JPH04325090A

JPH04325090A - ブタ膵臓エラスターゼｉｉｉ

Info

Publication number: JPH04325090A
Application number: JP9206991A
Authority: JP
Inventors: Yuji Ozawa; 小沢　雄次; Hidehiko Furukawa; 秀比古古川; Kaori Nakahara; かおり中原; Hiroshi Takiguchi; 滝口　洋
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1991-04-23
Filing date: 1991-04-23
Publication date: 1992-11-13

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、胆汁酸分泌促進剤また
は肝臓機能改善剤としての利用が期待されるブタ膵臓エ
ラスタ−ゼＩＩＩ、該ブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩをコ
ードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ発現
ベクターおよび該組換えＤＮＡ発現ベクターで形質転換
せしめた宿主に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来、血液中のコレスレロ−ルを低下さ
せることが動脈硬化の予防および治療に重要であること
が知られている。そして、現在まで種々の化合物が提供
されている。そして先に、ブタの膵臓のプロテアーゼＥ
についての報告がなされている（Ｒ．Ｋｏｂａｙａｓｈ
ｉ　ｅｔ　ａｌ．、　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２５
３、　５５２６−５５３０　（１９７８））。　　しか
しながら、該報文ではアミノ酸配列の　１０　番目がＡ
ｌａであり、本発明のブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩでは
、Ｓｅｒであり、異なる。更に、ブタ膵臓エラスタ−ゼ
ＩＩＩではプロ体部分の断片は切断後もＳ−Ｓ結合でマ
チュア体と結合している点で異なる。また、該報文では
約　３０　個のＮ末端アミノ酸配列を決定しているに過
ぎない。また、その作用の記載もない。また、近年、　
ブタ膵臓由来のエラスタ−ゼ様酵素（Ｅｌａｓｔａｓｅ
　ｌｉｋｅ　ｅｎｚｙｍｅ）をラットに比較的長期間、
連続投与することによって、血中および肝臓のコレステ
ロールの低下およびコレステロール−　７α−　ヒドロ
キシラーゼ活性の上昇が見出された（Ｍｉｙａｋｅ　Ｙ
．，　Ａｃｔａ．　Ｍｅｄ．　Ｋｉｎｋｉ　Ｕｎｉｖ．
，　１１，　（１），　４３−５２，　（１９８６））
。しかしながら、該報文のエラスタ−ゼ様酵素は分子量
が　３１、５００　であり、本発明のブタ膵臓エラスタ
−ゼＩＩＩが　２６、０００　である点で異なる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは胆汁酸の
分泌を促進し、血中のコレステロールを低下させる医薬
として期待される新規なブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩを
見出し、組換えＤＮＡ技術を用いて該ブタ膵臓エラスタ
−ゼＩＩＩをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組
換えＤＮＡ発現ベクターおよび該組換えＤＮＡ発現ベク
ターで形質転換せしめた宿主を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、（１）配列表
の配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸
番号１２〜２５３までの部分的アミノ酸配列を含有する
ブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩ活性を有する蛋白、および
これらをコードするＤＮＡ、（２）配列表の配列番号２
に示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１〜２５
３までの部分的アミノ酸配列を含有するブタ膵臓エラス
タ−ゼＩＩＩ活性を有する蛋白、およびこれらをコード
するＤＮＡ、（３）配列表の配列番号２に示されるアミ
ノ酸配列のうち、アミノ酸番号１〜１１までの部分的ア
ミノ酸配列を含有するオリゴペプチドと、アミノ酸番号
１２〜２５３までの部分的アミノ酸配列を含有するポリ
ペプチドがジスルフィド結合によって結合された、ブタ
膵臓エラスタ−ゼＩＩＩ活性を有する蛋白、およびこれ
らをコードするＤＮＡ、（４）配列表の配列番号２に示
されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１２〜２５３
までのアミノ酸配列で表されるブタ膵臓エラスタ−ゼＩ
ＩＩ活性を有する蛋白、およびこれらをコードするＤＮ
Ａ、（５）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列
のうち、アミノ酸番号１〜２５３までのアミノ酸配列で
表されるブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩ活性を有する蛋白
、およびこれらをコードするＤＮＡ、（６）配列表の配
列番号２に示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号
１〜１１までのアミノ酸配列で表されるオリゴペプチド
と、アミノ酸番号１２〜２５３までのアミノ酸配列で表
されるポリペプチドがジスルフィド結合によって結合さ
れた、ブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩ活性を有する蛋白、
およびこれらをコードするＤＮＡ、（７）Ｎ末端に水素
原子またはＭｅｔを有する、上記の蛋白、およびこれら
をコードするＤＮＡ、（８）配列表の配列番号１に示さ
れる塩基配列のうち、ヌクレオチド番号１から７５９ま
での塩基配列またはそれと同効の塩基配列を含有するＤ
ＮＡ、（９）該ＤＮＡの５’末端にＡＴＧを有するＤＮ
Ａ、（１０）ここに記載した全てのＤＮＡを含有する組
換えＤＮＡ発現ベクター、（１１）該組換えＤＮＡ発現
ベクターで形質転換せしめた宿主、に関する。

【０００５】本発明のＤＮＡはブタ膵臓からブタ膵臓エ
ラスタ−ゼＩＩＩをコードするｍＲＮＡを調製した後、
以下に述べる既知の方法により２本鎖ｃＤＮＡに変換す
ることによって得られる。ｍＲＮＡの抽出にあたっては
、グアニジン・チオシアネート・ホット・フェノール法
、グアニジン・チオシアネートーグアニジン・塩酸法な
ども採用し得るが、グアニジン・チオシアネート・塩化
セシウム法が適している（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏ
ｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ
，Ｖｏｌ．１　）。

【０００６】真核細胞の細胞質に存在するｍＲＮＡの多
くは、その３’末端にポリＡ配列をもつことが知られて
いるので、この特徴を利用してオリゴ（ｄＴ）セルロー
スのカラムにｍＲＮＡを吸着させて、次にこれを溶出し
て精製する。さらに、ショ糖密度勾配遠心法などにより
ｍＲＮＡを分画することもできる。上記の如くして得ら
れたｍＲＮＡを鋳型として逆転写酵素を用いて１本鎖ｃ
ＤＮＡを合成した後、この１本鎖ｃＤＮＡから２本鎖ｃ
ＤＮＡを合成するが、その方法としてはＳ１ヌクレアー
ゼ法（Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．、
Ｃｅｌｌ、　７　、２７９−２８８（１９７６））　、
Ｌａｎｄ法（Ｌａｎｄ，Ｈ．ｅｔ　ａｌ．、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．、　９、　２２５１−２２
６６　（１９８１））、Ｏ．Ｊｏｏ　Ｙｏｏ　法（Ｙｏ
ｏ，Ｏ．Ｊ．ｅｔ　ａｌ．、　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、　７９、　１０４９−１０５
３　（１９８３）　）　、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ法
（Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．ａｎｄ　Ｂｅｒｇ，Ｐ．、　Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、　２、　１６１−１７０
　（１９８２）　）なども採用し得るが、　本発明の目
的にはポリメラーゼ連鎖反応法（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．
　ｅｔ　ａｌ．、　　Ｓｃｉｅｎｓｅ、　２３０、　１
３５０−１３５４　（１９８５））に基づいたｃＤＮＡ
クロニング法（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｌ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．
、　Ｃｅｌｌ、　５０、　８３１−８４０（１９８７）
）が好適である。ポリメラーゼ連鎖反応法とは、目的と
するＤＮＡ領域を挾む２種のプライマーを用いて、特定
のＤＮＡ塩基配列をｉｎ　　ｖｉｔｒｏでＤＮＡ　ポリ
メラーゼによる鋳型特異的なＤＮＡ　成反応を繰り返す
ことによって数十万倍に増幅させる反応である。ｍＲＮ
Ａより逆転写酵素によって合成した一本鎖ｃＤＮＡをこ
の反応の鋳型とすることによって、　極微量のｍＲＮＡ
から、　目的とするｃＤＮＡ断片を特異的に増幅するこ
とが可能である。　また目的とするＤＮＡ　領域が未知
であっても、　用いるプライマーを適当に選択すること
によって、目的のＤＮＡ断片を特異的に増幅できる。

