DK172339B1

DK172339B1 - Anvendelse af IL-1alfa eller derivat deraf til fremstilling af et lægemiddel til fremme af CSF-produktion eller til helbredelse af en malign tumor

Info

Publication number: DK172339B1
Application number: DK051493A
Authority: DK
Inventors: Kiyoshi Ishii; Yasuo Yanagihara; Yoshikatsu Hirai; Satoru Nakai; Mayumi Kaneta; Kazuyoshi Kawai; Yoshikazu Kikumoto; Yeong-Man Hong; Setsuko Takegata
Original assignee: Otsuka Pharma Co Ltd
Priority date: 1986-03-14
Filing date: 1993-05-05
Publication date: 1998-04-06
Also published as: DK127787A; US5008374A; DK171647B1; DK127787D0; EP0237073B1; EP0237073A2; US5371204A; JPS63164899A; US5342615A; ES2009216A6; DE3750432T2; JP2572220B2; DK51493D0; EP0237073A3; EP0578278A1; DE3750432D1; HK1003115A1; KR870009023A; KR950000886B1; US5702698A

Description

i DK 172339 B1

Den foreliggende opfindelse angår anvendelsen af IL-ΐα eller derivat deraf med samme biologiske virkning til fremstilling af et lægemiddel til fremme af CSF-produktion eller til helbredelse af en malign tumor.

5 Den anden internationale Lymphokin Workshop be sluttede at vælge at bruge et fælles navn, interleukin-1 (IL-1), for de fysiologisk aktive materialer, som havde været betegnet lymfocytaktiverende faktor (LAF), mi-togent protein, hjælper top-1, T-celleerstattende faktor 10 III (TRF-III), T-celleerstattende faktor Mø (TRFM), B-celle aktiverende faktor, B-celledifferentieringsfaktor, osv. (Cellular Immunol., 48, 433-436 (1979)). Denne beslutning er baseret på, at disse fysiologisk aktive materialer ikke kan skelnes fra hinanden som forskellige 15 materialer, men blot betegnes forskelligt i forbindelse med fysiologiske virkninger bedømt ud fra forskellige vinkler.

Endvidere er det rapporteret, at IL-1 aktiverer T-lymfocytter og B-lymfocytter, har virkning til at 20 fremme dannelse af interleukin-2 og antistoffer, virker på lever og væv til fremme af proteinsyntese og har virkning til at fremme dannelse af prostaglandiner (se Reviews of Infectious Disease, Vol. 6, No. 1, 51-59 (1984), New England J. of Med., 311, 1413 (1984), 25 etc.).

Medens man stadig mangler at eftervise at IL-1 selv er et stof, har der lige fornylig været rapporteret om tilstedeværelsen af to forskellige gener, der koder for polypeptider med LAF-virkning eller precursorer der-30 for (Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 81, 7907-7911 (1984), Nature, Vol. 315, 641 (1985), Nucleic Acid Research,

Vol. 13 (16), 5869 (1985)).

Ifølge dette skrift fandt man, at en kultursu-pernatant opnået ved genrekombinantmetoder havde LAF-35 virkning og på basis af denne opdagelse fandt man, at polypeptidet, der har den følgende formel (A) og betegnes "IL-la", er et polypeptid med LAF-virkning.

2 DK 172339 B1 5 10

Ser - Ala - Pro - Phe - Ser - Phe - Leu - Ser - Asn - Val - 5 15 20

Lys - Tyr - Asn - Phe - Met - Arg - Ile - Ile - Lys - Tyr - 25 30

Glu - Phe - Ile - Leu - Asn - Asp - Ala - Leu - Asn - Gin - 35 40 10 Ser - Ile - Ile - Arg - Ala - Asn - Asp - Gin - Tyr - Leu - 45 50

Thr - Ala - Ala - Ala - Leu - His - Asn - Leu- Asp - Glu - 55 60

Ala - Val - Lys - Phe - Asp - Met - Gly - Ala - Tyr - Lys - 15 55 70

Ser - Ser - Lys - Asp - Asp - Ala - Lys - Ile - Thr - Val - 75 80

Ile - Leu - Arg - Ile - Ser - Lys - Thr - Gin - Leu - Tyr - on 85 90 20 Val - Thr - Ala - Gin - Asp - Glu - Asp - Gin - Pro - Val - 95 100

Leu - Leu - Lys - Glu - Met - Pro - Glu - Ile - Pro - Lys - 105 110

Thr - Ile - Thr - Gly - Ser - Glu - Thr - Asn - Leu - Leu - 25 115 120

Phe - Phe - Trp - Glu - Thr - His - Gly - Thr - Lys - Asn - 125 130

Tyr - Phe - Thr - Ser - Val - Ala - His - Pro - Asn - Leu - 135 140 30 phe - Ile - Ala - Thr - Lys - Gin - Asp - Tyr - Trp - Val - 145 150

Cys - Leu - Ala - Gly - Gly - Pro - Pro - Ser - Ile - Thr - 155

Asp - Phe - Gin - Ile - Leu - Glu - Asn - Gin - Ala (A) 35 3 DK 172339 B1

Det har imidlertid ikke været beskrevet, at det foran beskrevne aktive materiale, og det fysiologisk aktive materiale, der ifølge skriftet kendes som det såkaldte IL-l, fremstilles og isoleres som et homogent ma-5 teriale, og der er heller ikke beskrevet noget om den fysiologiske virkning af et sådant homogent materiale, specielt for så vidt angår virkningen til fremme af CSF-produktion eller til helbredelse af en malign tumor.

Man har ifølge opfindelsen udført en intensiv 10 forskning vedrørende IL-Ια som et homogent materiale og allerede udviklet en fremgangsmåde til fremstilling af dette materiale, og afklaret dets egenskaber, fysiologiske virkning, osv. På basis af resultaterne af denne forskning har man også fastslået, at polypeptidet med 15 den foranstående formel (A) har LAF-virkning.

Ikke desto mindre har det overraskende vist sig, at dette polypeptid, skønt det som beskrevet, svarer til et gen i den levende organisme, er ustabilt som et materiale.

20 Man har derfor også tilvejebragt et hidtil ukendt polypeptid (IL-la-derivat), som adskiller sig fra polypeptidet med formlen (A) med hensyn til aminosyresek-vens, er mere stabilt som materiale og har passende egenskaber til medicinske anvendelser. Nærmere angivet 25 har man ved genmanipulationsmetoder tilvejebragt et polypeptid med en modificeret interleukin-a-aminosyrese-kvens med den foranstående formel (A), hvori mindst én aminosyre valgt blandt Asn i 36-stillingen og Cys i 141-stillingen mangler eller er erstattet af en anden 30 aminosyre. Disse interleukin-la-derivater, deres fremstilling og deres medicinske anvendelse er beskrevet i beskrivelsen til dansk patentansøgning nr. 1277/87.

Aminosyrer og polypeptider betegnes heri med symboler ifølge nomenclaturen eller reglerne anbefalet af 35 IUPAC og IUPAC-IUB eller symboler, der sædvanligvis an- 4 DK 172339 B1 vendes indenfor teknikken. Nucleinsyrerne i basesekvenser udtrykkes på lignende måde.

IL-la og IL-Ia -derivater anvendt ifølge opfindelsen har fysiologiske virkninger, såsom LAF-virkning, 5 hæmmende virkning på tumorcellers vækst (GIF-virkning eller aktivitet), dvs. virkning til specifikt at hæmme tumorcellers vækst, virkning til at fremme dannelse af forskellige cytokiner, såsom kolonistimulerende faktor (CSF), interferon (IFN), interleukin-2 (IL-2) og inter-10 leukin-3 (IL-3), dvs. f.eks. virkning på humane celler til i høj grad at fremme dannelsen af sådanne cytokiner, antiinflammatorisk virkning, dvs. virkning til f.eks. effektivt at hæmme arthritis fremadskriden, når det administreres til modeldyr med arthritis, og virkning til 15 hindring af stråleskade, dvs. virkning til at hindre eventuelle skader på den levende organisme eller alvorlige bivirkninger, der vil fremkomme ved systemisk bestråling ved benmarvstransplantation, bestråling til behandling af cancer og stråleulykker. Følgelig er IL-la 20 og IL-1a-derivater anvendt ifølge opfindelsen meget nyttige i form af lægemidler såsom immunsystemstimulerende midler, f.eks. til at fremme dannelse af antistoffer og forstærke virkningen af vacciner, antitumormidler, midler til at fremme dannelse af cytokiner, såsom CSF, IFN, 25 IL-2 og IL-3, antiinflammatoriske midler, midler til hindring af strålesyge og andre lignende lægemidler.

IL-la og IL-1 a-derivater anvendt ifølge opfindelsen er især effektive som middel til at fremme CSF-dan-nelse. Ved administrering til mennesker, kurerer IL-la 30 og IL-1 a-derivater anvendt ifølge opfindelsen f.eks. effektivt granulocytopenia på grund af formindsket dannelse af benmarv som et resultat af kemoterapi eller stråleterapi mod cancer uden at give sandsynlighed for virusinfektioner eller antigen-antistofreaktion (granulo-35cytopeniahelbredende medikament). Midlet til at fremme CSF-dannelsen kan også anvendes til hindring og helbre- 5 DK 172339 B1 delse af forskellige sygdomme på grund af virkningen af CFS, hvis dannelse fremmes på grund af det nævnte middel. CSF virker f.eks. fremmende på granulocyters og makrofagers virkning (Lopez, A. F. et al., J. Immunol., 5131, 2983 (1983); Handam, E. et al., samme, 122, 1134 (1979) og Vadas, Μ. A. et al., samme, 130, 795 (1983)), således at man forventer klinisk anvendelse af CSF til hindring og helbredelse af forskellige infektioner. Midler, der fremmer CSF-dannelsen, forventes ligeledes 1 0 at være nyttige til klinisk anvendelse.

