DK171648B1 - Polypeptid, der er et interleukin-1beta-derivat, gen, der koder for polypeptidet, vektor indeholdende genet, mikroorganisme indeholdende vektoren, og lægemidel indeholdende polypeptidet - Google Patents

Description

DK 171648 B1

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte polypeptider, nærmere betegnet hidtil ukendte derivater af interleukin-13 (i det følgende betegnet IL-Ιβ).

Den anden internationale Lymphokin Workshop bes-5 luttede at vælge at bruge et fælles navn, interleukin-1 (IL-l), for de fysiologisk aktive materialer, som havde været betegnet lymfocytaktiverende faktor (LAF), mito-gent protein, hjælper top-1, T-celleerstattende faktor III (TRF-III), T-celleerstattende faktor MØ (TRFM), ΒΙΟ celle aktiverende faktor, B-celledifferentieringsfaktor, osv. (Cellular Immunol., 48, 433-436 (1979)). Denne beslutning er baseret på, at disse fysiologisk aktive materialer ikke kan skelnes fra hinanden som forskellige materialer, men blot betegnes forskelligt i forbindelse 15 med fysiologiske virkninger bedømt ud fra forskellige vinkler.

Endvidere er det rapporteret, at IL-l aktiverer T-lymfocytter og B-lymfocytter, har virkning til at fremme dannelse af interleukin-2 og antistoffer, virker 20 på lever og væv til fremme af proteinsyntese og har virkning til at fremme dannelse af prostaglandiner (se Reviews of Infectious Disease, Vol. 6, No. 1, 51-59 (1984), New England J. of Med., 311, 1413 (1984), etc.).

25 Medens man stadig mangler at eftervise at IL-l selv er et stof, har der lige fornylig været rapporteret om tilstedeværelsen af to forskellige gener, der koder for polypeptider med LAF-virkning eller precursorer derfor (Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 81, 7907-7911 (1984), 30 Nature, Vol. 315, 641 (1985), Nucleic Acid Research,

Vol. 13 (16), 5869 (1985)). Disse rapporter nævner "IL-Ια" med en sekvens på 159 aminosyrer og "IL-IS" med 153 aminosyrer, som postuleres ud fra basesekvenserne af de to gener.

35 Ikke desto mindre må der yderligere forskes til afklaring af forbindelsen imellem virkningerne, testet DK 171648 Bl 2 ved anvendelse af et behandlet medium eller såkaldt delvist renset IL-1 og polypeptidet postuleret ud fra de ovenfor nævnte basesekvenser.

Kendt IL-1 formodes, som fysiologisk aktivt mate-5 riale, også at være identisk med et endogent pyrogen (EP) og vides at have pyrogene egenskaber (se Nature, 304, 449 (1983); Cell Immunol., 63, 164 (1981); J. Exp. Med., 150, 709 (1979); J. Immunol., 130, (6) 2708 (1983); samme, 132 (3) 1311 (1984); osv.). Dette viser, 10 at IL-1, hvis det er tilgængeligt som ét enkelt stof, for ikke at sige noget om konventionelt fysiologisk aktivt IL-1,. er vanskeligt at anvende til medicinske formål .

Et formål med den foreliggende opfindelse er at 15 tilvejebringe polypeptider, der er hidtil ukendte og nyttige IL-Ιβ-derivater, der kan anvendes medicinsk med stor effekt.

Et andet formål med opfindelsen er at tilvejebringe en medicinsk anvendelse for polypeptider, der er 20 hidtil ukendte IL-18-derivater.

Yderligere er et formål med opfindelsen at tilvejebringe et gen, der koder for et hidtil ukendt IL-1&-derivat, og en fremgangsmåde til fremstilling af IL-1&-derivatet, dvs. et polypeptid, ved genmanipulationstek-25 nikker ved anvendelse af genet.

Det ovennævnte og andre formål med opfindelsen vil fremgå af den følgende beskrivelse.

IL-18-derivatet (polypeptidet) ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det har en modificeret amino-30 syresekvens, der opfylder mindst én af de følgende betingelser a) til d) i interleukin-1$'s aminosyresekvens, som angivet ved formlen (A).

3 DK 171648 B1 5 10

Ala - Pro - Val - Arg - Ser - Leu - Asn - Cys - Thr - Leu - 15 20 5 Arg - Asp - Ser - Gin r- Gin - Lys - Ser - Leu - Val - Met- 25 1 30

Ser - Gly - Pro - Tyr - Glu - Leu - Lys - Ala - Leu - His- 35 40

Leu - Gin - Gly - Gin - Asp - Met - Glu - Gin - Gin - Val- 1° 45 50

Val - Phe - Ser - Met - Ser - Phe - Val - Gin - Gly - Glu- 55 60

Glu - Ser - Asn - Asp - Lys ** Ile - Pro - Val - Ala - Leu- 65 70 15 Gly - Leu - Lys - Glu - Lys - Asn - Leu - Tyr - Leu - Ser- 75 80

Cys - Val - Leu - Lys - Asp - Asp - Lys - Pro - Thr - Leu- 85 90

Gin - Leu - Glu - Ser - Val - Asp - Pro - Lys - Asn - Tyr- 20 95 100

Pro - Lys - Lys - Lys - Met - Glu - Lys - Arg - Phe - Val- 105 110

Phe - Asn - Lys - Ile - Glu - Ile - Asn - Asn - Lys - Leu- 115 120

Glu - Phe - Glu - Ser - Ala - Gin - Phe - Pro - Asn - Trp- 125 130

Tyr - Ile - Ser - Thr - Ser - Gin - Ala - Glu - Asn - Met- 135 140

Pro - Val - Phe - Leu - Gly - Gly - Thr - Lys - Gly - Gly- 30 145 150

Gin - Asp - Ile - Thr - Asp - Phe - Thr - Met - Gin - Phe-

Val - Ser - Ser 4 DK 171648 B1 a) Mindst en aminosyrerest valgt blandt Ala i 1-stillingen, Val i 3-stillingen, Arg i 4-stillingen, Ser i 5-stillingenf Cys i 8-stillingen, Arg i 11-stillingen, 5 His i 30-sti liingen, Cys i 71-stillingen, Lys i 93-stillingen, Lys i 97-stillingen, Arg i 98-stillingen,

Phe i 99-stillingen, Lys i 103-stillingen, Trp i 120-stillingen, Tyr i 121-stillingen, Ser i 153-stillingen mangler eller er erstattet af en anden aminosyre.

10 b) Aminosyre sekvens en fra Ala i 1-stillingen til Thr i 9-stillingen eller mindst en aminosyrerest i denne sekvens mangler (bortset fra at mindst én aminosyrerest valgt blandt Ala i 1-stillingen, Val i 3-stillingen, Arg i 4-stillingen, Ser i 5-stillingen og Cys i 8-stillingen 15 mangler som angivet under betingelsen a)).

c) Aminosyresekvensen fra Lys ved 103-stilling til Ser i 153-stillingen eller mindst én aminosyrerest i denne sekvens mangler (bortset fra at mindst én aminosyrerest valgt blandt Lys i 103-stillingen, Trp i 120-stillingen, 20 Tyr i 121-stillingen og Ser i 153-stillingen mangler som angivet i betingelse a)).

d) Met, eller aminosyresekvensen fra Met i 1'-stillingen til Asp i 116'-stillingen med den følgende formel (B), eller en del af sekvensen ifølge formlen (B) er mod 25 dens C terminale ende hæftet til den N terminale ende af polypeptidet med formlen (A).

5 DK 171648 B1

Formel (B) 5' 10»

Met - Ala - Glu - Val - Pro - Glu - Leu - Ala - Ser - Glu- 15' 20' 5 Met - Met - Ala - Tyr - Tyr - Ser - Gly - Asn - Glu - Asp- 25' 30'

Asp - Leu - Phe - Phe - Glu - Ala - Asp - Gly - Pro - Lys- 35' 40'

Gin - Met - Lys - Cys - Ser - Phe - Gin - Asp - Leu - Asp- 10 45' 50'

Leu - Cys - Pro - Leu - Asp - Gly - Gly - Ile - Gin - Leu- 55' ' 60'

Arg - Ile - Ser - Asp - His - His - Tyr - Ser - Lys - Gly- 65' 70' 15 Phe - Arg - Gin - Ala - Ala - Ser - Val - Val - Val - Ala- 75' 80'

Met - Asp - Lys - Leu - Arg - Lys - Met - Leu - Val - Pro- 85' 90'

Cys - Pro - Gin - Thr - Phe - Gin - Glu - Asn - Asp - Leu- 20 95' 100'

Ser - Thr - Phe - Phe - Pro - Phe - Ile - Phe - Glu - Glu- 105' 110'

Glu - Pro - Ile - Phe - Phe - Asp - Thr - Trp - Asp - Asn- 115'

Glu - Ala - Tyr - Val - His - Asp 25

Aminosyrer og peptider betegnes heri ved symboler ifølge nomenclaturen eller reglerne anbefalet af IUPAC-IUB eller ved symboler, der sædvanligvis anvendes indenfor teknikken. Nucleinsyrerne i basesekvenserne beteg— 30 nes på lignende måde. Aminosyrenummeret eller positionen, som den anvendes heri i forbindelse med polypepti— det ifølge opfindelsen, er baseret på aminosyresekvensen af IL-18, dvs. aminosyresekvensen med formlen (A), bortset fra, hvor andet er angivet, også i de tilfælde, hvor 35 der er en mangel eller en udvidelse. Imidlertid er de mærkede numre eller positioner baseret på aminosyresekvensen med formlen (B).

6 DK 171648 B1 IL-lB-derivatet ifølge den foreliggende opfindelse er et hidtil ukendt polypeptid med en aminosyrese-kvens, der opfyldet et eller kombination af mindst to af de forannævnte betingelser a) til d) i amonisyresekven- 5 sen for IL-1B med formlen (A).

Foretrukne eksempler på IL-1B-derivater, dvs. po-lypeptider, ifølge opfindelsen er som følger.

1) Et polypeptid med aminosyresekvensen med formlen (A), hvori i det mindste Ala i 1-stillingen mangler 10 eller er erstattet af en anden aminosyre.

2) Et polypeptid med aminosyresekvensen med formlen (A), hvori i det mindste Val i 3-stillingen mangler eller er erstattet af en anden aminosyre.

3) Et polypeptid med aminosyresekvensen med form- 15 len (A), hvori i det mindste Arg i 4-stillingen mangler eller er erstattet af en anden aminosyre.

4) Et polypeptid med aminosyresekvensen med formlen (A), hvori i det mindste Ser i 5-stillingen mangler eller er erstattet af en anden aminosyre.

20 5) Et polypeptid med aminosyresekvensen med form len (A), hvori i det mindste Cys i 8-stillingen mangler eller er erstattet af en anden aminosyre.

6) Et polypeptid med aminosyresekvensen med formlen (A), hvori i det mindste Arg i 11-stillingen mangler 25 eller er erstattet af en anden aminosyre.

7) Et polypeptid med aminosyresekvensen med formlen (A), hvori i det mindste His i 30-stillingen mangler eller er erstattet af en anden aminosyre.

8) Et polypeptid med aminosyresekvensen med form- 30 len (A), hvori i det mindste Cys i 71-stillingen mangler eller er erstattet af en anden aminosyre.

9) Et polypeptid med aminosyresekvensen med formlen (A), hvori i det mindste Lys i 93-stillingen mangler eller er erstattet af en anden aminosyre.

35 10) Et polypeptid med aminosyresekvensen med formlen (A), hvori i det mindste Lys i 97-stillingen mangler eller er erstattet af en anden aminosyre.

7 DK 171648 B1 11) Et polypeptid med aminosyresekvensen med formlen (A), hvori i det mindste Arg i 98-stillingen mangler eller er erstattet af en anden aminosyre.

12) Et polypeptid med aminosyresekvensen med 5 formlen (A), hvori i det mindste Phe i 99-stillingen mangler eller er erstattet af en anden aminosyre.

13) Et polypeptid med aminosyresekvensen med formlen (A), hvori i det mindste Lys i 103-stillingen mangler eller er erstattet af en anden aminosyre.

10 14) Et polypeptid med aminosyresekvensen med formlen (A), hvori i det mindste Trp i 120-stillingen mangler eller er erstattet af en anden aminosyre.

15) Et polypeptid med aminosyresekvensen med formlen (A), hvori i det mindste Tyr i 121-stillingen 15 mangler eller er erstattet af en anden aminosyre.

