JPS62174022A - 抗腫瘍活性物質およびその製造法 - Google Patents
抗腫瘍活性物質およびその製造法Info
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、抗腫瘍活性物質、詳しくは腫瘍細胞に対して
特異的にその増殖を抑制する作用を有する物質、その製
造法、該物質を含む抗腫瘍剤及び該物質をコードする遺
伝子に関する。
特異的にその増殖を抑制する作用を有する物質、その製
造法、該物質を含む抗腫瘍剤及び該物質をコードする遺
伝子に関する。
従 来 の 技 術
従来より、生体内には腫瘍細胞に直接触いて、その増殖
を選択的に抑制し、該腫瘍細胞を生体系より消去する作
用を有する物質の存在することが知られている。之等の
抗腫瘍活性物質としては、例えばインターフェロン（Ｉ
ＦＮ）、リンフォトキシン（ＬＴ） 、ガン壊死因子（
ＴＮ Ｆ 、 ＴｕｍｏｒＮｅｃｒｏＮｚｉｎｇ Ｆ
ａｃｔｏｒ ）等が報告されている（Ｅｖａｎｓ Ｃ
，Ｈ，、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ。
を選択的に抑制し、該腫瘍細胞を生体系より消去する作
用を有する物質の存在することが知られている。之等の
抗腫瘍活性物質としては、例えばインターフェロン（Ｉ
ＦＮ）、リンフォトキシン（ＬＴ） 、ガン壊死因子（
ＴＮ Ｆ 、 ＴｕｍｏｒＮｅｃｒｏＮｚｉｎｇ Ｆ
ａｃｔｏｒ ）等が報告されている（Ｅｖａｎｓ Ｃ
，Ｈ，、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ。
Ｉ ｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、■、１８１ （１’１Ｊ８２
））、之等の抗腫瘍活性物質は、腫瘍細胞の増殖を抑制
する作用を有するところから、抗腫瘍剤として利用でき
ると考えられ、またそれらに対応するとされる遺伝子構
造が明らかにされつつあり、遺伝子工学的手法によるそ
れらの生産も種々研究されつつある（Ｎａｔｕｒｅ、Ｖ
ｏｌ、 ３１２．２０／２７． ｐ７２１ （１９８４
）；同Ｖｏ１．３１２．２０／２７、ｐ ７２４ （１
９８４）等）。
））、之等の抗腫瘍活性物質は、腫瘍細胞の増殖を抑制
する作用を有するところから、抗腫瘍剤として利用でき
ると考えられ、またそれらに対応するとされる遺伝子構
造が明らかにされつつあり、遺伝子工学的手法によるそ
れらの生産も種々研究されつつある（Ｎａｔｕｒｅ、Ｖ
ｏｌ、 ３１２．２０／２７． ｐ７２１ （１９８４
）；同Ｖｏ１．３１２．２０／２７、ｐ ７２４ （１
９８４）等）。
発明が解決しようとする問題点
本発明の目的は、上記報告された各種の抗腫瘍活性物質
とは、その性状、特性等を異にする新しい抗腫瘍活性物
質を提供することにある。
とは、その性状、特性等を異にする新しい抗腫瘍活性物
質を提供することにある。
本発明の他の目的は、上記新規な抗腫瘍活性物質を、哺
乳動物由来の免疫担当細胞から製造する技術を提供する
ことにある。
乳動物由来の免疫担当細胞から製造する技術を提供する
ことにある。
本発明の他の目的は、上記抗腫瘍活性物質を、遺伝子工
学的手法により製造する技術を提供することにある。
学的手法により製造する技術を提供することにある。
本発明の他の目的は、上記抗腫瘍活性物質を含有する抗
腫瘍剤を提供することにある。
腫瘍剤を提供することにある。
更に本発明の仙の目的は、上記抗腫瘍活性物質を遺伝子
工学的手法により製造するための遺伝子、これを挿入し
た発現ベクター及び該ベクターを組込んだ組換え微生物
を提供することにある。
工学的手法により製造するための遺伝子、これを挿入し
た発現ベクター及び該ベクターを組込んだ組換え微生物
を提供することにある。
上記目的及びその他の本発明の特徴を、以下に詳述する
。
。
問題点を解決するための手段
本発明の抗腫瘍活性物質（以下ｒＧＩ ＦＪという）は
、後記する実施例に記載した方法により測定される腫瘍
細胞増殖抑制活性〈以下ｒＧＩＦ活性」という）を有し
、下記一般式（１）で表わされる一次構造のポリペプチ
ドＡをその構成蛋白として含む点において特徴付けられ
る。
、後記する実施例に記載した方法により測定される腫瘍
細胞増殖抑制活性〈以下ｒＧＩＦ活性」という）を有し
、下記一般式（１）で表わされる一次構造のポリペプチ
ドＡをその構成蛋白として含む点において特徴付けられ
る。
〔ポリペプチドＡ） （一般式（１））％式％
〔式中、ＸはＣｙｓ又はＳｅｒを示す。７はＨを示すか
又は下記アミノ酸配列 Ｍｅｔ ＬＶｓ Ｃｙｓ Ｓｅｒ ｐｈｅ
Ｑｌｎ ＡＳｐｌ−ｅｕ ＡｓｐＬｅｕ ＣｙＳ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ ＡＳＩ） ａｌｙ Ｇｌｙ
Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｌｅｕ ＡｒｇＩｌｅ ５
ｅｒＡｓｐ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｓｅｒ
ＬＶＳ ＧＩＶ Ｐｈｅ Ａｒｏ Ｇｌｎ
ＡｌａＡ！ａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｖａｌ
Ｖａｌ Ａｌａ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｌｙｓ
Ｌｅｕ ＡｒａＬｙｓ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｖａ
ｌ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｈ
ｒ Ｐｈｅ ＧｌｎＧｌｕ Ａｓｎ ＡＳＩ）
Ｌｅｔｌ ３ｅｒ Ｔｈｒ ｐｈｅ Ｐｈ
ｅ ｐｒｏ Ｐｈｅ ｌ１ｅＰｈｅ Ｇｌｕ
Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｐｈｅ
Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｔｈｒ ＴｒｐＡｓｐ Ａ
ｓｎ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｈ
ｉｓ Ａｓｐで示されるペプチド又はそのＮ末端側か
らこの配列に従い１もしくはそれ以上のアミノ酸を欠失
するペプチド又はアミノ酸を表わす。〕 本明細書においてペプチドにおけるアミノ酸の表示は、
ＩＵＰＡＣにより採択されているアミノ酸命名法におけ
る略号乃至当該分野で慣用されている略号によるアミノ
酸残基の表示法に従うものとし、塩基配列における核酸
の表示も同様とする。
又は下記アミノ酸配列 Ｍｅｔ ＬＶｓ Ｃｙｓ Ｓｅｒ ｐｈｅ
Ｑｌｎ ＡＳｐｌ−ｅｕ ＡｓｐＬｅｕ ＣｙＳ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ ＡＳＩ） ａｌｙ Ｇｌｙ
Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｌｅｕ ＡｒｇＩｌｅ ５
ｅｒＡｓｐ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｓｅｒ
ＬＶＳ ＧＩＶ Ｐｈｅ Ａｒｏ Ｇｌｎ
ＡｌａＡ！ａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｖａｌ
Ｖａｌ Ａｌａ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｌｙｓ
Ｌｅｕ ＡｒａＬｙｓ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｖａ
ｌ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｈ
ｒ Ｐｈｅ ＧｌｎＧｌｕ Ａｓｎ ＡＳＩ）
Ｌｅｔｌ ３ｅｒ Ｔｈｒ ｐｈｅ Ｐｈ
ｅ ｐｒｏ Ｐｈｅ ｌ１ｅＰｈｅ Ｇｌｕ
Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｐｈｅ
Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｔｈｒ ＴｒｐＡｓｐ Ａ
ｓｎ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｈ
ｉｓ Ａｓｐで示されるペプチド又はそのＮ末端側か
らこの配列に従い１もしくはそれ以上のアミノ酸を欠失
するペプチド又はアミノ酸を表わす。〕 本明細書においてペプチドにおけるアミノ酸の表示は、
ＩＵＰＡＣにより採択されているアミノ酸命名法におけ
る略号乃至当該分野で慣用されている略号によるアミノ
酸残基の表示法に従うものとし、塩基配列における核酸
の表示も同様とする。
本発明ＧＩＦは、その蛋白の一次構造が１５３個のアミ
ノ酸配列からなる下記ポリペプチド■（上記式中ＸがＣ
ｙｓ及びＺがＨのもの）をその基本とするものであるが
、該蛋白の一次構造は、上記ポリペプチドＴのＮ末端に
上記Ｚで表わされるように１〜８５個のアミノ酸配列か
ら選択される任意のペプチド鎖又はアミノＭ（Ａｓｐ−
）を有するものであってもよい。上記蛋白の代表的具体
例としては、下記ポリペプチド■、■、■及びＩＶを例
示できる。
ノ酸配列からなる下記ポリペプチド■（上記式中ＸがＣ
ｙｓ及びＺがＨのもの）をその基本とするものであるが
、該蛋白の一次構造は、上記ポリペプチドＴのＮ末端に
上記Ｚで表わされるように１〜８５個のアミノ酸配列か
ら選択される任意のペプチド鎖又はアミノＭ（Ａｓｐ−
）を有するものであってもよい。上記蛋白の代表的具体
例としては、下記ポリペプチド■、■、■及びＩＶを例
示できる。
Ａｌａ ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｒｇ３ｅｒ ｌｅ
ｕ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｒ
ａＡＳｐ Ｓｅｒ Ｑｌｎ Ｇｌｎ Ｌｙｓ
３ｅｒ ｌｅｕ Ｖａｔ Ｍｅｔ ３ｅｒ
ＱｌｙＰｒｏ Ｔｙｒ Ｑｌｕ ｌｅｕ Ｌ
ＶＳ Ａｌａ Ｌｅｕ ＨｉＳ ｌｅｕ Ｇ
ｌｎ ＧｌｙＧｌｎ ＡＳＩ） Ｍｅｔ Ｑｌ
ｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｖａｔ Ｖａｔ ｐｈ
ｅ Ｓｅｒ １ｙｌｅｔＳｅｒ ｐｈｅ Ｖａ
ｌ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｑｌｕ Ｇｌｕ ３ｅ
ｒ ＡＳｎ ＡＳＩＩ ＬＶＳＩｌｅ Ｐｒｏ
Ｖａｔ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ ＡｓｎＬｅｕ
Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｖａｌ
Ｌｅｕ Ｌｙｓ ＡＳＤ ＡＳＩ） ＬＶＳＰ
ｒｏ Ｔｈｒ ｌｅｕ Ｇｌｎ １−ｅｕ
Ｑｌｕ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｓｐ ｐｒｏ
１−ｙｓＡｓｎ Ｔｙｒ Ｐｒｏ ＬＶＳ Ｌ
ＶＳ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｕ ＬＶＳ Ａ
ｒｇＰｈｅＶａｌ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｉ
ｌｅ ＧＩＬＩ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ
ＬｅｆｔＧｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ
Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ
Ｔｒｌｌ Ｔｙｒｌｌｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅ
ｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｍｅｔ
Ｐｒｏ ＶａｔＰｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｓｐ
ｌ１ｅＴｈｒ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｍｅ
ｔ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅ
ｒ〔ポリペプチド■〕 Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｃｙｓ
Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｎ
ＧｌｕＡｓｎ ＡＳＩ） ｌｅｕ ３ｅｒ Ｔ
ｈｒ ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｉ
ｌｅ ｐｈｅＧｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ
Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ ＡＳＤ Ｔｈｒ
Ｔｒｐ ＡｓｐＡｓｎ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔ
ｙｒ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐ
ｒｏ Ｖａｌ ＡｒａＳｅｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ
Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｌｅｕ ＡｒｇＡｓｐ
Ｓｅｒ Ｇｌｎ ＧｌｎＬｙｓ ３ｅｒ ｌｅ
ｕ Ｖａｌ Ｍｅｔ ３ｅｒ Ｇｌｌ／ ｐ
ｒｏ Ｔｌ／ｒ Ｇｌｔｌ ＬｅｕＬＪＳ Ａ
ｌａ Ｌｅｕ ｌ−１ｉｓ ｌｅｕ Ｇｌｎ
Ｇｌｙ Ｇｌｎ ＡＳＩ） Ｍｅｔ Ｇｌｕ
Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｐｈｅ
Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ
ＱｌｎＧｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓ
ｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｐｒｏ ｖａ
ｌ Ａｌａｌ−ｅｕ Ｇｌｙ ｌｅｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ ”ｒｙ
ｒ Ｌｅｕ ５ｅｒｃｙｓ Ｖａｌ ｌｅｕ
ＩＪＳ ＡＳｐＡＳＩ） ＬＶＳ Ｐｒｏ
Ｔｈｒ Ｉ−ｅｕ Ｇｌｎｌｅｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ
Ｖａｌ ＡＳＤ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｓｎ ｌｙｒ
Ｐｒｏ Ｌｌ／５ＬＶＳ ｃｙｓ Ｍｅｔ ＧｌｕＬｙ
ｓ ＡｒｔＪ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｐｈｅ ＡＳｎ Ｌ
ｙｓｌｌｅ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｓｎ ｌｙ
ｓ ｌｅｕ Ｑｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｕ ３ｅｒＡｌａ
Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ’Ａｓｎ ｒｒｐ
Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ ５ｅｒＧｌ
ｎ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｖａｔ
Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ ＧｌｙＴｈｒ Ｌｙｓ
Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ
Ａｓｐ Ｐｈｅ ＴｈｒＭｅｔ Ｇｌｎ Ｐｈｅ
Ｖａｌ Ｓｅｒ ３ｅｒ〔ポリペプチド■〕 Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｌｅｕ ＡｒｇＬＶ
Ｓ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｃｙ
ｓＰｒｏ Ｇｌｎ Ｔｈｒ ｐｈｅ Ｑｌｎ
ＧＩＬＩ Ａｓｎ Ａｓｐ １−ｅｕ ３ｅ
ｒ ＴｈｒＰｈｅ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ
Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ
Ｐｒｏ １ｉｅＰｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｔｈ
ｒ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｌａ
Ｔｙｒ Ｖａｔトｌｉｓ Ａｓｐ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ｖａｔ ＡｒＯＳｅｒ １−ｅ
ｕ Ａｓｎ Ｃｙｓ ＴｈｒＬｅｕ Ａｒｇ
Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｇｌｎ ＩＪｓ
ｓｅｒ １−ｅｕ Ｖａｌ ｆｖｌｅｔ３ｅｒ
Ｇｌ’Ｖ Ｐｒｏ ＴＶｒ Ｑ＋ｕ ｌｅｕ
Ｌｙｓ Ａｌａ ｌｅｕ Ｈｒｓ １−ｅ
ｕＧｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｍｅｔ
Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｖａｔ Ｖａｌ
ＰｈｅＳｅｒ Ｍｅｔ ３ｅｒ ｐｈｅｖａｌ
Ｇｌｎ Ｑｌｙ Ｇｌｕ （３１ｕ Ｓｅ
ｒ 、Ａ、ｓｎＡＳＩＩ ＬｙＳ Ｉｌｅ ｐ
ｒｏ Ｖａｌ Ａｌａ １−ｅｕ Ｇｌｙ
Ｌｅｕ ｌｙｓ ＱｌｕＬｙｓ Ａｓｎ １−
ｅｕ Ｔｙｒ ＬｅＬｌ ３ｅｒ Ｃ１／Ｓ
Ｖａｌ ＬｅＵ Ｌｌ／Ｓ ＡＳＤＡｓｐ Ｌ
ｙｓ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌ
ｅｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｖａ、ｌ Ａｓｐｐｒ
ｏ Ｌｙｓ ＡＳｎ Ｔｙｒ ｐｒｏ Ｌｙ
Ｓ ＬｙＳ ＩＪｓ Ｍｅｔ Ｇｌｕ ＬＶ
ＳＡｒａ ｐｈｅ Ｖａｌ ｐｈｅ Ａｓｎ
ｌｙｓ ｌｉｅ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｓｎ
ＡｓｎＬｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ ｐｈｅ Ｇｌｕ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｈｅ ＰｒＯＡ
ＳＩＩ７ｒｐ Ｔｙｒ ｌｉｅ ３ｅｒ 丁ｈ
ｒ ３ｅｒ Ｑｌｎ Ａｌａ Ｑｌｕ Ａｓ
ｎ ＭｅｔＰｒｏ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇ
ｌｙ ＧｌｎＡＳＤ ｌｌｅ Ｔｈｒ ＡＳＩＩ
Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｑｌｎ ｐｈｅ Ｖ
ａｔ Ｓｅｒｅｒ （ポリペプチドＩＶ） Ｍｅｔ ＬｙＳ ｃｙｓ Ｓｅｒ ｐｈｅ
Ｇｌｎ Ａｓｐ １ｅｕ ＡＳＩＩ １−ｅｌ
ｌ ＣＶＳｐｒｏ Ｌｅｕ ＡＳＩ） Ｇｔｙ
ＧＩＶ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｒｏ
［ｌｅ ５ｅｒＡＳＩＩ Ｈｉｓ Ｈｉｓ
ＴＶｒ Ｓｅｒ Ｌｙｓ ａｌｙ Ｐｈｅ
Ａｒ（ｌ Ｇｌｎ ＡＩａＡｌａ Ｓｅｒ
Ｖａｌ Ｖａｔ Ｖａｌ Ａｌａ Ｍｅｔ
Ａｓｐ ｔ−ｙｓ Ｌｅｕ Ａｒ（ＩＬｙＳ
Ｍｅｔ ｌｅｕ Ｖａｌ ｐｒｏ Ｃｙｓ
ｐｒｏ Ｇｌｎ ｌｈｒ ｐｈｅ （３１ｎＧ
ｌｕ Ａｓｎ ＡＳｐｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ
ｌ：）ｈｅ ｐｈａ ｐｒｏ Ｐｈｅ １
ｌｅＰｈｅ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ
Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｔｈｒ
ＴｒｐＡＳＤ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔ
ｙｒ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐ
ｒｏ ＶａｌＡｒｇ Ｓｅｒ １−ｅｕ Ａｓ
ｎ Ｃｙｓ ｌｈｒ １−ｅｕ Δｒ！ＩＩ
ＡＳＩＩ Ｓｅｒ （３Ｉｎ＜３１ｎ Ｌｙｓ
Ｓｅｒ ｌｅｕ Ｖａｔ Ｍｅｔ ３ｅｒ
Ｇｌｙ Ｐｒｏ ｒｙｒ Ｇｌｔｌｌｅｕ
ＬＶＳ Ａｌａ ＬｅｌＪ ｌ−１ｉｓ ｌ
ｅｕ Ｇｌｎ ＧＩＶ Ｇｉｎ ＡＳＩ）
ＭｅｔＧｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｖａ
ｔ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｐｈ
ｅ ＶａｌＧｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｕ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｉｌｅ
Ｐｒｏ ＶａｌＡｌａ Ｌ ｅｕ Ｇｌｙ
Ｌｅｕ Ｌ ｙｓ Ｇｌｕ １−ｙｓ Ａｓｎ
１−ｅｕ Ｔｙｒ Ｌ ｅｕＳｅｒ Ｃｙｓ
Ｖａｌ １−ｅｕ ＩＪｓ ＡＳＩ３ Ａ
ＳＩＩ ＬＶＳ ｐｒｏ Ｔｈｒ １−ｅｕＧ
ｌｎ ｌｅｕ Ｑｌｕ ３ｅｒ Ｖａｌ Ａ
ＳＩ） ｐｒｏ ｌｙｓ Ａｓｎ Ｔｙｒ
ｐｒ。
ｕ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｒ
ａＡＳｐ Ｓｅｒ Ｑｌｎ Ｇｌｎ Ｌｙｓ
３ｅｒ ｌｅｕ Ｖａｔ Ｍｅｔ ３ｅｒ
ＱｌｙＰｒｏ Ｔｙｒ Ｑｌｕ ｌｅｕ Ｌ
ＶＳ Ａｌａ Ｌｅｕ ＨｉＳ ｌｅｕ Ｇ
ｌｎ ＧｌｙＧｌｎ ＡＳＩ） Ｍｅｔ Ｑｌ
ｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｖａｔ Ｖａｔ ｐｈ
ｅ Ｓｅｒ １ｙｌｅｔＳｅｒ ｐｈｅ Ｖａ
ｌ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｑｌｕ Ｇｌｕ ３ｅ
ｒ ＡＳｎ ＡＳＩＩ ＬＶＳＩｌｅ Ｐｒｏ
Ｖａｔ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ ＡｓｎＬｅｕ
Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｖａｌ
Ｌｅｕ Ｌｙｓ ＡＳＤ ＡＳＩ） ＬＶＳＰ
ｒｏ Ｔｈｒ ｌｅｕ Ｇｌｎ １−ｅｕ
Ｑｌｕ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｓｐ ｐｒｏ
１−ｙｓＡｓｎ Ｔｙｒ Ｐｒｏ ＬＶＳ Ｌ
ＶＳ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｕ ＬＶＳ Ａ
ｒｇＰｈｅＶａｌ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｉ
ｌｅ ＧＩＬＩ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ
ＬｅｆｔＧｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ
Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ
Ｔｒｌｌ Ｔｙｒｌｌｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅ
ｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｍｅｔ
Ｐｒｏ ＶａｔＰｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｓｐ
ｌ１ｅＴｈｒ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｍｅ
ｔ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅ
ｒ〔ポリペプチド■〕 Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｃｙｓ
Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｎ
ＧｌｕＡｓｎ ＡＳＩ） ｌｅｕ ３ｅｒ Ｔ
ｈｒ ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｉ
ｌｅ ｐｈｅＧｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ
Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ ＡＳＤ Ｔｈｒ
Ｔｒｐ ＡｓｐＡｓｎ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔ
ｙｒ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐ
ｒｏ Ｖａｌ ＡｒａＳｅｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ
Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｌｅｕ ＡｒｇＡｓｐ
Ｓｅｒ Ｇｌｎ ＧｌｎＬｙｓ ３ｅｒ ｌｅ
ｕ Ｖａｌ Ｍｅｔ ３ｅｒ Ｇｌｌ／ ｐ
ｒｏ Ｔｌ／ｒ Ｇｌｔｌ ＬｅｕＬＪＳ Ａ
ｌａ Ｌｅｕ ｌ−１ｉｓ ｌｅｕ Ｇｌｎ
Ｇｌｙ Ｇｌｎ ＡＳＩ） Ｍｅｔ Ｇｌｕ
Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｐｈｅ
Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ
ＱｌｎＧｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓ
ｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｐｒｏ ｖａ
ｌ Ａｌａｌ−ｅｕ Ｇｌｙ ｌｅｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ ”ｒｙ
ｒ Ｌｅｕ ５ｅｒｃｙｓ Ｖａｌ ｌｅｕ
ＩＪＳ ＡＳｐＡＳＩ） ＬＶＳ Ｐｒｏ
Ｔｈｒ Ｉ−ｅｕ Ｇｌｎｌｅｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ
Ｖａｌ ＡＳＤ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｓｎ ｌｙｒ
Ｐｒｏ Ｌｌ／５ＬＶＳ ｃｙｓ Ｍｅｔ ＧｌｕＬｙ
ｓ ＡｒｔＪ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｐｈｅ ＡＳｎ Ｌ
ｙｓｌｌｅ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｓｎ ｌｙ
ｓ ｌｅｕ Ｑｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｕ ３ｅｒＡｌａ
Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ’Ａｓｎ ｒｒｐ
Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ ５ｅｒＧｌ
ｎ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｖａｔ
Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ ＧｌｙＴｈｒ Ｌｙｓ
Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ
Ａｓｐ Ｐｈｅ ＴｈｒＭｅｔ Ｇｌｎ Ｐｈｅ
Ｖａｌ Ｓｅｒ ３ｅｒ〔ポリペプチド■〕 Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｌｅｕ ＡｒｇＬＶ
Ｓ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｃｙ
ｓＰｒｏ Ｇｌｎ Ｔｈｒ ｐｈｅ Ｑｌｎ
ＧＩＬＩ Ａｓｎ Ａｓｐ １−ｅｕ ３ｅ
ｒ ＴｈｒＰｈｅ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ
Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ
Ｐｒｏ １ｉｅＰｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｔｈ
ｒ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｌａ
Ｔｙｒ Ｖａｔトｌｉｓ Ａｓｐ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ｖａｔ ＡｒＯＳｅｒ １−ｅ
ｕ Ａｓｎ Ｃｙｓ ＴｈｒＬｅｕ Ａｒｇ
Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｇｌｎ ＩＪｓ
ｓｅｒ １−ｅｕ Ｖａｌ ｆｖｌｅｔ３ｅｒ
Ｇｌ’Ｖ Ｐｒｏ ＴＶｒ Ｑ＋ｕ ｌｅｕ
Ｌｙｓ Ａｌａ ｌｅｕ Ｈｒｓ １−ｅ
ｕＧｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｍｅｔ
Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｖａｔ Ｖａｌ
ＰｈｅＳｅｒ Ｍｅｔ ３ｅｒ ｐｈｅｖａｌ
Ｇｌｎ Ｑｌｙ Ｇｌｕ （３１ｕ Ｓｅ
ｒ 、Ａ、ｓｎＡＳＩＩ ＬｙＳ Ｉｌｅ ｐ
ｒｏ Ｖａｌ Ａｌａ １−ｅｕ Ｇｌｙ
Ｌｅｕ ｌｙｓ ＱｌｕＬｙｓ Ａｓｎ １−
ｅｕ Ｔｙｒ ＬｅＬｌ ３ｅｒ Ｃ１／Ｓ
Ｖａｌ ＬｅＵ Ｌｌ／Ｓ ＡＳＤＡｓｐ Ｌ
ｙｓ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌ
ｅｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｖａ、ｌ Ａｓｐｐｒ
ｏ Ｌｙｓ ＡＳｎ Ｔｙｒ ｐｒｏ Ｌｙ
Ｓ ＬｙＳ ＩＪｓ Ｍｅｔ Ｇｌｕ ＬＶ
ＳＡｒａ ｐｈｅ Ｖａｌ ｐｈｅ Ａｓｎ
ｌｙｓ ｌｉｅ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｓｎ
ＡｓｎＬｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ ｐｈｅ Ｇｌｕ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｈｅ ＰｒＯＡ
ＳＩＩ７ｒｐ Ｔｙｒ ｌｉｅ ３ｅｒ 丁ｈ
ｒ ３ｅｒ Ｑｌｎ Ａｌａ Ｑｌｕ Ａｓ
ｎ ＭｅｔＰｒｏ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇ
ｌｙ ＧｌｎＡＳＤ ｌｌｅ Ｔｈｒ ＡＳＩＩ
Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｑｌｎ ｐｈｅ Ｖ
ａｔ Ｓｅｒｅｒ （ポリペプチドＩＶ） Ｍｅｔ ＬｙＳ ｃｙｓ Ｓｅｒ ｐｈｅ
Ｇｌｎ Ａｓｐ １ｅｕ ＡＳＩＩ １−ｅｌ
ｌ ＣＶＳｐｒｏ Ｌｅｕ ＡＳＩ） Ｇｔｙ
ＧＩＶ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｒｏ
［ｌｅ ５ｅｒＡＳＩＩ Ｈｉｓ Ｈｉｓ
ＴＶｒ Ｓｅｒ Ｌｙｓ ａｌｙ Ｐｈｅ
Ａｒ（ｌ Ｇｌｎ ＡＩａＡｌａ Ｓｅｒ
Ｖａｌ Ｖａｔ Ｖａｌ Ａｌａ Ｍｅｔ
Ａｓｐ ｔ−ｙｓ Ｌｅｕ Ａｒ（ＩＬｙＳ
Ｍｅｔ ｌｅｕ Ｖａｌ ｐｒｏ Ｃｙｓ
ｐｒｏ Ｇｌｎ ｌｈｒ ｐｈｅ （３１ｎＧ
ｌｕ Ａｓｎ ＡＳｐｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ
ｌ：）ｈｅ ｐｈａ ｐｒｏ Ｐｈｅ １
ｌｅＰｈｅ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ
Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｔｈｒ
ＴｒｐＡＳＤ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔ
ｙｒ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐ
ｒｏ ＶａｌＡｒｇ Ｓｅｒ １−ｅｕ Ａｓ
ｎ Ｃｙｓ ｌｈｒ １−ｅｕ Δｒ！ＩＩ
ＡＳＩＩ Ｓｅｒ （３Ｉｎ＜３１ｎ Ｌｙｓ
Ｓｅｒ ｌｅｕ Ｖａｔ Ｍｅｔ ３ｅｒ
Ｇｌｙ Ｐｒｏ ｒｙｒ Ｇｌｔｌｌｅｕ
ＬＶＳ Ａｌａ ＬｅｌＪ ｌ−１ｉｓ ｌ
ｅｕ Ｇｌｎ ＧＩＶ Ｇｉｎ ＡＳＩ）
ＭｅｔＧｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｖａ
ｔ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｐｈ
ｅ ＶａｌＧｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｕ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｉｌｅ
Ｐｒｏ ＶａｌＡｌａ Ｌ ｅｕ Ｇｌｙ
Ｌｅｕ Ｌ ｙｓ Ｇｌｕ １−ｙｓ Ａｓｎ
１−ｅｕ Ｔｙｒ Ｌ ｅｕＳｅｒ Ｃｙｓ
Ｖａｌ １−ｅｕ ＩＪｓ ＡＳＩ３ Ａ
ＳＩＩ ＬＶＳ ｐｒｏ Ｔｈｒ １−ｅｕＧ
ｌｎ ｌｅｕ Ｑｌｕ ３ｅｒ Ｖａｌ Ａ
ＳＩ） ｐｒｏ ｌｙｓ Ａｓｎ Ｔｙｒ
ｐｒ。
しＶＳ ＬＶＳ ｔ−ｙｓ Ｍｅｔ Ｑｌｕ
ＬＶＳ Ａｒｑ Ｐｈｅ Ｖａｌ ｐｈｅ
ＡｓｎＬＪＳ ｌｌｅ Ｑｌｕ ｌｅ Ａｓ
ｎ Ａｓｎ ｌｙｓ １−ｅｕ （３１ｕ
ｐｈｅ ＱｌｕＳｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｈ
ｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｙｒ ｌｌ
ｅ Ｓｅｒ ＴｈｒＳｅｒ Ｇｌｎ Ａｌａ
Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｖａｔ
Ｐｈｅ Ｌｅｕ ＧｌｙＧｌｙ Ｔｈｒ Ｌ
ｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｉ
ｌｅ Ｔｈｒ Ａｓｐ ＰｈｅＴｈｒ Ｍｅｔ
Ｑｌｎ ｐｈｅ ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
本発明ＧＩＦは、後記するように哺乳動物の免疫担当細
胞から単離することができ、この天然型ＧＩＦの遺伝子
解析により、その前駆体の存在が明らかにされており、
上記式（１）で表わされるポリペプチドＡ及びポリペプ
チド■〜■のアミノ酸配列は、この解析結果から誘導さ
れたものである。
ＬＶＳ Ａｒｑ Ｐｈｅ Ｖａｌ ｐｈｅ
ＡｓｎＬＪＳ ｌｌｅ Ｑｌｕ ｌｅ Ａｓ
ｎ Ａｓｎ ｌｙｓ １−ｅｕ （３１ｕ
ｐｈｅ ＱｌｕＳｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｈ
ｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｙｒ ｌｌ
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本発明ＧＩＦは、後記するように哺乳動物の免疫担当細
胞から単離することができ、この天然型ＧＩＦの遺伝子
解析により、その前駆体の存在が明らかにされており、
上記式（１）で表わされるポリペプチドＡ及びポリペプ
チド■〜■のアミノ酸配列は、この解析結果から誘導さ
れたものである。
更に本発明ＧＩＦには、ＧＩＦ活性を有するかぎりにお
いて、上記一般式（１）で表わされるポリペプチドＡ及
びポリペプチド■〜ＩＶで表わされるアミノ酸配列のＮ
末端又はＣ末端に１個若しくはそれ以上のアミノ酸を付
加したもの又は上記アミノ酸配列から１個若しくはそれ
以上のアミノ酸を欠失乃至置換した蛋白の一次構造を有
するものも包含される。
いて、上記一般式（１）で表わされるポリペプチドＡ及
びポリペプチド■〜ＩＶで表わされるアミノ酸配列のＮ
末端又はＣ末端に１個若しくはそれ以上のアミノ酸を付
加したもの又は上記アミノ酸配列から１個若しくはそれ
以上のアミノ酸を欠失乃至置換した蛋白の一次構造を有
するものも包含される。
以下、本発明ＧＩＦにつき、これをその製造法より詳述
する。
する。
本発明ＧＩＦは、例えば哺乳動物由来の免疫担当細胞の
培養により誘導産生される。ここで起源細胞として用い
られる免疫担当細胞としては、噛乳動物に由来する限り
特に制限はなく、哺乳動物種としても限定されず、例え
ばヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウサギ、マウス等
のいずれでもよい。代表的な免疫担当細胞としては、例
えばＴ−細胞、Ｂ−細胞、ヌル細胞、ナチュラル キラ
ー細胞等のリンパ球細胞、単核細胞、マクロファージ等
の単核球細胞等及びそれらの細胞系統（ｃｅｌｌｌｉｎ
ｅ）を例示できる。上記リンパ球細胞の例としては、例
えば上記各哺乳動物の牌臓、扁桃腺、肺、血液、リンパ
節等の組織より分離されるリンパ球細胞を例示すること
ができる。２等免疫担当細胞の分離は、常法に従い例え
ば目的とする細胞を含む組織を粉砕し、粗雑物を炉別し
、遠心分離する方法等によることができる。
培養により誘導産生される。ここで起源細胞として用い
られる免疫担当細胞としては、噛乳動物に由来する限り
特に制限はなく、哺乳動物種としても限定されず、例え
ばヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウサギ、マウス等
のいずれでもよい。代表的な免疫担当細胞としては、例
えばＴ−細胞、Ｂ−細胞、ヌル細胞、ナチュラル キラ
ー細胞等のリンパ球細胞、単核細胞、マクロファージ等
の単核球細胞等及びそれらの細胞系統（ｃｅｌｌｌｉｎ
ｅ）を例示できる。上記リンパ球細胞の例としては、例
えば上記各哺乳動物の牌臓、扁桃腺、肺、血液、リンパ
節等の組織より分離されるリンパ球細胞を例示すること
ができる。２等免疫担当細胞の分離は、常法に従い例え
ば目的とする細胞を含む組織を粉砕し、粗雑物を炉別し
、遠心分離する方法等によることができる。
本発明者らの研究によれば、上記起源細胞とする免疫担
当細胞の種類やこれを提供する哺乳動物の種類にかかわ
らず、得られるＧＩＦの有するＧＩＦ活性は種特異性を
有しないことが確認されている。従って本発明ＧＩＦは
その製造に際して起澱細胞に制約を受けず、この点から
も医療分野での利用に好適である。
当細胞の種類やこれを提供する哺乳動物の種類にかかわ
らず、得られるＧＩＦの有するＧＩＦ活性は種特異性を
有しないことが確認されている。従って本発明ＧＩＦは
その製造に際して起澱細胞に制約を受けず、この点から
も医療分野での利用に好適である。
上記各種免疫担当細胞の培養は、この種細胞培養に通常
使用される培地を用いて、好ましくは抗腫瘍物質誘導剤
の存在下に実施され、これにより本発明物質がその培養
上清中に産生される。上記培地としては、例えばＯＥＭ
培地、ＣＭＲＬ−１０６６培地、ＤＭ−１６０培地、イ
ーグルの最小必須培地（Ｅａｇｌｅ ｓ ＭＥＭ）
、オートクレーブ可能ＭＥＭ、フィッシャーの培地（Ｆ
ｉｓｈｅｒ ｓＭｅｄｉｕｍ ） 、Ｆ−１０，Ｆ −
１２培地、シー１５培地、ＮＣＴＣ−１０９培地、ＲＰ
ＭＩ−１６４０培地等を単独で用いるか又は必要に応じ
て２等培地に牛胎児血清（Ｆｅ２）等の血清やアルブミ
ン等の血清成分を添加した培地等を例示できる。免疫担
当細胞の上記培地に対する使用量は、通常ｌＸ１０’〜
ｌＸ１０７個／ｍＱ程度とするのが好ましい。
使用される培地を用いて、好ましくは抗腫瘍物質誘導剤
の存在下に実施され、これにより本発明物質がその培養
上清中に産生される。上記培地としては、例えばＯＥＭ
培地、ＣＭＲＬ−１０６６培地、ＤＭ−１６０培地、イ
ーグルの最小必須培地（Ｅａｇｌｅ ｓ ＭＥＭ）
、オートクレーブ可能ＭＥＭ、フィッシャーの培地（Ｆ
ｉｓｈｅｒ ｓＭｅｄｉｕｍ ） 、Ｆ−１０，Ｆ −
１２培地、シー１５培地、ＮＣＴＣ−１０９培地、ＲＰ
ＭＩ−１６４０培地等を単独で用いるか又は必要に応じ
て２等培地に牛胎児血清（Ｆｅ２）等の血清やアルブミ
ン等の血清成分を添加した培地等を例示できる。免疫担
当細胞の上記培地に対する使用量は、通常ｌＸ１０’〜
ｌＸ１０７個／ｍＱ程度とするのが好ましい。
この細胞浮遊液に添加存在させることができる抗腫瘍物
質誘導剤としては、通常のもの、例えば１２−Ｏ−テト
ラデカノイルフォルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ
）、フイトヘモアグルチニン（ＰＨＡ） 、ｍｌンカナ
バリンＡ（ＣｏｎΔ）、細菌リポポリサッカライド（Ｌ
ＰＳ） 、ポラクライードマイト−ジエン（ＰＷＭ）、
プロティンＡ（ＰｒｏＡ）等を例示できる。その使用量
は、通常０．０００１〜０．１％（Ｗ／Ｖ％、以下同じ
）、好ましくは０．００１％前後の濃度とするのがよい
。培養は、通常の方法、例えば炭酸ガス培養法により実
施でき、３０〜４０℃程度、好ましくは３７℃程度で、
１〜５日間を要して行なわれる。
質誘導剤としては、通常のもの、例えば１２−Ｏ−テト
ラデカノイルフォルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ
）、フイトヘモアグルチニン（ＰＨＡ） 、ｍｌンカナ
バリンＡ（ＣｏｎΔ）、細菌リポポリサッカライド（Ｌ
ＰＳ） 、ポラクライードマイト−ジエン（ＰＷＭ）、
プロティンＡ（ＰｒｏＡ）等を例示できる。その使用量
は、通常０．０００１〜０．１％（Ｗ／Ｖ％、以下同じ
）、好ましくは０．００１％前後の濃度とするのがよい
。培養は、通常の方法、例えば炭酸ガス培養法により実
施でき、３０〜４０℃程度、好ましくは３７℃程度で、
１〜５日間を要して行なわれる。
培養終了後、培養上清は、常法に従い遠心分離等の分離
手段により分離される。
手段により分離される。
上記方法により得られる培養上清からの本発明ＧＩＦの
分離は、基本的には、この種バイオロジカル物質からの
蛋白様物質の分離に利用される通常の方法と同様にして
、例えば目的とするＧＩＦの物理的、化学的性質等を利
用した各種の処理操作に従い実施できる。〔例えば「生
化学データーブックＩｒＪｌｌＩ）１１７５〜１２５９
、第１版第１刷、１９８０年６月２３日、株式会社東京
化学同人発行参照〕。該方法としては、具体的には例え
ば通常の蛋白沈澱剤による処理、限外濾過、分子ふるい
クロマトグラフィー（ゲルか過）、液体クロマトグラフ
ィー、遠心分離、電気泳動、アフィニティークロマトグ
ラフィー、透析法、之等の組合せ等を採用できる。
分離は、基本的には、この種バイオロジカル物質からの
蛋白様物質の分離に利用される通常の方法と同様にして
、例えば目的とするＧＩＦの物理的、化学的性質等を利
用した各種の処理操作に従い実施できる。〔例えば「生
化学データーブックＩｒＪｌｌＩ）１１７５〜１２５９
、第１版第１刷、１９８０年６月２３日、株式会社東京
化学同人発行参照〕。該方法としては、具体的には例え
ば通常の蛋白沈澱剤による処理、限外濾過、分子ふるい
クロマトグラフィー（ゲルか過）、液体クロマトグラフ
ィー、遠心分離、電気泳動、アフィニティークロマトグ
ラフィー、透析法、之等の組合せ等を採用できる。
特に好ましい分離方法においては、まず培養上清より予
め目的とするＧＩＦを部分精製する。この部分精製は、
例えば、アセトン、メタノール、エタノール、プロパツ
ール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の有機溶媒や
酢酸、過塩素酸（ＰＣＡ）、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ＞
等の酸を蛋白沈澱剤として用いる処理、硫酸アンモニウ
ム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等の塩析剤を用
いる処理及び／又は透析膜、平板膜、中空繊維膜等を用
いる限外濾過処理等により行なわれる。
め目的とするＧＩＦを部分精製する。この部分精製は、
例えば、アセトン、メタノール、エタノール、プロパツ
ール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の有機溶媒や
酢酸、過塩素酸（ＰＣＡ）、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ＞
等の酸を蛋白沈澱剤として用いる処理、硫酸アンモニウ
ム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等の塩析剤を用
いる処理及び／又は透析膜、平板膜、中空繊維膜等を用
いる限外濾過処理等により行なわれる。
之等の各処理の操作及び条件は、通常のこの種方法のそ
れらと同様のものとすればよい。
れらと同様のものとすればよい。
次いで上記で得られた粗精製物を、グルか過に付すこと
により目的物質の活性が認められる両分を収得する。こ
こで用いられるゲル濾過剤としては、特に限定はなく、
例えばデキストランゲル、ポリアクリルアミドゲル、ア
ガロースゲル、ポリアクリルアミド−アガロースゲル、
セルロース等を素材とするものをいずれも利用できる。
により目的物質の活性が認められる両分を収得する。こ
こで用いられるゲル濾過剤としては、特に限定はなく、
例えばデキストランゲル、ポリアクリルアミドゲル、ア
ガロースゲル、ポリアクリルアミド−アガロースゲル、
セルロース等を素材とするものをいずれも利用できる。
之等の具体例としては、セファデックスＧタイプ、同Ｌ
Ｈタイプ、セファロースタイブ、セファクリルタイプ（
以上、ファルマシア社）、セルロファイン（チッソ■）
、バイオグルＰタイプ、同Ａタイプ（ＬＫＢ社）、ＴＳ
Ｋ−Ｇタイプ（東洋曹達■）等の市販品を例示できる。
Ｈタイプ、セファロースタイブ、セファクリルタイプ（
以上、ファルマシア社）、セルロファイン（チッソ■）
、バイオグルＰタイプ、同Ａタイプ（ＬＫＢ社）、ＴＳ
Ｋ−Ｇタイプ（東洋曹達■）等の市販品を例示できる。
上記ゲル濾過によれば、分子量１万〜２万５千の両分に
本発明物質の活性が認められる。
本発明物質の活性が認められる。
本発明物質は、上記ゲル濾過により得られる両分を、例
えばハイドロキシアパタイトカラムを用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィー、ＤＥＡＥ法等のイオン交換カ
ラムクロマトグラフィー、クロマトフオーカシング法、
逆相高速液体クロマトグラフィー等に付すことにより、
又は之等各操作の組合せにより更に精製することができ
、均質な物質として単離することができる。
えばハイドロキシアパタイトカラムを用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィー、ＤＥＡＥ法等のイオン交換カ
ラムクロマトグラフィー、クロマトフオーカシング法、
逆相高速液体クロマトグラフィー等に付すことにより、
又は之等各操作の組合せにより更に精製することができ
、均質な物質として単離することができる。
上記クロマトフオーカシング法は、公知の各種方法によ
り実施できる。カラムとしては、例えばＰＢＥ９４ （
ファルマシア社製）等を、開始緩衝液としては、例えば
イミダゾール−塩酸等を、また溶出液としては、例えば
ポリバッファー７４（ファルマシア社製）−塩Ｍ（ｐＨ
４，０）等を使用できる。
り実施できる。カラムとしては、例えばＰＢＥ９４ （
ファルマシア社製）等を、開始緩衝液としては、例えば
イミダゾール−塩酸等を、また溶出液としては、例えば
ポリバッファー７４（ファルマシア社製）−塩Ｍ（ｐＨ
４，０）等を使用できる。
また、上記逆相高速液体クロマトグラフィーは、例えば
ＣＡハイボアー逆相ＨＰＬＣカラム（バイオ−ラド社（
Ｂｉｏ−Ｒａｄ １ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ） ）
等を用いて、移動剤としてアセトニトリル、トリフルオ
ロ酸１１ｉ（ＴＦＡ） 、水等及び之等の混合溶媒を用
いて実施できる。
ＣＡハイボアー逆相ＨＰＬＣカラム（バイオ−ラド社（
Ｂｉｏ−Ｒａｄ １ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ） ）
等を用いて、移動剤としてアセトニトリル、トリフルオ
ロ酸１１ｉ（ＴＦＡ） 、水等及び之等の混合溶媒を用
いて実施できる。
かくして得られるＧＩＦは、前記ポリペプチド■をその
構成蛋白とする天然型ＧＩＦ（即ち成熟ＧＩＦ）である
。
構成蛋白とする天然型ＧＩＦ（即ち成熟ＧＩＦ）である
。
また、本発明ＧＴＦは遺伝子工学的手法によって、即ち
ＧＩＦをコードする遺伝子を利用し、これを微生物のベ
クターに組込んで該微生物細胞内で複製、転写、翻訳さ
せることによって、製造することができる。この方法は
、特に大量生産が可能である点より有利である。
ＧＩＦをコードする遺伝子を利用し、これを微生物のベ
クターに組込んで該微生物細胞内で複製、転写、翻訳さ
せることによって、製造することができる。この方法は
、特に大量生産が可能である点より有利である。
上記遺伝子工学的手法によるＧＩＦの製造において、用
いられる遺伝子は、ＧＩＦをコードすることにより特徴
付けられる。本発明は、かかる新規な遺伝子をも提供す
るものである。
いられる遺伝子は、ＧＩＦをコードすることにより特徴
付けられる。本発明は、かかる新規な遺伝子をも提供す
るものである。
上記遺伝子の代表例は、前記ポリペプチドＡ、殊にポリ
ペプチド■をコードするものであるが、特にこれに限定
されず、本発明のＧＩＦをコードしており且つその利用
によりＧＩＦが発現、製造される限りいかなるものでも
よく、また各種公知の遺伝暗号（ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏ
ｄｅ）が採用されていてもよい。
ペプチド■をコードするものであるが、特にこれに限定
されず、本発明のＧＩＦをコードしており且つその利用
によりＧＩＦが発現、製造される限りいかなるものでも
よく、また各種公知の遺伝暗号（ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏ
ｄｅ）が採用されていてもよい。
上記遺伝子には、例えばそのＤＮＡ鎖中に制限酵素Ｍｓ
ｏＩ、ＨｉｎｄＩ及び１）ｖｕｌｉｒ切断さレル個所を
この順序で配置された部分を含むことで特徴付けられる
ヒトリンパ球由来細胞より分離されるメツセンジャーＲ
ＮＡ （以下ｒｍＲＮＡＪという）より調製されたもの
が含まれる。これはより具体的には、前記ポリペプチド
エ〜■に対応する以下の塩基配列工、■、■及びＩＶと
して特定される塩基配列を有する遺伝子である。
ｏＩ、ＨｉｎｄＩ及び１）ｖｕｌｉｒ切断さレル個所を
この順序で配置された部分を含むことで特徴付けられる
ヒトリンパ球由来細胞より分離されるメツセンジャーＲ
ＮＡ （以下ｒｍＲＮＡＪという）より調製されたもの
が含まれる。これはより具体的には、前記ポリペプチド
エ〜■に対応する以下の塩基配列工、■、■及びＩＶと
して特定される塩基配列を有する遺伝子である。
（塩基配列■）
ＧＣＡ ＣＣＴ ＧＴＡ ＣＧＡ ＴＣＡ
ＣＴＧ ＡＡＣＴＧＣＡＣＧ ＣＴＣＣＧＧ Ｇ
ＡＣＴＣＡ ＣＡＧ ＣＡＡ ＡＡＡＡＧＣＴＴ
Ｇ ＧＴＧ ＡＴＧ ＴＣＴ ＧＧＴ ＣＣ
Ａ ＴＡＴＧＡＡ ＣＴＧ ＡＡＡ ＧＣＴ
ＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＧＧＡ ＣＡＧ ＧＡ
Ｔ ＡＴＧ ＧＡＧ ＣＡＡ ＣＡＡ ＧＴ
ＧＧＴＧ ＴＴＣＴＣＣＡＴＧ ＴＣＣＴＴＴ
ＧＴＡ ＣＡＡＧＧＡ ＧＡＡ ＧＡＡ ＡＧ
Ｔ ＡＡＴ ＧＡＣＡＡＡ ＡＴＡＣＣＴ Ｇ
ＴＧ ＧＣＣＴＴＧ ＧＧＣＣＴＣＡＡＧ ＧＡ
ＡＡＡＧ ＡＡＴ ＣＴＧ ＴＡＣＣＴＧ Ｔ
ＣＣＴＧＣＧＴＧＴＴＧ ＡＡＡ ＧＡＴ ＧＡ
Ｔ ＡＡＧ ＣＣＣＡＣＴ ＣＴＡＣＡＧ Ｃ
ＴＧ ＧＡＧ ＡＧＴ ＧＴＡ ＧＡＴ Ｃ
ＣＣＡＡＡＡＡＴ ＴＡＣＣＣＡ ＡＡＧ ＡＡ
Ｇ ＡＡＧ ＡＴＧ ＧＡＡＡＡＧ ＣＧＡ
丁ＴＴ ＧＴＣＴＴＣＡＡＣＡＡＧ ＡＴＡＧＡ
Ａ ＡＴＣＡＡＴ ＡＡＣＡＡＧ ＣＴＧ Ｇ
ＡＡ ＴＴＴＧＡＧ ＴＣＴ ＧＣＣＣＡＧ
ＴＴＣＣＣＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＴ
ＣＴ ＣＡＡ ＧＣＡ ＧＡＡＡＡＣＡＴＧ
ＣＣＣＧＴＣＴＴＣＣＴＧ ＧＧＡ ＧＧＧＡＣＣ
ＡＡＡ ＧＧＣＧＧＣＣＡＧ ＧＡＴ ＡＴＡ
ＡＣＴＧＡＣＴＴＣＡＣＣＡＴＧ ＣＡＡ ＴＴ
Ｔ ＧＴＧ ＴＣＴＣＣ 〔塩基配列旧 ＡＴＧ ＣＴＧ ＧＴＴ ＣＣＣＴＧＣＣＣＡ
ＣＡＧ ＡＣＣＴＴＣＣＡＧ ＧＡＧ ＡＡＴ
ＧＡＣＣＴＧ ＡＧＣＡＣＣＴＴＣＴＴＴ Ｃ
ＣＣＴＴＣＡＴＣＴＴＴ ＧＡＡ ＧＡＡＧＡＡ
ＣＣＴ ＡＴＣＴＴＣＴＴＣＧＡＣＡＣＡ ＴＧ
ＧＧＡＴ ＡＡＣＧＡＧ ＧＣＴ ＴＡＴ Ｇ
ＴＧ ＣＡＣＧＡＴＧＣＡ ＣＣＴ ＧＴＡ
ＣＧＡ ＴＣＡ ＣＴＧ ＡＡＣＴＧＣＡＣＧ
ＣＴＣＣＧＧ ＧＡＣＴＣＡ ＣＡＧ ＣＡＡ
ＡＡＡＡＧＣＴＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＴＣ
Ｔ ＧＧＴ ＣＣＡ ＴＡＴＧＡＡ ＣＴＧ
ＡＡＡ ＧＣＴ ＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＧＧ
Ａ ＣＡＧ ＧＡＴ ＡＴＧ ＧＡＧ ＣＡ
Ａ ＣＡＡ ＧＴＧＧＴＧ ＴＴＣＴＣＣＡＴＧ
ＴＣＣＴＴＴ ＧＴＡ ＣＡＡＧＧＡ ＧＡ
Ａ ＧＡＡ ＡＧＴ ＡＡＴ ＧＡＣＡＡＡ
ＡＴＡＣＣＴ ＧＴＧ ＧＣＣＴＴＧ ＧＧＣ
ＣＴＣＡＡＧ ＧＡＡＡＡＧ ＡＡＴ ＣＴＧ
ＴＡＣＣＴＧ ＴＣＣＴＧＣＧＴＧＴＴＧ ＡＡＡ
ＧＡＴ ＧＡＴ ＡＡＧ ＣＣＣＡＣＴ Ｃ
ＴＡＣＡＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＡＧＴ ＧＴＡ
ＧＡＴ ＣＣＣＡＡＡＡＡＴ ＴＡＣＣＣＡ
ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＴＧ ＧＡＡＡＡＧ
ＣＧＡ ＴＴＴ ＧＴＣＴＴＣＡＡＣＡＡＧ
ＡＴＡＧＡＡ ＡＴＣＡＡＴ ＡＡＣＡＡＧ Ｃ
ＴＧ ＧＡＡ ＴＴＴＧＡＧ ＴＣＴ ＧＣＣＣ
ＡＧ ＴＴＣＣＣＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＡＴＣＡＧＣ
ＡＣＣＴＣＴ ＣＡＡ ＧＣＡ ＧＡＡＡＡＣＡ
ＴＧ ＣＣＣＧＴＣＴＴＣＣＴＧ ＧＧＡ ＧＧ
ＧＡＣＣ： ＡＡＡ ＧＧＣＧＧＣＣＡＧ ＧＡ
Ｔ ＡＴＡ ＡＣＴＧＡＣＴＴＣＡＣＣＡＴＧ
ＣＡＡ ＴＴＴ ＧＴＧ ＴＣＴＣＣ 〔塩基配列■〕 ＡＴＧ ＧＡＣＡＡＧ ＣＴＧ ＡＧＧ ＡＡ
Ｇ ＡＴＧ ＣＴＧＧＴＴ ＣＣＣＴＧＣＣＣＡ
ＣＡＧ ＡＣＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧ ＡＡＴ
ＧＡＣＣＴＧ ＡＧＣＡＣＣＴＴＣＴＴＴＣＣＣＴ
ＴＣＡＴＣＴＴＴ ＧＡＡ ＧＡＡ ＧＡＡ
ＣＣＴＡＴＣＴＴＣＴＴＣＧＡＣＡＣＡ ＴＧＧ
ＧＡＴ ＡＡＣＧＡＧ ＧＣＴ ＴＡＴ ＧＴ
Ｇ ＣＡＣＧＡＴ ＧＣＡ ＣＣＴＧＴＡ Ｃ
ＧＡ ＴＣＡ ＣＴＧ ＡＡＣＴＧＣＡＣＧ
ＣＴＣＣＧＧ ＧＡＣＴＣＡ ＣＡＧ ＣＡＡ
ＡＡＡ ＡＧＣＴＴＧＧＴＧ ＡＴＧ ＴＣＴ
ＧＧＴ ＣＣＡ ＴＡＴ ＧＡＡ ＣＴＧ
ＡＡＡ ＧＣＴ ＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧ Ｇ
ＧＡ ＣＡＧＧＡＴ ＡＴＧ ＧＡＧ ＣＡＡ
ＣＡＡ ＧＴＧ ＧＴＧ 王ＴＣＴＣＣＡＴ
Ｇ ＴＣＣＴＴＴ ＧＴＡ ＣＡＡ ＧＧＡ
ＧＡＡＧＡＡ ＡＧＴ ＡＡＴ ＧＡＣＡＡＡ
ＡＴＡ ＣＣＴ ＧＴＧＧＣＣＴＴＧ ＧＧ
ＣＣＴＣＡＡＧ ＧＡＡ ＡＡＧ ＡＡＴＣＴＧ
ＴＡＣＣＴＧ ＴＣＣＴＧＣＧＴＧ ＴＴＧ
ＡＡＡＧＡＴ ＧＡＴ ＡＡＧ ＣＣＣＡＣＴ
ＣＴＡ ＣＡＧ ＣＴＧＧＡＧ ＡＧＴ
ＧＴＡ ＧＡＴ ＣＣＣＡＡＡ ＡＡＴ ＴＡ
ＣＣＣＡ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＴＧ
ＧＡＡ ＡＡＧ ＣＧＡＴＴＴ ＧＴＣＴＴＣ
ＡＡＣＡＡＧ ＡＴＡ ＧＡＡ ＡＴＣＡＡＴ
ＡＡＣＡＡＧ ＣＴＧ ＧＡＡ ＴＴＴ Ｇ
ＡＧ ＴＣＴＧＣＣＣＡＧ ＴＴＣＣＣＣＡＡＣＴ
ＧＧ ＴＡＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＴＣＴ ＣＡＡ
ＧＣＡ ＧＡＡ ＡＡＣＡＴＧＣＣＣＧＴＣＴＴ
ＣＣＴＧ ＧＧＡ ＧＧＧ ＡＣＣＡＡＡＧＧＣ
ＧＧＣＣＡＧ ＧＡＴ ＡＴＡ ＡＣＴ ＧＡ
ＣＴＴＣＡＣＣＡＴＧ ＣＡＡ Ｔ、ＴＴ ＧＴ
Ｇ ＴＣＴ ＴＣＣ〔塩基配列ＩＶ） ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＧＣＴＣＣＴＴＣＣＡＧ Ｇ
ＡＣＣＴＧＧＡＣＣＴＣＴＧＣＣＣＴ ＣＴＧ Ｇ
ＡＴ ＧＧＣＧＧＣＡＴＣＣＡＧ ＣＴＡ ＣＧ
Ａ ＡＴＣＴＣＣＧＡＣＣＡＣＣＡＣＴＡＣＡＧＣＡ
ＡＣＧＧＣＴＴＣＡＧＧ ＣＡＧＧＣＣＧＣＧ Ｔ
ＣＡ ＧＴＴ ＧＴＴ ＧＴＧ ＧＣＣＡＴＧ
ＧＡＣＡＡＧ ＣＴＧ ＡＧＧ ＡＡＧ ＡＴ
Ｇ ＣＴＧ ＧＴＴＣＣＣＴＧＣＣＣＡ ＣＡＧ
ＡＣＣＴＴＣＣＡＧ ＧＡＧＡＡＴ ＧＡＣＣ
ＴＧ ＡＧＣＡＣＣＴＴＣＴＴＴ ＣＣＣＴＴＣＡ
ＴＣＴＴＴ ＧＡＡ ＧＡＡ ＧＡＡ ＣＣＴ
ＡＴＣＴＴＣＴＴＣＣＡＣＡＣＡ ＴＧＧ Ｇ
ＡＴ ＡＡＣＧＡＧＧＣＴ ＴＡＴ ＧＴＧ
ＣＡＣＧＡＴ ＧＣＡ ＣＣＴ ＧＴＡＣＧＡ
ＴＣＡ ＣＴＧ ＡＡＣＴＧＣＡＣＧ ＣＴＣ
ＣＧＧＧＡＣＴＣＡ ＣＡＧ ＣＡＡ ＡＡＡ
ＡＧＣＴＴＧ ＧＴＧＡＴＧ ＴＣＴ ＧＧＴ
ＣＣＡ ＴＡＴ ＧＡＡ ＣＴＧ ＡＡＡ
ＧＣＴ ＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧ ＧＧＡ Ｃ
ＡＧ ＧＡＴＡＴＧ ＧＡＧ ＣＡＡ ＣＡＡ
ＧＴＧ ＧＴＧ ＴＴＣ４ＣＣＡＴＧ ＴＣ
ＣＴＴＴ ＧＴＡ ＣＡＡ ＧＧＡ ＧＡＡ
ＧＡＡＡＧＴ ＡＡＴ ＧＡＣＡＡＡ ＡＴＡ
ＣＣＴ ＧＴＧ ＧＣＣＴＴＧ ＧＧＣＣＴＣ
ＡＡＧ ＧＡＡ ＡＡＧ ＡＡＴ ＣＴＧＴＡ
ＣＣＴＧ ＴＣＣＴＧＣＧＴＧ ＴＴＧ ＡＡＡ
ＧＡＴＧＡＴ ＡＡＧ ＣＣＣＡＣＴ ＣＴ
Ａ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＡＧＡＧＴ ＧＴＡ
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ＣＡＣＣＡ丁Ｇ ＣＡＡ ＴＴＴ ＧＴＧ Ｔ
ＣＴ ＴＣＣ本発明方法において用いられる上記遺伝
子の製造方法は、特に制限はなく、以下に示す各種の方
法に従うことができる。即ち、該方法としては例えばＧ
ＩＦ生産能を有するリンパ球由来細胞より得られるｍ
ＲＮＡより調製されたｃ ＤＮＡを、エシェリヒア・コ
リー（Ｅ ５ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のプラスミ
ド ベクター等の適当なベクターに接続して、微生物細
胞内で増幅させ、ＧＩＦを発現し得るクローンを単離し
、この単離されたクローンが有するプラスミド中に挿入
されているＤＮＡを分離する方法、本明細書に開示した
ＧＩＦ及びその遺伝情報に基づいて、例えばホスホアイ
ト トリエステル法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ ）
、 ３１０゜１０５ （１９８４））等の常法に従って
、核酸の化学合成を行なう方法、或いは上記各方法を併
用する方法等を例示できる。
ＣＴＧ ＡＡＣＴＧＣＡＣＧ ＣＴＣＣＧＧ Ｇ
ＡＣＴＣＡ ＣＡＧ ＣＡＡ ＡＡＡＡＧＣＴＴ
Ｇ ＧＴＧ ＡＴＧ ＴＣＴ ＧＧＴ ＣＣ
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ＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＧＧＡ ＣＡＧ ＧＡ
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Ｔ ＡＡＴ ＧＡＣＡＡＡ ＡＴＡＣＣＴ Ｇ
ＴＧ ＧＣＣＴＴＧ ＧＧＣＣＴＣＡＡＧ ＧＡ
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ＣＣＴＧＣＧＴＧＴＴＧ ＡＡＡ ＧＡＴ ＧＡ
Ｔ ＡＡＧ ＣＣＣＡＣＴ ＣＴＡＣＡＧ Ｃ
ＴＧ ＧＡＧ ＡＧＴ ＧＴＡ ＧＡＴ Ｃ
ＣＣＡＡＡＡＡＴ ＴＡＣＣＣＡ ＡＡＧ ＡＡ
Ｇ ＡＡＧ ＡＴＧ ＧＡＡＡＡＧ ＣＧＡ
丁ＴＴ ＧＴＣＴＴＣＡＡＣＡＡＧ ＡＴＡＧＡ
Ａ ＡＴＣＡＡＴ ＡＡＣＡＡＧ ＣＴＧ Ｇ
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Ｔ ＧＴＧ ＴＣＴＣＣ 〔塩基配列旧 ＡＴＧ ＣＴＧ ＧＴＴ ＣＣＣＴＧＣＣＣＡ
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ＧＡＣＣＴＧ ＡＧＣＡＣＣＴＴＣＴＴＴ Ｃ
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Ｇ ＡＴＧ ＣＴＧＧＴＴ ＣＣＣＴＧＣＣＣＡ
ＣＡＧ ＡＣＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧ ＡＡＴ
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ＣＡＣＣＡ丁Ｇ ＣＡＡ ＴＴＴ ＧＴＧ Ｔ
ＣＴ ＴＣＣ本発明方法において用いられる上記遺伝
子の製造方法は、特に制限はなく、以下に示す各種の方