I de senere år har man bemærket, at kompromitterede værter med nedsat biofylaktisk evne lider af såkaldte opportunistiske infektioner eller terminalinfektioner, der forekommer når normalt harmløse organismer 15 bliver patogene. Klinisk skyldes disse infektioner patogene organismer, herunder gram-negative bacilli, såsom Pseudomonas og Serratia, virus såsom herpes simplex virus (HSV), Varicella-zoster virus (VZV) og cytomegalovirus (CMV), fungi såsom Candida albicans, Aspergillus fu-20 mlgatus og Nocardia asteroidea, protozoer, såsom Pneumocystis carlnii og Toxoplasma gondii, osv. Idet de antibiotika, der i dag anvendes ikke er helt effektive mod opportunistiske infektioner, ønskes det at udføre forskning i og udvikle nye medikamenter mod sådanne infektio-25 ner. IL-Ια og IL-la-derivater anvendt ifølge opfindelsen er også effektive til forebyggelse og helbredelse af opportunistiske infektioner, som ofte forekommer, især når der gives anticancermedikamenter. De er f.eks. nyttige til forebyggelse og helbredelse af forskellige in-30 fektioner, der udvikles under kemoterapeutisk behandling af akut leukæmia og benmarvstransplantation, såsom can-didosis, cryptococcosis, aspergillosis, zygomycosis, chromomycosis, virusinfektioner, cytomegalovirus pneumonia og komplikationer af disse infektioner.

35 Endvidere er IL-Ια og IL-1 a-derivater anvendt ifølge opfindelsen effektive til forebyggelse og helbre- 6 DK 172339 B1 delse af arthritis eller lignende, og derfor nyttige som antiinflammatorisk middel.

IL-la og iL-la-derivater anvendt ifølge opfindelsen har virkning til at inhibere tumorcellers vækst 5 (i det følgende betegnet "GIF-virkning" eller "GIF-ak-tivitet") som bestemt og sandsynliggjort ved fremgangsmåden beskrevet i eksemplet, der følger senere, idet de virker specifikt på forskellige tumorceller til at inhibere deres vækst. Følgelig anvendes antitumormid-10 let omfattende IL-la eller nævnte derivat deraf som dets aktive komponent hensigtsmæssigt som et kemoterapeutisk middel mod cancer, især i kombination med forskellige midler til behandling af maligne tumorer, med henblik på en kraftigere virkende terapeutisk behandling til op-15 nåelse af midlertidig bedring eller vedvarende midlertidig bedring.

Foruden de i det foregående nævnte terapeutiske formål kan IL-la eller nævnte derivat deraf endvidere anvendes effektivt, f.eks. til fremstilling af nyttige 20 cytokiner in vitro ud fra cellestammer på grund af dets cytokinproduktionsfremmende aktivitet. Opmærksomheden henledes på fremstillingen af cytokiner af glycoprotein-typen blandt de naturlige cytokiner, der fremstilles ud fra cellestammer. Nyttige cytokiner kan fremstilles ef-25 fektivt i store mængder.

Man har således erkendt hidtil ukendte biologiske virkninger af IL-la og nævnte derivater deraf. IL-la og nævnte derivater deraf har GIF-virkning og CSF-produk-tionsfremmende virkning og kan anvendes til de nævnte 30 forskellige terapeutiske formål på grund af disse biologiske virkninger.

I overensstemmelse med det ovenstående angår opfindelsen anvendelsen af IL-la eller derivat deraf med samme biologiske virkning til fremstilling af et læge-35 middel til fremme af CSF-produktion eller til helbredelse af en malign tumor.

DK 172339 Bl 7

Specielt er der tale om anvendelse af humant IL-lamed aminosyresekvensen med ovenstående formel (A) eller anvendelse af et polypeptid med aminosyresekvensen med den ovenstående formel (A), som er modificeret ved, 5 at mindst én af Asn i 36-stillingen og Cys i 141-stil-lingen mangler eller er erstattet af en anden aminosyre.

Mere specielle anvendelser ifølge opfindelsen er angivet i krav 3-6.

10 IL-ΐα eller andet polypeptid anvendt ifølge op findelsen kan f.eks. fremstilles ved genmanipulationsmetoder ved anvendelse af et gen, der koder for det specifikke polypeptid ifølge opfindelsen, dvs. ved inkorporering af genet i en mikroorganismevektor til fremkaldelse 15 af replikation, transkription og translation i mikroorganismecellen. Denne fremgangsmåde er fordelagtig, idet den muliggør masseproduktion.

Skønt genet, der skal anvendes ved denne fremgangsmåde, kan fremstilles udelukkende ved kemisk synte-20 se ud fra nucleinsyrer ved en sædvanlig fremgangsmåde, f.eks. ved phosphittriestermetoden (Nature, 310, 105 (1984)) eller lignende, er det hensigtsmæssigt at anvende genet, der koder for IL-Ια eller en precursor derfor. Ved den sædvanlige fremgangsmåde, der involverer 25 den ovennævnte kemiske syntese, modificeres genet til en nucleinsyresekvens, der koder for den i det foregående nævnte specifikke aminosyresekvens, hvorved det ønskede gen let kan fremstilles.

30 Genet, der koder for IL-Ια eller en precursor derfor kendes allerede. Genet, der koder for IL-Ια op nåedes, og det lykkedes at fremstille IL-ΐα ved genmanipulationsmetoder ved anvendelse af dette gen. Den anvendte serie af genmanipulationsmetoder vil blive be- 35 skrevet i referenceeksemplet, der følger senere.

Den ovenfor nævnte modificerede sekvens af nucleinsyrer (baser) fremstilles også ved en kendt frem- DK 172339 B1 s gangsmåde, som udføres i overensstemmelse med det ønskede polypeptids aminosyresekvens (Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laboratory (1982)).

Spaltning, ligering, phosphorylering, osv. af DNA 5 kan f.eks. udføres ved sædvanlige fremgangsmåder, herunder behandling med enzymer, såsom restriktionsenzymer, DNA-ligase, polynucleotidkinase og DNA-polymerase, der er let tilgængelige som kommercielle produkter. Isolationen og rensningen af genet og nucleinsyrerne omfattet 10 af disse fremgangsmåder udføres også på sædvanlig måde, f.eks. ved agarosegelelektroforese. Som det vil blive beskrevet delvist senere, replikeres det opnåede gen ved anvendelse af en sædvanlig vektor. DNA-fragmentet, der koder for den ønskede aminosyresekvens, og synteti-15 ske linkere kan også let fremstilles ved den i det foregående nævnte kemiske syntese. Codonet, der svarer til den ønskede aminosyre og skal anvendes ved fremgangsmåderne beskrevet i det foregående, er kendt og vælges efter ønske. En sædvanlig fremgangsmåde kan anvendes til 20 dette formål, f.eks. under hensyntagen til codonets anvendelsesfrekvens for værten, der skal anvendes (Nucl.

Acids Res., 9, 43-73 (1981)). Endvidere kan man til modifikation af codonet i den nucleinsyresekvens, det drejer sig om, f.eks. gribe til stedsspecifik mutagenese 25 (Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 5662-5666 (1984)), som den sædvanligvis udføres, og ved hvilken der sædvanligvis anvendes en primer omfattende et syntetisk oligonucleo-tid, der koder for den ønskede modificerede sekvens, ca.

15-30-mer.

30 Det ønskede gen opnået ved den foregående frem gangsmåde kan f.eks. undersøges med hensyn til dets basesekvens ved den kemiske modifikationsmetode ifølge Maxam-Gilbert (Meth. Enzym., 65, 499-560 (1980)) eller ved dideoxynucleotidkædetermineringsmetoden ved anven-35 delse af M13 Phage (Messing, J. og Vieira, J., Gene, 19, 269-276 (1982)).

9 DK 172339 B1

Skønt fremgangsmåderne og metoderne nævnt i det foregående derfor vil blive beskrevet i referenceeksemplet og eksemplerne, der følger senere, er fremgangsmåden ikke specifikt begrænset, og alle allerede kendte frem-5 gangsmåder indenfor teknikken kan anvendes.

Polypeptidet anvendt ifølge opfindelsen kan fremstilles ved sædvanlige, kendte genrekombinantmetoder ved anvendelse af det pågældende gen. Nærmere betegnet fremstilles det ved fremstilling af et rekombinant DNA, som 10 kan eksprimere det pågældende gen i værtsceller, transformation af DNA'et ind i værtscellen og inkubation af transformanten.

Nyttige værtsceller kan være enten eucaryotiske eller procaryotiske celler. De eucaryotiske celler om-15 fatter celler af hvirveldyr, gær, osv.. COS-celler, der er abeceller (Y. Gluzman, Cell, 23, 175-182 (1981)) di- hydrofolatreduktase-manglende stamme af kinesiske ham-sterovarieceller (G. Urlaub og L.A., Chasin, Proc.