【０００７】次に、　得られたＤＮＡ断片は適当なプラ
スミドベクタ−に挿入の後、　例えばＹＡ２１株に導入
して、テトラサイクリン耐性あるいはアンピシリン耐性
を指標として組換え体を選択することができる。宿主細
胞の形質転換は、例えば宿主細胞が大腸菌（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　の場合にはＨａｎａｈａｎ
　の方法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．、　Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．、　１６６、　５５７−５８０　（１９８３）　
）、すなわち　ＣａＣｌ２　　や　ＭｇＣｌ２　　また
は　ＲｂＣｌを共存させて調製したコンピテント細胞に
該組換えＤＮＡ体を加える方法により実施することがで
きる。なお、ベクターとしてはプラスミド以外にもラム
ダ系などのファージベクターも用いることができる。

【０００８】上記により得られる形質転換株から、目的
のブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩのＤＮＡを有する株を選
択する方法としては、例えば以下に示す各種方法を採用
できる。（１）　合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスク
リーニグ法目的の蛋白のアミノ酸配列の全部または一部が解明され
ている（該配列は、複数個連続した特異的配列であれば
、目的蛋白のどの領域でもよい）場合、該アミノ酸に対
応するオリゴヌクレオチドを合成し（この場合コドン使
用頻度を用いて導いた塩基配列または考えられる塩基配
列を組み合わせた複数個の塩基配列のどちらでもよく、
また後者の場合、イノシンを含ませてその種類を減らす
こともできる）、これをプローブ（３２Ｐまたは３５Ｓ
で標識する）として、形質転換株のＤＮＡを変性固定し
たニトロセルロースフィルターとハイブリダイズさせ、
得られたポジティブ株を検索して、これを選択する。

【０００９】（２）　ポリメラーゼ連鎖反応法により作
製したプローブを用いるスクリーニング法目的蛋白のアミノ酸配列の全部または一部が解明されて
いる場合、該アミノ酸の一部に対応センス鎖とアンチセ
ンス鎖のオリゴヌクレオチドを合成し、これを組み合わ
せてポリメラーゼ連鎖反応法（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．　
ｅｔ　ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｓｅ、　２３０、　１３５０
−１３５４　（１９８５）　）　を行い、目的のブタ膵
臓エラスタ−ゼＩＩＩをコードするＤＮＡ断片を増幅す
る。ここで用いる鋳型ＤＮＡとしては、ブタ膵臓ｍＲＮ
Ａより逆転写酵素にて合成したｃＤＮＡ、またはゲノム
ＤＮＡを用いることができる。このようにして調製した
ＤＮＡ断片を３２Ｐまたは３５Ｓで標識し、これをプロ
ーブとして用いてコロニーハイブリダイゼーションを行
うことにより目的のクローンを選択できる。

【００１０】（３）　ブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩに対
する抗体を用いて選択する方法予め、ｃＤＮＡを発現ベクターに組み込み形質転換株内
で蛋白を生産させ、ブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩに対す
る抗体、またはブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩ類縁蛋白に
対する抗体でブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩとも反応する
抗体を用いて、所望のブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩ産生
株を検出し、目的の株を選択する。

【００１１】（４）　他の動物細胞でブタ膵臓エラスタ
−ゼＩＩＩを産生させてスクリーニングする方法形質転
換株を培養し、遺伝子を増幅させ、その遺伝子を動物細
胞にトランスフェクトし（この場合、自己複製可能で転
写プロモーター領域を含むプラスミドもしくは動物細胞
の染色体に組み込まれ得るようなプラスミドのいずれで
もよい）、遺伝子にコードされた蛋白を産生させ、その
培養上清もしくは細胞抽出物のブタ膵臓エラスタ−ゼＩ
ＩＩ活性を測定するか、ブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩに
対する抗体またはブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩ類縁蛋白
に対する抗体でブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩとも反応す
る抗体を用いてブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩを検出する
ことにより、元の形質転換株より目的のブタ膵臓エラス
タ−ゼＩＩＩをコードするｃＤＮＡを有する株を選択す
る。

【００１２】（５）　セレクティブ・ハイブリダイゼー
ション・トランスレーションの系を用いる方法形質転換
株から得られるｃＤＮＡを、ニトロセルロースフィルタ
ー等に転写し、ブタ膵臓からのｍＲＮＡをハイブリダイ
ズさせた後，ｃＤＮＡに結合したｍＲＮＡを解離させ、
回収する。回収されたｍＲＮＡを蛋白翻訳系、例えばア
フリカツメガエルの卵母細胞への注入や、ウサギ網状赤
血球ライゼートや小麦胚芽等の無細胞系で蛋白に翻訳さ
せ、その蛋白のブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩ活性を測定
するか、ブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩに対する抗体また
はブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩとも反応するブタ膵臓エ
ラスタ−ゼＩＩＩ類縁蛋白に対する抗体を用いてブタ膵
臓エラスタ−ゼＩＩＩを検出することにより、元の形質
転換株より目的のブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩをコード
するｃＤＮＡを有する株を選択する。

【００１３】得られた目的の形質転換株よりブタ膵臓エ
ラスタ−ゼＩＩＩをコードするＤＮＡを採取する方法は
、公知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．　ｅｔａｌ．、
“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　：ａ　ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ−２ｎｄ　ｅｄ．”Ｃｏｌ
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ　（１９８９）　）　に従い実施
できる。　例えば細胞よりプラスミドＤＮＡに相当する
画分を分離し、該プラスミドＤＮＡよりｃＤＮＡ領域を
切り出すことにより行える。この様にして得られるＤＮ
Ａの配列決定は、例えばマキサムーギルバートの化学修
飾法（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．　ａｎｄ　Ｇｉｌｂｅｒｔ
，Ｗ．、　“Ｍｅｔｏｄｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　
”、　６５、　４９９−５５９　（１９８０）　）、Ｍ
１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法
（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．ａｎｄ　Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．、
　Ｇｅｎｅ、　１９、　２６９−２７６　、（１９８２
））等により行うことができる。このようにしてクロー
ン化されたブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩをコードする遺
伝子を含む断片は、適当なベクターに再び組み込むこと
により、他の原核生物または真核生物の宿主細胞を形質
転換させることができる。さらに、これらのベクターに
適当なプロモーターおよび形質発現にかかわる配列を導
入することにより、それぞれの宿主細胞において同遺伝
子を発現させることが可能である。

