JP2595206B2 - 酸化耐性ミユーテイン - Google Patents
酸化耐性ミユーテインInfo
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- JP2595206B2 JP2595206B2 JP61007216A JP721686A JP2595206B2 JP 2595206 B2 JP2595206 B2 JP 2595206B2 JP 61007216 A JP61007216 A JP 61007216A JP 721686 A JP721686 A JP 721686A JP 2595206 B2 JP2595206 B2 JP 2595206B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
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- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
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- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
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- Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、酸化に対して耐性を有する変形された蛋
白質、すなわち酸化−寛容性蛋白質を提供するための組
換技法の使用に関する。さらに詳しくは、この発明は十
分な生物学的活性を保持しているが、しかし酸化に対し
て特に感受性の特定のメチオニンに代る保存的アミノ酸
置換を含有する蛋白質を提供することにある。
白質、すなわち酸化−寛容性蛋白質を提供するための組
換技法の使用に関する。さらに詳しくは、この発明は十
分な生物学的活性を保持しているが、しかし酸化に対し
て特に感受性の特定のメチオニンに代る保存的アミノ酸
置換を含有する蛋白質を提供することにある。
異る蛋白質が精製の過程で種々の程度の変形を受ける
ことはよく知られているが、しかし十分には理解されて
いない。ある蛋白質が熱分解又は蛋白質分解酵素による
開裂に対して一般に感受性であり、他の蛋白質が酸化を
含む化学的変形に対してそれらを特に感受性にする位置
に反応性アミノ酸側鎖を含有することが知られている。
一般に、このような変形が生ずる程度をアミノ酸配列か
ら予想することは不可能である。
ことはよく知られているが、しかし十分には理解されて
いない。ある蛋白質が熱分解又は蛋白質分解酵素による
開裂に対して一般に感受性であり、他の蛋白質が酸化を
含む化学的変形に対してそれらを特に感受性にする位置
に反応性アミノ酸側鎖を含有することが知られている。
一般に、このような変形が生ずる程度をアミノ酸配列か
ら予想することは不可能である。
この問題は、蛋白質の精製のための通常の製造的方法
が少量の不純物を検出し又は分離する分解能を有しない
ために、妥協されている。電気泳動、ゲル過、及びイ
オン交換クトマトグラフィーのごとき一般に使用される
均一性に係る技法及び基準は、逆相高性能液体クロマト
グラフィー（RP−HPLC）のごとき一層鋭敏な分析技法に
よってその存在が示される少量の汚染物質の存在を明ら
かにすることができない。
が少量の不純物を検出し又は分離する分解能を有しない
ために、妥協されている。電気泳動、ゲル過、及びイ
オン交換クトマトグラフィーのごとき一般に使用される
均一性に係る技法及び基準は、逆相高性能液体クロマト
グラフィー（RP−HPLC）のごとき一層鋭敏な分析技法に
よってその存在が示される少量の汚染物質の存在を明ら
かにすることができない。
Floor,E.等，Anal.Biokhem.（1980）101:498−503は
この問題の例示を記載している。神経伝達性を有するウ
ンデカプロテイン、すなわち、空気に暴露された希溶液
中でメチオニンスルホキシドに酸化されるカルボキシ末
端メチオニンを含有する物質Ｐは、イオン交換カラムか
ら単一ピークとして溶出するが、しかしRP−HPLCにかけ
られた場合スルホキシド含有汚染の存在を示す。同様
に、Frelinger,A.L.等、J.Biol.Chem.（1984）256:5507
−5513は、常用の基準により均一であるように見えるウ
シ副甲状腺ホルモンが、スルホキシドに酸化された１方
又は両方のメチオニン残基を有する配列を含有すること
がRP−HPLCによって示され得ることを明らかにした。こ
れらの蛋白質は、酸化されたメチオニン残基の数に直接
相関する順序でRP−HPLCから溶出された。
この問題の例示を記載している。神経伝達性を有するウ
ンデカプロテイン、すなわち、空気に暴露された希溶液
中でメチオニンスルホキシドに酸化されるカルボキシ末
端メチオニンを含有する物質Ｐは、イオン交換カラムか
ら単一ピークとして溶出するが、しかしRP−HPLCにかけ
られた場合スルホキシド含有汚染の存在を示す。同様
に、Frelinger,A.L.等、J.Biol.Chem.（1984）256:5507
−5513は、常用の基準により均一であるように見えるウ
シ副甲状腺ホルモンが、スルホキシドに酸化された１方
又は両方のメチオニン残基を有する配列を含有すること
がRP−HPLCによって示され得ることを明らかにした。こ
れらの蛋白質は、酸化されたメチオニン残基の数に直接
相関する順序でRP−HPLCから溶出された。
最近、Rosenberg,S.等、Nature（1984）312:77−80
は、活性部位のメチオニンの代りにバリン残基を含有
し、そして有意な生物学的活性を保持している変異され
たヒトα−１抗−トリプシンを酵母中で生産した。この
置換は、肺におけるα−１抗−トリプシンの保護機能を
破壊する、前記メチオニンの酸化によって生ずる、エラ
スターゼに対する阻害活性の観察される低下を防止する
ために行われた。このバリン置換は、天然の抗トリプシ
ンとは異り、白血球により放出されるか又はタバコの煙
中に存在するものと同様の化学酸化剤による酸化に対し
て耐性を有する活性な抗−トリプシンをもたらした。従
って、この置換により、投与を必要とする抗−トリプシ
ンのレベルを低下せしめることができると信じられた。
Carrell,R.,Nature（1984）312:77−80は、α−抗トリ
プシン変異体、例えばメチオニンがバリンによって置換
されたRosenbergの変異体の使用を開示している。Trans
gene S.Aはα−抗トリプシンのメチオニンをアルギニン
により置き変えた（1985年５月20発表）。
は、活性部位のメチオニンの代りにバリン残基を含有
し、そして有意な生物学的活性を保持している変異され
たヒトα−１抗−トリプシンを酵母中で生産した。この
置換は、肺におけるα−１抗−トリプシンの保護機能を
破壊する、前記メチオニンの酸化によって生ずる、エラ
スターゼに対する阻害活性の観察される低下を防止する
ために行われた。このバリン置換は、天然の抗トリプシ
ンとは異り、白血球により放出されるか又はタバコの煙
中に存在するものと同様の化学酸化剤による酸化に対し
て耐性を有する活性な抗−トリプシンをもたらした。従
って、この置換により、投与を必要とする抗−トリプシ
ンのレベルを低下せしめることができると信じられた。
Carrell,R.,Nature（1984）312:77−80は、α−抗トリ
プシン変異体、例えばメチオニンがバリンによって置換
されたRosenbergの変異体の使用を開示している。Trans
gene S.Aはα−抗トリプシンのメチオニンをアルギニン
により置き変えた（1985年５月20発表）。
α−１抗−トリプシンにおけるように活性部位に又は
その近傍にメチオニンが位置し、そして生物学的活性の
ために明らかに非常に重要である場合、スルホキシドへ
のその酸化は不利であると予想されよう。しかしなが
ら、活性部位に存在しない幾つかのメチオニン残基を含
有する蛋白質の精製過程での残基の酸化効果は明らかで
ない。酸化されたメチオニン残基を含有する多数の酵素
のデータは、この酸化が活性に対して種々の程度の負の
効果を与えることを示す。少なくとも、得られる推定上
純粋な蛋白質は、もし酸化形が分離除去されなければ、
汚染物を含有し、そしてそれ故に均一ではないであろ
う。このような汚染物の存在の効果は、例えば蛋白質医
薬製剤においては、望ましくない。さらに、酸化された
メチオニンの存在は、目的蛋白質中の他の構造的変化、
例えば溶解性の低下、プロテアーゼ感受性の増加、又は
必要なジスルフイド結合の形成の阻害を惹起し、今度は
これが追加の副効果、例えば二量体又は高度集合体の形
成をもたらすであろう。これらが相まって、不純物のこ
の集まりは、非経腸的に投与された蛋白質のしばしば観
察される免疫原性、又は他の不都合な生理学的反応を少
なくとも部分的に担当するであろう。
その近傍にメチオニンが位置し、そして生物学的活性の
ために明らかに非常に重要である場合、スルホキシドへ
のその酸化は不利であると予想されよう。しかしなが
ら、活性部位に存在しない幾つかのメチオニン残基を含
有する蛋白質の精製過程での残基の酸化効果は明らかで
ない。酸化されたメチオニン残基を含有する多数の酵素
のデータは、この酸化が活性に対して種々の程度の負の
効果を与えることを示す。少なくとも、得られる推定上
純粋な蛋白質は、もし酸化形が分離除去されなければ、
汚染物を含有し、そしてそれ故に均一ではないであろ
う。このような汚染物の存在の効果は、例えば蛋白質医
薬製剤においては、望ましくない。さらに、酸化された
メチオニンの存在は、目的蛋白質中の他の構造的変化、
例えば溶解性の低下、プロテアーゼ感受性の増加、又は
必要なジスルフイド結合の形成の阻害を惹起し、今度は
これが追加の副効果、例えば二量体又は高度集合体の形
成をもたらすであろう。これらが相まって、不純物のこ
の集まりは、非経腸的に投与された蛋白質のしばしば観
察される免疫原性、又は他の不都合な生理学的反応を少
なくとも部分的に担当するであろう。
1985年１月９日に公表されたEPO,130,756は、ズブチ
リシンの222位のメチオニンのアラニンのごときアミノ
酸による置換による酸化に対する耐性の付与を開示して
いる。Estell,D.等、J.Biol.Chem.（1985）260:6518−6
521は、そのメチオニン残基が酸化に対して感受性であ
る変異体ズブチリシン酵素を開示している。
リシンの222位のメチオニンのアラニンのごときアミノ
酸による置換による酸化に対する耐性の付与を開示して
いる。Estell,D.等、J.Biol.Chem.（1985）260:6518−6
521は、そのメチオニン残基が酸化に対して感受性であ
る変異体ズブチリシン酵素を開示している。
この発明は、メチオニンを通常が含有するヒトの療法
的蛋白質を、保存的アミノ酸により酸化に対して特に感
受性のメチオニンを置き換えることにより、精製中のメ
チオニンスルホキシドへの酸化に対して保護する方法を
提供するものである。このように保護された場合、この
ミューテインはその生物学的活性を維持するが、しかし
増強された安定性を有する。このものは、メチオニンス
ルホキシドそれ自体を含有する変形体によっても又はそ
の結果生成する副生物によっても汚染されない。
的蛋白質を、保存的アミノ酸により酸化に対して特に感
受性のメチオニンを置き換えることにより、精製中のメ
チオニンスルホキシドへの酸化に対して保護する方法を
提供するものである。このように保護された場合、この
ミューテインはその生物学的活性を維持するが、しかし
増強された安定性を有する。このものは、メチオニンス
ルホキシドそれ自体を含有する変形体によっても又はそ
の結果生成する副生物によっても汚染されない。
この発明は、その選択的酸化がメチオニンスルホキシ
ド残基を含有する療法的ヒト蛋白質配列をもたらす特定
のメチオニン残基を保護する手段を提供する。少量でさ
え、これらの不純物は潜在的免疫原であり、そしてこれ
らは療法剤の均一性を低下せしめるであろう。特に高投
与量で注射される薬剤、例えばインターフェロン及びリ
ンホカインに関しては、非常に少量の汚染物質が意味を
有する。本発明者等は、感受性メチオニンを保存的アミ
ノ酸で置き換えることにより不純物の大部分が回避でき
ると信ずる。
ド残基を含有する療法的ヒト蛋白質配列をもたらす特定
のメチオニン残基を保護する手段を提供する。少量でさ
え、これらの不純物は潜在的免疫原であり、そしてこれ
らは療法剤の均一性を低下せしめるであろう。特に高投
与量で注射される薬剤、例えばインターフェロン及びリ
ンホカインに関しては、非常に少量の汚染物質が意味を
有する。本発明者等は、感受性メチオニンを保存的アミ
ノ酸で置き換えることにより不純物の大部分が回避でき
ると信ずる。
従って、１つの観点において、この発明は生物学的に
活性な関連ヒト療法的蛋白質を酸化に対して保護する方
法に関し、この方法はクロラミンＴ又は過酸化物酸化に
対して感受性の各メチオニン残基を保存的（conservati
ve）アミノ酸により置き換えることを含んで成る。該関
連蛋白質中の有意に感受性でない他のメチオニン残基は
そのように置換されない。得られる酸化に対して耐性を
有するミューテインは関連蛋白質と実質的に同じ活性を
有する（すなわち質的に同じ生物学的効果を有する）
が、しかし精製中に通常遭遇される低レベルの酸化に対
して抵抗することができ、その結果、RP−HPLC、及びメ
チオニンスルホキシドを検出する他の分析技法の基準に
より均一な調製物がもたらされる。他の観点において、
この発明はこのようにして製造されたミューテイン、該
ミューテインをコードする組換DNA配列、適当な宿主に
適合性の制御配列に作用可能に連結された前記DNA配列
を含有する組換発現ベクター、該ベクターにより形質転
換された宿主、及び前記のようにして製造されたミュー
テインのいずれかを含有する療法剤に関する。
活性な関連ヒト療法的蛋白質を酸化に対して保護する方
法に関し、この方法はクロラミンＴ又は過酸化物酸化に
対して感受性の各メチオニン残基を保存的（conservati
ve）アミノ酸により置き換えることを含んで成る。該関
連蛋白質中の有意に感受性でない他のメチオニン残基は
そのように置換されない。得られる酸化に対して耐性を
有するミューテインは関連蛋白質と実質的に同じ活性を
有する（すなわち質的に同じ生物学的効果を有する）
が、しかし精製中に通常遭遇される低レベルの酸化に対
して抵抗することができ、その結果、RP−HPLC、及びメ
チオニンスルホキシドを検出する他の分析技法の基準に
より均一な調製物がもたらされる。他の観点において、
この発明はこのようにして製造されたミューテイン、該
ミューテインをコードする組換DNA配列、適当な宿主に
適合性の制御配列に作用可能に連結された前記DNA配列
を含有する組換発現ベクター、該ベクターにより形質転
換された宿主、及び前記のようにして製造されたミュー
テインのいずれかを含有する療法剤に関する。
この発明の方法のための感受性の候補である多くの蛋
白質は多数のメチオニン残基を有し、そしてそれ故にど
のメチオン残基が酸化に対して特に感受性であるかを保
存的アミノ酸の置換の前に決定するのが好ましい。イン
ターロイキン−２中の４個のメチオニンの内、104位の
メチオニンが情報の精製の間に又は化学酸化剤への暴露
の間に選択的に酸化されることが示された。従って、他
の観点において、この発明は104位に保存的アミノ酸置
換を有するIL−２ミューテイン、及びこのミューテイン
を含有する療法剤に関する。他の観点において、この発
明は62位に保存的アミノ酸置換を有するIFN−βミュー
テイン及び該ミューテインを含有する療法剤に関する。
この発明はまた、通常は１又は複数の感受性メチオニン
を含有する他の療法用蛋白質、例えばコロニー刺激因子
−１、α（ａ）−インターフェロン、γ−インターフェ
ロン、ヒト成長ホルモン、組織プラスミノーゲンアリチ
ベーター、及びウロキナーゼに関する。
白質は多数のメチオニン残基を有し、そしてそれ故にど
のメチオン残基が酸化に対して特に感受性であるかを保
存的アミノ酸の置換の前に決定するのが好ましい。イン
ターロイキン−２中の４個のメチオニンの内、104位の
メチオニンが情報の精製の間に又は化学酸化剤への暴露
の間に選択的に酸化されることが示された。従って、他
の観点において、この発明は104位に保存的アミノ酸置
換を有するIL−２ミューテイン、及びこのミューテイン
を含有する療法剤に関する。他の観点において、この発
明は62位に保存的アミノ酸置換を有するIFN−βミュー
テイン及び該ミューテインを含有する療法剤に関する。
この発明はまた、通常は１又は複数の感受性メチオニン
を含有する他の療法用蛋白質、例えばコロニー刺激因子
−１、α（ａ）−インターフェロン、γ−インターフェ
ロン、ヒト成長ホルモン、組織プラスミノーゲンアリチ
ベーター、及びウロキナーゼに関する。
A. 定義 この明細書において使用する場合、“関連”蛋白質
は、既知のアミノ酸配列を有し、その生物学的活性も知
られており、そしてクロラミンＴによる処理の際に酸化
される少なくとも１個のメチオニンを含有する蛋白質に
関する。クロラミンＴは、天然（未−変性）蛋白質にお
いて、露出しているメチオニン残基のみを選択的に酸化
することが示されている〔Shechter,Y.等、Biochem.（1
975）14:4497−4503〕。ペプチド又は変性された天然蛋
白質の処理は、少なくとも幾つかの場合には、すべての
メチオニン残基のスルホキシドへの酸化をもたらす。あ
る利用可能なスルヒドリル基のジスルフィド橋への酸化
も生ずるであろう。
は、既知のアミノ酸配列を有し、その生物学的活性も知
られており、そしてクロラミンＴによる処理の際に酸化
される少なくとも１個のメチオニンを含有する蛋白質に
関する。クロラミンＴは、天然（未−変性）蛋白質にお
いて、露出しているメチオニン残基のみを選択的に酸化
することが示されている〔Shechter,Y.等、Biochem.（1
975）14:4497−4503〕。ペプチド又は変性された天然蛋
白質の処理は、少なくとも幾つかの場合には、すべての
メチオニン残基のスルホキシドへの酸化をもたらす。あ
る利用可能なスルヒドリル基のジスルフィド橋への酸化
も生ずるであろう。
“関連”蛋白質に対して、“酸化に対して耐性を有す
る（酸化耐性と称する場合もある）ミューテイン”と
は、該関連蛋白質と実質的に同一の生物学的活性を有す
るがクロラミンＴ又は過酸化水素による酸化に対して特
に感受性のメチオニン残基に代って保存的アミノ酸を含
有する、関連するアミノ酸配列を意味する。このような
置換は、十分な活性のために必要なジスルフィド結合の
形成を含む有益な酸化のごときすべての酸化に対してミ
ューテインを耐性にすることは意図されない。
る（酸化耐性と称する場合もある）ミューテイン”と
は、該関連蛋白質と実質的に同一の生物学的活性を有す
るがクロラミンＴ又は過酸化水素による酸化に対して特
に感受性のメチオニン残基に代って保存的アミノ酸を含
有する、関連するアミノ酸配列を意味する。このような
置換は、十分な活性のために必要なジスルフィド結合の
形成を含む有益な酸化のごときすべての酸化に対してミ
ューテインを耐性にすることは意図されない。
“クロラミンＴ又は過酸化物による酸化に対して感受
性の”メチオニンは、下記の条件下、これらの試薬の存
在中で、スルホキシドへの比較的急速な、すなわち検出
可能な転換を受けるメチオニンに関する。いずれかの試
薬による処理のため、蛋白質が緩衝液中に、すなわちク
ロラミンＴについては50mM Tris−HCl（pH8.0）中に、
過酸化物については50mMリン酸ナトリウム（pH6.8）中
に、約0.2mg/mlの濃度で溶解される。幾つかの組換法に
より製造された蛋白質のためには、溶解のために溶解
剤、例えば0.1％の洗剤が必要であろう。クロラミンＴ
については、該酸化剤が２倍モル過剰に添加され、そし
て反応混合物が25℃にて15分間インキュベートされる。
過酸化物については、H2O2が30mMになるように添加さ
れ、そして反応混合物が25℃にて１時間インキュベート
される。クロラミンＴ酸化及び過酸化水素酸化はメチオ
ニンに関して重複する特異性を示す。上記の条件下での
これらの試薬のいずれかに関する有意な（検出可能な）
酸化が、メチオニン残基を、この発明の目的のために
“感受性である”と定義する。
性の”メチオニンは、下記の条件下、これらの試薬の存
在中で、スルホキシドへの比較的急速な、すなわち検出
可能な転換を受けるメチオニンに関する。いずれかの試
薬による処理のため、蛋白質が緩衝液中に、すなわちク
ロラミンＴについては50mM Tris−HCl（pH8.0）中に、
過酸化物については50mMリン酸ナトリウム（pH6.8）中
に、約0.2mg/mlの濃度で溶解される。幾つかの組換法に
より製造された蛋白質のためには、溶解のために溶解
剤、例えば0.1％の洗剤が必要であろう。クロラミンＴ
については、該酸化剤が２倍モル過剰に添加され、そし
て反応混合物が25℃にて15分間インキュベートされる。
過酸化物については、H2O2が30mMになるように添加さ
れ、そして反応混合物が25℃にて１時間インキュベート
される。クロラミンＴ酸化及び過酸化水素酸化はメチオ
ニンに関して重複する特異性を示す。上記の条件下での
これらの試薬のいずれかに関する有意な（検出可能な）
酸化が、メチオニン残基を、この発明の目的のために
“感受性である”と定義する。
“非感受性”メチオニン残基は、酸化され得るが、し
かし上記の条件下で検出可能に（感受性メチオニンを検
出する手段により）酸化されない、すなわち“感受性”
メチオニン残基よりも遅い速度で酸化されるメチオニン
残基として定義される。蛋白質中のメチオニンは酸化に
対する可変的な感受性を有し、そして好ましい化合物に
おいては１又は複数の最も感受性のメチオニンが置換さ
れる。感受性の程度及び置換されるべきメチオニンの個
数は蛋白質に依存するであろう。一層多くのメチオニン
置換を行わないで蛋白質を均一にすることが可能であれ
ば、１又は複数の最も感受性のメチオニンのみが置換さ
れるであろう。なぜなら、蛋白質配列を天然蛋白質配列
に可能な限り近似に維持することが望ましいからであ
る。
かし上記の条件下で検出可能に（感受性メチオニンを検
出する手段により）酸化されない、すなわち“感受性”
メチオニン残基よりも遅い速度で酸化されるメチオニン
残基として定義される。蛋白質中のメチオニンは酸化に
対する可変的な感受性を有し、そして好ましい化合物に
おいては１又は複数の最も感受性のメチオニンが置換さ
れる。感受性の程度及び置換されるべきメチオニンの個
数は蛋白質に依存するであろう。一層多くのメチオニン
置換を行わないで蛋白質を均一にすることが可能であれ
ば、１又は複数の最も感受性のメチオニンのみが置換さ
れるであろう。なぜなら、蛋白質配列を天然蛋白質配列
に可能な限り近似に維持することが望ましいからであ
る。
“保存的”アミノ酸変化は、生物学的活性に不都合な
影響を与えないアミノ酸変化として定義される。この発
明に従う、酸化され得るメチオニンのためのアミノ酸置
換は中性又は非極性アミノ酸から選択される。グリシ
ン、アラニン、セリン、スレオニン、バリン、イソロイ
シン、ロイシン、アスパラギン、グルタミン、グルタミ
ン酸、チロシン、及びフェニルアラニンが好ましい。ア
ラニン、セリン、スレオニン、バリン、ロイシン、及び
イソロイシンが一層好ましい。アラニン、セリン、ロイ
シン、グルタミン酸、及びバリンがさらに好ましく、そ
してアラニンが最も好ましい。保存的変化にはさらにメ
チオニンの除去が含まれる。
影響を与えないアミノ酸変化として定義される。この発
明に従う、酸化され得るメチオニンのためのアミノ酸置
換は中性又は非極性アミノ酸から選択される。グリシ
ン、アラニン、セリン、スレオニン、バリン、イソロイ
シン、ロイシン、アスパラギン、グルタミン、グルタミ
ン酸、チロシン、及びフェニルアラニンが好ましい。ア
ラニン、セリン、スレオニン、バリン、ロイシン、及び
イソロイシンが一層好ましい。アラニン、セリン、ロイ
シン、グルタミン酸、及びバリンがさらに好ましく、そ
してアラニンが最も好ましい。保存的変化にはさらにメ
チオニンの除去が含まれる。
残基104の近傍の領域を含む全体として、65％のアミ
ノ酸の相同性をヒトIL−２と共有するマウスIL−２がメ
チオニン104に代るグルタミン酸置換を有することに注
目すべきである。Fiers,W.等，Cellular and Molecular
Biology of Lymphokines,C.Sorg及びA.Schimpl編、595
−603頁、アカデミックプレス、1985年。マウスの配列