Nat. Acad. Sci., U.S.A., 77, 4216-4220 (1980)), osv.

20 anvendes f.eks. i almindelighed som celler af hvirveldyr, skønt nyttige celler ikke er begrænset til disse celler. Nyttige ekspressionsvektorer af vertebratceller er de vektorer, hvori der er placeret en promotor opstrøms for genet, der skal eksprimeres, RNA-splejsnings-25 steder, polyadenyleringssted, transkriptionstermine-ringssekvens, osv. Disse vektorer kan endvidere, når det er nødvendigt, have et replikationsstartsted. Eksempler på nyttige ekspressionsvektorer omfatter pSV2dhfr med en indledende promotor for SV40 (S. Subramani, R. Mul-30 ligan og P. Berg, Mol. Cell. Biol., 1(9), 854-864), men er ikke begrænset til denne.

Gær anvendes i vid udstrækning som eucaryotisk mikroorganisme, og gærarter af slægten Saccharoymces kan i almindelighed anvendes. Eksempler på populære eks-35 pressionsvektorer for gær og lignende eucaryotiske mikroorganismer omfatter pAM82 med en promotor for genet 10 DK 172339 B1 for sur phosphatase (A. Miyanohara et al., Proc. Natl.

Acad. Sci., U.S.A., 80, 1-5 (1983), osv.

E. coll og Bacillus subtills anvendes i almindelighed som procaryotiske værter. Til polypeptidet an-5 vendt ifølge den foreliggende opfindelse anvendes der f.eks. plasmidvektorer, der er i stand til at replikere i værten. Til eksprimering af genet i vektoren kan man anvende ekspressionsplasmider, som har en promotor og SD-basesekvens (Shine Dalgarno-basesekvens) opstrøms for 10 genet og ATG, der kræves til initiering af proteinsyntese. E. coli-K12-stammen anvendes i vid udstrækning som værts-E. coli. pBR322 er en vektor, som i almindelighed anvendes. Imidlertid er opfindelsen ikke begrænset til disse, og talrige kendte stammer og vektorer kan anven-15 des. Eksempler på promotorer, der kan anvendes, er tryp-tophanpromotorer, PL-promotor, lac-promotor, lpp-promo-tor, osv. Genet kan eksprimeres ved anvendelse af en vilkårlig af disse promotorer.

Til beskrivelse af fremgangsmåden med henvisning 20 til det tilfælde, ved hvilket tryptophan-promotoren anvendes, anvendes vektoren pTMl (Fumio Imamoto, Taisha, (Metabolism), Vol. 22, 289 (1985)) med tryptophanpromo-tor og SD-sekvens som en ekspressionsvektor. Et gen, der koder for det ønskede polypeptid og om nødvendigt med 25 ATG bindes til stedet for restriktionsenzymet Clal, som findes nedstrøms for SD-sekvensen.

løvrigt kan ikke kun det direkte ekspressionssystem, men også et fusionsprotein-ekspressionssystem, ved hvilket der f.eks. anvendes β-galaktosidase, β-lactamase 30 eller lignende, anvendes.

Den således opnåede ekspressionsvektor indføres i værtsceller og transformeres således ved sædvanlige fremgangsmåder. F.eks. opsamles celler, hovedsagelig i den logaritmiske vækstfase, de behandles med Cacl2 og 35 præpareres derved til let at acceptere DNA, hvorefter vektoren indføres i cellen. Ved denne fremgangsmåde kan 11 DK 172339 B1

MgCl2 eller RbCl være til stede sammen med vektoren, hvorved der opnås en forbedret transformationseffektivitet, som det er almindelig kendt. Cellen kan omdannes til en spheroplast eller protoplast inden transforma-5 tion.

Den således opnåede ønskede transformant kan inkuberes på sædvanlig måde, hvorved det ønskede polypep-tid fremstilles og akkumuleres. Mediet til inkubationen kan være et vilkårligt af de medier, der sædvanligvis 10 anvendes til inkubation af celler, såsom L-medium, E-medium, M9-medium, osv. Forskellige carbonkilder, nitrogenkilder, uorganiske salte, vitaminer osv., som er alment kendte, kan blandes med disse medier. Når tryptop-hanpromotoren anvendes, kan minimalt M9-medium, hvori 15 der er blandet casaminosyre for at fremkalde promotorens virkning, f.eks. anvendes. Et kemikalium, såsom indola-crylsyre, til forøgelse af tryptophanpromotorens virkning, kan sættes til mediet under et passende trin af inkubationen.

20 Det ønskede polypeptid kan isoleres fra den resulterende kultur og renses ved sædvanlige fremgangsmåder. Det er ønskeligt, at ekstrahere polypeptidet fra værten under milde betingelser som f.eks. ved osmotisk chok, for at bevare dets højere ordensstruktur.

25 Den ovennævnte isolations- eller rensningsmetode udføres i det væsentlige ved samme fremgangsmåde som sædvanligvis anvendes til separation af et proteinlignende materiale fra et sådant biologisk materiale.

F.eks. kan man anvende forskellige fremgangsmåder, ved 30 hvilke de fysiske eller kemiske egenskaber af det ønskede polypeptid, udnyttes. (Se for eksempel, "Biological Data Book II,"pp. 1175-1259, 1. udgave, 1. oplag, Juni 23, 1980, udgivet af Kabushiki Kaisha Tokyo Kagaku-dojin.). Eksempler på anvendelige fremgangsmåder er be-35 handling under anvendelse af et sædvanligt proteinfældningsmiddel, ultrafiltrering, molekylsigtechromatografi 12 DK 172339 B1 (gelfiltrering), væskechromatografi, centrifugering, elektroforese, affinitetschromatografi, dialyse og kombinationer af sådanne fremgangsmåder.

Det ønskede polypeptid skilles fra supernatanten 5 som delvist renset. Denne delvise rensning udføres f.eks. ved en behandling med anvendelse af et organisk opløsningsmiddel, såsom acetone, methanol, ethanol, propanol eller dimethylformamid (DMF), eller et surt reagens, såsom eddikesyre, perchlorsyre (PCA) eller tri-10 chloreddikesyre (TCA), som proteinfældningsmiddel eller ved en behandling ved anvendelse af et udsaltningsmiddel, såsom ammoniumsulfat, natriumsulfat eller natriumfosfat og/eller ved ultrafiltrering ved anvendelse af en dialysemembran, en flad membran, en hulfibermembran el-15 ler lignende. Disse behandlinger udføres på samme måde som de normalt udføres under sædvanlige betingelser.

Det således opnåede groft rensede produkt udsættes dernæst for gelfiltrering, hvorved en fraktion, der udviser det ønskede materiales virkning, opsamles. An-20 vendelige gelfiltreringsmidler er ikke specifikt begrænsede. Sådanne midler omfatter dem der er fremstillet af dextrangel, polyacrylamidgel, agarosegel, polyacrylami-dagarosegel, cellulose eller lignende. Eksempler på nyttige, kommercielt tilgængelige midler er midler af Se-25 phadex G-typen, Sephadex LH-typen, Sepharose-typen,

Sephacryl-typen (alle produkter fra Pharmacia), Cellofine (Chisso Corporation), Biogel P-typen, Biogel A-ty-pen (begge produkter fra Bio-Rad Lab), Ultro gel-C (LKB), TSK-G-typen (produkt fra Toyo Soda Mfg. Co., 30 Ltd.), osv.

Polypeptidet anvendt ifølge opfindelsen kan isoleres fra fraktionen som et homogent materiale, f.eks. ved at udsætte fraktionen for affinitetschromatografi ved anvendelse af en hydroxyapatitkolonne, ionbytnings-35 chromatografi, f.eks. ved DEAE-, CM- eller SP-metoden, chromatofokuseringsmetoden, revers-fase HPLC eller lignende eller en kombination af sådanne metoder.

13 DK 172339 B1

Chromatofokuseringen kan udføres ved forskellige kendte metoder. PBE94 (Pharmacia Fine Chemicals) eller lignende, kan f.eks. anvendes som kolonne, imidazol-saltsyre eller lignende kan f.eks. anvendes som start-5 puffer og blandingen af polypuffer 74 (Pharmacia Fine Chemicals) og saltsyre (pH 4,0) eller lignende, kan f.eks. anvendes som elueringsmiddel.

Revers-fase HPLC kan f.eks. udføres med C^ Hi-Pore revers-fase HPLC-kolonne (Bio-Rad Laboratories) 10 eller lignende, ved anvendelse af acetonitril, trifluo-reddikesyre (TFA), vand eller lignende eller en blanding af sådanne opløsningsmidler som elueringsmiddel.

På denne måde kan IL-Ια og andet ifølge opfindelsen anvendt polypeptid opnås ved isolation.

15 IL-Ια og andet ifølge opfindelsen anvendt poly peptid, der som allerede angivet har fremragende farmakologiske egenskaber, kan formuleres til nyttige præparater til de tidligere nævnte medicinske anvendelser. Eksempler på sadanne medicinske præparater omfatter 20 immunostimulerende midler til dannelse af antistoffer, forstærkning af vacciners virkning og helbredelse af immundefekt, antitumormidler, cytokindannelsespromotorer, antiinflammatoriske midler, midler til forebyggelse eller helbredelse af stråleskade, midler til forebyggelse 25 eller helbredelse af opportunistiske infektioner, osv.