16) Et polypeptid med aminosyresekvensen med formlen (A), hvori i det mindste Ser i 153-stillingen mangler eller er erstattet af en anden aminosyre.

17) Et polypeptid med aminosyresekvensen med 20 formlen (A), som mangler i det mindste aminosyresekvensen fra Ala i 1-stillingen til Val i 3-stillingen, aminosyresekvensen fra Ala i 1-stillingen til Leu i 6-stil-1ingen eller aminosyresekvensen fra Ala i 1-stillingen til Thr i 9-stillingen.

25 18) Polypeptid med aminosyresekvensen med formlen (A), som mangler i det mindste aminosyresekvensen fra Val i 151-stillingen til Ser i 153-stillingen, aminosyresekvensen fra Gin i 149-stillingen til Ser i 153-stillingen, aminosyresekvensen fra Gin i 141-stillingen til 30 Ser i 153-stillingen, aminosyresekvensen fra Tyr i 121-stillingen til Ser i 153-stillingen eller amonosyrese-kvensen fra Lys i 103-stillingen til Ser i 153-stillingen.

19) Et polypeptid med aminosyresekvensen med 35 formlen (A), til hvis N-terminal der er hæftet i det mindste Met, aminosyresekvensen fra Met i 77'-stillingen 8 DK 171648 B1 til Asp i 116'-stillingen, aminosyresekvensen fra Met i 71’-stillingen til Asp i 116'-stillingen, aminosyresek-vensen fra Met i 32'-stillingen til Asp i 116'-stillingen eller aminosyresekvensen fra Met i 1’-stillingen 5 til Asp i 116'-stillingen af formlen (B).

Medens IL-1B-derivaterne ifølge den foreliggende opfindelse omfatter polypeptider med IL-1B's aminosyre-sekvens, hvori specifikke aminosyrer i specifikke positioner er erstattet af andre aminosyrer, kan de erstat-10 tende aminosyrer være vilkårlige af α-aminosyrerne, der indgår i humane proteiner. Cys har imidlertid tendens til at danne en disulfidbinding intra- eller intermole-kylært via dens SH-gruppe. I betragtning af dette er de ønskelige aminosyrer andre aminosyrer end Cys. Eksempler 15 på mere ønskelige aminosyrer er Gly til erstatning for Arg i 4-stillingen, Ser eller Ala for Cys i 8-stillin-gen, Gin for Arg i ll-stillingen, Tyr for His i 30-stillingen, Ser, Ala eller Val for Cys i 71-stillingen,

Leu for Lys i 93-stillingen, Leu for Arg i 98-stillin-20 gen, Gin for Lys i 103-stillingen, Arg for Trp i 120-stillingen og Gin for Tyr i 121 stillingen.

IL-l-derivaterne ifølge opfindelsen og homogent IL-1B opnået i overensstemmelse med opfindelsen har f.eks. fysiologiske virkninger, såsom LAF-virkning, hæm-25 mende virkning på tumorcellers vækst (GIF-virkning eller aktivitet), dvs. virkning til specifikt at hæmme tumorcellers vækst, virkning til at fremme dannelse af forskellige cytokiner, såsom kolonistimulerende faktor (CSF), interferon (IFN), interleukin-2 (IL-2) og inter-30 leukin-3 (IL-3), dvs. f.eks. virkning på humane celler til i høj grad at fremme dannelsen af sådanne cytokiner, antiinflammatorisk virkning, virkning til f.eks. effektivt at hæmme arthritis fremadskriden, når det administreres til modeldyr med arthritis, og virkning til 35 hindring af stråleskade, dvs. virkning til at hindre eventuelle skader på den levende organisme eller alvor- 9 DK 171648 B1 lige bivirkninger, der vil fremkomme ved systemisk bestråling ved benmarvstransplantation, bestråling til behandling af cancer og stråleulykker. Følgelig er det homogene IL-lfJ og dets derivater ifølge opfindelsen meget 5 nyttige som immunsystemstimulerende midler, f.eks. til at fremme dannelse af antistoffer og forstærke virkningen af vacciner, antitumormidler, midler til at fremme dannelse af cytokiner, såsom CSF, I FN, IL-2 og IL-3, anti-inflammatoriske midler, midler til hindring af 10 strålesyge og andre lignende lægemidler.

Den nye opdagelse, at det homogene IL-1& udviser en bemærkelsesværdig virkning til behandling af en inflammation, såsom arthritis, er overraskende i betragtning af det faktum, at man hidtil har formodet at IL-1 15 fremkalder en inflammation indirekte ved at virke som en mediator. Derivaterne ifølge den foreliggende opfindelse er fortrinlige med hensyn til mindst én af virkningerne angivet i det foregående og/eller har lav toksicitet og ringe bivirkninger.

20 Derivaterne ifølge opfindelsen er især effektive som midler til at fremme CSF-dannelse. Ved administrering til mennesker, kurerer derivatet effektivt granulocytopenia på grund af formindsket dannelse af benmarv som et resultat af kemoterapi eller stråleterapi mod 25 cancer uden at give sandsynlighed for virusinfektioner eller antigen-antistofreaktion (granulocytopenia-helbre-dende medikament). Midlet til at fremme CSF-dannelsen kan også anvendes til hindring og helbredelse af forskellige sygdomme på grund af virkningen af CFS, hvis 30 dannelse fremmes på grund af det nævnte middel. CSF virker f.eks. fremmende på granulocyters og makrofagers virkning (Lopez, A. F. et al., J. Immunol., 131, 2983 (1983); Handam, E. et al., samme, 122, 1134 (1979) og

Vadas, Μ. A. et al., samme, 130, 795 (1983)), således at 35 man forventer klinisk anvendelse af CSF til hindring og helbredelse af forskellige infektioner. Midler, der 10 DK 171648 B1 fremmer CSF-dannelsen, forventes ligeledes at være nyttige til klinisk anvendelse.

I de senere år har man bemærket, at kompromitterede værter med nedsat biofylaktisk evne lider af så-5 kaldte opportunistiske infektioner eller terrainalinfek-tioner, der forekommer når normalt harmløse organismer bliver patogene. Klinisk skyldes disse infektioner patogene organismer, herunder gram-negative bacilli, såsom Pseudomonas og Serratia, virus såsom herpes simplex vi-10 rus (HSV), Varicella-zoster virus (VZV) og cytomegalovirus (CMV), fungi såsom Candida albicans, Aspergillus fu-migatus og Nocardia asteroidea, protozoer, såsom Pneumocystis carinii og Toxoplasma gondii, osv. Idet de anti-biota, der i dag anvendes ikke er helt effektive mod 15 opportunistiske infektioner, ønskes det at udføre forskning i og udvikle nye medikamenter mod sådanne infektioner. De nærværende IL-1β-derivater er også effektive til forebyggelse og helbredelse af opportunistiske infektioner, som ofte forekommer, især når der gives anti-20 cancermedikamenter.

De er f.eks. nyttige til forebyggelse og helbredelse af forskellige infektioner, der udvikles under kemoterapeutisk behandling af akut leukæmia og benmarvstransplantation, såsom candidosis, cryptococcosis, 25 aspergillosis, zygomycosis, chromomycosis, virusinfektioner, cytomegalovirus pneumonia og komplikationer af disse infektioner.

Foruden de ovennævnte medicinske anvendelser er IL-lSet og dets derivater ifølge den foreliggende op-30 findelse f.eks. meget nyttige til fremstilling af forskellige nyttige cytokiner in vitro ud fra cellelinier, osv. på grund af deres evne til at fremme cytokindan-nelse. Opmærksomheden har været rettet mod fremstillingen af cytokiner af naturlig type, især de cytokiner, 35 der er glycoproteiner. Derivaterne ifølge opfindelsen gør det muligt effektivt at opnå nyttige cytokiner i 11 DK 171648 B1 store mængder, når de anvendes som et middel til fremkaldelse af cytokindannelse.

Blandt derivaterne ifølge den foreliggende opfindelse udviser derivaterne med formlen (A), hvori i det 5 mindste Cys i 71-stillingen mangler eller erstattet af en anden aminosyre, især en aminosyre, såsom Ser, Ala,

Val eller lignende, høj aktivitet.

Endvidere har derivaterne ifølge opfindelsen med formlen (A), hvori i det mindste Arg i 4-stillingen el-10 ler Cys i 8-stillingen mangler eller erstattet af en anden aminosyre, og derivaterne, hvori i det mindste én af aminosyrerne ved 103-stillingen og de følgende positioner mangler, den egenskab, at de har lav aktivitet til at fremme dannelse af prostaglandin E (PGE) og derfor 15 har reducerede bivirkninger, såsom pyrogen virkning og lav toksicitet, og de derivater, hvori i det mindste Arg i 4-stillingen mangler eller erstattet, har den egenskab, at de har højere aktivitet til at fremme CSF-dannelse, at de har højere antiinflammatorisk virkning 20 end GIF-virkning og LAF-virkning.

Endvidere har derivaterne ifølge opfindelsen med i det mindste den eller de i det foregående specificerede aminosyre(r) eller polypeptider hæftet til N-terminalen af formlen (A) også den egenskab, at de har højere 25 aktivitet til at fremme CSF-dannelse og stærkere anti-inflammatorisk virkning end GIF-virkning og LAF-virk-ning, og de er nyttige som lægemidler, især som orale lægemidler eller suppositorier, idet de har lav toksicitet og langvarig virkning.

30 Endvidere har de derivater ifølge opfindelsen, især de derivater, hvori Cys i 8-stillingen og/eller Cys i 71-stillingen mangler eller er udskiftet, en fortrinlig bindingsaktivitet overfor IL-l-receptoren under forskellige betingelser. Mest foretrukne er de derivater, 35 hvori Cys i 8- og/eller 71-stillingerne er erstattet af Ser, Ala og/eller Val.

12 DK 171648 B1

Blandt derivaterne ifølge opfindelsen er de derivater, hvori molekylet har et lavere Cys-indhold end IL-Ιβ eller er frit for Cys, i betragtning af den mulige unødvendige dannelse af en intra- eller intermolekylær 5 binding på grund af SH-gruppen i Cys, mere foretrukne.

Polypeptidet ifølge opfindelsen kan f.eks. fremstilles ved genmanipulationsmetoder ved anvendelse af et gen, der koder for det specifikke polypeptid ifølge opfindelsen, dvs. ved inkorporering af genet i en mikro-10 organismevektor til fremkaldelse af replikation, trans-kription og translation i mikroorganismecellen. Denne fremgangsmåde er fordelagtig, idet den muliggør masseproduktion.

Skønt genet, der skal anvendes ved denne frem-15 gangsmåde, kan fremstilles udelukkende ved kemisk syntese ud fra nucleinsyrer ved en sædvanlig fremgangsmåde, f.eks. ved phosphittriestermetoden (Nature, 310, 105 (1984)) eller lignende, er det hensigtsmæssigt at anvende genet, der koder for IL-Ιβ eller en precursor 20 derfor. Ved den sædvanlige fremgangsmåde, der involverer den ovennævnte kemiske syntese, modificeres genet til en nucleinsyresekvens, der koder for den i det foregående nævnte specifikke aminosyresekvens, hvorved det ønskede gen let kan fremstilles.

25 Genet, der koder for IL-Ιβ eller en precursor derfor kendes allerede. Genet, der koder for IL-Ιβ op nåedes, som beskrevet i den samtidigt verserende danske patentansøgning nr. 5866/85, ifølge hvilket det lykkedes at fremstille IL-Ιβ ved genmanipulationsmetoder ved an-30 vendelse af dette gen. Den anvendte serie af genmanipulationsmetoder vil blive beskrevet i referenceeksemplerne, der følger senere.

Den ovenfor nævnte modificerede sekvens af nucleinsyrer (baser) fremstilles også ved en kendt frem-35 gangsmåde, som udføres i overensstemmelse med det ønskede polypeptids aminosyresekvens (Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laboratory (1982)).