のこの近傍にはメチオニンは存在せず、活性のために残
基104に又はその近傍にメチオニンは必要でないこと、
及びグルタミン酸がヒトの配列中においても残基104に
おける許容される置換であることが示唆される。
ノ酸の相同性をヒトIL−２と共有するマウスIL−２がメ
チオニン104に代るグルタミン酸置換を有することに注
目すべきである。Fiers,W.等，Cellular and Molecular
Biology of Lymphokines,C.Sorg及びA.Schimpl編、595
−603頁、アカデミックプレス、1985年。マウスの配列
のこの近傍にはメチオニンは存在せず、活性のために残
基104に又はその近傍にメチオニンは必要でないこと、
及びグルタミン酸がヒトの配列中においても残基104に
おける許容される置換であることが示唆される。
従って、“関連”蛋白質と酸化に対して耐性を有する
ミューテインとの関係は、感受性メチオニンに代って保
存的アミノ酸が置き換えられているか、又は該メチオニ
ンが除去されている点を除きアミノ酸配列が同一である
ことである。
ミューテインとの関係は、感受性メチオニンに代って保
存的アミノ酸が置き換えられているか、又は該メチオニ
ンが除去されている点を除きアミノ酸配列が同一である
ことである。
“組換宿主細胞”、“宿主細胞”、“細胞”、“細胞
培養物”等は交換可能に使用され、そしてこの発明の組
換ベクターによりすでに形質転換されているか、又は形
質転換されることが意図される、個々の細胞、細胞系、
細胞培養物、及び収得された細胞を意味する。これらの
用語はまた、最初にベクターを受け入れた細胞の子孫を
も包含する。培養条件下での自然的な又は意図的な変異
又は変化のため、単一細胞の子孫のすべてが正確に、必
然的に親と同一ではないことがよく理解される。
培養物”等は交換可能に使用され、そしてこの発明の組
換ベクターによりすでに形質転換されているか、又は形
質転換されることが意図される、個々の細胞、細胞系、
細胞培養物、及び収得された細胞を意味する。これらの
用語はまた、最初にベクターを受け入れた細胞の子孫を
も包含する。培養条件下での自然的な又は意図的な変異
又は変化のため、単一細胞の子孫のすべてが正確に、必
然的に親と同一ではないことがよく理解される。
これらの子孫もまた、ベクターにより付与されるこの
発明の酸化に対して耐性を有するミューテインを生産す
る機能を発揮する能力が保持されている限り、上記の定
義に含まれる。
発明の酸化に対して耐性を有するミューテインを生産す
る機能を発揮する能力が保持されている限り、上記の定
義に含まれる。
“形質転換する”なる語は、宿主のDNA含量を変化せ
しめるための任意の方法に関し、これには後に記載する
イン−ビトロ形質転換法、ファージ感染、及び当業界に
おいて知られている制御されたDNAの取り込みを行うた
めの他の方法が含まれる。
しめるための任意の方法に関し、これには後に記載する
イン−ビトロ形質転換法、ファージ感染、及び当業界に
おいて知られている制御されたDNAの取り込みを行うた
めの他の方法が含まれる。
“作用可能に連結される（operably linked）”なる
語は、この明細書において用いる場合、配列又は遺伝子
が、これらの通常の機能が発揮されるように並置されて
いる状態に関する。例えば、コード配列に作用可能に連
結されたプロモーターは、該プロモーターが該コード配
列の発現を制御することができるような連結に関する。
語は、この明細書において用いる場合、配列又は遺伝子
が、これらの通常の機能が発揮されるように並置されて
いる状態に関する。例えば、コード配列に作用可能に連
結されたプロモーターは、該プロモーターが該コード配
列の発現を制御することができるような連結に関する。
“制御配列”は、酸化に対して耐性を有するミューテ
インをコードする配列の発現を制御するDNA配列に関す
る。この例には転写開始のためのプロモーターが含ま
れ、場合によってはオペレーター、エンハンサー領域、
リボゾーム結合部位配列、並びに遺伝子の翻訳の開始及
び終止を行う翻訳配列が含まれる。
インをコードする配列の発現を制御するDNA配列に関す
る。この例には転写開始のためのプロモーターが含ま
れ、場合によってはオペレーター、エンハンサー領域、
リボゾーム結合部位配列、並びに遺伝子の翻訳の開始及
び終止を行う翻訳配列が含まれる。
“不活性な、非アレルゲン性の、医薬として適合性の
担体”は、ミューテインの担体であって、該ミューテイ
ンと反応せず、水溶性でありそして好ましくは水に対し
て非感受性であり、それ自体安定であり、患者において
アレルギー反応を惹起せず、生理学的及び薬剤的にミュ
ーテインと適合性であり、そのために安定で可溶性の製
剤が作られるようなものを言う。この担体は液体でも固
体でもよく、そして固体の場合は医薬錠剤のための固体
増量剤であろう。
担体”は、ミューテインの担体であって、該ミューテイ
ンと反応せず、水溶性でありそして好ましくは水に対し
て非感受性であり、それ自体安定であり、患者において
アレルギー反応を惹起せず、生理学的及び薬剤的にミュ
ーテインと適合性であり、そのために安定で可溶性の製
剤が作られるようなものを言う。この担体は液体でも固
体でもよく、そして固体の場合は医薬錠剤のための固体
増量剤であろう。
B. 一般的記載 この発明の酸化に対して耐性のミューテインを得るた
め、特定のメチオニン残基の選択的酸化を生じさせる関
連蛋白質を同定し、その残基を保存的アミノ酸で置き換
える。この発明は、この残基が知られる蛋白質に適用さ
れる。この残基の位置が知られていない場合、当業界に
おいて知られている手段によりそれを決定することがで
きる。
め、特定のメチオニン残基の選択的酸化を生じさせる関
連蛋白質を同定し、その残基を保存的アミノ酸で置き換
える。この発明は、この残基が知られる蛋白質に適用さ
れる。この残基の位置が知られていない場合、当業界に
おいて知られている手段によりそれを決定することがで
きる。
例えば、メチオニンスルホキシドを含有する関連蛋白
質から関連蛋白質を分離するために、幾つかの場合には
RP−HPLCが適当である。例えば前記のＡ項において特定
した条件下で例えばクロラミンＴにより処理する前後
に、蛋白質をRP−HPLCにかける。（クロラミンＴに代え
て過酸化物を使用することもできる。）最も感受性のメ
チオニン残基がスルホキシドに酸化されるように条件を
選択する。クロラミンＴ酸化から生ずる主ピーク、及び
このような酸化を行わない場合に生ずる主ピークを、酸
化されたメチオニン残基を決定するために設計された方
法にかける。
質から関連蛋白質を分離するために、幾つかの場合には
RP−HPLCが適当である。例えば前記のＡ項において特定
した条件下で例えばクロラミンＴにより処理する前後
に、蛋白質をRP−HPLCにかける。（クロラミンＴに代え
て過酸化物を使用することもできる。）最も感受性のメ
チオニン残基がスルホキシドに酸化されるように条件を
選択する。クロラミンＴ酸化から生ずる主ピーク、及び
このような酸化を行わない場合に生ずる主ピークを、酸
化されたメチオニン残基を決定するために設計された方
法にかける。
種々の方法を用いることができる。しかしながら、特
に便利な方法はシアノゲンブロミド開裂を用い、（この
試薬はメチオニン残基を開裂するが、メチオニン残基が
酸化されている場合には反応性でない）、次にHPLCによ
るペプチドのマッピング及び配列分析を行う。
に便利な方法はシアノゲンブロミド開裂を用い、（この
試薬はメチオニン残基を開裂するが、メチオニン残基が
酸化されている場合には反応性でない）、次にHPLCによ
るペプチドのマッピング及び配列分析を行う。
シアノゲンブロミド開裂混合物をまず、例えばジチオ
エリスリトール（DTE）で還元することにより残りのジ
スルフィド結合を破壊する。クロラミンＴで処理されて
いない関連蛋白質については、得られるペプチドの数は
内部メチオニン残基を数＋１に等しいはずである。クロ
ラミンＴにより酸化された蛋白質については、生ずるペ
プチドの数は酸化された内部メチオニンの数に応じて減
少するであろう。従って、シアノゲンブロミド開裂、DT
E還元、及びHPLC分析の後に得られるペプチドの数の比
較が、存在する内部メチオニン残基の数、及びクロラミ
ンＴによる酸化に暴露された数に関する結論を可能にす
るであろう。こうして得られた配列決定が、例えば別途
確立された完全アミノ酸配列との比較と相まって、完全
配列に対する酸化されたメチオニンの位置を明らかにす
るであろう。
エリスリトール（DTE）で還元することにより残りのジ
スルフィド結合を破壊する。クロラミンＴで処理されて
いない関連蛋白質については、得られるペプチドの数は
内部メチオニン残基を数＋１に等しいはずである。クロ
ラミンＴにより酸化された蛋白質については、生ずるペ
プチドの数は酸化された内部メチオニンの数に応じて減
少するであろう。従って、シアノゲンブロミド開裂、DT
E還元、及びHPLC分析の後に得られるペプチドの数の比
較が、存在する内部メチオニン残基の数、及びクロラミ
ンＴによる酸化に暴露された数に関する結論を可能にす
るであろう。こうして得られた配列決定が、例えば別途
確立された完全アミノ酸配列との比較と相まって、完全
配列に対する酸化されたメチオニンの位置を明らかにす
るであろう。
感受性メチオニンの位置を確立した後、蛋白質のコー
ド配列を得、そしてこれを部位特異的変異誘発のために
使用する。多数の蛋白質、例えばインターロイキン−
２、インターフェロン−α（ａ）、−β、及び−γ、ヒ
ト成長ホルモン、組織プラスミノーゲンアクチベータ
ー、コロニー刺激因子−１（CSF−１）、ウロキナー
ゼ、及び他の多くの蛋白質のコード配列がすでに知られ
ており、そして当業界において入手することができる。
知られておらずそして当業界において入手できないコー
ド配列は、常法、例えば目的蛋白質を生産する細胞から
単離されたメッセンジャーRNAから調製されたcDNAライ
ブラリーからの、プローブ特異的クローンの配列決定に
より得られる。
ド配列を得、そしてこれを部位特異的変異誘発のために
使用する。多数の蛋白質、例えばインターロイキン−
２、インターフェロン−α（ａ）、−β、及び−γ、ヒ
ト成長ホルモン、組織プラスミノーゲンアクチベータ
ー、コロニー刺激因子−１（CSF−１）、ウロキナー
ゼ、及び他の多くの蛋白質のコード配列がすでに知られ
ており、そして当業界において入手することができる。
知られておらずそして当業界において入手できないコー
ド配列は、常法、例えば目的蛋白質を生産する細胞から
単離されたメッセンジャーRNAから調製されたcDNAライ
ブラリーからの、プローブ特異的クローンの配列決定に
より得られる。
関連蛋白質の酸化耐性ミューテインを製造するため、
便利なＭ−13クローニングベクター中にクローン化され
た、該関連蛋白質をコードするDNA配列を適当なプライ
マーを用いて部位特異的変異誘発にかけて同定された位
置の残基をメチオニンから保存的アミノ酸置換体に転換
する。部位特異的（又はプライマー指令）変異誘発は、
今や当業界においてよく確立された技法である。要約す
れば、ファージ単鎖関連配列に相補的な鎖の合成におけ
るプライマーとして、目的とする配列に相補的な合成オ
リゴヌクレオチドを用いる。得られる２本鎖DNAをファ
ージ担持性宿主細胞に形質転換する。形質転換された細
菌の培養物を上層寒天中にプレートし、ファージを担持
する単一細胞からプラークを形成せしめる。理論的に
は、プラークの50％が変異体を含有するファージから成
り、50％がもとの配列を有するであろう。プローブと完
全にマッチする目的配列のみとのハイブリダイゼーショ
ンを許容する厳重な条件（stringency condition）下
で、プラークをキナーゼ処理された合成プライマーとハ
イブリダイズせしめる。次に、ハイブリダイズするプラ
ークを拾い上げ、そして培養し、そしてDNAを回収す
る。
便利なＭ−13クローニングベクター中にクローン化され
た、該関連蛋白質をコードするDNA配列を適当なプライ
マーを用いて部位特異的変異誘発にかけて同定された位
置の残基をメチオニンから保存的アミノ酸置換体に転換
する。部位特異的（又はプライマー指令）変異誘発は、
今や当業界においてよく確立された技法である。要約す
れば、ファージ単鎖関連配列に相補的な鎖の合成におけ
るプライマーとして、目的とする配列に相補的な合成オ
リゴヌクレオチドを用いる。得られる２本鎖DNAをファ
ージ担持性宿主細胞に形質転換する。形質転換された細
菌の培養物を上層寒天中にプレートし、ファージを担持
する単一細胞からプラークを形成せしめる。理論的に
は、プラークの50％が変異体を含有するファージから成
り、50％がもとの配列を有するであろう。プローブと完
全にマッチする目的配列のみとのハイブリダイゼーショ
ンを許容する厳重な条件（stringency condition）下
で、プラークをキナーゼ処理された合成プライマーとハ
イブリダイズせしめる。次に、ハイブリダイズするプラ
ークを拾い上げ、そして培養し、そしてDNAを回収す
る。
次に、得られたDNAを標準的方法を用いて発現ベクタ
ー中に連結する。この方法は、関連配列のための発現ベ
クターの調製において使用された方法と正確に同一であ
ることができる。次に、適当な宿主中、適合性の制御配
列の制御のもとで、当業界において知られている任意の
組換宿主細胞系を用いて酸化耐性ミューテインを製造す
ることができる（C.1項を参照のこと）。こうして生産
されたメチオニン−置換されたミューテインを回収し、
そして標準的な蛋白質精製技法を用いて精製する。
ー中に連結する。この方法は、関連配列のための発現ベ
クターの調製において使用された方法と正確に同一であ
ることができる。次に、適当な宿主中、適合性の制御配
列の制御のもとで、当業界において知られている任意の
組換宿主細胞系を用いて酸化耐性ミューテインを製造す
ることができる（C.1項を参照のこと）。こうして生産
されたメチオニン−置換されたミューテインを回収し、
そして標準的な蛋白質精製技法を用いて精製する。
蛋白質が微生物宿主により生産される屈折性（refrac
tile）物質の形態をとる場合、１つの蛋白質精製技法
は、（ａ）宿主の細胞膜を破砕し、（ｂ）この破砕物か
ら99重量％以上の塩を除去し、（ｃ）脱塩された破砕物
を破砕し、（ｄ）この破砕物にシュークロースのごとき
物質を添加して該破砕物中の液の密度又は粘度を上昇せ
しめ、又は該破砕物中の液に密度勾配又は粘度勾配を生
じさせ、そして（ｅ）10,000〜40,000xgの高速遠心分離
により細胞片から屈折性物質を分離する。好ましくは、
液の密度が1.13〜1.17g/cm3のＰに上昇するようにシュ
ークロースを加える。
tile）物質の形態をとる場合、１つの蛋白質精製技法
は、（ａ）宿主の細胞膜を破砕し、（ｂ）この破砕物か
ら99重量％以上の塩を除去し、（ｃ）脱塩された破砕物
を破砕し、（ｄ）この破砕物にシュークロースのごとき
物質を添加して該破砕物中の液の密度又は粘度を上昇せ
しめ、又は該破砕物中の液に密度勾配又は粘度勾配を生
じさせ、そして（ｅ）10,000〜40,000xgの高速遠心分離
により細胞片から屈折性物質を分離する。好ましくは、
液の密度が1.13〜1.17g/cm3のＰに上昇するようにシュ
ークロースを加える。
他の方法として、（IL−２のためには）細胞膜を破砕
し、そして破砕物を、細胞性物質及びIL−２から非−IL
−２蛋白質を選択的に抽出するチャオトロピック剤（ch
aotropic agent）例えば尿素の水素溶液で抽出する。次
に、IL−２を還元する還元剤の存在下で溶解剤、例えば
SDSによりIL−２を溶解し、次に還元されたIL−２を還
元剤の存在下で溶液から分離し、次にIL−２を酸化しゲ
ル過又は逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製
し、そして回収する。
し、そして破砕物を、細胞性物質及びIL−２から非−IL
−２蛋白質を選択的に抽出するチャオトロピック剤（ch
aotropic agent）例えば尿素の水素溶液で抽出する。次
に、IL−２を還元する還元剤の存在下で溶解剤、例えば
SDSによりIL−２を溶解し、次に還元されたIL−２を還
元剤の存在下で溶液から分離し、次にIL−２を酸化しゲ
ル過又は逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製
し、そして回収する。
第３の態様においては、第１の方法を用いて屈折体
（refractile）を単離し、そして次に第２の方法を用い
て還元剤の存在下でSDSのごとき溶解剤中で屈折体を可
溶化し、そして上記のようにして分離し、酸化し、そし
て精製する。
（refractile）を単離し、そして次に第２の方法を用い
て還元剤の存在下でSDSのごとき溶解剤中で屈折体を可
溶化し、そして上記のようにして分離し、酸化し、そし
て精製する。
回収段階でのIL−２又はIFN−βのごとき蛋白質の酸
化は、米国特許No.4,530,787に記載されているようにヨ
ードソ安息香酸を用いて、又は約5.5〜９のpHにおいて
銅イオン、例えば塩化銅を用いて行うことができる。
化は、米国特許No.4,530,787に記載されているようにヨ
ードソ安息香酸を用いて、又は約5.5〜９のpHにおいて
銅イオン、例えば塩化銅を用いて行うことができる。
この酸化耐性調製物は親である関連蛋白質に類似する
生物学的活性を有し、そしてそれ故に同じ用途を有する
であろう。
生物学的活性を有し、そしてそれ故に同じ用途を有する
であろう。
B.1. １つの好ましい態様…IL−２酸化耐性ミューテイ
ン この発明の方法は、１つの観点において、タニグチ,
T.等，Nature（1983）24:305により記載されているよう
にジャーカット細胞により又は誘導された末梢血細胞リ
ンパ球から分泌されるリンホカインであるインターロイ
キン−２への適用によって例示する。
ン この発明の方法は、１つの観点において、タニグチ,
T.等，Nature（1983）24:305により記載されているよう
にジャーカット細胞により又は誘導された末梢血細胞リ
ンパ球から分泌されるリンホカインであるインターロイ
キン−２への適用によって例示する。
IL−２の組換技法による生産は多数のグループにより
報告されている。第１図に示すように、成熟天然IL−２
は133個のアミノ酸の配列を有し、この配列は１位のア
ラニン、３個のシステイン（58位、105位及び125位）、
及び４個のメチオニン（23位、38位、46位、及び104
位）を含有する。この明細書においては、小さい字で記
載した位置における変形にのみ注目して、第１図中に示
されそして番号が付与されている配列に関してIL−２の
種々の形を命名する。すなわち、同じ配列であるがＮ−
末端のアラニンを欠失しているものをdes−ala1、IL−
２と命名し、そして同じ配列であるが125位にセリン残
基を有する（示されているようにシステインではなく）
ものをser125IL−２と命名する。
報告されている。第１図に示すように、成熟天然IL−２
は133個のアミノ酸の配列を有し、この配列は１位のア
ラニン、３個のシステイン（58位、105位及び125位）、
及び４個のメチオニン（23位、38位、46位、及び104
位）を含有する。この明細書においては、小さい字で記
載した位置における変形にのみ注目して、第１図中に示
されそして番号が付与されている配列に関してIL−２の
種々の形を命名する。すなわち、同じ配列であるがＮ−
末端のアラニンを欠失しているものをdes−ala1、IL−
２と命名し、そして同じ配列であるが125位にセリン残
基を有する（示されているようにシステインではなく）
ものをser125IL−２と命名する。
天然IL−２のほかに、アミノ酸構造において幾つかの
変形を含有するIL−２の組換形が天然配列に匹敵する活
性を有することが示されている。例えば、３位のグリコ
シル化部分を含む５個のＮ−末端アミン酸を欠く組換IL
−２は有意な生物学的活性を有する（S.Gillis,Immune
x,1984年12月，私信）。1985年５月21日に発行された米
国特許No.4,518,584は、１位のアラニン残基の除去を伴
うＮ−末端配列の好ましい変形を開示する。さらに、12
5位にシステインではなく、セリン、アラニン、スレオ
ニン又はバリンのごとき中性アミノ酸を有するIL−２ミ
ューテインが開示されている。これらのミューテイン
は、ジスルフィド結合の形成に関して、卓越した予測可
能性を有する。125位における他の保存的アミノ酸置
換、特にアラニン又はバリンも開示されている。本発明
者等は、ser125IL−２及びala125IL−２の両者が細胞増
殖アッセイにおいて十分に活性であることを見出した。
（58位及び105位のシステインは天然分子の必要的ジス
ルフィド結合に関与するため、これらの置換は活性の喪
失をもたらす。） 臨床サンプルの製造に使用される製造的精製法よりも
高い分離能を有する分析的技法を用いて、臨床試験用に
調製された組換形IL−２は少量の汚染物を含有すること
が示された。一般に蛋白質について、そして特にIL−２
について、３次元構造の変化又は複合体の形成に基く精
製中の汚染物の生成の原因の１つは、活性形の蛋白質に
存在するジスルフィドとは異るジスルフィドを形成する
ある遊離スルヒドリル基の能力にある。従って、IL−２
の精製法は、システイン残基をスルヒドリル状態に維持
する条件下で実施され、その後で、穏和な酸化の制御さ
れた条件下でジスルフィド形成が行われる。それにもか
かわらず、医療用蛋白質の精製法において使用される装
置及び試薬は無菌的でなければならないため、殺菌洗浄
液に由来する酸化剤、例えば過酸化水素が、IL−２調製
物における酸化的変換を惹起するのに十分な量で存在す
ることが見出された。さらに、このような酸化は貯蔵中
にも生ずることができる。
変形を含有するIL−２の組換形が天然配列に匹敵する活
性を有することが示されている。例えば、３位のグリコ
シル化部分を含む５個のＮ−末端アミン酸を欠く組換IL
−２は有意な生物学的活性を有する（S.Gillis,Immune
x,1984年12月，私信）。1985年５月21日に発行された米
国特許No.4,518,584は、１位のアラニン残基の除去を伴
うＮ−末端配列の好ましい変形を開示する。さらに、12
5位にシステインではなく、セリン、アラニン、スレオ
ニン又はバリンのごとき中性アミノ酸を有するIL−２ミ
ューテインが開示されている。これらのミューテイン
は、ジスルフィド結合の形成に関して、卓越した予測可
能性を有する。125位における他の保存的アミノ酸置
換、特にアラニン又はバリンも開示されている。本発明
者等は、ser125IL−２及びala125IL−２の両者が細胞増
殖アッセイにおいて十分に活性であることを見出した。
（58位及び105位のシステインは天然分子の必要的ジス
ルフィド結合に関与するため、これらの置換は活性の喪
失をもたらす。） 臨床サンプルの製造に使用される製造的精製法よりも
高い分離能を有する分析的技法を用いて、臨床試験用に
調製された組換形IL−２は少量の汚染物を含有すること
が示された。一般に蛋白質について、そして特にIL−２
について、３次元構造の変化又は複合体の形成に基く精
製中の汚染物の生成の原因の１つは、活性形の蛋白質に
存在するジスルフィドとは異るジスルフィドを形成する
ある遊離スルヒドリル基の能力にある。従って、IL−２
の精製法は、システイン残基をスルヒドリル状態に維持
する条件下で実施され、その後で、穏和な酸化の制御さ
れた条件下でジスルフィド形成が行われる。それにもか
かわらず、医療用蛋白質の精製法において使用される装
置及び試薬は無菌的でなければならないため、殺菌洗浄
液に由来する酸化剤、例えば過酸化水素が、IL−２調製
物における酸化的変換を惹起するのに十分な量で存在す
ることが見出された。さらに、このような酸化は貯蔵中
にも生ずることができる。
このような酸化に対して感受性のメチオニン残基を除
去し又は保存的アミノ酸で置き換えるために設計される
この好ましい具体例において、上記のすべての形のIL−
２を用いることができる。酸化耐性ミューテインは蛋白
質製品としての能力を維持する組成物を提供する点にお
いて価値があり、あるいは酸化耐性は分子の薬理学的挙
動を他の有利な態様で変化せしめるであろう。
去し又は保存的アミノ酸で置き換えるために設計される
この好ましい具体例において、上記のすべての形のIL−
２を用いることができる。酸化耐性ミューテインは蛋白
質製品としての能力を維持する組成物を提供する点にお
いて価値があり、あるいは酸化耐性は分子の薬理学的挙
動を他の有利な態様で変化せしめるであろう。
酸化耐性IL−２ミューテインの活性は、Watson,J.J.F
xp.Med.（1979）150:1507−1519、及びGillis,S.等，J.