Disse medicinske præparater formuleres sædvanligvis i form af farmaceutiske midler, omfattende en farmakologisk effektiv mængde af polypeptidet og en passende bæ rer. Eksempler på nyttige farmaceutiske bærere omfatter 30 excipienser og fortyndingsmidler såsom fyldstoffer, forstrækningsmidler, bindemidler, befugtningsmidler, desintegreringsmidler, overfladeaktive midler, osv., som sædvanligvis anvendes til fremstilling af lægemidler, af den form der ønskes anvendt. Formen af lægemidlerne er 35 ikke specifikt begrænset, forsåvidt de faktisk indeholder polypeptidet, og de kan f.eks. foreligge i form af 14 DK 172339 B1 tabletter, pulverpræparater, granulatpræparater, piller eller lignende faste præparater. Det er imidlertid hensigtsmæssigt, at midlet foreligger i form af en opløsning, suspension, emulsion eller lignende til injektion.

5 Alternativt kan et sådant middel være et tørt produkt, der kan gøres flydende ved tilsætning af en passende bærer inden anvendelse. Lægemidlerne nævnt ovenfor kan fremstilles ved sædvanlige fremgangsmåder.

Lægemidlet administreres ad en passende vej i 10 overensstemmelse med formen af det opnåede lægemiddel. Lægemidlerne til injektion gives f.eks. intravenøst, in-tramuskulært, subcutant, intracutant, intraperitonealt eller på anden måde. De faste midler gives oralt eller intraintestinalt. Mængden af den aktive komponent i mid-15 let og dosen af midlet bestemmes hensigtsmæssigt i overensstemmelse med administreringsformen og -metoden, anvendelsesformålet, patientens symptomer osv. og kan ikke fastlægges entydigt. Det er i almindelighed ønskeligt at inkorporere ca. 1 til ca. 80 vægt% af den aktive kompo-20 nent i lægemidlet og at give præparatet i en daglig dosis fra ca. 0,1 yg til ca. 10 mg, beregnet som aktiv komponent, til voksne. Præparatet behøver ikke altid at blive givet én gang dagligt, men det kan gives i tre til fire delte doser dagligt.

25 Den foreliggende opfindelse vil blive beskrevet mere detaljeret i de følgende eksempler.

I de følgende eksempler bestemtes fysiologiske virkninger ved de følgende fremgangsmåder. 1 35 (1) Bestemmelse af IL-l-virkning.

Udtrykt som LAF-virkning som målt ved fremgangsmåden ifølge J. J. Oppenhein et al. (J. Immunol., 116, 1466 (1976)) ved anvendelse af thymusceller fra en mus af C3H/HeJ-stammen.

15 DK 172339 B1 (2) Bestemmelse af GIF-virkning.

Portioner (0,1 ml) af testopløsningen fortyndet til forskellige koncentrationer anbragtes i brøndene i en 96-brøndes mikroplade (Corning Co., Ltd.), 0,1 ml 5 Eagle's MEM-suspension indeholdende 10% FCS, indeholdende humane melanomaceller A375 i en mængde på 2 x 104 celler/ml anbragtes dernæst i hver brønd, og cellerne inkuberedes i en C02-inkubator (Napco Co., Ltd.) i 4 dage. Efter inkubationen anbragtes 0,05 ml 0,05% neutral-10 rød (Wako Junyaku Co., Ltd.) i hver brønd, hvorefter der inkuberedes ved 37°C i 2 timer. Efter fjernelse af su-pernatanten, hældtes 0,3 ml phosphorsyrepuffer-saltopløsning forsigtigt i hver brønd til vaskning. Efter fjernelse af vaskevæsken, anbragtes 0,1 ml af en blan-15 ding af natriumhydrogenphosphat og ethanol i lige store mængder i hver brønd, pladen blev rystet i adskillige minutter ved hjælp af en mikromikser, og mængden af pigment optaget i hver celle måltes ved en absorbans på 540 my ved anvendelse af et fotometer for 96-brøndes mikro-20 titerplader (Titer check multiscane, Flow Lab.) til bestemmelse af den væksthæmmende virkning. Testgruppen udviste 50%'s hæmning af kontrolgruppens cellevækst, dvs. at testgruppen, der udviste halvdelen af absorbansen målt for kontrolgruppen, identificeredes. Den reciprokke 25 værdi af antallet af fortyndingsgange for testgruppen blev taget som GIF-aktivitetsenheden. Følgelig har testopløsningen, når GIF-aktiviteten f.eks. er 10 enheder, hvis den fortyndes 10 gange, stadigvæk virkning til at hæmme cellevækst 50%.

30 Der refereres til de følgende tegningsfigurer i referenceeksemplet og eksemplerne.

Fig. 1 viser restriktionsenzymkort fra cDNA for plasmid pcD-GIF-16 og plasmid pcD-GIF-207.

Fig. 2 er et diagram, der viser hvorledes plasmid 35 ptrpIL-la-113 konstrueres ud fra plasmid pcD-GIF-207 og plasmid pTMl.

16 DK 172339 B1

Fig. 3 viser resultaterne af en antitumoraktivi-tetstest.

Fig. 4 og 5 viser resultaterne opnået ved testning af polypeptidet anvendt ifølge opfindelsen for 5 CSF-produkt ions fremmende virkning.

Referenceeksempel 1 (1) Inkubation af U937-celler.

Humane histiocytiske lymphoma-U937-celler (Ascen-10 so, J. L. et al.. Blood, Vol. 57, side 170 (1981)), i et antal på 1,4 x 109 anbragtes i rpmi-1640 kulturmedium indeholdende 25 ng/ml 12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA, produkt fra Pharmacia), 10 yg/ml concanava-lin A (ConA, produkt fra Sigma) og 10% FCS til fremstil-15 ling af en cellesuspension med en koncentration på 4 x 105 celler/ml.

Ti-ml1 s portioner af cellesuspensionen anbragtes separat i skåle (Falcon 3003) med en diameter på 9 cm og inkuberedes i 5% carbondioxidgas ved 37°C i 3 dage. Ef-20 ter fjernelse af kultursupernatanten ved sugning, anbragtes 10 ml RPMI-1640 medium indeholdende 10% FCS, 10 yg/ml bakterielt lipopolysaccharid (LPS, produkt fra Difco), l yg/ml muramyldipeptid (MDP, produkt fra Wako Pure Chemical Ind. Ltd. ) og l ng/ml TPA i hver skål.

25 Cellerne blev inkuberet i dette medium i 5% carbondioxidgas i 37°C i 18 timer. U937-cellerne, der hæftede til bunden af skålen anvendtes til fremstilling af mRNA.

(2) Fremstilling af mRNA.

30 RNA blev udtaget ved en kombination af guanidi- nium/varm phenolmetoden (Feramisco, J. R. et al., J.

Bio. Chem., Vol. 257, 11024 (1982)) og guanidinium/cae-siumchloridmetoden (Glisin, V, et al., Biochemistry,

Vol. 13, 2633 (1974)).

35 Til vaskning af U937 cellerne inkuberet ved frem gangsmåden (1) blev skålene skyllet med 5 ml PBS(-) op- 17 DK 172339 B1 løsning efter fjernelse af supernatanten. Cellerne opløstes dernæst med 1 ml 4 M guanidinisothiocyanatopløsning (4 M guanidinisothiocyanat (produkt fra Fluka), 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 10 mM EDTA og 2% natriumlauroylsarko-5 sinat) anbragtes i hver skål. Opløsningen opsamledes med "gummipolisher" og Pasteurpipette til opnåelse af 420 ml celleopløsning, som holdtes ved 60eC og ledtes gennem en 18G injektionsnål til ituskæring af kromosom-DNAet ved forskydningskræfter. Dernæst sattes phenol op-10 varmet til 60°C til opløsningen i en mængde, der var lige så stor som mængden af opløsningen, og blandingen om-rørtes med 18G-injektionsnål til yderligere ituskæring ved forskydningskræfter. Dernæst tilsattes 210 ml 0,1 M natriumacetat-10 mM tris-HCl (pH 7,4)-1 mM EDTA-15 opløsning og 420 ml chloroform-isoamylalkoholblanding (volumenforhold 24:1) til blandingen. Den resulterende blanding omrørtes kraftigt ved 60°C i 15 minutter, afkøledes dernæst med is og centrifugeredes ved 3000 omdr./min. ved 4°C i 20 minutter. Til det opsamlede van-20 dige lag sattes ethanol i en mængde, der var 2 gange mængden af det vandige lag. Man lod blandingen henstå natten over ved -70°C til opnåelse af råt RNA-precipi-tat. Det rå RNA opløstes i 48 ml 6M guanidinisothiocya-nat-5 mM natriumcitrat (pH 7,0)-0,1 M β-mercaptoethanol-25 0,5% natriumlauroylsarkosinatopløsning. Dernæst opløstes 19,2 g caesiumchlorid i opløsningen. Portioner af 7 ml af den resulterende opløsning anbragtes dernæst ovenpå 4 ml 5,7 M caesiumchlorid-0,1 M EDTA (pH 7,5). Blandingen centrifugeredes ved 31500 omdr./min. ved 25°C i 20 timer 30 med Beckman SW40Ti-rotor til opsamling af RNA.

