（１）API類似遺伝子8Kbp EcoR I断片のクローニングアクロモバクターリティカス M497−１菌のゲノム
DNA250μｇをEcoR Iで消化し、pACYC184へ挿入し、これ
により得られた形質転換体約6,000個に対し、下記のオ
リゴヌクレオチドをプローブとして、コロニーハイブリ
ダイゼーションによりスクリーニングした。該プローブ
はAPI蛋白質の一次構造（成熟蛋白質の71〜77位配列を
コード）に基いて合成された次の21マーをT₄ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５′末端をラベ
ルして得た、API遺伝子に特異的なプローブである。室
温洗浄後オートラジオグラフィーにかけ、約600クロー
ンをレプリカ、コロニーハイブリダイゼーションを行っ
た後、42℃洗浄、オートラジオグラム上で１個のポジテ
ィブクローンが得られ、8Kbpの断片が挿入されていた
（pAS800）。該約8KbpのEcoR I断片の回収を行った。

（２）8Kbp EcoR I断片からの400bp Sau3A Iのサブクロ
ーニングと塩基配列決定 8Kbp EcoR I断片をSau3A Iで消化しM13ファージmp9へ
挿入し、これを用いて得られた形質転換プラーク約1000
個に対し、上記のオリゴヌクレオチドをプローブとし
て、プラークハイブリダイゼーションによりスクリーニ
ングした。12℃で洗浄後のオートラジオグラフィーの結
果、ポジティブとなった13クローンについてダイデオキ
シ法により塩基配列決定を行ない、アミノ酸配列への変
換により、アミノ酸レベルでAPIと約70％のホモロジー
を持つDNA断片であることが明らかとなった。その後、
この断片はmp9からEcoR I/Hind III消化により切り出さ
れpUC9へ移された（pAPS400）。

〔Ｂ〕API遺伝子のクローニングとその塩基配列の決定（３）API遺伝子2.5Kbp Sal I断片のクローニング（２）で得られたpAPS400をEcoR I/Pst I消化して得
られた約400bp断片の１μｇを〔³²P〕dCTPを用いたニッ
クトランスレーションによりラベルしてプローブを調製
し、全ゲノムDNA250μｇのSal I消化物に対し、サザン
ハイブリダイゼーションを行なった。オートラジオグラ
ム上に２本のバンドが得られたが、強いバンドは先にク
ローニングした類似配列DNAと考えられるため、2.5Kbp
のうすいバンドに相当する領域を同様に泳動したゲルよ
り切り出し、DNA断片を回収した。これをpUC9に挿入
し、これによって生じた形質転換体約2000個をライブラ
リーとして、400bpのDNA断片を用いてコロニーハイブリ
ダイゼーションによりスクリーニングを行なった。これ
より約12個の陽性クローンを得、それぞれのコロニーよ
りプラスミドを調製、Sal I消化し目的の約2.5Kbp断片
であることを再度同一プローブのサザンハイブリダイゼ
ーションで確認した（pAPC250）。この2.5Kbp断片はSal
Iで切り出し回収した後、M13ファージmp9Sal Iサイト
へ挿入した。このファージ感染体より両方向に挿入され
たクローンをとり、両クローンに対してDNase Iにより
欠除体（deletion体）を作製し、両方向からのダイデオ
キシ法による塩基配列決定を行なった。

これより、この断片上にAPI成熟蛋白質をコードする
領域がすべて含まれていることが確認されたが、APIが
分泌蛋白質であるにもかかわらず、シグナル配列を見出
せないこと、いくつかあるMetの前にSD配列が見出せな
いことより、枠内（in frame）の可能性が考えられた。

〔Ｃ〕API遺伝子５′領域のクローニングとその塩基配
列の決定（４）API遺伝子15Kbp断片のクローニング完全なAPI遺伝子をクローニングする目的で、アクロ
モバクターリティカスM497−１菌のゲノムDNAがBamH
Iで消化され、サザンハイブリダイゼーションが行なわ
れた。プローブとして（３）で得られたpAPC250のSal I
消化断片である2.5Kbp断片が〔α³²P〕dCTPを用いたニ
ックトランスレーションによりラベルされ使用された。