Inmunol.（1978）120:2027−2032により記載された標準
的HT−２細胞アッセイを用いて確認される。このミュー
テインはまた、NK細胞のイン−ビトロ活性化に関して関
連分子と同等に有効である。
xp.Med.（1979）150:1507−1519、及びGillis,S.等，J.
Inmunol.（1978）120:2027−2032により記載された標準
的HT−２細胞アッセイを用いて確認される。このミュー
テインはまた、NK細胞のイン−ビトロ活性化に関して関
連分子と同等に有効である。
酸化耐性IL−２ミューテインは、Ｂ項において記載し
たようにして得られるRP−HPLCプロールから次のように
して回収することができる。前記プール（酸性プロパノ
ールから成る）から前記ミューテインを沈澱せしめ、す
なわち塩基を添加することによってpHを中性にし、これ
によって沈澱を得、遠心分離し、遠沈物をSDSのごとき
非イオン性溶解剤中で溶解し、そして必要であればＳ−
200ゲル過によりオリゴマーを除去する。溶解剤とし
てSDSを使用する場合、最終製剤化段階において、適当
な緩衝液を用いる透析過により、SDSをIL−2mg当り約
100−250μｇ、好ましくは約200μｇのレベルに減少せ
しめる。
たようにして得られるRP−HPLCプロールから次のように
して回収することができる。前記プール（酸性プロパノ
ールから成る）から前記ミューテインを沈澱せしめ、す
なわち塩基を添加することによってpHを中性にし、これ
によって沈澱を得、遠心分離し、遠沈物をSDSのごとき
非イオン性溶解剤中で溶解し、そして必要であればＳ−
200ゲル過によりオリゴマーを除去する。溶解剤とし
てSDSを使用する場合、最終製剤化段階において、適当
な緩衝液を用いる透析過により、SDSをIL−2mg当り約
100−250μｇ、好ましくは約200μｇのレベルに減少せ
しめる。
透析過に続き、IL−２の濃度を約0.01〜2mg/mlの範
囲の濃度に再調製し、そしてこのIL−２を非毒性の、非
アレルゲン性の、医薬として適合性の担体媒体、例えば
蒸留水、リンゲル液、ハンク液、又は生理的食塩水中に
製剤化することができる。水溶性担体を所望のレベルに
添加することができる。この担体は典型的には、約１〜
10重量％、好ましくは約５重量％の濃度で溶液中に存在
するように添加する。担体の正確な量は臨界的ではな
い。医薬錠剤の製剤において使用される常用の固体増量
剤を担体として使用することができる。これらの材料は
水溶性であり、IL−２と反応せず、そしてそれ自体安定
である。これらはまた、好ましくは水に対して非感受性
（すなわち、非吸湿性）である。使用することができる
担体の例として、非毒性安定剤、例えばマンニトール又
は他の材料、例えばラクトース、及び他の還元された
糖、例えばソルビトール、小麦、トウモロコシ、米及び
じゃがいもからの澱粉及び澱粉加水分解物、ミクロクリ
スタリンセルロース、及びアルブミン、例えばヒト血清
アルブミンを挙げることができる。マンニトールが好ま
しい。
囲の濃度に再調製し、そしてこのIL−２を非毒性の、非
アレルゲン性の、医薬として適合性の担体媒体、例えば
蒸留水、リンゲル液、ハンク液、又は生理的食塩水中に
製剤化することができる。水溶性担体を所望のレベルに
添加することができる。この担体は典型的には、約１〜
10重量％、好ましくは約５重量％の濃度で溶液中に存在
するように添加する。担体の正確な量は臨界的ではな
い。医薬錠剤の製剤において使用される常用の固体増量
剤を担体として使用することができる。これらの材料は
水溶性であり、IL−２と反応せず、そしてそれ自体安定
である。これらはまた、好ましくは水に対して非感受性
（すなわち、非吸湿性）である。使用することができる
担体の例として、非毒性安定剤、例えばマンニトール又
は他の材料、例えばラクトース、及び他の還元された
糖、例えばソルビトール、小麦、トウモロコシ、米及び
じゃがいもからの澱粉及び澱粉加水分解物、ミクロクリ
スタリンセルロース、及びアルブミン、例えばヒト血清
アルブミンを挙げることができる。マンニトールが好ま
しい。
担体は、単位投与量の溶液が容器、例えば無菌バイア
ル中で凍結乾燥された場合に肉眼で明瞭に観察され得る
ような嵩を製剤に付与する。これに関して、好ましい担
体であるマンニトールは、水に非感受性の美的に許容さ
れる（白色、結晶性）残渣を提供する。水に対するマン
ニトールの非感受性は製剤の安定性を増強するであろ
う。
ル中で凍結乾燥された場合に肉眼で明瞭に観察され得る
ような嵩を製剤に付与する。これに関して、好ましい担
体であるマンニトールは、水に非感受性の美的に許容さ
れる（白色、結晶性）残渣を提供する。水に対するマン
ニトールの非感受性は製剤の安定性を増強するであろ
う。
担体を加えた後、0.01〜2mg、好ましくは0.2〜0.3mg
のIL−２をもたらす容量の溶液を容器に入れ、そして内
容物を常用の凍結乾燥条件及び装置を用いて凍結乾燥す
る。
のIL−２をもたらす容量の溶液を容器に入れ、そして内
容物を常用の凍結乾燥条件及び装置を用いて凍結乾燥す
る。
凍結乾燥された無菌生成物は、（１）組換IL−２、
（２）担体（マンニトール）、（３）洗剤（SDS）、及
び（４）混合物が再調製された場合に生理的pHをもたら
す少量の緩衝剤から成る。組換IL−２は、典型的には、
混合物の0.015〜3.85重量％、さらに好ましくは混合物
の約0.4〜0.6％を占める。この製品の貯蔵試験は、IL−
２がこの形態で、２℃〜８℃において３箇月以上安定で
あることを示す。
（２）担体（マンニトール）、（３）洗剤（SDS）、及
び（４）混合物が再調製された場合に生理的pHをもたら
す少量の緩衝剤から成る。組換IL−２は、典型的には、
混合物の0.015〜3.85重量％、さらに好ましくは混合物
の約0.4〜0.6％を占める。この製品の貯蔵試験は、IL−
２がこの形態で、２℃〜８℃において３箇月以上安定で
あることを示す。
凍結乾燥された混合物は、常用の非経腸的水性注射
剤、例えば注射用水、リンゲル注射剤、デキストロース
注射剤、デキストロース／塩注射剤等をバイアルに注入
することによって再調製することができる。注射剤は、
過剰の発泡を防止するためバイアルの側壁に対して加え
るべきである。バイアルに加える注射剤の量は典型的に
１〜5ml、好ましくは１〜2mlの範囲である。
剤、例えば注射用水、リンゲル注射剤、デキストロース
注射剤、デキストロース／塩注射剤等をバイアルに注入
することによって再調製することができる。注射剤は、
過剰の発泡を防止するためバイアルの側壁に対して加え
るべきである。バイアルに加える注射剤の量は典型的に
１〜5ml、好ましくは１〜2mlの範囲である。
IL−２ミューテインのヒト又は動物への投与は、医師
により適当と認められるところに従って、例えば静脈内
に、腹腔内に、筋肉内に、又は皮下に行われる。投与さ
れるIL−２ミューテインの量は通常、対象及びその体重
に依存して約１×104〜２×108ユニットの範囲である。
により適当と認められるところに従って、例えば静脈内
に、腹腔内に、筋肉内に、又は皮下に行われる。投与さ
れるIL−２ミューテインの量は通常、対象及びその体重
に依存して約１×104〜２×108ユニットの範囲である。
この発明のミューテインは、細菌感染、ウイルス感
染、寄生虫感染、原生動物感染及び真菌感染の診断及び
治療（局所的又は全身的）のため、細胞介在性細胞変性
の増大のため、リンホカインで活性化されるキラー細胞
の活性を刺激するため；リンパ球の免疫機能の回復を調
節するため；アロ抗原の応答性を増強するため；後天性
免疫不全状態において免疫機能の回復を促進するため；
老人又は動物における正常な免疫機能の回復のため；診
断測定、例えば酵素増幅を用いる測定、ラジオラベリン
グ、ラジオイメージング、又は疾患状態においてIL−２
レベルをモニターするための当業界において知られてい
る他の方法の開発において；療法的又は診断的方法のた
めのイン−ヒドロＴ細胞増殖の促進のため；リンホカイ
ンのリセプター部位をブロックするため；並びに他の種
々の療法的、診断的、及び研究的用途において、有用で
ある。
染、寄生虫感染、原生動物感染及び真菌感染の診断及び
治療（局所的又は全身的）のため、細胞介在性細胞変性
の増大のため、リンホカインで活性化されるキラー細胞
の活性を刺激するため；リンパ球の免疫機能の回復を調
節するため；アロ抗原の応答性を増強するため；後天性
免疫不全状態において免疫機能の回復を促進するため；
老人又は動物における正常な免疫機能の回復のため；診
断測定、例えば酵素増幅を用いる測定、ラジオラベリン
グ、ラジオイメージング、又は疾患状態においてIL−２
レベルをモニターするための当業界において知られてい
る他の方法の開発において；療法的又は診断的方法のた
めのイン−ヒドロＴ細胞増殖の促進のため；リンホカイ
ンのリセプター部位をブロックするため；並びに他の種
々の療法的、診断的、及び研究的用途において、有用で
ある。
ヒトIL−２の種々の療法的用途は、S.A.Rosenberg及
び共同研究者〔例えばMule等，Science（1984）225:148
7及びS.Rosenberg等，New England Journol of Medicin
e（1985）313（23）:1485−1492を参照のこと〕により
研究されそして報告されている。IL−２はそれ自体とし
て、又は他の免疫的に関連するＢもしくはＣ細胞又は他
の療法剤と組合わせて使用することができる。関連細胞
の非限定的な例はＢ細胞又はＴ細胞、及びナチュラルキ
ラー細胞であり、そしてこの発明のポリペプチドと組合
わせて使用される例示的な療法剤は種々のインターフェ
ロン、特にα−、β−、及びγ−インターフェロン、Ｂ
細胞増殖因子、CSF−１、インターロイキン−１、又は
他の腫瘍壊死因子である。
び共同研究者〔例えばMule等，Science（1984）225:148
7及びS.Rosenberg等，New England Journol of Medicin
e（1985）313（23）:1485−1492を参照のこと〕により
研究されそして報告されている。IL−２はそれ自体とし
て、又は他の免疫的に関連するＢもしくはＣ細胞又は他
の療法剤と組合わせて使用することができる。関連細胞
の非限定的な例はＢ細胞又はＴ細胞、及びナチュラルキ
ラー細胞であり、そしてこの発明のポリペプチドと組合
わせて使用される例示的な療法剤は種々のインターフェ
ロン、特にα−、β−、及びγ−インターフェロン、Ｂ
細胞増殖因子、CSF−１、インターロイキン−１、又は
他の腫瘍壊死因子である。
B.2.他の好ましい態様…IFN−β酸化耐性ミューテイン β−インターフェロン（IFN−β）についても同様の
状況が存在する。天然IFN−βの166個のアミノ酸配列を
第２図に示す。17位、31位及び141位に３個のシステイ
ン残基が存在する。17位のシステイン残基は生物学的活
性のために必須でないことが示されており、そして17位
に保存的アミノ酸置換を有するIFN−βミューテインは1
985年５月21日に発行された英国特許No.5,518,584に開
示されている。天然形及び変形形のIFN−βの両者に存
在するジスルフィド橋は141位と31位のシステイン間に
存在することが結論ずけられている。さらに、第２図に
示されるIFN−β配列は４個のメチオニン残基（１位、3
6位、62位、及び117位）を含有する。ser17IFN−βに対
して行われる精製法は、精製された臨床用IL−２製品か
ら得られるのと同様のRP−HPLC分析パターンを与える生
成物を提供する。前記の条件を用いるクロラミンＴによ
るIFN−βの酸化は、IL−２について観察されるのと同
様の効果をRP−HPLCパターンに与える。酸化されたメチ
オニンを含有するIFN−βの生物学的活性もやはり大き
く低下する。IL−２の104位のメチオニンの酸化に類似
する態様で、IFN−βの62位のメチオニンが選択的にス
ルホキシドに酸化される。影響を受けたメチオニンの位
置を決定するために、IL−２に関して下に記載するのと
同様にして、酸化形について得られたピークを分析する
ことができ、そしてIFN−β関連蛋白質の酸化耐性ミュ
ーテイン形を同様にして部位特異的変異誘発により得る
ことができる。酸化耐性IFN−βミューテインを回収し
た後、天然IFN−βと同様にして製剤化することができ
る。療法的又は診断的用途のため、これを無毒性の、非
アレルゲン性の、医薬として適合性の担体媒体、例えば
蒸留水、リンゲル液、ハンク液、又は生理的食塩水中に
製剤化することができる。製剤はまた、非毒性安定剤、
例えばデキストロース及び非毒性溶解剤、例えばアルブ
ミンを含有することができる。ヒト又は動物へのIFN−
βの投与は、医師が適当と認めるところに従って、例え
ば静脈内、腹腔内、筋肉内、又は皮下に行うことができ
る。投与されるIFN−βミューテインの量は対象及びそ
の体重に従って一般に約１×104〜２×108ユニットの間
である。
状況が存在する。天然IFN−βの166個のアミノ酸配列を
第２図に示す。17位、31位及び141位に３個のシステイ
ン残基が存在する。17位のシステイン残基は生物学的活
性のために必須でないことが示されており、そして17位
に保存的アミノ酸置換を有するIFN−βミューテインは1
985年５月21日に発行された英国特許No.5,518,584に開
示されている。天然形及び変形形のIFN−βの両者に存
在するジスルフィド橋は141位と31位のシステイン間に
存在することが結論ずけられている。さらに、第２図に
示されるIFN−β配列は４個のメチオニン残基（１位、3
6位、62位、及び117位）を含有する。ser17IFN−βに対
して行われる精製法は、精製された臨床用IL−２製品か
ら得られるのと同様のRP−HPLC分析パターンを与える生
成物を提供する。前記の条件を用いるクロラミンＴによ
るIFN−βの酸化は、IL−２について観察されるのと同
様の効果をRP−HPLCパターンに与える。酸化されたメチ
オニンを含有するIFN−βの生物学的活性もやはり大き
く低下する。IL−２の104位のメチオニンの酸化に類似
する態様で、IFN−βの62位のメチオニンが選択的にス
ルホキシドに酸化される。影響を受けたメチオニンの位
置を決定するために、IL−２に関して下に記載するのと
同様にして、酸化形について得られたピークを分析する
ことができ、そしてIFN−β関連蛋白質の酸化耐性ミュ
ーテイン形を同様にして部位特異的変異誘発により得る
ことができる。酸化耐性IFN−βミューテインを回収し
た後、天然IFN−βと同様にして製剤化することができ
る。療法的又は診断的用途のため、これを無毒性の、非
アレルゲン性の、医薬として適合性の担体媒体、例えば
蒸留水、リンゲル液、ハンク液、又は生理的食塩水中に
製剤化することができる。製剤はまた、非毒性安定剤、
例えばデキストロース及び非毒性溶解剤、例えばアルブ
ミンを含有することができる。ヒト又は動物へのIFN−
βの投与は、医師が適当と認めるところに従って、例え
ば静脈内、腹腔内、筋肉内、又は皮下に行うことができ
る。投与されるIFN−βミューテインの量は対象及びそ
の体重に従って一般に約１×104〜２×108ユニットの間
である。
IFN−βミューテインは、ポリエチレングリコールの
ごとき活性化されたホモポリマーによる変形を含んで、
IL−２ミューテインについて記載したのと同様にして製
剤化することができる。
ごとき活性化されたホモポリマーによる変形を含んで、
IL−２ミューテインについて記載したのと同様にして製
剤化することができる。
IFN−βミューテインは抗ウイルス剤、抗乾癬剤、抗
増殖剤、免疫調節剤及び抗−腫瘍剤として有用である。
増殖剤、免疫調節剤及び抗−腫瘍剤として有用である。
上記のようにして精製されそして製剤化された場合、
62位において置換されたアラニンを有するIFN−βミュ
ーテインは天然配列を有するIFN−βに対して４％の生
物学的活性を有する。62位における他のアミノ酸置換は
異るレベルのIFN−β活性を示すと予想される。
62位において置換されたアラニンを有するIFN−βミュ
ーテインは天然配列を有するIFN−βに対して４％の生
物学的活性を有する。62位における他のアミノ酸置換は
異るレベルのIFN−β活性を示すと予想される。
C. 標準的方法 細胞の形質転換、ベクターの造成、プローブとのハイ
ブリダイゼーション等のために使用される技法のほとん
どは当業界において広く実施されており、そしてほとん
どの実施者は特定の条件及び方法を記載する標準的材料
に親しんでいる。しかしながら、便宜上下記の項がガイ
ドラインとして役立つであろう。
ブリダイゼーション等のために使用される技法のほとん
どは当業界において広く実施されており、そしてほとん
どの実施者は特定の条件及び方法を記載する標準的材料
に親しんでいる。しかしながら、便宜上下記の項がガイ
ドラインとして役立つであろう。
C.1. 宿主及び制御配列 DNA配列の発現のためには原核性宿主又は真核性宿主
のいずれも使用することができ、このような配列のクロ
ーニングには便宜上原核性宿主を使用する。原核生物は
最もしばしばE.コリの種々の株によって代表される。し
かしながら、他の微生物株、例えばバシルス、例えばバ
シルス・ズブチリス（Bacillus sbtilis）、シュードモ
ナス（Pseudomonas）の色々な種、又は他の細菌株も使
用することができる。このような原核系において、宿主
と適合成の種に由来する複製部位及び制御配列を含有す
るプラスミドベクターが使用される。例えば、E.コリは
典型的にはpBR322の誘導体を用いて形質転換される。こ
のプラスミドはBoliver等、Gene（1977）２:95,による
E.コリからのプラスミドである。pBR322はアンピシリン
耐性遺伝子及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含有し、
そしてそれ故に、目的とするベクターの造成において保
持され又は破壊することができる追加のマーカーを提供
する。一般に使用される原核性制御配列には、一般に使
用されるプロモーター系、例えばβ−ラクタマーゼ（ペ
ニシリナーゼ）プロモーター系及びラクトース（lac）
プロモーター系〔chang等，Nature（1977）198:105
6〕、及びトリプトファン（trp）プロモーター系〔Goed
del等，Nucleic Acids Res（1980）８:4057〕、λ由来P
Lプロモーター及びＮ−遺伝子リポゾーム結合部位〔シ
マタケ等，Nature（1981）292:128〕（1984年２月８日
に出願され同一承継人に承継された係属中の米国出願N
o.578,133に記載されているように、ポータブル制御カ
セットとして有用にされている）が含まれる。しかしな
がら、原核生物と適合性の任意の入手可能なプロモータ
ー系を使用することができる。
のいずれも使用することができ、このような配列のクロ
ーニングには便宜上原核性宿主を使用する。原核生物は
最もしばしばE.コリの種々の株によって代表される。し
かしながら、他の微生物株、例えばバシルス、例えばバ
シルス・ズブチリス（Bacillus sbtilis）、シュードモ
ナス（Pseudomonas）の色々な種、又は他の細菌株も使
用することができる。このような原核系において、宿主
と適合成の種に由来する複製部位及び制御配列を含有す
るプラスミドベクターが使用される。例えば、E.コリは
典型的にはpBR322の誘導体を用いて形質転換される。こ
のプラスミドはBoliver等、Gene（1977）２:95,による
E.コリからのプラスミドである。pBR322はアンピシリン
耐性遺伝子及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含有し、