Således opnåedes 9,7 mg RNA.

Til opnåelse af mRNA ud fra RNAet, underkastedes RNAet kolonnechromatografi ved anvendelse af oligo (dT)-cellulose (produkt fra Collaborative Research Inc.). Til 35 adsorption anvendtes 10 mM tris-HCl (pH 7,5)-0,5 M NaCl-1 mM EDTA. Til eluering anvendtes 10 mM tris-HCl (pH 7,5)-1 mM EDTA.

18 DK 172339 B1

Herved opnåedes 400 yg mRNA.

(3) Fremstilling af cDNA-bibliotek.

cDNA-bibliotek blev fremstillet ved Okayama-Berg-5 metoden, ved hvilken cDNA kan ekprimeres i dyreceller. dT-halevedhæftet vektorprimer til anvendelse ved cDNA-kloning blev således fremstillet ud fra plasmid pcDVi og dG halevedhæftet linker-DNA ud fra plasmid pLl, begge ved fremgangsmåden ifølge Okayama et al. (Okayama, H og 10 p. Berg, Molecular og Cellular Biology, Vol. 3, side 280 (1983)).

mRNA (15 yg) opnået ved fremgangsmåden (2) opløstes i 20 yl vandig 5 mM tris-HCl (pH 7,5)-0,5 mM EDTA (pH 7,5)-opløsning og inkuberedes ved 65°C i 5 minutter 15 og derefter ved 37°C i 5 minutter. Reaktionsblandingen blev justeret til en total mængde på 40 yl indeholdende 50 mM tris-HCl (pH 8,3), 8 mM MgCl2, 30 mM KCl, 0,3 mM dithiothreitol, 2 mM af hver af dATP, dGTP, dCTP og dTTP, 2,8 yg vektorprimer-DNA, 60 enheder RNase-inhibi-20 tor (produkt fra Promega Biotech) og 40 enheder omvendt transferase (produkt fra Bio-Lad), hvorefter den blev inkuberet ved 37eC i 1 time. Reaktionen blev afsluttet ved tilsætning af 2 yl 0,5 M EDTA (pH 7,5) og 2 yl 10% SDS. Dernæst underkastedes blandingen phenol-chloro-25 formekstraktion og chloroformekstraktion, og ekstraktet blev fældet fra ethanol til opsamling af vektor p r ime r-cDNA:mRNA.

Det opsamlede vektor primer cDNAtmRNA blev inkuberet ved 37°C i 5 minutter i 30 yl af en reaktionsblan-30 ding bestående af 140 mM natriumcacodylat, 30 mM tris-HCl (pH 6,8), 1 mM CaCl2, 0,1 mM dithiothreitol, 0,3 yg poly A, 66 yM dCTP og 38 enheder terminal deoxynucleoti-dyltransferase (produkt fra Pharmacia), hvorefter 1,5 yl 0,5 M EDTA (pH 7,5) og 1,5 yl 10% SDS sattes til blan-35 dingen til afslutning af reaktionen. Blandingen underkastedes phenol-chloroformekstraktion og chloroformeks- 19 DK 172339 B1 traktion, og ekstraktet blev fældet fra ethanol til opsamling af oligo dC-halevedhæftet cDNArmRNA-vektor primer.

Den opsamlede nucleinsyre blev inkuberet ved 37°C 5 i 90 min. i 20 μΐ af en reaktionsblanding omfattende 7 mM tris-HCl (pH 7,5)/ 7 mM MgCl2, 60 mM NaCl, 100 pg/ml bovint serumalbumin og 12 enheder af restriktionsenzymet Hindlll (produkt fra Nippon Gene Col, Ltd.). Dernæst sattes 1 μΐ 0,5 M EDTA (pH 7,5) og 1 μΐ 10% SDS til 10 blandingen til afslutning af reaktionen, hvorefter der udførtes ekstraktion med phenol-chloroform og derefter med chloroform og fældning fra ethanol til opsamling af Hindlll-digesteret oligo dC-halevedhæftet cDNA:mRNA-vektor primer. Produktet opløstes i 10 μΐ 10 mM tris-HCl 15 (pH 7,5)-1 mM EDTA (pH 7,5) (TE (pH 7,5)). Portioner af opløsningen på en μΐ blev inkuberet i 10 μΐ af en reaktionsblanding indeholdende det ovennævnte TE (pH 7,5), 0,1 M NaCl og oligo dC-halevedhæftet linker-DNA (14 ng), ved 65°C i 2 minutter og derefter ved 42°C i 30 minut-20 ter. Blandingen blev derefter afkølet til 0eC.

Reaktionsblandingens volumen blev justeret til 100 μΐ indeholdende 20 mM tris-HCl (pH 7,5), 4 mM MgCl2/ 10 mM (NH4)2S04, 0,1 M KCl, 50 μg/ml bovint serumalbumin, 0,1 mM β-NAD (nikotinamidadenindinucleotid, produkt 25 fra Pharmacia) og 0,6 μg E. coli-DNA-ligase (produkt fra Pharmacia) og inkuberet natten over ved 12°C. Til reaktionsblandingen sattes 40 μΜ af hver af dATP, dGTP, dCTP og dTTP og 0,15 mM β-NAD. Endvidere blev blandingen inkuberet ved 12°C i 1 time, og derefter ved 25°C i 1 time 3Omed tilsætning af 0,4 μg E. coli-DNA-ligase, 4,6 enheder E. coli-DNA-polymerase I (produkt fra Boehringer Mannheim) og 1 enhed E. coli-RNase H (produkt fra Pharmacia) .

E. coll HB101 blev transformeret ved anvendelse 35af den således opnåede reaktionsblanding. De kompetente celler af den anvendte stamme var et produkt fra Bethes- DK 172339 Bl 20 da Research Laboratories (BRL). Cellerne blev transformeret i overensstemmelse med BRL's manual.

Herved opnåedes et cDNA bibliotek, der indeholdt ca. 21000 kloner.

5 (4) Transfektion af abe Cos-l-celler.

cDNA-biblioteket opnået ved den foranstående fremgangsmåde (3) inddeltes i grupper, der hver i gennemsnit indeholdt ca. 70 kloner. Plasmid DNA blev frem-10 stillet fra hver gruppe.

Plasmid DNAet blev fremstillet ved den alkaliske lysemetode (Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, s. 368).

Inkuberede abeceller, COS-l-celler (Gluzman, Y., 15 Cell, Vol. 23, s. 175 (1981)), blev inficeret med plasmid DNA, der var fremstillet således ud fra hver gruppe, til transfektion. Transfektionen udførtes ved DEAE-dextranmetoden (Yokota, T. et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. U.S.A., Vol. 81, s. 1070 (1984)). Mere specifikt 20 blev COS-l-cellerne, der var behandlet med trypsin, suspenderet i RPMI-1640 medium indeholdende 10% FCS, og deres koncentration blev justeret til l x 106 celler/ml. Dernæst blev portioner af 500 yl af suspensionen anbragt i 6 brønde i en plade, hvilke brønde hver indeholdt 2 ml 25 RPMI-1640 medium indeholdende 10% FCS. Efter inkubation af cellerne ved 37°C natten over, fjernedes supernatan-ten, cellerne blev vasket med et medium, der var frit for serum og 1 ml RPMI-1640 medium indeholdende 10 yg/ml plasmid DNA, 0,4 mg/ml DEAE-dextran (produkt fra Pharma-30 cia), 50 mM tris-HCl (pH 7,4) og 10% FCS blev placeret i hver brønd, hvorefter der blev inkuberet ved 37°C i 4,5 timer. Dernæst fjernedes supernatanten, cellerne vaskedes med et medium, der var frit for serum og 2 ml RPMI-1640 medium indeholdende 150 yM chlorquin (produkt 35 fra Sigma Chemical Co.) og 10% FCS anbragtes i hver brønd, hvorefter der inkuberedes ved 37°C i tre timer.

21 DK 172339 B1

Supernatanten fjernedes, og cellerne vaskedes med et medium, der var frit for serum, og inkuberedes derefter ved 37eC i 72 timer med tilsætning af 3 ml RPMI-1640 medium indeholdende 10% FCS til cellerne i hver brønd. Ef-5 ter opsamling af supernatanten anbragtes 2 ml RPMI-1640 medium indeholdende 10% FCS i hver brønd, hvorefter der gennemførtes to cycler af frysning og optøning. Dernæst opsamledes celleekstraktet. Kultursupernatanten og cel-leekstraktet undersøgtes for GIF-aktivitet.

10 Gruppen, der udviste GIF-aktivitet, deltes i 24 grupper af hver 10 kloner, og den samme fremgangsmåde som ovenfor blev gentaget ved anvendelse af disse grupper til bestemmelse af GIF-aktivitet. Den samme fremgangsmåde som ovenfor blev gentaget for klonerne inden-15 for gruppen, der udviste GIF-aktivitet, til identifikation af de kloner, der udviste GIF-aktivitet.

Følgelig opnåedes 2 slags kloner, dvs. pcD-GIF-16 og pcD-GIF-207.

I tabel 1 vises GIF-aktiviteten (GIF-enheder/ml) 20 for disse kloner.

Tabel 1

Kloner Kultursupernatant Celleekstrakt 25 pcD-GIF-16 48,3 120,7 pcD-GIF-207 62,6 196,9 pcDVl (kontrol) 0 0 (5) Analyse af klon.