13 DK 171648 B1

Spaltning, ligering, phosphorylering, osv. af DNA kan f.eks. udføres ved sædvanlige fremgangsmåder, herunder behandling med enzymer, såsom restriktionsenzymer, DNA-ligase, polynucleotidkinase og DNA-polymerase, der 5 er let tilgængelige som kommercielle produkter. Isolationen og rensningen af genet og nucleinsyrerne omfattet af disse fremgangsmåder udføres også på sædvanlig måde, f.eks. ved agarosegelelektroforese. Som det vil blive beskrevet delvist senere, replikeres det opnåede gen 10 ved anvendelse af en sædvanlig vektor. DNA-fragmentet, der koder for den ønskede aminosyresekvens, og syntetiske linkere kan også let fremstilles ved den i det foregående nævnte kemiske syntese. Codonet, der svarer til den ønskede aminosyre og skal anvendes ved fremgangs-15 måderne beskrevet i det foregående, er kendt og vælges efter Ønske. En sædvanlig fremgangsmåde kan anvendes til dette formål, f.eks. under hensyntagen til codonets anvendelsesfrekvens for værten, der skal anvendes (Nucl. Acids Res., 9, 43-73 (1981)). Endvidere kan man til mo-20 difikation af codonet i den nucleinsyresekvens, det drejer sig om, f.eks. gribe til stedsspecifik mutagenese (Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 5662-5666 (1984)), som den sædvanligvis udføres, og ved hvilken der sædvanligvis anvendes en primer omfattende et syntetisk oligonucleo-25 tid, der koder for den ønskede modificerede sekvens, ca.

15-30-mer.

Det ønskede gen opnået ved den foregående fremgangsmåde kan f.eks. undersøges med hensyn til dets ba— sesekvens ved den kemiske modifikationsmetode ifølge 30 Maxam-Gilbert (Meth. Enzym., 65, 499-560 (1980)) eller ved dideoxynucleotidkædetermineringsmetoden ved anvendelse af M13 Phage (Messing, J. og Vieira, J., Gene, 19, 269-276 (1982)).

Skønt fremgangsmåderne og metoderne nævnt i det 35 foregårende derfor vil blive beskrevet i referenceeksemplerne og eksemplerne, der følger senere, er frem- 14 DK 171648 B1 gangsmåden ikke specifikt begrænset, og alle allerede kendte fremgangsmåder indenfor teknikken kan anvendes *

Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes der også et hidtil ukendt gen, der koder for et polypep-5 tid med aminosyresekvensen, specificeret i det foregående. (Genet vil i det følgende blive betegnet "genet ifølge opfindelsen" ).

Ifølge opfindelsen tilvejebringes der endvidere en vektor, der er ejendommelig ved, at den indeholder genet ifølge opfindelsen, og 10 en mikroorganisme, der er ejendommelig ved, at den indeholder vektoren ifølge opfindelsen.

Desuden tilvejebringes der et lægemiddel, som er ejendommeligt ved, at det indeholder en farmakologisk effektiv mængde af et poly-peptid ifølge opfindelsen og et medicinsk hjælpestof.

15 Polypeptidet ifølge den foreliggende opfindelsen kan fremstilles ved sædvanlige, kendte genrekombinant— metoder ved anvendelse af genet ifølge opfindelsen. Nærmere betegnet fremstilles det ved fremstilling af et re-kombinant DNA, som kan eksprimere genet ifølge opfindel-20 sen i værtsceller, transformation af DNA*et ind i værtscellen og inkubation af transformanten.

Nyttige værtsceller kan være enten eucaryotiske eller procaryotiske celler. De eucaryotiske celler omfatter celler af hvirveldyr, gær, osv.. COS-celler, der 25 er abeceller (Y. Gluzman, Cell, 23, 175-182 (1981)) di- hydrofolatreduktase-manglende stamme af kinesiske ham-streovarieceller (G. Urlaub og L.A., Chasin, Proc.

Nat. Acad. Sci., U.S.A., 77, 4216-4220 (1980)), osv.

anvendes f.eks. i almindelighed som celler af hvirvel-30 dyr, skønt nyttige celler ikke er begrænset til disse celler. Nyttige ekspressionsvektorer af vertebratceller er de vektorer, hvori der er placeret en promotor opstrøms for genet, der skal eksprimeres, RNA-splejsnings-steder, polyadenyleringssted, transkriptionstermine-35 ringssekvens, osv. Disse vektorer kan endvidere, når det er nødvendigt, have et replikationsstartsted. Eksempler på nyttige ekspressionsvektorer omfatter pSV2dhfr med en indledende promotor for SV40 (S. Subramani, R. Mulligan og P. Berg, Mol. Cell. Biol., 1(9), 854-864), men 15 DK 171648 B1 er ikke begrænset til denne.

Gær anvendes i vid udstrækning som eucaryotisk mikroorganisme, og gærarter af slægten Saccharoymces kan i almindelighed anvendes. Eksempler på populære ek- 5 spressionsvektorer for gær og lignende eucaryotiske mikroorganismer omfatter pAM82 med en promotor for genet for sur phosphatase (A. Miyanohara et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 80, 1-5 (1983), osv.

E. coli og Bacillus subtilis anvendes i alminde-10 lighed som procaryotiske værter. Ifølge den foreliggende opfindelse anvendes der f.eks. plasmidvektorer, der er i stand til at replikere i værten. Til eksprimering af genet i vektoren kan man anvende ekspressionsplasmider, som har en promotor og SD-basesekvens (Shine Dalgarno-15 basesekvens) opstrøms for genet og ATG, der kræves til initiering af proteinsyntese. E. coli-Kl2-stammen anvendes i vid udstrækning som værts-E. coli. pBR322 er en vektor, som i almindelighed anvendes. Imidlertid er opfindelsen ikke begrænset til disse, og talrige kendte 20 stammer og vektorer kan anvendes. Eksempler på promotorer, der kan anvendes, er tryptophanpromotorer, PL-pro-motor, lac-promotor, lpp-pormotor, osv. Genet kan éks-primeres ved anvendelse af en vilkårlig af disse promotorer .

25 Til beskrivelse af fremgangsmåden med henvisning til det tilfælde, ved hvilket tryptophan-promotoren anvendes, anvendes vektoren pTMl (Fumio Imamoto, Taishya,

Vol. 22, 289 (1985)) med tryptophanpromotor og SD-se- kvens som en ekspressionsvektor. Et gen, der koder for 20 det Ønskede polypeptid ifølge opfindelsen og om nødvendigt med ATG bindes til stedet for restriktionsenzymet Clal, som findes nedstrøms for SD-sekvensen.

løvrigt kan ikke kun det direkte ekspressionssy— stem, men også et fusionsprotein-ekspressionssystem, ved 25 hvilket der f.eks. anvendes β-galaktosidase, $-lactamase eller lignende, anvendes.

Den således opnåede ekspressionsvektor indføres i værtsceller og transformeres således ved sædvandlige DK 171648 Bl 16 fremgangsmåder. F.eks. opsamles celler, hovedsagelig i den logaritmiske vækstfase, de behandles med CaCl2 og præpareres derved til let at acceptere DNA, hvorefter vektoren indføres i cellen. Ved denne fremgangsmåde kan 5 MgCl2 eller RbCl være til stede sammen med vektoren, hvorved der opnås en forbedret transformationseffektivitet, som det er almindelig kendt. Cellen kan omdannes til en spheroplast eller protoplast inden transformation.

10 Den således opnåede ønskede transformant kan in kuberes på sædvanlig måde, hvorved det ønskede polypep-tid fremstilles og akkumuleres. Mediet til inkubationen kan være et vilkårligt af de medier, der sædvanligvis anvendes til inkubation af celler, såsom L-medium, E-15 medium, M9-medium, osv. Forskellige carbonkilder, nitrogenkilder, uorganiske salte, vitaminer osv., som er alment kendte, kan blandes med disse medier. Når tryptop-hanpromotoren anvendes, kan minimalt M9-medium, hvori der er blandet casaminosyre for at fremkalde promotorens 20 virkning, f.eks. anvendes. Et kemikalium, såsom indola-crylsyre, til forøgelse af tryptophanpromotorens virkning, kan sættes til mediet under et passende trin af inkubationen.

Det ønskede polypeptid ifølge opfindelsen kan 25 isoleres fra den resulterende kultur og renses ved sædvanlige fremgangsmåder. Det er Ønskeligt, at ekstrahere polypeptidet fra værten under milde betingelser som f. eks. ved osmotisk chok, for at bevare dets højere ordensstruktur.

30 Den ovennævnte isolations- eller rensningsmetode udføres i det væsentlige ved samme fremgangsmåde som sædvanligvis anvendes til separation af et proteinlignende materiale fra et sådant biologosk materiale.

F.eks. kan man anvende forskellige fremgangsmåder, ved 35 hvilke de fysiske eller kemiske egenskaber af det ønskede polypeptid, udnyttes. (Se for eksempel, "Biological Data Book II,”pp. 1175-1259, 1st edition, 1st oplag, June 23, 1980, udgivet af Kabushiki Kaisha Tokyo Kagaku- 17 DK 171648 B1 dojin.). Eksempler på anvendelige fremgangsmåder er behandling under anvendelse af et sædvanligt proteinfældningsmiddel, ultrafiltrering, molekylsigtchroraatografi (gelfiltrering), væskechromatografi, centrifugering, 5 elektroforese, affinitetschromatografi, dialyse og kombinationer af sådanne fremgangsmåder.

Det ønskede polypeptid skilles fra supernatanten som delvist renset. Denne delvise rensning udføres f.eks. ved en behandling med anvendelse af et organisk 10 opløsningsmiddel, såsom acetone, methanol, ethanol, propanol eller dimethylformamid (DMF), eller et surt reagens, såsom eddikesyre, perchlorsyre (PCA) eller trich-loreddikesyre (TCA), som proteinfældningsmiddel eller ved en behandling ved anvendelse af et udsaltningsmid-15 del, såsom ammoniumsulfat, natriumsulfat eller natriumfosfat og/eller ved ultrafiltrering ved anvendelse af en dialysemembran, en flad membran, en hul fibermembran eller lignende. Disse behandlinger udføres på samme måde som de normalt udføres under sædvanlige betingelser.

20 Det således opnåede groft rensede produkt udsæt tes dernæst for gelfiltrering, hvorved en fraktion, der udviser det Ønskede materiales virkning, opsamles. Anvendelige gelfiltreringsmidler er ikke specifikt begrænsede. Sådanne midler omfatter dem der er fremstillet af 25 dextrangel, polyacrylamidgel, agarosegel, polyacrylami-dagarosegel, cellulose eller lignende. Eksempler på nyttige, kommercielt tilgængelige midler er midler af Sep-hadex G-typen, Sephadex LH-typen, Sepharose-typen, Sep-hacryl-typen (alle produkter fra Pharmacia), Cellofine 30 (Chisso Corporation), Biogel P-typen, Biogel A-typen (begge produkter fra Bio-Rad Lab), Ultro gel-C (LKB), TSK-G-typen (produkt fra Toyo Soda Mfg. Co., Ltd.), osv.

Polypeptidet ifølge den foreliggende opfindelsen kan isoleres fra fraktionen som et homogent materiale, 35 f.eks. ved at udsætte fraktionen for affinitetschromatografi ved anvendelse af en hydroxyapatitkolonne, ion- 18 DK 171648 B1 bytningschromatografi, f.eks. ved DEAE-, CM- eller SP-metoden, chromatofokuseringsmetoden, omvendt fase HPLC eller lignende eller en kombination af sådanne metoder.

Chromatofokuseringen kan udføres ved forskellige 5 kendte metoder. PBE94 (Pharmacia Fine Chemicals) eller lignende, kan f.eks. anvendes som kolonne, imidazol-saltsyre eller lignende kan f.eks. anvendes som startpuffer og blandingen af polypuffer 74 (Pharmacia Fine Chemicals) og saltsyre (pH 4,0) eller lignende, kan 10 f.eks. anvendes som elueringsmiddel.

Omvendt fase HPLC kan f.eks. udføres med C4 Hi-Pore omvendt fase HPLC-kolonne (Bio-Rad Laboratories) eller lignende, ved anvendelse af acetonitril, trifluo-reddikesyre (TFA), vand eller lignende eller en blanding 15 af sådanne opløsningsmidler som elueringsmiddel.

På denne måde kan IL-18-derivatet (polypeptidet) ifølge opfindelsen opnås ved isolation. Genet, der koder for IL-18 giver IL-18 ved hjælp af en lignende rekombi-nantmetode.