そしてそれ故に、目的とするベクターの造成において保
持され又は破壊することができる追加のマーカーを提供
する。一般に使用される原核性制御配列には、一般に使
用されるプロモーター系、例えばβ−ラクタマーゼ（ペ
ニシリナーゼ）プロモーター系及びラクトース（lac）
プロモーター系〔chang等，Nature（1977）198:105
6〕、及びトリプトファン（trp）プロモーター系〔Goed
del等，Nucleic Acids Res（1980）８:4057〕、λ由来P
Lプロモーター及びＮ−遺伝子リポゾーム結合部位〔シ
マタケ等，Nature（1981）292:128〕（1984年２月８日
に出願され同一承継人に承継された係属中の米国出願N
o.578,133に記載されているように、ポータブル制御カ
セットとして有用にされている）が含まれる。しかしな
がら、原核生物と適合性の任意の入手可能なプロモータ
ー系を使用することができる。
細菌のほかに、真核性微生物、例えば酵母も宿主とし
て使用することができる。サッカロミセス・セレビシエ
ー（Saccharomyces cerevisiae）パン酵母の実験室株が
ほとんど使用される。但し他の多くの株を一般に入手可
能である。酵母での発現に適当なプラスミドベクターに
おいては、２ミクロン複製開始点〔Broach,J.R.,Meth.E
nz.（1983）101:307〕、及び例えばStinchcomd等，Natu
re（1979）282:39,Tschempe等，Gene（1980）10:157、
及びClark,L.等，Meth.Enz.（1983）101:300、により記
載されているものが使用される。酵母用ベクターのため
の制御配列には、解糖系酵母の合成のためのプロモータ
が包含される〔Hess等，J.Adv.Enzyme Reg.（1968）７:
149;Holland等，Biochemistry（1978）17:4900〕。当業
界において知られている他のプロモーターには、３−ホ
スホグリセレートキナーゼのためのプロモーター〔Hitz
eman等，J.Biol.Chem.（1980）255:2073〕、及び他の解
糖系酵母のためのプロモーターが包含される。増殖条件
により転写が制御されるという追加の利点を有する他の
プロモーター、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ−
２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代
謝に関連する分解酵素、並びにマルトース及びカラクト
ースの資化を担当する酵素のためのプロモーター領域も
使用可能である（Holland,前掲）。コード配列の３′末
端にターミネータ配列が存在するのが好ましいと信じら
れる。このようなターミネータは酵母由来遺伝子、例え
ばエノラーゼ遺伝子を含有するプラスミドpeno46〔Holl
and,M.J.等，J.Biol.Chem.（1981）256:1385〕、又はYE
p13から得られるLEU2遺伝子〔Broach,J.等，Gene（197
8）８:121〕のコード配列に続く３′−非翻訳領域中に
見出される。
て使用することができる。サッカロミセス・セレビシエ
ー（Saccharomyces cerevisiae）パン酵母の実験室株が
ほとんど使用される。但し他の多くの株を一般に入手可
能である。酵母での発現に適当なプラスミドベクターに
おいては、２ミクロン複製開始点〔Broach,J.R.,Meth.E
nz.（1983）101:307〕、及び例えばStinchcomd等，Natu
re（1979）282:39,Tschempe等，Gene（1980）10:157、
及びClark,L.等，Meth.Enz.（1983）101:300、により記
載されているものが使用される。酵母用ベクターのため
の制御配列には、解糖系酵母の合成のためのプロモータ
が包含される〔Hess等，J.Adv.Enzyme Reg.（1968）７:
149;Holland等，Biochemistry（1978）17:4900〕。当業
界において知られている他のプロモーターには、３−ホ
スホグリセレートキナーゼのためのプロモーター〔Hitz
eman等，J.Biol.Chem.（1980）255:2073〕、及び他の解
糖系酵母のためのプロモーターが包含される。増殖条件
により転写が制御されるという追加の利点を有する他の
プロモーター、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ−
２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代
謝に関連する分解酵素、並びにマルトース及びカラクト
ースの資化を担当する酵素のためのプロモーター領域も
使用可能である（Holland,前掲）。コード配列の３′末
端にターミネータ配列が存在するのが好ましいと信じら
れる。このようなターミネータは酵母由来遺伝子、例え
ばエノラーゼ遺伝子を含有するプラスミドpeno46〔Holl
and,M.J.等，J.Biol.Chem.（1981）256:1385〕、又はYE
p13から得られるLEU2遺伝子〔Broach,J.等，Gene（197
8）８:121〕のコード配列に続く３′−非翻訳領域中に
見出される。
IL−２の製造のために宿主として酵母を用いる利点は
次の通りである。均一な天然末端（アラニン）が達成さ
れ、このために蛋白質が十分に活性であり、蛋白質は58
−105ジスルフェド結合を有する形で分泌されるためこ
れを形成するために蛋白質をイン−ビトロ酸化する必要
がなく、この蛋白質は天然の蛋白質がそうであるように
３個のシステインを含有し、そしてこの蛋白質はE.コリ
中で生産された組換IL−２よりも可溶性である。酵母に
より生産されるIL−２ポリペプチドは天然源由来のIL−
２に一層よく類似するが、これはE.コリ宿主から最近可
能である程高収量で得られず、そして酵母から分泌され
たIL−２は翻訳後修飾から生ずる非天然グリコシル化を
含有する可能性がある。
次の通りである。均一な天然末端（アラニン）が達成さ
れ、このために蛋白質が十分に活性であり、蛋白質は58
−105ジスルフェド結合を有する形で分泌されるためこ
れを形成するために蛋白質をイン−ビトロ酸化する必要
がなく、この蛋白質は天然の蛋白質がそうであるように
３個のシステインを含有し、そしてこの蛋白質はE.コリ
中で生産された組換IL−２よりも可溶性である。酵母に
より生産されるIL−２ポリペプチドは天然源由来のIL−
２に一層よく類似するが、これはE.コリ宿主から最近可
能である程高収量で得られず、そして酵母から分泌され
たIL−２は翻訳後修飾から生ずる非天然グリコシル化を
含有する可能性がある。
いうまでもなく、ヒト以外の多細胞生物由来の真核性
宿主細胞培養物中で、ポリペプチドをコードする遺伝子
を発現せしめることも可能である。例えば、Tissue Cul
tures，アカデミックプレス、Cruz及びPatterson編（19
73）を参照のこと。有用な宿主細胞系には、VERO,HeLa
細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、及び
菌類系、例えばアスペルギルス（Aspegillus）が包含さ
れる。これらの細胞のための発現ベクターは一般に、哺
乳動物細胞と適合性のプロモーター及び制御配列、例え
ば一般に使用されるシミアンウイルス40（SV40）からの
初期及び後期プロモーター〔Fiers等，Nature（1978）2
73:113〕、又は他のウイルス性プロモーター、例えばポ
リオーマ、アデノウイルス２、ウシ乳頭腫ウイルス、又
は取類肉腫ウイルスからのウイルス性プロモーターを含
む。哺乳動物細胞宿主系形質転換の一般的概要はAxel,1
983年８月16日に発行された米国特許No.4,399,216に記
載されている。今や、発現の最適化において“エンハイ
ンサー”領域も重要なようであり、これらは一般に、非
コードDNA領域中のプロモーター領域の上流又は下流に
見出される配列である。必要であれば、複数開始点をウ
イルスから得ることができる。しかしながら、染色体へ
の組込みが真核生物におけるDNA複製の一般的機構であ
る。今や、植物細胞もまた宿主として使用することがで
き、そして植物細胞と適合性の制御配列、例えばノパリ
ン合成プロモータ及びポリアデニレーションシグナル配
列を使用することができる〔Depicker,A.等，J.Mol.App
l.Gen.（1982）１:561）。
宿主細胞培養物中で、ポリペプチドをコードする遺伝子
を発現せしめることも可能である。例えば、Tissue Cul
tures，アカデミックプレス、Cruz及びPatterson編（19
73）を参照のこと。有用な宿主細胞系には、VERO,HeLa
細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、及び
菌類系、例えばアスペルギルス（Aspegillus）が包含さ
れる。これらの細胞のための発現ベクターは一般に、哺
乳動物細胞と適合性のプロモーター及び制御配列、例え
ば一般に使用されるシミアンウイルス40（SV40）からの
初期及び後期プロモーター〔Fiers等，Nature（1978）2
73:113〕、又は他のウイルス性プロモーター、例えばポ
リオーマ、アデノウイルス２、ウシ乳頭腫ウイルス、又
は取類肉腫ウイルスからのウイルス性プロモーターを含
む。哺乳動物細胞宿主系形質転換の一般的概要はAxel,1
983年８月16日に発行された米国特許No.4,399,216に記
載されている。今や、発現の最適化において“エンハイ
ンサー”領域も重要なようであり、これらは一般に、非
コードDNA領域中のプロモーター領域の上流又は下流に
見出される配列である。必要であれば、複数開始点をウ
イルスから得ることができる。しかしながら、染色体へ
の組込みが真核生物におけるDNA複製の一般的機構であ
る。今や、植物細胞もまた宿主として使用することがで
き、そして植物細胞と適合性の制御配列、例えばノパリ
ン合成プロモータ及びポリアデニレーションシグナル配
列を使用することができる〔Depicker,A.等，J.Mol.App
l.Gen.（1982）１:561）。
C.2. 形質転換 使用する宿主細胞に依存して、形質転換はその細胞に
適当な標準的技法を用いて行われる。Cohen,S.N.,Proc.
Natl.Acad.Sci.（USA）（1972）69:2110により記載され
た塩化カルシウムを用いるカルシウム処理法、又はMani
atis等，Molecular Cloning:A Laboratory Manwal（198
2），コールドスプリング・ハバー・プレス,254頁に記
載されているRbCl2法が、原核性細胞又は実質的な細胞
壁障壁を有する他の細胞のために有用である。アグロバ
クテリウム・チュメファシエンス（Agrobactrium tumef
aciensによる感染〔Shaw,C.H.等，Gene（1983）23:31
5〕がある種の植物細胞のために使用される。この様な
細胞壁を有しない哺乳動物細胞のためには、Craham及び
Van der Eb,Virology（1978）52:546のリン酸カルシウ
ム沈澱法が好ましい。酵母への形質転換は、Van Soling
en,P.等、J.Bact.（1977）130:946、Hsiao,C.L.等，Pro
c.Natl.Acad.Sci.（USA）（1979）76:3829、及びKlebe,
R.J.等，Gene（1983）25:333、の方法に従って行われ
る。
適当な標準的技法を用いて行われる。Cohen,S.N.,Proc.
Natl.Acad.Sci.（USA）（1972）69:2110により記載され
た塩化カルシウムを用いるカルシウム処理法、又はMani
atis等，Molecular Cloning:A Laboratory Manwal（198
2），コールドスプリング・ハバー・プレス,254頁に記
載されているRbCl2法が、原核性細胞又は実質的な細胞
壁障壁を有する他の細胞のために有用である。アグロバ
クテリウム・チュメファシエンス（Agrobactrium tumef
aciensによる感染〔Shaw,C.H.等，Gene（1983）23:31
5〕がある種の植物細胞のために使用される。この様な
細胞壁を有しない哺乳動物細胞のためには、Craham及び
Van der Eb,Virology（1978）52:546のリン酸カルシウ
ム沈澱法が好ましい。酵母への形質転換は、Van Soling
en,P.等、J.Bact.（1977）130:946、Hsiao,C.L.等，Pro
c.Natl.Acad.Sci.（USA）（1979）76:3829、及びKlebe,
R.J.等，Gene（1983）25:333、の方法に従って行われ
る。
C.B. cDNA又はゲノムライブラリーのプローブ検出 cDNA又はゲノムライブラリーはコロニーハイブリダイ
ゼーション法を用いてスクリーニングする。各ミクロタ
イタープレートを２重のニトロセルロース紙（Ｓ＆Ｓ
タイプBA−85）にレプリカし、そして50μg/mlのアンピ
シリンを含有するＬ寒天上で14〜16時間、37℃にてコロ
ニーを増殖せしめる。コロニーを溶解し、フィルターを
500mM NaOH,1.5M NaClで５分間続けて処理することによ
りDNAを紙上に固定する。紙を、5X標準食塩クエン
酸塩（SSC）を用いて５分間ずつ２回洗浄する。紙を
空気乾燥し、そして80℃にて２時間焼成する。２重の
紙を、所望の温度において所望の時間にわたり、紙当
り10mlのDNAハイブリダイゼーショ緩衝液〔5XSSC（pH7.
0）、5Xデンハート溶液（ポリビニルピロリドン＋フィ
コール及びウシ血清アルブミン;1Xは各0.02％であ
る）、50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）、0.2％SD
S、20μg/mlポリＵ、及び50μg/ml変性サケ精子DNA〕と
ハイブリダイズせしめる。
ゼーション法を用いてスクリーニングする。各ミクロタ
イタープレートを２重のニトロセルロース紙（Ｓ＆Ｓ
タイプBA−85）にレプリカし、そして50μg/mlのアンピ
シリンを含有するＬ寒天上で14〜16時間、37℃にてコロ
ニーを増殖せしめる。コロニーを溶解し、フィルターを
500mM NaOH,1.5M NaClで５分間続けて処理することによ
りDNAを紙上に固定する。紙を、5X標準食塩クエン
酸塩（SSC）を用いて５分間ずつ２回洗浄する。紙を
空気乾燥し、そして80℃にて２時間焼成する。２重の
紙を、所望の温度において所望の時間にわたり、紙当
り10mlのDNAハイブリダイゼーショ緩衝液〔5XSSC（pH7.
0）、5Xデンハート溶液（ポリビニルピロリドン＋フィ
コール及びウシ血清アルブミン;1Xは各0.02％であ
る）、50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）、0.2％SD
S、20μg/mlポリＵ、及び50μg/ml変性サケ精子DNA〕と
ハイブリダイズせしめる。
サンプルを、所望の厳重さに依存する条件下で、キナ
ーゼ処理されたプローブとハイブリダイズせしめる。典
型的な中程度に厳重な条件は、プローブ含有DNAハイブ
リダイゼーション緩衝液１〜5ml/紙と共に、24〜36時
間にわたる42℃の温度を用いる。一層高い厳重さのため
によりより高い温度及びより短い時間を用い、そして一
層低い厳重さのためにはこの逆の条件を用いる。紙
を、30分間ずつ４回、37℃にて、2XSSC,0.2％SDS及び50
mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7）で洗浄し、そして2XS
SC及び0.2％SDSで２回洗浄し、空気乾燥し、−70℃にて
２〜３日間オートラジオグラフ処理する。
ーゼ処理されたプローブとハイブリダイズせしめる。典
型的な中程度に厳重な条件は、プローブ含有DNAハイブ
リダイゼーション緩衝液１〜5ml/紙と共に、24〜36時
間にわたる42℃の温度を用いる。一層高い厳重さのため
によりより高い温度及びより短い時間を用い、そして一
層低い厳重さのためにはこの逆の条件を用いる。紙
を、30分間ずつ４回、37℃にて、2XSSC,0.2％SDS及び50
mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7）で洗浄し、そして2XS
SC及び0.2％SDSで２回洗浄し、空気乾燥し、−70℃にて
２〜３日間オートラジオグラフ処理する。
C.4. ベクターの造成 所望のコード配列及び制御配列を含有する適当なベク
ターの造成は、当業界においてよく知られている標準的
連結及び制限技法を用いる。単離されたプラスミド、DN
A配列、又は合成されたオリゴヌクレオチドは切断さ
れ、仕立てられ、そして所望の形に連結される。部位特
異的なDNA切断は当業界において一般に理解されている
条件下で適切な制限酵素を用いて行い、その具体的な条
件は商業的に入手可能な制限酵素の製造者により特定さ
れている。例えば、ニューイングランドビオラブスの製
品カタログを参照のこと。一般に、１μｇのプラスミド
又はDNA配列が１ユニットの酵素により約20μの緩衝
液中で切断される。この発明の例においては、典型的に
は、DNA基質の完全な消化を保証するため過剰の制限酵
素を用いる。約37℃にて約１〜２時間の反応時間が有効
であり、但し変更することも可能である。各イキュベー
ションの後、フェノール／クロロホルムで抽出すること
により蛋白質を除去し、そして次にエーテル抽出するこ
ともでき、そして核酸をエタノールで沈澱せしめ、次に
セファデックスＧ−50スピンカラムに直すことにより水
性画分から回収する。所望により、標準的方法を用い
て、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はアガロースゲ
ル電気泳動により、切断された断片のサイズ分離を行
う。サイズ分離の一般的記載はMethod in Enzymology
（1980）65:499−560中に見られる。
ターの造成は、当業界においてよく知られている標準的
連結及び制限技法を用いる。単離されたプラスミド、DN
A配列、又は合成されたオリゴヌクレオチドは切断さ
れ、仕立てられ、そして所望の形に連結される。部位特
異的なDNA切断は当業界において一般に理解されている
条件下で適切な制限酵素を用いて行い、その具体的な条
件は商業的に入手可能な制限酵素の製造者により特定さ
れている。例えば、ニューイングランドビオラブスの製
品カタログを参照のこと。一般に、１μｇのプラスミド
又はDNA配列が１ユニットの酵素により約20μの緩衝
液中で切断される。この発明の例においては、典型的に
は、DNA基質の完全な消化を保証するため過剰の制限酵
素を用いる。約37℃にて約１〜２時間の反応時間が有効
であり、但し変更することも可能である。各イキュベー
ションの後、フェノール／クロロホルムで抽出すること
により蛋白質を除去し、そして次にエーテル抽出するこ
ともでき、そして核酸をエタノールで沈澱せしめ、次に
セファデックスＧ−50スピンカラムに直すことにより水
性画分から回収する。所望により、標準的方法を用い
て、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はアガロースゲ
ル電気泳動により、切断された断片のサイズ分離を行
う。サイズ分離の一般的記載はMethod in Enzymology
（1980）65:499−560中に見られる。
制限酵素により切断された断片は、50mM Tris（pH7.