法に従うことができる。即ち、該方法としては例えばＧ
ＩＦ生産能を有するリンパ球由来細胞より得られるｍ
ＲＮＡより調製されたｃ ＤＮＡを、エシェリヒア・コ
リー（Ｅ ５ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のプラスミ
ド ベクター等の適当なベクターに接続して、微生物細
胞内で増幅させ、ＧＩＦを発現し得るクローンを単離し
、この単離されたクローンが有するプラスミド中に挿入
されているＤＮＡを分離する方法、本明細書に開示した
ＧＩＦ及びその遺伝情報に基づいて、例えばホスホアイ
ト トリエステル法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ ）
、 ３１０゜１０５ （１９８４））等の常法に従って
、核酸の化学合成を行なう方法、或いは上記各方法を併
用する方法等を例示できる。
尚、上記において遺伝暗号の選択は任意でよく、例えば
利用する宿主のコドン使用頻度等を考慮した常法に従え
ばよい。またそれら遺伝子がコードするＧＩＦの一部の
アミノ酸の置換や配列の改変等には、例えばサイト−ス
ペシフィック ミュータジエネシス（Ｓ ｉｔｅ −３
ｐｅｃｉｆｉｃ Ｍ ｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｐ ｒ
ｏｃ、ＮａｔｌＪｃａｄ、３ｃｉ、、８１ 、５６６２
−５６６６ （１９８４））等の方法を採用するのが簡
便である。
利用する宿主のコドン使用頻度等を考慮した常法に従え
ばよい。またそれら遺伝子がコードするＧＩＦの一部の
アミノ酸の置換や配列の改変等には、例えばサイト−ス
ペシフィック ミュータジエネシス（Ｓ ｉｔｅ −３
ｐｅｃｉｆｉｃ Ｍ ｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｐ ｒ
ｏｃ、ＮａｔｌＪｃａｄ、３ｃｉ、、８１ 、５６６２
−５６６６ （１９８４））等の方法を採用するのが簡
便である。
本発明に利用する遺伝子の製造法において、上記ｍ Ｒ
ＮＡを経る方法につき、より詳細に説明すれば次の通り
である。
ＮＡを経る方法につき、より詳細に説明すれば次の通り
である。
上記遺伝子の入手のための起源細胞としては、ＧＩＦ生
産能を有する哺乳動物由来の免疫担当細胞（ＧＩＦ産生
細胞）を好適に利用できる。該ＧＩＦ産生細胞の具体例
は、前記した通りである。
産能を有する哺乳動物由来の免疫担当細胞（ＧＩＦ産生
細胞）を好適に利用できる。該ＧＩＦ産生細胞の具体例
は、前記した通りである。
ＧＩＦをコードするｍ ＲＮＡを含むＲＮＡは、上記Ｇ
ＩＦ産生細胞から常法に従い抽出される。
ＩＦ産生細胞から常法に従い抽出される。
該抽出に先だって、ＧＩＦ産生細胞は、一般にＧＩＦ産
生条件下におかれる。これは、該細胞をこの種細胞培養
に通常使用される培地を用いて、好ましくは抗腫瘍物質
−誘導剤の存在下に、培養することにより行なわれる。
生条件下におかれる。これは、該細胞をこの種細胞培養
に通常使用される培地を用いて、好ましくは抗腫瘍物質
−誘導剤の存在下に、培養することにより行なわれる。
上記培地、ＧＩＦ産生細胞の上記培地に対する使用量、
抗腫瘍物質誘導剤、その使用量、培養方法等は前記した
それらと同様とすることができる。ＲＮＡの抽出は、Ｇ
ＩＦ活性が培養上清中に出現する頃の細胞について行な
うのがよい。
抗腫瘍物質誘導剤、その使用量、培養方法等は前記した
それらと同様とすることができる。ＲＮＡの抽出は、Ｇ
ＩＦ活性が培養上清中に出現する頃の細胞について行な
うのがよい。
上記ＲＮＡの抽出は、適当な界面活性剤、例えばＳＯ８
，ＮＰ−４０，トリトンＸ１００．デオキシコール酸等
を用いて、或いはホモジナイザーを用いる方法や凍結融
解等の物理的方法によって、細胞を部分的又は完全に破
壊、可溶化した後、染色体ＤＮＡを、ポリトロン（Ｐ
ｏｌｙｔｏｒｏｎ ｍｏｄｅｌＣＨ−６０１０、キネ
マチイカ（Ｋ ｉｎｅｍａｔｉｃａ ） 。
，ＮＰ−４０，トリトンＸ１００．デオキシコール酸等
を用いて、或いはホモジナイザーを用いる方法や凍結融
解等の物理的方法によって、細胞を部分的又は完全に破
壊、可溶化した後、染色体ＤＮＡを、ポリトロン（Ｐ
ｏｌｙｔｏｒｏｎ ｍｏｄｅｌＣＨ−６０１０、キネ
マチイカ（Ｋ ｉｎｅｍａｔｉｃａ ） 。
スイス社製〕等のミキサーもしくは注射筒を用い、ある
程度せん断し、その後、蛋白質と核酸分画とを分別する
操作により行なわれる。この操作には、−３０＝ 特にフェノール・クロロホルム抽出もしくは超遠心を用
いるＣｓ Ｃ９重層法〔グリシンら（Ｇ ｌ１ｓｉｎ、
ｅｔ ａｔ） 、バイオケミストリー（Ｂ ｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ ） 、ユ≦３．２６３３ （１９７４
）及びチルブラインら（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ 、 Ｊ、
Ｍ、、ｅｔａｌ、）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ ） 。
程度せん断し、その後、蛋白質と核酸分画とを分別する
操作により行なわれる。この操作には、−３０＝ 特にフェノール・クロロホルム抽出もしくは超遠心を用
いるＣｓ Ｃ９重層法〔グリシンら（Ｇ ｌ１ｓｉｎ、
ｅｔ ａｔ） 、バイオケミストリー（Ｂ ｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ ） 、ユ≦３．２６３３ （１９７４
）及びチルブラインら（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ 、 Ｊ、
Ｍ、、ｅｔａｌ、）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ ） 。
１影、５２９４ （１９７９））等が一般に用いられる
。
。
また上記各方法においては、ＲＮ ａｓｅによるＲＮＡ
の分解を防ぐために、ＲＮ ａｓｅインヒビター、例え
ばヘパリン、ポリビニル硫酸、ジエチルピロカーボネー
ト、バナジルリボヌクレオシド複合体、ベントナイト、
マカロイド等を添加しておくのがよい。
の分解を防ぐために、ＲＮ ａｓｅインヒビター、例え
ばヘパリン、ポリビニル硫酸、ジエチルピロカーボネー
ト、バナジルリボヌクレオシド複合体、ベントナイト、
マカロイド等を添加しておくのがよい。
上記抽出操作に従い得られるＲＮＡからのｍＲＮへの分
離精製は、抽出物を例えばオリゴｄＴ−セルロース（Ｃ
ｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ［ｎｃ
、）、ポリＵ−セファロース（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ社
）、セファロース２Ｂ（ファルマシア社）等の吸着カラ
ムを用いる方法により又はバッチ法により実施できる。
離精製は、抽出物を例えばオリゴｄＴ−セルロース（Ｃ
ｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ［ｎｃ
、）、ポリＵ−セファロース（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ社
）、セファロース２Ｂ（ファルマシア社）等の吸着カラ
ムを用いる方法により又はバッチ法により実施できる。
かくして得られるｍ ＲＮＡからの、ＧＩＦに対応する
目的のｍ ＲＮＡの精製濃縮及び同定は、次の如くして
行ない得る。即ち、例えばＧＩＦに対する抗体を用いて
ポリゾームからｍ ＲＮＡを沈澱させる方法により実施
できる。また、蔗糖密度勾配遠心等によって分画し、そ
の分画につき、蛋白質の翻訳系、例えばアフリカッメガ
エルの卵母細胞への注入やウサギ網状赤血球ライゼート
又は小麦胚芽等の無細胞系で蛋白質に翻訳させ、その蛋
白質のＧＩＦ活性を調べることにより、目的とするｍ
ＲＮＡの存在を確認する方法によっても行なうことがで
きる。更に目的ｍ ＲＮＡの確認は、上記ＧＩＦ活性測
定に代えて、ＧＩＦに対する抗体を用いる免疫法によっ
ても行ない得る。
目的のｍ ＲＮＡの精製濃縮及び同定は、次の如くして
行ない得る。即ち、例えばＧＩＦに対する抗体を用いて
ポリゾームからｍ ＲＮＡを沈澱させる方法により実施
できる。また、蔗糖密度勾配遠心等によって分画し、そ
の分画につき、蛋白質の翻訳系、例えばアフリカッメガ
エルの卵母細胞への注入やウサギ網状赤血球ライゼート
又は小麦胚芽等の無細胞系で蛋白質に翻訳させ、その蛋
白質のＧＩＦ活性を調べることにより、目的とするｍ
ＲＮＡの存在を確認する方法によっても行なうことがで
きる。更に目的ｍ ＲＮＡの確認は、上記ＧＩＦ活性測
定に代えて、ＧＩＦに対する抗体を用いる免疫法によっ
ても行ない得る。
上記により得られる精製ｍ ＲＮＡは、通常不安定であ
り、安定な相補ＤＮＡ （ｃ ＤＮＡ）の型に代えられ
、目的遺伝子の増幅を可能とするために微生物由来のレ
プリコンに接続される。インビトロでの、上記ｍ ＲＮ
Ａのｃ ＤＮＡへの変換、即ちＣＤＮＡの合成は、一般
に次のようにして行なうことができる。
り、安定な相補ＤＮＡ （ｃ ＤＮＡ）の型に代えられ
、目的遺伝子の増幅を可能とするために微生物由来のレ
プリコンに接続される。インビトロでの、上記ｍ ＲＮ
Ａのｃ ＤＮＡへの変換、即ちＣＤＮＡの合成は、一般
に次のようにして行なうことができる。
即ち、まずオリゴｄＴをプライマーとしくこのプライマ
ーは遊離のオリゴｄＴもしくは既にベクタープライマー
に付加されたオリゴｄＴのいずれでもよい）、ｍＲＮＡ
を鋳型としてｄ ＮＴＰ（ｄ ＡＴＰ、ｄ ＧＴＰ、ｄ
ＣＴＰ又はｄ ＴＴＰ）の存在下で、逆転写酵素を用
いてｍ ＲＮＡに相補的な一本鎖ｃ ＤＮＡを合成する
。次のステップは、上記において遊離のオリゴｄＴを用
いたか、ベクタープライマに付加されたオリゴｄＴを用
いたかにより、各々以下の如く異なる。
ーは遊離のオリゴｄＴもしくは既にベクタープライマー
に付加されたオリゴｄＴのいずれでもよい）、ｍＲＮＡ
を鋳型としてｄ ＮＴＰ（ｄ ＡＴＰ、ｄ ＧＴＰ、ｄ
ＣＴＰ又はｄ ＴＴＰ）の存在下で、逆転写酵素を用
いてｍ ＲＮＡに相補的な一本鎖ｃ ＤＮＡを合成する
。次のステップは、上記において遊離のオリゴｄＴを用
いたか、ベクタープライマに付加されたオリゴｄＴを用
いたかにより、各々以下の如く異なる。
前者の場合、鋳型としたｍ ＲＮＡをアルカリ処理等に
より分解して除去し、その後−重鎖ＤＮＡを鋳型として
逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖ＤＮ
Ａを作成する。次に得られる二本鎖ＤＮＡの両端をエキ
ソヌクレアーゼで処理し、そのそれぞれに適当なリンカ
−ＤＮＡ又はアニーリング可能な組合せの塩基を複数付
加し、これを適当なベクター、例えばＥＫ系プラスミド
ベクター（ストリンジェント型若しくはリラックス型の
いずれでもよい）やλｇｔ系ファージベクターに組込む
。
より分解して除去し、その後−重鎖ＤＮＡを鋳型として
逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖ＤＮ
Ａを作成する。次に得られる二本鎖ＤＮＡの両端をエキ
ソヌクレアーゼで処理し、そのそれぞれに適当なリンカ
−ＤＮＡ又はアニーリング可能な組合せの塩基を複数付
加し、これを適当なベクター、例えばＥＫ系プラスミド
ベクター（ストリンジェント型若しくはリラックス型の
いずれでもよい）やλｇｔ系ファージベクターに組込む
。
また、接当の場合、鋳型としたｍＲＮＡを残存させたま
ま、上記と同様のリンカ−を付与した閉環状プラスミド
と、！シカ−ＤＮＡ ｌばしば動物細胞で自立複製でき
る領域とｍ ＲＮＡの転写プロモーター領域を含むＤＮ
Ａ断片が用い得る）とを、アニーリングさせて閉環状と
した後、ｄＴＮＰ存在下で、ＲＮ ａｓｅとＤＮＡポリ
メラーゼとを共存させて、ｍ ＲＮＡをＤＮＡ鎖に置換
し、完全なプラスミドＤＮＡを作成できる。
ま、上記と同様のリンカ−を付与した閉環状プラスミド
と、！シカ−ＤＮＡ ｌばしば動物細胞で自立複製でき
る領域とｍ ＲＮＡの転写プロモーター領域を含むＤＮ
Ａ断片が用い得る）とを、アニーリングさせて閉環状と
した後、ｄＴＮＰ存在下で、ＲＮ ａｓｅとＤＮＡポリ
メラーゼとを共存させて、ｍ ＲＮＡをＤＮＡ鎖に置換
し、完全なプラスミドＤＮＡを作成できる。
上記のごとくして得られるＤＮＡは、ベクターの宿主微
生物に導入され、該微生物を形質転換できる。
生物に導入され、該微生物を形質転換できる。
宿主微生物としては、エシェリヒア コリーが代表的で
あるが、特にこれに限定されず、その他にバチルス・ズ
ブチルス（３ａｃｉｌｌｕｓ ｓｕＭｉｌｉｓ）、サツ
カロミセス・セレビシアエ（Ｓ ａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等も使用することができる
。
あるが、特にこれに限定されず、その他にバチルス・ズ
ブチルス（３ａｃｉｌｌｕｓ ｓｕＭｉｌｉｓ）、サツ
カロミセス・セレビシアエ（Ｓ ａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等も使用することができる
。
ＤＮＡの宿主微生物への導入及びこれによる形質転換の
方法としては、一般に用いられている方法、例えば主と
して対数増殖期にある細胞を集め、ＣａＣＱ２処理して
自然にＤＮＡを取り込みやすい状態にして、プラスミド
を取り込ませる方法等を採用できる。上記方法において
は、通常知られているように形質転換の効率を一層向上
させるためにＭ（ＩｃＧ！２やＲｂ ＣＱを更に共存さ
せることもできる。また、微生物細胞をスノエロブラス
ト又はプロトプラスト化してから形質転換させる方法も
採用することができる。
方法としては、一般に用いられている方法、例えば主と
して対数増殖期にある細胞を集め、ＣａＣＱ２処理して
自然にＤＮＡを取り込みやすい状態にして、プラスミド
を取り込ませる方法等を採用できる。上記方法において
は、通常知られているように形質転換の効率を一層向上
させるためにＭ（ＩｃＧ！２やＲｂ ＣＱを更に共存さ
せることもできる。また、微生物細胞をスノエロブラス
ト又はプロトプラスト化してから形質転換させる方法も
採用することができる。
上記により得られる形質転換株から、目的のＧＩＦのｃ
ＤＮＡを有する株を選出する方法としては、例えば以
下に示す各種方法を採用できる。
ＤＮＡを有する株を選出する方法としては、例えば以
下に示す各種方法を採用できる。
（１）合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリ
ーニング法 目的蛋白質のアミノ酸配列の全部又は一部が解明されて
いる（該配列は、複数個連続した特異的配列であれば、
目的蛋白のどの領域のものでもよい）場合、該アミノ酸
に対応するオリゴヌクレオチドを合成しくこの場合、コ
ドン使用頻度を用いて導いた塩基配列又は考えられる塩
基配列の組合せの複数個のどちらでもよく、また後者の
場合、イノシンを含ませてその種類を減らすこともでき
る）、これをプローブ（３２Ｐ又は３５Ｓでラベルする
）として、形質転換株のＤＮＡを変性固定したニトロセ
ルロースフィルターとハイブリダイゼーションし、得ら
れたポジティブ株を検索して、これを選出する。
ーニング法 目的蛋白質のアミノ酸配列の全部又は一部が解明されて
いる（該配列は、複数個連続した特異的配列であれば、
目的蛋白のどの領域のものでもよい）場合、該アミノ酸
に対応するオリゴヌクレオチドを合成しくこの場合、コ
ドン使用頻度を用いて導いた塩基配列又は考えられる塩
基配列の組合せの複数個のどちらでもよく、また後者の
場合、イノシンを含ませてその種類を減らすこともでき
る）、これをプローブ（３２Ｐ又は３５Ｓでラベルする
）として、形質転換株のＤＮＡを変性固定したニトロセ
ルロースフィルターとハイブリダイゼーションし、得ら
れたポジティブ株を検索して、これを選出する。
（２）動物細胞でＧＩＦを産生させてスクリーニングす
る方法 形質転換株を培養し、遺伝子を増幅させ、その遺伝子を
動物細胞にトランスフェクトしくこの場合、自己複製可
能でｍ ＲＮＡ転写プロモーター領域を含むプラスミド
若しくは動物細胞染色体にインチグレートするようなプ
ラスミドのいずれでもよい）、遺伝子にコードされた蛋
白質を産生させ、その培養上清若しくは細胞抽出物のＧ
ＩＦ活性を測定するか、又はＧＩＦに対する抗体を用い
てＧＩＦを検出するかにより、元の形質転換株より目的
のＧＩＦをコードするＯ ＤＮＡを有する株を選出する
。
る方法 形質転換株を培養し、遺伝子を増幅させ、その遺伝子を
動物細胞にトランスフェクトしくこの場合、自己複製可
能でｍ ＲＮＡ転写プロモーター領域を含むプラスミド
若しくは動物細胞染色体にインチグレートするようなプ
ラスミドのいずれでもよい）、遺伝子にコードされた蛋
白質を産生させ、その培養上清若しくは細胞抽出物のＧ
ＩＦ活性を測定するか、又はＧＩＦに対する抗体を用い
てＧＩＦを検出するかにより、元の形質転換株より目的
のＧＩＦをコードするＯ ＤＮＡを有する株を選出する
。
（３）インダクション特異的な形質転換株を選出する方
法 ＧＩＦは、前記したようにＬＰＳやＴＰＡ等の抗腫瘍物
質誘導剤によって、特異的にその産生が誘発される。
法 ＧＩＦは、前記したようにＬＰＳやＴＰＡ等の抗腫瘍物
質誘導剤によって、特異的にその産生が誘発される。
インダクション特異的な株を選出するには、コロニー
ハイブリダイゼーションのプローブとして、ＧＩＦを誘
導していない産生株（インダクションマイナス）からの
ＩＩＩ ＲＮＡと、上記薬剤を用いてＧＩＦを誘導させ
（インダクションプラス）且つ該ＧＩＦをコードするｍ
ＲＮＡが増幅している＋！ｌ ＲＮＡ （該Ｉｌｌ
ＲＮＡから合成したｃ ＤＮＡでもよい）との両者を用
い、これらをハイブリダイゼーションさせ、その強弱に
より、インダクション特異的な転換株を選出する（プラ
ス・マイナス法）。
ハイブリダイゼーションのプローブとして、ＧＩＦを誘
導していない産生株（インダクションマイナス）からの
ＩＩＩ ＲＮＡと、上記薬剤を用いてＧＩＦを誘導させ
（インダクションプラス）且つ該ＧＩＦをコードするｍ
ＲＮＡが増幅している＋！ｌ ＲＮＡ （該Ｉｌｌ
ＲＮＡから合成したｃ ＤＮＡでもよい）との両者を用
い、これらをハイブリダイゼーションさせ、その強弱に
より、インダクション特異的な転換株を選出する（プラ
ス・マイナス法）。
また、インダクションマイナスのＩＩＩ ＲＮＡ （又
はそれから作成されるｃ ＤＮＡ）とインダクションプ
ラスのｍ ＲＮＡから作成されたｃ ＤＮＡ （又は１
ＲＮＡそのもの）とのハイブリダイゼーションを行なっ
て後、ハイブリダイゼーションしなかったｍ ＲＮＡ
（又はＣＤＮＡ）をプローブとし、−３８＝ コロニー ハイブリダイゼーションを行なって、インダ
クション特異的な株を選出する（セレクテイブ・ハイブ
リダイゼーション法）。
はそれから作成されるｃ ＤＮＡ）とインダクションプ
ラスのｍ ＲＮＡから作成されたｃ ＤＮＡ （又は１
ＲＮＡそのもの）とのハイブリダイゼーションを行なっ
て後、ハイブリダイゼーションしなかったｍ ＲＮＡ
（又はＣＤＮＡ）をプローブとし、−３８＝ コロニー ハイブリダイゼーションを行なって、インダ
クション特異的な株を選出する（セレクテイブ・ハイブ
リダイゼーション法）。
目的株の選出は、ｃ ＤＮＡ若しくはｍ ＲＮＡの検索
により行ない得る。
により行ない得る。
（４）ＧＩＦに対する抗体を用いて選出する方法予め、
ｃ ＤＮＡを形質転換株内で蛋白質を発現し得るベクタ
ーに組込み、形質転換株内で蛋白質を産生させ、ＧＩＦ
に対する抗体及び該抗体に対する第二抗体を用いて、Ｇ
ＩＦ産生株を検出し、目的株を得る。
ｃ ＤＮＡを形質転換株内で蛋白質を発現し得るベクタ
ーに組込み、形質転換株内で蛋白質を産生させ、ＧＩＦ
に対する抗体及び該抗体に対する第二抗体を用いて、Ｇ
ＩＦ産生株を検出し、目的株を得る。
（５）セレクテイブ・ハイブリダイゼーション・トラン
スレーションの系を用いる方法 形質転換株から得られるＣ ＤＮＡを、ニトロセルロー
スフィルター等にプロットし、ＧＩＦ産生細胞からのｍ
ＲＮＡをハイブリダイゼーションさせた後、ｃ ＤＮ
Ａに対応するｍ ＲＮＡを回収する。
スレーションの系を用いる方法 形質転換株から得られるＣ ＤＮＡを、ニトロセルロー
スフィルター等にプロットし、ＧＩＦ産生細胞からのｍ
ＲＮＡをハイブリダイゼーションさせた後、ｃ ＤＮ
Ａに対応するｍ ＲＮＡを回収する。
回収されたｍ ＲＮＡを蛋白翻訳系、例えばアフリカッ
メガエルの卵母細胞への注入や、ウサギ網状赤血球ライ
ゼートや小麦胚芽等の無細胞系で蛋白質に翻訳させ、そ
の蛋白質のＧＩＦ活性を調べるか、又はＧＩＦに対する
抗体を用いて検出して、目的の株を得る。
メガエルの卵母細胞への注入や、ウサギ網状赤血球ライ
ゼートや小麦胚芽等の無細胞系で蛋白質に翻訳させ、そ
の蛋白質のＧＩＦ活性を調べるか、又はＧＩＦに対する
抗体を用いて検出して、目的の株を得る。
得られた目的の形質転換株よりＧＩＦをコードするＤＮ
Ａを採取する方法は、公知の方法、例えば細胞よりプラ
スミドＤＮＡに相当する画分を分離し、該プラスミドＤ
ＮＡよりｃ ＤＮＡ領域を切り出すことにより行ない得
る。
Ａを採取する方法は、公知の方法、例えば細胞よりプラ
スミドＤＮＡに相当する画分を分離し、該プラスミドＤ
ＮＡよりｃ ＤＮＡ領域を切り出すことにより行ない得
る。
上記各方法に従い得られるＧＩＦのｃ ＤＮＡの構造及
び塩基配列は、例えばマキサム−ギルバート（Ｍ ａＸ
ａｍ−Ｇ １ｌｂｅｒｔ）の化学的修飾法（ｌｙｊｅｔ
ｈ。
び塩基配列は、例えばマキサム−ギルバート（Ｍ ａＸ
ａｍ−Ｇ １ｌｂｅｒｔ）の化学的修飾法（ｌｙｊｅｔ
ｈ。
Ｅｎｚｙｍ、６５．４９９−５６０ ＜１９８０））及
びＭ１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終
結法（Ｍｅｓｓ＋ｎｇ Ｊ、 ａｎｄ Ｖｉｅｉｒａ
、Ｊ、 。
びＭ１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終
結法（Ｍｅｓｓ＋ｎｇ Ｊ、 ａｎｄ Ｖｉｅｉｒａ
、Ｊ、 。
Ｇｅｎｅ、１９，２６９−２７６ （１９８２））にて
決定できる。
決定できる。
尚、上記の如くして得られる形質転換体の一例として、
後記実施例で得られるＧＩＦＩ伝子を含むプラスミドｐ
ＧＩＦ−αを、エシェリヒア コリーχ１７７６にトラ
ンスフオームさせた形質転換体を、［Ｅ ５ｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉχ１７７６／ｐＧＩＦ−α」なる
名称で工業技術院微生物工業技術研究所に［微工研条寄
第９４８号（ＦＥＲＭＢＰ−９４８＞として寄託してい
る。従って上記ＧＩＦＩ伝子の調製に当っては、この形
質転換体を利用するのがより簡便であり好ましい。
後記実施例で得られるＧＩＦＩ伝子を含むプラスミドｐ
ＧＩＦ−αを、エシェリヒア コリーχ１７７６にトラ
ンスフオームさせた形質転換体を、［Ｅ ５ｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉχ１７７６／ｐＧＩＦ−α」なる
名称で工業技術院微生物工業技術研究所に［微工研条寄
第９４８号（ＦＥＲＭＢＰ−９４８＞として寄託してい
る。従って上記ＧＩＦＩ伝子の調製に当っては、この形
質転換体を利用するのがより簡便であり好ましい。
ＧＩＦをコードする遺伝子の利用によれば、遺伝子組換
え技術に従い、ＧＩＦを大量に収得することができる。
え技術に従い、ＧＩＦを大量に収得することができる。
上記技術においては該遺伝子が宿主細胞中で発現でき得
るような組換えＤＮＡを作成する。該組換えＤＮＡの作
成は、当該技術分野における通常の方法に従うことがで
き、本明細書に開示のＧＩＦの遺伝情報に基づいて容易
に実施できる。個々の具体的操作については一部既に詳
述したが、以下により具体的に詳述する。
るような組換えＤＮＡを作成する。該組換えＤＮＡの作
成は、当該技術分野における通常の方法に従うことがで
き、本明細書に開示のＧＩＦの遺伝情報に基づいて容易
に実施できる。個々の具体的操作については一部既に詳
述したが、以下により具体的に詳述する。
宿主細胞としては、真核生物及び原核生物のいずれをも
用いることができる。該真核生物の細胞には、を推動物
、酵母等の細胞が含まれ、を推動物細胞としては、例え
ばサルの細胞であるＣＯ６細胞（Ｙ、 Ｇｌｕｚｍａｎ
、 Ｃｅ１ｌ、２３．１７５−１８２（１９８１））や
チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞のジヒドロ葉酸レダ
クターゼ欠損株（Ｇ。
用いることができる。該真核生物の細胞には、を推動物
、酵母等の細胞が含まれ、を推動物細胞としては、例え
ばサルの細胞であるＣＯ６細胞（Ｙ、 Ｇｌｕｚｍａｎ
、 Ｃｅ１ｌ、２３．１７５−１８２（１９８１））や
チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞のジヒドロ葉酸レダ
クターゼ欠損株（Ｇ。
Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｌ、 Ａ、 Ｃｈａｓｉｎ 、
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、 ７７．４２１６−４２
２０（１９８０））等がよく用いられているが、之等に
限定される訳ではない。を推動物細胞の発現ベクターと
しては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置する
プロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル
化部位及び転写終了配列等を保有するものを使用でき、
これは更に必要により複製起源を保有していてもよい。
２０（１９８０））等がよく用いられているが、之等に
限定される訳ではない。を推動物細胞の発現ベクターと
しては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置する
プロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル
化部位及び転写終了配列等を保有するものを使用でき、
これは更に必要により複製起源を保有していてもよい。
該発現ベクターの例としては、５ｖ４０の初期プロモー
ターを保有するｐ ３ｙ２ｄｈｆｒ（Ｓ、 ５ａｂｉ’
ａｍａｎｉ、 Ｒ。
ターを保有するｐ ３ｙ２ｄｈｆｒ（Ｓ、 ５ａｂｉ’
ａｍａｎｉ、 Ｒ。
Ｍｕｌｌｉａａｎ ａｎｄ Ｐ、Ｂｅｒｇ、Ｍｏ１．
Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ、、１．８５４−７６４）等を例示
できるが、これに限定されない。
Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ、、１．８５４−７６４）等を例示
できるが、これに限定されない。
また真核微生物としては酵母が一般によく用いられてお
り、その中でもサツカロミセス属ｉｓａが有利に利用で
きる。該酵母等の真核微生物の発現ベクターとしては、
例えば酸性ホスファターゼ遺伝子に対するプロモーター
を持つｐ ＡＭ８２ （Ａ。
り、その中でもサツカロミセス属ｉｓａが有利に利用で
きる。該酵母等の真核微生物の発現ベクターとしては、
例えば酸性ホスファターゼ遺伝子に対するプロモーター
を持つｐ ＡＭ８２ （Ａ。
Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ、 Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、。
ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、。
ＵＳＡ、江、１−５ （１９８３））等を好ましく利用
できる。
できる。
原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌が一般によく
用いられている。本発明では例えば該宿主菌中で複製可
能なプラスミドベクターを用い、このベクター中にＧＩ
Ｆの遺伝子が発現できるようにＧＩＦ遺伝子の上流にプ
ロモーター及びＳＤくシャイン・アンド・ダルガーノ）
塩基配列、更に蛋白合成開始に必要なＡＴＧを付与した
発現プラスミドが使用できる。上記宿主菌としての大腸
菌としては、■シエリヒア・コリー（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｋ
１２株等がよく用いられ、ベクターとしては一般にＩ）
ＢＲ３２２がよく用いられるが、これに限定されず、公
知の各種の菌株及びベクターがいずれも利用できる。プ
ロモーターとしては、例えばトリプトファン・プロモー
ター、ＰＬプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌｐｐ
プロモーター等を使用することができ、いずれの場合に
もＧＩＦ遺伝子を発現させることができる。
用いられている。本発明では例えば該宿主菌中で複製可
能なプラスミドベクターを用い、このベクター中にＧＩ
Ｆの遺伝子が発現できるようにＧＩＦ遺伝子の上流にプ
ロモーター及びＳＤくシャイン・アンド・ダルガーノ）
塩基配列、更に蛋白合成開始に必要なＡＴＧを付与した
発現プラスミドが使用できる。上記宿主菌としての大腸
菌としては、■シエリヒア・コリー（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｋ
１２株等がよく用いられ、ベクターとしては一般にＩ）
ＢＲ３２２がよく用いられるが、これに限定されず、公
知の各種の菌株及びベクターがいずれも利用できる。プ
ロモーターとしては、例えばトリプトファン・プロモー
ター、ＰＬプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌｐｐ
プロモーター等を使用することができ、いずれの場合に
もＧＩＦ遺伝子を発現させることができる。
トリプトファン・プロモーターを用いる場合を例にとり
詳述すれば、発現ベクターとしてトリプトファン・プロ
モーター及びＳＤ配列を持つベクター１）ＴＭｌ（今本
文男、代謝、ＶＯｌ、２２゜２８９ （１９８５））を
使用し、ＳＤ配列の下流に存在する制限酵素Ｃ１ａ■部
位に、必要に応じてＡＴＧを付与したＧＩＦをコードす
る遺伝子を連結させればよい。この方法により例えば前
記ポリペプチド■を製造する場合、より具体的には、ま
ずＧＩＦのｃ ＤＮＡを持つ例えば後記実施例に示すプ
ラスミドｐＧＩＦ−αを、制限酸素ＡＣＣＩ及びＭｓｐ
Ｉで切断してポリペプチド■をコードする遺伝子の大部
分と３′非翻訳領域の一部を含むＤＮＡフラグメントを
単離する。このＤＮＡフラグメントではポリペプチド■
のアミン末端側の１０アミノ酸残基をコードする遺伝子
領域が不足している。従って、上記方法では次いでトリ
プトファン・プロモーターを持つ発現ベクターｐＴＭ１
の制限酵素Ｃ１ａＩ部位に連結することができ、且つ翻
訳開始コドンＡＴＧを持ち、更にポリペプチド■のアミ
ノ末端側から１０アミノ酸残基をコードし得る合成りＮ
Ａクリンカを作成し、このリンカ−を用いて、トリプト
ファン・プロモーターの下流にポリペプチド■遺伝子を
挿入して発現プラスミドを調製する。該プラスミドをＣ
ａＣＱ２処理によりＤＮＡを取り込みやすい状態とした
大腸菌へ形質転換させ、目的の形質転換株を常法に従い
培養することにより、ポリペプチド■を収得できる。上