20 Polypeptidet ifølge opfindelsen, der som allerede angivet har fremragende farmakologiske egenskaber, kan formuleres til nyttige præparater til de tidligere nævnte medicinske anvendelser. Eksempler på sadanne medicinske præparater omfatter immunostimulerende midler til 25 dannelse af antistoffer, forstærkning af vacciners virkning og helbredelse af immundefekt, antitumormidler, cytokindannelsespromotorer, antiinflammatoriske midler, midler til forebyggelse eller helbredelse af stråleskade, midler til forebyggelse eller helbredelse af oppor-30 tunistiske infektioner, osv. Disse medicinske præparater formuleres sædvanligvis i form af farmaceutiske midler, omfattende en farmakologisk effektiv mængde af peptidet ifølge opfindelsen eller IL-18 og en passende bærer. Eksempler på nyttige farmaceutiske bærere omfatter excipi-35 enter og fortyndingsmidler såsom fyldstoffer, forstrækningsmidler, bindemidler, befugtningsmidler, desinte- 19 DK 171648 B1 greringsmidler, overfladeaktive midler, osv., som sædvanligvis anvendes til fremstilling af lægemidler, af den form der ønskes anvendt. Formen af lægemidlerne er ikke specifikt begrænset, forsåvidt de faktisk indehol-5 der peptidet ifølge opfindelsen eller Il-lp, og de kan f.eks. foreligge i form af tabletter, pulverpræparater, granulatpræparater, piller eller lignende faste præparater. Det er imidlertid hensigtsmæssigt, at midlet foreligger i form af en opløsning, suspension, emulsion 10 eller lignende til injektion. Alternativt kan en sådant middel være et tørt produkt, der kan gøres flydende ved tilsætning af en passende bærer inden anvendelse. Lægemidlerne nævnt ovenfor kan fremstilles ved sædvanlige fremgangsmåder.

15 Lægemidlet administreres ad en passende vej i overensstemmelse med formen af det opnåede lægemiddel. Lægemidlerne til injektion gives f.eks. intravenøst, in-tramuskulært, subcutant, intracutant, intraperitonealt eller på anden måde. De faste midler gives oralt eller 20 intraintestinalt. Mængden af den aktive komponent i midlet og dosen af midlet bestemmes hensigtsmæssigt i overensstemmelse med administreringsformen og -metoden, anvendelsesformålet, patientens symptomer osv. og kan ikke fastlægges entydigt. Det er i almindelighed ønskeligt at 25 inkorporere ca. 1 til ca. 80 vægt% af den aktive komponent i lægemidlet og at give præparatet i en daglig dosis fra ca. 0,1 ug til ca. 10 mg, beregnet som aktiv komponent, til voksne. Præparatet behøver ikke altid at blive givet én gang dagligt, men det kan gives i tre til 30 fire delte doser dagligt.

Den foreliggende opfindelse vil blive belyst nærmere ved hjælp af de følgende referenceeksempler, ifølge hvilke IL-Ιβ fremstilledes, og eksemplerne, ifølge hvilke derivaterne ifølge opfindelsen fremstilledes.

35 I eksemplerne anvendes de følgende symboler for derivaterne ifølge opfindelsen for at forenkle beskrivelsen.

20 DK 171648 B1

Symbol (polypeptid Nr. _IL-Ιβ og derivater I IL-IS 5 II [Gly4]lL-lS (IL-IS, hvori Arg i 4-stilling er erstattet med Gly) III [GlnUJlL-lS (IL-IS, hvori Arg i 11-stilling er 10 erstattet med Gin) IV [Ser®]lL-l6 (IL-IS, hvori Cys i 8-stilling er erstattet med Ser) 15 V [Ser^, Ser71]lL-lS (IL-IS, hvori Cys i 8-stil ling er erstattet med Ser, og Cys i 71-stilling med Ser) VI {Ser71]lL-S (IL-IS, hvori Cys i 71-stilling er 20 erstattet med Ser) VII [Gln^O^]il-1 S (IL-IS, hvori Lys i 103-stilling er erstattet med Gin) 25 VIII 11-16(1-140)-polypeptid (IL-IS, hvori aminosyre i 141-stilling mangler følgende) IX [Gln*21 ]IL-1S (IL-IS, hvori Tyr i 121-stilling er erstattet med Gin) 30 X Met-lL-lS (IL-IB med Met bundet til dens N terminal) XI des-Alal-lL-lS (IL-16, hvori Ala i 1-stilling 35 mangler) 21 DK 171648 B1 XII [Leu98]IL_iø (il-IS, hvori Arg i 98-stilling er erstattet med Leu) XIII [Gly4, Gin11, Leu98]lL-lB (IL-Ιβ, hvori Arg i 5 4-stilling er erstattet med Gly, Arg i 11-stil- ling med Gin, og Arg i 98-stilling med Leu) XIV [Gly4, Gin11 ]lL-lβ (IL-Ιβ (IL-Ιβ, hvori Arg i 4-stilling er erstattet med Gly, og Arg i 10 11-stilling med Gin) XV [Gly4, Leu98]iL-13 (IL-Ιβ, hvori Arg i 4-stilling er erstattet med Gly, og Arg i 98-stilling med Leu) 15 XVI [Gin11, Leu88]lL-lB (IL-Ιβ, hvori Arg i 11-stilling er erstattet med Gin, og Arg i 98-stilling med Leu) 20 XVII des-Arg4-IL-16 (IL-Ιβ, hvori Arg i 4-stilling mangler) XVIII des-Arg11-IL-18 (IL-Ιβ, hvori Arg i 11-stilling mangler) 25 XIX des-Arg98IL-lβ (IL-Ιβ, hvori Arg i 98-stilling mangler) XX [Ala8]lL-lB (IL-Ιβ, hvori Cys i 8-stilling er er- 30 etattet med Ala) XXI des-Cys8-IL-lfl (IL-Ιβ, hvori Cys i 8-stilling mangler) 35 XXII [Ala71]iL-ie (IL-Ιβ, hvori Cys i 71-stilling er erstattet med Ala) 22 DK 171648 B1 XXIII [Val71]lL-18 (IL-18, hvori Cys i 7i-stilling er erstattet med Val) 5 XXIV des-Cys7l-IL-18 (IL-18, hvori Cys i 71-stilling mangler) XXV [Leu93]lL-18 (IL-18, hvori Lys i 93-stilling er erstattet med Leu) 10 XXVI IL-18-(l-144)-polypeptid (IL-18, hvori aminosyrer i 145-stilling og følgende mangler) XXVII IL-18-(l-148)-polypeptid (IL-18, hvori aminosyrer 15 i 149-stilling og følgende mangler) XXVIII Arg120]lL-18 (IL-18, hvori Trp i 120-stilling er erstattet med Arg) 20 XXIX [Tyr30]lL-18 (IL-18, hvori His i 30-stilling er erstattet med Tyr) XXX IL-18-(l-102)-polypeptid (IL-18, hvori aminosyre i 103-stilling og følgende mangler) 25 XXXI (77'-116' )-IL-18 (IL-18 med sekvensen fra 77’- til 116'-stillingen af aminosyresekvensen med formlen (B) hæftet til dens N-terminal).

30 XXXII (71'-116')—IL-18 (IL-18 med sekvensen 71'- til 116'-stillingen af aminosyresekvensen med formlen (B) hæftet til dens N-terminal).

XXXIII (32’-116')-IL-18 med sekvensen fra 32’- til 116'- 35 stillingen af aminosyresekvensen med formlen (B) hæftet til dens N-terminal).

23 DK 171648 B1 XXXIV (l'-lie1)-IL-18 (IL-18 med sekvensen fra 1'- til 116'-stillingen af aminosyresekvensen med formlen (B) hæftet til dens N-terminal).

5 XXXV 11-18-(1-120)-polypeptid (IL-18# hvori aminosyren i 121-stillingen og følgende mangler) XXXVI [Ala®# Ser7l]lL-lS (IL-18# hvori Cys i 8-stil- 10 lingen er erstattet med Ala, og Cys i 71-stilling med Ser) XXXVII [Ala®, Ala^lJlL-lS (IL-18# hvori Cys i 8-stilling er erstattet med Ala, og Cys i 71-stilling med 15 Ala) XXXVIII [Ala®, Val?l ]lL-lS (IL-18, hvori Cys i 8-stilling er erstattet med Ala, og Cys i 71-stilling med Val) 20 XXXIX IL-18-(4-153)-polypeptid (IL-18, som mangler aminosyresekvensen fra Ala i 1-stilling til Val i 3-stilling) 25 XXXX IL-18-(7-153)-polypeptid (IL-Ιβ, som mangler i aminosyresekvensen fra Ala i 1-stilling til Leu i 6-stilling) XXXXI IL-18-(10-153)-polypeptid (IL-18# som mangler i 30 aminosyresekvensen fra Ala i 1-stilling til Thr i 9-stilling) XXXXII des-Val3“IL-18 (IL-18, hvori Val i 3-stilling mangler) 35 XXXXIII des-Ser5-iL-18 (IL-18# hvori Ser i 5-stilling 24 DK 171648 B1 mangler) XXXXIV des-Lys97_IL_18 (η,-ΐβ, hvori Lys i 97-stilling mangler) 5 XXXXV des-Phe99-IL-l& (IL-Ιβ, hvori Phe i 99-stilling mangler) XXXXVI IL-16-(l-150)-polypeptid (IL-Ιβ, hvori aminosyren 10 i 151-stilling og følgende mangler) XXXXVII des-Ser153-IL-18 (IL-18, hvori Ser i 153-stil-ling mangler) 15 XXXXVIII Met-[Gly4]lL-lB(IL-ie N-terminal med Met hæftet til og i hvilken Arg i 4-stilling er erstattet med Gly.

I de følgende eksempler bestemtes fysiologiske 20 virkninger ved de følgende fremgangsmåder.

(1) Bestemmelse af IL-l-virkning.

Udtrykt som LAF-virkning som målt ved fremgangsmåden ifølge J. J. Oppenhein et al. (J. Immunol., 116, 1466 (1976)) ved anvendelse af thymusceller fra en mus 25 af C3H/HeJ-stammen.

(2) Bestemmelse af GIF-virkning.

Portioner (0,1 ml) af testopløsningen fortyndet til forskellige koncentrationer anbragtes i brøndene i en 96-brØndes mikroplade (Corning Co., Ltd.), 0,1 ml 30 Eagle's MEM-suspension indeholdende 10% FCS, indeholdende humane melonomaceller A375 i en mængde på 2 x 104 celler/ml anbragtes dernæst i hver brønd, og brøndene inkuberedes i en C02**inhubator (Napco Co., Ltd.) i 4 dage. Efter inkubationen anbragtes 0,05 ml 0,05% neutral-35 rød (Wako Junyaku Co., Ltd.) i hver brønd, hvorefter der inkuberedes ved 37°C i 2 timer. Efter fjernelse af su- 25 DK 171648 B1 pernatanten, hældtes 0,3 ml phosphorsyrepuffer-saltopløsning forsigtigt i hver brønd til vaskning. Efter fjernelse af vaskevæsken, anbragtes 0,1 ml af en blanding natriumhydrogenphosphat og ethanol i lige store 5 mængder i hver brønd, pladen blev rystet i adskillige minutter ved hjælp af en mikromikser, og mængden af pigment optaget i hver celle måltes ved en absorbans på 540 my ved anvendelse af et fotometer for 96-brøndes mikro-titerplader (Titer check multiscane, Flow Lab.) til be-10 stemmelse af den væksthæmmende virkning. Testgruppen udviste 50%'s hæmning af kontrolgruppens cellevækst, dvs. at testgruppen, der udviste halvdelen af absorbansen målt for kontrolgruppen, identificeredes. Den reciprokke værdi af antallet af fortyndingsgange for testgruppen 15 blev taget som GIF-aktivitetsenheden. Følgelig har testopløsningen, når GIF-aktiviteten f.eks. er 10 enheder, hvis den fortyndes 10 gange, stadigvæk virkning til at hæmme cellevækst 50%.

Der refereres til de følgende tegninger i refe-20 renceeksempierne og eksemplerne.

Fig. 1 er et restriktionsenzymkort for plasmidet pGIF-o-cDNA.

Fig. 2 er et diagram, der viser hvorledes plasmid ptrpGIF-α konstrueres ud fra plasmid pGIF-α og plasmid 25 pTMI.

Fig. 3a til 3d er kurver, der viser indflydelsen af anti-polypeptid I-serum (neutraliseret antistof på GIF-aktivitet opnået ud fra plasmid pcD-GIG-16 eller på GIF-aktivitet opnået fra plasmid pcD-GIF-207.

30 Fig. 4 er et restriktionsenzymkort for DNA for plasmid pcD-GIF-16 og for plasmid pcD-GIF-207.

Fig. 5 til 7 er afbildninger, der viser resultaterne opnået ved testning af polypeptid I for dets virkning til at fremme CSF-dannelse.