【００１４】原核細胞の宿主としては、例えば大腸菌や
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）　等が
挙げられる。　目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形
質発現させるには、　宿主と適合し得る種由来のレプリ
コン、すなわち複製起点および調節配列を含んでいるプ
ラスミドベクタ−で宿主細胞を形質転換させればよい。またベクターは形質転換細胞に表現形質（表現型）の選
択性を付与することができる配列を持つことが望ましい
。例えば大腸菌としてはＫ−１２株等がよく用いられ、
　ベクターとしては一般にｐＢＲ３２２やｐＵＣ　系の
プラスミドがよく用いられるが、これに限定されず、公
知の各種の菌株およびベクターがいずれも利用できる。プロモーターとしては、大腸菌においてはトリプトファ
ン（ｔｒｐ）　プロモーター、　ラクトース（ｌａｃ）
　プロモーター、トリプトファン・ラクトース（ｔａｃ
）　プロモーター、リポプロテイン（ｌｐｐ）　プロモ
ーター、バクテリオファージ由来のラムダ（　λ）ＰＬ
　プロモーター、ポリペプチド鎖延長因子Ｔｕ（ｔｕｆ
Ｂ）プロモーター等が挙げられるが、これ以外のプロモ
ーターも本発明のブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩの産生に
使用することができる。枯草菌としては、例えば２０７
−２５株が好ましく、　ベクターとしてはｐＴＵＢ２２
８（Ｏｈｍｕｒａ，Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．（１９８４）　
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　９５，　８７−９３）等が用い
られるが、　これに限定されるものではない。　プロモ
ーターとしては、枯草菌のα−アミラーゼ遺伝子の調節
配列がよく用いられ、さらに必要によりα−アミラーゼ
のシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を連結
することにより、菌体外の分泌発現も可能となる。

【００１５】真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫
、酵母の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば
サルの細胞であるＣＯＳ　細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，ｙ．
（１９８１）　Ｃｅｌｌ　２３，　１７５−１８２）　
やチャイニーズ・ハムスター卵母細胞（ＣＨＯ）　のジ
ヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ａ
ｎｄ　Ｃｈａｓｉｎ、　Ｌ．Ａ．　　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　、７７、　４２１６−
４２２０（１９８０）　）等がよく用いられているが、
　これらに限定されるわけではない。脊椎動物細胞の発
現ベクターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上
流に位置するプロモーター，ＲＮＡのスプライス部位、
ポリアデニル化部位および転写終結配列等を有するもの
を使用でき、これはさらに必要により複製起点を有して
もよい。該発現ベクターの例としては，ＳＶ４０の初期
プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍ
ａｎｉ，Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．、　Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂ
ｉｏｌ．、　１、　８５４−８６４　（１９８１）　）
　等を例示できるが、　これに限定されない。また真核
微生物としては酵母が一般によく用いられており、　そ
の中でもサッカロミセス属酵母、例えばＳａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　　もしくは石油
酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）　等が好ましい
。　該酵母等の真核微生物の発現ベクターには、例えば
アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（Ｂｅｎｎ
ｅｔｚｅｎ，Ｊ．Ｌ．ａｎｄ　Ｈａｌｌ，Ｂ．Ｄ．（１
９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２５７，　３０１
８−３０２５）　や酸性フォスファターゼ遺伝子のプロ
モーター（Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ，Ａ．　ｅｔ　ａｌ．
、　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、
　８０、　１−５　（１９８３）　）　等を好ましく利
用できる。宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合を
例に挙げると、　発現ベクターとしては，ＳＶ４０複製
起点を有し、ＣＯＳ細胞において自立増殖が可能であり
、さらに転写プロモーター、転写終結シグナルおよびＲ
ＮＡスプライス部位を供えたものを用いることができる
。該発現ベクターはＤＥＡＥ−　デキストラン法（Ｌｕ
ｔｈｍａｎ，Ｈ．ａｎｄ　Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｇ．、
　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．、１１、　１２
９５−１３０８　（１９８３）　）　、リン酸カルシウ
ム−ＤＮＡ共沈澱法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ　
ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｄ，Ａ．Ｊ．、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
、　５２，　４５６−４５７（１９７３）　）および電
気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．
、　ＥＭＢＯ　Ｊ．、１、　８４１−８４５　（１９８
２）　）　等によりＣＯＳ　細胞に取り込ませることが
でき、　かくして所望の形質転換細胞を得ることができ
る。　また、　宿主細胞としてＣＨＯ　細胞を用いる場
合には、　発現ベクターと共に、Ｇ４１８耐性マーカー
として機能するｎｅｏ　遺伝子を発現し得るベクター、
例えばｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．　ｅｔ
　ａｌ．、　“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　
：ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ−２ｎｄ　
ｅｄ．”Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮＹ　（１９８９）
）やｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．ａ
ｎｄ　Ｂｅｒｇ，Ｐ．、　Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅ
ｎｅｔ．、　１、　３２７−３４１　（１９８２））等
をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを
選択することによりブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩを安定
に産生する形質転換細胞を得ることができる。上記で得
られる所望の形質転換体は、常法にしたがい培養するこ
とができ、該培養により細胞内または細胞外にエラスタ
−ゼＩＩＩが生産される。該培養に用いられる培地とし
ては、採用した宿主に応じて慣用される各種のものを適
宜選択でき、例えば上記大腸菌　Ｋ１２株であればＬＢ
培地や２×ＹＴ培地に必要に応じてアンピシリン、テト
ラサイクリン、クロラムフェニコール等の抗生物質を添
加したものを使用できる。

【００１６】上記により、形質転換体の細胞内または細
胞外に生産されるブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩは、該ブ
タ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩの物理的性質や化学的性質等
を利用した各種の公知の分離操作法により、それらより
分離・精製することができる。該方法としては、具体的
には例えば通常の蛋白沈澱剤あるいは蛋白可溶化剤によ
る処理、　限外濾過、　分子篩クロマトグラフィー（ゲ
ル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロ
マトグラフィー、透析法、これらの組み合わせなどを例
示できる。　　上記方法により、容易に高収率、高純度で所望のブ
タ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩを工業的規模で生産できる。このようにして得られる本発明の組換えブタ膵臓エラス
タ−ゼＩＩＩの諸性質は、下記実施例に詳述するとおり
である。

【００１７】また、本発明において、配列番号２で示さ
れるアミノ酸配列の＋１〜＋２５３中の１個またはそれ
以上のアミノ酸を欠くか、または前後に付加された蛋白
であって、ブタエラスタ−ゼＩＩＩ活性を有する限りそ
れらの蛋白およびそれらをコ−ドするＤＮＡは全て本発
明に含まれる。