記形質転換株の培養は、一般にはトリプトファン・プロ
モーターが働くようにするためにカザミノ酸を添加した
Ｍ９最小培地を用いて行なわれ、該培地中には培養中の
適当な時期にインドールアクリル酸等のトリプトファン
・プロモーターの働きを強めるための薬剤を添加するこ
ともできる。かくして培養された大腸菌内には、ポリペ
プチド■が大量に産生、蓄積される。
詳述すれば、発現ベクターとしてトリプトファン・プロ
モーター及びＳＤ配列を持つベクター１）ＴＭｌ（今本
文男、代謝、ＶＯｌ、２２゜２８９ （１９８５））を
使用し、ＳＤ配列の下流に存在する制限酵素Ｃ１ａ■部
位に、必要に応じてＡＴＧを付与したＧＩＦをコードす
る遺伝子を連結させればよい。この方法により例えば前
記ポリペプチド■を製造する場合、より具体的には、ま
ずＧＩＦのｃ ＤＮＡを持つ例えば後記実施例に示すプ
ラスミドｐＧＩＦ−αを、制限酸素ＡＣＣＩ及びＭｓｐ
Ｉで切断してポリペプチド■をコードする遺伝子の大部
分と３′非翻訳領域の一部を含むＤＮＡフラグメントを
単離する。このＤＮＡフラグメントではポリペプチド■
のアミン末端側の１０アミノ酸残基をコードする遺伝子
領域が不足している。従って、上記方法では次いでトリ
プトファン・プロモーターを持つ発現ベクターｐＴＭ１
の制限酵素Ｃ１ａＩ部位に連結することができ、且つ翻
訳開始コドンＡＴＧを持ち、更にポリペプチド■のアミ
ノ末端側から１０アミノ酸残基をコードし得る合成りＮ
Ａクリンカを作成し、このリンカ−を用いて、トリプト
ファン・プロモーターの下流にポリペプチド■遺伝子を
挿入して発現プラスミドを調製する。該プラスミドをＣ
ａＣＱ２処理によりＤＮＡを取り込みやすい状態とした
大腸菌へ形質転換させ、目的の形質転換株を常法に従い
培養することにより、ポリペプチド■を収得できる。上
記形質転換株の培養は、一般にはトリプトファン・プロ
モーターが働くようにするためにカザミノ酸を添加した
Ｍ９最小培地を用いて行なわれ、該培地中には培養中の
適当な時期にインドールアクリル酸等のトリプトファン
・プロモーターの働きを強めるための薬剤を添加するこ
ともできる。かくして培養された大腸菌内には、ポリペ
プチド■が大量に産生、蓄積される。
上記に具体的に例示した以外のすべての本発明ＧＩＦの
製造方法も、上記方法と略々同様にして行なうことがで
きる。
製造方法も、上記方法と略々同様にして行なうことがで
きる。
上記により、目的の組換え微生物の細胞内又は細胞外に
生産されるＧＩＦは、常法に従い分離され、ＧＩＦの物
理的、化学的性質等を利用した各種の処理操作に従い単
離、精製することができる。
生産されるＧＩＦは、常法に従い分離され、ＧＩＦの物
理的、化学的性質等を利用した各種の処理操作に従い単
離、精製することができる。
４６一
該処理操作の具体例は、前記した通りである。
本発明方法に従い得られるＧＩＦは、その有するＧＩＦ
活性及び種々の腫瘍細胞に対して特異的にその増殖を抑
制する作用により、単独でヒト及びその他の動物の抗腫
瘍剤として有用であり、またガンの化学療法剤として、
特に各種抗悪性腫瘍剤との併用による寛解強化療法、寛
解維持療法に有利に用いられる。更に該ＧＩＦは、毒性
が極めて低く、この低毒性の面でも上記用途に有利であ
る。
活性及び種々の腫瘍細胞に対して特異的にその増殖を抑
制する作用により、単独でヒト及びその他の動物の抗腫
瘍剤として有用であり、またガンの化学療法剤として、
特に各種抗悪性腫瘍剤との併用による寛解強化療法、寛
解維持療法に有利に用いられる。更に該ＧＩＦは、毒性
が極めて低く、この低毒性の面でも上記用途に有利であ
る。
ＧＩＦを抗腫瘍剤として用いるに当り、該抗腫瘍剤はＧ
ＩＦの有効量を、薬理的に許容される通常の無毒性担体
と共に含有する各種の薬理組成物の形態に調製され、該
形態に応じた各種投与経路により投与される。その製剤
形態としては、通常液状形態、即ち溶液、懸濁液、乳濁
液等を例示でき、之等は一般に経口、静脈、皮下又は筋
肉内投与される。之等はまた使用前に適当な通常の担体
の添加によって液状となし得る乾燥品として提供するこ
ともできる。該抗腫瘍剤の投与量は、患者の年齢、性別
や疾患の程度等により異なるが、通常蛋白量として約０
、 １〜１００ｍｏ／ｋｏ／日を１〜数回に分けて投
与するのが好ましい。
ＩＦの有効量を、薬理的に許容される通常の無毒性担体
と共に含有する各種の薬理組成物の形態に調製され、該
形態に応じた各種投与経路により投与される。その製剤
形態としては、通常液状形態、即ち溶液、懸濁液、乳濁
液等を例示でき、之等は一般に経口、静脈、皮下又は筋
肉内投与される。之等はまた使用前に適当な通常の担体
の添加によって液状となし得る乾燥品として提供するこ
ともできる。該抗腫瘍剤の投与量は、患者の年齢、性別
や疾患の程度等により異なるが、通常蛋白量として約０
、 １〜１００ｍｏ／ｋｏ／日を１〜数回に分けて投
与するのが好ましい。
実 施 例
以下、本発明を更に詳細に説明するため実施例を挙げる
。
。
尚、ＧＩＦ活性は次の方法により測定した。
ＧＩＦ活性の測定
９６ウエルマイクロプレート（コーニング社）に種々の
濃度に希釈した供試液０．１ｍＱを入れ、次に各ウェル
にヒトメラノーマ細１ｔｌＡ３７５を２×１０４個／ｌ
１１１２の濃度で含有する１０％ＦＣ８を含むイーグル
スＭＥＭ浮遊液０．１ｍＱを加え、炭酸ガス培養器（ナ
フコ社製）内で４日間培養する。
濃度に希釈した供試液０．１ｍＱを入れ、次に各ウェル
にヒトメラノーマ細１ｔｌＡ３７５を２×１０４個／ｌ
１１１２の濃度で含有する１０％ＦＣ８を含むイーグル
スＭＥＭ浮遊液０．１ｍＱを加え、炭酸ガス培養器（ナ
フコ社製）内で４日間培養する。
培養終了後、０．０５％ニュウトラルレッド（和光紬薬
社製）０．０５ｍ１ｌｉを各ウェルに加え、３７℃で２
時間培養する。上澄液を除去した後、リン酸緩衝整理食
塩水０．３−を各ウェルに静かに加えてウェルを洗浄す
る。洗浄液を除去した後、各ウェルにリン酸１ナトリウ
ム−エタノール等量混合液０．１ｍ１２を加え、マイク
ロミキサーで数分間振盪し、細胞内に取込まれた色素量
を、９６ウ工ルーマイクロタイトレーシヨンプレート用
光度計（タイターチェックマルチスキャン、フロララボ
ラトリーズ社製）を用いて、吸光度５４０ｍμにて測定
し、増殖抑制活性を求める。対照群（コントロール群）
の細胞増殖の５０％抑制を示ず試験群、即ち対照群の吸
光度測定値の１／２の吸光度測定値を示す試験群、の希
釈倍数の逆数をとり、これをＧＩＦ活性単位とする。従
って例えばこのＧＩＦ活性が１０単位の場合、この供試
液は１０倍希釈してもなお細胞増殖を５０％抑制する活
性を有する。
社製）０．０５ｍ１ｌｉを各ウェルに加え、３７℃で２
時間培養する。上澄液を除去した後、リン酸緩衝整理食
塩水０．３−を各ウェルに静かに加えてウェルを洗浄す
る。洗浄液を除去した後、各ウェルにリン酸１ナトリウ
ム−エタノール等量混合液０．１ｍ１２を加え、マイク
ロミキサーで数分間振盪し、細胞内に取込まれた色素量
を、９６ウ工ルーマイクロタイトレーシヨンプレート用
光度計（タイターチェックマルチスキャン、フロララボ
ラトリーズ社製）を用いて、吸光度５４０ｍμにて測定
し、増殖抑制活性を求める。対照群（コントロール群）
の細胞増殖の５０％抑制を示ず試験群、即ち対照群の吸
光度測定値の１／２の吸光度測定値を示す試験群、の希
釈倍数の逆数をとり、これをＧＩＦ活性単位とする。従
って例えばこのＧＩＦ活性が１０単位の場合、この供試
液は１０倍希釈してもなお細胞増殖を５０％抑制する活
性を有する。
実施例１
（Ｉ＞天然型ＧＩＦの製造
ヒト末梢血リーンパ球を、２％牛脂児血清（Ｆｅ２）加
ＲＰＭ Ｉ−１６４０ｔ８ｔＬＤ：懸ｉ１サセ、１×１
０８個／鶴の濃度の細胞浮遊液に調製した。
ＲＰＭ Ｉ−１６４０ｔ８ｔＬＤ：懸ｉ１サセ、１×１
０８個／鶴の濃度の細胞浮遊液に調製した。
この液に抗腫瘍物質誘導剤であるＰＨＡ−Ｐ（インゲン
マメレクチン、ディフコ（ＱＮｃｏ）社製）を０．２％
の濃度となるように加え、３７℃で３日間炭酸ガス培養
器（ＮＡＰＣＯ５３００゜ナフコ社製）内で培養し、培
養液を遠心分離（２０００（ｌ Ｘ１０分）して培養上
清を得た。得られた培養上清を以下原料液とする。
マメレクチン、ディフコ（ＱＮｃｏ）社製）を０．２％
の濃度となるように加え、３７℃で３日間炭酸ガス培養
器（ＮＡＰＣＯ５３００゜ナフコ社製）内で培養し、培
養液を遠心分離（２０００（ｌ Ｘ１０分）して培養上
清を得た。得られた培養上清を以下原料液とする。
原料液を、硫酸アンモニウム沈澱法（日本生化学金線、
生化学実験講座第１巻、東京化学同人）により分画した
。硫酸アンモニウム濃度５０〜８０％の両分にＧＩＦ活
性を有する沈澱が認められた。
生化学実験講座第１巻、東京化学同人）により分画した
。硫酸アンモニウム濃度５０〜８０％の両分にＧＩＦ活
性を有する沈澱が認められた。
この沈澱物をＡｃ Ａ５４ （ＬＫＢ社）ゲルクロマト
グラフィー（８０ｃｍｘ ４ 、４ ｃｍ直径、移動相
０．０２％ポリエチレングリコール（分子量６０００）
を含むリン酸塩緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｙｅｒ
５ａｌｉｎｅ） 、流速３０ｍ１２／ｈｒ）に付し
、分子量１万〜２．５万の画分にＧＩＦ活性を認めた。
グラフィー（８０ｃｍｘ ４ 、４ ｃｍ直径、移動相
０．０２％ポリエチレングリコール（分子量６０００）
を含むリン酸塩緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｙｅｒ
５ａｌｉｎｅ） 、流速３０ｍ１２／ｈｒ）に付し
、分子量１万〜２．５万の画分にＧＩＦ活性を認めた。
この両分にはＴＮＦ、、ＩＦＮ、Ｃ８Ｆの活性は認めら
れなかった。
れなかった。
上記ゲルクロマトグラフィーの結果を第１図に示す。図
において横軸はフラクションＮＯ，を示し、縦軸は下記
各測定法に従って求められた各種生理活性及びＯＤ２
ｓ ｏでの吸光度をそれぞれ示す。
において横軸はフラクションＮＯ，を示し、縦軸は下記
各測定法に従って求められた各種生理活性及びＯＤ２
ｓ ｏでの吸光度をそれぞれ示す。
また図には参考のため各フラクションに相当する分子量
を矢印を付して示した。図中（１）はＣ８Ｆ活性を、（
２）はＩＦＮ活性をζ （３）はＩＬ−２活性を、（４
）は本発明ＧＩＦ活性を、（５）はＢＣＤＦ活性を、及
び（６）はＴＮＦ活性をそれぞれ示す曲線であり、（７
）は吸光度曲線である。
を矢印を付して示した。図中（１）はＣ８Ｆ活性を、（
２）はＩＦＮ活性をζ （３）はＩＬ−２活性を、（４
）は本発明ＧＩＦ活性を、（５）はＢＣＤＦ活性を、及
び（６）はＴＮＦ活性をそれぞれ示す曲線であり、（７
）は吸光度曲線である。
活性測定
各生理活性の測定は、次の方法によった。
０ＧＩＦ（上記方法に従う）。
０ＴＮＦ （Ｌ９２９細胞株を使用し、Ａ、Ｋｈａｎら
の方法（Ｈｕｍａｎ Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ、 Ａ
ｃａｄｅｍｉｃｐｒｅｓｓ 、 Ｏ２３〜３２ （１９
８２） ）に従い活性測定）。
の方法（Ｈｕｍａｎ Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ、 Ａ
ｃａｄｅｍｉｃｐｒｅｓｓ 、 Ｏ２３〜３２ （１９
８２） ）に従い活性測定）。
０１ＦＮ（ヒト羊膜由来ＦＬ細胞とシンドビスウィルス
（３ｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ ）を使用した系にお
いてインターフェロン活性測定〔須藤哲夫、大久保礼子
、飯塚雅彦、小林茂保、第４２回ウィルス抑制因子研究
会、１９８２年〕にて活性測定）。
（３ｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ ）を使用した系にお
いてインターフェロン活性測定〔須藤哲夫、大久保礼子
、飯塚雅彦、小林茂保、第４２回ウィルス抑制因子研究
会、１９８２年〕にて活性測定）。
ｏ Ｏ３Ｆ （ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎ
ｏ ｆａｃｔｏｒ：ファラ（Ｊ、 Ｊ、 Ｆａｒｒａｒ
）らの方法（Ｊ 、（ｍｍｕｎｏｌ、。
ｏ ｆａｃｔｏｒ：ファラ（Ｊ、 Ｊ、 Ｆａｒｒａｒ
）らの方法（Ｊ 、（ｍｍｕｎｏｌ、。
１２７．１９８３ （１９８１））に従いＢＡＬＢ／Ｃ
系マウス骨髄細胞を使用して活性測定）。
系マウス骨髄細胞を使用して活性測定）。
ｏ Ｌ Ａ Ｆ （Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖ
ａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ、オツヘンハインＬＪ 、
Ｊ 、 Ｑｐｐｅｎｈｅｉｎ）らの方法ＬＪ、 Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、、１１６．１４６６ （１９７６） ）に
従い、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ Ｊ系マウスの胸腺細胞を利用して
活性測定）。
ａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ、オツヘンハインＬＪ 、
Ｊ 、 Ｑｐｐｅｎｈｅｉｎ）らの方法ＬＪ、 Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、、１１６．１４６６ （１９７６） ）に
従い、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ Ｊ系マウスの胸腺細胞を利用して
活性測定）。
０ＩＬ−２（インターロイキン−２、ギリス（Ｓ。
Ｇ１１ｌｉｓ ）とスミス（Ｋ、 Ａ、 Ｓｍ１ｔｈ）
の方法（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１２０．２０２７ （
１９７８））に従い、ＩＬ−２依存性マウスＴ細胞（Ｃ
ＴＬＬ２）を使用して活性測定）。
の方法（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１２０．２０２７ （
１９７８））に従い、ＩＬ−２依存性マウスＴ細胞（Ｃ
ＴＬＬ２）を使用して活性測定）。
０ＢＣＤＦ （Ｂ細胞分化因子、３−ｃｅｌｌｄｉｆｆ
ｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ、岸本らの方法
〔Ｊ。
ｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ、岸本らの方法
〔Ｊ。
Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１２７．４１２ （１９８１） ）
に従い、ＣＥＳＳｉ［胞株を使用して活性測定）。
に従い、ＣＥＳＳｉ［胞株を使用して活性測定）。
次いで上記画分につき、ＰＢＥ９４ （ファルマシア社
製）ゲルを使用してクロマトフオーカシングを行なった
。即ち、開始緩衝液として０．０２５Ｍイミダゾール−
塩酸（１）Ｈ４）を用い、また溶出液としてポリバッフ
ァー７４−塩酸（ｐＨ４）を用いて上記画分を分画し、
得られる各フラクションのＧＩＦ活性を測定した。その
結果、等電点（ＰＩ）６．４〜６．６の領域にＧＩＦ活
性が存在した。この領域にはＢＣＤＦ活性は認、められ
なかった。
製）ゲルを使用してクロマトフオーカシングを行なった
。即ち、開始緩衝液として０．０２５Ｍイミダゾール−
塩酸（１）Ｈ４）を用い、また溶出液としてポリバッフ
ァー７４−塩酸（ｐＨ４）を用いて上記画分を分画し、
得られる各フラクションのＧＩＦ活性を測定した。その
結果、等電点（ＰＩ）６．４〜６．６の領域にＧＩＦ活
性が存在した。この領域にはＢＣＤＦ活性は認、められ
なかった。
このクロマトフオーカシング分析結果を第２図に示す。
図において横軸はフラクションＮｏ、を、縦軸は０Ｄ２
８０の吸光度（曲線（１）で示される）、ＢＣＤＦ活性
（曲線（２）で示される）、本発明ＧＩＦ活性（曲線（
３）で示される）及びｐＨ（曲線（４）で示される）を
それぞれ示す。
８０の吸光度（曲線（１）で示される）、ＢＣＤＦ活性
（曲線（２）で示される）、本発明ＧＩＦ活性（曲線（
３）で示される）及びｐＨ（曲線（４）で示される）を
それぞれ示す。
更に上記ＧＩＦ活性画分を、逆相高速液体クロマトグラ
フィー（ＣＡハイボアー逆相カラム（Ｒ’Ｐ３０４）、
パイオーラド社製、直径４．６Ｘｂ 液＝０．１％ＴＦＡ＋７０％アセトニトリル、濃度勾配
；Ａ液１００％から８０分間でＢ液１００％とする、流
速１ｍ１２／分）に付し、アセトニトリルが４４±３％
の画分を得た。この画分にはＩＬ−２の活性は認められ
なかった。またＧＩＦ活性とＬＡＦ活性とは一致しなか
った。
フィー（ＣＡハイボアー逆相カラム（Ｒ’Ｐ３０４）、
パイオーラド社製、直径４．６Ｘｂ 液＝０．１％ＴＦＡ＋７０％アセトニトリル、濃度勾配
；Ａ液１００％から８０分間でＢ液１００％とする、流
速１ｍ１２／分）に付し、アセトニトリルが４４±３％
の画分を得た。この画分にはＩＬ−２の活性は認められ
なかった。またＧＩＦ活性とＬＡＦ活性とは一致しなか
った。
上記により、本発明の天然型Ｇ［Ｆを単離した。
上記逆相高速液体クロマトグラフィーの分析結果を第３
図に示す。図において横軸は保持時間（分）を、縦軸は
曲線（１）で示されるアセトニドＵ／Ｌ、（７）ＩＩＩ
、曲１！ ＜２） テ示すｔｔル２８０ｎｍニおける蛋
白の吸光度（ＯＤ２８０）、曲線（３）で示される本発
明ＧＩＦ活性、曲線（４）で示されるＬへＦ活性及び曲
線（５）で示される１１２活性をそれぞれ示す。
図に示す。図において横軸は保持時間（分）を、縦軸は
曲線（１）で示されるアセトニドＵ／Ｌ、（７）ＩＩＩ
、曲１！ ＜２） テ示すｔｔル２８０ｎｍニおける蛋
白の吸光度（ＯＤ２８０）、曲線（３）で示される本発
明ＧＩＦ活性、曲線（４）で示されるＬへＦ活性及び曲
線（５）で示される１１２活性をそれぞれ示す。
（ＩＦ）天然型Ｇ Ｉ Ｆの製造
ヒト末梢血リンパ球を、１％牛脂児血清（Ｆｅ２）、０
．１μｇ／岐インドメタシン、２０１１１Ｍ Ｎ−２
−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’ −２−エタンス
ルホン酸（ＨＥＰＥＳ）及び１０μＱ ／ｍＱＬＰｓ
（ディフコ社製）を加えたＲＰＭＩ−１６４０培地ニテ
、１Ｘ１０Ｂ（Ｉｌｉｌ／ｍＱの濃度の細胞浮遊液に調
製した。
．１μｇ／岐インドメタシン、２０１１１Ｍ Ｎ−２
−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’ −２−エタンス
ルホン酸（ＨＥＰＥＳ）及び１０μＱ ／ｍＱＬＰｓ
（ディフコ社製）を加えたＲＰＭＩ−１６４０培地ニテ
、１Ｘ１０Ｂ（Ｉｌｉｌ／ｍＱの濃度の細胞浮遊液に調
製した。
この液を、３７℃で２０〜２４時間炭酸ガス培養器（ナ
フコ社製、ＮＡＰＣＯ５３００）内で培養し、培養液を
遠心分離（１００００ｒｐｍｘ３０分）して培養上清２
４３００回を得、次いでこれをペリコン膜（分子量カッ
トオフ、１００００：ミリポ７− （Ｍ １ｌｌｉｐｏ
ｒｅ）社製）を用いて１０倍に濃縮した。、得られた培
養上清濃縮液を以下原料液という。
フコ社製、ＮＡＰＣＯ５３００）内で培養し、培養液を
遠心分離（１００００ｒｐｍｘ３０分）して培養上清２
４３００回を得、次いでこれをペリコン膜（分子量カッ
トオフ、１００００：ミリポ７− （Ｍ １ｌｌｉｐｏ
ｒｅ）社製）を用いて１０倍に濃縮した。、得られた培
養上清濃縮液を以下原料液という。
原料液を、上記（Ｉ）と同様に硫酸アンモニウム沈澱法
により水冷下に分画した。硫酸アンモニウム濃度５０〜
８０％の両分にＧＩＦ活性を有する沈澱が認められた。
により水冷下に分画した。硫酸アンモニウム濃度５０〜
８０％の両分にＧＩＦ活性を有する沈澱が認められた。
これを生理食塩水に溶解し、生理食塩水で透析した。
上記硫酸アンモニウム分画物を４回に分けて各々４℃で
ウルトロゲルＡｃ Ａ５４ （ＬＫＢ社）を用いたゲル
クロマトグラフィーに付した。その条件は次の通りであ
る。
ウルトロゲルＡｃ Ａ５４ （ＬＫＢ社）を用いたゲル
クロマトグラフィーに付した。その条件は次の通りであ
る。
カラム： ８８ ｃｍｘ ４ 、４ ｃｍ直径溶離液：
０．０２％ポリエチレングリ］−ル（分子量６０００）
及び０．０２％ Ｎａ Ｎ３を含むリン酸塩緩衝生理食塩液（ＰＢＳ） 流 速：３０鵬／時間 フラクション容積：１５ｍＧ／３０分／チューブ各回と
も分子量約１万〜２．５万の画分くフラクションＮｏ、
５７〜６５）にＧＩＦ活性を認め、これを集めた。
０．０２％ポリエチレングリ］−ル（分子量６０００）
及び０．０２％ Ｎａ Ｎ３を含むリン酸塩緩衝生理食塩液（ＰＢＳ） 流 速：３０鵬／時間 フラクション容積：１５ｍＧ／３０分／チューブ各回と
も分子量約１万〜２．５万の画分くフラクションＮｏ、
５７〜６５）にＧＩＦ活性を認め、これを集めた。
この活性画分を、次いで水冷下、ＹＭ−５８！Ｊ（アミ
コン社製）を用いて濃縮し、溶媒を５０ＩＩＩＭ！￥酸
ナトリウム（ｐ）−１５，５）とした。濃縮後、マイレ
ックスＧＶ（０，２２μｍ；ミリポア社製）で濾過した
。
コン社製）を用いて濃縮し、溶媒を５０ＩＩＩＭ！￥酸
ナトリウム（ｐ）−１５，５）とした。濃縮後、マイレ
ックスＧＶ（０，２２μｍ；ミリポア社製）で濾過した
。
上記で得られた活性画分濃縮処理試料を、２回に分けて
ジルリン ハイパーミュエーション リキッド クロマ
トグラフィー システム（ジルリン（Ｇｉｌｓｏｎ）社
製）によるイオン交換クロマトグラフィー（ＣＭ−）−
ＩＰＬｃ）にかけた。その条件は次の通りである。
ジルリン ハイパーミュエーション リキッド クロマ
トグラフィー システム（ジルリン（Ｇｉｌｓｏｎ）社
製）によるイオン交換クロマトグラフィー（ＣＭ−）−
ＩＰＬｃ）にかけた。その条件は次の通りである。
カラム： ＩＥＸ−５３５ＣＭ （６，Ｏｘ１５０ｍｍ
、東洋曹達社製） 溶離液Ａ：５０ｎ＋Ｍ−酢酸ナトリウム（ｐＨ５，５） 溶離液Ｂ ： ０．５Ｍ−Ｎａ ＣＱ含有５０ｍＭ−酢
酸ナトリウム（ｐＨ５，５＞ 流 速：０．５１１１１１！／分 フラクション容積： リテンションタイム ０〜６０ 分・・・２屈Ｑ／４分／チューブ６０〜１２
０分・・・０．５講／分／チューブ１２０〜１８０分・
・・２魅／４分／チューブ濃度勾配二 時間（分）
％Ｂ 上記ＣＭ−ＨＰＬＣの結果、ＧＩＦ活性画分は、リテン
ションタイム９０〜９１分に認められた。
、東洋曹達社製） 溶離液Ａ：５０ｎ＋Ｍ−酢酸ナトリウム（ｐＨ５，５） 溶離液Ｂ ： ０．５Ｍ−Ｎａ ＣＱ含有５０ｍＭ−酢
酸ナトリウム（ｐＨ５，５＞ 流 速：０．５１１１１１！／分 フラクション容積： リテンションタイム ０〜６０ 分・・・２屈Ｑ／４分／チューブ６０〜１２
０分・・・０．５講／分／チューブ１２０〜１８０分・
・・２魅／４分／チューブ濃度勾配二 時間（分）
％Ｂ 上記ＣＭ−ＨＰＬＣの結果、ＧＩＦ活性画分は、リテン
ションタイム９０〜９１分に認められた。
上記によるＧＩＦ活性画分（フラクションＮｏ。
４５）を、次いで逆相高速液体クロマトグラフィーに付
した。その条件は、次の通りである。
した。その条件は、次の通りである。
カラム：０４ハイボアー逆相カラム（ＲＰ３０４、バイ
オ−ラド社、直径４．６ Ｘ２５０＋１１１１１） 溶離液：Ａ液＝０．１％ＴＦＡ Ｂ液＝アセトニトリル＝１％ＴＦＡ （９：１） 流 速：１ｍＱ／分 チャートスピード： リテンションタイム ０〜５０分・・・５分／Ｃｌｌ１ ５０〜８０分・・・２分／ｃｍ 濃度勾配二 時間（分） ％Ｂ フラクション容積：２ｍＱ／２分／チューブ上記クロマ
トグラフィーの結果を第４図に示す。
オ−ラド社、直径４．６ Ｘ２５０＋１１１１１） 溶離液：Ａ液＝０．１％ＴＦＡ Ｂ液＝アセトニトリル＝１％ＴＦＡ （９：１） 流 速：１ｍＱ／分 チャートスピード： リテンションタイム ０〜５０分・・・５分／Ｃｌｌ１ ５０〜８０分・・・２分／ｃｍ 濃度勾配二 時間（分） ％Ｂ フラクション容積：２ｍＱ／２分／チューブ上記クロマ
トグラフィーの結果を第４図に示す。
図において横軸はリテンションタイム（分）を、縦軸は
ＧＩＦ活性（曲線１）、２８０ｎｍにおける蛋白の吸光
度（Ａ２ ｓ Ｑ 、曲線２）及び溶離液の濃度勾配（
％Ｂ１曲線３）をそれぞれ示す。
ＧＩＦ活性（曲線１）、２８０ｎｍにおける蛋白の吸光
度（Ａ２ ｓ Ｑ 、曲線２）及び溶離液の濃度勾配（
％Ｂ１曲線３）をそれぞれ示す。
リテンションタイム６３．９〜６５．３分に、ＧＩＦ活
性に一致する単一の蛋白の吸光度ピークを示すＧＩＦが
得られた。
性に一致する単一の蛋白の吸光度ピークを示すＧＩＦが
得られた。
その比活性は２．ｌＸ１０７単位／ｍａ蛋白であった。
ｌａｅｍｍｌｉ、 Ｕ、 Ｋ、の方法（Ｎａｔｕｒｅ
、 ２７７゜６８０ （１９７０））に従い、上記（Ｉ
Ｉ）で得たＧＩＦの５ＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。その
条件は次の通りである。
、 ２７７゜６８０ （１９７０））に従い、上記（Ｉ
Ｉ）で得たＧＩＦの５ＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。その
条件は次の通りである。
試 料：上記ＧＩＦ活性画分１０μＱを乾固した後、ラ
エメリーのサンプル バッフ ァー（１／２０体積の２−メルカプト エタノールを含む）に溶解し、１００ ℃で４分間処理した。
エメリーのサンプル バッフ ァー（１／２０体積の２−メルカプト エタノールを含む）に溶解し、１００ ℃で４分間処理した。
ゲ ル：厚さ０．７５ｍｍの１５％ポリアクリルアミド
ゲルを使用した。
ゲルを使用した。
電気泳動装置：バイオ−ラド社製プロチアンを用いた。
泳動条件：２０ｍＡの定電流で２時間泳動させた。
泳動後のゲルをバイオ−ラド社製シルバースタインキッ
ト（Ｓ １ｔｖｅｒ ５ｔａｉｎ ｋｉｔ ）を用いて
染色した。その結果を第５図に示す。
ト（Ｓ １ｔｖｅｒ ５ｔａｉｎ ｋｉｔ ）を用いて
染色した。その結果を第５図に示す。
第５図においてレーン■は以下の分子量マーカーの結果
であり、レーン■は上記ＧＩＦ試料の結果であり、レー
ン■は０．１％ＴＦＡＩＯμＱを、ＧｒＦ活性画分に代
えて用いて上記レーン■に用いた試料と同じ処理をした
ものの結果を示す。
であり、レーン■は上記ＧＩＦ試料の結果であり、レー
ン■は０．１％ＴＦＡＩＯμＱを、ＧｒＦ活性画分に代
えて用いて上記レーン■に用いた試料と同じ処理をした
ものの結果を示す。
〈レーン■における分子量マーカー〉
９４に：フオスフオリラーゼ ｂ
６７に：アルブミン
４３に：オバルブミン
３０に二カルボニック アンバイトラーゼ２０．１にニ
トリプシン インヒビター１４．４に：α−ラクトアル
ブミン 上記第５図より、ＧＩＦは、分子量約１８Ｋに単一のバ
ンドとして泳動されることが判る。
トリプシン インヒビター１４．４に：α−ラクトアル
ブミン 上記第５図より、ＧＩＦは、分子量約１８Ｋに単一のバ
ンドとして泳動されることが判る。
等電点電気泳動法（ＩＥＦ）
上記（ＩＩ）で得たＧＩＦの等電点電気泳動を、ｐＨ範
囲３．５〜９．５のアンフオラインＰＡＧプレート（Ｌ
ＫＢ社製）及びモデル１４１５（バイオ−ラド社製）を
用いて行なった。
囲３．５〜９．５のアンフオラインＰＡＧプレート（Ｌ
ＫＢ社製）及びモデル１４１５（バイオ−ラド社製）を
用いて行なった。
その条件は次の通りである。
試 料：上記ＧＩＦ活性画分１０μＱを、２５ｍ ｆｖ
ｌのナトリウムフォスフェートバッファー（ｉｌｌ−１
７，４）で５倍希釈して用いた。
ｌのナトリウムフォスフェートバッファー（ｉｌｌ−１
７，４）で５倍希釈して用いた。
電極液：陽極液＝ＩＭＨａＰＯ４
陰極液−ＩＭＮ’ａＯＨ
泳動条件：定電力ＩＷ／ａｍゲル幅で９０分間冷却下（
１０℃）に泳動させた。
１０℃）に泳動させた。
染 色：染色は、シルバー スタイン キットで行なっ
た。
た。
上記泳動の結果を第６図に示す。該図においてレーン■
及び■は、分子量マーカー２０μＱの結果であり、レー
ン■は上記ＧＩＦ試料５０μＱの結果であり、レーン■
は、０．１％ＴＦＡ１０μＱをレーン■の試料と同様に
して希釈したもの（バッファー）５０μＱの結果を示す
。
及び■は、分子量マーカー２０μＱの結果であり、レー
ン■は上記ＧＩＦ試料５０μＱの結果であり、レーン■
は、０．１％ＴＦＡ１０μＱをレーン■の試料と同様に
して希釈したもの（バッファー）５０μＱの結果を示す
。
また上記泳動後、ゲルを５ｍｍ又は２ｍｍ間隔でスライ
スし、１０％ＦＣ８加ＲＰＭ１１６４０培地１鵬にて振
盪抽出（２日）し、ＧＩＦ活性の測定に供した。等電点
は、泳動後のｐＨの測定結果から算出した。
スし、１０％ＦＣ８加ＲＰＭ１１６４０培地１鵬にて振
盪抽出（２日）し、ＧＩＦ活性の測定に供した。等電点
は、泳動後のｐＨの測定結果から算出した。
上記結果を第７図に示す。第７図において横軸はスライ
スしたゲルＮｏ、を、縦軸はｐＨ勾配（破線で示される
）及びＧＩＦ活性（実線のグラフ）を示す。
スしたゲルＮｏ、を、縦軸はｐＨ勾配（破線で示される
）及びＧＩＦ活性（実線のグラフ）を示す。
第６図及び第７図よりＧＩＦの等電点（ｐＩ）は、７．
０２〜６．８８であり、この位置に単一のバンドとして
現れることが判る。
０２〜６．８８であり、この位置に単一のバンドとして
現れることが判る。
アミノ酸組成比
上記（ＩＩ）で得たＧＩＦを、加水分解（４Ｎ−メタン
スルホン酸、２４時間）後、オルトフタルアルデヒド（
ＯＰＡ）法により、アミノ酸アナライザー（日立製作所
製）を用いて分析した。
スルホン酸、２４時間）後、オルトフタルアルデヒド（
ＯＰＡ）法により、アミノ酸アナライザー（日立製作所
製）を用いて分析した。
その結果ＧＩＦは、ｐｈｅを基準として、以下のモル比
で各アミノ酸を含有するものと認められた。
で各アミノ酸を含有するものと認められた。
尚、上記分析条件下においては、ｐｒｏ及びＣｙｓは測
定できない。またＳｅｒ及びＴｈｒは同条件で一般に約
５〜１０％程度分解することが知られている。
定できない。またＳｅｒ及びＴｈｒは同条件で一般に約
５〜１０％程度分解することが知られている。
ア ミ ノ 酸 モ ル 比
Ａｓｐ及び／又はＡｓｎ １７．６Ｓｅｒ
１２．１ Ｔｈｒ ５．７ Ｇｌｕ及び／又はＧｌｎ ２３．ＩＧＩＶ
Ｂ、ｌ Ａ１８ ５．２ Ｖａｌ １１．８ １ｙｊｅｔ ５．６ １１ｅ ４．８
Ｌｅｕ １５．４Ｔ
ｙｒ ３．９Ｐｈｅ
（９）Ｌｙｓ
１５．３Ｈｔｓ
１．ＩＴｒｐ
Ｏ，８Ａｒａ
３．０アミノ酸配列 上記（ＩＩ）で得たＧＩＦのＮ端アミノ酸配列を、気相
シークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製）に
より決定した。
Ａｓｐ及び／又はＡｓｎ １７．６Ｓｅｒ
１２．１ Ｔｈｒ ５．７ Ｇｌｕ及び／又はＧｌｎ ２３．ＩＧＩＶ
Ｂ、ｌ Ａ１８ ５．２ Ｖａｌ １１．８ １ｙｊｅｔ ５．６ １１ｅ ４．８
Ｌｅｕ １５．４Ｔ
ｙｒ ３．９Ｐｈｅ
（９）Ｌｙｓ
１５．３Ｈｔｓ
１．ＩＴｒｐ
Ｏ，８Ａｒａ
３．０アミノ酸配列 上記（ＩＩ）で得たＧＩＦのＮ端アミノ酸配列を、気相
シークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製）に
より決定した。
その結果ＧＩＦのＮ端２０個のアミノ酸配列は、以下の
ものであると認められた。
ものであると認められた。
Ａ ｌａ −Ｐ ｒｏ−Ｖ ａｌ −Ａ ｒＱ −Ｓ
ｅｒ −Ｌ ｅｕ−Ａ ｓｎ −ＣＶＳ −Ｔ ｈｒ
−Ｌ ｅＵ −Ａ ｒＱ −Ａ Ｓ＋１− Ｓ ｅｒ
−ＧＩｎ −Ｑｌｎ−１−ｙｓ−８ｅｒ−１ｅｕ−１／
ａｔ−Ｊｅｔ尚、Ｎ末端より８番目のアミノ酸は、ＰＴ