オートラジオグラム上で検出される15Kbpに相当する
領域を同様に泳動したゲルより切り出し、DNA断片を回
収した。これらの断片はpACYC184に挿入され、約1000個
の形質転換体をライブラリーとして同じプローブを用い
コロニーハイブリダイゼーションを行なった結果、１個
の陽性クローンが得られた（pAPW150）。これよりプラ
スミドを調製、BamH I消化し、目的の約15Kbpの断片で
あることを同一プローブのサザンハイブリダイゼーショ
ンで確認、15Kbp断片が回収された。

（５）15Kbp BamH I断片からの600bp EcoR I断片のサブ
クローニング（３）で得られた2.5Kbp Sal I断片に続く領域を持つ
DNA断片を得るために、2.5Kbp断片よりプローブとするD
NA断片が調製された。配列分析の結果、2.5Kbp断片中に
は１ヶ所だけEcoR Iのサイトが確認されていたので、pA
PC250をSal I/EcoR Iで消化し、得られる２断片のうち
蛋白質Ｎ末端側にわたる100bp EcoR I/Sal I断片を回収
した。次いで、この断片の５′末端リン酸基をバクテリ
アルアルカリンホスファターゼ（Bacterial Alkali
ne Phosphatase）で除去し、これを〔γ−³²P〕ATPでオ
リゴヌクレオチドと同様にラベルしてプローブとした。

15Kbp BamH I断片20μｇはEcoR Iで消化されサザンハ
イブリダイゼーションが行なわれた。この時0.1×SSC,
0.1％SDS溶液での洗浄は50℃で行なった。

オートラジオグラム上で約600bpの位置にバンドが出
現したので、15Kbp断片のEcoR I消化物の６％ポリアク
リルアミド電気泳動を行なったゲルより、これに相当す
るバンドを切り出し溶出し、Μ13ファージmp9へ挿入し
た。両方向挿入クローンをとり、塩基配列の決定を行っ
た。この結果、プローブとしたEcoR I−Sal I断片100bp
の配列も確認された。後に、この600bp EcoR I断片はpU
C9へ移された（pAPN600）。

実施例２（第３図）〔Ｄ〕API全長遺伝子の構築（６）API全遺伝子を有するプラスミドの構築 API全遺伝子を持つプラスミドの製造は第３図の如く
行なわれた。

pAPC250をEcoR Iで切断し、プラスミド上のEcoR Iサ
イトと挿入DNA断片中のEcoR Iサイトの間にはさまれた
部分を取り去り、５′末端リン酸基をバクテリアルア
ルカリンホスファターゼにより除去した。

pAPN600をEcoR Iで切断し、プラスミドよりEcoR I挿
入断片を分離、回収した。

とを連結し、API全領域を持つプラスミドが構築
された。なお、EcoR I断片の挿入方向はプラスミド上に
あるPvu II制限サイト挿入断片中にあるPvu II,Sal Iを
利用して消化断片の大きさで確認した。

実施例３（第４図）〔Ｄ〕API遺伝子発現系の構築 pAPI300をPvu IIで消化し、0.8％アガロースゲルから
約1.7Kbp断片を回収した。次いで、この断片をCfrl3 I
で消化し、混合物のままでT4DNAポリメラーゼで末端を
平滑化した。この断片に８マーNco IリンカーGCCATGGC
を結合した。Nco Iリンカーの結合したこの断片をEcoR
I,Nco Iで消化し目的とするNco I−EcoR I断片（）を
得た。

pAPC250をEcoR I/Nco Iで消化し、約1.8KbのEcoR I−
Nco I（）を0.8％アガロースゲルから回収した。

発現ベクターであるpKK233−２をNco Iで消化し、
５′末端のリン酸基をバクテリアルアルカリンホス
ファターゼで除去した。

断片、、pKK233−２を結合し、APIの発現プラス
ミドpKYN200を得た。Nco I断片の挿入の方向性はEcoR I
（ベクター側に一ヶ所、挿入断片に一ヶ所）、Hind III
（ベクター側に一ヶ所）の消化で出現する断片の大きさ
で確認した。

この発現のシステムは第５図に示すようなものであ
る。図中、イがアクロモバクター由来遺伝子であり、ロ
の部分にあるMetで始まる翻訳は矢印の部分で終結す
る。一度終結した翻訳は、アクロモバクター由来遺伝子
中のSDを利用して再びハのMetから始められ、API蛋白質
を生産する。