【００１８】また各種の本発明のＤＮＡは、上記ブタ膵
臓エラスタ−ゼＩＩＩの情報に基づいて、例えば亜リン
酸アミダイト法（Ｓｉｎｈａ，Ｎ．Ｄ．　ｅｔａｌ．、
　Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．、　１２、４５３９
−４５５８　（１９８４）　）　等の常法に従い、　核
酸の化学合成により製造することもできる。なお、　所
望アミノ酸に対するコドンはそれ自体公知であり、その
選択も任意でよく、例えば利用する宿主のコドンの使用
頻度を考慮して常法に従い決定できる（Ｇｒａｎｔｈａ
ｍ，Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．、　Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒ
ｅｓ．、　９、　４３−７４　（１９８１）　）。

【００１９】

【実施例】以下実施例をあげて本発明を詳細に説明する
が、これらは本発明の範囲を制限するものではない。実
施例１．　　ブタ膵臓よりのｍＲＮＡの分離８　〜９ｇ
のブタ膵臓をグアニジンチオシアネート溶液（４Ｍのグ
アニジンチオシアネート，１％のサルコシル，２０ｍＭ
のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ），２５ｍＭのク
エン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）　，１００ｍＭ　の２
−メルカプトエタノール，０．１％のアンチフォームＡ
）中でポリトロンによって破壊、変性した後、遠心して
上澄を得た。これに０．０２５　倍量の１Ｍ酢酸および
０．７５倍量のエタノールを加え、ー２０　℃で数時間
冷却した後、遠心処理によって沈澱を得た。次にこの沈
澱をグアニジンハイドロクロライド溶液（７．５Ｍのグ
アニジンハイドロクロライド，２５ｍＭのクエン酸ナト
リウム（ｐＨ７．０）　，５ｍＭ　のジチオスレイトー
ル（ＤＴＴ）　）に懸濁し、０．０２５　倍量の１Ｍ酢
酸および０．５　倍量のエタノールを加え、−２０　℃
で数時間冷却した後、遠心処理を行なった。ここで得ら
れた沈澱をグアニジンハイドロクロライド溶液に再懸濁
し、酢酸、エタノールを加え、−２０　℃に冷却した後
、遠心処理で沈澱を集めた。次に、この沈澱をエタノー
ルで数回洗い、混在しているグアニジンハイドロクロラ
イドを除き、蒸留水に溶かした後にエタノールでＲＮＡ
　を沈澱させた。遠心分離により沈澱を集め，５３．９
ｍｇのＲＮＡ　を得た。こうして得たＲＮＡ　を高塩溶
液（０．５Ｍ　のＮａＣｌ，２０ｍＭ　のＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ　のＥＤＴＡ，０．１％　
のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））中でオリゴ（ｄ
Ｔ）セルロースカラムに吸着させた後、ホ゜リ（Ａ）を
含むｍＲＮＡを溶出溶液（１０ｍＭ　のＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ　のＥＤＴＡ，０．０５％の
ＳＤＳ）で溶出させ、５４０　μｇ　のｍＲＮＡを得た
。

【００２０】実施例２．　　ブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩ
ＩｃＤＮＡの特異的増幅ブタ膵臓ｍＲＮＡからのブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩｃ
ＤＮＡの特異的増幅はＰｏｗｅｌｌらのｃＤＮＡクロー
ニング法に基づいて行なった。上記で得たｍＲＮＡと逆
転写酵素とプライマー１を用いて、１００　μｌ　の反
応液（１μｇ　のｍＲＮＡ，１００ｐｍｏｌｅ　のプラ
イマー１，５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）
，５０ｍＭのＫＣｌ，２．５ｍＭ　のＭｇＣｌ２，０．
０２％　のゼラチン，２００μＭ　ずつのｄＧＴＰ，ｄ
ＡＴＰ，ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ，８４　ユニットの逆
転写酵素）中で４２℃で２０分間保温し、単鎖ｃＤＮＡ
を合成した。プライマー１としては、ヒト膵臓エラスタ
ーゼＩＩＩＢｍＲＮＡ（Ｔａｎｉ，Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．
、　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、　２６３、　１２３１
−１２３９　（１９８８）　）の３’非翻訳領域の相補
鎖の２１塩基オリゴヌクレオチド５’ｄ（ＧＣＣＡＧＣ
ＴＧＧＧＣＣＴＴＧＧＴＴＣＴＡ）を化学合成して用い
た（アプライドバイオシステムズ社製３８０Ｂ型合成機
）。反応終了後、１００ｐｍｏｌｅのプライマー２と２
．５　ユニットのＴａｑ　ポリメラーゼを上記反応液に
加えた。プライマー２としては、ヒト膵臓エラスターゼ
ＩＩＩＢｍＲＮＡ（Ｔａｎｉ，Ｔ．　ｅｔａｌ．（１９
８８）　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２６３，　１２３
１−１２３９）のシグナルペプチドをコードする領域の
２４塩基オリゴヌクレオチド５’ｄ（ＡＧＴＴＣＣＣＴ
ＣＣＴＣＣＴＴＧＴＧＧＣＣＧＴＴ）　を化学合成して
用いた（アプライドバイオシステムズ社製３８０Ｂ型合
成機）。上記反応液に対して９２℃で１　分間加熱した
後５５℃で２　分間保温し、さらに７２℃で３　分間保
温する操作を、プログラムインキュベーターを用いて３
０回繰り返した。この操作によってブタ膵臓エラスタ−
ゼＩＩＩをコードするｃＤＮＡを特異的に増幅した。こ
れをアガロースゲル電気泳動にて精製し、０．２　μｇ
　のｃＤＮＡを得た。ブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩをコ
ードするｃＤＮＡの塩基配列は、上記の様にして増幅し
たｃＤＮＡを直接鋳型として用いた直接決定法（Ｐｏｗ
ｅｌｌ，Ｌ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．、　Ｃｅｌｌ、５０、
　８３１−８４０　（１９８７））、および、実施例３
に記載の方法でプラスミドにクローニングしたｃＤＮＡ
を鋳型とした方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ
．、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ　ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ−２ｎｄ　ｅｄ．　”
Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、　ＮＹ　（１９８９）　）によって決定した
。その１次構造とそれがコードするアミノ酸配列を配列
表の配列番号１に示す。