Ｉ−１７ミノ酸として検出されなかったことがらＣｙＳ
と推定した。
ｅｒ −Ｌ ｅｕ−Ａ ｓｎ −ＣＶＳ −Ｔ ｈｒ
−Ｌ ｅＵ −Ａ ｒＱ −Ａ Ｓ＋１− Ｓ ｅｒ
−ＧＩｎ −Ｑｌｎ−１−ｙｓ−８ｅｒ−１ｅｕ−１／
ａｔ−Ｊｅｔ尚、Ｎ末端より８番目のアミノ酸は、ＰＴ
Ｉ−１７ミノ酸として検出されなかったことがらＣｙＳ
と推定した。
生理活性
上記（ＩＩ）で得たＧＩＦを、前記各種生理活性の測定
試験に供した結果、ＴＮＦ、ＩＮＦ、Ｃ８Ｆ、１ｍ−２
及びＢＣＤＦのいずれの活性も認められず、之等生理活
性物質とは明確に区別される異なる物質であることが判
ると共に、極めて均質であることが確認された。
試験に供した結果、ＴＮＦ、ＩＮＦ、Ｃ８Ｆ、１ｍ−２
及びＢＣＤＦのいずれの活性も認められず、之等生理活
性物質とは明確に区別される異なる物質であることが判
ると共に、極めて均質であることが確認された。
各種レクチンカラムに対する親和性試験上記（Ｉ）及び
＜ＩＩ）で得たＧＩＦの糖結合特異性を調べるために、
以下に示される各レクチンを用いてアフィニティークロ
マトグラフィー〔供試試料３６２４単位１０．０６１１
Ｂ］１０．５戒、ゲル容積１ｍＱ、洗浄液： ＰＢＳ−
−〇、００５％ＰＥＧ （但しＳＪＡについては０．０
５Ｍトリス−０，１５ＭＮａ ＣＱ、ｐ Ｈ８，７を使
用）、溶出液：各洗浄液に下記第１表に示す糖を添加し
た溶液〕により２等レクチンカラムに対するＧＩＦの結
合性を調べた。
＜ＩＩ）で得たＧＩＦの糖結合特異性を調べるために、
以下に示される各レクチンを用いてアフィニティークロ
マトグラフィー〔供試試料３６２４単位１０．０６１１
Ｂ］１０．５戒、ゲル容積１ｍＱ、洗浄液： ＰＢＳ−
−〇、００５％ＰＥＧ （但しＳＪＡについては０．０
５Ｍトリス−０，１５ＭＮａ ＣＱ、ｐ Ｈ８，７を使
用）、溶出液：各洗浄液に下記第１表に示す糖を添加し
た溶液〕により２等レクチンカラムに対するＧＩＦの結
合性を調べた。
結果を下記第１表に示す。尚各レクチンはいずれもイー
、ライ。ラボラトリ−（Ｅ、Ｙ。
、ライ。ラボラトリ−（Ｅ、Ｙ。
Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）社より入手した。
第１表
レクチン
ＣｏｎＡＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ ＡＷＧＡ
Ｗｈｅａｔ ＧｅｒｍＡｕｌｕｔｉｎｉｎＵ Ｅ Ａ
−Ｉ Ｕ ｔｅｘ ｅｕｒｏｐｅｕｓ Ａ ｇｇ
ｌｕｔｉｎｔｎＤ Ｂ Ａ Ｄ ｏｌｉｃｈｏｓ
ｂｉｆｌｏｒｕｓ Ａ ｇｇｌｕｔｉｎｉｎＷ Ｆ
Ａ Ｗ １ｓｔａｒｉａ ｆｌｏｒｉｂｕｎｄ
ａＡ ｇｇｌｕｔｉｎｉｎ Ｐ Ｎ Ａ Ｐ ｅａｎｕｔ Ａ ｇｇｌｕｔｔ
ｎｉｎＳ Ｂ Ａ Ｓ ｏｙｂｅａｎ Ａ ｇ
ｇｌｕｔｉｎｉｎＳ Ｊ Ａ Ｓ ｏｐｈｏｒａ
ｊａｐｏｎｉｃａ Ａ ｏｇｌｕＮｎｉｎレクチ
ン 溶 出 液 ド Ｗ Ｇ Ａ ０．２Ｍ −Ｎ−アセチルグルコサミ
ンＵＥＡ−Ｉ Ｏ，Ｏ５Ｍ−フコース Ｄ Ｂ Ａ Ｏ，ＩＭ −Ｎ−アセチルガラクトサ
ミンＷＦＡ （同 上） Ｐ Ｎ Ａ Ｏ，２Ｍ−ガラクトースＳＢＡ
（同 上） ＳＪＡ （同 上） レクチン 認識される糖鎖 ＣｏｎＡａ−Ｍａｎ＞α−Ｇｌｃ ＷＧＡ ＧＩｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃＵＥ
Ａ−Ｉ （同 上） ＤＢＡ α−ＧａｌＮＡｃ ＷＦＡ （同 上） ＰＮＡ β−Ｑａｌ ＳＢＡ Ｕ−ＧａｌＮＡｃ ＞β−ＧａｌＮＡｃ
ＳＪＡ β−ＧａｌＮＡｃ ＞β−Ｇａｌ上記（
Ｉ）で得たＧＩＦについての結果を、また第８図に示す
。図において縦軸は供試試料中に存在するＧＩＦ活性量
を１００％として、各レクチンカラムに吸着せず、通過
した両分（Ｗ）及びカラムに吸着し、溶出液により溶出
された画分（Ｅ）に含まれる活性量の割合を示し、横軸
は各レクチンカラムにおける各画分（Ｗ及びＥ）を示す
。
Ｗｈｅａｔ ＧｅｒｍＡｕｌｕｔｉｎｉｎＵ Ｅ Ａ
−Ｉ Ｕ ｔｅｘ ｅｕｒｏｐｅｕｓ Ａ ｇｇ
ｌｕｔｉｎｔｎＤ Ｂ Ａ Ｄ ｏｌｉｃｈｏｓ
ｂｉｆｌｏｒｕｓ Ａ ｇｇｌｕｔｉｎｉｎＷ Ｆ
Ａ Ｗ １ｓｔａｒｉａ ｆｌｏｒｉｂｕｎｄ
ａＡ ｇｇｌｕｔｉｎｉｎ Ｐ Ｎ Ａ Ｐ ｅａｎｕｔ Ａ ｇｇｌｕｔｔ
ｎｉｎＳ Ｂ Ａ Ｓ ｏｙｂｅａｎ Ａ ｇ
ｇｌｕｔｉｎｉｎＳ Ｊ Ａ Ｓ ｏｐｈｏｒａ
ｊａｐｏｎｉｃａ Ａ ｏｇｌｕＮｎｉｎレクチ
ン 溶 出 液 ド Ｗ Ｇ Ａ ０．２Ｍ −Ｎ−アセチルグルコサミ
ンＵＥＡ−Ｉ Ｏ，Ｏ５Ｍ−フコース Ｄ Ｂ Ａ Ｏ，ＩＭ −Ｎ−アセチルガラクトサ
ミンＷＦＡ （同 上） Ｐ Ｎ Ａ Ｏ，２Ｍ−ガラクトースＳＢＡ
（同 上） ＳＪＡ （同 上） レクチン 認識される糖鎖 ＣｏｎＡａ−Ｍａｎ＞α−Ｇｌｃ ＷＧＡ ＧＩｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃＵＥ
Ａ−Ｉ （同 上） ＤＢＡ α−ＧａｌＮＡｃ ＷＦＡ （同 上） ＰＮＡ β−Ｑａｌ ＳＢＡ Ｕ−ＧａｌＮＡｃ ＞β−ＧａｌＮＡｃ
ＳＪＡ β−ＧａｌＮＡｃ ＞β−Ｇａｌ上記（
Ｉ）で得たＧＩＦについての結果を、また第８図に示す
。図において縦軸は供試試料中に存在するＧＩＦ活性量
を１００％として、各レクチンカラムに吸着せず、通過
した両分（Ｗ）及びカラムに吸着し、溶出液により溶出
された画分（Ｅ）に含まれる活性量の割合を示し、横軸
は各レクチンカラムにおける各画分（Ｗ及びＥ）を示す
。
第８図よりＧＩＦは、上記各レクチンのいずれにも親和
性を示さず、従ってこれらの一般的糖鎖は結合していな
いことが認識された。
性を示さず、従ってこれらの一般的糖鎖は結合していな
いことが認識された。
また上記（ＩＩ）で得たＧ［Ｆについての結果も、上記
第８図と同様であった。
第８図と同様であった。
安 定 性
ＧＩＦの安定性試験を以下の通り行なった。尚、ＧＩＦ
としては上記（Ｉ）で得たもの及び（ＩＦ）で得たもの
をそれぞれ用いたがいずれの場合も同様の結果を与えた
。
としては上記（Ｉ）で得たもの及び（ＩＦ）で得たもの
をそれぞれ用いたがいずれの場合も同様の結果を与えた
。
ａ、温度安定性
ＧＩＦを第２表に示す各条件下で処理し、その温度安定
性を調べた。即ち上記ゲル濾過画分３５０３単位／鶴を
各温度でインキュベーションし、処理後の活性量を対照
群に対する残存活性％として求めた。結果を下記第２表
に示す。
性を調べた。即ち上記ゲル濾過画分３５０３単位／鶴を
各温度でインキュベーションし、処理後の活性量を対照
群に対する残存活性％として求めた。結果を下記第２表
に示す。
第 ２ 表
処 理 条 件 対照群に対する残存活性％３７℃、
１時間 ９７％ ５６℃、３０分間 ０％ ７０℃、３０分間 ０％ ８０℃、３０分間 ０％ ４℃、１時間 １００％（対照群）ｂ、ｐＨ
安定性 上記ａと同様にしてＧＩＦを第３表に示す各条件（温度
は４℃一定とした）下で処理し、そのＩＩＨ安定性を同
様にして求めた。結果を下記第３表に示す。
１時間 ９７％ ５６℃、３０分間 ０％ ７０℃、３０分間 ０％ ８０℃、３０分間 ０％ ４℃、１時間 １００％（対照群）ｂ、ｐＨ
安定性 上記ａと同様にしてＧＩＦを第３表に示す各条件（温度
は４℃一定とした）下で処理し、そのＩＩＨ安定性を同
様にして求めた。結果を下記第３表に示す。
第 ３ 表
処 理 条 件 対照群に対する残存活性％ｐＨ７，
４，５時間 １００％〈対照群）１１ Ｈ２，０，
５時間 ６０％１）Ｈ４，０，５時間 ８
０％ ｐ）１６．０．５時間 ９０％ ＋１８８．０，５時間 ９５％ ｐＨ９，５，５時間 ７５％ Ｃ０蛋白分解酵素に対する安定性 上記ａと同様にしてＧＩＦの各種蛋白分解酵素に対する
安定性を下記第４表に示す条件下に調べた。結果を同表
に示す。尚、トリプシンとしてはシグマ社製トリプシン
タイプ■、１２７００ＢＡＥＥ単位／１ｉｔ（ｌ蛋白
）を１１１１ｇ／ｍＱの濃度で用いた。またプロナーゼ
としては科研化学社製プロナーゼ（４５０００ｐ、ｕ
、ｋ ／（ｌ蛋白）を１ ｍｏ／鶴の濃度で利用した。
４，５時間 １００％〈対照群）１１ Ｈ２，０，
５時間 ６０％１）Ｈ４，０，５時間 ８
０％ ｐ）１６．０．５時間 ９０％ ＋１８８．０，５時間 ９５％ ｐＨ９，５，５時間 ７５％ Ｃ０蛋白分解酵素に対する安定性 上記ａと同様にしてＧＩＦの各種蛋白分解酵素に対する
安定性を下記第４表に示す条件下に調べた。結果を同表
に示す。尚、トリプシンとしてはシグマ社製トリプシン
タイプ■、１２７００ＢＡＥＥ単位／１ｉｔ（ｌ蛋白
）を１１１１ｇ／ｍＱの濃度で用いた。またプロナーゼ
としては科研化学社製プロナーゼ（４５０００ｐ、ｕ
、ｋ ／（ｌ蛋白）を１ ｍｏ／鶴の濃度で利用した。
第 ４ 表
処 理 条 件 残存活
性％リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ ７，４）処理（３７℃、２時間） １００％（対照群
） トリプシン処理（３７℃、２時間） ０％プロナー
ゼ処理（３７℃、２時間） ０％上記第４表より、
ＧＩＦはトリプシン処理及びプロナーゼ処理により失活
することが判る。
性％リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ ７，４）処理（３７℃、２時間） １００％（対照群
） トリプシン処理（３７℃、２時間） ０％プロナー
ゼ処理（３７℃、２時間） ０％上記第４表より、
ＧＩＦはトリプシン処理及びプロナーゼ処理により失活
することが判る。
ＧＩＦ活性の用量作用曲線
（ａ ）上記（Ｉ）で得たＧＩＦ試料１４４．６単位／
戒（蛋白濃度７２３ｎｏ／ｍ１２）を用いて、各種希釈
倍率におけるＧＩＦ活性の用量作用曲線を求めた。結果
を第９図に示す。図において横軸は試料の希釈倍率を、
縦軸はＧＩＦ活性（腫瘍細胞増殖抑制率）を示す。
戒（蛋白濃度７２３ｎｏ／ｍ１２）を用いて、各種希釈
倍率におけるＧＩＦ活性の用量作用曲線を求めた。結果
を第９図に示す。図において横軸は試料の希釈倍率を、
縦軸はＧＩＦ活性（腫瘍細胞増殖抑制率）を示す。
第９図より、ＧＩＦは数十ｎｇ／戒の用量で５０％程度
腫瘍細胞の増殖を抑制することが判る。
腫瘍細胞の増殖を抑制することが判る。
（ｂ）前記（ＩＩ）で得た天然型ＧＩＦの各種癌細胞に
対する抗腫瘍活性を、以下のコロニー抑制試験及び増殖
抑制試験により試験した。
対する抗腫瘍活性を、以下のコロニー抑制試験及び増殖
抑制試験により試験した。
コロニー抑制試験
１２ウ工ル組織培養プレート（コースタ−＜ｃｏｓｔｅ
ｒ ）社製）を用い、該プレートの各ウェルに各種供試
癌細胞を１０％ＦＯ８含有ＲＰＭＴ１６４０培地に２×
１０２〜５Ｘ１０２細胞／ウエル（５００ＩｉＱ／ウエ
ル）となる濃度で懸濁させた液を分注する。
ｒ ）社製）を用い、該プレートの各ウェルに各種供試
癌細胞を１０％ＦＯ８含有ＲＰＭＴ１６４０培地に２×
１０２〜５Ｘ１０２細胞／ウエル（５００ＩｉＱ／ウエ
ル）となる濃度で懸濁させた液を分注する。
上記各ウェルに、ＧＩＦ試料を最終濃度が１．６〜１０
００単位／脱となる所定量で加える。
００単位／脱となる所定量で加える。
またＧＩＦ試料無添加の対照を作成する。
上記各ウェルを３７℃で５％炭酸ガス存在下に、１週間
培養する。その後、培地をアスピレータ−で除去し、Ｃ
ａＣＱ２含有ＰＢＳ （ＰＢＳ＋ ）で２回洗浄し、１
００％メタノールで生成したコロニーを固定し、次にコ
ロニーをギムザ染色して計数する。
培養する。その後、培地をアスピレータ−で除去し、Ｃ
ａＣＱ２含有ＰＢＳ （ＰＢＳ＋ ）で２回洗浄し、１
００％メタノールで生成したコロニーを固定し、次にコ
ロニーをギムザ染色して計数する。
コロニー抑制率（％）は、次式により算出される。
コロニー抑制率（％）＝
１−試料のコロニー数 Ｘ１００
対照のコロニー数
供試癌細胞として、Ａ−５４９（ヒト肺癌細胞、ｈｕｍ
ａｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ、ＡＴＣ
ＣＣＣＬ１８５）を用いた結果を第１０図に示す。図に
おいて横軸はＧＩＦＩｆ１度（単位／謡）を、縦軸はコ
ロニー抑制率（％）を示す。
ａｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ、ＡＴＣ
ＣＣＣＬ１８５）を用いた結果を第１０図に示す。図に
おいて横軸はＧＩＦＩｆ１度（単位／謡）を、縦軸はコ
ロニー抑制率（％）を示す。
増殖抑制試験
９６ウ工ル組織培養プレート（コーニング（Ｃｏｒｎｉ
ｎｇ）社製）を用い、該プレートの各ウェルに各種供試
癌細胞を１０％ＦＣ８含有ＲＰＭ１１６４０培地に２Ｘ
１０３〜５×１０３細胞／ウエル（１００μＱ／ウエル
）となる濃度で懸濁させた液を分注する。
ｎｇ）社製）を用い、該プレートの各ウェルに各種供試
癌細胞を１０％ＦＣ８含有ＲＰＭ１１６４０培地に２Ｘ
１０３〜５×１０３細胞／ウエル（１００μＱ／ウエル
）となる濃度で懸濁させた液を分注する。
、上記各ウェルに、ＧｒＦ試料を最終濃度が１〜１００
０単位／綬培地となるように各々１００μＱづつ分注す
る。またＧＩＦ試料無添加の対照を作成する。
０単位／綬培地となるように各々１００μＱづつ分注す
る。またＧＩＦ試料無添加の対照を作成する。
上記各ウェル内細胞を３７℃で５％炭酸ガス存在下に４
〜５時間培養後、ウェルに更に０．０５％ニュートラル
レッドを５０μＱづつ加え、３７℃で５％炭酸ガス存在
下に、１時間インキュベートし、その後、各ウェルをＣ
ａＣＱ２不含ＰＢＳ（ＰＢＳ−）で洗浄し、色素抽出緩
衝液１００μＱづつを加え、各ウェルの５４０ ｎｍに
おける吸光度（０，Ｄ、）を測定する。
〜５時間培養後、ウェルに更に０．０５％ニュートラル
レッドを５０μＱづつ加え、３７℃で５％炭酸ガス存在
下に、１時間インキュベートし、その後、各ウェルをＣ
ａＣＱ２不含ＰＢＳ（ＰＢＳ−）で洗浄し、色素抽出緩
衝液１００μＱづつを加え、各ウェルの５４０ ｎｍに
おける吸光度（０，Ｄ、）を測定する。
増殖抑制率〈％）は、次式により算出される。
試料のＯＤ
増殖抑制率（％）−１−Ｘ１００
対照の００
供試癌細胞として、ＡＣＨＮ （ヒト腎臓アデノカルシ
ノーマ、ｈｕｍａｎ ｒｅｎａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃ
ｉｎｏｍａ。
ノーマ、ｈｕｍａｎ ｒｅｎａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃ
ｉｎｏｍａ。
ＡＴＣＣＣＲＬ’７６１１）を用いた結果を第１１図に
、また５Ｋ−８Ｒ−３（ヒトプレストアデノカルシノー
マ、ｈｕｍａｎ ｂｒｅａＳｔａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎ
ｏｍａ、 Ａ Ｔ ＣＣＨＴ Ｂ ３０）を用いた結果
を第１２図にそれぞれ示す。各図において横軸はＧＩＦ
濃度（単位／ｍ１２）を、縦軸は増殖抑制率（％）を示
す。
、また５Ｋ−８Ｒ−３（ヒトプレストアデノカルシノー
マ、ｈｕｍａｎ ｂｒｅａＳｔａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎ
ｏｍａ、 Ａ Ｔ ＣＣＨＴ Ｂ ３０）を用いた結果
を第１２図にそれぞれ示す。各図において横軸はＧＩＦ
濃度（単位／ｍ１２）を、縦軸は増殖抑制率（％）を示
す。
ＧＩＦ蛋白の一時構造の決定
（１）ヒト末梢血を採血し、フィコール・ハイバークの
密度勾配遠心法（［：ｕｒ、 Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ
、 ４゜８０８ （１９７４））により末梢血リンパ球
１．９Ｘ１０閲個を得た。
密度勾配遠心法（［：ｕｒ、 Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ
、 ４゜８０８ （１９７４））により末梢血リンパ球
１．９Ｘ１０閲個を得た。
このリンパ球を４Ｘ１０８／ｍＱの細胞濃度で、ヒト血
清５％を含むＲＰＭ１１６４０培地に懸濁させ、直径９
ｃｍのシャーレに分注後、５％炭酸ガス中、３７℃で１
時間培養した。その後、シャーし底部に付着していない
細胞を除去し、ウシ胎児血清１０％、ＴＰＡ （シグマ
（Ｓ ｉｇｍａ）社製）０．５ｎｇ／ｍＱ及びＬＰＳ
（デイフＩＩ（Ｄｉｒｃｏ）社製）１０μｇ／閾を含む
ＲＰＭ１１６４０培地にて細胞を刺激した。５％炭酸ガ
ス中、３７℃で４時間培養した後、ＰＢＳ及び０．０２
％ＥＤＴＡにて付着性リンパ球９Ｘ１０８個を得た。
清５％を含むＲＰＭ１１６４０培地に懸濁させ、直径９
ｃｍのシャーレに分注後、５％炭酸ガス中、３７℃で１
時間培養した。その後、シャーし底部に付着していない
細胞を除去し、ウシ胎児血清１０％、ＴＰＡ （シグマ
（Ｓ ｉｇｍａ）社製）０．５ｎｇ／ｍＱ及びＬＰＳ
（デイフＩＩ（Ｄｉｒｃｏ）社製）１０μｇ／閾を含む
ＲＰＭ１１６４０培地にて細胞を刺激した。５％炭酸ガ
ス中、３７℃で４時間培養した後、ＰＢＳ及び０．０２
％ＥＤＴＡにて付着性リンパ球９Ｘ１０８個を得た。
上記においてシャーレ底部に付着した細胞を同様の培養
条件でＬＰ８１０μ（］／ＴｌｌＩ２で刺激した後、経
時的に培養上清中のＧＩＦ活性を測定した。
条件でＬＰ８１０μ（］／ＴｌｌＩ２で刺激した後、経
時的に培養上清中のＧＩＦ活性を測定した。
結果を第１３図に示した。図において横軸は培養時間（
時間）であり、縦軸はＧＩＦ活性（単位／ｗｌ１２）で
ある。
時間）であり、縦軸はＧＩＦ活性（単位／ｗｌ１２）で
ある。
第１３図より、ＬＰＳ刺激４時間後より、ＧＩＦ活性が
培養上清中に出現し、従ってＧＩＦ蛋白質を産生するｍ
ＲＮＡは、ＬＰＳ刺激４時間後のヒト付着性細胞より
調製すればよいことが判る。
培養上清中に出現し、従ってＧＩＦ蛋白質を産生するｍ
ＲＮＡは、ＬＰＳ刺激４時間後のヒト付着性細胞より
調製すればよいことが判る。
（２）上記（１）に従い、ＴＰＡ ０．５ｎ（１／ｍ
Ｑ及びＬＰＳＩＯμｏ／ｍＱで４時間誘導したヒト付着
性リンパ球９Ｘ１０８細胞を、６Ｍ−グアニジンチオシ
アネート溶液（６Ｍ−グアニジンイソチオシアネート、
５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐｉ−１７，０）、０．１
Ｍ２−メルカプトエタノール、０．５％ザルコシル（Ｓ
ａｒｋｏｓｙｌ ） ３０ｍＱニＴ溶解後、Ｇ１８Ｇ注
射針をつけた５０ｍＧ注射筒を用いてＤＮＡをせん断し
た。この溶液に塩化セシウム（Ｃｓ ＣＱ）１２（＋を
添加し、完全に溶解させた後、その６．４ｍＱずつを５
．７Ｍ Ｃ３ＣＱ（５，７ＭＣ５Ｃ（１−０，１ＭＥ
ＤＴＡ）４鵬に重層し、ベックマンローター（Ｂ’ｅｃ
ｋｍａｎ Ｓ Ｗ −４０Ｔ ｉ ｒｏｔｏｒ ）に
て２５℃で３１５００ｒｔ１ｍで２０時間遠心した。沈
澱したＲＮＡのベレットを７０％エタノールで洗浄後、
ＴＥ温溶液１０ｍＭトリス・Ｈ（１，１１Ｈ７，５，１
ＭＭＥＤＴＡ）に溶解し、１／９容の３Ｍ酢酸ナトリウ
ム（ＤＨ５，２）及び２．２容のエタノールを加えて、
−７０℃で１時間放置した。４℃にて１５０００ｒｐｍ
で２０分間遠心し、ＲＮＡを回収し、ＴＥ温溶液溶解さ
せた。
Ｑ及びＬＰＳＩＯμｏ／ｍＱで４時間誘導したヒト付着
性リンパ球９Ｘ１０８細胞を、６Ｍ−グアニジンチオシ
アネート溶液（６Ｍ−グアニジンイソチオシアネート、
５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐｉ−１７，０）、０．１
Ｍ２−メルカプトエタノール、０．５％ザルコシル（Ｓ
ａｒｋｏｓｙｌ ） ３０ｍＱニＴ溶解後、Ｇ１８Ｇ注
射針をつけた５０ｍＧ注射筒を用いてＤＮＡをせん断し
た。この溶液に塩化セシウム（Ｃｓ ＣＱ）１２（＋を
添加し、完全に溶解させた後、その６．４ｍＱずつを５
．７Ｍ Ｃ３ＣＱ（５，７ＭＣ５Ｃ（１−０，１ＭＥ
ＤＴＡ）４鵬に重層し、ベックマンローター（Ｂ’ｅｃ
ｋｍａｎ Ｓ Ｗ −４０Ｔ ｉ ｒｏｔｏｒ ）に
て２５℃で３１５００ｒｔ１ｍで２０時間遠心した。沈
澱したＲＮＡのベレットを７０％エタノールで洗浄後、
ＴＥ温溶液１０ｍＭトリス・Ｈ（１，１１Ｈ７，５，１
ＭＭＥＤＴＡ）に溶解し、１／９容の３Ｍ酢酸ナトリウ
ム（ＤＨ５，２）及び２．２容のエタノールを加えて、
−７０℃で１時間放置した。４℃にて１５０００ｒｐｍ
で２０分間遠心し、ＲＮＡを回収し、ＴＥ温溶液溶解さ
せた。
かくして付着性リンパ球約９Ｘ１０８細胞から、全ＲＮ
Ａ２５０μ０を得た。
Ａ２５０μ０を得た。
次に、上記で得たＲＮＡからｍ ＲＮＡを取得するため
に、オリゴ（ｄＴ）−セルロース（Ｃｏｌｌａｂｏｒａ
ｔｉｖｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｉｎｃ、）を用いてカ
ラムクロマトグラフィーを行なった。吸着は、１０ｍＭ
トリス−ＨＣ＋！ （１）Ｈ７，５）、０．５ＭＮａ
ＣＱ 、１ｍ ＭＥＤ’ＴＡにて行ない、カラムを同溶
液にて洗浄後、１０ｍＭｔ−リス・Ｈ（１（ｌ］Ｈ７，
５）及び１ｍＭＥＤＴＡにてＲＮＡを溶出させた。
に、オリゴ（ｄＴ）−セルロース（Ｃｏｌｌａｂｏｒａ
ｔｉｖｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｉｎｃ、）を用いてカ
ラムクロマトグラフィーを行なった。吸着は、１０ｍＭ
トリス−ＨＣ＋！ （１）Ｈ７，５）、０．５ＭＮａ
ＣＱ 、１ｍ ＭＥＤ’ＴＡにて行ない、カラムを同溶
液にて洗浄後、１０ｍＭｔ−リス・Ｈ（１（ｌ］Ｈ７，
５）及び１ｍＭＥＤＴＡにてＲＮＡを溶出させた。
この結果、溶出されたｍ ＲＮＡ量は、１７．５μｇで
あった。
あった。
（３）上記（２）で得たｍ ＲＮＡから、次イテＣＤＮ
Ａを、インビトロで合成し、オカヤマーベルグのプラス
ミドベクター（Ｏｋａｙａｍａ、 Ｈ，ａｎｄＢｅｒｇ
、Ｐ、、Ｍｏ１． Ｃｅ１１．Ｂ ｉｏｌ、、 ２
． １６１（１９８２））を用いて組換え体ＤＮＡを作
成し、これをエシェリヒア コリーにトランスホームし
て、ＣＤＮＡライブラリーを作製した。各手法は次の通
りである。
Ａを、インビトロで合成し、オカヤマーベルグのプラス
ミドベクター（Ｏｋａｙａｍａ、 Ｈ，ａｎｄＢｅｒｇ
、Ｐ、、Ｍｏ１． Ｃｅ１１．Ｂ ｉｏｌ、、 ２
． １６１（１９８２））を用いて組換え体ＤＮＡを作
成し、これをエシェリヒア コリーにトランスホームし
て、ＣＤＮＡライブラリーを作製した。各手法は次の通
りである。
（３−１）ベクター・プライマーとリンカ−ＤＮＡの調
製 ｐ ＢＲ３２２−８Ｖ４０ （０，７１〜０．８６）Ｄ
ＮＡ４００／ｌを、ＫｐｎＩ （ＮＥＢ）７００単位で
、３７℃で５時間消化し、０．２５ＭＥＤＴＡ （ｐ
Ｈ８，０）４０μＱと１０％５ＤＳ２０μＱとの混液で
反応を停止させた後、等容のフェノール−クロロホルム
（１：１）で抽出し、エタノールにてＤＮＡを沈澱させ
、遠心後、７０％エタノールで洗浄し、ＤＮＡを回収し
た。得られたＤＮＡを１４０ｍＭカコジル酸ナトリウム
。
製 ｐ ＢＲ３２２−８Ｖ４０ （０，７１〜０．８６）Ｄ
ＮＡ４００／ｌを、ＫｐｎＩ （ＮＥＢ）７００単位で
、３７℃で５時間消化し、０．２５ＭＥＤＴＡ （ｐ
Ｈ８，０）４０μＱと１０％５ＤＳ２０μＱとの混液で
反応を停止させた後、等容のフェノール−クロロホルム
（１：１）で抽出し、エタノールにてＤＮＡを沈澱させ
、遠心後、７０％エタノールで洗浄し、ＤＮＡを回収し
た。得られたＤＮＡを１４０ｍＭカコジル酸ナトリウム
。
３０ｍＭトリス−ＨＣＱ （ｐＨ６，８）、１ｍＭＣ
ｏ Ｃ２０，０，１ｍ Ｍ ＤＴＴ及び０．２５ｍＭ
ｄＴＴＰ（α−３２Ｐ−ｄＴＴＰ ０．５μ
Ｃｉを含む）２００μＱに溶解させ、ターミナルトラン
スフェラーゼ（ＴＴａｓｅ 、ＰＬ）４００単位にて３
０分間ｄＴ鎖の伸長を行なわせ、０．２５Ｍ ＥＤＴ
Ａ２０μＱと１０％５ＤＳ１０μＱとを加えて反応を停
止させ、フェノール−クロロホルム抽出を４回繰返した
後、エタノール沈澱にてＤＮＡを回収した。この結果、
ｄＴ鎖は約７０塩基伸長された。
ｏ Ｃ２０，０，１ｍ Ｍ ＤＴＴ及び０．２５ｍＭ
ｄＴＴＰ（α−３２Ｐ−ｄＴＴＰ ０．５μ
Ｃｉを含む）２００μＱに溶解させ、ターミナルトラン
スフェラーゼ（ＴＴａｓｅ 、ＰＬ）４００単位にて３
０分間ｄＴ鎖の伸長を行なわせ、０．２５Ｍ ＥＤＴ
Ａ２０μＱと１０％５ＤＳ１０μＱとを加えて反応を停
止させ、フェノール−クロロホルム抽出を４回繰返した
後、エタノール沈澱にてＤＮＡを回収した。この結果、
ｄＴ鎖は約７０塩基伸長された。
次に、上記で得たＤＮＡを、ＨｐａＩ（ＮＥＢ）１７単
位を用いて、３７℃で６時間消化し、アガロース（低融
点アガロース、ＢＲＬ、１％）電気泳動にて約２．７ｋ
ｂのＤＮＡ断片の回収を行なった。
位を用いて、３７℃で６時間消化し、アガロース（低融
点アガロース、ＢＲＬ、１％）電気泳動にて約２．７ｋ
ｂのＤＮＡ断片の回収を行なった。
電気泳動後、エチジウムブロマイド０．５μΩ／戒にて
ＤＮＡを染色し、Ｕｖ照射下で約２，７ｋｂの断片を含
むアガロースを切り出し、５倍容の２０ｍＭトリス・Ｈ
ＣＱ （ｐ Ｈ８，０）−１ｍ ＭＥＤＴＡを加え、６
５℃で５分間でアガロースを溶解後、フェノール抽出、
フェノール−クロロホルム（１：１）抽出及びクロロホ
ルム抽出を順次行ない、エタノール沈澱にてＤＮＡを回
収した。
ＤＮＡを染色し、Ｕｖ照射下で約２，７ｋｂの断片を含
むアガロースを切り出し、５倍容の２０ｍＭトリス・Ｈ
ＣＱ （ｐ Ｈ８，０）−１ｍ ＭＥＤＴＡを加え、６
５℃で５分間でアガロースを溶解後、フェノール抽出、
フェノール−クロロホルム（１：１）抽出及びクロロホ
ルム抽出を順次行ない、エタノール沈澱にてＤＮＡを回
収した。
次にオリゴ（ｄＡ）セルロースカラムクロマトグラフィ
ーでベクタープライマーＤＮＡの精製を行なった。上記
ＤＮＡを１０ｍＭトリス・１−ＩＣＱ（ｐ Ｈ７，３）
−１ｍ ＭＥＤＴＡ−１ＭＮａ Ｃ（１緩衝液１ｍＱ
に溶かし、氷冷した後、同緩衝液で平衡化したカラムに
載せ、同緩衝液１戒で洗浄後、室温に戻して、１０ｍＭ
トリス−ＨＣＱ（１１Ｈ７，３） −１ｍ Ｍ ＥＤ
ＴＡで、ＤＮＡを溶出した。溶出のピーク画分を集め、
エタノール沈澱にＴＤＮＡを回収後、１０ｍＭトリス−
ＨＣＱ（ｐ）−１７，３＞−１ｍＭ ＥＤＴＡｌｏｏ
、ｃｌに溶かし、４℃で保存した。
ーでベクタープライマーＤＮＡの精製を行なった。上記
ＤＮＡを１０ｍＭトリス・１−ＩＣＱ（ｐ Ｈ７，３）
−１ｍ ＭＥＤＴＡ−１ＭＮａ Ｃ（１緩衝液１ｍＱ
に溶かし、氷冷した後、同緩衝液で平衡化したカラムに
載せ、同緩衝液１戒で洗浄後、室温に戻して、１０ｍＭ
トリス−ＨＣＱ（１１Ｈ７，３） −１ｍ Ｍ ＥＤ
ＴＡで、ＤＮＡを溶出した。溶出のピーク画分を集め、
エタノール沈澱にＴＤＮＡを回収後、１０ｍＭトリス−
ＨＣＱ（ｐ）−１７，３＞−１ｍＭ ＥＤＴＡｌｏｏ
、ｃｌに溶かし、４℃で保存した。
リンカ−ＤＮＡを次の通り調製した。即ち、ｐ ＢＲ３
２２−８Ｖ４０ （０，１９〜０．３２）ＤＮＡ１００
μＱを、ＰｓｔＩ （ＮＥＢ）１２０単位で、３７℃下
、１．５時間消化後、反応を停止させ、フェノール−ク
ロロホルム抽出、エタノール沈澱を行なった。ＤＮＡを
回収し、１４０ｍＭカコジル酸ナトリウム、３０ｍＭｔ
−リス・ＨＣＱ（Ｄ Ｈ６，８） 、１ｍ ＭＣＯＣ２
０、Ｏ，１ｍ ＭＤＴＴ、０．２５ｍ Ｍｄ ＧＴＰ
（１μＣｉのα−５２Ｐ−ｄ ＧＴＰを含む）５０μＱ
に溶解し、ＴＴａｓｅ６０単位を２０分間作用させた。
２２−８Ｖ４０ （０，１９〜０．３２）ＤＮＡ１００
μＱを、ＰｓｔＩ （ＮＥＢ）１２０単位で、３７℃下
、１．５時間消化後、反応を停止させ、フェノール−ク
ロロホルム抽出、エタノール沈澱を行なった。ＤＮＡを
回収し、１４０ｍＭカコジル酸ナトリウム、３０ｍＭｔ
−リス・ＨＣＱ（Ｄ Ｈ６，８） 、１ｍ ＭＣＯＣ２
０、Ｏ，１ｍ ＭＤＴＴ、０．２５ｍ Ｍｄ ＧＴＰ
（１μＣｉのα−５２Ｐ−ｄ ＧＴＰを含む）５０μＱ
に溶解し、ＴＴａｓｅ６０単位を２０分間作用させた。
この結果、１８残基のｄＧ鎖が付加された。反応停止後
、ＤＮＡを回収し、ＨｉｎｄＩ［［（宝酒造）５０単位
で消化し、前記したようにアガロース（１，８％）電気
泳動で約０．２８ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、２．３μ
ｇのリンカ−ＤＮＡを得た。
、ＤＮＡを回収し、ＨｉｎｄＩ［［（宝酒造）５０単位
で消化し、前記したようにアガロース（１，８％）電気
泳動で約０．２８ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、２．３μ
ｇのリンカ−ＤＮＡを得た。
（３−２）ｃ ＤＮＡの合成とｃ ＤＮＡライブラリー
の作製 ＲＮＡ５μｇを減圧乾燥した後、５ｍＭトリス・ＨＣＱ
（＋１ Ｈ８，３）１０μＱに溶解し、６５°Ｃで５
分間加熱した。直ちに３７℃に移し、反応混合液２０ｕ
Ｑ （５０ｍＭトリス・ＨＣＱ（ｐＨ８，３）、８ｍＭ
ＭＯＣ２０，３０１＋１ＭＫＣ（！。
の作製 ＲＮＡ５μｇを減圧乾燥した後、５ｍＭトリス・ＨＣＱ
（＋１ Ｈ８，３）１０μＱに溶解し、６５°Ｃで５
分間加熱した。直ちに３７℃に移し、反応混合液２０ｕ
Ｑ （５０ｍＭトリス・ＨＣＱ（ｐＨ８，３）、８ｍＭ
ＭＯＣ２０，３０１＋１ＭＫＣ（！。
０．３ｍＭＤＴＴ、２ｍ Ｍｄ ＮＴＰ、１０ｕＣｔα
−５２Ｐ−ｄ ＣＴＰ）を加え、５分間３７℃にて保温
した。
−５２Ｐ−ｄ ＣＴＰ）を加え、５分間３７℃にて保温
した。
ＲＴａｓｅ（リバーストランスクリブターゼ、生化学工
業社製）１０単位を加え、３７℃で１５分間反応させた
後、再度ＲＴａＳ０１０単位を加え、更に１５分間保温
した。０．２５＋＋＋ＭＥＤＴＡ（１１８，０＞２μＱ
と１０％５Ｏ８１μＱとを加えて反応を停止させた後、
フェノール−クロロホルム抽出を行ない、４Ｍ酢酸アン
モニウム２０μＱとエタノール８０μＱとを加え、１５
分間−７０℃で凍らせた後、室温で融解し、１５０００
ｒｐｍ 、４℃で１０分間遠心し、沈澱サ８６一 せた。沈澱を１０ｍＭ！−リス・ＨＣＱ（＋１ Ｈ７，
３）２０μＱに溶がし、４Ｍ酢酸アンモニウム１９μＱ
とエタノール８ｏμＱとを加え、再沈澱させた。
業社製）１０単位を加え、３７℃で１５分間反応させた
後、再度ＲＴａＳ０１０単位を加え、更に１５分間保温
した。０．２５＋＋＋ＭＥＤＴＡ（１１８，０＞２μＱ
と１０％５Ｏ８１μＱとを加えて反応を停止させた後、
フェノール−クロロホルム抽出を行ない、４Ｍ酢酸アン
モニウム２０μＱとエタノール８０μＱとを加え、１５
分間−７０℃で凍らせた後、室温で融解し、１５０００
ｒｐｍ 、４℃で１０分間遠心し、沈澱サ８６一 せた。沈澱を１０ｍＭ！−リス・ＨＣＱ（＋１ Ｈ７，
３）２０μＱに溶がし、４Ｍ酢酸アンモニウム１９μＱ
とエタノール８ｏμＱとを加え、再沈澱させた。
沈澱を回収し、７０％エタノールで洗った後、１４０ｍ
Ｍカコジル酸ナトリウム、３０ｍＭトリス・ＨＣ（！
（ｐ Ｈ６，８） 、１ｍ Ｍ Ｃｏ Ｃ＋２２．０
．１ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｕａポ’Ｊ Ａ及ヒ６６ｕ
Ｍ （α−５２Ｐ）ｄ ＣＴＰ （１０μＣｉ ）（７
）１５μＱに溶解した。ＴＴａｓｅ （Ｐ、Ｌ、）１
８単位を加え、３７℃で５分間反応させた後、０℃に急
冷し、０．２５Ｍ ＥＤＴＡｌ、３μＱと１０％ＳＤ
Ｓ Ｏ，６５μＱとで反応を停止させ、フェノール−
クロロホルム抽出及びエタノール沈澱を行なった。
Ｍカコジル酸ナトリウム、３０ｍＭトリス・ＨＣ（！
（ｐ Ｈ６，８） 、１ｍ Ｍ Ｃｏ Ｃ＋２２．０
．１ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｕａポ’Ｊ Ａ及ヒ６６ｕ
Ｍ （α−５２Ｐ）ｄ ＣＴＰ （１０μＣｉ ）（７
）１５μＱに溶解した。ＴＴａｓｅ （Ｐ、Ｌ、）１