6）、50mM NaCl、6mM MgCl2、6mM DTT及び５〜10μM dN
TP中、20〜25℃にて約15〜25分間のインキュベーション
時間を用いて、４種類のデオキシヌクレオチドトリホス
フェート（dNTP）の存在下でE.コリDNAポリメラーゼ１
の大断片（Klenow）で処理することにより、平滑末端化
することができる。Klenow断片は５′接着末端をフィル
−インするが、しかし４種類のdNTPが存在する場合でさ
え、突出した３′単鎖をチューバックする。所望によ
り、接着末端の種類により決定される限界内で１種類の
みの又は選択された複数のdNTPを供給することにより、
選択的修復を行うことができる。Klenowで処理した後、
混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、そしてエ
タノール沈澱を行い、次にセファデックスＧ−50スピン
カラムに通す。S1ヌクレアーゼによる適当な条件下での
処理が単鎖部分の加水分解をもたらす。
6）、50mM NaCl、6mM MgCl2、6mM DTT及び５〜10μM dN
TP中、20〜25℃にて約15〜25分間のインキュベーション
時間を用いて、４種類のデオキシヌクレオチドトリホス
フェート（dNTP）の存在下でE.コリDNAポリメラーゼ１
の大断片（Klenow）で処理することにより、平滑末端化
することができる。Klenow断片は５′接着末端をフィル
−インするが、しかし４種類のdNTPが存在する場合でさ
え、突出した３′単鎖をチューバックする。所望によ
り、接着末端の種類により決定される限界内で１種類の
みの又は選択された複数のdNTPを供給することにより、
選択的修復を行うことができる。Klenowで処理した後、
混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、そしてエ
タノール沈澱を行い、次にセファデックスＧ−50スピン
カラムに通す。S1ヌクレアーゼによる適当な条件下での
処理が単鎖部分の加水分解をもたらす。
合成オリゴヌクレオチドは、Matteucci等，J.Am.Che
m.Soc.（1981）103:3185、のトリエステル法により、又
は市販のオリゴヌクレオチド合成機を用いて調製する。
アニーリング又はラベル化に先行する単鎖のキナーゼ処
理は、50mM Tris（pH7.6）、10mM MgCl2、5mMジチオス
レイトール、１〜2mM ATP、1.7pmolγ32P−ATP（2.9m C
i/mmole）、0.1mMスペルミジン、0.1mM EDTAの存在下、
0.1n mleの基質に対して過剰の、例えば約10ユニットの
ポリヌクレオチドキナーゼを用いることにより達成す
る。
m.Soc.（1981）103:3185、のトリエステル法により、又
は市販のオリゴヌクレオチド合成機を用いて調製する。
アニーリング又はラベル化に先行する単鎖のキナーゼ処
理は、50mM Tris（pH7.6）、10mM MgCl2、5mMジチオス
レイトール、１〜2mM ATP、1.7pmolγ32P−ATP（2.9m C
i/mmole）、0.1mMスペルミジン、0.1mM EDTAの存在下、
0.1n mleの基質に対して過剰の、例えば約10ユニットの
ポリヌクレオチドキナーゼを用いることにより達成す
る。
連結は次の標準的条件及び温度のもとで15〜30μの
容積中で行う。20mM Tris−Cl（pH7.5）、10mM MgCl2、
10mM DTT、33μg/ml BSA、10mM〜50mM NaCl;及び40μM
ATP、0.01〜0.02（Weiss）ユニットT4 DNAリガーゼ、０
℃にて（“接着末端”連結のため）；又は1mM ATP、0.3
〜0.6（Weiss）ユニットT4 DNAリガーゼ、14℃にて
（“平滑末端”連結のため）。分子間“接着末端”連結
は通常、33〜100μg/mlの合計DNA濃度（５〜100nMの合
計末端濃度）において行う。分子間平滑末端連結（通常
10〜30倍過剰のリンカーを用いる）は１μＭの合計末端
濃度において行う。
容積中で行う。20mM Tris−Cl（pH7.5）、10mM MgCl2、
10mM DTT、33μg/ml BSA、10mM〜50mM NaCl;及び40μM
ATP、0.01〜0.02（Weiss）ユニットT4 DNAリガーゼ、０
℃にて（“接着末端”連結のため）；又は1mM ATP、0.3
〜0.6（Weiss）ユニットT4 DNAリガーゼ、14℃にて
（“平滑末端”連結のため）。分子間“接着末端”連結
は通常、33〜100μg/mlの合計DNA濃度（５〜100nMの合
計末端濃度）において行う。分子間平滑末端連結（通常
10〜30倍過剰のリンカーを用いる）は１μＭの合計末端
濃度において行う。
“ベクター断片”を用いるベクターの造成において
は、一般にベクター断片を細菌アルカリホスファアター
ゼ（BAP）で処理して５′のリン酸を除去し、そしてベ
クターの再連結を防止する。BAP消化は、pH8にて約150m
M Tris中で、Na+及びMg+2の存在下で、ベクターμｇ当
り約１ユニットのBAPを用いて約１時間行う。核酸断片
を回収するため、調製物をフェノール／クロロホルムで
抽出し、そしてエタノール沈澱し、そしてセファデック
スＧ−50スピンカラムに適用することによって抽出す
る。別の方法として、不所望の断片の追加の制限酵素消
化により２重消化されたベクターにおいて再連結を防止
することができる。
は、一般にベクター断片を細菌アルカリホスファアター
ゼ（BAP）で処理して５′のリン酸を除去し、そしてベ
クターの再連結を防止する。BAP消化は、pH8にて約150m
M Tris中で、Na+及びMg+2の存在下で、ベクターμｇ当
り約１ユニットのBAPを用いて約１時間行う。核酸断片
を回収するため、調製物をフェノール／クロロホルムで
抽出し、そしてエタノール沈澱し、そしてセファデック
スＧ−50スピンカラムに適用することによって抽出す
る。別の方法として、不所望の断片の追加の制限酵素消
化により２重消化されたベクターにおいて再連結を防止
することができる。
C.5 造成の確認 下記の造成において、プラスミド造成の正しい連結
は、まず、E.コリ・ゼネティック・ストック・センター
（E.coli Genetic Stock Center）CGSCから得られるE.
コリMM294株、又は他の適当な宿主を連結混合物により
形質転換することにより確認される。好結果の形質転換
体を、アンピシリン、テトラサイクリンもしくは他の適
当な抗生物質に対する耐性により、又はプラスミド造成
の態様に依存して他のマーカーを用いて選択する。次
に、形質転換体からのプラスミドをClewell,D.B.等、Pr
oc.Natl.Acad.Sci.（USA）（1969）62:1159の方法に行
って調製し、場合によってはその前にクロラムフェニコ
ール増幅〔Clewell,D.B.等，J.Bacteriol.（1972）110:
667〕を行う。単離されたDNAを制限酵素処理により分析
し、そして／又はSanger,F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.
（USA）（1977）74:5463〔さらにMessing等、Ncleic Ac
ids Res.（1981）９:309により記載されている〕のジデ
オキシ法により、又はMaxam等、Methods in Enzymology
（1980）65:499の方法により配列決定する。
は、まず、E.コリ・ゼネティック・ストック・センター
（E.coli Genetic Stock Center）CGSCから得られるE.
コリMM294株、又は他の適当な宿主を連結混合物により
形質転換することにより確認される。好結果の形質転換
体を、アンピシリン、テトラサイクリンもしくは他の適
当な抗生物質に対する耐性により、又はプラスミド造成
の態様に依存して他のマーカーを用いて選択する。次
に、形質転換体からのプラスミドをClewell,D.B.等、Pr
oc.Natl.Acad.Sci.（USA）（1969）62:1159の方法に行
って調製し、場合によってはその前にクロラムフェニコ
ール増幅〔Clewell,D.B.等，J.Bacteriol.（1972）110:
667〕を行う。単離されたDNAを制限酵素処理により分析
し、そして／又はSanger,F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.
（USA）（1977）74:5463〔さらにMessing等、Ncleic Ac
ids Res.（1981）９:309により記載されている〕のジデ
オキシ法により、又はMaxam等、Methods in Enzymology
（1980）65:499の方法により配列決定する。
C.6 宿主の例 この発明でクローニング及び発現において使用される
宿主株は次の通りである。
宿主株は次の通りである。
クローニング及び配列決定のため、並びにほとんどの
細菌性プロモーターの制御のもとでの造成物の発現のた
め、E.コリMM294株（前掲）〔Talmadge,K.等，Gene（19
80）12:235;Meselson,M.等，Nature（1968）217:1110〕
を宿主として使用した。
細菌性プロモーターの制御のもとでの造成物の発現のた
め、E.コリMM294株（前掲）〔Talmadge,K.等，Gene（19
80）12:235;Meselson,M.等，Nature（1968）217:1110〕
を宿主として使用した。
M13ファージ組換体のため、ファージの感染に感受性
のE.コリ株、例えばE.コリK12、DG98を使用する。DG98
株は1984年７月13日にATCCに寄託され、そして受託番号
39,768を有する。酵母の形質転換のため、S.セレビシュ
ーの株、例えばC468〔Innis,M.A.等，Science（1985）2
28:21−26〕、遅びそのcir゜誘導体を使用した。C468ci
r゜は1985年12月13日にATCCに寄託され、そしてATCC受
託番号20787を有する。E.コリ中でのIFN−βミューテイ
ンの発現のため、MM294のごとき株が使用され、この菌
株は1984年２月14日にATCCに寄託され、そしてATCC受託
番号39,607を有する。
のE.コリ株、例えばE.コリK12、DG98を使用する。DG98
株は1984年７月13日にATCCに寄託され、そして受託番号
39,768を有する。酵母の形質転換のため、S.セレビシュ
ーの株、例えばC468〔Innis,M.A.等，Science（1985）2
28:21−26〕、遅びそのcir゜誘導体を使用した。C468ci
r゜は1985年12月13日にATCCに寄託され、そしてATCC受
託番号20787を有する。E.コリ中でのIFN−βミューテイ
ンの発現のため、MM294のごとき株が使用され、この菌
株は1984年２月14日にATCCに寄託され、そしてATCC受託
番号39,607を有する。
以下に記載する例において、特にことわらない限り、
すべての温度は℃で示され、そしてすべての部及び％は
重量による。これらの例は単に例示的なものであって、
限定的なものではない。従って、IL−２及びIFN−βの
他の関連形、又は他の蛋白質を使用することができ、そ
して蛋白質を得るために他の発現系を使用することがで
きる。例えば、この明細書に記載するリーダー配列を欠
く細胞内酵母生成物が得られるように酵母造成物を設計
することができる。上記のように、既知の制御配列を用
いて、目的コード配列を種々の原核性宿主系及び真核性
宿主系で発現せしめることができる。
すべての温度は℃で示され、そしてすべての部及び％は
重量による。これらの例は単に例示的なものであって、
限定的なものではない。従って、IL−２及びIFN−βの
他の関連形、又は他の蛋白質を使用することができ、そ
して蛋白質を得るために他の発現系を使用することがで
きる。例えば、この明細書に記載するリーダー配列を欠
く細胞内酵母生成物が得られるように酵母造成物を設計
することができる。上記のように、既知の制御配列を用
いて、目的コード配列を種々の原核性宿主系及び真核性
宿主系で発現せしめることができる。
例 D. E.コリにおけるdes−ala1Ala104Ser125IL−２の発
現 次に特定の例は、関連蛋白質としてのIL−２の特定の
活性形へのこの発明の方法の適用を例示するために用い
る。この例においては、104位のメチオニンのコドンの
代りにアラニンのコドンを生じさせる適切な置換を有す
るコード配列が、trpプロモーター系を用いる発現ベク
ター中に連結され、そして生じたベクターがE.コリ中で
目的蛋白質を生産するために用いられる。（des−ala1
はIL−２の１位のアラニンが除去されていることを示
す。） D.1. クロラミンＴに対して選択的に感受性のIL−２中
のメチオニン残基の同定 関連蛋白質としてdes−ala1Ser125IL−２を使用し
た。製造的規模の技法を用いてこの蛋白質を製造し、そ
して見かけ上均一になるまで精製した。しかし、このも
のは、さらに鋭敏な分析法を適用した場合不均一である
ことが見出された。色々な種の分析は、IL−２中のメチ
オニン104の感受性残基としての同定に同意し、この残
基のスルホキシドへの転換は最終生成物中の不均一性の
大部分を説明する。
現 次に特定の例は、関連蛋白質としてのIL−２の特定の
活性形へのこの発明の方法の適用を例示するために用い
る。この例においては、104位のメチオニンのコドンの
代りにアラニンのコドンを生じさせる適切な置換を有す
るコード配列が、trpプロモーター系を用いる発現ベク
ター中に連結され、そして生じたベクターがE.コリ中で
目的蛋白質を生産するために用いられる。（des−ala1
はIL−２の１位のアラニンが除去されていることを示
す。） D.1. クロラミンＴに対して選択的に感受性のIL−２中
のメチオニン残基の同定 関連蛋白質としてdes−ala1Ser125IL−２を使用し
た。製造的規模の技法を用いてこの蛋白質を製造し、そ
して見かけ上均一になるまで精製した。しかし、このも
のは、さらに鋭敏な分析法を適用した場合不均一である
ことが見出された。色々な種の分析は、IL−２中のメチ
オニン104の感受性残基としての同定に同意し、この残
基のスルホキシドへの転換は最終生成物中の不均一性の
大部分を説明する。
D.1.a E.コリにおける関連蛋白質の調製 des−ala1ser125IL−２は天然配列の４個のメチオニ
ン残基を含有する生物学的に活性なミューテインであ
る。このものは、pLW45、すなわちtrpプロモーターの制
御のもとにての蛋白質のためのコード配列を含有する発
現ベクターで形質転換されたE.コリK12株MM294から製造
された。この形質転換された菌株は、1984年５月６日に
ATCCに寄託され、そしてATCC受託番号39,626を有する。
ン残基を含有する生物学的に活性なミューテインであ
る。このものは、pLW45、すなわちtrpプロモーターの制
御のもとにての蛋白質のためのコード配列を含有する発
現ベクターで形質転換されたE.コリK12株MM294から製造
された。この形質転換された菌株は、1984年５月６日に
ATCCに寄託され、そしてATCC受託番号39,626を有する。
pLW45で形質転換されたE.コリを次のようにして増殖
せしめた。
せしめた。
培地組成 （NH4）2SO4 150 mM KH2PO4 21.6mM Na3サイトレート 1.5mM ZnSO4・7H2O 30 μＭ MnSO4・H2O 30 μＭ CuSO4・5H2O １ μＭ pHを2.5N NaOHにより6.50に調整し、そして混合物を
オートクレーブ殺菌した。
オートクレーブ殺菌した。
無菌条件下（オートクレーブ後に）で、次のものを下
記の示す最終濃度まで加えた。
記の示す最終濃度まで加えた。
MgSO4 3mM FeSO4 100μＭ Ｌ−トリプトファン 14mg/ チアミン−HCl 20mg/ グルコース 5g/ テトラサイクリン 5mg/ エタノール ２％ カザミノ酸 ２％ ダウコーニングアンチフォーム、ポリエチレングルコ
ール20％溶液、グルコース50％溶液、5N KOHを必要に応
じて加え、そして発酵槽中で発酵を続けた。
ール20％溶液、グルコース50％溶液、5N KOHを必要に応
じて加え、そして発酵槽中で発酵を続けた。
発酵槽のpHを5N KOHにより6.8に維持した。残留グル
コースを５〜10g/の間に、溶存酵素を40％にそして温
度を37±１℃に維持した。OD680が約10となったとき、
カザミノ酸（20％ストック溶液）を２％の濃度に加え
た。ODが約20に対したとき集菌を行なった。
コースを５〜10g/の間に、溶存酵素を40％にそして温
度を37±１℃に維持した。OD680が約10となったとき、
カザミノ酸（20％ストック溶液）を２％の濃度に加え
た。ODが約20に対したとき集菌を行なった。
D.1.b. 関連蛋白質の精製 細胞を溶解し、そしてIL−２ミューテインを次のよう
にして精製した。
にして精製した。
要約すれば、集菌した細胞を、例えば中空繊維過に
より濃縮し、そして約20〜40gの材料を200mlの50mM Tri
s/1mM EDTA（pH8.1〜8.5）に再懸濁し、そして3000〜40
00xgにて10分間遠心分離した。ペレットを200mlのTris/
EDTA緩衝液に４℃にて再懸濁し、そして超音波処理し
た。超音波処理物から目的蛋白質を含有する細胞破片を
遠心分離により回収し、そしてペレットを60mlのTrtis/
EDTA緩衝液に室温にて再懸濁した。急速な撹拌を続けな
がら、同容量の、同じ緩衝液中8M尿素を５分間にわたっ
て加えた。ゆるやかな撹拌を15〜30分間続けた後、やは
り目的蛋白質を含有する破片を、12,000xgにて15分間遠
心分離することにより回収した。尿素抽出されたペレッ
トを9mlの50mMリン酸ナトリウム（pH6.8）、1mM EDTA、
10mM DTT中に20℃にて再懸濁し、20％SDSを２％の最終
濃度に加え、そして懸濁液を５分間激しく撹拌した。今
や目的蛋白質を含有する上清を、室温にて10分間12,000
xgで遠心分離した後に回収した。スルヒドリル基の完全
な還元を保証するため、上清を15分間40℃に加熱した。
より濃縮し、そして約20〜40gの材料を200mlの50mM Tri
s/1mM EDTA（pH8.1〜8.5）に再懸濁し、そして3000〜40
00xgにて10分間遠心分離した。ペレットを200mlのTris/
EDTA緩衝液に４℃にて再懸濁し、そして超音波処理し
た。超音波処理物から目的蛋白質を含有する細胞破片を
遠心分離により回収し、そしてペレットを60mlのTrtis/
EDTA緩衝液に室温にて再懸濁した。急速な撹拌を続けな
がら、同容量の、同じ緩衝液中8M尿素を５分間にわたっ
て加えた。ゆるやかな撹拌を15〜30分間続けた後、やは
り目的蛋白質を含有する破片を、12,000xgにて15分間遠
心分離することにより回収した。尿素抽出されたペレッ
トを9mlの50mMリン酸ナトリウム（pH6.8）、1mM EDTA、
10mM DTT中に20℃にて再懸濁し、20％SDSを２％の最終
濃度に加え、そして懸濁液を５分間激しく撹拌した。今
や目的蛋白質を含有する上清を、室温にて10分間12,000
xgで遠心分離した後に回収した。スルヒドリル基の完全
な還元を保証するため、上清を15分間40℃に加熱した。
尿素ペレットの還元されたSDS抽出物を、室温にて、1
mM DTTを含有する同容量の２−ブタノールで抽出した。
pH8.0に調整された有機相を、10mMリン酸ナトリウム、2
mM DTT（pH6）中0.1％SDSにゆっくり加え、そして20分
間撹拌して沈殿を生じさせ、これを回収し、リン酸緩衝
化塩溶液中５％SDSに懸濁し、そして上記のようにして
加熱することにより還元した。得られた溶液（pH5.5に
調整）をセファクリル−200カラムを用いるゲル過に
より精製した。
mM DTTを含有する同容量の２−ブタノールで抽出した。
pH8.0に調整された有機相を、10mMリン酸ナトリウム、2
mM DTT（pH6）中0.1％SDSにゆっくり加え、そして20分
間撹拌して沈殿を生じさせ、これを回収し、リン酸緩衝
化塩溶液中５％SDSに懸濁し、そして上記のようにして
加熱することにより還元した。得られた溶液（pH5.5に
調整）をセファクリル−200カラムを用いるゲル過に
より精製した。
この溶液を、50mM酢酸ナトリウム（pH5.5）、1mM EDT
A、2mM DTT、１％SDS中で2.6cm×95cm S−200カラムに
負荷した。IL−２活性の最高濃度及び最低汚染物濃度を
含有する画分をプールし、遠心分離し、還元し、そして
８〜50μＭ塩化第２銅を用いて酸化した。この酸化にお
いては、可溶化形のIL−２を空気の存在下６〜８のpHに
おいて、CuCl2により処理する。（この酸化が58位及び1
05位のシステイン残基を連結して所望のシスチン連結を
形成する。）この酸化された蛋白質を調製用RP−HPLCに
よりさらに精製し、そしてIL−２のピークをプールし、
マンニトールを５％に加えた後凍結乾燥した。IL−２蛋
白質を、0.1％SDSを含有する50mMリン酸ナトリウム緩衝
液（pH6.8）中にもとの容量に再懸濁し、そして生物活
性（標準的HT−２細胞増殖アッセイを使用する）、蛋白
質濃度（ローリー）、及び純度（RP−HPLC及び非還元SD
S−PAGEによる）について測定した。比生物活性は天然
ジャーカットIL−２のそれと同じ（４×106ユニット/m
g）であり、そして純度は95％以上であった。
A、2mM DTT、１％SDS中で2.6cm×95cm S−200カラムに
負荷した。IL−２活性の最高濃度及び最低汚染物濃度を
含有する画分をプールし、遠心分離し、還元し、そして
８〜50μＭ塩化第２銅を用いて酸化した。この酸化にお
いては、可溶化形のIL−２を空気の存在下６〜８のpHに
おいて、CuCl2により処理する。（この酸化が58位及び1
05位のシステイン残基を連結して所望のシスチン連結を
形成する。）この酸化された蛋白質を調製用RP−HPLCに
よりさらに精製し、そしてIL−２のピークをプールし、
マンニトールを５％に加えた後凍結乾燥した。IL−２蛋
白質を、0.1％SDSを含有する50mMリン酸ナトリウム緩衝
液（pH6.8）中にもとの容量に再懸濁し、そして生物活
性（標準的HT−２細胞増殖アッセイを使用する）、蛋白
質濃度（ローリー）、及び純度（RP−HPLC及び非還元SD
S−PAGEによる）について測定した。比生物活性は天然
ジャーカットIL−２のそれと同じ（４×106ユニット/m
g）であり、そして純度は95％以上であった。
D.1.c. スルホキシド含有蛋白質の検出及び分析 D.1.b.項からの酸化されたdes−ala1ser125IL−２を
分析用RP−HPLCにかけた場合、第３図Ａに示す結果が得
られた。主IL−２含有ピーク（ピークＢ）に先行して小
ピーク（ピークＡ）が現れる。ピークＡもまたIL−２で
あることが示された。但し、このものは104位にメチオ
ニンスルホキシド残基を含有する。
分析用RP−HPLCにかけた場合、第３図Ａに示す結果が得
られた。主IL−２含有ピーク（ピークＢ）に先行して小
ピーク（ピークＡ）が現れる。ピークＡもまたIL−２で
あることが示された。但し、このものは104位にメチオ
ニンスルホキシド残基を含有する。
ピークＡとIL−２中に酸化されたメチオニンとの相互
関係を、前記の標準的条件下でサンプルをクロラミンＴ
により酸化し、そして酸化されたサンプルを分析用RP−
HPLCにかけることによって確認した。第３図Ａはクロラ
ミンＴ酸化前のRP−HPLCを示し、そして第３図Ｂはクロ
ラミンＴ酸化後のRP−HPLCを示す。第３図Ｂは、第３図
ＡのピークＢ蛋白質の実質的にすべてがクロラミンＴ処
理後にピークＡの位置に現われることを示している。こ
れは、メチオニンに対するクララミンＴの既知の特異性
〔Shechter,Y,等（前掲）〕に基く前記の説明と一致す
る。酸化剤としてクロラミンＴの代りに30mM過酸化水素
を用いる同様の実験において類似の結果が得られた。
（第４図Ａ及び第４図Ｂを参照のこと。） 特定のメチオニンの酸化速度は三次元構造におけるそ
の位置に依在し、そしてそれ故に特定の配列中のメチオ
ニン残基は感受性を異にすることが知られている。IL−
２中の感受性メチオニンの位置を２つの方法により得
た。１つの方法においては、特に多量のピークＡを含有
する１つのロットのピークＡ及びピークＢの両者をRP−
HPLC上での精製により分離し、シアノゲンブロミド（こ
の物質はメチオニン残基において蛋白質を切断するが、
しかしメチオニンスルホキシド残基においては切断しな
い）に暴露し、そして次にRP−HPLC蛋白質マッピング及
びアミノ酸配列により、又は完全消化物のＮ−末端配列
分析により試験した。各RP−HPLCピークからの400μｇ
の材料を、1mgのシアノゲンブロミドを含有する70％蟻
酸1ml中に溶解した。暗中で16時間インキュベートした
後、サンプルを水で10倍に稀釈し、凍結乾燥し、そして
１％SDSを含有する0.15M Tris−HCl（pH8.8）1mlに再溶
解した。50μのアリコートを、ジチオエリスリトール
（DTE）による還元の前後にHPLCにより試験した。この
還元は1mgのDTEを加え、そして85℃に１時間インキュベ
ートすることにより行なった。得られた結果の解析によ
り、ピークB IL−２中のすべてのメチオニンは実質的に
変化しないが、ピークＡにおいては各分子の104位のメ
チオニン残稀のみがスルホキシドに酸化されていること
が示された。
関係を、前記の標準的条件下でサンプルをクロラミンＴ
により酸化し、そして酸化されたサンプルを分析用RP−
HPLCにかけることによって確認した。第３図Ａはクロラ
ミンＴ酸化前のRP−HPLCを示し、そして第３図Ｂはクロ
ラミンＴ酸化後のRP−HPLCを示す。第３図Ｂは、第３図
ＡのピークＢ蛋白質の実質的にすべてがクロラミンＴ処
理後にピークＡの位置に現われることを示している。こ
れは、メチオニンに対するクララミンＴの既知の特異性
〔Shechter,Y,等（前掲）〕に基く前記の説明と一致す