【００２１】実施例３．ブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩ発
現ベクタ−の構築大腸菌を宿主とした発現ベクターｐＥＬＥ００１　の構
築法を図１に示した。発現ベクタにはラクトースプロモ
ーターを含むｐＵＣ８（Ｊ．Ｖｉｅｉｒａ．ら、　Ｇｅ
ｎｅ、　１９、　２５９　（１９８２））　を使用した
。上記の様にして得られたブタ膵臓エラスターゼＩＩＩ
ｃＤＮＡを鋳型として１００　μｌ　の反応液（１０ｎ
ｇ　のｃＤＮＡ，１００ｐｍｏｌｅ　のプライマー１と
プライマー３，５０ｍＭ　のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８
．８），５０ｍＭのＫＣｌ，２．５ｍＭ　のＭｇＣｌ　
　，０．０２％　のゼラチン，２００μＭ　ずつのｄＧ
ＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ，２．５ユニ
ットのＴａｑ　ポリメラーゼ）　中で９２℃で１　分間
加熱した後５５℃で２　分間保温し、さらに７２℃で３
　分間保温する操作を、プログラムインキュベーターを
用いて３０回繰り返した。プライマー１としては、ヒト
膵臓エラスターゼＩＩＩＢｍＲＮＡ（Ｔａｎｉ，Ｔ．　
ｅｔ　ａｌ．、　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、　２６３
、　１２３１−１２３９　　（１９８８））の３’非翻
訳領域の相補鎖の２１塩基オリゴヌクレオチド５’ｄ（
ＧＣＣＡＧＣＴＧＧＧＣＣＴＴＧＧＴＴＣＴＡ）を化学
合成して用いた。プライマー３としては、ヒト膵臓エラ
スターゼＩＩＩＢのＮ−末端７　アミノ酸をコードする
２１塩基と制限酵素ＳｍａＩ認識部位５’ｄ（ＣＣＣＧ
ＧＧ）　からなるオリゴヌクレオチド５’ｄ（ＣＣＣＧ
ＧＧＴＴＧＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＧＧＡＴＧＣＧ）　を
化学合成して用いた。この操作によってブタ膵臓エラス
タ−ゼＩＩＩをコードするｃＤＮＡの５’末端にＳｍａ
Ｉ認識部位を付加した７５２　塩基対のｃＤＮＡを特異
的に増幅した。これをＳｍａＩで消化し、アガロースゲ
ル電気泳動にて精製し、０．２μｇ　のｃＤＮＡを得た
。このｃＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣ８のＳｍａＩ切
断部位に、Ｔ４　リガーゼを用いて組み込んだ。この様
にして構築したプラスミドを用いて、大腸菌ＹＡ２１株
（Ｆ−，λ−，ｌｅｕ，ｍｅｔ，ｒｅｌＡ）　形質転換
した。いくつかの形質転換株からプラスミドを抽出し、
ＳｍａＩ，ＨｉｎｄＩＩＩによる制限酵素マッピングに
よって、ｃＤＮＡの転写の方向とラクトースプロモータ
ーの転写方向が一致しているものを選択した。このブタ
膵臓エラスタ−ゼＩＩＩ発現ベクターをｐＥＬＥ００１
　と命名した（図１）。ｐＥＬＥ００１　中のプロテー
アゼＥｃＤＮＡの５’末端付近の塩基配列とアミノ酸配
列は、次のようになる。　　したがって、ｐＥＬＥ００１　によって発現される
ブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩは成熟体のＮ−末端側にβ
−ガラクトシダーゼ遺伝子との結合により生じる７　個
のアミノ酸が付加した融合タンパク質になる。

【００２２】実施例４．培養菌体中のブタ膵臓エラスタ
−ゼＩＩＩ活性の検出次に、ｐＥＬＥ００１　で形質転換した大腸菌ＹＡ２１
株によるブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩの生産を確認した
。ｐＥＬＥ００１　で形質転換したＹＡ２１株を、　２
×ＴＹーアンピシリン培地（１．６％のバクトトリプト
ン，１％のイーストエキストラクト，０．５％のＮａＣ
ｌ，５０μｇ／ｍｌのアンピシリン）に接種し、３７℃
、１５　時間培養した。　培養後、　培養液を遠心して
菌体を集め、５×１０　　細胞相当量の菌体を１０μｌ
　のＳＤＳ　溶液（２％のＳＤＳ，５％の２−メルカプ
トエタノール，１０％のグリセリン，６０ｍＭ　のＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８））に懸濁し、１００　℃，
５分間加熱した後、Ｌａｅｍｍｌｉらの方法（Ｎａｔｕ
ｒｅ，２２７，６８０（１９７０））に従ってＳＤＳー
ポリアクリルアミド電気泳動し、生産されているタンパ
ク質を解析した。その結果、分子量が約　２７，０００
　のブタ膵臓エラスタ−ゼに相当する蛋白がＹＡ２１株
の全蛋白質の　８　　％生産されていた。ブタ膵臓エラ
スタ−ゼＩＩＩ融合タンパク質は菌体内でインクルージ
ョンボディーを形成しているので比較的容易に精製する
ことができた。ｐＥＬＥ００１　で形質転換したＹＡ２
１株の培養液１ｌより、インクルージョンボディーを形
成している菌体が湿菌体として５ｇ得られた。得られた
菌体はＥＤＴＡ−　リゾチーム法（Ｔ．Ｍｉｕｒａら，
Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９３，
２６８（１９６９）　によって破壊した。　すなわち、
　得られた菌体５ｇをスフェロプラスト化反応液（　水
３５．５ｍｌ，０．１Ｍ　のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８
．３，４℃）２０ｍｌ，２ＭのＳｕｃｒｏｓｅ１８ｍｌ
，１％のＥＤＴＡ（ＰＨ７．０）３．５ｍｌ，０．５％
のリゾチーム３．５ｍｌ）に懸濁し、３０℃で１　時間
放置する。高速遠心分離（１５，０００　×ｇ、２０分間）　でス
フェロプラストを集め，２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（
ｐＨ８．０）３００ｍｌに懸濁して破裂させた。これに
１ＭのＭｇＣｌ　３ｍｌと１０ｍｇ／ｍｌ　のＤＮａｓ
ｅＩ０．２ｍｌ　を加え溶出したＤＮＡを分解した。未
破壊の菌体を、低速遠心分離（１，５００×ｇ、１０分
間）　にて除去した後、　高速遠心分離（１８，０００
　×ｇ、２０分間）　にてインクルージョンボディーを
沈澱として回収した。このインクルージョンボディーに
はまだ菌体断片が多量に含まれているので、トライトン
Ｘ−１００　溶液（１％　のトライトンＸ−１００，５
０ｍＭ　のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ　
のＥＤＴＡ）　に懸濁した後、高速遠心分離（１８，０
００　×ｇ、　２０　分間）　にてインクルージョンボ
ディーを洗浄した。洗浄したインクルージョンボディー
は、１ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０）　緩衝液に懸濁して低温で保存した。このようにして精製することにより２００ｍｇ　のイン
クルージョンボディーが得られ、これには約６０％　の
ブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩ融合タンパク質が含有され
ていた。また、ｐＥＬＥ００１　で形質転換したＹＡ２
１株により生産されたインクルージョンボディーがブタ
膵臓エラスタ−ゼＩＩＩ融合タンパク質であることは、
抗ヒトエラスタ−ゼＩＩＩＢ抗体を用いたイムノブロッ
ティング（Ｉｍｍｕｎｏ−ｂｌｏｔｔｉｎｇ）　にて確
認した。このようにして得た不溶性ブタ膵臓エラスタ−
ゼＩＩＩは、８Ｍ尿素／５０ｍＭ　　　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０）／１ｍＭ　　　還元グルタチオン中に
て室温で３　時間緩やかに撹拌することにより溶解した
。可溶化したブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩタンパク質は
４　℃に冷却後、１２５ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ９．０）／３１３ｍＭ　　　ＭｇＣｌ　／２．５ｍＭ
　還元グルタチオンにて５倍希釈し、４　℃で１６時間
冷却することによりその高次構造を回復させた。これを
２０倍量の２５ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０
）　に透析するか、または２５ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０）　で平衡化したセファデックスＧ−２
５（ファルマシア社製）でゲル濾過することによって、
尿素を除去した。このブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩ融合
タンパク質はまだ酵素的には不活性であり、活性発現に
はトリプシンによる処理を必要とした。インクルージョ
ンボディーと等量のトリプシンを添加し４　℃で２０分
間反応させた後、残存するトリプシンなどを除去するた
めに、このブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩ混合液を２５ｍ
ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）　で平衡化した陰
イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−セファロース（フ
ァルマシア社製））に吸着させ、０Ｍから１ＭのＮａＣ
ｌの直線濃度勾配の溶離液による溶出によって、精製ブ
タ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩ標品を得た。