８単位を加え、３７℃で５分間反応させた後、０℃に急
冷し、０．２５Ｍ ＥＤＴＡｌ、３μＱと１０％ＳＤ
Ｓ Ｏ，６５μＱとで反応を停止させ、フェノール−
クロロホルム抽出及びエタノール沈澱を行なった。
沈澱を遠心して回収後、Ｈｉｎｄｌ［［（宝酒造）４単
位で３７℃で２時間消化し、反応停止後、フェノール−
クロロホルム抽出し、エタノール沈澱を行なった。沈澱
を回収後、１０ｍＭｌ−リス・ＨＣＱ （＋）Ｈ７，３
）及び１ｍ ＭＥＤＴＡの１゜μＱに溶かし、エタノー
ル３μＱを加え、−２０℃で保存した。
位で３７℃で２時間消化し、反応停止後、フェノール−
クロロホルム抽出し、エタノール沈澱を行なった。沈澱
を回収後、１０ｍＭｌ−リス・ＨＣＱ （＋）Ｈ７，３
）及び１ｍ ＭＥＤＴＡの１゜μＱに溶かし、エタノー
ル３μＱを加え、−２０℃で保存した。
上記で得た試料１μＱをリンカ−Ｄ Ｎ Ａ ５ ｎｏ
と共に、１０ｍＭトリス−ＨＣ（１（ｐ Ｈ７，５）−
１ｍ ＭＥＤＴＡ−０，１’ＭＮａ ＣＱｌ ０μＱ中
で、６５℃で２分間、次いで４２℃で３０分間保温した
後、０℃に冷却した。これに２０ｍＭトリス・ＨＣＱ
＜１）８７．５） 、４ｍ Ｍ Ｍｌｌ ＣＱ２．１
０ｍＭ （ＮＨ，！ ＞２ Ｓｏ、ｌ 、Ｏ，ＩＭ
ＫＣＱ。
と共に、１０ｍＭトリス−ＨＣ（１（ｐ Ｈ７，５）−
１ｍ ＭＥＤＴＡ−０，１’ＭＮａ ＣＱｌ ０μＱ中
で、６５℃で２分間、次いで４２℃で３０分間保温した
後、０℃に冷却した。これに２０ｍＭトリス・ＨＣＱ
＜１）８７．５） 、４ｍ Ｍ Ｍｌｌ ＣＱ２．１
０ｍＭ （ＮＨ，！ ＞２ Ｓｏ、ｌ 、Ｏ，ＩＭ
ＫＣＱ。
０．１ｍＭ β−ＮＡＤ１５０μｇ ／ｍ１２ＢｓＡ
及び６単位／ｍＱエシェリヒア コリーＤＮＡリガーゼ
の混合溶液を９０μＱ加え、全液量を１００μＱとし、
１２℃で一夜保存した。
及び６単位／ｍＱエシェリヒア コリーＤＮＡリガーゼ
の混合溶液を９０μＱ加え、全液量を１００μＱとし、
１２℃で一夜保存した。
次いで、”ＩＯｒｎＭ ｄＮＴＰ ０．５ｔｌＱ。
１１０１ｎ ＮＡＤ ０．５６１１Ｑ、Ｅ、：１ｌ
Ｊ−ＤＮＡポリメラーゼ■（ベーリンガーマンハイム社
製）０．５μＱ及びＲＮａｓｅ Ｈ（ＰＬ） ０．２μ
Ｑを加え、１２℃及び２５℃で順次１時間ずつ保温した
後、−２０”Ｃで凍結保存した。
Ｊ−ＤＮＡポリメラーゼ■（ベーリンガーマンハイム社
製）０．５μＱ及びＲＮａｓｅ Ｈ（ＰＬ） ０．２μ
Ｑを加え、１２℃及び２５℃で順次１時間ずつ保温した
後、−２０”Ｃで凍結保存した。
エシェリヒア コリーＨ８１０１株を、ＬＢ培地（バク
トートリプトン１０ｇ、バクトーイースト抽出物５ｇ及
びＮａＣＱＩＯｇ／ｌにて、ｏＤ５５０＝０．４５まで
培養し、５ 分間水冷後、４℃でｓ ｏ ｏ ｏ ｒｐ
ｍで５分間遠心して菌体を回収した。菌体のベレットを
氷冷した３０ｍＭ酢酸カリウム、１００ｍＭ ＲｂＣ
Ｑ、１０ｍＭＣａ ＣＱ２．５０ｍ Ｍ Ｍｎ ＣＱ
、１５％グリセリンに懸濁させ、０℃で５分間保ち、４
℃、８０００ｒｐｍ、５分間遠心し、得られた菌体を、
１０ｍＭ ＭＯＰＳ（モルホリノブロパンスルボニツ
クアシッド＞、７５ｍＭ Ｃａ ＣＱ２．１０ｍＭ
ＲｂＣＱ、１５％グリセリンに再度懸濁させ、０℃に
て１５分間保温して、コンピテント細胞を作製した。か
くして得られたコンピテント細胞は、その後−７０℃で
保存した。
トートリプトン１０ｇ、バクトーイースト抽出物５ｇ及
びＮａＣＱＩＯｇ／ｌにて、ｏＤ５５０＝０．４５まで
培養し、５ 分間水冷後、４℃でｓ ｏ ｏ ｏ ｒｐ
ｍで５分間遠心して菌体を回収した。菌体のベレットを
氷冷した３０ｍＭ酢酸カリウム、１００ｍＭ ＲｂＣ
Ｑ、１０ｍＭＣａ ＣＱ２．５０ｍ Ｍ Ｍｎ ＣＱ
、１５％グリセリンに懸濁させ、０℃で５分間保ち、４
℃、８０００ｒｐｍ、５分間遠心し、得られた菌体を、
１０ｍＭ ＭＯＰＳ（モルホリノブロパンスルボニツ
クアシッド＞、７５ｍＭ Ｃａ ＣＱ２．１０ｍＭ
ＲｂＣＱ、１５％グリセリンに再度懸濁させ、０℃に
て１５分間保温して、コンピテント細胞を作製した。か
くして得られたコンピテント細胞は、その後−７０℃で
保存した。
凍結菌液を室温で融解し、４００μＱの菌液に対して上
記ＤＮＡ試料２０μＱを加え、３０分分間℃に放置した
後、４２℃で９０秒間熱シヨツクを与え、再び０℃で１
〜２分間静置した。これにＬＢ培培地２ｍ合加え、３７
℃で３０分間保温し、５０容のＬＢ培地に植菌し、３７
℃で６時間培養した後、５０Ｍｇ／−になるようにアン
ピシリンを加え、更に一夜培養し、ＣＤＮＡライブラリ
ーを作製した。このｃ ＤＮＡライブラリーは、５０％
グリセリン中で一２０℃にて保存した。
記ＤＮＡ試料２０μＱを加え、３０分分間℃に放置した
後、４２℃で９０秒間熱シヨツクを与え、再び０℃で１
〜２分間静置した。これにＬＢ培培地２ｍ合加え、３７
℃で３０分間保温し、５０容のＬＢ培地に植菌し、３７
℃で６時間培養した後、５０Ｍｇ／−になるようにアン
ピシリンを加え、更に一夜培養し、ＣＤＮＡライブラリ
ーを作製した。このｃ ＤＮＡライブラリーは、５０％
グリセリン中で一２０℃にて保存した。
（３−３）合成、プローブの作製
前記で決定された天然型ＧＩＦのアミノ酸配列（Ｎ末端
より２０残基）より、下記核酸配列を導いた。
より２０残基）より、下記核酸配列を導いた。
Ａｌａ −Ｐｒｏ −Ｖａｌ −Ａｒｏ −３ｅｒ
−Ｌｅｕ −Ａｓｎ −Ｃｙｓ −５’ ＧＣＣＣＣＣ
ＧＴＧ ＡＧＧ ＴＣＣＣＴＧ ＡＡＣＴＧＣ３’ Ｃ
ＧＧ ＧＧＧ ＣＡＣＴＣＣＡＧＧ ＧＡＣＴＴＧ
ＡＣＧＴｈｒ −Ｌｅｕ −Ａｒｇ −ＡＳＦ
） −５ｅｒ −Ｇｌｎ −Ｇｌｎ −Ｌｙｓ
−ＡＣＣＣＴＧ ＡＧＧ ＧＡＣＴＣＣＣＡＧ
ＣＡＧ ＡＡＧＴＧＧ ＧＡＣＴＣＣＣＴＧ
ＡＧＧ ＧＴＣＧＴＣＴＴＣ３ｅｒ −１ｅｕ
−ｙａｌ −ＭｅｔＴＣＣＣＴＧ ＧＴＧ Ａ
ＴＧ−３’ＡＧＧ ＧＡＣＣＡＣＴＡＣ−５’ 上上記塩基列は、ヒトコドン使用頻度〔ヌクレイツク
アシッド リサーチ（Ｎ ｕｃｌｅｉｃ Ａ ａｉｄ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ 、 ９． ｒ ４３−７４ （１９
８１，）より決定した。
−Ｌｅｕ −Ａｓｎ −Ｃｙｓ −５’ ＧＣＣＣＣＣ
ＧＴＧ ＡＧＧ ＴＣＣＣＴＧ ＡＡＣＴＧＣ３’ Ｃ
ＧＧ ＧＧＧ ＣＡＣＴＣＣＡＧＧ ＧＡＣＴＴＧ
ＡＣＧＴｈｒ −Ｌｅｕ −Ａｒｇ −ＡＳＦ
） −５ｅｒ −Ｇｌｎ −Ｇｌｎ −Ｌｙｓ
−ＡＣＣＣＴＧ ＡＧＧ ＧＡＣＴＣＣＣＡＧ
ＣＡＧ ＡＡＧＴＧＧ ＧＡＣＴＣＣＣＴＧ
ＡＧＧ ＧＴＣＧＴＣＴＴＣ３ｅｒ −１ｅｕ
−ｙａｌ −ＭｅｔＴＣＣＣＴＧ ＧＴＧ Ａ
ＴＧ−３’ＡＧＧ ＧＡＣＣＡＣＴＡＣ−５’ 上上記塩基列は、ヒトコドン使用頻度〔ヌクレイツク
アシッド リサーチ（Ｎ ｕｃｌｅｉｃ Ａ ａｉｄ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ 、 ９． ｒ ４３−７４ （１９
８１，）より決定した。
上記式に示した塩基配列に対する相補的な塩基配列（最
下段に示す）を、ＧＩＦをコードするｃ ＤＮＡを有す
る形質転換株の選出のためのプローブとして利用するた
め、以下の方法により合成した。即ち、Ｎ、Ｎ−ジアル
キルメチルホスホロアミダイト誘導体を綜合ユニットと
して用いた、同相ホスファイト トリエステル法（Ｎ
ａｔｕｒｅ。
下段に示す）を、ＧＩＦをコードするｃ ＤＮＡを有す
る形質転換株の選出のためのプローブとして利用するた
め、以下の方法により合成した。即ち、Ｎ、Ｎ−ジアル
キルメチルホスホロアミダイト誘導体を綜合ユニットと
して用いた、同相ホスファイト トリエステル法（Ｎ
ａｔｕｒｅ。
３１０．１０５ （１９８４））にて、自動合成機（３
８０Ａ ＤＮＡ ５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、 Ａ
ｐｐｌｉｅｄＢ ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉ ｎｃ、Ｆ
、ｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ９４４
０４、ＵＳＡ）を用いて、目的とする完全像ｌＤＮＡを
合成した。続いて該完全像ｌＤＮＡを２８％アンモニア
水で５５℃で１０時間処理することにより、５′末端の
ＯＨ基に結合している保護基としてのＤＭＴｒ （ジ
メトキシトリチル）基以外の保護基（Ａ、ＧｌＣのアミ
ノ基のアシル基をさす）を脱保護させ、部分保護［）Ｎ
Ａ（ＤＭＴｒ体）を得た。次いでこのＤＭＴｒ体をＣ＋
ａを担体とする逆相ＨＰＬＣにより精製した後、８０％
酢酸で室温で１０分間処理して上記ＤＭＴｒ基を脱離さ
せ、続いて得られる塩基を、７Ｍ尿素を含む１０％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動及びバイオ−ゲルＰ−３０
（バイオ−ラド社）により精製して、目的のＤＮＡ （
６０ｍｅｒ ）を得た。
８０Ａ ＤＮＡ ５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、 Ａ
ｐｐｌｉｅｄＢ ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉ ｎｃ、Ｆ
、ｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ９４４
０４、ＵＳＡ）を用いて、目的とする完全像ｌＤＮＡを
合成した。続いて該完全像ｌＤＮＡを２８％アンモニア
水で５５℃で１０時間処理することにより、５′末端の
ＯＨ基に結合している保護基としてのＤＭＴｒ （ジ
メトキシトリチル）基以外の保護基（Ａ、ＧｌＣのアミ
ノ基のアシル基をさす）を脱保護させ、部分保護［）Ｎ
Ａ（ＤＭＴｒ体）を得た。次いでこのＤＭＴｒ体をＣ＋
ａを担体とする逆相ＨＰＬＣにより精製した後、８０％
酢酸で室温で１０分間処理して上記ＤＭＴｒ基を脱離さ
せ、続いて得られる塩基を、７Ｍ尿素を含む１０％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動及びバイオ−ゲルＰ−３０
（バイオ−ラド社）により精製して、目的のＤＮＡ （
６０ｍｅｒ ）を得た。
上記で得たＤＮＡ６μｇを、５０μＱの反応溶液（５０
ＩＩＩＭトリス・ＨＣＱ （ｐ Ｈ７，６）、Ｉ Ｑｍ
Ｍ Ｍ（Ｉ ＣＱ ２．１０ｍ Ｍ ２−メルカ
プトエタノール、０．２ｍ（１／ＩＩＩＱ子牛胸腺ＤＮ
Ａ、５０μＣｉ Ｃα−５２Ｐ〕−ＡＴＰ）中で、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）１２単位と、３
７℃にて１時間反応させ、ＤＮＡの５′末端をラベルし
た。ラベルされたＤＮＡと未反応の３２ｐを分別するた
めに、バイオゲルＰ−３０（バイオ−ラド社）によるカ
ラムクロマトグラフィーを行なった。ラベルされたＤＮ
Ａ画分を１／９容の３Ｍ酢酸ナトリウムと２．５容のエ
タノールにて沈澱させ、遠心して、回収後、１０ｍＭト
リス・ＨＣ（１（１）Ｈ８，０）−１１１１Ｍ ＥＤ
ＴＡ４００μＱに溶解し、−２０℃で保存した。
ＩＩＩＭトリス・ＨＣＱ （ｐ Ｈ７，６）、Ｉ Ｑｍ
Ｍ Ｍ（Ｉ ＣＱ ２．１０ｍ Ｍ ２−メルカ
プトエタノール、０．２ｍ（１／ＩＩＩＱ子牛胸腺ＤＮ
Ａ、５０μＣｉ Ｃα−５２Ｐ〕−ＡＴＰ）中で、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）１２単位と、３
７℃にて１時間反応させ、ＤＮＡの５′末端をラベルし
た。ラベルされたＤＮＡと未反応の３２ｐを分別するた
めに、バイオゲルＰ−３０（バイオ−ラド社）によるカ
ラムクロマトグラフィーを行なった。ラベルされたＤＮ
Ａ画分を１／９容の３Ｍ酢酸ナトリウムと２．５容のエ
タノールにて沈澱させ、遠心して、回収後、１０ｍＭト
リス・ＨＣ（１（１）Ｈ８，０）−１１１１Ｍ ＥＤ
ＴＡ４００μＱに溶解し、−２０℃で保存した。
得られたプローブの比活性は１１０７ｃｐ／μｑＤＮＡ
以上であった。
以上であった。
（３−４）ＣＤＮＡライブラリーのスクリーニン＝９３
− アンピシリン５０μ（Ｊ／ｍｆｌを含むＬＢ寒天培地上
に径８Ｑｍｍのニトロセルロースフィルター（ミリポア
ＨＡＩＦ○８２５０）を置き、この上にフィルター当り
５０００コロニーになるように希釈した前記ｃ ＤＮＡ
ライブラリー菌液を播き、３７℃にて一夜培養した。フ
ィルターは、合計２４枚を作製した。
− アンピシリン５０μ（Ｊ／ｍｆｌを含むＬＢ寒天培地上
に径８Ｑｍｍのニトロセルロースフィルター（ミリポア
ＨＡＩＦ○８２５０）を置き、この上にフィルター当り
５０００コロニーになるように希釈した前記ｃ ＤＮＡ
ライブラリー菌液を播き、３７℃にて一夜培養した。フ
ィルターは、合計２４枚を作製した。
コロニーの出現したフィルターに新しいニトロセルロー
スフィルターを載せることによって、レプリカフィルタ
ーを作製した。
スフィルターを載せることによって、レプリカフィルタ
ーを作製した。
元のフィルター（マスターフィルター）を、４℃にて保
存し、レプリカフィルターを、上記した寒天培地上で３
７℃で６時間培養後、クロラムフェニコール２００μｇ
／Ｔｌ１１２を含むＬＢ寒天培地上に移し替え、３７℃
で一夜培養した。
存し、レプリカフィルターを、上記した寒天培地上で３
７℃で６時間培養後、クロラムフェニコール２００μｇ
／Ｔｌ１１２を含むＬＢ寒天培地上に移し替え、３７℃
で一夜培養した。
フィルターを、０．５Ｎ Ｎａ ＯＨ，１Ｍトリス・
）−ＩＣＱ （１１８８，Ｏ）及び１Ｍトリス・ＨＣ（
１（ＦＩＨ８，Ｏｌｌ、５Ｍ ＮａＣＱの順で処理し
、風乾後、８０℃真空下で２時間ベーキングを行なった
。
）−ＩＣＱ （１１８８，Ｏ）及び１Ｍトリス・ＨＣ（
１（ＦＩＨ８，Ｏｌｌ、５Ｍ ＮａＣＱの順で処理し
、風乾後、８０℃真空下で２時間ベーキングを行なった
。
ベーキング済みのフィルターを、１．２ＭＮａ ＣＱ、
０．１２Ｍクエン１１ｉ３ナトリウム、１０ｍｑ／ｍＱ
フイＤ−／Ｌ／ （Ｆ １ｃｏｌｌ ） 、１０ｍａ／
ｍ１ｌｌポリビニルピロリジン、１０１１１（］／ＴＩ
ＩＱＢＳＡ。
０．１２Ｍクエン１１ｉ３ナトリウム、１０ｍｑ／ｍＱ
フイＤ−／Ｌ／ （Ｆ １ｃｏｌｌ ） 、１０ｍａ／
ｍ１ｌｌポリビニルピロリジン、１０１１１（］／ＴＩ
ＩＱＢＳＡ。
０．１％ＳＯ８及び０．１１１１（１／ＩＩＩＱサルモ
ン スペ５ム（Ｓａｌｍｏｎ Ｓｐｅｒｍ） ＤＮＡの
２０鶴中で軽く振盪しながら、６８°Ｃにて一夜保温し
た。溶液を１．２ＭＮａ ＣＱ、０．１２Ｍクエン酸３
ナトリウム、１０ｍｏ／ｍＱフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ
） 、１０ｍｇ／ｍＱポリビニルピロリジン、１０＋
１１０／１Ｉ１２ＢｓＡ。
ン スペ５ム（Ｓａｌｍｏｎ Ｓｐｅｒｍ） ＤＮＡの
２０鶴中で軽く振盪しながら、６８°Ｃにて一夜保温し
た。溶液を１．２ＭＮａ ＣＱ、０．１２Ｍクエン酸３
ナトリウム、１０ｍｏ／ｍＱフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ
） 、１０ｍｇ／ｍＱポリビニルピロリジン、１０＋
１１０／１Ｉ１２ＢｓＡ。
０．１％ＳＤＳ及び１０６ｃｐｍ ／＋ｎＱプローブに
替え、４２℃で一昼夜軽く振盪し、ハイブリダイゼーシ
ョンを行なった。
替え、４２℃で一昼夜軽く振盪し、ハイブリダイゼーシ
ョンを行なった。
ハイブリダイゼーションの終わったフィルターを取り出
し、１．２ＭＮａ ＣＱ、０．１２Ｍクエン酸ナトリウ
ム、０．１％ＳＤＳにて室温で３回洗浄し、その後、６
０℃で同溶液にてフィルターのバックグラウンドのカウ
ントがＧＭササ−イメーターで２００ ｃｐｍになるま
で洗浄した。
し、１．２ＭＮａ ＣＱ、０．１２Ｍクエン酸ナトリウ
ム、０．１％ＳＤＳにて室温で３回洗浄し、その後、６
０℃で同溶液にてフィルターのバックグラウンドのカウ
ントがＧＭササ−イメーターで２００ ｃｐｍになるま
で洗浄した。
フィルターを」軟接、増感紙を用いてＸ線フィルム（フ
ジＲＸ）に−７０℃にて２日間オートラジオグラムを行
なった。
ジＲＸ）に−７０℃にて２日間オートラジオグラムを行
なった。
フィルムを現像後、シグナル領域に存在するコロニーを
マスターフィルターよりかき取り、上記の方法を繰返し
てポジティブシグナルを有するコロニーの単離を行なっ
た。
マスターフィルターよりかき取り、上記の方法を繰返し
てポジティブシグナルを有するコロニーの単離を行なっ
た。
その結果、強いシグナルを有するクローンＴ−２を単離
した。
した。
（３−５）クローンの解析
クローンＩ−２の有するプラスミドＩ）ＧＩＦ−αのＣ
ＤＮＡの制限酵素地図を作製した。
ＤＮＡの制限酵素地図を作製した。
その結果を第１４図に示す。
第１４図よりｃ ＤＮＡ中には、ＮｃｏＩ（日本ジーン
）、Ｈｉｎｄｌｌ（日本ジーン）、ＰｖｕＩＩ（日本ジ
ーン）及びＡｃｃＩ（日本ジーン）により切断される個
所がそれぞれ１個所ずつ存在し、５′末端よりその順序
で之等制限醇素による切断個所が存在していることが確
認された。また、ＣＤＮＡの長さは、約ｉ、５ｋｂであ
り、分子量約１８にのＧＩＦを充分にコードできる長さ
であることが確認された。
）、Ｈｉｎｄｌｌ（日本ジーン）、ＰｖｕＩＩ（日本ジ
ーン）及びＡｃｃＩ（日本ジーン）により切断される個
所がそれぞれ１個所ずつ存在し、５′末端よりその順序
で之等制限醇素による切断個所が存在していることが確
認された。また、ＣＤＮＡの長さは、約ｉ、５ｋｂであ
り、分子量約１８にのＧＩＦを充分にコードできる長さ
であることが確認された。
次に、ｐＧＩＦ−αのｃ ＤＮＡの塩基配列を、マキサ
ム−ギルバートの化学修飾法（ｌｙｌｅｔｈ。
ム−ギルバートの化学修飾法（ｌｙｌｅｔｈ。
Ｅｎｚｙｍ、６５．４９９−５６０．１９８０）及びＭ
１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法
（Ｍｅｓｓｉｎｇ、 Ｊ、 ａｎｄ Ｖｉｅｉｒａ 、
Ｊ 、。
１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法
（Ｍｅｓｓｉｎｇ、 Ｊ、 ａｎｄ Ｖｉｅｉｒａ 、
Ｊ 、。
Ｇｅｎｅ 、 １９．２６９−２７６ （１９８２）
）ニて決定した。その結果を下記式に示す。
）ニて決定した。その結果を下記式に示す。
ＣＴＴＡＴＴＡＣＡＧＴＧＧＣＡＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡ
ＣＴＴＧＴＴＣＴＴＴＧＡＡＧＣＴＧＡＴＧＧＣＣＣＴ
ＡＡＡＣＡＧＡＴＧＡＡＧＭｅｔ ＬＶＳ ＴＧＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＧＡＣＣＴＣＴ
ＧＣＣＣＴＣＴＧｃｙｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｇｌ
ｎ ＡＳｐＬｅｕ ＡＳＩ） Ｌｅｕ Ｃｙｓ
ｐｒｏ １−ｅｕＧＡＴＧＧＣＧＧＣＡＴＣＣＡ
ＧＣＴＡＣＧＡＣＴＣＴＣＣＧＡＣＯＡＣＡＳＩＩ
Ｇｌｙ Ｇｌｌ／ Ｉｌｅ Ｇｌｎ ＬｅｌＪ
Ａｒｇｌｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｐ ＨｉｓＣＡ
ＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＧＧＣＴＴＣＡＧＧＣＡＧＧＣＣ
ＧＣＧＴＣΔＨｉｓ Ｔｙｒ Ｓｅｒ ＬＶｓ
Ｇｌｙ ｐｈｅ ＡｒＯＧｉｎ Ａｌａ Ａ
ｌａ ５ｅｒＧＴＴＧＴＴＧＴＧＧＣＣＡＴＧＧＡＣ
ＡＡＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＶａｔ ｖａｔ
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Ｌｅｕ ＡｒＧ Ｌｙｓ ＭｅｔＣＴＧＧＴＴＣ
ＣＣＴＧＣＣＣＡＣＡＧＡＣＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧＡＡ
Ｔしｅｕ Ｖａｌ ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ
Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ
ＡｓｎＧＡＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＴＴＴＣＣＣ
ＴＴＣＡＴＣＴＴＴＧＡＡＡＳｐｌｅｕ ３ｅｒ
Ｔｈｒ Ｐｈｅ ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ
Ｉｌｅ ＰｈＣＧｌｕＣＴＧＡＡＣＴＧＣＡＣＧＣＴ
ＣＣＧＧＧＡＣＴＣＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＳｅｒ ｌ
ｅｕ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ
Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ ＬｙｓＧＣＴＣＴＣＣＡ
ＣＣＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴＡＴＧＧＡＧＣＡＡ
Ａｌａ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇ
ｌｎ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｕ ＧｌｕＣＡＡＧＴＧＧ
ＴＧＴＴＣＴＣＣＡＴＧＴＣＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＧ
ＡＧｌｎ Ｖａｌ Ｖａｔ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｍｅ
ｔ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇｌｎ ＧｌｙＧＡＡＧ
ＡＡＡＧＴＡＡＴＧＡＣＡＡＡＡＴＡＣＣＴＧＴＧＧＣ
ＣＴＴＧＧｌｕ Ｑｌｕ ３ｅｒ Ａｓｎ Ａ
ｓｐ ＬＶＳ Ｉｌｅ ｐｒｏ Ｖａｌ Ａ
ｌａ １ｅｕＧＧＣＣＴＣＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＡＴ
ＣＴＧＴＡＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＧｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙ
ｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｌｕｅ Ｔｙｒ Ｌｅｕ
Ｓｅｒ ＣｙｓＧＴＧＴＴＧＡＡＡＧＡＴＧＡＴＡＡ
ＧＣＣＣＡＣＴＣＴＡＣＡＧＣＴＧＶａｔ Ｌｅｕ
ＩＪｓ ＡＳｐＡＳＩ） Ｌｌ／Ｓ Ｐｒｏ Ｔｈｒ
Ｌｅｕ ｌ−１１ｎ １ｅｕＧＡＧＡＧＴＧＴＡＧＡＴ
ＣＣＣＡＡＡＡＡＴＴＡＣＣＣＡＡＡＧＡＡＧＧｌｕ
Ｓｅｒ Ｖａｌ ＡＳＤ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｔ
ｙｒ ｐｒｏ ｔ−ｙｓ ＬＶＳＧｉｌｌ Ｉｌｅ
Ａｓｎ ＡＳｎ ＬＪｓ １−ｅｕ Ｇｌｕ ｐｈｅ
Ｑｌｕ Ｓｅｒ ＡｌａＣＡＧＴＴＣＣＣＣＡＡＣＴＧ
ＧＴＡＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＴＣＴＣＡＡＧｌｎ Ｐ
ｈｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｉ
ｌｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ ＧｌｎＧＣＡ
ＧＡＡＡＡＣＡＴＧＣＣＣＧＴＣＴＴＣＣＴＧＧＧＡＧ
ＧＧＡＣＣＡｌａ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｍｅｔ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｐｈｅ １−ｅｕ Ｑｌｙ
Ｇｌｙ ＴｈｒＡＡＡＧＧＣＧＧＣＣＡＧＧＡＴＡ
ＴＡＡＣＴＧＡＣＴＴＣＡＣＣＡＴＧＬ／ＶＳ ＧＩ
Ｖ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈ
ｒ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｔｈｒ ＭｅｔＣＡＡＴＴ
ＴＧＴＧＴＣＴＴＣＣＴＡＡＡＧＡＧＡＧＣＴＧＴＡＣ
ＣＣＡＧｌｎ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ ５ｅ
ｒＧＡＧＡＧＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＡＡＴＧＴＧＧＡＣ
ＴＣＡＡＴＣＣＣＴＡＧＧＧＣＴＧＧＣＡＧＡΔＡＧＧ
ＧＡＡＣＡＧＡＡＧＧＴＴＴＴＴＧＡＧＴＡＣＧＧＣＴ
ＡＴＡＧＣＣＴＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＧＴＴＧＴＣＴＡ
ＣＡＣＣＡＡＴＧＣＣＣＡＡＣＴＧＣＣＴＧＣＣＴＴＡ
ＧＧＧＴＡＧＴＧＣＴＡＡＧＡＣＧＡＴＣＴＣＣＴＧＴ
ＣＣＡＴＣＡＧＣＣＡＧＧＡＣＡＧＴＣＡＧＣＴＣＴＣ
ＴＣＣＴＴＴＣＡＧＧＧＣＣＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＴ
ＴＴＴＧＴＴＧＡＧＣＣＡＧＧＣＣＴＣＴＣＴＣＴＣＡ
ＣＣＴＣＴＣＣＴＡＣＴＣＡＣＴＴＡＡＡＧＣＣＣＧＣ
ＣＴＧＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＴＴＧ
ＧＴＴＣＴＡＡＧＡＡＡＣＣＣＴＣＣＴＣＴＧＴＣＡＴ
ＴＣＧＣＴＣＣＣＡＣＡＴＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＡＣ
ＣＧＣＴＴＣＣＣＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴ
ＧＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＧＡＴＴＣＡＴＴＧＧＴＣ
ＴＡＡＴＴＴＡＴＴＣＡＡＡＧＧＧＧＧＣＡＡＧＡＡＧ
ＴＡＧＣＡＧＴＧＴＣＴＧＴＡＡＡＡＧＡＧＣＣＴＡＣ
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ＡＡＴＴＴＧＧＡＣＴＧＧＴＧＴＧＣＴＣＴＣＴＴＴＡ
ＡＡＴＣＡＡＧＴＣＣＴＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＣＴＧＡ
ＡＡＡＴＡＴＡＴＡＡＧＣＴＣＡＧＡＴＴＡＴＴＴＡＡ
ＡＴＧＧＧＡＡＴＡＴＴＴＡＴＡＡＡＴＧＡＧＣＡＡＡ
ＴＡＴＣＡＴＡＣＴＧＴＴＣＡＡＴＧＧＴＴＣＴＣＡＡ
ＡＴＡＡＡＣＴＴＣＡＣＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ上記図より、合成
プローブと相補的な領域が５′末端より３１２番目〜３
７１番目に存在（図に下線を付して示す）し、ヒトコド
ン使用頻度から導いた塩基配列に７５％の相同性を示し
た。
ＣＴＴＧＴＴＣＴＴＴＧＡＡＧＣＴＧＡＴＧＧＣＣＣＴ
ＡＡＡＣＡＧＡＴＧＡＡＧＭｅｔ ＬＶＳ ＴＧＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＧＡＣＣＴＣＴ
ＧＣＣＣＴＣＴＧｃｙｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｇｌ
ｎ ＡＳｐＬｅｕ ＡＳＩ） Ｌｅｕ Ｃｙｓ
ｐｒｏ １−ｅｕＧＡＴＧＧＣＧＧＣＡＴＣＣＡ
ＧＣＴＡＣＧＡＣＴＣＴＣＣＧＡＣＯＡＣＡＳＩＩ
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Ｌｅｕ ＡｒＧ Ｌｙｓ ＭｅｔＣＴＧＧＴＴＣ
ＣＣＴＧＣＣＣＡＣＡＧＡＣＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧＡＡ
Ｔしｅｕ Ｖａｌ ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ
Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ
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ＴＴＣＡＴＣＴＴＴＧＡＡＡＳｐｌｅｕ ３ｅｒ
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Ｉｌｅ ＰｈＣＧｌｕＣＴＧＡＡＣＴＧＣＡＣＧＣＴ
ＣＣＧＧＧＡＣＴＣＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＳｅｒ ｌ
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Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ ＬｙｓＧＣＴＣＴＣＣＡ
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Ａｌａ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇ
ｌｎ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｕ ＧｌｕＣＡＡＧＴＧＧ
ＴＧＴＴＣＴＣＣＡＴＧＴＣＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＧ
ＡＧｌｎ Ｖａｌ Ｖａｔ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｍｅ
ｔ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇｌｎ ＧｌｙＧＡＡＧ
ＡＡＡＧＴＡＡＴＧＡＣＡＡＡＡＴＡＣＣＴＧＴＧＧＣ
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ＩＪｓ ＡＳｐＡＳＩ） Ｌｌ／Ｓ Ｐｒｏ Ｔｈｒ
Ｌｅｕ ｌ−１１ｎ １ｅｕＧＡＧＡＧＴＧＴＡＧＡＴ
ＣＣＣＡＡＡＡＡＴＴＡＣＣＣＡＡＡＧＡＡＧＧｌｕ
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Ａｓｎ ＡＳｎ ＬＪｓ １−ｅｕ Ｇｌｕ ｐｈｅ
Ｑｌｕ Ｓｅｒ ＡｌａＣＡＧＴＴＣＣＣＣＡＡＣＴＧ
ＧＴＡＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＴＣＴＣＡＡＧｌｎ Ｐ
ｈｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｉ
ｌｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ ＧｌｎＧＣＡ
ＧＡＡＡＡＣＡＴＧＣＣＣＧＴＣＴＴＣＣＴＧＧＧＡＧ
ＧＧＡＣＣＡｌａ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｍｅｔ
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Ｇｌｙ ＴｈｒＡＡＡＧＧＣＧＧＣＣＡＧＧＡＴＡ
ＴＡＡＣＴＧＡＣＴＴＣＡＣＣＡＴＧＬ／ＶＳ ＧＩ
Ｖ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈ
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ＴＧＴＧＴＣＴＴＣＣＴＡＡＡＧＡＧＡＧＣＴＧＴＡＣ