30 Fig. 1 viser restriktionsenzymkort for cDNA'et fra plasmid pcD-GIF-16 og plasmid pcD-GIF-207.

Basesekvensen af cDNA'et fra hvert af disse plas-mider bestemtes ved den basespecifikke kemiske modifikationsmetode (Methods in Enzymology, Vol. 65, s 499 35 (1980)) og dideoxykædeterminering (Proc. Natl. Acad.

Sci., U.S.A., Vol. 74, s 5463 (1977)) ved anvendelse af phag M13-vektor (Gene, Vol. 19, s 269 (1982)).

22 DK 172339 B1

Herved fandt man, at cDNA fra pcD-GIF-207 var identisk med cDNA i den kodende region for IL-Ια, beskrevet af March et al. (Nature, Vol. 315, s 641 (1985)).

5 E. coll stamme χΐ776 indeholdende plasmid pcD-GIF-207 med cDNA, der koder for et precursorprotein for IL-lct, blev deponeret under navnet "Escherichia coli Xl776/pcD-GIF-207" med deponeringsnummeret FERM BP1294 ved Fermentation Research Institute, Agency of Indu-10 strial Science & Technology.

(6) Ekspression og fremstilling af polypeptid.

Det forannævnte plasmid pcD-GIF-207, blev skåret over med restriktionsenzymerne Hindlll og Hindi og der-15 efter underkastet elektroforese på agarosegel til isolation og rensning af et ca. 0,66-kb HindIII-HincII-DNA-fragment, som desuden blev skåret over med restriktionsenzymet Alul til på samme måde at opnå et ca. 0,5-kb AluI-HincII-DNA-fragment efter isolation.

20 Dernæst blev de syntetiske oligonucleotider (51CGATAATGTCAGCACCTTTTAG 3' og 5 1 CTAAAAGGTGCTGACATTAT 3' ) begge phosphoryleret ved 5'-terminalen med T4 poly-nucleotidkinase og ligeret med AluI-Hincll-DNA-fragmen-tet opnået ovenfor ved anvendelse af T4 DNA-ligase. Den 25 ligerede blok blev dernæst skåret over med restriktionsenzymet Clal og underkastet elektroforese på agarosegel til isolation og rensning af et ca. 0,54-kb Clal-Clal-DNA-fragment.

På den anden side blev plasmid pTMl (Fumio imamo-30 to, Taisha (Metabolism), Vol. 22, 289 (1985)) skåret over med restriktionsenzymet Clal, omsat med intestinal, alkalisk phosphatase fra kalve (CIAP) og derefter ligeret med det ca. 0,54-kb Clal-Clal-DNA-fragment opnået tidligere ved anvendelse af T4 DNA-ligase til opnåelse 35 af det ønskede polypeptidekspressionsplasmid ptrpIL-la-113.

23 DK 172339 B1

Dette plasmid blev transformeret ind i E. coll HB101, og den ønskede transformant udvalgtes ved analyse af størrelsen af de udskårne fragmenter opnået fra det resulterende plasmid-DNA ved kogemetoden.

5 Pig. 2 viser skematisk ovenstående fremgangsmåde.

Plasmid ptrpIL-la-113 blev udvundet fra den udvalgte transformant og transformeret ind i E. coll W3110 til opnåelse af E. coli W3110/ptrpIL-la-ll3.

1 o Eksempel 1 (1) Inkubation af transformant.

Transformanten (E. coll W3110/p trpIL-la-113) opnået i referenceeksempel l (6) blev inkuberet under rystning ved 37eC natten over i 10 ml LB-medium (1% 15 trypton, 0,5% gærekstrakt og 0,5% NaCl) indeholdende 50 Vig/ml ampicillin og 20 yg/ml L-tryptophan. En portion på 400 ml M9-minimummedium (0,6% Na2HP04, 0,3% KH2P04, 0,05% NaCl, 0,1% NH4C1, 2 mM MgS04, 0,2% glucose og 0,1 mM CaCl2) indeholdende 50 yg/ml ampicillin og 1% Casami- 20 nosyre blev inokuleret med 8 ml af kulturen, hvorefter der blev inkuberet ved 37°C i 9 timer. De opnåede E. coli-celler blev suspenderet i 10 ml 1 M Na2HP04 og hen-stod natten over i et kølerum. Suspensionen blev dernæst dialyseret mod 10 mM tris-HCl puffer (pH 8,0) i 2 dage.

25 Det opnåede dialysat blev centrifugeret og derved skilt i en supernatant og et sediment. Supernatanten, der blev opnået i en mængde på 28 ml, viste sig at have en GIF-aktivitet på 7,3 x 107 enheder.

30 (2) Rensning af polypeptid.

En portion på 2 ml af supernatanten opnået ved fremgangsmåden (1) blev renset under de følgende betingelser ved ionbytningsHPLC (DEAE-HPLC) ved anvendelse af ULTROCHROM GTi (LKB)-chromatografisystem.

24 DK 172339 B1

Kolonne : TSK-gel-DEAE-5PW (7,5 x 75 mm, produkt fra Toyo Soda Mfg. Co., Ltd.)

Elueringsmiddel A : 20 mM tris-HCl-puffer (pH 8,0) Elueringsmiddel B : 20 mM tris-HCl-puffer (pH 8,0) in-5 deholdende 0,5 M NaCl.

Strømningshastighed: 1 ml/min.

Praktionsvolumen : 1 ml/min/rør.

Gradientprofil : Tid (min) %B

0 0 10 5 0 65 60 70 100 80 100 85 0 15 100 0 DEAE-HPLC-metoden gav to GIF-aktive fraktioner, en fraktion fra 26 til 28 min i retentionstid (i det følgende betegnet "fraktion 1") og en anden fraktion fra 32,5 til 34,5 min i retentionstid (i det følgende beteg-20 net "fraktion 2").

Disse to fraktioner blev underkastet DEAE-HPLC igen og gelfiltrerings-HPLC til opnåelse af fraktionerne 1 og 2 som rensede.

Idet de delte GIP-aktive fraktioner opnåedes som 25 ovenfor, blev disse fraktioner testet som følger til identifikation.

(3) SDS-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE)

Fraktionerne 1 eller 2 blev underkastet SDS-PAGE 30 ved fremgangsmåden ifølge U.K. Laemmli (Nature, 277, 680 (1970)) under de følgende betingelser.

25 DK 172339 B1

Prøve : Fraktion 1 eller 2 blev tørret fuldstændigt, dernæst opløst i Laemmli prøvepuffer (indeholdende 2-mercaptoethanol (2ME+) i en mængde på 1/20 af pufferens volumen) og behandlet ved 5 100°C i 4 minutter.

Gel : 15% polyacrylamidgel med en tykkelse på 1,5 mm. Apparat : PROTEAN, produkt fra Bio-Rad.

Elektroforese: 40 mA konstant strømstyrke i 2 timer.

Gelen opnået ved elektroforesen blev farvet med 10 Silver Stain Kit (Bio-Rad). Herved vandrede hver af fraktionerne 1 og 2 som et enkelt bånd til en molekylvægt på ca. 18,3kd, hvilket omtrent passede med molekylvægten på 18kd beregnet ud fra genet.

15 (4) Isoelektrofokusering (IEF).

Fraktionerne 1 og 2 blev underkastet IEF ved anvendelse af ampholin PAG-plade (LKB) med pH området fra 3,5-9,5 og Model 1415 (Bio-Rad) under de følgende betingelser.

20 Prøver : PBS-opløsning af fraktion 1, som havde henstå-et 2 dage, samme, som havde henstået i 2 uger, PBS-opløsning af fraktion 2, som havde henstået i 2 uger, PBS-opløsning som kontrol og følgende markørproteiner (pi markørprotei-25 ner), fem baner ialt.

26 DK 172339 B1

Markørproteiner:

Amyloglucosidase (3,50)

Sojabønnetrypsininhibitor (4,55) β-lactoglobulin A (5,20) 5 Bovinkulsyreanhydrase B (5,85)

Human kulsyrehydrase B (6,55) Hestemyoglobin-syrebånd (6,85) Hestemyoglobin-basebånd (7,35)

Lentil lectin-syrebånd (8,15) 10 Lentil lectin-middelbånd (8,45)

Lentin lectin-basebånd (8,65)

Tryspinogen (9,30)

Elektrodeopløsninger: Anodeopløsning = 1M H3P04

1 5 Katodeopløsning = 1M NaOH

Elektroforese: Med konstant effekt på lW/cm gelbredde med afkøling (10°C) i 90 minutter. Farvning: Med Silver Stain Kit.

20

Den fra elektroforesen resulterende gel blev opskåret i strimler med en bredde på 1 cm, underkastet ekstraktion ved anvendelse af 1 ml destilleret vand under rystning (i to dage) hvorefter det isoelektriske punkt 25 beregnedes ud fra pH-målingen.

Det isoelektriske punkt (pi) af fraktion 2 fandtes at være ca. 5,0, og fraktionen vandrede som et enkelt bånd til denne position. Fraktion 1 havde isoelektriske punkter på ca. 5,2 og ca. 5,0 og vandrede som to 30 bånd.

(5) Aminosyresammensaetning.