35 Fig. 8 er en afbildning, der viser resultaterne opnået ved testning af polypeptid I for antiarthritis-virkning.

26 DK 171648 B1

Fig. 9 er en afbildning, der viser resultaterne opnået ved testning af IL-1β-derivater ifølge opfindelsen for CSF-dannelsesfremmende virkning.

Fig. 10 er en afbildning, der viser resultaterne 5 opnået ved testning af IL-1β-derivater ifølge opfindelsen for antiinflammatorisk virkning.

Fig. 11 er en afbildning, der viser resultaterne opnået ved testning af IL-1β-derivater ifølge opfindelsen for virkning til forebyggelse af strålesyge.

10 Fig. 12 er en afbildning, der viser resultatet opnået ved testning af IL-1β-derivater ifølge opfindelsen for virkning til forebyggelse af opportunistiske infektioner.

Fig. 13 er et fotografi, der viser resultaterne 15 opnået ved testning af IL-1β-derivaterne ifølge opfindelsen for virkning til inducering og dannelse af GM-CSF.

Fig. 14 er et fotografi, der viser resultaterne opnået ved testning af IL-1β-derivatet ifølge opfindel— 20 sen for virkning til inducering og dannelse af BSF-2.

Referenceeksempel 1 Fremstilling af plasmid pGIF-α 25 (1) Fremstilling af humane lymfocytter

Man opsamlede humant perifert blod, hvorfra 1,9 x 1018 lymphocytter blev opnået ved Ficoll-Hypaque-densi-tetsgradientscentrifugeringsmetoden (Eur. J. Immunol. 4, 808 (1974)).

30 En portion af lymphocytterne suspenderedes i RPMI

1640-medium indeholdende 5% humant serum i en koncentration på 4 x 108 celler/ml. Suspensionen anbragtes opdelt i Petriskåle med en diameter på 9 cm, og cellerne inkuberedes i tilstedeværelse af 5% carbondioxidgas ved 37°C 35 i en time. De celler, som ikke hæftede til bunden af hver skål fjernedes og stimuleredes med RPMI 1640-mediura DK 171648 Bl 27 indeholdende 10% FCS, 0,5 ng/ml TPA (produkt fra Sigma) og 10 yg/ml LPS (produkt fra Difco). Efter inkubation af cellerne i 5% carbondioxidgas ved 37°C i 4 timer, opnåedes 9 x 10® vedhæftede lymphocytter ved anvendelse af 5 PBS og 0,02% EDTA.

(2) Fremstilling af mRNA

Humane vedhæftede lymphocyter (9 x 10® celler) opnået ved fremgangsmåden (1) blev opløst i 30 ml 6 M 10 guanidinthiocyanat-opløsning (6M guanidinisothiocyanat, 5mM natriumcitrat (pH 7,0), 0,1M 2-mercaptoethanol og 0,5% Sarkosyl), og DNA'et blev derefter ituskåret med en 50 ml sprøjtecylinder med G18G-injektionsnål. En portion på 12 g caesiumchlorid (CSC1) blev opløst fuldstændigt i 15 opløsningen. Portioner (6,4 ml hver) af opløsningen blev anbragt oven på 4 ml 5,7M CsCl (5,7M CsCl-Ο,ΙΜ EDTA), og det kombinerede lag blev centrifugeret med Beckman SW-40 Ti-rotor ved 31500 rpm og 25°C i 20 timer. RNA-pelletsedimentet blev vasket med 70% ethanol og opløst i TE-20 opløsning (lOmM tris-HCl (pH 7,5), ImM EDTA). Til opløsningen blev der sat 3M natriumacetat (pH 5,2) og ethanol i mængder på henholdsvis 1,9 og 2,2 gange mængden af opløsningen, og blandingen blev henstillet ved -70°C i én time. Blandingen blev derefter centrifugeret ved 25 15000 rpm og 4°C i 20 minutter for at indsamle FNA'et, der derefter blev opløst i TE-opløsning.

På denne måde blev der fremstillet ialt 250 yg RNA ud fra ca. 9 x 10® vedhæftede lymphocyter.

Til fremstilling af mRNA ud fra FNA'et blev 30 RNA1et underkastet søjlechromatografi under anvendelse af oligo(dT)-cellulose (Collaborative Research Inc.).

Til absorption anvendtes en opløsning af lOmM tris-HCl (pH 7,5), 0,5M NaCl og ImM EDTA, og søjlen blev vasket med samme opløsning. FNA'et blev elueret med lOmM tris-35 HC1 (pH 7,5) og ImM EDTA.

Herved vandtes 17,5 ug mRNA.

28 DK 171648 B1

(3) Fremstilling af cDNA

Ud fra det ved fremgangsmåden (2) vundne mRNA blev der in vitro syntetiseret cDNA, og rekombinant DNA blev fremstillet ved anvendelse af Okayama-Berg-plasmid-5 vektor (Okayama, H. og Berg, P., Mol. Cell. Biol., 2, 161 (1982)) og transformeret i E.coli for at opnå cDNA-bibliotek. Der anvendtes de nedenfor angivne fremgangsmåder (3-1) Fremstilling af voktorprimer- og linker-DNA 10 DNA (400 yg) fra pBR322-SV40 (0,71-0,86) blev di gesteret med 700 enheder Kpnl (NEB) ved 37°C i 5 timer. Reaktionen blev afsluttet med en blanding af 40 yl 0,25M EDTA (pH 8,0) og 20 yl 10% SDS. Reaktionsblandingen blev underkastet ekstraktion med samme volumen phenol-15 chloroform (lsl). DNA blev fældet med ethanol efterfulgt af centrifugering og vask med 70% ethanol for at indsamle DNA. Det vundne DNA blev opløst i 200 yl blanding af 140mM natriumcacodylat, 30mM tris-HCl (pH 6,8), lraM C0CI2/ 0,lmM DTT og 0,25mM dTTP (indeholdende 0,5 yCi 20 a-32p-dTTP). Opløsningen blev behandlet med 400 enheder terminal-transferase (TTase, PL) i 30 minutter for at forlænge dT-kæden. Reaktionen blev afsluttet med 20 yl 0,25M EDTA og 10 yl 10% SDS efterfulgt af ekstraktion med phenol-chloroform 4 gange. DNA blev indsamlet ved 25 fældning med ethanol. Herved blev dT-kæden forlænget med ca. 70 baser.

Det således vundne DNA blev digesteret ved 37°C i 6 timer med 17 enheder Hpal (NEB) og underkastet elek-troforese med agarose (lavtsmeltende agarose, BRL, 1%), 30 hvorved der blev indsamlet ca. 2,7 kb DNA-fragment.

Efter elektroforesen blev DNA'et farvet med 0,5 yg/ml af ethidiumbromid, agarosen indeholdende det ca.

2,7 kb lange fragment blev udskåret under UV-bestråling, og til agarosen blev der sat det 5-dobbelte volumen af 35 20mM tris-HCl (pH 8,0)-lmM EDTA for at opløse agarosen ved 65°c over en periode på 5 minutter efterfulgt af ek- 29 DK 171648 B1 straktion med phenol, derefter med phenol-chloroforra (1:1) og derefter med chloroform. DNA'et blev Indsamlet ved fældning med ethanol.

Derefter blev vektorprimer-DNA'et renset ved 5 oligo(dA)-cellulose-søjlechromatografi. DNA'et blev opløst i 1 ml lOmM tris-HCl(pH 7,3)-lmM EDTA-1M NaCl-puffer. Opløsningen blev isafkølet, derefter anbragt på søjlen, der var ækvilibreret med samme puffer, hvorefter søjlen blev vasket med 1 ml af samme puffer og 10 derefter atter bibragt stuetemperatur. Eluering foregik derefter med lOmM tris-HCl (pH 7,3)-lmM EDTA, hvorved topfraktionen blev indsamlet. DNA'et blev indsamlet ved fældning med ethanol, derefter opløst i 100 yl lOmM tris-HCl (pH 7,3)-lmM EDTA og lagret ved 4°C.

15 Linker-DNA blev fremstillet ved følgende metode.

pBR322-SV40 (0,19-0,32)-DNA (100 yg) blev digereret med 120 enheder PstI (NEB) ved 37°C i 1,5 time. Efter endt reaktion blev der ekstraheret med phenol-chloroform og fældet med ethanol. Det indsamlede DNA blev opløst i 50 20 yl af en blanding af 140mM natriumcacodylat, 30mM tris-HCl (pH 6,8), ImM CoCl2, 0,lmM DTT og 0,25mM dGTP (indeholdende 1 yCi a-32P-dGTP). Opløsningen blev behandlet med 60 enheder TTase i 20 minutter, hvorved der blev tilknyttet en dG-kæde på 18 baser. Efter endt reak-25 tion blev DNA'et indsamlet, digesteret med 50 enheder Hindlll (Takara Shuzo Co., Ltd.) og underkastet elektro-forese med agarose (1,8%) på samme måde som ovenfor, hvorved der blev indsamlet ca. 0,28 kb DNA-fragment og vundet 2,3 yg linker-DNA.

30 (3-2) Syntese af cDNA og fremstilling af cDNA-bibliotek RNA (5 yg) blev tørret i vakuum, derefter opløst i 10 yl 5mM tris-HCl (pH 8,3), opvarmet ved 65°C i 5 minutter og straks afkølet til 37°C. Til reaktionsblandingen blev der sat 20 yl af en blanding af 50mM tris-HCl 35 (pH 8,3), 8mM MgCl2, 30mM KC1, 0,3mM DTT, 2mM dNTP og 10 yCi a-32p_<jcTP. Den resulterende blanding holdtes ved 37°C i 5 minutter.

30 DK 171648 B1

Ti enheder RTase (omvendt transcriptase, produkt fra Seikagaku Kogyo Co., Ltd.) blev sat til blandingen og omsat dermed ved 37°C i 15 minutter. Efter tilsætningen af 10 enheder RTase blev blandingen holdt ved samme 5 temperatur i 15 minutter. Reaktionen blev afsluttet med 2 yl 0,25mM EDTA (pH 8,0) og 1 μΐ 10% SDS efterfulgt af ekstraktion med phenol-chloroform. Til ekstraktet blev der sat 20 yl 4M ammoniumacetat og 80 yl ethanol, og blandingen blev frosset ved -70°C i 15 minutter, deref-10 ter optøet ved stuetemperatur og centrifugeret ved 15000 rpm og 4°C i 10 minutter. Sedimentet blev opløst i 20 yl lOmM tris-HCl (pH 7,3). Til opløsningen blev der sat 19 yl 4M ammoniumacetat og 80 yl ethanol med henblik på udfældning.

15 Bundfaldet blev indsamlet, vasket med 70% ethanol og opløst i 15 yl af en blanding af 140 mM natriumcaco-dylat 30mM tris-HCl (pH 6,8), ImM C0CI2» 0,lmM DTT, 0,2 yg poly A og 66 yM (a-32p)dCTP (10 yCi). TTase (P.L., 18 enheder) blev tilsat til opløsningen og omsat dermed ved 20 37°C i 5 minutter. Reaktionsblandingen blev hurtig afkølet til 0°C, og reaktionen blev afsluttet med 1,3 yl 0,25M EDTA og 0,65 yl 10% SDS efterfulgt af ekstraktion med phenol-chloroform og fældning med ethanol.

Bundfaldet blev indsamlet ved centrifugering og 25 derefter digesteret med 4 enheder Hindlll (Takara Shuzo Co., Ltd.) ved 37°C i 2 timer. Efter endt reaktion blev der ekstraheret med phenol-chloroform og fældet med ethanol. Bundfaldet blev indsamlet og opløst i 10 yl af en blanding af lOmM tris-HCl (pH 7,3) og ImM EDTA. Ved 30 tilsætning af 3 yl ethanol blev opløsningen præserveret ved -20°C.

Af den således vundne prøve blev 1 yl holdt sammen med 5 ng linker-DNA i 10 yl af en blanding af lOmM tris-HCl (pH 7,5), ImM EDTA og 0,1M NaCl, holdt ved 65°C 35 i 2 minutter og derefter ved 42°C i 30 minutter og derefter afkølet til 0°C. Til blandingen blev der sat 90 yl 31 DK 171648 B1 af en blandingsopløsning af 20mM tris-HCl (pH 7,5), 4mM MgCl2, lOmM (1^4)2804, 0,1M KCl, 0,lmM $-NAD, 50 vg/ml BSA-6 enheder/ml af E.coli-DNAligase, og derefter blev den kombinerede opløsning holdt ved 12°C natten over.