実施例４〔Ｆ〕API遺伝子のE.coli UT481での発現とその産物の
精製 E.coli UT481はlon^-種であり（Lon＝プロテアーゼLa:
ATP依存プロテアーゼ）、産物の分解がある程度抑えら
れるものと考えられた。

pKYN200のE.coli UT481への形質転換体を一夜100μg/
mlのアンピシリンを含む培地中で前培養し、250mlの同
じ培地に2.5ml加え25℃で24時間培養した。培養液より
集菌した菌体よりオスモティックショック方法（Osmo
tic shock procedure）〔ウィルスキー，ジーアール
（Willsky,G.R.）等、ジャーナルオブバクテリオロ
ジィー（J.Bacteriol.）127595−609（1976）〕により
ペリプラズム蛋白質を抽出した。この蛋白質溶液を10mM
Tris−HCl pH9.5で平衡化したQAEセファデックスＡ−5
0（１×40cm）に吸着させた後、500mMまでのNaClリニア
グラジエントをかけ溶出させた。60〜65mMで溶出された
ピークを分取し、10mM Tris−HCl pH8.0に対し透析した
後、凍結乾燥した。凍結乾燥した粗蛋白は2mlの水に溶
解し、TSKゲル2000SWカラムを用いたHPLCによるゲルろ
過で最終精製を行なった。HPLCの条件は流速0.7ml/分、
バッファー0.2M酢酸アンモニウム、pH7.0であった。

培養液１当り1.6mgのAPI類（第１図のアミノ酸配列
１〜448位に相当するもの）が生成し、上記の方法によ
り約0.5mgの精製標品を得た。この標品は成熟API（第１
図のアミノ酸配列１〜268位に相当するもの）の60％の
比活性を示し、腸炎ビブリオ由来ヘモリジンの消化物の
分析からLys−Ｘ結合を特異的に加水分解することが判
明した。また単離したAPI類のＮ末端23残基は標準API
（市販品、天然品）のそれと完全に一致し、アミノ酸組
成は第１表に示すとおり１位のグリシンから448位のグ
リシンに至るペプチド鎖の組成とよく一致した。また分
子量4.8万は計算値4.6万とほぼ一致した。

【図面の簡単な説明】

第１図はAPI類をコードするDNAを包含するDNA配列、お
よびそれに対応するアミノ酸配列である。第２図は本発明におけるAPI類をコードするDNAのクロー
ニングの過程を示すフローチャートである。第３図はAPI類全長遺伝子の構築図であり、第４図はAPI
類遺伝子発現系の構築図である。第５図は本発明におけるAPI類発現のシステムの概略を
示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:025） (56)参考文献ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，264［７］（1989年．３月．５日) ｐ．3832−3839 Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．, 50［12］（1986）ｐ．3087−3091 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】アクロモバクタープロテアーゼＩ類をコ
ードする以下のDNA配列を含有する、アクロモバクター
プロテアーゼＩ類をコードするDNA。
【請求項２】アクロモバクタープロテアーゼＩ類をコ
ードするDNA配列が以下のものである請求項１記載のDN
A。
【請求項３】アクロモバクタープロテアーゼＩ類をコ
ードするDNA配列が以下のものである請求項１記載のDN
A。
【請求項４】アクロモバクタープロテアーゼＩ類をコ
ードするDNA配列が以下のものである請求項１記載のDN
A。
【請求項５】アクロモバクタープロテアーゼＩ類をコ
ードするDNAがアクロモバクターリティカスM497−１
の染色体DNA由来のDNAである、請求項１、２、３または
４記載のDNA。
【請求項６】請求項１、２、３、４または５記載のDNA
を、アクロモバクタープロテアーゼＩ類を発現させる
ように、発現用ベクターに構築した組み換えDNA。
【請求項７】請求項６記載のDNAを保持する形質転換
体。
【請求項８】形質転換体の宿主が大腸菌である請求項７
記載の形質転換体。
【請求項９】請求項７または８記載の形質転換体を培養
し、培養物中にアクロモバクタープロテアーゼＩ類を
生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする、該
アクロモバクタープロテアーゼＩ類の製造法。
【請求項１０】部位特異的変異により改変した請求項９
記載のアクロモバクタープロテアーゼＩ類の製造法。
【請求項１１】以下のアミノ酸配列における１〜269位
乃至448位で表わされるアクロモバクタープロテアー
ゼＩ類蛋白質。