る。酸化剤としてクロラミンＴの代りに30mM過酸化水素
を用いる同様の実験において類似の結果が得られた。
（第４図Ａ及び第４図Ｂを参照のこと。） 特定のメチオニンの酸化速度は三次元構造におけるそ
の位置に依在し、そしてそれ故に特定の配列中のメチオ
ニン残基は感受性を異にすることが知られている。IL−
２中の感受性メチオニンの位置を２つの方法により得
た。１つの方法においては、特に多量のピークＡを含有
する１つのロットのピークＡ及びピークＢの両者をRP−
HPLC上での精製により分離し、シアノゲンブロミド（こ
の物質はメチオニン残基において蛋白質を切断するが、
しかしメチオニンスルホキシド残基においては切断しな
い）に暴露し、そして次にRP−HPLC蛋白質マッピング及
びアミノ酸配列により、又は完全消化物のＮ−末端配列
分析により試験した。各RP−HPLCピークからの400μｇ
の材料を、1mgのシアノゲンブロミドを含有する70％蟻
酸1ml中に溶解した。暗中で16時間インキュベートした
後、サンプルを水で10倍に稀釈し、凍結乾燥し、そして
１％SDSを含有する0.15M Tris−HCl（pH8.8）1mlに再溶
解した。50μのアリコートを、ジチオエリスリトール
（DTE）による還元の前後にHPLCにより試験した。この
還元は1mgのDTEを加え、そして85℃に１時間インキュベ
ートすることにより行なった。得られた結果の解析によ
り、ピークB IL−２中のすべてのメチオニンは実質的に
変化しないが、ピークＡにおいては各分子の104位のメ
チオニン残稀のみがスルホキシドに酸化されていること
が示された。
このことは、ヨード酢酸を用いてカルボキシメチル化
されたジチオスレイトール（DTT）中で還元され、そし
てRP−HPLCにかけられたピークＡ蛋白質及びピークＢ蛋
白質のトリプシン消化物を分析することによって確認さ
れた。この分析の結果もまた、104位のメチオニンの酸
化を除き、ピークＡ蛋白質とピークＢ蛋白質とが同一で
あることを示した。
されたジチオスレイトール（DTT）中で還元され、そし
てRP−HPLCにかけられたピークＡ蛋白質及びピークＢ蛋
白質のトリプシン消化物を分析することによって確認さ
れた。この分析の結果もまた、104位のメチオニンの酸
化を除き、ピークＡ蛋白質とピークＢ蛋白質とが同一で
あることを示した。
D.2. E.コリ中でのdes−ala1ala104ser125のためのコ
ード配列の調製 D.1項のdes−ala1ser125IL−２のala104ミューテイン
を、1985年５月21日に発行された米国特許No.4,518,584
中に記載されているのと実質上同様にして調製された。
M13にコードされた関連蛋白質配列を用いて、部位特異
的変異誘発により調製した。
ード配列の調製 D.1項のdes−ala1ser125IL−２のala104ミューテイン
を、1985年５月21日に発行された米国特許No.4,518,584
中に記載されているのと実質上同様にして調製された。
M13にコードされた関連蛋白質配列を用いて、部位特異
的変異誘発により調製した。
要約すれば、ATCC No.39,405として1983年８月４日に
ATCCに寄託されたプラスミドpLW1からのIL−２遺伝子を
M13mp 9中にクローン化してM13−IL−２を形成した。M1
3−IL−２をオリゴヌクレオチド指令異変誘導のための
鋳型として機能するように使用して125位のシステイン
をセリン残基に転換した。この目的のため、40pmoleの
オリゴヌクレオチド５′−GATGATGCTCTGAGAAAAGGTAATC
−３′を、プライマー及びプローブとして使用するため
に、標準的条件下でキナーゼ処理した。キナーゼ処理さ
れたプライマー10pmoleを100mM NaCl、20mM Tris−HCl
（pH7.9）、20mM MgCl2、及び20mM β−メルカプトエタ
ノールを含有する混合物15μ中で、67℃にて５分間及
び42℃にて25分間が加熱することにより、2.6μｇの単
鎖（ss）M13−IL−2DNAとハイブリダイズせしめた。ア
ニールした混合物を氷上で冷却し、そして0.5mMずつのd
NTP、17mM Tris−HCl（pH7.9）、17mM MgCl2、83mM NaC
l、17mM β−メルカプトエタノール、５ユニットのDNA
ポリメラーゼI Klenow断片、0.5mM ATP及び２ユニット
のT4DNAリガーゼを含有する反応混合物中25μの最終
容量に調整し、そして37℃にて５時間インキュベートし
た。80℃に加熱することにより反応を停止し、そして反
応混合物を用いてコンピテントJM103細胞を形質転換
し、これを寒天プレート上に拡げ、そして一夜インキュ
ベートしてファージプラークを得た。このプラークを、
高度に厳重な標準的前ハイブリダイゼーション及びハイ
ブリダイゼーション条件（42℃にて８時間）を用いて、
キナーゼ処理されたプライマーにより探知した。プライ
マーにハイブリダイズしたプラークを拾い上げた。この
プラークをM13−LW46と称し、このものはdes−ala1ser
125IL−２のコード配列を含有する。
ATCCに寄託されたプラスミドpLW1からのIL−２遺伝子を
M13mp 9中にクローン化してM13−IL−２を形成した。M1
3−IL−２をオリゴヌクレオチド指令異変誘導のための
鋳型として機能するように使用して125位のシステイン
をセリン残基に転換した。この目的のため、40pmoleの
オリゴヌクレオチド５′−GATGATGCTCTGAGAAAAGGTAATC
−３′を、プライマー及びプローブとして使用するため
に、標準的条件下でキナーゼ処理した。キナーゼ処理さ
れたプライマー10pmoleを100mM NaCl、20mM Tris−HCl
（pH7.9）、20mM MgCl2、及び20mM β−メルカプトエタ
ノールを含有する混合物15μ中で、67℃にて５分間及
び42℃にて25分間が加熱することにより、2.6μｇの単
鎖（ss）M13−IL−2DNAとハイブリダイズせしめた。ア
ニールした混合物を氷上で冷却し、そして0.5mMずつのd
NTP、17mM Tris−HCl（pH7.9）、17mM MgCl2、83mM NaC
l、17mM β−メルカプトエタノール、５ユニットのDNA
ポリメラーゼI Klenow断片、0.5mM ATP及び２ユニット
のT4DNAリガーゼを含有する反応混合物中25μの最終
容量に調整し、そして37℃にて５時間インキュベートし
た。80℃に加熱することにより反応を停止し、そして反
応混合物を用いてコンピテントJM103細胞を形質転換
し、これを寒天プレート上に拡げ、そして一夜インキュ
ベートしてファージプラークを得た。このプラークを、
高度に厳重な標準的前ハイブリダイゼーション及びハイ
ブリダイゼーション条件（42℃にて８時間）を用いて、
キナーゼ処理されたプライマーにより探知した。プライ
マーにハイブリダイズしたプラークを拾い上げた。この
プラークをM13−LW46と称し、このものはdes−ala1ser
125IL−２のコード配列を含有する。
M13−LW46を前記と同様の方法で、但しプライマー
５′−CAGCATACTCACACGCGAATGTTGTTTC−３′を用いて部
位特異的変異誘発にかけた。このプライマーは、ヌクレ
オチド307及び308が、関連配列のようにATではなく、GC
である配列に相補的である。このオリゴヌクレオチドを
キナーゼ処理し、そして部位特異的変異誘発及び変異し
たファージの回収におけるプライマー及びプローブとし
て上記のように使用した。
５′−CAGCATACTCACACGCGAATGTTGTTTC−３′を用いて部
位特異的変異誘発にかけた。このプライマーは、ヌクレ
オチド307及び308が、関連配列のようにATではなく、GC
である配列に相補的である。このオリゴヌクレオチドを
キナーゼ処理し、そして部位特異的変異誘発及び変異し
たファージの回収におけるプライマー及びプローブとし
て上記のように使用した。
プローブとハイブリダイズする変異したM13−LW46プ
ラークの１つをSDL23と称し、これを拾い上げ、培養
し、そして発現ベクターpSY3001を調製するために用い
た。
ラークの１つをSDL23と称し、これを拾い上げ、培養
し、そして発現ベクターpSY3001を調製するために用い
た。
D.3 pSY3001の造成 SDL23からのRF−DNAをHind III及びPst Iで消化し、
そして挿入断片を１％アガロースゲルから精製した。同
様にして、trpプロモーターを含有するpBR322の誘導体
であるpTRP3（0.7項）をHind III及びEcoR Iで消化し、
trpプロモーターを含有する小断片をアガロースゲル上
で精製した。pBR322ベクターをEcoR I及びPst Iで消化
し、そして大断片をアガロースゲル上で精製した。精製
されたベクター断片及びtrpプロモーター断片をIL−２
ミューテインコード断片と連結し、そして連結混合物を
コンピテントE.コリK12株MM294に形質転換し、TetR表現
型に生じさせた。プラスミドDNAを単離し、そしてpSY30
01の正しい構成を制限分析及びジデオキシ配列決定によ
り確認した。
そして挿入断片を１％アガロースゲルから精製した。同
様にして、trpプロモーターを含有するpBR322の誘導体
であるpTRP3（0.7項）をHind III及びEcoR Iで消化し、
trpプロモーターを含有する小断片をアガロースゲル上
で精製した。pBR322ベクターをEcoR I及びPst Iで消化
し、そして大断片をアガロースゲル上で精製した。精製
されたベクター断片及びtrpプロモーター断片をIL−２
ミューテインコード断片と連結し、そして連結混合物を
コンピテントE.コリK12株MM294に形質転換し、TetR表現
型に生じさせた。プラスミドDNAを単離し、そしてpSY30
01の正しい構成を制限分析及びジデオキシ配列決定によ
り確認した。
D.4 des−ala1ala104ser125IL−２の生産及び精製 次に、pSY3001で形質転換されたE.コリをD.1.aに前記
したようにして増殖せしめ、そして目的の酸化耐性ミュ
ーテインをD.1.bに記載したようにして精製しそして酸
化した。但し、次の点で異る方法を用いた。２％SDS抽
出された尿素ペレットからの還元された上清を、50mMリ
ン酸ナトリウム（pH6.8）、1mM EDTA、1mM DTT、0.1％S
DS中で、2.6cm×95cmのＧ−100カラムに負荷した。IL−
２活性及び最低の汚染物濃度を含有する画分をプール
し、そしてアミコンYM−５膜を用いて限外過により濃
縮した。すべての分子が還元されることを保証するた
め、DTTを10mMに加え、そしてサンプルを10分間60℃に
加熱した。サンプルをすぐに0.9cm×20cm G−25カラム
を用いて50mMリン酸ナトリウム（pH7.0）、0.1％SDSに
より脱塩した。生じた精製された酸化耐性ミューテイン
を前記のようにしてすぐに酸化してシスチン結合を得、
そして関連蛋白質のために使用したのと同様の方法で生
物学的活性及び純度について測定し、そして同様の結果
を得た。
したようにして増殖せしめ、そして目的の酸化耐性ミュ
ーテインをD.1.bに記載したようにして精製しそして酸
化した。但し、次の点で異る方法を用いた。２％SDS抽
出された尿素ペレットからの還元された上清を、50mMリ
ン酸ナトリウム（pH6.8）、1mM EDTA、1mM DTT、0.1％S
DS中で、2.6cm×95cmのＧ−100カラムに負荷した。IL−
２活性及び最低の汚染物濃度を含有する画分をプール
し、そしてアミコンYM−５膜を用いて限外過により濃
縮した。すべての分子が還元されることを保証するた
め、DTTを10mMに加え、そしてサンプルを10分間60℃に
加熱した。サンプルをすぐに0.9cm×20cm G−25カラム
を用いて50mMリン酸ナトリウム（pH7.0）、0.1％SDSに
より脱塩した。生じた精製された酸化耐性ミューテイン
を前記のようにしてすぐに酸化してシスチン結合を得、
そして関連蛋白質のために使用したのと同様の方法で生
物学的活性及び純度について測定し、そして同様の結果
を得た。
pSY3001−形質転換細胞からの精製された物質の生物
学的活性を評価するために、標準的HT−２細胞バイオア
ッセイ（前掲）を使用した。酸化耐性ミューテインの比
活性は約４×106ユニット/mgであり、臨床銘柄のdes−a
la1ser125IL−２又はジャーカット細胞系又は末梢血リ
ンパ球から精製された未然IL−２のそれと同じであっ
た。４℃にて２箇月間溶液として貯蔵した場合、酸化耐
性ミューテインは関連IL−２蛋白質と同じ生物学的活性
を示した。このミューテインはまた、NK活性化アッセイ
において関連蛋白質と同じ比活性を示した。
学的活性を評価するために、標準的HT−２細胞バイオア
ッセイ（前掲）を使用した。酸化耐性ミューテインの比
活性は約４×106ユニット/mgであり、臨床銘柄のdes−a
la1ser125IL−２又はジャーカット細胞系又は末梢血リ
ンパ球から精製された未然IL−２のそれと同じであっ
た。４℃にて２箇月間溶液として貯蔵した場合、酸化耐
性ミューテインは関連IL−２蛋白質と同じ生物学的活性
を示した。このミューテインはまた、NK活性化アッセイ
において関連蛋白質と同じ比活性を示した。
酸化耐性ミューテインの精製の経過を第５図に示し、
そして精製された酸化耐性ミューテイン生成物をpLW45
形質転換体から得られた精製されたIL−２蛋白質と比較
した。
そして精製された酸化耐性ミューテイン生成物をpLW45
形質転換体から得られた精製されたIL−２蛋白質と比較
した。
D.5. IL−２酸化耐性ミューテインの均一性及び活性 D.4項に記載したようにしてpSY3001形質転換体から精
製された酸化耐性ミューテインを分析用RP−HPLCにか
け、第３図Ｃに示す結果を得た。単一の対称的なピーク
が得られ、同様にして精製されたIL−２において得られ
たピークＡ物質が除去されていることが示された。ミュ
ーテインのRP−HPLC保持時間は、他のIL−２点変異につ
いて観察されているように（クニタニ等、蛋白質、ペプ
チド及びポリヌクレオチドのHPLCに関する第５国際シン
ポジウム、トロント、カナダ、1985年11月４〜６日）、
関連蛋白質のそれとわずかに異る。第３図Ｄは、関連IL
−２について前に記載したのと正確に同様にして行われ
た。この調製物のクロラミンＴ処理の結果を示す。予想
通り、des1ala104ser125IL−２についてRP−HPLCパター
ンの変化は得られず、このミューテインはクロラミンＴ
による酸化に対して選択的に感受性のメチオニン残基を
欠くことが示された。
製された酸化耐性ミューテインを分析用RP−HPLCにか
け、第３図Ｃに示す結果を得た。単一の対称的なピーク
が得られ、同様にして精製されたIL−２において得られ
たピークＡ物質が除去されていることが示された。ミュ
ーテインのRP−HPLC保持時間は、他のIL−２点変異につ
いて観察されているように（クニタニ等、蛋白質、ペプ
チド及びポリヌクレオチドのHPLCに関する第５国際シン
ポジウム、トロント、カナダ、1985年11月４〜６日）、
関連蛋白質のそれとわずかに異る。第３図Ｄは、関連IL
−２について前に記載したのと正確に同様にして行われ
た。この調製物のクロラミンＴ処理の結果を示す。予想
通り、des1ala104ser125IL−２についてRP−HPLCパター
ンの変化は得られず、このミューテインはクロラミンＴ
による酸化に対して選択的に感受性のメチオニン残基を
欠くことが示された。
第４図Ｃ及び第4D図は、酸化が過酸化水素を用いて行
われた場合の対応する結果を示す。
われた場合の対応する結果を示す。
D.7 E.コリにおける他の酸化耐性IL−２ミューテイン 天然IL−２、des−ala1IL−２、及びser125IL−２並
びに上に例示したdes−ala1ser125IL−２のためのDNA配
列は、類似の方法を用いて遺伝的に変形することができ
る。但し、出発材料としてMB−LW46の代りに、ala104IL
−２を製造するためにはM13−LW32を;des−ala1ala104I
L−２を製造するためにはM13−IL−２を;ala104ser125I
L−２を製造するためにはpLW55を用いて調製されたM13
を用いる。pLW55は、目的コード配列を含有するプラス
ミドであり、1983年11月18にATCCに寄託され、ATCC受託
番号No.39,516を有する。さらに、ala125IL−２のため
のDNA配列を同様の方法を用いて遺伝的に変形すること
ができる。ala125IL−２が製造され、精製され、そして
活物学的測定において十分に活性であることが示され
た。
びに上に例示したdes−ala1ser125IL−２のためのDNA配
列は、類似の方法を用いて遺伝的に変形することができ
る。但し、出発材料としてMB−LW46の代りに、ala104IL
−２を製造するためにはM13−LW32を;des−ala1ala104I
L−２を製造するためにはM13−IL−２を;ala104ser125I
L−２を製造するためにはpLW55を用いて調製されたM13
を用いる。pLW55は、目的コード配列を含有するプラス
ミドであり、1983年11月18にATCCに寄託され、ATCC受託
番号No.39,516を有する。さらに、ala125IL−２のため
のDNA配列を同様の方法を用いて遺伝的に変形すること
ができる。ala125IL−２が製造され、精製され、そして
活物学的測定において十分に活性であることが示され
た。
これらの出発材料は、米国特許第4,518,584（前掲）
に詳細に記載されている。
に詳細に記載されている。
D.8 pTRP3の造成 Hind III部位の後に制御配列を含有する宿主ベクター
を造成するため、アテヌエーター領域を欠くtrpプロモ
ーター／オペレーター／リポゾーム結合部位配列を、ス
タンホード大学C.Yonofskyから入手したpVH153から誘導
した。trp配列は当業界においてよく知られている種々
のプラスミド中で入手可能である。pVH153をHha I（こ
のものは露出された３′接着末端を残してtrpプロモー
ターのちようど５′を切断する）で処理し、Klenowで平
滑末端化し、そしてTaq Iで部分消化する。trpリーダー
のATG開始コドンに６ヌクレオチド先行するTaq I部位に
おける制限に対応する99bp断片を単離し、そして次にEc
oR I（修復）/cla I消化されたpBR322に連結してpTRP3
を得る。pTRP3は1984年12月18日にATCC No.39,946とし
て寄託された。
を造成するため、アテヌエーター領域を欠くtrpプロモ
ーター／オペレーター／リポゾーム結合部位配列を、ス
タンホード大学C.Yonofskyから入手したpVH153から誘導
した。trp配列は当業界においてよく知られている種々
のプラスミド中で入手可能である。pVH153をHha I（こ
のものは露出された３′接着末端を残してtrpプロモー
ターのちようど５′を切断する）で処理し、Klenowで平
滑末端化し、そしてTaq Iで部分消化する。trpリーダー
のATG開始コドンに６ヌクレオチド先行するTaq I部位に
おける制限に対応する99bp断片を単離し、そして次にEc
oR I（修復）/cla I消化されたpBR322に連結してpTRP3
を得る。pTRP3は1984年12月18日にATCC No.39,946とし
て寄託された。
E. 酵母におけるAla104IL−２の発現 E.コリ以外の宿主中でIL−２の他の活性形を製造する
ためにこの発明の方法を適用する他の態様を例示するた
めに次の特定の例を用いる。この例においては、幾つか
のミューテインのいずれかを生じさせる適切な置換を有
するコード配列を、酵母αファクタープロモーター、リ
ーダー及びターミネーター配列を用いる酵母発現ベクタ
ーに連結し、そしてこれを用いて目的蛋白質を酵母中で
生産する。
ためにこの発明の方法を適用する他の態様を例示するた
めに次の特定の例を用いる。この例においては、幾つか
のミューテインのいずれかを生じさせる適切な置換を有
するコード配列を、酵母αファクタープロモーター、リ
ーダー及びターミネーター配列を用いる酵母発現ベクタ
ーに連結し、そしてこれを用いて目的蛋白質を酵母中で
生産する。
E.1. 酵母における関連IL−２の製造 ヒトの細胞から単離される成熟IL−２中に存在するの
と同じアミノ酸配列を含有す成熟野性型組換IL−２を、
pPM42により形質転換されたサッカロミセス・セレビシ
エーC468株のcir゜誘導体〔Innis,M.A.等、Science（19
85）228:21−26〕から製造した。このプラスミドpPM42
は、酵母αファクタープロモーターの制御のもとに、酵
母αファクターシグナルペプチド配列と５′においてフ
レームを合わせて融合している成熟天然IL−２コード配
列を含有する発現ベクターである。pPM42で形質転換さ
れた菌株は1985年12月13日にATCCに寄託され、そしてAT
CC受託番号No.53,355を有する。
と同じアミノ酸配列を含有す成熟野性型組換IL−２を、
pPM42により形質転換されたサッカロミセス・セレビシ
エーC468株のcir゜誘導体〔Innis,M.A.等、Science（19
85）228:21−26〕から製造した。このプラスミドpPM42
は、酵母αファクタープロモーターの制御のもとに、酵
母αファクターシグナルペプチド配列と５′においてフ
レームを合わせて融合している成熟天然IL−２コード配
列を含有する発現ベクターである。pPM42で形質転換さ
れた菌株は1985年12月13日にATCCに寄託され、そしてAT
CC受託番号No.53,355を有する。
凍結された酵母培養物（10％グリセリンを含む）を解
凍し、そしてこれを次の組成を有する選択種母培地に1:
50に稀釈することによりpPM42で形質転換されたS.セレ
ビシエーの種母培養を開始した。
凍し、そしてこれを次の組成を有する選択種母培地に1:
50に稀釈することによりpPM42で形質転換されたS.セレ
ビシエーの種母培養を開始した。
組 成 0.01Mコハク酸 5.0mM H3PO4 3.0mM H2SO4 5.0mM KCl 1.0mM NaCl 1.0mM MgCl2・6H2O 0.01mM MnSO4・H2O 1.0μM CuSO4・5H2O 5.0μM ZnSO4・7H2O 5.0μM CoCl2・6H2O 5.0μM Na2MoO4・2H2O 0.05mM H3BO3 0.1mM CbCl2・2H2O 0.2g/ヒスチジン NH4OHによりpHを4.25に調整した。オートクレーブ殺
菌の後、次の成分を次に記載する濃度に無菌的に添加し
た。
菌の後、次の成分を次に記載する濃度に無菌的に添加し
た。
10％グルコース 0.5μg/ピリドキシンHCl 1.0μg/チアミンHCl 0.01μg/ D−ビオチン 1.0μg/パントテン酸カルシウム 0.04g/ミオ−イノシトール（メソ−イノシトール） 0.04mM FeSO4 この培養物を、30℃にて２〜３日間、A680nmにより測
定される細胞濃度が10〜20に達するまで増殖せしめた。
定される細胞濃度が10〜20に達するまで増殖せしめた。
次に、この培養物を用いて10の培地を収容する大形
発酵槽に接種した。この培地の組成は次の通りである。
発酵槽に接種した。この培地の組成は次の通りである。
75mM NH4Cl 5.0mM H3PO4 3.0mM H2SO4 5.0mM KCl 1.0mM NaCl 1.0mM MgCl2・6H2O 0.01mM MnSO4・H2O 1.0μM CuSO4・5H2O 5.0μM ZnSO4・7H2O 5.0μM CoCl2・6H2O 5.0μM Na2MoO4・2H2O 0.05mM H3BO3 0.1mM CaCl2・2H2O 0.5g/ヒスチジン 上記の培地の調製にあたっては、2.5N NaOHNによりpH
を５に調整し、そして混合物をオートクレーブ殺菌し
た。次の成分を次に記載する最終濃度に、無菌条件下で
（オートクレーブ処理後）添加した。
を５に調整し、そして混合物をオートクレーブ殺菌し
た。次の成分を次に記載する最終濃度に、無菌条件下で
（オートクレーブ処理後）添加した。
10−15％グルコース 0.5μg/ピリドキシンHCl 1.0μg/チアミンHCl 0.01μg/ D−ビオチン 1.0μg/パントテン酸カルシウム 0.04g/ミオ−イノシトール（メソ−イノシトール） 0.04mM FeSO4 発泡を調節するため、必要に応じてダウコーニングシ
リコンエマルジョンＢを発酵槽に加えた。4N NaOHを添
加することにより発酵槽のpHを4.5に維持し、そして溶
存酸素を、空気の吹込により40％空気飽和に保持した。
発酵槽を500rpmで撹拌し、そして30℃にて、培養物濃度
が約20のA680nmに達するまで２〜３日間維持した。細胞
の分離により培養物を収得し、そして培養上清をさらに
処理した。
リコンエマルジョンＢを発酵槽に加えた。4N NaOHを添
加することにより発酵槽のpHを4.5に維持し、そして溶
存酸素を、空気の吹込により40％空気飽和に保持した。
発酵槽を500rpmで撹拌し、そして30℃にて、培養物濃度
が約20のA680nmに達するまで２〜３日間維持した。細胞
の分離により培養物を収得し、そして培養上清をさらに
処理した。
E.2 酵母からの関連蛋白質の精製 4000xgにて15分間遠心分離することにより、又は向流
過により培養上清から細胞を分離する。
過により培養上清から細胞を分離する。
次に、10,000ダルトン以下の分子量のみに対して透過
性を有する中空繊維カートリッジ（例えばPM10）を用い
て、清浄化された酵母培養上清を濃縮する。IL−２含有
上清を約100〜200倍に濃縮した後、SDSを２％に加え、
そして溶液を37℃にて20分間加熱する。次に可溶化され
たIL−２を、0.2M NaCl及び0.1％SDSを含有する50mMリ
ン酸ナトリウム（pH7.0）中であらかじめ平衡化された
セファクリル−200カラム（2.6×95cm）に適用する。蛋
白質プロフィールを280nmでの吸収により可視化し、そ
して低分子蛋白質を含有する画分をSDS−PAGEにより分
析して、最もIL−２に富む画分の位置を決定する。