Hver af fraktionerne 1 og 2 (30 μΐ) blev forsigtigt anbragt i bunden af et tykvægget, hårdt testrør 35 af Pyrex-glas på 12 mm x 120 mm og blev derefter tørret i vakuum i en exsiccator indeholdende natriumhydroxid- 27 DK 172339 B1 pellets. En portion på 50 yl af 4N methansulfonsyre (indeholdende 0,2% 3-(2-aminoethyl)indol og fremstillet af Pierce) blev sat til den tørre prøve i testrøret. Testrørets indre blev afluftet ved 0,1 til 0,2 mm Hg i 1 5 minut og derefter forseglet. Prøven blev hydrolyseret i en opvarmer ved 118°C over en periode på 24 timer. Efter åbning af reagensglasset blev blandingen neutraliseret med 46 yl 4N natriumhydroxid og fortyndet til en mængde på 450 yl med citronsyrepuffer.

10 En portion på 250 yl af prøveopløsningen anvend tes til aminosyreanalyse med en aminosyreanalysator (Model HITACHI 835, produkt fra Hitachi Ltd.). De fraskilte aminisyrer blev påvist ved o-phthalaldehyd-meto-den og bestemt kvantitativt på basis af kalibrerings-15 kurver fremstillet ved anvendelse af autentiske aminosyrer.

Tabel 2 viser resultaterne udtrykt som molforholdet mellem indgående aminosyrer baseret på Phe (10 mol).

Under de ovennævnte analysebetingelser er Pro og Cys ik-20ke bestemmelige.

DK 172339 B1 28

Tabel 2

Aminosyre Fraktion 2 (molforhold)

Asp og/eller Asn 20,6

Thr 11,4 5 Ser 10,1

Gly og/eller Gin 16,8

Gly 6,6

Ala 14,4

Val 5,8 10 Met 2,3

Ile 9,3

Leu 15,0

Tyr 6,8

Phe (10) 15 Lys 10,5

His 3,0

Trp 1,6

Arg 2,9 20 (6) Aminosyresekvens.

Hver af fraktionerne 1 og 2 (150 μΐ) analyseredes ved hjælp af et proteinsekvensbestemmelsesapparat (Model 470A, Applied Biosystems Inc.)· Hver resulterende PTH-aminosyre blev fortyndet passende med 100 til 50 yl 25 33%'s vandig acetonitrilopløsning, og en 5 yl's portion af den fortyndede opløsning blev sprøjtet ind i en chro-matografisk kolonne ved hjælp af en autoprøveudtager, Waters 710B. Til det chromatografiske system styredes to pumper, Beckman Model 112, ved hjælp af en kontrolenhed, 30 Model 421. Den anvendte kolonne, der målte 2 mm x 250 mm og var pakket med Ultrasphere ODS-5 ym, holdtes ved 55°C ved hjælp af et kolonneopvarmningsapparat. Strømningshastigheden var 0,3 ml/min. En blanding af 20 mM natriumacetat og acetonitril anvendtes til gradientelu-35 ering. Absorbansen måltes ved 269 nM. Analyse udførtes i 45 minutter.

29 DK 172339 B1

Resultatet af 40 analysecycler viste, at de to fraktioner var identiske med hensyn til aminosyrese-kvens, bortset fra den 36. aminosyre, og at de havde den følgende sekvens: 55 10

Ser - Ala - Pro - Phe - Ser - Phe - Leu - Ser - Asn - Val - 15 20 Lys - Tyr - Asn - Phe - Met - Arg - Ile - Ile - Lys - Tyr - 25 30 10 Glu - Phe - Ile - Leu - Asn - Asp - Ala - Leu - Asn - Gin - 35 40

Ser - Ile - Ile - Arg - Ala - X - Asp - Gin - Tyr - Leu 15 Den 36. aminosyre (X i den ovenstående formel) var for fraktion 1 Asn, som det var forudsagt ud fra genets sekvens, og for fraktionen 2 var den Asp.

Det foranstående viser, at fraktion 1 er et po-lypeptid med formlen (A), nemlig IL-Ια, og at den anden 20 fraktion er et polypeptid, som svarer til IL-Ια, hvori den 36. aminosyre er erstattet af Asp. Dette polypeptid vil i det følgende blive betegnet "polypeptid I".

IL-la'et var ustabilt som materiale, og man fandt at det f.eks. delvist omdannedes til et mere stabilt po-25 lypeptid I, når det fandtes i en trisHCl-puffer (pH 8,0).

Eksempel 2 (1) Fremstilling af polypeptid I.

30 Et polypeptid I-ekspressionsplasmid fremstilledes ved den stedspecifikke mutagenese metode (Pro. Nat.

Acad. Sci., 81, 5662-5666 (1984); Science, 224, 1431 (1984)), ved anvendelse af plasmid ptrpIL-la-113 opnået i referenceeksempel 1, og polypeptid I blev fremstillet 35 ud fra plasmidet, som beskrevet i det følgende.

Ml 3 mp 11-phagvektor anvendtes som en enkeltstrengs DNA-templat. EcoRI/BamHI-DNA-fragment isoleredes 30 DK 172339 B1 fra plasmid ptrpIL-la-113 og klonedes i M13 mp 11-phag (RF) ved restriktionsstederne for restriktionsenzymerne EcoRI og BamHI til opnåelse af enkeltstrenget (ss) DNA (M13-IL-la-113), som dernæst anvendtes som mutagenese-5 templat.

Det syntetiske oligonucleotid [5' -ACTGGGTGAGCTTGGCAG-31 (primer)] phosphoryleredes med T4-polynucleotidkinase og hybrideseredes med ss M13-IL-la-113 DNA. Hybridet blev annealet, derefter behandlet 10 med DNA-polymerase I (Klenow fragment) og T4 DNA-ligase i tilstedeværelse af dNTPs og inkuberet ved 15eC i 18 timer.

Det opnåede DNA indføjedes i JM105 kompetentcelle til transformation. Den resulterende phagplak (100 15 kolonier) inokuleredes på en agarplade og inkuberedes ved 37°C i 18 timer. Et filter indeholdende kulturen behandledes med en base på sædvanlig måde til denaturering, tørredes og opvarmedes dernæst ved 80°C i 2 timer.

DNA'et prehybridiseredes og hybridiseredes dernæst ved 20 stuetemperatur med 32P-probe, fremstillet ved mærkning af primeren med 32P-y-ATP. Filteret opnået ved hybridi-sering vaskedes med 6 x SSC-puffer ved stuetemperatur i 10 minutter og desuden ved 54°C i 5 minutter, tørredes og underkastedes dernæst autoradiografi ved -70°C i 18 25 timer.

Ml 3-IL-la-36D udvalgtes som en typisk klon blandt fem mutantkloner, inficeredes med JM105 og inkuberedes til dannelse af ssDNA og RF DNA.

Ml 3-dideoxynucleotidsekvensbestemmelse udførtes 30 for ssDNA for at bekræfte mutationen af det behandlede gen.

EcoRI/BamHI-fragment fremstilledes ud fra RF DNA fremstillet i JM105, indføjet i ekspressionsplasmid på samme måde som i det foregående referenceeksempel til 35 opnåelse af det ønskede polypeptid I-ekspressionsplasmid (IL-1Q-36D).

31 DK 172339 B1

Ved anvendelse af dette plasmid blev polypeptid I eksprimeret på samme måde som i eksempel 1, hvorefter det blev oprenset (DEAE-HPLC gav en enkelt GIF-aktivi-tetstop), hvorved det ønskede polypeptid I opnåedes med 5 de tidligere beskrevne egenskaber. Man fandt, at produktet havde en specifik aktivitet på ca. 1 x 107 GIF-en-heder/mg protein.

Eksempel 3 10 (1) Fremstilling af polypeptiderne II og III.

Plasmid ptrpIL-1 a-141S til ekspression af et po-lypeptid svarende til IL-Ια, hvori den 141. aminosyre (Cys) er erstattet af Ser, fremstilledes på samme måde som i eksempel 2 ved anvendelse af 15 5'-ACTGGGTGAGCTTGGCAG-3' som primer.

Den samme ekspressions- og rensningsmetode som i eksempel 1 blev gentaget ved anvendelse af dette plasmid, og DEAE-HPLC udført på samme måde gav to GIF-akti-vitetstoppe. Topfraktionerne analyseredes på samme måde 20 som i det foregående med det resultat, at topfraktionen, der var tidligst i retentionstid, identificeredes som et polypeptid (polypeptid III) forudsagt fra gensekvensen, dvs. et polypeptid svarende til IL-Ια, hvori den 141. aminosyre (Cys) var erstattet af Ser.

25 Analysen viste, at den anden topfraktion var et polypeptid svarende til IL-Ια, hvori den 36. aminosyre (Asn) og den 141. aminosyre (Cys) var erstattet af henholdsvis Asp og Ser. Dette polypeptid vil i det følgende blive betegnet "polypeptid II".

30

Eksempel 4 (1) Fremstilling af polypeptid II ifølge opfindelsen.

Plasmid ptrpIL-la-36D . 141S til ekspression af det ønskede polypeptid II fremstilledes på samme måde 35 som i eksempel 3 ved anvendelse af ptrpIL-la-141S opnået i eksempel 3 og 5'-ATTCGAGCCGATGATCAG-3' som primeren.