【００２３】こうして、得られたエラスタ−ゼＩＩＩの
合成基質に対する切断活性は天然のブタ膵臓プロテア−
ゼＥのそれとも良く一致していた（表１）。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　表
　　　　１−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　相対活性（％）　　　　　　　
　　　　　基　　　　　　質　　　　　　　　　　　　
　　　　　　−−−−−−−−−−−−−−−−　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　天然型　　　　　　組換
え体　　　　　　　　　　−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−　　　
　　　　ＭｅＯＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａ
ｌ−ｐＮＡ　　　　　　　　　１００　　　　　　　　
１００　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｓｕｃ−Ａ
ｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ｐＮＡ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　８８　　　　　　　　　　７４　　　　
　　　　　　　　　　　　　Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−
Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ｐＮＡ　　　　　　　　　　　　　　
６４　　　　　　　　　　５９　　　　　　　　　　　
　　　　　　Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐＮＡ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　２６　　　　　
　　　　　１９　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｓ
ｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−ｐＮＡ　　　
　　　　　　　　　　　１６　　　　　　　　　　１０
　　　　　　　　　　−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−　　ただし
、表中　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　ＭｅＯＳｕｃ　＝Ｍ
ｅｔｈｏｘｙ　Ｓｕｃｃｉｎｙｌ、　Ａｌａ＝Ａｌａｎ
ｙｌ、　Ｐｒｏ＝Ｐｒｏｌｙｌ、　　　　　　　　　　
　　　　　　　Ｖａｌ＝Ｖａｌｙｌ　、　Ｓｕｃ＝Ｓｕ
ｃｃｉｎｙｌ、　Ｌｅｕ＝Ｌｅｕｃｙｌ、　Ｍｅｔ＝Ｍ
ｅｔｈｉｏｎｙｌ　、　　　　　　　　　　　ｐＮＡ＝
ｐ−Ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ、　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　を示す。

【００２４】

【発明の効果】本発明のブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩは
、胆汁酸分泌促進剤または肝臓機能改善剤として利用が
期待される。