5 Til opløsningen blev der sat 0,5 μΐ lOmM dNTP, 0,56 vi lOmM NAD, 0,5 μΐ E.coli-DNA-polymerase I (produkt fra Boehringer Mannheim) og 0,2 μΐ RNase H (PL). Blandingen holdtes ved 12¾ i én time og derefter ved 25°C i én time og blev derefter frosset ved -20°C 10 med henblik på præservering.

E.coli HBlOl-stamme blev inkuberet til OD550 på 0,45 i LB-medium (10 g bacto-trypton, 5 g bacto-gæreks-trakt og 10 g/liter af NaCl). Kulturen blev isafkølet i 5 minutter og derefter centrifugeret ved 4°C ved 8000 15 rpm i 5 minutter for at indhøste cellerne. De vundne celle-pellets blev suspenderet i en isafkølet blanding af 30mM kaliumacetat, lOOmM RbCl, lOmM CaCl2» 50mM MnCl og 15% glycerol, holdt ved 0°C i 5 minutter og centrifugeret ved 4°C ved 8000 rpm i 5 minutter. De indsamlede 20 celler blev igen suspenderet i en blanding af lOmM MOPS (morpholinopropansulfonsyre), 75mM CaCl2, lOmM RbCl og 15% glycerol og holdt ved 0°C i 15 minutter for at fremstille kompetente celler, der derefter blev præserveret ved -70°C.

25 Den frosne suspension blev optøet ved stuetempe ratur. DNA-prøven (20 μΐ) blev sat til en 400 μΐ portion af suspensionen, og blandingen blev henstillet ved 0°C i 30 minutter, underkastet varmechock ved 42°C i 90 sekunder og derefter igen henstillet ved 0°C i 1-2 minutter.

30 Med tilsætning af 2 ml LB-medium blev blandingen holdt ved 37°C i 30 minutter. LB-medium (50 gange blandingens volumen) blev inokuleret med blandingen efterfulgt af inkubation ved 37°C i 6 timer. Ampicillin blev sat til kulturen til en koncentration på 50 vg/ml, efterfulgt af 35 inkubation igen natten over, hvorved cDNA-bibliotek blev fremstillet. cDNA-biblioteket blev præserveret i 50% glycerol ved -20°C.

32 DK 171648 B1 (3-3) Fremstilling af syntetisk probe.

Ala - Pro - Val - Arg - Ser - Leu - Asn - Cys -

5’ GCC CCC GTG AGG TCC CTG AAC TGC

5

3' CGG GGG CAC TCC AGG GAC TTG ACG

Thr - Leu - Arg - Asp - Ser - Gin - Gin - Lys -

ACC CTG AGG GAC TCC CAG CAG AAG

1Q TGG GAC TCC CTG AGG GTC GTC TTC

Ser - Leu - Val - Met TCC CTG GTG ATG - 3' AGG GAC CAC TAC - 5' 15

En nucleotidsekvens (vist i den nederste linie) komplementær til basesekvensen med ovennævnte formel syntetiseres ved følgende fremgangsmåde for at anvende 20 den komplementære sekvens som probe til udvælgelse af en transformant med cDNA kodende for IL-1$. På denne måde blev det fuldt beskyttede DNA syntetiseret ved fastfa-sephosphittriestermetoden, hvor N,N-dialkylmethyl-phos— phoramiditderivat anvendes som en kondensationsenhed 25 (Nature, 310, 105 (1984)), under anvendelse af et automatisk synteseanlæg (380A DNA Synthesizer, Applied Biosystems Inc., Foster City, California 94404, U.S.A.).

Derefter blev det fuldt beskyttede DNA behandlet med 28% vandig ammoniak ved 55°C i 10 timer, hvorved beskyttel— 30 sesgrupperne (dvs. acylgrupperne for aminogrupperne A, G og C), forskellige fra DMTr(dimethoxytrityl)-gruppen bundet til hydroxygruppen ved 5'-terminalen, blev fjernet, hvorved der vandtes partielt beskyttet DNA. Derefter blev det partielt beskyttede DNA renset ved omvendt-35 fase-HPLC under anvendelse af C^g-søjle og derefter behandlet med 80% eddikesyre ved stuetemperatur i 10 mi- 33 DK 171648 B1 nutter for at fjerne DMTr-gruppen. Det således vundne nucleotid blev renset ved elektroforese under anvendelse af 10% polyacrylamidgel indeholdende 7M urinstof og ved gelfiltrering under anvendelse af Bio-gel P-30 5 (Bio-Rad), hvorved vandtes det ønskede DNA (60mer).

Det således vundne DNA (6 yg) blev omsat med 12 enheder af T4 polynucleotid-kinase (Takara Shuzo) ved 37°c i 1 time i 50 yl reaktionsblanding (50mM tris-HCl (pH 7,6), lOmM MgCl2, lOmM 2-mercaptoethanol, 0,2 mg/ml 10 af foetalt kvæg thymus-DNA og 50 yCi (y-32p)-ATP) for at mærke 5'terminalen af DNA’et. For at fraskille det mærkede DNA fra ikke-omsat 32p blev reaktionsblandingen underkastet søjlechromatografi under anvendelse af Bio-gel P-30 (Bio-Rad). Fraktionen af det mærkede DNA blev fæl-15 det med 3M natriumacetat i 1/9 af fraktionsvoluminet og ethanol i 2,5 gange fraktionsvoluminet. Bundfaldet blev indsamlet ved centrifugering, opløst i 400 yl blanding af lOmM tris-HCl (pH 8,0) og ImM EDTA og præserveret ved -20°C· 20 Den specifikke aktivitet af den resulterende pro be var mindst 10? cpm/yg DNA.

(3-4) Screening af cDNA-bibliotek.

24 Nitrocellulosefiltre (Millipore HAIFO 8250), 80 mm i diameter, blev anbragt over LB-agarmedium inde-25 holdende 50 yg/ml af ampicillin, og cDNA-bibliotekop-løsningen blev spredt over filtrene fortyndet således, at 5000 kolonier blev anbragt på hvert filter, efterfulgt af inkubation natten over ved 37°C·

Et frisk nitrocellulosefilter blev anbragt over 30 filteret, hvor kolonier viste sig, for at frembringe et replika-filter.

Det oprindelige filter (stamfilter) blev præsen-veret ved 4°C. Replika-filteret holdtes på samme agarmedium som ovenfor ved 37°C i 6 timer til inkubation og 35 overførtes derefter på LB agarmedium indeholdende 200 yg/ml af chloramphenicol, efterfulgt af inkubation ved 37°C natten over.

34 DK 171648 B1

Filteret blev behandlet med 0,5N NaOH, derefter med 1M tris-HCl (pH 8,0) og derefter med en blanding af 1M tris-HCl (pH 8,0) og 1,5M NaCl. Filteret blev derefter tørret i atmosfærisk luft og derefter opvarmet i va-5 kuum ved 80°C i 2 timer.

Det opvarmede filter blev under let rystning holdt ved 68°C natten over i 20 ml opløsning af 1,2M NaCl, 0,12M trinatriumcitrat, 10 mg/ml af Ficoll, 10 mg/ml af polyvinylpyrrolodin, 10 mg/ml BSA, 0,1% SDS og 10 1 mg/ml af laksesperma-DNA. Opløsningen blev erstattet med en opløsning af 1,2M NaCl, 0,12M trinatriumcitrat, 10 mg/ml af Ficoll, 10 mg/ml af polyvinylpyrrolidin, 10 mg/ml af BSA, 0,1% SDS og 10^ cpm/ml af proben, hvori filteret holdtes ved 42°C natten over under let rystning 15 med henblik på hybridisering.

Efter hybridiseringen blev filteret udtaget fra opløsningen, vasket med en opløsning af 1,2M NaCl, 0,12M natriumcitrat og 0,1% SDS tre gange ved stuetemperatur og derefter vasket med samme opløsning ved 60°C, indtil 20 tællingen af filterbaggrunden blev 200 cpm bestemt med GM-intensitetsmåler.

Filteret blev tørret i luften og derefter underkastet autoradiografi ved -70°C i 2 dage under anvendelse af sensibiliseret papir og røntgenstrålefilm (Fuji 25 RX).

Efter fremkaldelse af filmen blev de i signal-regionen tilstedeværende kolonier skrabet fra stamfilte-ret, og ovennævnte fremgangsmåde blev gentaget for at isolere kolonierne med et positivt signal.

30 Herved blev isoleret klon 1-2, der havde et stærkt signal.

(3-5) Analyse af klon.

Restriktionsenzymkort for plasmid pGIF-e-cDNA indeholdt i klon 1-2 blev frembragt.

35 Fig. 1 viser kortet.

Fig. 1 viser, at cDNA'et har steder, der kan skæres over med Ncol (Nippon Gene), Hind III (Nippon Gene), 35 DK 171648 B1

PvuII (Nippon Gene) og AccI (Nippon Gene), ét sted for hver, hvilke overskæringssteder er anbragt i nævnte rækkefølge fra 5'-terminus'en. Det fandtes, at cDNA'et har en længde på ca. 1,5 kb, hvilket er tilstrækkeligt til 5 at kode for GIF med en molekylvægt på ca. 18 Kd.

Derefter blev basesekvensen for pGIF-a-cDNA bestemt ved den kemiske modifikationsmetode ifølge Maxara-Gilbert (Meth.Enzym.65, 499-566, 1980) og dideoxynucle-otid-kædeterminationsmetoden under anvendelse af Ml 3-10 phag (Messing, J. og Vieira, J., Gene, 19, 269-276 (1982)).

DK 171648 Bl 36

CTTATTACAGTGGCAATGAGGATGACTTG

5 TT CTTTGAAGCTGATGGCCCTAAACAGATGAAG

Met Lys TGCTCCTTCCAGGACCTGGACCTCTGCCCTCTG Cys Ser Phe Gin Asp Leu Asp Leu Cys Pro Leu 10 gatggcggcatccagctacgaAtctccgaccac

Asp G ly G ly Ile Gin Leu Arg Ile Ser Asp His CACTACAGCAAGGGCTTCAGGCAGGCCGCGTCA 15 His Tyr Ser Lys G ly Phe Arg Gin Ala Ala Ser GTTGTTGTGGCCAT GGACAAGCTGAGGAAGATG Val Val Val Ala Met Asp Lys Leu Arg Lys Met 20 CTGGTT CCCTGCCCACAGACCTTCCAGGAGAAT Leu Val Pro Cys Pro Gin Thr Phe Gin Glu Asn

GACCTGAGCACCTT CTTT CCCTT CATCTTTGAA

Asp Leu Ser Thr phe Phe Pro Phe I le Phe Glu 25 GAAGAACCTAT CTTCTT CGACACATGGGATAAC Glu Glu Pro Ile Phe Phe Asp Thr Trp Asp Asn GAGGCTTATGTGCACGATGCACCTGTACGATCA 30 Glu Ala Tyr Val His Asp Ala Pro Val Arg Ser CTGAACTGCACGCT CCGGGACT CACAGCAAAAA Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gin Gin Lys 35 AGCTTGGTGATGTCTGGTCCATATGAACTGAAA Ser Leu Val Met Ser G ly Pro Tyr Glu Leu Lys 37 DK 171648 B1 GCTCTCCACCTCCAGGGACAGGATATGGAGCAA Ala Leu His Leu Gin G ly Gin Asp Met Glu Glfo 5 CAAGTGGTGTT CTCCATGT CCTTTGTACAAGGA Gin Val Val phe Ser Met Ser Phe Val Gin Gly GAAGAAAGT AAT GACAAAATACCT GTGGCCTTG io Glu Glu Ser Asn Asp Lys I le Pro Val Ala Leu GGCCT CAAGGAAAAGAAT CTGTACCTGTCCTGC Gly Leu Lys Glu Lys Asn Lue Tyr Leu Ser Cys 15 GTGTTGAAAGATGATAAGCCCACTCTACAGCTG Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu (^In Leu GAGAGTGTAGATCCCAAAAATTACCCAAAGAAG Glu Ser Val Asp Pro. Lys Asn Tyr Pro Lys Lys 20 AAGATGGAAAAGCGATTT GTCTTCAACAAGATA Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile GAAAT CAATAACAAGCTGGAATTTGAGT CTGCC 25 Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala CAGTT CCCCAACT GGTACATCAGCACCT CTCAA Gin Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gin 30 GCAGAAAACATGCCCGTCTTCCTGGGAGGGACC Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr AAAGGCGGCCAGGATATAACTGACTT CACCATG Lys Gly Gly Gin Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met 38 DK 171648 B1 CAATTT GTGTCTT CCTAAAGAGAGCTGTACCCA Gin Phe Val Ser Ser