32 DK 172339 B1

Man lod HBlOl-stamme huse det førnævnte plasmid ptrplL-la-36D . 141S. Denne stamme blev deponeret under navnet "Escherichia coli HB101/IL-la-36D14lS" med deponeringsnummeret FERM BP-1295 ved Fermentation Research 5 Institute, Agency of Industrial Science & Technology.

De samme ekspressions- og rensningsmetoder som i eksempel 1 blev gentaget med anvendelse af det ovennævnte plasmid til opnåelse af det ønskede polypeptid II.

10 SDS-PAGE viste, at polypeptidet havde en molekyl vægt på ca. I8kd. Dets isoelektriske punkt (PI) fandtes at være ca. 5,0 ved IEF.

Polypeptiderne II og III var ækvivalente med po-lypeptid I med hensyn til specifik aktivitet (GIF-akti-15 vitet).

Farmaceutisk testeksempel l (1) GIF-aktivitet og LAF-aktivitet.

20 GIF-aktiviteten af polypeptiderne I, II og III er allerede beskrevet. LAF-aktiviteten af polypeptiderne I, II og III var sammenlignelig med deres GIF-aktivitet.

Polypeptider anvendt ifølge opfindelsen blev testet som følger.

25 (2) Test for antitumorvirkning.

Tumorceller (200.000), "Meth A", blev intracutant transplanteret ind i hver af BALB/c mus (på 0. dagen).

På 7. dagen og 8. dagen efter transplantationen blev po-30 lypeptid I givet til musenes tumorsteder ved det første eksperiment i en mængde på 0,3, 1 eller 3 yg pr. mus.

Der anvendtes syv mus i hver gruppe. Et opløsningsmiddel (1% museserum) blev administreret på samme måde til kontrolgruppen.

35 Testresultaterne er vist i fig. 3, i hvilken an tallet af dage efter inokuleringen af tumorceller er af- 33 DK 172339 B1 hildet som abscisse versus tumorens vægt (mg) som ordinat. Kontrolgruppen er repræsenteret ved kurve (1), en gruppe med en dosis på 0,3 pg polypeptid I ved kurve (2), en gruppe med en dosis på 1 jig polypeptid I ved 5 kurve (3), og en gruppe med en dosis på 3 pg polypeptid I ved kurve (4). Tumorens vægt blev udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse (SD). Mærket * angiver p<0,05 ved Students' T-test og mærket ** P<0,01.

10 (3) Test for virkning til at fremme CSF-produktion.

(3) —1 Den følgende test ved anvendelse af cellestamme U-373MG (ATCC HTB17, glioblastoma, astrocytoma, human).

Cellerne af den ovennævnte stamme suspenderedes i 15 Eagle's MEM-medium (produkt fra Nissui Pharm. Co.) indeholdende 10% FCS (produkt fra GIBCO), MEM-ikke-essentielle aminosyrer (produkt fra Flow) og MEM-natri-umpyruvat (produkt fra Flow) til en koncentration på 2 x 105 celler/ml. Polypeptidet I, der skulle testes, til-20 sattes i varierende koncentrationer til portioner af suspensionen. Hver af blandingerne blev inkuberet i en carbondioxidinkubator ved 37°C i 24 timer.

Kultursupernatanten blev opsamlet, og den dannede og akkumulerede mængde CSF i supernatanten blev målt ved 2 5 anvendelse af musebenmarvsceller (Lewis, I. C. et al., J. Immunol, 128, 168 (1982)).

Resultaterne er givet i fig. 4, hvori koncentrationen (ng/ml) af polypeptid I er afbildet som abscisse versus CSF-aktiviteten (U/ml x 10“2) som ordinat.

30 (3)-2 Det følgende dyreforsøg udførtes til underbyg- gelse af, at polypeptid I, når det administreres til den levende organisme, virker fremmende på CSF-produktion in vivo.

Polypeptid I blev givet intravenøst til normale 35 mus (BALB/C-stamme leveret fra Experimental Animal Cooperative Associatin of Shizuoka Prefecture, Japan) i va- 34 DK 172339 B1 rierende mængder. Blod opsamledes fra dyrene 8 timer efter administreringen og undersøgtes for CSF-aktivitet som i (3)-l i det foregående. Som kontrol administreredes humant serumalbumin (HSA) på samme måde til en kon-5 trolgruppe for testen.

Resultaterne er vist i fig. 5, hvori den administrerede mængde polypeptid I eller HSA (pg/mus) er afbildet som abscisse og CSF-aktivitet (enheder/ml serum, x 10-3) som ordinat.

10 (4) Testning af IL-ΐα for virkning til at fremme CSF-produktion.

Følgende test udførtes ved anvendelse af humane embryoniske lungefibroblaster (HFL-1, ATCC registreret 15 cellestamme nr. CCL-153) som danner CSF.

HFL-l-celler suspenderedes i hamster 12K-kultur (Ham, R.G., Proc. Natl. Acad. Sci., 53, 288 (1965)) indeholdende 10% FCS til en koncentration på 2 x 105 celler/ml.

20 IL-Ια opnået i eksempel l sattes til portioner af cellesuspensionen i varierende koncentrationer. Hver af blandingerne inkuberedes i en carbondioxidgasinkubator ved 37°C i 24, 48 eller 72 timer. Kultursupernatanten opsamledes, og den dannede og akkumulerede mængde CSF i 25 supernatanten måltes ved anvendelse af musebenmarvscel-ler (Lewis, I.C. et al, J. Immunol., 128 (1982)).

35 DK 172339 B1

Resultaterne er opstillet i tabel 3 nedenfor.

Tabel 3

Koncentration af inkuberet IL-Ια (GIF-enheder/ml).

5

Tid 0 1 10 (dag) _CSF-aktivltet (U/ml) 1 0 190 130 2 0 240 145 10 3 0 100 120

De ovenstående resultater viser, at tilsætningen af IL-Ια fremmer CSF-produktion med HFL-1-cellestamme.

15 Præparateksempel 1

Til en opløsning af 1 x 107 enheder/ml, beregnet som GIF-aktivitet, af polypeptid I i saltopløsning sattes humant serumalbumin (HSA) til en koncentration på 0,5%. Blandingen filtreredes (0,22 pm membranfilter), 20 anbragtes i hætteglas, 1 ml i hvert, i steril tilstand og lyofiliseredes til opnåelse af et præparat til injektion.

Præparatet anvendes opløst i 1 ml destilleret vand til injektion.

Claims

1. Thr - Ala - Ala - Ala - Leu - Eis - Asn - Leu - Asp - Glu - 55 60 Ala - Val - Lys - Phe - Asp - Met - Gly - Ala - Tyr - Lys - 65 70 Ser “ Ser - Lys - Asp - Asp - Ala - Lys - Ile — Thr - Val — 20 75 80 Ile - Leu - Arg - Ile - Ser - Lys - Thr - Gin - Leu - Tyr - 85 90 Val - Thr - Ala - Gin - Asp - Glu - Asp - Gin - Pro - Val - 95 100 Leu - Leu - Lys - Glu - Met - Pro - Glu - Ile - Pro - Lys - 25 105 110 Thr - Ile - Thr - Gly - Ser - Glu - Thr - Asn - Leu - Leu - 115 120 Phe - Phe - Trp - Glu - Thr - Eis - Gly - Thr - Lys - Asn - 125 130 Tyr - Phe - Thr - Ser - Val - Ala - His - Pro - Asn - Leu - 30 135 140 Phe - Ile - Ala - Thr - Lys - Gin - Asp - Tyr - Trp - Val -

145 ISO Cys - Leu - Ala - Gly - Gly - Pro - Pro - Ser - Ile - Thr - 155

35 Asp - Phe - Gin - Ile - Leu - Glu - Asn - Gin - Ala (A) DK 172339 B1 eller anvendelse af et polypeptid med aminosyresekvensen med den ovenstående formel (A), som er modificeret ved, at mindst én af Asn i 36-stillingen og Cys i 141-stil-lingen mangler eller er erstattet af en anden aminosyre.

1. Anvendelse af IL-Ια eller derivat deraf med samme biologiske virkning til fremstilling af et lægemiddel til fremme af CSF-produktion eller til helbredelse af en malign tumor.

2. Anvendelse ifølge krav l af humant IL-Ια med aminosyresekvensen med følgende formel (A) 5 10 Ser - Ala - Pro - Phe - Ser - Phe - Leu - Ser - Asn - Val - 15 20

10 Lys - Tyr - Asn - Phe - Met - Arg - Ile - Ile - Lys - Tyr 25 30 Glu - Phe - Ile - Leu - Asn - Asp - Ala - Leu - Asn - Gin 35 40 Ser - Ile - Ile - Arg - Ala - Asn - Asp - Gin - Tyr - Leu - 45 50

3. Anvendelse ifølge krav 2, ved hvilken der an vendes humant IL-Ict med formlen (A).

4. Anvendelse ifølge krav 2, ved hvilken der anvendes et polypeptid med formlen (A), som er modificeret ved, at Asn i 36-stillingen er erstattet af Asp.

5. Anvendelse ifølge krav 2, ved hvilken der an vendes et polypeptid med formlen (A), som er modificeret ved, at Cys i 141-stillingen er erstattet af Ser.

6. Anvendelse ifølge krav 2, ved hvilken der anvendes et polypeptid med formlen (A), som er modificeret 15 ved, at Asn i 36-stillingen og Cys i 141-stillingen er erstattet af henholdsvis Asp og Ser.