性を有する中空繊維カートリッジ（例えばPM10）を用い
て、清浄化された酵母培養上清を濃縮する。IL−２含有
上清を約100〜200倍に濃縮した後、SDSを２％に加え、
そして溶液を37℃にて20分間加熱する。次に可溶化され
たIL−２を、0.2M NaCl及び0.1％SDSを含有する50mMリ
ン酸ナトリウム（pH7.0）中であらかじめ平衡化された
セファクリル−200カラム（2.6×95cm）に適用する。蛋
白質プロフィールを280nmでの吸収により可視化し、そ
して低分子蛋白質を含有する画分をSDS−PAGEにより分
析して、最もIL−２に富む画分の位置を決定する。
IL−２ピーク画分をプールし、そしてPM10膜を用いて
アミコン濃縮機上で濃縮する。次に、アセトニトリルを
10％まで加え、そしてTFAを0.5v/v％に加えることによ
りpHを約2.5に下げる。IL−２溶液をVydac C4カラム（1
0mm×25cm）上に負荷し、そして30〜60％のアセトニト
リルグラジエントにより、2ml/分の流速にて45分間溶出
する。ほとんどの他の汚染蛋白質より後に溶出するIL−
２ピークを0.1％TFAで２倍に稀釈し、そして流速を1ml/
分とするほか前記と同様の条件を用いて、第２のVydac
C4カラム上で再クロマトグラフ処理する。次に、精製し
たIL−２を上記のようにして製剤化する。
アミコン濃縮機上で濃縮する。次に、アセトニトリルを
10％まで加え、そしてTFAを0.5v/v％に加えることによ
りpHを約2.5に下げる。IL−２溶液をVydac C4カラム（1
0mm×25cm）上に負荷し、そして30〜60％のアセトニト
リルグラジエントにより、2ml/分の流速にて45分間溶出
する。ほとんどの他の汚染蛋白質より後に溶出するIL−
２ピークを0.1％TFAで２倍に稀釈し、そして流速を1ml/
分とするほか前記と同様の条件を用いて、第２のVydac
C4カラム上で再クロマトグラフ処理する。次に、精製し
たIL−２を上記のようにして製剤化する。
E.3 酵母からのメチオニンスルホキシド含有蛋白質の
検出及び分析 pPM42で形質転換されたS.セレビシェーの培養物から
の組換IR−２をRP−HPLCにより分析した場合、生物学的
に活性なIL−２蛋白質の２個のピークが分離される。先
に溶出するピーク、すなわちピークＡは回収される全IL
−２生物活性の約15％を占めた。IL−２の残りは幾分後
に、ピークＢ中に溶出した。両IL−２ピークは、B.1に
記載したHT−２細胞増殖アッセイにおいておよそ同等の
生物学的比活性を有していた。RP−HPLCプロフィール
は、E.コリ中で生産されたIL−２のそれ（先に溶出する
ピーク、すなわちピークＡは、ピークＢの物質中の同じ
位置に存在するメチオニンの代りに104位にメチオニン
スルホキシド残基を含有することが示された。）に類似
していた。
検出及び分析 pPM42で形質転換されたS.セレビシェーの培養物から
の組換IR−２をRP−HPLCにより分析した場合、生物学的
に活性なIL−２蛋白質の２個のピークが分離される。先
に溶出するピーク、すなわちピークＡは回収される全IL
−２生物活性の約15％を占めた。IL−２の残りは幾分後
に、ピークＢ中に溶出した。両IL−２ピークは、B.1に
記載したHT−２細胞増殖アッセイにおいておよそ同等の
生物学的比活性を有していた。RP−HPLCプロフィール
は、E.コリ中で生産されたIL−２のそれ（先に溶出する
ピーク、すなわちピークＡは、ピークＢの物質中の同じ
位置に存在するメチオニンの代りに104位にメチオニン
スルホキシド残基を含有することが示された。）に類似
していた。
あらかじめ４℃にて２週間貯蔵しておいた上記の同じ
酵母培養上清の異るアリコートに対して同一の精製を行
った場合、RP−HPLC分析は、IL−２調製物の約60％がピ
ークＡ位置において溶出することを示した。この結果
は、酵母培養上清中に酸化剤が存在し、それが貯蔵の際
にIL−２蛋白質中の104位のメチオニンを酸化し続ける
ことを示唆した。
酵母培養上清の異るアリコートに対して同一の精製を行
った場合、RP−HPLC分析は、IL−２調製物の約60％がピ
ークＡ位置において溶出することを示した。この結果
は、酵母培養上清中に酸化剤が存在し、それが貯蔵の際
にIL−２蛋白質中の104位のメチオニンを酸化し続ける
ことを示唆した。
ピークＡ及びピークＢ物質のSDS−PAGE分析は、両ピ
ークからのIL−２について同一の分子量を示した。従っ
て、蛋白質分解又はグリコシル化の差異がRP−HPLCにお
ける保持時間の変化の原因である可能性があるようであ
った。さらに、クロラミンＴのごとき特定の化学酸化剤
を用いて行われた実験は、ピークＡはピークＢから、特
定のメチオニン残基のメチオニンスルホキシドへの酸化
により生成することを示す。ピークＡが酵母からのピー
クＢのIL−２中の104位のメチオニン残基の酸化により
生ずるという理解は、メチオニンの代りに104位にアラ
ニンを含有するミューテイン中にピークＡ物質が存在し
ないことにより確認される。
ークからのIL−２について同一の分子量を示した。従っ
て、蛋白質分解又はグリコシル化の差異がRP−HPLCにお
ける保持時間の変化の原因である可能性があるようであ
った。さらに、クロラミンＴのごとき特定の化学酸化剤
を用いて行われた実験は、ピークＡはピークＢから、特
定のメチオニン残基のメチオニンスルホキシドへの酸化
により生成することを示す。ピークＡが酵母からのピー
クＢのIL−２中の104位のメチオニン残基の酸化により
生ずるという理解は、メチオニンの代りに104位にアラ
ニンを含有するミューテイン中にピークＡ物質が存在し
ないことにより確認される。
E.4 酵母における、ala104含有ミューテインIL−２の
ためのコード配列 E.1の野性形IL−２のala104ミューテインを、1985年
５月21日に発行された米国特許No.4,518,584中に記載さ
れている方法と実質上に同様にして調製されたM13クロ
ーン化関連蛋白質配列を用いる部位特異的変異位誘発に
より製造した。IL−2ala104ala125ミューテインを同じ
方法で製造することができる。
ためのコード配列 E.1の野性形IL−２のala104ミューテインを、1985年
５月21日に発行された米国特許No.4,518,584中に記載さ
れている方法と実質上に同様にして調製されたM13クロ
ーン化関連蛋白質配列を用いる部位特異的変異位誘発に
より製造した。IL−2ala104ala125ミューテインを同じ
方法で製造することができる。
要約すれば、1985年12月13日にATCC No.53,354として
ATCCに寄託されたプラスミドpLW32からIL−２遺伝子をH
ind III−Stu I断片として切り出した〔Wang,A.等（198
4）Seience 224:1431−1433;Stu I部位はBam II部位か
らおよそ132bp上流に位置する〕。この断片の平滑Stu I
末端にHind IIIリンカーを加えた。これが、M13mp7ベク
ターに挿入するためのIL−２遺伝子を含有するHind III
断片をもたらした。このベクターを次のようにして変形
した。
ATCCに寄託されたプラスミドpLW32からIL−２遺伝子をH
ind III−Stu I断片として切り出した〔Wang,A.等（198
4）Seience 224:1431−1433;Stu I部位はBam II部位か
らおよそ132bp上流に位置する〕。この断片の平滑Stu I
末端にHind IIIリンカーを加えた。これが、M13mp7ベク
ターに挿入するためのIL−２遺伝子を含有するHind III
断片をもたらした。このベクターを次のようにして変形
した。
酵母接合因子α１遺伝子〔Singh,A.等（1983）Nuclei
c Acide Res. 11:4049−4063〕〔４コピーの成熟α−フ
ァクターのコード配列を除去するためにHind III−Sal
I断片（ヌクレオチド268−533）が除去されている〕を
含有する約1.5kdのEcoR I断片を、M13mp7のEcoR I部位
間に挿入した。α−ファクターリーダー配列の３′に位
置するHind III末端（ヌクレオチド267）と成熟α−フ
ァクターコード配列の第４番目のコードに続く修復され
たSal I末端との連結が変形されたM13mp7ベクター中の
ユニークHind III部位の形成（そして、すぐ上に記載し
たように成熟α−ファクターコード配列の除去）をもた
らした。こうして変形されたM13mp7をY13mp7::MFα−δ
と称し、そしてこのものは酵母α−ファクタープロモー
ター、リーダー及びターミネーターの配列を含有し、リ
ーダーとターミネーターの間にユニークHind III部位を
有し、この部位に注目の遺伝子を挿入することができ
る。M13mp7::MFα−δは1985年12月13日にATCC No.40,2
10としてATCCに寄託された。
c Acide Res. 11:4049−4063〕〔４コピーの成熟α−フ
ァクターのコード配列を除去するためにHind III−Sal
I断片（ヌクレオチド268−533）が除去されている〕を
含有する約1.5kdのEcoR I断片を、M13mp7のEcoR I部位
間に挿入した。α−ファクターリーダー配列の３′に位
置するHind III末端（ヌクレオチド267）と成熟α−フ
ァクターコード配列の第４番目のコードに続く修復され
たSal I末端との連結が変形されたM13mp7ベクター中の
ユニークHind III部位の形成（そして、すぐ上に記載し
たように成熟α−ファクターコード配列の除去）をもた
らした。こうして変形されたM13mp7をY13mp7::MFα−δ
と称し、そしてこのものは酵母α−ファクタープロモー
ター、リーダー及びターミネーターの配列を含有し、リ
ーダーとターミネーターの間にユニークHind III部位を
有し、この部位に注目の遺伝子を挿入することができ
る。M13mp7::MFα−δは1985年12月13日にATCC No.40,2
10としてATCCに寄託された。
次に、前記のIL−２遺伝子を担持するHind III断片を
M13mp7::MFα−δ中に、そのユニークHind III部位にお
いて挿入した。次の配列５′CTTTGGATAAAAGAGCGCCTACTT
CAAG3′のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて約16
のヌクレオチドを除去することにより、α−ファクター
リーダープペチド配列とIL−２コード配列とを、連結部
のアミノ酸配列がLys−Arg−Alaとなるように並置し
た。このアミノ酸配列はプロセシング部位として正しく
認識されるものである。得られた造成物をM13mp7::MFα
−δ（IL−２）と命名した。このものは1985年12月13日
にATCC No.40,211としてATCCに寄託された。
M13mp7::MFα−δ中に、そのユニークHind III部位にお
いて挿入した。次の配列５′CTTTGGATAAAAGAGCGCCTACTT
CAAG3′のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて約16
のヌクレオチドを除去することにより、α−ファクター
リーダープペチド配列とIL−２コード配列とを、連結部
のアミノ酸配列がLys−Arg−Alaとなるように並置し
た。このアミノ酸配列はプロセシング部位として正しく
認識されるものである。得られた造成物をM13mp7::MFα
−δ（IL−２）と命名した。このものは1985年12月13日
にATCC No.40,211としてATCCに寄託された。
α−ファクタープロモーター、ソーダー、IL−２遺伝
子及びα−ファクターターミネーターを担持するM13mp
7::MFα−δ（IL−２）からのEcoR I断片を切り出し、
そしてC.4項に記載したDNAポリメラーゼＩによる修復に
より平滑化した。E.コリ及び酵母の両者中で複製するこ
とができるプラスミドpJDB219はBeggs,J.D.（1978）Nat
ure 275:104−109に記載されており、そしてもともと
E.コリプラスミドpMB9に由来するpJDB219の部分の非必
須領域中２個のTth I部位を含有する（第６図を参照の
こと）。次に、ベクターTth I断片をIL−２遺伝子を担
持する平滑末端化されたEcoR I断片により置き換える。
ベクター内のこの断片の２つの方向付けがこの方法によ
り得られるが、これらの間にIL−２遺伝子の発現に関し
て差異は検出されていない。野性型IL−２の製造をpPM4
2と称する造成物を用いて行った。このプラスミド中に
は、IL−２遺伝子がpJDB219中のテトラサイクリン耐性
（TetR）遺伝子と同じ方向（すなわち、第６図において
時計方向）に存在する。このプラスミドpPM42は、1985
年12月13日に、ATCC No.53,355としてATCCに寄託され
た。
子及びα−ファクターターミネーターを担持するM13mp
7::MFα−δ（IL−２）からのEcoR I断片を切り出し、
そしてC.4項に記載したDNAポリメラーゼＩによる修復に
より平滑化した。E.コリ及び酵母の両者中で複製するこ
とができるプラスミドpJDB219はBeggs,J.D.（1978）Nat
ure 275:104−109に記載されており、そしてもともと
E.コリプラスミドpMB9に由来するpJDB219の部分の非必
須領域中２個のTth I部位を含有する（第６図を参照の
こと）。次に、ベクターTth I断片をIL−２遺伝子を担
持する平滑末端化されたEcoR I断片により置き換える。
ベクター内のこの断片の２つの方向付けがこの方法によ
り得られるが、これらの間にIL−２遺伝子の発現に関し
て差異は検出されていない。野性型IL−２の製造をpPM4
2と称する造成物を用いて行った。このプラスミド中に
は、IL−２遺伝子がpJDB219中のテトラサイクリン耐性
（TetR）遺伝子と同じ方向（すなわち、第６図において
時計方向）に存在する。このプラスミドpPM42は、1985
年12月13日に、ATCC No.53,355としてATCCに寄託され
た。
酵母におけるIL−２のala104含有ミューテインは、鋳
型としてM13mp7::MFα−δ（IL−２）を用いる部位特異
的変異誘発により得られた。104位のメチオニンをアラ
ニンに転換するため、オリゴヌクレオチド５′−ACAACA
TTCGCTTGTGAATATG−３′を合成し、そしてD.2項に記載
したのと同様にして使用した。オリゴヌクレオチドプラ
イマー５′−GATTACCTTCGCTCAAAGCATC−３′を用いて12
5位のシステインをアラニンに転換した。１個より多く
の変異を含有する遺伝子を製造するため、それぞれ適切
なプライマーを用いて変異誘発を逐次的に行った。
型としてM13mp7::MFα−δ（IL−２）を用いる部位特異
的変異誘発により得られた。104位のメチオニンをアラ
ニンに転換するため、オリゴヌクレオチド５′−ACAACA
TTCGCTTGTGAATATG−３′を合成し、そしてD.2項に記載
したのと同様にして使用した。オリゴヌクレオチドプラ
イマー５′−GATTACCTTCGCTCAAAGCATC−３′を用いて12
5位のシステインをアラニンに転換した。１個より多く
の変異を含有する遺伝子を製造するため、それぞれ適切
なプライマーを用いて変異誘発を逐次的に行った。
E.5 種々のala104IL−２ミューテインを含有する発現
ベクターの造成 変異誘発及びM13mp7::MFα−δ（IL−２）中の正しく
変形されたコード配列の選択に続き、野性型IL−２遺伝
子断片についてE.4項に記載したようにして、IL−２ミ
ューテイン遺伝子及びその制御配列をEcoR I断面として
取り出した。DNAポリメラーゼＩによる修復の後、IL−
２ミューテイン遺伝子を含有する平滑末端化された断片
をpJDB219中のTth I部位間に連結し、こうしてベクター
断片を置き換えた。ala104IL−２ミューテインを含有す
る得られた発現ベクターをpPM43と称し、そしてこのも
のは1985年12月13日にATCC No.53,356としてATCCに寄託
された。
ベクターの造成 変異誘発及びM13mp7::MFα−δ（IL−２）中の正しく
変形されたコード配列の選択に続き、野性型IL−２遺伝
子断片についてE.4項に記載したようにして、IL−２ミ
ューテイン遺伝子及びその制御配列をEcoR I断面として
取り出した。DNAポリメラーゼＩによる修復の後、IL−
２ミューテイン遺伝子を含有する平滑末端化された断片
をpJDB219中のTth I部位間に連結し、こうしてベクター
断片を置き換えた。ala104IL−２ミューテインを含有す
る得られた発現ベクターをpPM43と称し、そしてこのも
のは1985年12月13日にATCC No.53,356としてATCCに寄託
された。
上記の造成物を含有する最初にE.コリから単離された
プラスミドDNA、及びE.4項に記載したpPM42を、ポリエ
キレングリコール（PEG）処理されたS.セレビシェ−C46
8株cir゜に、下に詳細に記載するようにして形質転換
し、leu ＋表現型を生じさせた。形質転換されるべき細
胞を、Klebe,R.J.等（1983）Geme 25:333−341に記載
されているのと同様にして調製した。要約すると、単一
コロニーを2mlのYEPD（10g/酵母エキス、20g/ペプ
トン、２％グルコース）中に拾い込み、そして30℃にて
１夜増殖せしめた。１夜培養物を新しいYERD中に80倍に
稀釈し、発酵当り10mlの稀釈された培養物を得た。培養
物を30℃にてA600nm＝0.6〜0.9まで、通常約３〜3.5時
間増殖せしめた。室温にて4000rpm（ソルバルJA−20ロ
ーター）にて５分間遠心分離することにより、細胞をペ
レット化した。細胞ペレットをそれぞれ5mlのSBEG〔1M
ソルビトール、20mMビシン（bicine）（pH8.35）、３％
エチレングリコール〕中に懸濁し、そして再度遠心分離
した。細胞ペレットをそれぞれ0.2mlのSBEG中に５分間
室温にて再懸濁した。５〜10μｇの形質転換用DNAを20
μより少量に加え、そして混合物を30℃にて10分間イ
ンキュベートした。この混合物を−70℃にて少なくとも
10分間凍結した。この混合物を37℃の浴中で解糖し、そ
して1.5mlのPEG−ビシン（40％PEG−1000、200mMビシ
ン、pH8.35）を加えた。穏和に混合した後、3mlのNB（1
50mM NaCl、10mMビシン、pH8.35）をゆっくり加え、そ
して卓上遠心分離機中で2000rpmにて３分間遠心分離す
ることにより細胞をペレット化した。最後に細胞を1ml
のNBに再懸濁し、そして選択培地〔この場合、1.45g/
のイースト・ニトロゲン・ベース（ディフコ）、0.04m
（NH4）2SO4、２％グルコース、ロイシンを除くアミノ
酸類〕上に直接プレートした。
プラスミドDNA、及びE.4項に記載したpPM42を、ポリエ
キレングリコール（PEG）処理されたS.セレビシェ−C46
8株cir゜に、下に詳細に記載するようにして形質転換
し、leu ＋表現型を生じさせた。形質転換されるべき細
胞を、Klebe,R.J.等（1983）Geme 25:333−341に記載
されているのと同様にして調製した。要約すると、単一
コロニーを2mlのYEPD（10g/酵母エキス、20g/ペプ
トン、２％グルコース）中に拾い込み、そして30℃にて
１夜増殖せしめた。１夜培養物を新しいYERD中に80倍に
稀釈し、発酵当り10mlの稀釈された培養物を得た。培養
物を30℃にてA600nm＝0.6〜0.9まで、通常約３〜3.5時
間増殖せしめた。室温にて4000rpm（ソルバルJA−20ロ
ーター）にて５分間遠心分離することにより、細胞をペ
レット化した。細胞ペレットをそれぞれ5mlのSBEG〔1M
ソルビトール、20mMビシン（bicine）（pH8.35）、３％
エチレングリコール〕中に懸濁し、そして再度遠心分離
した。細胞ペレットをそれぞれ0.2mlのSBEG中に５分間
室温にて再懸濁した。５〜10μｇの形質転換用DNAを20
μより少量に加え、そして混合物を30℃にて10分間イ
ンキュベートした。この混合物を−70℃にて少なくとも
10分間凍結した。この混合物を37℃の浴中で解糖し、そ
して1.5mlのPEG−ビシン（40％PEG−1000、200mMビシ
ン、pH8.35）を加えた。穏和に混合した後、3mlのNB（1
50mM NaCl、10mMビシン、pH8.35）をゆっくり加え、そ
して卓上遠心分離機中で2000rpmにて３分間遠心分離す
ることにより細胞をペレット化した。最後に細胞を1ml
のNBに再懸濁し、そして選択培地〔この場合、1.45g/
のイースト・ニトロゲン・ベース（ディフコ）、0.04m
（NH4）2SO4、２％グルコース、ロイシンを除くアミノ
酸類〕上に直接プレートした。
酵母形質転換体のIL−２生物活性を測定するため、選
択プレートからの単一酵母コロニーを3mlの選択培地又
は非選択培地中に拾い上げ、そして30℃にて振とうしな
がら１夜インキュベートした。培養物のアリコートを取
り出し、そして0.2ミクロンフィルター（ゲルマン・ア
クロディスク）を通して過してすべての酵母細胞を除
去した。すでに記載した（前掲）ようにして生物学的活
性を測定するためにさらに処理することなく上清を稀釈
した。
択プレートからの単一酵母コロニーを3mlの選択培地又
は非選択培地中に拾い上げ、そして30℃にて振とうしな
がら１夜インキュベートした。培養物のアリコートを取
り出し、そして0.2ミクロンフィルター（ゲルマン・ア
クロディスク）を通して過してすべての酵母細胞を除
去した。すでに記載した（前掲）ようにして生物学的活
性を測定するためにさらに処理することなく上清を稀釈
した。
E.6. 酵母からのala104含有IL−２ミューテインの生産
及び精製 次に、pPM43で形質転換したS.セレビシェーをE.1に記
載したようにして増殖せしめ、そして目的とする酸化耐
性ミューテインをE.2に記載したようにして精製する。
及び精製 次に、pPM43で形質転換したS.セレビシェーをE.1に記
載したようにして増殖せしめ、そして目的とする酸化耐
性ミューテインをE.2に記載したようにして精製する。
E.7. 酵母からの酸化耐性ミューテインの生化学的及び
生物学的特徴付け プラスミドpPM43を含有する酵母細胞をE.1に記載した
方法に従って増殖せしめ、そしてE.2に記載したように
して、培養上清からala104IL−２を精製する。酵母ala
104IL−２は、関連蛋白質と比較した場合、NK細胞の活
性化のごとき生物学的アッセイ、又はIL−２依存HT−２
細胞増殖アッセイにおいて十分に活性である。精製され
た酸化耐性ミューテインのRP−HPLC分析は、単一の対称
的ピークを示し、同様にして精製された関連IL−２にお
いて得られたピークＡ物質が除去されていることが示さ
れる。E.コリにおける、ala1ala104ser125IL−２（クニ
タニ等、蛋白質、ペプチド、及びポリヌクレオチドのHP
LCに関する第５回国際シンポジウム、トロント、カナ
ダ、1985年11月４〜６日）を含む他のIL−２点変異につ
いて観察されたのと同様に、このミューテインのRP−HP
LC保持時間は関連蛋白質のそれからわずかに異る。
生物学的特徴付け プラスミドpPM43を含有する酵母細胞をE.1に記載した
方法に従って増殖せしめ、そしてE.2に記載したように
して、培養上清からala104IL−２を精製する。酵母ala
104IL−２は、関連蛋白質と比較した場合、NK細胞の活
性化のごとき生物学的アッセイ、又はIL−２依存HT−２
細胞増殖アッセイにおいて十分に活性である。精製され
た酸化耐性ミューテインのRP−HPLC分析は、単一の対称
的ピークを示し、同様にして精製された関連IL−２にお
いて得られたピークＡ物質が除去されていることが示さ
れる。E.コリにおける、ala1ala104ser125IL−２（クニ
タニ等、蛋白質、ペプチド、及びポリヌクレオチドのHP
LCに関する第５回国際シンポジウム、トロント、カナ
ダ、1985年11月４〜６日）を含む他のIL−２点変異につ
いて観察されたのと同様に、このミューテインのRP−HP
LC保持時間は関連蛋白質のそれからわずかに異る。
関連IL−２について上記したのと正確に同じ方法によ
り実施するこの調製物のクロラミンＴ処理は、PR−HPLC
パターンにおいて変化を示さず、このミューテインが、
クロラミンＴによる酸化に対して選択的に感受性のメチ
オニン残基を欠くことが示される。
り実施するこの調製物のクロラミンＴ処理は、PR−HPLC
パターンにおいて変化を示さず、このミューテインが、
クロラミンＴによる酸化に対して選択的に感受性のメチ
オニン残基を欠くことが示される。
F. IFN−βの酸化耐性ミューテインの製造 62位にメチオニン残基を含有する組換体ser17IFN−β
を変形して、ミューテイン、例えば、ser17ala62IFN−
β，又はala62IFN−βを製造することができる。これら
の潜在的に酸化耐性のミューテインser17ala62IFN−β
の造成を記載する。
を変形して、ミューテイン、例えば、ser17ala62IFN−
β，又はala62IFN−βを製造することができる。これら
の潜在的に酸化耐性のミューテインser17ala62IFN−β
の造成を記載する。
D.2項に記載したのと同様の条件のもとで、鋳型とし
てのM13−SY2501〔Mark,D.F.等（1984）Proc.Natl.Aca
d.Sci.U.S.A 81:5662−5666〕、及びオリゴヌクレオチ
ドプライマー５′CCATCTATGAGGCGCTGCAGAACATC3′を用
いて、部位特異的変異誘発によりser17ala62IFN−βを
製造した。得られた造成物をM13DM101と命名した。E.コ
リ中でser17ala62IFN−βミューテインを発現せしめる
ため、D.8項に記載したpTrp3の小（0.35kb）Hind III−
BamH I断片をser17ala62IFN−β遺伝子を含有するM13−
DM101からのHind III−xho II断片に置き換えた。