5 GAGAGT CCTGTGCT GAATGTGGACT CAATCCCT AGGGCTGGCAGAAAGGGAACAGAAGGTTTTTGA 10 GTACGGCTATAGCCTGGACTTTCCTGTTGTCTA CACCAAT GCCCAACTGCCT GCCTTAGGGTAGT G CTAAGACGAT CTCCTGTCCAT CAGCCAGGACAG 15 TCAGCTCTCTCCTTT CAGGGCCAAT CCCAGCCC TTTTGTTGAGCCAGGCCT CTCTCT CACCTCTCC 20 TACTCACTTAAAGCCCGCCTGACAGAAACCAGG CGACATTTT GGTTCTAAGAAACCCTCCTCTGTC ATTCGCT CCCACATT CTGATGAGCAACCGCTT C 25 CCTATTTATTTATTTATTT GTTTGTTT GTITT G ATTCATTGGT CTAATT.TATTCAAAGGGGGCAAG AAGTAGCAGTGT CT GTAAAAGAGCCTACTTTTT

30

ATTAGCTATGGAATCAATT CAATTTGGACTGGT GTGCTCTCTTTAAATCAAGTCCTTT AATTAAGA 35 CTGAAAATATATAAGCTCAGATTATTTAAATGG

39 DK 171648 B1

GAATATTTATAAATGAGCAAATAT CATACTGTT

5

CAATGGTTCTCAAATAAACTT CACTAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

10

Formlen viser, at den understregede region fra det 312. til det 371. nucleotid fra 5'-terminalen er komplementær med den syntetiserede probe. Nucleotidsek-15 vensen havde 75% homologi med nucleotidsekvensen bestemt ifølge human-codon-brugsfrekvenserne.

Når endvidere cDNA'et for pGIF blev efterforsket for den længste læseramme, fandtes denne ramme at være regionen fra det 57. til det 771. nucleotid fra 5'-ter-20 minalen. Dette viser, at cDNA'et for pGIF-a er cDNA, der koder for et IL-l$-precursorprotein.

Transformanten fremstillet ved indføjelse af det ovennævnte plasmid, pGIF-α, i E.Coli χ 1776 har været deponeret under navnet Escherichia coli χ 1776/p GIF-a 25 under deponeringsnummeret FERM BP-948 ver Fermentation Research institute, Agency of Industrial Sciences and Technology siden 12. december 1985.

DK 171648 Bl 40

Referenceeksempel 2

(I) Fremstilling af polypeptid I

(1) De følgende oligodeoxynucleotider (I) og (II) blev fremstillet ved de nedenfor beskrevne fremgangsmåder.

5 5' HOCGATAATGGCTCCTGTACGTTCTCTGAACTGCACTCTCOH 3’ (I) 5' HOCGGAGAGTGCAGTTCAGAGAACGTACAGGAGCCATTATOH 3' (II) 5'-O-Dimethoxytrityl- og N-beskyttet deoxynucleo-10 sid (Applied Biosystem Inc.) bundet til makroporøst silica anvendtes som udgangsmaterialer. Nucleotidkæden blev successivt forlænget fra 3’-terminalen mod 5'-terminalen med kondensationsenhederne af 5'-O-dimethoxy-trityl- og N-beskyttet deoxymononucleosid-3'-phosphoami-15 dit under anvendelse af et automatisk synteseanlæg (380A DNA synthesizer, Applied Biosystems Inc.). Det resulterende produkt blev behandlet med thiophenol med henblik på demethylering og yderligere behandlet med 28% ammoniak ved stuetemperatur for at fjerne nucleotidet fra 20 silica'et, hvorved der vandtes fuldt beskyttet oligo-nucleotid. Ovennævnte fremgangsmåde blev gennemført helt med det automatiske synteseanlæg (Hunkapiller et al.. Nature, 310, 105 (1984)).

Oligonucleotidet blev behandlet med 2 ml 28% van-25 dig ammoniak ved 55°C i 10 timer for at fjerne N-beskyttelsesgruppen og vinde 5'-O-dimethoxytrityl-oligo-nu-cleotid. En femtedel af produktmængden blev renset ved omvendt-fase-HPLC under anvendelse af ODS (Yamamura Ka-gaku Kenkyusho Co., Ltd.)-søjle og derefter behandlet 30 med 150 μΐ 80% eddikesyre ved stuetemperatur i 20 minutter, hvorved vandtes råt oligonucleotid. Produktet blev renset yderligere ved omvendt-fase-HPLC med ODS-søjle, hvorved vandtes det Ønskede oligonucleotid.

Det ved fremgangsmåden ifølge Referenceeksempel 1 35 vundne plasmid pGIF-α blev skåret over med restriktionsenzymer Accl og Clal, hvorved vandtes et DNA-fragment på 41 DK 171648 B1 ca. 1,2 kilobasepar (kbp), der blev isoleret og renset ved agarosegel-elektroforese. DNA-fragmentet blev ved anvendelse af DNA-polymerase I (Klenow-fragment) forsynet med ender uden vedhæftende evne ved de ender, der 5 var skåret over med restriktionsenzymer Accl og Clal.

På den anden side blev BamHI-linker (5'H0CGGATCCG0H3') phosphryleret ved 5'-terminalen med T4 polynucleotid-kinase og forbundet til DNA-fragment uden vedhæftende evne med T4 DNA-ligase efterfulgt af 10 digestering med restriktionsenzym BamHI og yderligere med restriktionsenzym Mspl. Det resulterende reaktions-produkt blev underkastet elektroforese på agarosegel, hvorved der blev isoleret renset MspI-BamHI-DNA-fragment på ca. 540 bp.

15 Oligedeoxynucleotiderne (I) og (II) syntetiseret ovenfor blev phosphoryleret ved 5'-terminalen med T4 polynucleotid-kinase og bundet til MspI-BamHI-DNA-fragmentet under anvendelse af T4 DNA-ligase efterfulgt af digestering med restriktionsenzymer BamHI og Clal. Reak-20 tionsproduktet blev underkastet elektroforese på agaro— segel, hvorved der blev isoleret renset Clal-BamHI-DNA-fragment på ca. 580 bp.

På den anden side blev plasmider pTMI (Fumio Ima-moto, Taishya, bind 22, 289 (1985)) skåret over med 25 restriktionsenzymer BamHI og Clal efterfulgt af agarosegel-elektroforese, hvorved der blev isoleret og renset DNA-fragment på ca. 4,4 kbp med en trp-promotor-region. DNA-fragmentet og Clal-BamHI-DNA-fragmentet på ca. 580 bp fremstillet ovenfor blev ligeret med T4 DNA-30 ligase, hvorved vandtes det ønskede plasmid ptrpGIF-α til ekspression af polypeptid I.

Plasmidet blev indført i E.coli HB101 til transformation, og den Ønskede transformant E.coli HBlOl/ptrpGIF-a blev udvalgt ved restriktionsenzym-ana— 35 lyse af plasmid-DNA'erne, hvilket foregik ved kogemeto— den (T.Maniatis, E.F. Fritsch og J. Sambrook, Molecular 42 DK 171648 B1

Cloning, side 366, Cold Spring Harbor Laboratory, (1982)).

Fig. 2 viser skematisk ovennævnte fremgangsmåde.

Den ved indføring af plasmidet ptrpGIF-α i 5 E.coli χ1776 fremstillede transformant er deponeret under navnet Escherichia coli x1776/ptrpGIF-a og med deponeringsnummeret FERM BP-949 i Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, siden 12. december 1985.

10 (2) Dyrkning af transformant.

Den ovenfor vundne transformant, dvs. E.coli HB10l/ptrpGIF-a, blev inkuberet natten over ved 379c under rystning i 10 ml LB-medium (1% trypsin, 0,5% gæreks-15 trakt og 0,5% NaCl) indeholdende 50 yg/ml af ampicillin og 20 yg/ml af L-tryptophan. En portion på 1 ml af kulturen blev inokuleret i 50 ml M9-miniroummedium (0,6% Na2HP04, 0,3% KH2PO4, 0,05% NaCl, 0,1% NH4CI, 2mM MgS04,

0,2% glucose og 0,lmM CaCl2) indeholdende 50 yg/ml af 20 ampicillin og 1% casaminosyre og inkuberet ved 37°C under rystning. Cellerne blev indhøstet, da absorptionsevnen (O.D.) ved 550 my nåede 1,0, og suspenderet i 5 ml af en opløsning af 15% sucrose, 50mM tris-HCl (pH 8,0) og 50mM EDTA (pH 8,0). En portion på 500 yl af 10 mg/ml 25 lysozyraopløsning (opløst i lOmM tris-HCl (pH 8,0)), blev sat til suspensionen, og 5 ml af en opløsning af 0,3% Triton X100, 187,5mM EDTA (pH 8,0) og 150mM tris-HCl (pH

8,0) blev yderligere tilsat. Blandingen blev henstillet ved stuetemperatur i 15 minutter, derefter omrørt grun-30 digt og centrifugeret, hvorved vandtes en supernatant af celleekstrakt.

43 DK 171648 B1 (3) Rensning af polypeptid I.

Ionbytter-chromatografi (CM-HPLC)

Den på den ovenfor beskrevne måde fremstillede 5 celleekstrakt-supernatant blev dialyseret med 50mM na-triumacetatpuffer (pH 5,5), og dialysatet blev underkastet ionbytterchromatografi (CM-HPLC) under anvendelse af Gilson-HPLC-system (Gilson) under de følgende betingelser: 10 Søjle: IEX-535CM (6,0 x 150 mm, Toyo

Soda Co., Ltd.)

Elueringsmiddel A: 50mM natriumacetat (pH 5,5)

Elueringsmiddel B: 50mM natriumacetat (pH 5,5) indeholdende 0,5M NaCl.

15 Strømningshastighed: 0,5 ml/min.

Fraktionsvolumen: Retentionstid: 0-60......... 2 ml/4 min/rør

60-120 min... 0,5 ml/min/rør 120-180 min.. 2 ml/4 min/rør 20 Koncentrationsgradient: Tid (min) %B

0 0 40 0 120 20 140 100 25 165 100 170 0

Omvendt-fase-HPLC

CM-HPLC-metoden resulterede i en GIF-aktiv frak-30 tion med en retentionstid på 90 til 91 minutter.

Den aktive fraktion blev derefter underkastet om-vendt-fase-HPLC under de følgende betingelser: 44 DK 171648 B1 Søjle: C4 Highpore reverse-fase-sØjle (RP304, Bio-Rad, 250 mm x 4,6 mm (diam.))

Elueringsmidler: A-væske^O,1% TFA

5 B-væske=acetonitril-l% TFA (9:1)

Strømningshastighed: 1 ml/min.

Diagramhastighed: Retentionstid: 0-50 min..... 5 min/cm 50-80........ 2 min/cm

10 Koncentrationsgradient: Tid (min %B

0 0 5 0 15 20 75 45 15 80 100 85 100 90 0

Fraktionsvolumen: 2 ml/2 min/rør 20 Ved en retentionstid på 63,9 til 65,3 minutter opnåedes det ønskede polypeptid I udvisende en enkelt protein-absorbanstop svarende til toppen for GIF-aktivi-tet.

Det således opnåede polypeptid I havde IL-l-ak-25 tivitet og den specifikke aktivitet var 2,7 x 10? GIF-ennheder/mg protein.

(4) Identification af polypeptid I.

30 SDS-polyacrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) SDS-PAGE-analysen af Polypeptid I opnået ved den foranstående fremgangsmde (3) udførtes i overensstemmelse med metoden ifølge Laemmli, U.K. (Nature, 277, 680 (1970)) under følgende betingelser.

45 DK 171648 B1

Prøve: Polypeptid I-fraktionen vundet ved omvendt-fase-HPLC-metoden blev tørret fuldstændigt, derefter 5 opløst i Laemmli-prøve- puffer (ikke-indeholdende 2-mercaptoethanol (2ME“) eller indeholdende 2-mercaptoethanol i en mængde 10 på 1/20 af puffervoluminet (2ME+)) og behandlet ved 100°C i 4 minutter.