ＣＣＡＧｌｎ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ ５ｅ
ｒＧＡＧＡＧＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＡＡＴＧＴＧＧＡＣ
ＴＣＡＡＴＣＣＣＴＡＧＧＧＣＴＧＧＣＡＧＡΔＡＧＧ
ＧＡＡＣＡＧＡＡＧＧＴＴＴＴＴＧＡＧＴＡＣＧＧＣＴ
ＡＴＡＧＣＣＴＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＧＴＴＧＴＣＴＡ
ＣＡＣＣＡＡＴＧＣＣＣＡＡＣＴＧＣＣＴＧＣＣＴＴＡ
ＧＧＧＴＡＧＴＧＣＴＡＡＧＡＣＧＡＴＣＴＣＣＴＧＴ
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ＧＴＴＣＴＡＡＧＡＡＡＣＣＣＴＣＣＴＣＴＧＴＣＡＴ
ＴＣＧＣＴＣＣＣＡＣＡＴＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＡＣ
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ＧＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＧＡＴＴＣＡＴＴＧＧＴＣ
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ＴＡＧＣＡＧＴＧＴＣＴＧＴＡＡＡＡＧＡＧＣＣＴＡＣ
ＴＴＴＴＴＡＴＴＡＧＣＴＡＴＧＧＡＡＴＣＡＡＴＴＣ
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ＡＡＴＣＡＡＧＴＣＣＴＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＣＴＧＡ
ＡＡＡＴＡＴＡＴＡＡＧＣＴＣＡＧＡＴＴＡＴＴＴＡＡ
ＡＴＧＧＧＡＡＴＡＴＴＴＡＴＡＡＡＴＧＡＧＣＡＡＡ
ＴＡＴＣＡＴＡＣＴＧＴＴＣＡＡＴＧＧＴＴＣＴＣＡＡ
ＡＴＡＡＡＣＴＴＣＡＣＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
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プローブと相補的な領域が５′末端より３１２番目〜３
７１番目に存在（図に下線を付して示す）し、ヒトコド
ン使用頻度から導いた塩基配列に７５％の相同性を示し
た。
また、１１ＧＩＦ−αのｃ ＤＮＡ中の最長のり一ディ
ングフレーム（ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ ）を検索
したところ、５′末端より５７番目から７７１７１番目
域であり、そのコドンのフレームによる３１２番目〜３
７１番目の塩基配列に対応するアミノ酸配列は、天然型
ＧＩＦのＮ ＯＮ ２０−アミノ酸と完全に同一であっ
た。このことは、ｐＧＩＦ−αのｃ ＤＮＡがＧＩＦ前
駆蛋白質をコードするｃ ＤＮＡであることを示してい
る。
ングフレーム（ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ ）を検索
したところ、５′末端より５７番目から７７１７１番目
域であり、そのコドンのフレームによる３１２番目〜３
７１番目の塩基配列に対応するアミノ酸配列は、天然型
ＧＩＦのＮ ＯＮ ２０−アミノ酸と完全に同一であっ
た。このことは、ｐＧＩＦ−αのｃ ＤＮＡがＧＩＦ前
駆蛋白質をコードするｃ ＤＮＡであることを示してい
る。
上記塩基配列より、天然型ＧＩＦは３１２番〜７７１番
の塩基配列にコードされており、１５３アミノ酸より構
成されていると同定される。
の塩基配列にコードされており、１５３アミノ酸より構
成されていると同定される。
この結果は、前述した天然型ＧＩＦの物性（分子量、Ｎ
末端アミノ酸配列及び構成アミノ酸組成比）の結果に一
致した。
末端アミノ酸配列及び構成アミノ酸組成比）の結果に一
致した。
以上の結果より、決定された天然型ＧＩＦの蛋白−次構
造を下記に示す。
造を下記に示す。
Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｒｇ ３ｅｒ
ｌｅｕ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｔｈｒ ｌｅｕ
ＡｒｇＡｓｐ Ｓｅｒ Ｑｌｎ Ｑｌｎ Ｌｙｓ
Ｓｅｒ Ｌ ｅＵ Ｖａｔ Ｍｅｔ ３ｅ
ｒ Ｇｌｌ／Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｇｌｕ ｌｅｕ
Ｌｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｈｉｓ ｌｅｕ
Ｇｌｎ ＧｌｙＧｌｎ Ａｓｐ Ｍｅｔ
Ｑｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｖａｌ
ｐｈｅ ３ｅｒ ＭｅｔＳｅｒ Ｐｈｅ Ｖａ
ｔ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅ
ｒ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌ ｙｓＩｌｅ Ｐｒｏ
Ｖａｔ Ａｌａ ｌｅｕ ＧＩＶ Ｌｅａｆ
ＩＪｓ Ｇｌｕ Ｌｌ／Ｓ ＡＳｎＬｅｕ
Ｔｙｒ ｌｅｕ ３ｅｒ ＣＶＳ Ｖａｔ
１−ｅｕ Ｌｌ／Ｓ ＡＳＤ ＡＳＩ） ｔ−ｙ
ｓＰｒｏ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ
Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｖａｔ Ａｓｐ Ｐｒｏ
ＬＶｓＡｓｎ Ｔｙｒ ｐｒｏ ＬＶＳ Ｌ
ｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｒｇ
ＰｈｅＶａｌ Ｐｈｅ ＡＳｎ Ｌｙｓ Ｉｌ
ｅ Ｇｌｕ ）ｌｅ Ａｓｎ Ａｓｎ ＩＪ
ｓ ＬｅｕＱｌｕ Ｐｈｅ Ｑｌｕ ３ｅｒ
Ａｌａ Ｇｉｎ ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ
Ｔｒｐ ＴｙｒＴｌｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓ
ｅｒ ＧＩＴＩ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｍ
ｅｔ Ｐｒｏ ＶａｔＰｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｙｓ ＧＩＶ ＧＩＶ
Ｇｌｎ Ａｓｐ ｌ１ｅＴｈｒ Ａｓｐ ｐ
ｈｅ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｑｌｎ Ｐｈｅ Ｖａ
ｔ ３ｅｒ ５ｅｒ−１ｎＱ 一 実施例２ （Ｉ）組換えＧＩＦ （ｒ−ＧＩＦ）の製造上記実施例
１（■）の（３−５）で得たクローンＩ−２の有するプ
ラスミドｐ ＧＩＦ−αを、制限酵素トｌ（］ｉＡＩ
（ＮＥＢ）及びΔｃｃＩ （日本ジーン）で切断してポ
リペプチドエをコードする遺伝子５８１ベースペアーズ
（ｂｐ）を切り出し、その５′末端及び３′末端をヌク
レエース マングビーン（Ｎｕｃｌｅａｓｅ 、 Ｍｕ
ｎｇＢｅａｎ 、 ＰｈａｒｍａｃｉａＰ −Ｌ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ） Ｔ：削った。コ（７）
７７ ’ｊメントをＭ１３ファージＲＦｍｐ１０の３
ｍａＩサイトにクローニングし、エシェリヒア コリー
ＪＭ １０５に感染させて培養し、ジングルストラン
ド（ＳＳ）−ＤＮＡを得た。
ｌｅｕ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｔｈｒ ｌｅｕ
ＡｒｇＡｓｐ Ｓｅｒ Ｑｌｎ Ｑｌｎ Ｌｙｓ
Ｓｅｒ Ｌ ｅＵ Ｖａｔ Ｍｅｔ ３ｅ
ｒ Ｇｌｌ／Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｇｌｕ ｌｅｕ
Ｌｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｈｉｓ ｌｅｕ
Ｇｌｎ ＧｌｙＧｌｎ Ａｓｐ Ｍｅｔ
Ｑｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｖａｌ
ｐｈｅ ３ｅｒ ＭｅｔＳｅｒ Ｐｈｅ Ｖａ
ｔ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅ
ｒ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌ ｙｓＩｌｅ Ｐｒｏ
Ｖａｔ Ａｌａ ｌｅｕ ＧＩＶ Ｌｅａｆ
ＩＪｓ Ｇｌｕ Ｌｌ／Ｓ ＡＳｎＬｅｕ
Ｔｙｒ ｌｅｕ ３ｅｒ ＣＶＳ Ｖａｔ
１−ｅｕ Ｌｌ／Ｓ ＡＳＤ ＡＳＩ） ｔ−ｙ
ｓＰｒｏ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ
Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｖａｔ Ａｓｐ Ｐｒｏ
ＬＶｓＡｓｎ Ｔｙｒ ｐｒｏ ＬＶＳ Ｌ
ｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｒｇ
ＰｈｅＶａｌ Ｐｈｅ ＡＳｎ Ｌｙｓ Ｉｌ
ｅ Ｇｌｕ ）ｌｅ Ａｓｎ Ａｓｎ ＩＪ
ｓ ＬｅｕＱｌｕ Ｐｈｅ Ｑｌｕ ３ｅｒ
Ａｌａ Ｇｉｎ ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ
Ｔｒｐ ＴｙｒＴｌｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓ
ｅｒ ＧＩＴＩ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｍ
ｅｔ Ｐｒｏ ＶａｔＰｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｙｓ ＧＩＶ ＧＩＶ
Ｇｌｎ Ａｓｐ ｌ１ｅＴｈｒ Ａｓｐ ｐ
ｈｅ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｑｌｎ Ｐｈｅ Ｖａ
ｔ ３ｅｒ ５ｅｒ−１ｎＱ 一 実施例２ （Ｉ）組換えＧＩＦ （ｒ−ＧＩＦ）の製造上記実施例
１（■）の（３−５）で得たクローンＩ−２の有するプ
ラスミドｐ ＧＩＦ−αを、制限酵素トｌ（］ｉＡＩ
（ＮＥＢ）及びΔｃｃＩ （日本ジーン）で切断してポ
リペプチドエをコードする遺伝子５８１ベースペアーズ
（ｂｐ）を切り出し、その５′末端及び３′末端をヌク
レエース マングビーン（Ｎｕｃｌｅａｓｅ 、 Ｍｕ
ｎｇＢｅａｎ 、 ＰｈａｒｍａｃｉａＰ −Ｌ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ） Ｔ：削った。コ（７）
７７ ’ｊメントをＭ１３ファージＲＦｍｐ１０の３
ｍａＩサイトにクローニングし、エシェリヒア コリー
ＪＭ １０５に感染させて培養し、ジングルストラン
ド（ＳＳ）−ＤＮＡを得た。
次に得られた５Ｓ−ＤＮＡにＭ１３ユニバーサルブライ
マー及びデオキシＮＴＰｓ （宝酒造）の存在下で、
ＤＮＡポリメラーゼエ（クレノーフラグメント） （
Ｄ Ｎ Ａ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＩ、Ｋ ｌｅｎｏ
ｗＦ ｒａｏｍｅｎｔ 、宝酒造）を働かせてダブルス
トランド（ｄｓ） −ＤＮＡを合成し、続いて制限酵素
ＥＣ０ＲＴ及びＢａｍＨＩ＜日本ジーン）で切断して目
的の制限酵素サイトをもつＤＮＡフラグメントを得た。
マー及びデオキシＮＴＰｓ （宝酒造）の存在下で、
ＤＮＡポリメラーゼエ（クレノーフラグメント） （
Ｄ Ｎ Ａ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＩ、Ｋ ｌｅｎｏ
ｗＦ ｒａｏｍｅｎｔ 、宝酒造）を働かせてダブルス
トランド（ｄｓ） −ＤＮＡを合成し、続いて制限酵素
ＥＣ０ＲＴ及びＢａｍＨＩ＜日本ジーン）で切断して目
的の制限酵素サイトをもつＤＮＡフラグメントを得た。
このフラグメントをエクスプレッションベクターｐ （
ＮＩ［［Ａ−３（バイオ テクノロジー（Ｂｉ。
ＮＩ［［Ａ−３（バイオ テクノロジー（Ｂｉ。
ＴｅｃｈｎｏｌｏＯＶ ） 、 Ｖｏｌ、 ２ 、８１
−８５（１９８４））のＥＣ０ＲＩ及びＢａｍＨＩサイ
トに挿入して、所望のプラスミドＩ） ＩＮＩＩｒｆ−
ＧＩＦ−αを得た。
−８５（１９８４））のＥＣ０ＲＩ及びＢａｍＨＩサイ
トに挿入して、所望のプラスミドＩ） ＩＮＩＩｒｆ−
ＧＩＦ−αを得た。
以上の概略を第１５図に示す。
上記で得たベクタープラスミドを、エシェリヒア コリ
ーＨ８１０１にトランスフオームさせて、所望の形質転
換体を得た。
ーＨ８１０１にトランスフオームさせて、所望の形質転
換体を得た。
上記形質転換体をＬ−ブロス培地（アンピシリン５０μ
Ｑ／ｍＱを含む）で、３７℃で振盪培養し、増殖がＯＤ
６５０ｎｍで０．２となった時、培地にイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（Ｉ ＰＴＧ）を最終
濃度２ｍＭ加え、その添加の２時間、５時間及び６．５
時間後に、培養液者１戒をサンプリングし、遠心分＃Ｉ
（１ｏｏｏｏｒｐｍ 。
Ｑ／ｍＱを含む）で、３７℃で振盪培養し、増殖がＯＤ
６５０ｎｍで０．２となった時、培地にイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（Ｉ ＰＴＧ）を最終
濃度２ｍＭ加え、その添加の２時間、５時間及び６．５
時間後に、培養液者１戒をサンプリングし、遠心分＃Ｉ
（１ｏｏｏｏｒｐｍ 。
５分）し、菌体を集め、ＥＤＴＡ−リゾチーム−トリト
ンＸ１００（最終濃度１％、 Ｔ ｒｉｔｏｎ Ｘ１０
Ｘ１００）１で溶菌後、超音波処理し、サンプルとし、
その有するＧＩＦ活性を検討した。
ンＸ１００（最終濃度１％、 Ｔ ｒｉｔｏｎ Ｘ１０
Ｘ１００）１で溶菌後、超音波処理し、サンプルとし、
その有するＧＩＦ活性を検討した。
対照としてベクタープラスミドｐ ＴＮＩ［［Ａ−３を
用いて同様の方法で試験を行ない、ＧＩＦ活性を調べた
。
用いて同様の方法で試験を行ない、ＧＩＦ活性を調べた
。
結果を下記第５表に示す。
第 ５ 表
エシェリヒア コ ＩＰＴＧ ＧＩＦ活性リーす
８１０１に 添加後 （単位／トランスフオーム
時間 ｍｌ培養液）ζ１丸仄狙にｍ−（
時間） ｐ ＩＮｍｒ −５２４２００ 第５表より、プラスミド１）ＩＮＩＩ［ｆ−ＧＩＦ−α
でトランスフオームさせた形質転換微生物の培養により
目的とするＧＩＦの製造を行ない得ることが判る。
８１０１に 添加後 （単位／トランスフオーム
時間 ｍｌ培養液）ζ１丸仄狙にｍ−（
時間） ｐ ＩＮｍｒ −５２４２００ 第５表より、プラスミド１）ＩＮＩＩ［ｆ−ＧＩＦ−α
でトランスフオームさせた形質転換微生物の培養により
目的とするＧＩＦの製造を行ない得ることが判る。
（ＩＩ）ｒ−ＧＩＦの製造
下記オリゴデオキシヌクレオチド（Ｉ）及び（ｆｆ）を
以下のようにして合成した。
以下のようにして合成した。
５’ ＣＧＡＴＡＡＴＧＧＣＴＣＣＴＧＴＡＣＧＴ
ＴＣＴＣＴＧＡＡＣＴＧＣＡＣＴＣＴＣ３’
（Ｉ）５’ ＣＧＧＡＧＡＧＴＧＣＡ
ＧＴＴＣＡＧＡＧＡＡＣＧＴＡＣＡＧＧＡＧＣＣＡＴＴ
ＡＴ ３’ （１）即ち、マ
クロポーラスシリカに結合した５′−〇−ジメトキシト
リチル及びＮ−保護デオキシヌクレオシド（アプライド
バイオシステムズ社製）を出発原料とし、３′側より
５′側へ５’ −０−ジメトキシトリチル及びＮ−保護
デオキシモノヌクレオシド−３′−ホスホアミダイトを
縮合単位として、自動合成８Ｎ（アプライド バイオシ
ステムズ社製、３８０Ａ ＤＮＡシンセサイザー）を
用いて順次、ヌクレオチド鎖を延長させた。続いてチオ
フェノールを用いた処理による脱メチル化及び２８％ア
ンモニアを用いた室温での処理により、シリカよりヌク
レオチドを脱離させ、完全保護オリゴヌクレオチドを得
た。以上の操作はすべて自動合成機を用いて行なった（
）ｌ ｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ等１、Ｎａｔｕｒｅ 、
３１０．１０５ （１９８４） ）。
ＴＣＴＣＴＧＡＡＣＴＧＣＡＣＴＣＴＣ３’
（Ｉ）５’ ＣＧＧＡＧＡＧＴＧＣＡ
ＧＴＴＣＡＧＡＧＡＡＣＧＴＡＣＡＧＧＡＧＣＣＡＴＴ
ＡＴ ３’ （１）即ち、マ
クロポーラスシリカに結合した５′−〇−ジメトキシト
リチル及びＮ−保護デオキシヌクレオシド（アプライド
バイオシステムズ社製）を出発原料とし、３′側より
５′側へ５’ −０−ジメトキシトリチル及びＮ−保護
デオキシモノヌクレオシド−３′−ホスホアミダイトを
縮合単位として、自動合成８Ｎ（アプライド バイオシ
ステムズ社製、３８０Ａ ＤＮＡシンセサイザー）を
用いて順次、ヌクレオチド鎖を延長させた。続いてチオ
フェノールを用いた処理による脱メチル化及び２８％ア
ンモニアを用いた室温での処理により、シリカよりヌク
レオチドを脱離させ、完全保護オリゴヌクレオチドを得
た。以上の操作はすべて自動合成機を用いて行なった（
）ｌ ｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ等１、Ｎａｔｕｒｅ 、
３１０．１０５ （１９８４） ）。
次いで、得られた完全保護オリゴヌクレオチドを２８％
アンモニア水２ｍＱで５５℃で１０時間処理してＮ−保
護基を脱離させ、５′−〇−ジメトキシトリチルオリゴ
ヌクレオチドを得た。この１１５量を用いて、ＯＤＳ
（山村化学研究所社製）を担体とする逆相高速液体クロ
マトグラフィーにより精製後、８０％酢酸１５０μＱで
室温で２０分間処理して粗オリゴヌクレオチドを得た。
アンモニア水２ｍＱで５５℃で１０時間処理してＮ−保
護基を脱離させ、５′−〇−ジメトキシトリチルオリゴ
ヌクレオチドを得た。この１１５量を用いて、ＯＤＳ
（山村化学研究所社製）を担体とする逆相高速液体クロ
マトグラフィーにより精製後、８０％酢酸１５０μＱで
室温で２０分間処理して粗オリゴヌクレオチドを得た。
これをＯＤＳを担体とする逆相高速液体クロマトグラフ
ィーにより更に精製して、目的とするオリゴヌクレオチ
ドを得た。
ィーにより更に精製して、目的とするオリゴヌクレオチ
ドを得た。
前記実施例１の（ＩＩ）の（３−５）で得たプラスミド
ｐＧＩＦ−αを、制限酵素ＡＣＣ■及びＣｌａ■により
切断後、約１．２キロベースペアー（ｋｂｐ）のＤＮＡ
断片をアガロースゲル電気泳動により単ｗＩＮ製した。
ｐＧＩＦ−αを、制限酵素ＡＣＣ■及びＣｌａ■により
切断後、約１．２キロベースペアー（ｋｂｐ）のＤＮＡ
断片をアガロースゲル電気泳動により単ｗＩＮ製した。
このＤＮＡ断片をＤＮＡポリメラーゼ■（クレノー断片
）を用いて、制限酵素ＡＣＣＩ及びＣ１，ａＩ切断部分
を平滑末端とした。
）を用いて、制限酵素ＡＣＣＩ及びＣ１，ａＩ切断部分
を平滑末端とした。
−万Ｂａｎ＋ＨＩリンカ−（５’ ＣＧＧＡＴＣＣ
Ｇ３′）の５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼに
よりリン酸化し、これを先の平滑末端としたＤＮＡ断片
に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した後、制限酵素
ＢａｍＨＩで切断し、更に制限酵素ＭＳ１１Ｉで切断し
、得られた反応物をアガロースゲル電気泳動に付して、
約５４０ベースベア（ｂｐ）のＭｓｐＩ −ＢａｍＨＩ
ＤＮＡ断片を単離精製した。
Ｇ３′）の５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼに
よりリン酸化し、これを先の平滑末端としたＤＮＡ断片
に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した後、制限酵素
ＢａｍＨＩで切断し、更に制限酵素ＭＳ１１Ｉで切断し
、得られた反応物をアガロースゲル電気泳動に付して、
約５４０ベースベア（ｂｐ）のＭｓｐＩ −ＢａｍＨＩ
ＤＮＡ断片を単離精製した。
次に上記で合成した合成オリゴデオキシヌクレオチド（
Ｉ＞及び（ＩＩ）の各５′末端を、Ｔ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼによりリン酸化し、上記で得たＭｓｐＩ−Ｂ
ａｍ）−ＩＩ ＤＮＡ断片に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを
用いて連結後、制限酵素Ｂａ１ｌｌ）−ＩＩ及びＣ１ａ
工で切断し、得られた反応物をアガロ−スゲル雷気泳動
に付して、約５８０ ｂｐのＣ１ａ■−ＢａｍＨＩＤＮ
Ａ断片を単離精製した。
Ｉ＞及び（ＩＩ）の各５′末端を、Ｔ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼによりリン酸化し、上記で得たＭｓｐＩ−Ｂ
ａｍ）−ＩＩ ＤＮＡ断片に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを
用いて連結後、制限酵素Ｂａ１ｌｌ）−ＩＩ及びＣ１ａ
工で切断し、得られた反応物をアガロ−スゲル雷気泳動
に付して、約５８０ ｂｐのＣ１ａ■−ＢａｍＨＩＤＮ
Ａ断片を単離精製した。
他方、プラスミドｐＴＭＩ（合本・文男１代謝。
Ｖｏｌ、２２，２８９ （１９８５））を、制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ及びＣｌａＩで切断後、アガロースゲル電気泳
動によりｔｒｐプロモーター領域を含む約４．４ｋｂｐ
のＤＮＡ断片を単離精製した。このＤＮＡ断片と、先に
調製した約５８０ｂｐのＣｌａＩ−ＢａｍＨＩＤＮＡ断
片とを、Ｔ４［）ＮＡリガーゼで連結して所望のプラス
ミドｐｔｒｐＧ Ｉ Ｆ−αを得た。
ａｍＨＩ及びＣｌａＩで切断後、アガロースゲル電気泳
動によりｔｒｐプロモーター領域を含む約４．４ｋｂｐ
のＤＮＡ断片を単離精製した。このＤＮＡ断片と、先に
調製した約５８０ｂｐのＣｌａＩ−ＢａｍＨＩＤＮＡ断
片とを、Ｔ４［）ＮＡリガーゼで連結して所望のプラス
ミドｐｔｒｐＧ Ｉ Ｆ−αを得た。
該プラスミドをエシェリヒア・コリーＨ８１０１にトラ
ンスフオームさせ、目的のトランスフォーマントを、ボ
イリング法（ｂｏｉｌｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）により得
られるプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により選択した
（Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉｓ 、 Ｅ、 Ｆ。
ンスフオームさせ、目的のトランスフォーマントを、ボ
イリング法（ｂｏｉｌｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）により得
られるプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により選択した
（Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉｓ 、 Ｅ、 Ｆ。
Ｆｒ１ｔｓｃｈ ａｎｄ Ｊ、 Ｓａｍｂｒｏｏｋ
、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉｎｏ、 Ｉ）ｌ）３
６６ 、 Ｃｏ１ｄ Ｓ Ｉ）ｒｉｎｏ Ｈａｒｆｏｒ
ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ、 （１９８２） ） 。
、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉｎｏ、 Ｉ）ｌ）３
６６ 、 Ｃｏ１ｄ Ｓ Ｉ）ｒｉｎｏ Ｈａｒｆｏｒ
ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ、 （１９８２） ） 。
以上の概略を第１６図に示す。
また上記トランスフォーマントに組込まれたプラスミド
ｐｔｒｐＧ Ｉ Ｆ−αは、これをエシェリヒア・コリ
ーχ１７７６にトランスフオームさせ、該形質転換体を
Ｅ ５ｃｈｅｒｉｃｈｔａ ｃｏｌｉχ１７７６／ｐ
ｔｒｐＧ Ｉ Ｆ −ａなる名称で１９８５年１２月１
２日に工業技術院微生物工業研究所に微工研条寄第９４
９号（ＦＥＲＭ ＢＰ−９４９）として寄託されてい
る。
ｐｔｒｐＧ Ｉ Ｆ−αは、これをエシェリヒア・コリ
ーχ１７７６にトランスフオームさせ、該形質転換体を
Ｅ ５ｃｈｅｒｉｃｈｔａ ｃｏｌｉχ１７７６／ｐ
ｔｒｐＧ Ｉ Ｆ −ａなる名称で１９８５年１２月１
２日に工業技術院微生物工業研究所に微工研条寄第９４
９号（ＦＥＲＭ ＢＰ−９４９）として寄託されてい
る。
上記形質転換体（エシェリヒア・コリーＨＢ１０１／ｐ
ｔｒｐＧ Ｉ Ｆ−ａ＞を、アンピシリン５０μｇ／鵬
及びＬ−トリプトファン２０μｇ／ＷＩＩ２を含むＬＢ
培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス及び０．５
％ＮａＣ１１０ｍ１２中で、３７℃で一晩振盪培養し、
この１ｍ１２をアンピシリン５０μ（＋／ｍｕ及び１％
カザミノ酸を含むＭ９最小培地（０，６％Ｎａ２ＨＰ○
４．０．３％ ＫＨ２ＰＯ４，０，０５％Ｎａ Ｃ（１，０，１％Ｎ
Ｈａ ＣＱ 、２ｍ Ｍ Ｍ（ｌ Ｓｏｔ 、０．２
％グルコース及びＯ，１ｍ ＭＣａ ＣＱ２ ）５０ｍ
Ｇに植菌し、３７℃で振盪培養し、５５０ｍμでの吸光
度（０，Ｄ、）が１．０となった時点で菌体を集め、１
５％シュークロース−３０ｍＭトリス・ＨＣＱ（ｐ Ｈ
８，０）−５Ｏｎ＋ Ｍ ＥＤＴＡ （ｐ Ｈ８，０
）の溶液５ｍＱに懸濁させ、１０ｍ（１／ｌｌ１ｆ２リ
ゾチーム（１０ＩＩＩＭトリス・ＨＣＱ（１１８８，０
）で溶解した溶液）５００μＱを加え、更に０．３％ト
ＩＪ トンＸｉ ００−１８７．５ｍ ＭＥＤＴＡ（ｐ
Ｈ８，０）−１５０ｍ Ｍトリス・１−ＩＣＱ（ｐ
Ｈ８，０）の溶液５鵬を加え、室温で１５分間放置後、
更によく懸濁させ、遠心分離によって菌体抽出物上清を
得た。
ｔｒｐＧ Ｉ Ｆ−ａ＞を、アンピシリン５０μｇ／鵬
及びＬ−トリプトファン２０μｇ／ＷＩＩ２を含むＬＢ
培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス及び０．５
％ＮａＣ１１０ｍ１２中で、３７℃で一晩振盪培養し、
この１ｍ１２をアンピシリン５０μ（＋／ｍｕ及び１％
カザミノ酸を含むＭ９最小培地（０，６％Ｎａ２ＨＰ○
４．０．３％ ＫＨ２ＰＯ４，０，０５％Ｎａ Ｃ（１，０，１％Ｎ
Ｈａ ＣＱ 、２ｍ Ｍ Ｍ（ｌ Ｓｏｔ 、０．２
％グルコース及びＯ，１ｍ ＭＣａ ＣＱ２ ）５０ｍ
Ｇに植菌し、３７℃で振盪培養し、５５０ｍμでの吸光
度（０，Ｄ、）が１．０となった時点で菌体を集め、１
５％シュークロース−３０ｍＭトリス・ＨＣＱ（ｐ Ｈ
８，０）−５Ｏｎ＋ Ｍ ＥＤＴＡ （ｐ Ｈ８，０
）の溶液５ｍＱに懸濁させ、１０ｍ（１／ｌｌ１ｆ２リ
ゾチーム（１０ＩＩＩＭトリス・ＨＣＱ（１１８８，０
）で溶解した溶液）５００μＱを加え、更に０．３％ト
ＩＪ トンＸｉ ００−１８７．５ｍ ＭＥＤＴＡ（ｐ
Ｈ８，０）−１５０ｍ Ｍトリス・１−ＩＣＱ（ｐ
Ｈ８，０）の溶液５鵬を加え、室温で１５分間放置後、
更によく懸濁させ、遠心分離によって菌体抽出物上清を
得た。
この菌体抽出物上清につきＧＩＦ活性の測定を行なった
結果は第６表に示す通りであり、培養物１ｍＱ当り２×
１０６単位の活性が認められた。
結果は第６表に示す通りであり、培養物１ｍＱ当り２×
１０６単位の活性が認められた。
第 ６ 表
検 体 ＧＩＦ活性（単
位／鵬培養液） 対照１（アッセイ培地） 検出されず対照２（エシェ
リヒア・ コリーＨＢ１０１抽出物） 検出されずエシェリヒア・
コリー ＨＢ１０１／ｐｔｒｐＧＩＦ ２Ｘ１０８上記で得
た菌体抽出物上清を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ５，５）で透析後、ジルソンハイパーミュエーション
リキッド クロマトグラフィー システム（ジルソン
（Ｇｉｌｓｏｎ ）社製）によるイオン交換クロマトグ
ラフィー（ＣＭ−ＨＰＬＣ）にかけた。その条件は次の
通りである。
位／鵬培養液） 対照１（アッセイ培地） 検出されず対照２（エシェ
リヒア・ コリーＨＢ１０１抽出物） 検出されずエシェリヒア・
コリー ＨＢ１０１／ｐｔｒｐＧＩＦ ２Ｘ１０８上記で得
た菌体抽出物上清を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ５，５）で透析後、ジルソンハイパーミュエーション
リキッド クロマトグラフィー システム（ジルソン
（Ｇｉｌｓｏｎ ）社製）によるイオン交換クロマトグ
ラフィー（ＣＭ−ＨＰＬＣ）にかけた。その条件は次の
通りである。
カラム： ＩＥＸ−５３５ＣＭ （６，Ｏｘ１５０ｍｍ
、東洋曹達社製） 溶離液Ａ：５０ｍＭ−酢酸ナトリウム （ｔ＋Ｈ５，５） 溶離液Ｂ ： ０．５Ｍ−Ｎａ ＣＱ含有５０ｍＭ−酢
酸ナトリウム（ｐ Ｈ５，５） 流 速：０．５ｍ１２／分 フラクション容積： リテンションタイム Ｏ〜６０ 分・・・２ｍ１２／４分／チューブ６０〜１
２０分・・・０．５ｍＧ／分／チューブ１２０〜１８０
分・・・２−／４分／チューブ濃度勾配二 時間（分）
％Ｂ 逆相高速液体クロマトグラフィー 上記ＣＭ−ＨＰＬＧで得たＧＩＦ活性画分（リテンショ
ンタイム９０〜９１分）を、次いで逆相高速液体クロマ
トグラフィーに付した。その条件は、次の通りである。
、東洋曹達社製） 溶離液Ａ：５０ｍＭ−酢酸ナトリウム （ｔ＋Ｈ５，５） 溶離液Ｂ ： ０．５Ｍ−Ｎａ ＣＱ含有５０ｍＭ−酢
酸ナトリウム（ｐ Ｈ５，５） 流 速：０．５ｍ１２／分 フラクション容積： リテンションタイム Ｏ〜６０ 分・・・２ｍ１２／４分／チューブ６０〜１
２０分・・・０．５ｍＧ／分／チューブ１２０〜１８０
分・・・２−／４分／チューブ濃度勾配二 時間（分）
％Ｂ 逆相高速液体クロマトグラフィー 上記ＣＭ−ＨＰＬＧで得たＧＩＦ活性画分（リテンショ
ンタイム９０〜９１分）を、次いで逆相高速液体クロマ
トグラフィーに付した。その条件は、次の通りである。
カラム；Ｃ４ハイボアー逆相カラム
（ＲＰ３０４）バイオ−ラド社、直径
４．６Ｘ２５０ｍｍ
溶離液：Ａ液＝０．１％ＴＦＡ、
Ｂ液＝アセトニトリル：１％ＴＦＡ
（９： １ ）
流 速＝１鵬／分
チャートスピード：
リテンションタイム
０〜５０分・・・５分／ｃｍ
５０〜８０分・・・２分７ｃｍ
濃度勾配二 時間（分） ％Ｂ
Ｏ
フラクション容積：２＋１１０／２分／チューブリテン
ションタイムが６３．９〜６５．３分に、ＧＩＦ活性に
一致する単一の蛋白の吸光度ピークを示すｒ−ＧＩＦが
得られた。
ションタイムが６３．９〜６５．３分に、ＧＩＦ活性に
一致する単一の蛋白の吸光度ピークを示すｒ−ＧＩＦが
得られた。
その比活性は２．７Ｘ１０７単位／ｍｇ蛋白であった。
尚、前記実施例１の（Ｉ＞に示した天然型ＧＩＦの逆相
高速液体クロマトグラフィーの分析結果（第３図）によ
れば、該天然型ＧＩＦ活性はＬＡＦ活性とは一致しない
ものの、ＬＡＦ活性は極めてブロードに観察されＧＩＦ
活性画分にも認められることから、上記で得たｒ−ＧＩ
Ｆについて再度これがＬＡＦ活性を有するか否かを試験
したところ、該ｒ−ＧＩＦはＬＡＦ活性を有することが
確認された。
高速液体クロマトグラフィーの分析結果（第３図）によ
れば、該天然型ＧＩＦ活性はＬＡＦ活性とは一致しない