てのM13−SY2501〔Mark,D.F.等（1984）Proc.Natl.Aca
d.Sci.U.S.A 81:5662−5666〕、及びオリゴヌクレオチ
ドプライマー５′CCATCTATGAGGCGCTGCAGAACATC3′を用
いて、部位特異的変異誘発によりser17ala62IFN−βを
製造した。得られた造成物をM13DM101と命名した。E.コ
リ中でser17ala62IFN−βミューテインを発現せしめる
ため、D.8項に記載したpTrp3の小（0.35kb）Hind III−
BamH I断片をser17ala62IFN−β遺伝子を含有するM13−
DM101からのHind III−xho II断片に置き換えた。
ser17ala62IFN−βミューテインは、その酸化耐性に
ついて試験された場合、62位のメチオニンが酸化に対し
て最も感受性のメチオニンであることを示した。ピーク
Ａの形成についてのRP−HPLC分析において、化学的酸化
に対するser17ala62IFN−βの感受性はser17IFN−βに
比べて顕著に低下していた。
ついて試験された場合、62位のメチオニンが酸化に対し
て最も感受性のメチオニンであることを示した。ピーク
Ａの形成についてのRP−HPLC分析において、化学的酸化
に対するser17ala62IFN−βの感受性はser17IFN−βに
比べて顕著に低下していた。
生物学的を維持しながら、酸化耐性IL−２ミューテイ
ンのＮ−端において、最初の５個のアミン酸の少なくと
も１個を任意の組合わせて除去することができ、又は他
のアミノ酸で置き換えることができる。IFN−βのごと
き他の酸化耐性ミューテインに関して同様の可能性が存
在する。さらに、IL−２ミューテインの125位又はIFN−
βミューテインの17位におけるアラニン又はセリンのご
とき保存的アミノ酸の置換を行って、ミューテインの生
物学的活性にとって必須でないシステイン残基を置換す
ることによりミューテインに追加の安定性を付与するこ
とができる。これらの変化のみの、又はこれらの変化以
外の１又は複数の変化の組合わせにおける、幾つかの変
化の並べ替えをこの発明の酸化耐性ミューテインに対し
て行うことができる。例えば、次のようなミューテイン
はこの発明の範囲内である。
ンのＮ−端において、最初の５個のアミン酸の少なくと
も１個を任意の組合わせて除去することができ、又は他
のアミノ酸で置き換えることができる。IFN−βのごと
き他の酸化耐性ミューテインに関して同様の可能性が存
在する。さらに、IL−２ミューテインの125位又はIFN−
βミューテインの17位におけるアラニン又はセリンのご
とき保存的アミノ酸の置換を行って、ミューテインの生
物学的活性にとって必須でないシステイン残基を置換す
ることによりミューテインに追加の安定性を付与するこ
とができる。これらの変化のみの、又はこれらの変化以
外の１又は複数の変化の組合わせにおける、幾つかの変
化の並べ替えをこの発明の酸化耐性ミューテインに対し
て行うことができる。例えば、次のようなミューテイン
はこの発明の範囲内である。
ser17ala62IFN−β， ala62IFN−β， ser17val62IFN−β， val62IFN−β， ser17leu62IFN−β， leu62IFN−β。
ala104ser125IL−2, ala104IL−2, ala104ala125IL−2, glu104ser125IL−2, glu104IL−2, glu104ala125IL−2, des−ala1ala104ser125IL−2, des−ala1ala104IL−2, des−ala1ala104ala125IL−2, des−ala1glu104ser125IL−2, des−ala1glu104IL−2, des−ala1glu104ala125IL−2, des−ala1des−pro2ala104ser125IL−2, des−ala1des−pro2ala104IL−2, des−ala1des−pro2ala104ala125IL−2, des−ala1des−pro2glu104ser125IL−2, des−ala1des−pro2glu104IL−2, des−ala1des−pro2glu104ala125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3ala104ser125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3ala104IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3ala104ala125IL−2, des−ala1des−pro−2des−thr3glu104ser125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3glu104IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3glu104ara125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4ala104ser125IL
−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4ala104IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4ala104ara125IL
−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4glu104ser125IL
−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4glu104IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4glu104ala125IL
−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5ala
104ser125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5ala
104IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5ala
104ala125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5glu
104ser125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5glu
104IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5glu
104ala125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5des−
ser6ala104ala125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5des−
ser6ala104IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5des−
ser6ala104ser125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5des−
ser6glu104ser125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5des−
ser6glu104IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5des−
ser6glu104ala125IL−２。
−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4ala104IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4ala104ara125IL
−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4glu104ser125IL
−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4glu104IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4glu104ala125IL
−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5ala
104ser125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5ala
104IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5ala
104ala125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5glu
104ser125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5glu
104IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5glu
104ala125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5des−
ser6ala104ala125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5des−
ser6ala104IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5des−
ser6ala104ser125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5des−
ser6glu104ser125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5des−
ser6glu104IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5des−
ser6glu104ala125IL−２。
これらの寄託は、特許手続きのための微生物の寄託の
国際的承認に関するブタペスト条約及びその規則（ブタ
ペスト条約）の規定のもとに行われた。この条約は寄託
の日から30年間にわたる生存培養物の維持を保証する。
微生物は、ブタペスト条約の下で、そして本出願人とAT
CCとの間の契約に従って、ATCCにより入手可能にされる
であろう。この契約は、培養物の子孫の永久的且つ無制
限の入手可能性を、関連する米国特許が発せられた後、
又は米国特許出願又は外国の特許出願が、いずれが先に
到来するにしても、公表された後に公衆に対して保証
し、そして前記子孫の入手可能性を、35USC§122及びそ
れに基く長官規則（886 OG638への特別の言及を伴う（3
7CFR§1.14を含む）に従って米国特許商標局長官により
その権利を有すると決定された者に対して保証する。本
出願人は、寄託中の微生物が適切な条件下で培養された
場合に死滅し、失われ又は破損した場合に、それらが通
知の後に同じ培養物の生存試料により取り替えられるで
あろうことを承認していた。寄託された菌株が入手可能
であることは、いずれの政府の当局によりその特許法に
従って許可された権利に反して発明を実施することを承
諾するものであると解されるべきではない。
国際的承認に関するブタペスト条約及びその規則（ブタ
ペスト条約）の規定のもとに行われた。この条約は寄託
の日から30年間にわたる生存培養物の維持を保証する。
微生物は、ブタペスト条約の下で、そして本出願人とAT
CCとの間の契約に従って、ATCCにより入手可能にされる
であろう。この契約は、培養物の子孫の永久的且つ無制
限の入手可能性を、関連する米国特許が発せられた後、
又は米国特許出願又は外国の特許出願が、いずれが先に
到来するにしても、公表された後に公衆に対して保証
し、そして前記子孫の入手可能性を、35USC§122及びそ
れに基く長官規則（886 OG638への特別の言及を伴う（3
7CFR§1.14を含む）に従って米国特許商標局長官により
その権利を有すると決定された者に対して保証する。本
出願人は、寄託中の微生物が適切な条件下で培養された
場合に死滅し、失われ又は破損した場合に、それらが通
知の後に同じ培養物の生存試料により取り替えられるで
あろうことを承認していた。寄託された菌株が入手可能
であることは、いずれの政府の当局によりその特許法に
従って許可された権利に反して発明を実施することを承
諾するものであると解されるべきではない。
第１図は天然IL−２、及びそこで使用される位置番号を
示す。 第２図は天然β−インターフェロン（IFN−β）のアミ
ノ酸配列、及びそこで使用されるアミノ酸番号を示す。 第３図はE.コリ（E.coli）中で生産された変形されたIL
−２及び関連IL−２の両者の、クロラミンＴ処理の前後
におけるRP−HPLC分析を示す。 第４図は、E.コリ中で生産された変形されたIL−２及び
関連IL−２の両者の、過酸化水素処理の前後におけるRP
−HPLC分析を示す。 第５図は、この発明のIL−２又は関連IL−２を生産する
形質転換されたE.コリからの、抽出物又は精製されたIL
−２のクマーシーブルー染色されたSDS−PAGE分析を示
す。 第６図は、酵母発現ベクターとして使用されるpJDB219
の制限地図を示す。この地図はこのプラスミドのＢ形を
示す。S.セレビシエー（S.cerevisiae）C468のごときサ
ークルゼロ細胞においては、このプラスミドは無傷のfl
ip遺伝子を含有しないため、Ｂ形として残るであろう。
示す。 第２図は天然β−インターフェロン（IFN−β）のアミ
ノ酸配列、及びそこで使用されるアミノ酸番号を示す。 第３図はE.コリ（E.coli）中で生産された変形されたIL
−２及び関連IL−２の両者の、クロラミンＴ処理の前後
におけるRP−HPLC分析を示す。 第４図は、E.コリ中で生産された変形されたIL−２及び
関連IL−２の両者の、過酸化水素処理の前後におけるRP
−HPLC分析を示す。 第５図は、この発明のIL−２又は関連IL−２を生産する
形質転換されたE.コリからの、抽出物又は精製されたIL
−２のクマーシーブルー染色されたSDS−PAGE分析を示
す。 第６図は、酵母発現ベクターとして使用されるpJDB219
の制限地図を示す。この地図はこのプラスミドのＢ形を
示す。S.セレビシエー（S.cerevisiae）C468のごときサ
ークルゼロ細胞においては、このプラスミドは無傷のfl
ip遺伝子を含有しないため、Ｂ形として残るであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:865） 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ− ４０２１１ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ− ５３３５４ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ− ５３３５５ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ− ５３３５６ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ− ２０７８７ 審判番号 平6−11462 (72)発明者 ロバート フオーガン、ホーレンベツク アメリカ合衆国，カリフオルニア 94901 サン ラフアエル，スプリング グローブ アベニユ 136 (72)発明者 マイクル アレン イニス アメリカ合衆国，カリフオルニア 94602，オークランド，カールセン ス トリート 3133 (56)参考文献 特開 昭59−76043（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−176238（ＪＰ，Ａ) 特開 昭52−46068（ＪＰ，Ａ) Ｎａｔｕｒｅ，［312］Ｐ．77−80 （1984)
Claims (10)
- 【請求項１】インターロイキン−２と同じ生物学的活性
を有し、インターロイキン−２のクロラミンＴ又は過酸
化物酸化に対して感受性のメチオニン残基が保存的アミ
ノ酸により置き換えられておりそしてその他の非感受性
メチオニン残基がそのように置き換えられていないこと
を特徴とする酸化に対して耐性を有するインターロイキ
ン−２ミューテイン。 - 【請求項２】前記保存的アミノ酸がグリシン、アラニ
ン、セリン、スレオニン、バリン、イソロイシン、ロイ
シン、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、チロ
シン、又はフェニルアラニンである、特許請求の範囲第
１項に記載のインターロイキン−２ミューテイン。 - 【請求項３】前記インターロイキン−２がヒトインター
ロイキン−２である、特許請求の範囲第１項又は第２項
に記載のインターロイキン−２ミューテイン。 - 【請求項４】前記保存的アミノ酸がアラニン、セリン、
ロイシン、イソロイシン、グルタミン酸又はバリンであ
る、特許請求の範囲第１項又は第２項に記載のインター
ロイキン−２ミューテイン。 - 【請求項５】前記ミューテインが、 ala104ser125IL−2, ala104IL−2, ala104ala125IL−2, val104ser125IL−2, val104IL−2, val104ala125IL−2, glu104ser125IL−2, glu104IL−2, glu104ala125IL−2, des−ala1ala104ser125IL−2, des−ala1ala104IL−2, des−ala1ala104ala125IL−2, des−ala1val104ser125IL−2, des−ala1val104IL−2, des−ala1val104ala125IL−2, des−ala1glu104ser125IL−2, des−ala1glu104IL−2, des−ala1glu104ala125IL−2, des−ala1des−pro2ala104ser125IL−2, des−ala1des−pro2ala104IL−2, des−ala1des−pro2ala104ala125IL−2, des−ala1des−pro2val104ser125IL−2, des−ala1des−pro2val104IL−2, des−ala1des−pro2val104ala125IL−2, des−ala1des−pro2glu104ser125IL−2, des−ala1des−pro2glu104IL−2, des−ala1des−pro2glu104ala125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3ala104ser125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3ala104IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3ala104ala125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3val104ser125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3val104IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3val104ala125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3glu104ser125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3glu104IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3glu104ara125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4ala104ser125IL
−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4ala104IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4ala104ara125IL
−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4val104ser125IL
−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4val104IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4val104ala125IL
−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4glu104ser125IL
−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4glu104IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4glu104ala125IL
−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5ala
104ser125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5ala
104IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5ala
104ala125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5val
104ser125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5val
104IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5val
104ala125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5glu
104ser125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5glu
104IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5glu
104ala125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5des−
ser6ala104ala125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5des−
ser6ala104IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5des−
ser6ala104ser125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5des−
ser6val104ser125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5des−
ser6val104IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5des−
ser6val104ala125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5des−
ser6glu104ser125IL−2, des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5des−
ser6glu104IL−2,又は des−ala1des−pro2des−thr3des−ser4des−ser5des−
ser6glu104ala125IL−２ である、特許請求の範囲第１項に記載のインターロイキ
ン−２ミューテイン。 - 【請求項６】前記ミューテインが、 ala104ser125IL−2, ala104IL−2, ala104ala125IL−2, des−ala1ala104IL−2, des−ala1ala104ser125IL−2,又は des−ala1ala104ala125IL−２ である、特許請求の範囲第１項に記載のインターロイキ
ン−２ミューテイン。 - 【請求項７】104位のメチオニンが保存的アミノ酸によ
り置換されており、ヒトインターロイキン−２の生物学
的活性を示す、特許請求の範囲第１項に記載のインター
ロイキン−２ミューテイン。 - 【請求項８】前記保存的アミノ酸がグリシン、アラニ
ン、セリン、スレオニン、バリン、イソロイシン、ロイ
シン、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、チロ
シン、又はフェニルアラニンである、特許請求の範囲第
６項に記載のインターロイキン−２ミューテイン。 - 【請求項９】前記保存的アミノ酸がアラニン、セリン、
ロイシン、グルタミン酸又はバリンである、特許請求の
範囲第８項に記載のインターロイキン−２ミューテイ
ン。 - 【請求項１０】ミューテインがグリコシル化されてお
り、そして前記保存的アミノ酸がセリン又はアラニンで
ある、特許請求の範囲第９項に記載のインターロイキン
−２ミューテイン。
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