【００２５】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：７６２配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡハイポセティカ
ル：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ起源生物名：Ｓｕｓ　ｓｃｒｏｆａ組織の種類：膵臓配列の特徴１−２５３　Ｅ　ＣＤＳＴＧＴ　ＧＧＣ　ＣＧＡ　ＣＣＴ　ＴＣＣ　ＴＡＣ　Ａ
ＡＣ　ＣＣＣ　ＧＣＣ　ＴＣＣ　ＣＧＣ　ＧＴＴ　ＧＴ
Ｃ　ＡＡＴ　ＧＧＧ　ＧＡＧ　　　　　　　４８Ｃｙｓ
　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　
Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａ
ｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　　　　　１　　　　　　　　　
　　　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　　
１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５　　　
　　　　ＧＡＣ　ＧＣＧ　ＧＴＣ　ＣＣＣ　ＴＡＣ　Ａ
ＧＴ　ＴＧＧ　ＣＣＣ　ＴＧＧ　ＣＡＧ　ＧＴＣ　ＴＣ
Ｔ　ＣＴＧ　ＣＡＡ　ＴＡＴ　ＧＡＡ　　　　　　　９
６Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　
Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌ
ｅｕ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　　　　　　　　　　　
　　　　　２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　
２５　　　　　　　　　　　　　　　　　　３０　　　
　　　　　　　　ＡＡＧ　ＡＡＣ　ＧＧＡ　ＧＴＣ　Ｔ
ＴＣ　ＣＡＧ　ＣＡＴ　ＡＣＣ　ＴＧＴ　ＧＧＡ　ＧＧ
Ｃ　ＡＧＣ　ＣＴＣ　ＡＴＣ　ＧＣＣ　ＣＣＴ　　　　
　　１４４Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　
Ｇｌｎ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓ
ｅｒ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　　　　　　　
　　　　　３５　　　　　　　　　　　　　　　　　　
４０　　　　　　　　　　　　　　　　　　４５　　　
　　　　　　　　　　　　ＧＡＣ　ＴＧＧ　ＧＴＣ　Ｃ
ＴＡ　ＡＣＴ　ＧＣＡ　ＧＧＣ　ＣＡＣ　ＴＧＣ　ＡＴ
Ｃ　ＴＣＧ　ＡＧＣ　ＴＣＣ　ＣＴＧ　ＡＣＣ　ＴＡＣ
　　　　　　１９２Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　
Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　Ｉｌｅ　Ｓ
ｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　　　
　　　　　５０　　　　　　　　　　　　　　　　　　
５５　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　ＣＡＧ　ＧＴＧ　Ｇ
ＴＧ　ＴＴＧ　ＧＧＣ　ＧＡＧ　ＴＡＴ　ＧＡＣ　ＣＧ
Ｃ　ＴＣＴ　ＧＡＧ　ＡＡＴ　ＧＡＧ　ＧＧＣ　ＴＴＣ
　ＧＡＡ　　　　　　２４０Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　
Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｓ
ｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｇｌ
ｕ　　　　６５　　　　　　　　　　　　　　　　　　
７０　　　　　　　　　　　　　　　　　　７５　　　
　　　　　　　　　　　　　　　８０　　　ＣＡＧ　Ｇ
ＴＧ　ＡＴＣ　ＣＣＣ　ＡＴＣ　ＡＡＴ　ＧＣＴ　ＧＧ
Ｇ　ＧＡＣ　ＣＴＣ　ＴＴＣ　ＧＴＧ　ＣＡＣ　ＣＣＡ
　ＣＧＣ　ＴＧＧ　　　　　　２８８Ｇｌｎ　Ｖａｌ　
Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａ
ｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ａｒ
ｇ　Ｔｒｐ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
８５　　　　　　　　　　　　　　　　　　９０　　　
　　　　　　　　　　　　　　　９５　　　　　　　Ａ
ＡＴ　ＴＣＣ　ＡＡＣ　ＴＧＣ　ＧＴＧ　ＴＣＣ　ＴＧ
Ｔ　ＧＧＣ　ＡＡＴ　ＧＡＣ　ＡＴＴ　ＧＣＣ　ＣＴＣ
　ＧＴＣ　ＡＡＧ　ＣＴＣ　　　　　　３３６Ａｓｎ　
Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｇ
ｌｙ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｖａ
ｌ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　　　　　　　　　　　　　　　１
００　　　　　　　　　　　　　　　　　１０５　　　
　　　　　　　　　　　　　　１１０　　　　　　　　
　　　ＴＣＧ　ＣＧＣ　ＡＧＣ　ＧＣＣ　ＣＡＧ　ＣＴ
Ｇ　ＧＧＡ　ＧＡＣ　ＡＡＧ　ＧＴＣ　ＣＡＧ　ＣＴＧ
　ＧＣＣ　ＴＧＴ　ＣＴＣ　ＣＣＴ　　　　　　３８４
Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｇ
ｌｙ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ａｌ
ａ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　　　　　　　　　　　１
１５　　　　　　　　　　　　　　　　　１２０　　　
　　　　　　　　　　　　　　１２５　　　　　　　　
　　　　　　　ＣＣＣ　ＧＣＣ　ＧＧＴ　ＧＡＣ　ＡＴ
Ｃ　ＣＴＧ　ＣＣＣ　ＡＡＴ　ＧＡＴ　ＡＣＣ　ＣＣＣ
　ＴＧＣ　ＴＡＣ　ＡＴＣ　ＡＧＣ　ＧＧＣ　　　　　
　４３２Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｌ
ｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｃｙ
ｓ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　　　　　　　１
３０　　　　　　　　　　　　　　　　　１３５　　　
　　　　　　　　　　　　　　１４０　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　ＴＧＧ　ＧＧＣ　ＣＧＴ　ＣＴ
Ｃ　ＴＡＣ　ＡＣＣ　ＡＡＴ　ＧＧＧ　ＣＣＡ　ＣＴＣ
　ＣＣＧ　ＧＡＣ　ＡＡＧ　ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　
　　　　　４８０Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔ
ｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｐｒ
ｏ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　　　１
４５　　　　　　　　　　　　　　　　　１５０　　　
　　　　　　　　　　　　　　１５５　　　　　　　　
　　　　　　　　　１６０　　　ＧＣＴ　ＣＴＧ　ＣＴ
Ｇ　ＣＣＣ　ＧＴＧ　ＧＴＧ　ＧＡＣ　ＴＡＣ　ＣＡＧ
　ＣＡＣ　ＴＧＣ　ＴＣＣ　ＡＡＧ　ＴＧＧ　ＧＡＣ　
ＴＧＧ　　　　　　５２８Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐ
ｒｏ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎ　Ｈｉ
ｓ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１６５　　　
　　　　　　　　　　　　　　１７０　　　　　　　　
　　　　　　　　　１７５　　　　　　　ＴＧＧ　ＧＧ
Ｃ　ＡＧＣ　ＡＣＣ　ＧＴＧ　ＡＡＧ　ＣＡＧ　ＡＣＣ
　ＡＴＧ　ＧＴＧ　ＴＧＴ　ＧＣＣ　ＧＧＣ　ＧＧＧ　
ＧＡＣ　ＡＴＣ　　　　　　５７６Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｓ
ｅｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｍｅ
ｔ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ
　Ｉｌｅ　　　　　　　　　　　　　　　１８０　　　
　　　　　　　　　　　　　　１８５　　　　　　　　
　　　　　　　　　１９０　　　　　　　　　　　ＣＧ
Ｃ　ＴＣＴ　ＧＧＡ　ＴＧＣ　ＡＡＴ　ＧＧＴ　ＧＡＣ
　ＴＣＴ　ＧＧＡ　ＧＧＡ　ＣＣＣ　ＣＴＣ　ＡＡＣ　
ＴＧＣ　ＣＣＧ　ＧＣＡ　　　　　　６２４Ａｒｇ　Ｓ
ｅｒ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｓｅ
ｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ
　Ｐｒｏ　Ａｌａ　　　　　　　　　　　１９５　　　
　　　　　　　　　　　　　　２００　　　　　　　　
　　　　　　　　　２０５　　　　　　　　　　　　　
　　ＧＣＡ　ＧＡＴ　ＧＧＣ　ＴＣＣ　ＴＧＧ　ＣＡＧ
　ＧＴＣ　ＣＡＣ　ＧＧＣ　ＧＴＧ　ＡＣＣ　ＡＧＣ　
ＴＴＣ　ＧＴＴ　ＴＣＴ　ＧＣＣ　　　　　　６７２Ａ
ｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｎ　Ｖａ
ｌ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ
　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　　　　　　　２１０　　　
　　　　　　　　　　　　　　２１５　　　　　　　　
　　　　　　　　　２２０　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　ＴＡＴ　ＧＧＣ　ＴＧＴ　ＡＡＣ　ＡＣＣ
　ＣＴＣ　ＡＡＧ　ＡＡＧ　ＣＣＣ　ＡＣＡ　ＧＴＧ　
ＴＴＣ　ＡＣＧ　ＣＧＣ　ＡＣＣ　ＴＣＡ　　　　　　
７２０Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｌｅ
ｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ
　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　　　２２５　　　
　　　　　　　　　　　　　　２３０　　　　　　　　
　　　　　　　　　２３５　　　　　　　　　　　　　
　　　　２４０　　　ＧＣＣ　ＴＴＣ　ＡＴＴ　ＧＡＴ
　ＴＧＧ　ＡＴＴ　ＧＡＡ　ＧＡＧ　ＡＴＣ　ＡＴＴ　
ＧＣＡ　ＡＧＣ　ＣＡＣ　ＴＡＧ　　　　　　　　　　
　　　　７６２Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｔｒ
ｐ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ａｌａ
　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　２４５　　　　　　　　　　　　　　　　　２
５０　　　　　　　　　　　　　　　　　配列番号：２配列の長さ：２５３配列の型：アミノ酸トポロジ−直鎖状配列の種類：タンパク質ハイポセティカル：Ｙｅｓ起源生物名：Ｓｕｓ　ｓｃｒｏｆａ組織の種類：膵臓配列の特徴：　１−２５３　Ｅ　ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｅｌａｓｔ
ａｓｅ　ＩＩＩ　ｚｙｍｏｇｅｎ１２−２５３　Ｅ　ｐ
ａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｅｌａｓｔａｓｅ　ＩＩＩＣｙｓ
　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　
Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａ
ｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　　　１　　　　　　　　　　　
　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５　　　　　
Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｔ
ｒｐ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｅ
ｕ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　　　　　　　　　　　　
　　２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５　
　　　　　　　　　　　　　　　　　３０　　　　　　
　　　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｇｌ
ｎ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ
　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　　　　　　　　　
　３５　　　　　　　　　　　　　　　　　　４０　　
　　　　　　　　　　　　　　　　４５　　　　　　　
　　　　　　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ
　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　
Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　　　　　　
５０　　　　　　　　　　　　　　　　　　５５　　　
　　　　　　　　　　　　　　　６０　　　　　　　　
　　　　　　　　　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　
Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇ
ｌｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　　６
５　　　　　　　　　　　　　　　　　　７０　　　　
　　　　　　　　　　　　　　７５　　　　　　　　　
　　　　　　　　　８０　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｐ
ｒｏ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｌｅ
ｕ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　８５　　　　　
　　　　　　　　　　　　　９０　　　　　　　　　　
　　　　　　　　９５　　　　　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｓ
ｎ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ
　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　
Ｌｅｕ　　　　　　　　　　　　　１００　　　　　　
　　　　　　　　　　　１０５　　　　　　　　　　　
　　　　　　１１０　　　　　　　　　Ｓｅｒ　Ａｒｇ
　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　
Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｌ
ｅｕ　Ｐｒｏ　　　　　　　　　１１５　　　　　　　
　　　　　　　　　　１２０　　　　　　　　　　　　
　　　　　１２５　　　　　　　　　　　　　Ｐｒｏ　
Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａ
ｓｎ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｉｌ
ｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　　　　　１３０　　　　　　　　
　　　　　　　　　１３５　　　　　　　　　　　　　
　　　　１４０　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｔ
ｒｐ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓ
ｎ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ
　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　１４５　　　　　　　　　
　　　　　　　　１５０　　　　　　　　　　　　　　
　　　１５５　　　　　　　　　　　　　　　　　１６
０　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｖａｌ
　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎ　Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　
Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　　　　　　　　　　
　　　　　　　１６５　　　　　　　　　　　　　　　
　　１７０　　　　　　　　　　　　　　　　　１７５
　　　　　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　
Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ａ
ｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　　　　　　　
　　　　　　１８０　　　　　　　　　　　　　　　　
　１８５　　　　　　　　　　　　　　　　　１９０　
　　　　　　　　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ａ
ｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒ
ｏ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　　　　
　　　　　１９５　　　　　　　　　　　　　　　　　
２００　　　　　　　　　　　　　　　　　２０５　　
　　　　　　　　　　　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｓｅ
ｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ
　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　
　　　　２１０　　　　　　　　　　　　　　　　　２
１５　　　　　　　　　　　　　　　　　２２０　　　
　　　　　　　　　　　　　　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ
　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　
Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｓ
ｅｒ　２２５　　　　　　　　　　　　　　　　　２３
０　　　　　　　　　　　　　　　　　２３５　　　　
　　　　　　　　　　　　　２４０　Ａｌａ　Ｐｈｅ　
Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｉ
ｌｅ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　　　　　　　
　　　　　　　　　　２４５　　　　　　　　　　　　
　　　　　２５０