ものの、ＬＡＦ活性は極めてブロードに観察されＧＩＦ
活性画分にも認められることから、上記で得たｒ−ＧＩ
Ｆについて再度これがＬＡＦ活性を有するか否かを試験
したところ、該ｒ−ＧＩＦはＬＡＦ活性を有することが
確認された。
Ｌａｅｍｍｌｉ、 ＩＪ、 Ｋ、の方法（Ｎａｔｕｒｅ
、 ２７７ 。
、 ２７７ 。
６８０（１９７０））に従い、上記（Ｉ［）で得たｒ−
ＧＩＦの５ＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。その条件は次の
通りである。
ＧＩＦの５ＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。その条件は次の
通りである。
試 料二上記逆相高速液体りＯマドグラフィーにおける
ＧＩＦ活性画分を乾固した後、ラエメリーのサンプル
バッファー （１／２０体積の２−メルカプトエタ ノールを含む（２ＭＥ＋）又は含まな い（２ＭＥ−））に溶解し、１００℃ で４分間処理した。
ＧＩＦ活性画分を乾固した後、ラエメリーのサンプル
バッファー （１／２０体積の２−メルカプトエタ ノールを含む（２ＭＥ＋）又は含まな い（２ＭＥ−））に溶解し、１００℃ で４分間処理した。
ゲ ル：厚さ１．５ｍｍの１５％ポリアクリルアミドゲ
ルを使用した。
ルを使用した。
電気泳動装置：バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社製プ
ロチアンを用いた。
ロチアンを用いた。
泳動条件：４０ｍＡの定電流で２時間泳動させた。
泳動後のゲルをパイオーラド社製シルバースタインキッ
ト（Ｓｉｌｖｅｒ ５ｔａｉｎ ｋｉｔ ）を用いて染
色した。その結果を第１７図（２ＭＥ＋の場合）及び第
１８図（２ＭＥ−の場合）に示す。
ト（Ｓｉｌｖｅｒ ５ｔａｉｎ ｋｉｔ ）を用いて染
色した。その結果を第１７図（２ＭＥ＋の場合）及び第
１８図（２ＭＥ−の場合）に示す。
各図において、レーン■は以下の分子量マーカーの結果
であり、レーン■〜■はいずれも上記ＧＩＦ試料の結果
であり、またレーン■は天然型ＧＩＦの結果である。但
しレーン■では試料１１．７日ｇを、レーン■では試料
２３．３ｎｏを、レーン■では試料４６．６ｎ（］を、
レーン■では試料７０ｎｇを、またレーン■では試料１
１７ｎｇを各々用いた。
であり、レーン■〜■はいずれも上記ＧＩＦ試料の結果
であり、またレーン■は天然型ＧＩＦの結果である。但
しレーン■では試料１１．７日ｇを、レーン■では試料
２３．３ｎｏを、レーン■では試料４６．６ｎ（］を、
レーン■では試料７０ｎｇを、またレーン■では試料１
１７ｎｇを各々用いた。
〈レーン■における分子量マーカー〉
９４に＝フォスフォリラーゼ ｂ
６７に＝アルブミン
４３に：オバルブミン
３０に＝カルボニック アンバイトラーゼ２０．１にニ
トリプシン インヒビター１４．４に：α−ラクトアル
ブミン 上記結果より、ｒ−ＧＩＦは２ＭＥ÷下においては約１
７にの位置に、また２ＭＥ−下においては約１７゜５に
の位置にそれぞれ単一のバンドとして泳動されることが
判る。
トリプシン インヒビター１４．４に：α−ラクトアル
ブミン 上記結果より、ｒ−ＧＩＦは２ＭＥ÷下においては約１
７にの位置に、また２ＭＥ−下においては約１７゜５に
の位置にそれぞれ単一のバンドとして泳動されることが
判る。
等電点電気泳動法（ＩＥＦ）
ｒ−ＧＩＦの等電点電気泳動を、ＩＩＨ範囲３．５〜９
．５のアンフオラインＰＡＧプレート（ＬＫＢ社製）及
びモデル１４１５（パイオーラド社製）を用いて行なっ
た。その条件は次の通りである。
．５のアンフオラインＰＡＧプレート（ＬＫＢ社製）及
びモデル１４１５（パイオーラド社製）を用いて行なっ
た。その条件は次の通りである。
試 料：前記ｒ−ＧＩＦの製造（ＩＩ）で得た形質転換
体を浸透圧ショックで壊した後の上清（１０ｍＭトリス
−ＨＣｌ−１１Ｈ ８、Ｏ）を、蒸留水で１００倍希釈したもの１０μＱ利
用した。
体を浸透圧ショックで壊した後の上清（１０ｍＭトリス
−ＨＣｌ−１１Ｈ ８、Ｏ）を、蒸留水で１００倍希釈したもの１０μＱ利
用した。
電極液：陽極液＝１Ｍ Ｈ３ＰＯ４
陰極液＝ＩＭ ＮａＯＨ
泳動条件：定電力ＩＷ／ｃｍゲル幅で９０分間冷却下（
１０℃）に泳動させた。
１０℃）に泳動させた。
染 色：染色は、シルバー スタイン キットで行なっ
た。
た。
上記泳動後、ゲルを５＋ｎｍ又は２．５ｍｍ間隔でスラ
イスし、１０％ＦＯ８加ＲＰＭ１１６４０培地１ｍＱに
て振盪抽出（２日）し、ＧＩＦ活性の測定に供した。等
電点は、泳動後のｐト１の測定結果がら算出した。
イスし、１０％ＦＯ８加ＲＰＭ１１６４０培地１ｍＱに
て振盪抽出（２日）し、ＧＩＦ活性の測定に供した。等
電点は、泳動後のｐト１の測定結果がら算出した。
ｒ−ＧＩＦの等電点（ｐｌ）は約６．５〜６．９であり
、この位置に単一のバンドとして泳動された。
、この位置に単一のバンドとして泳動された。
ｒ−ＧＩＦのアミノ酸組成比
上記（ｎ）の逆相高速液体クロマトグラフィーにより得
られたｒ−ＧＩＦの３０１１Ｑを、１２ｍｍＸ１２０ｎ
＋ｍのバイレックス製肉厚硬質試験管の底部に注意深く
入れ、水酸化ナトリウム粒を入れたデシケータ−にて減
圧乾燥した。乾燥試料の入った試験管に４Ｎ−メタンス
ルホン酸〔０，２％の３−（２−アミノエチル）インド
ール含有、ピース＜ ｐ １ｅｒｃｅ ）社製）５０ｔ
ＩＱを加え、０．１〜０．２ｍｍＨｃ＋で１分間脱気後
、減圧封管した。加水分解は１１８℃のヒーター中で２
４時間を要して行なった。開管後、４Ｎ−水酸化ナトリ
ウム４６μＱで中和し、希釈用クエン酸緩衝液で４５０
μＱとした。
られたｒ−ＧＩＦの３０１１Ｑを、１２ｍｍＸ１２０ｎ
＋ｍのバイレックス製肉厚硬質試験管の底部に注意深く
入れ、水酸化ナトリウム粒を入れたデシケータ−にて減
圧乾燥した。乾燥試料の入った試験管に４Ｎ−メタンス
ルホン酸〔０，２％の３−（２−アミノエチル）インド
ール含有、ピース＜ ｐ １ｅｒｃｅ ）社製）５０ｔ
ＩＱを加え、０．１〜０．２ｍｍＨｃ＋で１分間脱気後
、減圧封管した。加水分解は１１８℃のヒーター中で２
４時間を要して行なった。開管後、４Ｎ−水酸化ナトリ
ウム４６μＱで中和し、希釈用クエン酸緩衝液で４５０
μＱとした。
アミノ酸分析は、アミノ酸アナライザー（日立製作断裂
、日立８３５型分析計）を用い、上記試料溶液２５０μ
Ｑを注入して行なった。分離されたアミノ酸は、オルト
フタルアルデヒド法で検出した。また定量は、試料の前
後に分析した標準アミノ酸で作成した検量線によって行
なった。
、日立８３５型分析計）を用い、上記試料溶液２５０μ
Ｑを注入して行なった。分離されたアミノ酸は、オルト
フタルアルデヒド法で検出した。また定量は、試料の前
後に分析した標準アミノ酸で作成した検量線によって行
なった。
その結果を、ｐｈｅを基準（９モル）として、各アミノ
酸の含有モル比で下記第７表に示す。尚、上記分析条件
下においては、ｐｒｏ及びＣｙｓは測定できない。また
３ｅｒ、Ｔｈｒ及びＭｅｔについては、上記分析条件下
での回収率を０内に示した。
酸の含有モル比で下記第７表に示す。尚、上記分析条件
下においては、ｐｒｏ及びＣｙｓは測定できない。また
３ｅｒ、Ｔｈｒ及びＭｅｔについては、上記分析条件下
での回収率を０内に示した。
第 ７ 表
ア ミ ノ 酸 モ ル
比ＡＳｐ及び／又はＡＳｒｌ １７．”ｌ５ｅｒ
１０．９ （８０％）Ｔｈｒ
５．４ （９０％）ＧＩＬＩ及び／又はＧｌｎ
２３．８ＧＩＶ ８−３ ＡＩａ ５．０Ｖ
ａｌ １０．８Ｍｅｔ
５．５ （９０％
）１１ｅ ４．９１
ｅｕ １５．ＩＴｙｒ
３．９Ｐｈｅ
（９）ＬＬ／３
１４．９Ｈｉｓ
Ｏ，９Ｔｒｐ
Ｏ，８Ａｒ（１３，０ ｒ−ＧＩＦのアミノ酸配列 上記（Ｉ）の逆相高速クロマトグラフィーで得たｒ−Ｇ
ＩＦの１５０μＱを、アブライドバイオシステムズ社製
プロテインシークエンサーにて分析した。生じたＰＴＨ
−アミノ酸を、３３％アセトニトリル水溶液１００〜５
０μＱにて適宜希釈し、その５μＱをウォータースフ１
０Ｂオートサンプラーにて注入した。クロマトグラフィ
ーのシステムは、ペックマン１１２型ポンプ２台を、４
２１型コントローラーで作動させた。カラムはウルトラ
スフェア−０ＤＳ−５μｍの充填された２ ｎ＋ｍＸ
２５０ ｍｍを用い、カラムヒーターにて５５℃に保っ
た。流速は０．３ｍＱ／分とし、２０ｍＭ酢酸ナトリウ
ムとアセトニトリルとの混合液を用い、グラジェント溶
出法で分離し、２６９ ｎｍでモニターした。分析は４
５分とした。
比ＡＳｐ及び／又はＡＳｒｌ １７．”ｌ５ｅｒ
１０．９ （８０％）Ｔｈｒ
５．４ （９０％）ＧＩＬＩ及び／又はＧｌｎ
２３．８ＧＩＶ ８−３ ＡＩａ ５．０Ｖ
ａｌ １０．８Ｍｅｔ
５．５ （９０％
）１１ｅ ４．９１
ｅｕ １５．ＩＴｙｒ
３．９Ｐｈｅ
（９）ＬＬ／３
１４．９Ｈｉｓ
Ｏ，９Ｔｒｐ
Ｏ，８Ａｒ（１３，０ ｒ−ＧＩＦのアミノ酸配列 上記（Ｉ）の逆相高速クロマトグラフィーで得たｒ−Ｇ
ＩＦの１５０μＱを、アブライドバイオシステムズ社製
プロテインシークエンサーにて分析した。生じたＰＴＨ
−アミノ酸を、３３％アセトニトリル水溶液１００〜５
０μＱにて適宜希釈し、その５μＱをウォータースフ１
０Ｂオートサンプラーにて注入した。クロマトグラフィ
ーのシステムは、ペックマン１１２型ポンプ２台を、４
２１型コントローラーで作動させた。カラムはウルトラ
スフェア−０ＤＳ−５μｍの充填された２ ｎ＋ｍＸ
２５０ ｍｍを用い、カラムヒーターにて５５℃に保っ
た。流速は０．３ｍＱ／分とし、２０ｍＭ酢酸ナトリウ
ムとアセトニトリルとの混合液を用い、グラジェント溶
出法で分離し、２６９ ｎｍでモニターした。分析は４
５分とした。
２０サイクルの分析の結果、前記（Ｉ）で得たｒ−ＧＩ
ＦのＮ末端２０個のアミノ酸配列は、以下のものである
と認められた。
ＦのＮ末端２０個のアミノ酸配列は、以下のものである
と認められた。
Ａ ｌａ −Ｐ ｒｏ −Ｖ ａｌ −Ａ ｒｇ−Ｓ
ｅｒ −Ｌ ｅｕ −Ａ Ｓｎ −ＣＶＳ−Ｔ ｈｒ−
Ｌ ｅｔｌ−Ａ ｒ（＋−Ａ Ｓ＋１− Ｓ ｅｒ−Ｇ
１ｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−８ｅｒ−Ｌ ｅｕ−Ｖａｔ−
Ｍｅｔ −尚、Ａｒ（ｌはＨＰＬＣ系を若干変更して別
途確認した。３ｅｒは副生物の一つで確認し、更に３２
２ｎｍでの確認も行なった。サイクル８では有意のビ−
クが認められず、Ｃｙｓであると推定された。
ｅｒ −Ｌ ｅｕ −Ａ Ｓｎ −ＣＶＳ−Ｔ ｈｒ−
Ｌ ｅｔｌ−Ａ ｒ（＋−Ａ Ｓ＋１− Ｓ ｅｒ−Ｇ
１ｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−８ｅｒ−Ｌ ｅｕ−Ｖａｔ−
Ｍｅｔ −尚、Ａｒ（ｌはＨＰＬＣ系を若干変更して別
途確認した。３ｅｒは副生物の一つで確認し、更に３２
２ｎｍでの確認も行なった。サイクル８では有意のビ−
クが認められず、Ｃｙｓであると推定された。
上記結果から前記（ＩＩ）で得たｒ−ＧＩＦは、ポリペ
プチド■に一致するものと認められる。尚、アミノ酸配
列から計算されたｒ−ＧＩＦの分子量は、１７３７６．
５９である。
プチド■に一致するものと認められる。尚、アミノ酸配
列から計算されたｒ−ＧＩＦの分子量は、１７３７６．
５９である。
抗腫瘍活性試験（インビボ）
上記実施例２の（ｎ）で得たｒ−ＧＩＦのインビボにお
ける抗腫瘍活性試験を以下の通り行なった。
ける抗腫瘍活性試験を以下の通り行なった。
（１）腫瘍細胞Ａ３７５の１００００００．ｅｔｌ胞を
、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの皮下に接種（ｓ、ｃ、
）した（第Ｏ日月）。次いで、第１０日目〜第１５日目
に、ｒ−ＧＩＦの１０万単位／体重を１日１回各々実験
動物の腫瘍細胞内に投与した。実験動物名６匹を１試験
群とした。対照（コントロール）群にはＰＢＳのみを同
様に投与した。
、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの皮下に接種（ｓ、ｃ、
）した（第Ｏ日月）。次いで、第１０日目〜第１５日目
に、ｒ−ＧＩＦの１０万単位／体重を１日１回各々実験
動物の腫瘍細胞内に投与した。実験動物名６匹を１試験
群とした。対照（コントロール）群にはＰＢＳのみを同
様に投与した。
試験結果を第１９図に示す。該図において横軸は腫瘍細
胞接種後日数（日）を、縦軸は腫瘍重量（（］ ＞を示
し、曲線（１）は対照群を、曲線（２）はｒ−ＧＩＦ投
与投与量れぞれ示す。また腫瘍重量は、ＳＤ士平均（ｍ
ｅａｎ）で示されており、曲線（１）における＊はスチ
ュデンッＴ−テストにおけるＰ＜０．０５を、＊＊は同
テストにおけるＰ＜０．０１を示す。
胞接種後日数（日）を、縦軸は腫瘍重量（（］ ＞を示
し、曲線（１）は対照群を、曲線（２）はｒ−ＧＩＦ投
与投与量れぞれ示す。また腫瘍重量は、ＳＤ士平均（ｍ
ｅａｎ）で示されており、曲線（１）における＊はスチ
ュデンッＴ−テストにおけるＰ＜０．０５を、＊＊は同
テストにおけるＰ＜０．０１を示す。
（２）腫瘍細胞ＭｅｔｈＡの２０００００細胞を、ＢＡ
ＬＢ／ｃヌードマウスに皮肉接種（ｉ、ｄ、） した（
第Ｏ０目）。次いで、第７日日と第８日日に、ｒ−ＧＩ
Ｆの１０万単位／体重を各１回実験動物の腫瘍ｍ膣内に
投与した。実験動物各７匹を１試験群とした。対照（コ
ントロール）群にはＰＢＳのみを同様に投与した。
ＬＢ／ｃヌードマウスに皮肉接種（ｉ、ｄ、） した（
第Ｏ０目）。次いで、第７日日と第８日日に、ｒ−ＧＩ
Ｆの１０万単位／体重を各１回実験動物の腫瘍ｍ膣内に
投与した。実験動物各７匹を１試験群とした。対照（コ
ントロール）群にはＰＢＳのみを同様に投与した。
試験結果を第２０図に示す。該図において横軸は腫瘍細
胞接種後日数（日）を、縦軸は腫瘍重量（（１）を示し
、曲線（１）は対照群を、曲線（２）はｒ−ＧＩＦ投与
投与量れぞれ示す。また腫瘍重量は、ＳＤ士平均（ｍｅ
ａｎ）で示されており、曲線（１）における＊＊はスチ
ュデンッＴ−テストにおけるＰ＜０．０１を示す。
胞接種後日数（日）を、縦軸は腫瘍重量（（１）を示し
、曲線（１）は対照群を、曲線（２）はｒ−ＧＩＦ投与
投与量れぞれ示す。また腫瘍重量は、ＳＤ士平均（ｍｅ
ａｎ）で示されており、曲線（１）における＊＊はスチ
ュデンッＴ−テストにおけるＰ＜０．０１を示す。
上記試験においては、ｒ−ＧＩＦ投与群実験動物の５匹
において腫瘍の退行が認められた。
において腫瘍の退行が認められた。
実施例３
実施例２で得られたプラスミドＩＩＧＩ−Ｆ−αを利用
して、該実施例２と同様の操作を行なうことにより所望
のｒ−ＧＩＦ、例えばポリペプチド■、■及び■を製造
できる。
して、該実施例２と同様の操作を行なうことにより所望
のｒ−ＧＩＦ、例えばポリペプチド■、■及び■を製造
できる。
例えばポリペプチドＩＶは、以下の方法により製造でき
る。即ち、先ずプラスミドｐＧＩＦ−αがら、Ｈｇ１Ａ
■−ＮＣｏＩ ＤＮＡフラグメント（約０．１ｋｂｐ）
及びＮｃｏＩ−８ｔｕＩ ＤＮＡフラグメント（約０
．．８ｋｂｐ ）の２つのフラグメントを単離する。次
いでポリペプチド■Ｖのアミノ末端領域の４アミノ酸コ
ドンを有し、且つプラスミドｐＴＭＩのｔｒｐプロモー
ターの下流に結合できるように構築した合成オリゴヌク
レオチドを、上記ｆ−１ｏｉＡＩ−ＮｃｏＩ ＤＮＡ
７ラクメントトＪＭすせる。更にかくして得られたＤＮ
Ａフラグメントと上記ＮｃｏＩ−８ｔｕＩ ＤＮＡフ
ラグメントとを、順次、プラスミドベクターのｔｒｐプ
ロモーターの下流に結合させる。
る。即ち、先ずプラスミドｐＧＩＦ−αがら、Ｈｇ１Ａ
■−ＮＣｏＩ ＤＮＡフラグメント（約０．１ｋｂｐ）
及びＮｃｏＩ−８ｔｕＩ ＤＮＡフラグメント（約０
．．８ｋｂｐ ）の２つのフラグメントを単離する。次
いでポリペプチド■Ｖのアミノ末端領域の４アミノ酸コ
ドンを有し、且つプラスミドｐＴＭＩのｔｒｐプロモー
ターの下流に結合できるように構築した合成オリゴヌク
レオチドを、上記ｆ−１ｏｉＡＩ−ＮｃｏＩ ＤＮＡ
７ラクメントトＪＭすせる。更にかくして得られたＤＮ
Ａフラグメントと上記ＮｃｏＩ−８ｔｕＩ ＤＮＡフ
ラグメントとを、順次、プラスミドベクターのｔｒｐプ
ロモーターの下流に結合させる。
かくして、エシェリヒア・コリー内で、ｔｒｐプロモー
ターの制御下に、ポリペプチドＩＶを発現する所望のプ
ラスミドを構築する。
ターの制御下に、ポリペプチドＩＶを発現する所望のプ
ラスミドを構築する。
該プラスミドを、プラスミドｐｔｒｐＧ Ｉ Ｆ−αの
代りに利用して、実施例２と同一操作を繰返すことによ
り、目的のポリペプチド■を収得できる。
代りに利用して、実施例２と同一操作を繰返すことによ
り、目的のポリペプチド■を収得できる。
実施例４
ｐｔｒｐＧ Ｉ Ｆ−αを用いて、サイト−スペシフィ
ック ミュータジエネシス（Ｓ ｉｔｅ −Ｓ ｐｅｃ
ｉｆｉｃｌｖｌｕｔａｇｅｎｅｓｔｓ） （Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、、８１ 。
ック ミュータジエネシス（Ｓ ｉｔｅ −Ｓ ｐｅｃ
ｉｆｉｃｌｖｌｕｔａｇｅｎｅｓｔｓ） （Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、、８１ 。
５６６２−５６６６ （１９８４））の方法に従い、ポ
リペプチドエのアミン末端から７１番目のＣｙｓをＳｅ
ｒに変更したＧＩＦ （７１Ｓｅｒ−ｒ−ＧＩＦ）を以
下の通り製造した。
リペプチドエのアミン末端から７１番目のＣｙｓをＳｅ
ｒに変更したＧＩＦ （７１Ｓｅｒ−ｒ−ＧＩＦ）を以
下の通り製造した。
即ち、Ｍ１３ｍａｌｌファージベクターを、−木調（ｓ
ｓ）ＤＮＡ鋳型とした。プラスミドｐｔｒｐＧＴＦ−ａ
より、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメント
を切り出し、Ｍ１３ｍｐ１１ファージのＥＣ０ＲＩとＢ
ａｍＨＩの制限酵素サイトにクローニングし、これから
−木調（ｓｓ） ＤＮＡ （Ｍｌ ３−ＧＩＦ−α）を
得、これをミュータジエネシスの鋳型として用いた。
ｓ）ＤＮＡ鋳型とした。プラスミドｐｔｒｐＧＴＦ−ａ
より、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメント
を切り出し、Ｍ１３ｍｐ１１ファージのＥＣ０ＲＩとＢ
ａｍＨＩの制限酵素サイトにクローニングし、これから
−木調（ｓｓ） ＤＮＡ （Ｍｌ ３−ＧＩＦ−α）を
得、これをミュータジエネシスの鋳型として用いた。
合成オリゴヌクレオチド（ＣＴＧＴＣＣＴＣＡＧＴＧＴ
ＴＧ （ブライマー）〕を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼでリン酸化し、これをＳＳＭ １３−ＧＦ−α Ｄ
ＮＡとハイブリダイズし、アニーリング後、ＤＮＡポリ
メラーゼエ、クレノーフラグメント及びＴ４ＤＮＡリガ
ーゼで各々処理し、１５℃で１８時間インキュベートし
た。
ＴＧ （ブライマー）〕を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼでリン酸化し、これをＳＳＭ １３−ＧＦ−α Ｄ
ＮＡとハイブリダイズし、アニーリング後、ＤＮＡポリ
メラーゼエ、クレノーフラグメント及びＴ４ＤＮＡリガ
ーゼで各々処理し、１５℃で１８時間インキュベートし
た。
得られたＤＮＡをＪＭ１０５コンとテント細胞にトラン
スフオームし、生じたファージプラークを、寒天プレー
ト上に５０コロニー植菌し、３７℃で１８時間培養した
、生育したコロニーを含むフィルターを通常の方法によ
りアルカリ変性し、乾燥後、８０℃で２時間ベークした
。上記ＤＮＡをプレハイブリダイズした後、このものと
、上記プライマーを３２Ｐ−ｒ−ＡＴＰでラベルした３
２ｐ−プローベとを、室温でハイブリダイズさせた。ハ
イブリダイズさせたフィルターを、６×ＳＳＣバツフア
ーで、室温で１０分間、次いで３７℃で１０分間各々洗
浄し、乾燥後、−７０℃で１８時間オートラジオグラフ
ィーを行なった。
スフオームし、生じたファージプラークを、寒天プレー
ト上に５０コロニー植菌し、３７℃で１８時間培養した
、生育したコロニーを含むフィルターを通常の方法によ
りアルカリ変性し、乾燥後、８０℃で２時間ベークした
。上記ＤＮＡをプレハイブリダイズした後、このものと
、上記プライマーを３２Ｐ−ｒ−ＡＴＰでラベルした３
２ｐ−プローベとを、室温でハイブリダイズさせた。ハ
イブリダイズさせたフィルターを、６×ＳＳＣバツフア
ーで、室温で１０分間、次いで３７℃で１０分間各々洗
浄し、乾燥後、−７０℃で１８時間オートラジオグラフ
ィーを行なった。
変異した５クローンの内から代表としてＭ１３−ＧＩＦ
−７１ｓを選びこれをＪＭｌ ０５に感染させて培養し
、ｓｓＤ Ｎ Ａ及びＲＦ、ＤＮＡを調製した。
−７１ｓを選びこれをＪＭｌ ０５に感染させて培養し
、ｓｓＤ Ｎ Ａ及びＲＦ、ＤＮＡを調製した。
上記で得たｓｓＤ Ｎ ＡのＭ１３デオキシヌクレオチ
ド シークエンジングにより目的の遺伝子の変異の確認
を行なった。
ド シークエンジングにより目的の遺伝子の変異の確認
を行なった。
また上記ＲＦ ＤＮＡにおいて、新しくできた制限酵
素Ｑｄｅ］：サイトも確認できた。
素Ｑｄｅ］：サイトも確認できた。
ＪＭｌ ０５で増殖させたＲＦ ＤＮＡより、ＥＣＯ
ＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを調製し、これを前記実
施例２の（ＩＩ）と同様にして発現ブラスミトニ組込ミ
、所望（７）” ５ｅｒ−ｒ −Ｇ Ｉ Ｆ発現プラス
ミド（ｐｔｒｐＧ Ｉ Ｆ−ａ−７１８）を得た。
ＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを調製し、これを前記実
施例２の（ＩＩ）と同様にして発現ブラスミトニ組込ミ
、所望（７）” ５ｅｒ−ｒ −Ｇ Ｉ Ｆ発現プラス
ミド（ｐｔｒｐＧ Ｉ Ｆ−ａ−７１８）を得た。
このプラスミドを用いて、前記実施例２の（［）と同様
にして、菌体抽出物上清を得、該上清のＧＩＦ活性を測
定した。
にして、菌体抽出物上清を得、該上清のＧＩＦ活性を測
定した。
結果を下記第８表に示す。
第 ８ 表
検 体 ＧＩ’Ｆ活性（
単位／鶴培養液） 対照（エシェリヒア・ コリーＨＢ１０１／１）ｔｒｌ）４７３．８Ｘ１０３Ｇ
ＩＦ−α） エシェリヒア・コリー １−ＩＢ１０１／１）ｔｒｉｌＧＩＦ ４３４．６Ｘ
１０３−α−７１８抽出物
単位／鶴培養液） 対照（エシェリヒア・ コリーＨＢ１０１／１）ｔｒｌ）４７３．８Ｘ１０３Ｇ
ＩＦ−α） エシェリヒア・コリー １−ＩＢ１０１／１）ｔｒｉｌＧＩＦ ４３４．６Ｘ
１０３−α−７１８抽出物
第１図は実施例１の（Ｉ）に示す天然型ＧＩＦのゲルク
ロマトグラフィー分析結果を示す。第２図は同例のＧＩ
Ｆのクロマトフオーカシング分析結果を示す。第３図は
同例のＧＩＦの逆相高速液−１３３一 体クロマトグラフイー分析結果を示す。 第４図は実施例１の（Ｉ［）に示す天然型ＧＩＦのゲル
クロマトグラフィー分析結果を示す。第５図は同例のＧ
ＩＦの５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動の結果を示す。第
６図は同例のＧＩＦの等電点電気泳動の結果を示す。第
７図は上記等電点電気泳動によるＧＩＦ活性とｌ）Ｈと
の関係を示すグラフである。第８図は同例のＧＩＦの各
種レクチンカラムに対する親和性を調べたグラフである
。第９図は同例のＧＩＦの各種希釈倍率におけるＧＩＦ
活性を求めたグラフである。第１０図は同例のＧＩＦの
癌細胞に対するコロニー抑制試験の結果を示すグラフで
ある。第１１図及び第１２図は同例のＧＩＦの各種癌細
胞に対する増殖抑制試験の結果を示すグラフである。第
１３図は同例に示すＧＩＦの培養時間と活性との関係を
示すグラフである。 第１４図は実施例２に用いるクローンＩ−２の有するプ
ラスミドｐＧＩＦ−αの制限酵素地図を示す。第１５図
は実施例２の（１）に従い上記ｐＧＩＦ−αをベクター
プラスミドｐ ＩＮＩ［１Ａ−３に組込んでプラスミド
ｐ ＩｆｌＩｆ−ＧＩＦ−αを構築する概略図を示す。 第１６図は実施例２の（Ｉ［）に従いｐＧＩＦ−αとプ
ラスミドｐＴＭＩとからプラスミド ｐｔｒｐＧＩＦ−
αを構築する概略図を示す。第１７図及び第１８図は実
施例２の（ＩＩ）で得られた組換えＧＩＦのＳＤ、５−
ＰＡＧＥゲル電気泳動の結果を示す。第１９図及び第２
０図は、実施例２の（ＩＩ）で得られた組換えＧｒＦの
インビボにおける抗腫瘍活性を調べたグラフである。 （以 上） 第５図 第６図 ■■■■ 第８図 ＣｏｎＡ ＷＧＡ ＵＥＡ−Ｉ ＤＢＡ ＰＮＡ
ＳＢＡ ＷＦＡ ＳＪＡ第９図 り黒春欲借字 第１０図 Ｒ顔Ｇ Ｉ Ｆ ５ｊＡ ）Ｌ （ＬＪ／ｍｌ）第１１
図 対照ＧＩＦ ４度（／ｍ＋） 第１２図 対照 ＧＩＦ−、！崖 （％１） 第１３図 埼肴Ｂ今間（時間） 第１７図 ｓ１８図 第１９図 Ｔ；ＳＤ 賛； Ｐ＜ ０．０５ 剥神：Ｐ＜０．０１ 第２０図 誉併； Ｐ＜０．０１
ロマトグラフィー分析結果を示す。第２図は同例のＧＩ
Ｆのクロマトフオーカシング分析結果を示す。第３図は
同例のＧＩＦの逆相高速液−１３３一 体クロマトグラフイー分析結果を示す。 第４図は実施例１の（Ｉ［）に示す天然型ＧＩＦのゲル
クロマトグラフィー分析結果を示す。第５図は同例のＧ
ＩＦの５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動の結果を示す。第
６図は同例のＧＩＦの等電点電気泳動の結果を示す。第
７図は上記等電点電気泳動によるＧＩＦ活性とｌ）Ｈと
の関係を示すグラフである。第８図は同例のＧＩＦの各
種レクチンカラムに対する親和性を調べたグラフである
。第９図は同例のＧＩＦの各種希釈倍率におけるＧＩＦ
活性を求めたグラフである。第１０図は同例のＧＩＦの
癌細胞に対するコロニー抑制試験の結果を示すグラフで
ある。第１１図及び第１２図は同例のＧＩＦの各種癌細
胞に対する増殖抑制試験の結果を示すグラフである。第
１３図は同例に示すＧＩＦの培養時間と活性との関係を
示すグラフである。 第１４図は実施例２に用いるクローンＩ−２の有するプ
ラスミドｐＧＩＦ−αの制限酵素地図を示す。第１５図
は実施例２の（１）に従い上記ｐＧＩＦ−αをベクター
プラスミドｐ ＩＮＩ［１Ａ−３に組込んでプラスミド
ｐ ＩｆｌＩｆ−ＧＩＦ−αを構築する概略図を示す。 第１６図は実施例２の（Ｉ［）に従いｐＧＩＦ−αとプ
ラスミドｐＴＭＩとからプラスミド ｐｔｒｐＧＩＦ−
αを構築する概略図を示す。第１７図及び第１８図は実
施例２の（ＩＩ）で得られた組換えＧＩＦのＳＤ、５−
ＰＡＧＥゲル電気泳動の結果を示す。第１９図及び第２
０図は、実施例２の（ＩＩ）で得られた組換えＧｒＦの
インビボにおける抗腫瘍活性を調べたグラフである。 （以 上） 第５図 第６図 ■■■■ 第８図 ＣｏｎＡ ＷＧＡ ＵＥＡ−Ｉ ＤＢＡ ＰＮＡ
ＳＢＡ ＷＦＡ ＳＪＡ第９図 り黒春欲借字 第１０図 Ｒ顔Ｇ Ｉ Ｆ ５ｊＡ ）Ｌ （ＬＪ／ｍｌ）第１１
図 対照ＧＩＦ ４度（／ｍ＋） 第１２図 対照 ＧＩＦ−、！崖 （％１） 第１３図 埼肴Ｂ今間（時間） 第１７図 ｓ１８図 第１９図 Ｔ；ＳＤ 賛； Ｐ＜ ０．０５ 剥神：Ｐ＜０．０１ 第２０図 誉併； Ｐ＜０．０１
Claims (1)
- （１）下記一次構造のポリペプチドＡをその構成蛋白と
して含み、腫瘍細胞増殖抑制活性を有することを特徴と
する抗腫瘍活性物質ＧＩＦ。 【アミノ酸配列があります】 〔式中、ＸはＳｙｓ又はＳｅｒを示す。ＺはＨをすか又
は下記アミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で示されるペプチド又はそのＮ末端側からこの配列に従
い１もしくはそれ以上のアミノ酸を欠失するペプチド又
はアミノ酸を表わす。〕
Applications Claiming Priority (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59-271207 | 1984-12-21 | ||
| JP27120784 | 1984-12-21 | ||
| JP60-138281 | 1985-06-24 | ||
| JP13828085 | 1985-06-24 | ||
| JP60-138280 | 1985-06-24 | ||
| JP13828185 | 1985-06-24 | ||
| JP22088285 | 1985-10-03 | ||
| JP60-220882 | 1985-10-03 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7353325A Division JP2721854B2 (ja) | 1984-12-21 | 1995-12-29 | 抗腫瘍活性物質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62174022A true JPS62174022A (ja) | 1987-07-30 |
| JP2583753B2 JP2583753B2 (ja) | 1997-02-19 |
Family
ID=27472130
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60284699A Expired - Lifetime JP2583753B2 (ja) | 1984-12-21 | 1985-12-17 | 抗腫瘍活性物質およびその製造法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2583753B2 (ja) |
| ES (2) | ES8801944A1 (ja) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5993093A (ja) * | 1982-10-19 | 1984-05-29 | シ−タス・コ−ポレイション | 変形されたインターロイキン―２及びその製造方法 |
| JPS617296A (ja) * | 1984-06-19 | 1986-01-13 | イミユネツクス、コ−ポレ−シヨン | インタ−ロイキン１の遺伝子の精製、クロ−ニング及び特性づけ |
-
1985
- 1985-12-17 JP JP60284699A patent/JP2583753B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-20 ES ES551055A patent/ES8801944A1/es not_active Expired
-
1987
- 1987-07-15 ES ES557623A patent/ES8802539A1/es not_active Expired
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5993093A (ja) * | 1982-10-19 | 1984-05-29 | シ−タス・コ−ポレイション | 変形されたインターロイキン―２及びその製造方法 |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES557623A0 (es) | 1988-07-16 |
| ES8802539A1 (es) | 1988-07-16 |
| ES8801944A1 (es) | 1988-03-16 |
| JP2583753B2 (ja) | 1997-02-19 |
| ES551055A0 (es) | 1988-03-16 |
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