【図面の簡単な説明】

【図１】　　本発明の実施例３に従うブタ膵臓エラスタ
−ゼＩＩＩ発現プラスミド構築の概略図を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配
列のうち、アミノ酸番号１２〜２５３までの部分的アミ
ノ酸配列を含有するブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩ活性を
有する蛋白。
【請求項２】配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配
列のうち、アミノ酸番号１〜２５３までの部分的アミノ
酸配列を含有するブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩ活性を有
する蛋白。
【請求項３】配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配
列のうち、アミノ酸番号１〜１１までの部分的アミノ酸
配列を含有するオリゴペプチドと、アミノ酸番号１２〜
２５３までの部分的アミノ酸配列を含有するポリペプチ
ドがジスルフィド結合によって結合した、ブタ膵臓エラ
スタ−ゼＩＩＩ活性を有する蛋白。
【請求項４】配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配
列のうち、アミノ酸番号１２〜２５３までのアミノ酸配
列で表されるブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩ活性を有する
蛋白。
【請求項５】配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配
列のうち、アミノ酸番号１〜２５３までのアミノ酸配列
で表されるブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩＩ活性を有する蛋
白。
【請求項６】配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配
列のうち、アミノ酸番号１〜１１までのアミノ酸配列で
表されるオリゴペプチドと、アミノ酸番号１２〜２５３
までのアミノ酸配列で表されるポリペプチドがジスルフ
ィド結合によって結合した、ブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩ
Ｉ活性を有する蛋白。
【請求項７】Ｎ末端に水素原子またはＭｅｔを有する、
請求項１、２、４または５記載の蛋白。
【請求項８】オリゴペプチドまたはポリペプチドのＮ末
端に水素原子またはＭｅｔを有する、請求項３または６
記載の蛋白。
【請求項９】請求項１記載のブタ膵臓エラスタ−ゼＩＩ
Ｉ活性を有する蛋白をコードするＤＮＡ。
【請求項１０】請求項２記載のブタ膵臓エラスタ−ゼＩ
ＩＩ活性を有する蛋白をコードするＤＮＡ。
【請求項１１】請求項３記載のオリゴペプチドとポリペ
プチド活性を有する蛋白をコードするＤＮＡ。
【請求項１２】請求項４記載のブタ膵臓エラスタ−ゼＩ
ＩＩ活性を有する蛋白をコードするＤＮＡ。
【請求項１３】請求項５記載のブタ膵臓エラスタ−ゼＩ
ＩＩ活性を有する蛋白をコードするＤＮＡ。
【請求項１４】請求項６記載のオリゴペプチドとポリペ
プチド活性を有する蛋白をコードするＤＮＡ。
【請求項１５】請求項７記載の蛋白をコードするＤＮＡ
。
【請求項１６】請求項８記載の蛋白をコードするＤＮＡ
。
【請求項１７】配列表の配列番号１に示される塩基配列
のうち、ヌクレオチド番号１から７５９までの塩基配列
またはそれと同効の塩基配列を含有する請求項９または
１２記載のＤＮＡ。
【請求項１８】配列表の配列番号１に示される塩基配列
のうち、ヌクレオチド番号３４から７５９までの塩基配
列またはそれと同効の塩基配列を含有する請求項１０ま
たは１３記載のＤＮＡ。
【請求項１９】配列表の配列番号１に示される塩基配列
のうち、ヌクレオチド番号１から３３までの塩基配列ま
たはそれと同効の塩基配列、および、ヌクレオチド番号
３４から７５９までの塩基配列またはそれと同効の塩基
配列を含有する請求項１１または１４記載のＤＮＡ。
【請求項２０】請求項１７記載のＤＮＡの５’末端にＡ
ＴＧを有するＤＮＡ。
【請求項２１】請求項１８記載のＤＮＡの５’末端にＡ
ＴＧを有するＤＮＡ。
【請求項２２】請求項１９記載のＤＮＡのいずれかまた
は両方の５’末端にＡＴＧを有するＤＮＡ。
【請求項２３】請求項９、１０、１１、１２、１３、１
４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または
２２記載のＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ発現ベクター
。
【請求項２４】請求項２３記載の組み換えＤＮＡ発現ベ
クターで形質転換せしめた宿主。
【請求項２５】請求項２４記載の宿主が、大腸菌、枯草
菌、酵母、植物細胞、昆虫細胞または動物細胞である宿
主。