Gel: 15% Polyacrylamidgel 1,5 mm i tykkelse.

15 Apparat: Protean, produkt fra Bio-

Rad.

Elektroforese: 40 mA konstant strøm i 2 timer.

Den fra elektroforensen resulterende gel blev 20 farvet med Silver Stain Kit (Bio-Rad).

Resultaterne viser, at Polypeptid I er vandret som et enkelt bånd til positionen til ca. 17Kd i tilfælde for 2ME+ eller af ca. 17,5Kd i tilfælde af 2ME".

25 Isoelektrofokusering (IEF)

Polypeptid I blev underkastet IEP under anvendelse af PAG-plade (LKB) 3,5 til 9,5 i pH-område, og Model 1415 (Bio-Rad) under følgende betingelser.

46 DK 171648 B1

Prøve: Der anvendtes fire baner, dvs. portioner af 0,037 yg, 0,074 ug Polypeptid I opnået ved den foranståen-5 de fremgangsmåde (3) og de følgende markørproteiner (pi markørprotein). Markørproteiner s Amyloglucosidase (3,50) 10 Sojabønnetrypsininhibitor (4,55) β-lactoglobulin A (5,20)

Bovinkulsyreanhydrase B (5,85)

Human kulsyrehydrase B (6,55) Hestemyoglobin-syrebånd (6,85) 15 Hestemyoglobin-basebånd (7,35)

Lentil lectin-syrebånd (8,15)

Lentil lectin-middelbånd (8,45)

Lentin lectin-basebånd (8,65) Tryspinogen (9,30) 20

Elektrodeopløsninger: Anodeopløsning = 1M H3PO4

Katodeopløsning ** 1M NaOH

Elektroforese: Med konstant effekt på lW/cm gelbredde med afkø-25 ling (10°C) i 90 minutter.

Farvning: Med Silver Stain Kit.

Den fra elektroforesen resulterende gel blev opskåret i strimler med en bredde på 1 cm, underkastet ek-30 straktion ved anvendelse af 1 ml destilleret vand under rystning (i to dage) og derefter checket for pH-værdi til beregning af det isoelektriske punkt.

Polypeptid havde et isoelektrisk punkt (PI) på 6,8 i 0,1 og viste sig som et enkelt bånd ved denne po-35 sition.

47 DK 171648 B1

Aminosyresammensætning

Polypeptid I-fraktionen (30 yl) vundet ved om-vendt-fase-HPLC-metoden (3) blev omhyggeligt anbragt i bunden af et tykvægget, hårdt reagensglas af Pyrex-glas 5 på 12 mm x 120 mm og blev derefter tørret i vakuum i en exsiccator indeholdende natriumhydroxid-pellets. En portion på 50 yl af 4N methansulfonsyre (indeholdende 0,2% 3-(2-aminoethyl)indol og fremstillet af Pierce) blev sat til den tørre prøve i reagensglasset. Reagensglassets 10 indre blev afluftet ved 0,1 til 0,2 mm Hg i 1 minut og derefter forseglet. Prøven blev hydrolyseret i en opvarmer ved 118°C over en periode på 24 timer. Efter'åbning af reagensglasset blev blandingen neutraliseret med 46 yl 4N natriumhydroxid og fortyndet til en mængde på 15 450 yl med citronsyrepuffer.

En portion på 250 yl af prøveopløsningen anvendtes til aminosyreanalyse med en aminosyreanalysator (Model HITACHI 835, produkt fra Hitachi Ltd.). De fraskilte aminisyrer blev påvist ved o-phthalaldehyd-meto-20 den og bestemt kvantitativt på basis af kalibreringskurver fremstillet ved anvendelse af autentiske aminosyrer.

Tabel 1 viser resultaterne udtrykt som molforholdet mellem indgående aminosyrer baseret på Phe (9 mol).

25 Under de ovennævnte analysebetingelser er Pro og Cys ikke bestemmelige. For Ser, Thr og Met er den under de ovennævnte betingelser opnåede procentuelle udvinding anført i parentes.

DK 171648 B1 48

Tabel 1

Aminosyre_ Mol-forhold_

Asp og/eller Asn 17,1

Ser 10,9 (80%) 5 Thr 5,4 (90%)

Glu og/eller Gin 23,8

Gly 8,3

Ala 5,0

Val 10,8 10 Met 5,5 (90%)

Ile 4,9

Leu 15,1

Tyr 3,9

Phe (9) 15 Lys 14,9

His 0,9

Trp 0,8

Arg 3,0 20 Aminosyresekvens

En portion på 150 yl af Polypeptid I-fraktionen vundet ved omvendt-fase-HPLC-metoden (3) blev analyseret med et proteinsekvensbestemmelsesapparat (Applied Biosy— stems Inc.)· Hver resulterende PTH-aminosyre blev pas— 25 sende fortyndet med 100 til 50 yl 33% vandig acetoni-trilopløsning, og en portion på 5 yl af fortyndingen blev injiceret i en chromatografisk søjle med et auto-prøveorgan, Waters 710B. Til det chromatografiske system blev to pumper, Beckman Model 112, opereret af et kon-30 trolorgan, Model 421. Den anvendte søjle, der målte 2 mm x 250 mm og var pakket med Ultra-sphere ODS-5 ym, holdtes ved 55°C med en søjleopvarmer. Strømningshastigheden var 0,3 ml/min. En blanding af 20mM natriumacetat og acetonitril anvendtes som gradientopløsning. Absorp-35 tionsevne fulgtes ved 269 nm. Analyse gennemførtes over en periode på 45 minutter.

49 DK 171648 B1

Resultaterne fra 20 analysecycler viste, at Poly-peptid I-fraktionen vundet ved fremgangsmåden (3) havde følgende sekvens af 20 aminosyrer ved N-terminalen.

5 Ala-Pro-Val-Arg-Ser-Leu-Asn-Cys-Thr-Leu-

Arg-Asp-Ser-Gln-Gln-Lys-Ser-Leu-Val-Met-,

Ser blev identificeret ved et af biprodukterne og endvidere identificeret som en dehydroform, der udviste 10 absorption ved 322 nm. I cyklus 8 syntes biproduktets top at angive Cys, og Cys blev endvidere identificeret ved analyse af den oprindelige prøve efter carboxamid-methylering.

Polypeptid I blev endvidere digesteret med tryp-15 sin til opnåelse af peptidfragmenter. Analyse af amino-syresammensætningen af fragmenterne viste, at det C-terminale peptid lige akkurat var indeholdt i det uska-dede polypeptid.

Nærmere betegnet opløstes en portion på 60 tig af 20 polypeptid I i 600 μΐ 1% ammoniumhydrogencarbonat. Til opløsningen sattes 20 ul af en trypsinopløsning (0,2 mg/ml, produkt fra Cooper/Biomedical) i 1% ammoniumhy-drogencarbonat. Man lod blandingen henstå ved 37 °C i 24 timer til opnåelse af peptider spaltet med trypsin. Pep-25 tidblandingen udsattes for omvendt-fase-HPLC (C-18, 300Å, 4,6 x 150 mm; under anvendelse af 0,1% TFA som A-opløsning og acetonitril indeholdende 1% TFA i 1/10 af volumenet af nitrilet som B-opløsning, idet mængden af B-opløsning øgedes med en hastighed på l%/3 min til elu-30 ering). Alle komponenterne var isoleret, da mængden af B-oplØsningen nåede 40%. Peptiderne underkastedes amino-syreanalyse, hvorved alle de forventede peptidfragmenter identificeredes. Især fandt man ved analysen, at det C-terminale peptid var frit for basiske aminosyrer, og 35 at det nøjagtigt indeholdt de forventede aminosyrer. Følgelig havde polypeptid I, opnået ved fremgangsmåden (3), nøjagtig den forudsagte C-terminal.

50 DK 171648 B1 På samme måde som i det foregående undersøgtes peptidfragmenterne for aminosyresekvens. Alle de identificerede sekvenser fandtes at svare til sekvensen af IL-1B. De identificerede sekvenser af de undersøgte pep— 5 tidfragmenter er vist nedenfor i aminosyrernumrene for IL-1B.

1-4, 5-11, 12-16, 17-27, 28-63, 64-65, 66-74, 75-88, 89-92, 95-98, 99-103, 104-109, 110-138, 139-153.

10

Disse resultater viste, at polypeptid I opnået ved fremgangsmåden (3) var polypeptid I med den specificerede sekvens. Den beregnede molekylvægt på polypeptid I er 17376.59.

15

Eksempel 1

(1) Fremstilling af polypeptid VI

ptrpGIF-a opnået ved fremgangsmåden i Referenceeksempel 2 anvendtes til fremstilling af polypeptid VI 20 med aminosyresekvensen for polypeptid I, hvori den 71. aminosyre, Cys, fra N-terminalen var erstattet af Ser, i overensstemmelse med den stedspecifikke mutagenesemetode (Pro. Nat. Acad. Sci., 81, 5662-5666 (1984); Science, 224, 1431 1984)).

25 M13 mp 11-phagvektor anvendtes som en enkelts trengs DNA-templat. EcoRl/BamHI-DNA-fragment isoleredes fra plasmid ptrpGIF-α og klonedes i M13 mp 11-phag ved restriktionsstederne for restriktionsenzymerne EcoRI og BamHI til opnåelse af enkeltstrenget (ss) DNA (M13-GIF-30 a), som dernæst anvendtes som en metagenesetemplat. Det syntetiske oligonnucleotid [5'-CTGTCCTCAGTGTTG-3' (primer)] phosphyleredes med T4-polynucleotidkinase og hybridiseredes med ss M13-GIF-aDNA. Hybridet blev "annealet", derefter behandlet med DNA-polymerase I 35 (Klenow fragment) og T4-DNA-ligase i tilstedeværelse af dNTP'er og inkuberet ved 15°C i 18 timer.

51 DK 171648 B1

Det opnåede DNA blev indføjet i JM105 kompetentcelle til transformation. Den resulterende phagplaque (50 kolonier) inokuleredes på en agarplade og inkuberedes ved 37°C i 18 timer. Et filter indeholdende kultu-5 ren behandledes med en base på sædvanlig måde til denaturering, tørredes og opvarmedes til 80°C i 2 timer. DNAet prehybridiseredes og hybridiseredes dernæst ved stuetemperatur med 32p probe fremstillet ved mærkning af primeren med 32p_r_ATp. Filtret opnået ved hybridiserin-10 gen vaskedes med 6 x SSC-puffer ved stuetemperatur i 10 minutter og desuden ved 37°C i 10 minutter, tørredes og underkastedes dernæst autoradiografi ved -70°C i 18 timer.

M13-GIF-71s udvalgtes som en typisk klon blandt 15 fem mutantkloner, inficeredes med JM105 og inkuberedes til dannelse af ssDNA og RF DNA.

M13-dideoxynucleotidsekvensbestemmelse udførtes for ssDNA for at bekræfte mutationen af det behandlede gen.

20 Nyligt dannet restriktionssted for restriktions enzymet Ddel identificeredes også i RF DNA.

EcoRl/BamHI-fragment fremstilledes ud fra RF DNA fremstillet i JM105, indføjet i ekspressionsplasmid som i (1) i det foregående til opnåelse af det Ønskede poly-25 peptid VI-ekspressionsplasmid ptrpGIF-a-71S.

E. coli HB 101 transformant indeholdende det forannævnte plasmid deponeredes under FERM nr. BP1296 som "Escherichia coll HB 101/ptrp GIF-a-71S" ved Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science 30 and Technology (FERM).

En celleekstraktsupernatant fremstilledes ved anvendelse af plasmidet på samme måde som i Referenceeksempel 2-(2) og undersøgtes for GIF-aktivitet. GIF— aktiviteten var herved 2,4 x 106 enheder/ml kultur, når 35 E. coli HB101 anvendtes som værten.

Det ønskede polypeptid VI isoleredes fra celle-ekstraktsupernatanten og rensedes på samme måde som i 52 DK 171648 B1

Referenceeksempel 2-(3).

(2) Fremstilling af polypeptid IV.

Polypeptid IV fremstilledes ifølge den foranstå-5 ende fremgangsmåde (1) ved anvendelse af plasmid ptrpGIF-α.

Ml3 mp 11-phagvektor anvendtes som en enkeltstrengs DNA-templat. EcoRI/BamHI-DNA-fragment isoleredes fra plasmid ptrpGIF-α og klonedes i Ml3 mp 11-phag ved 10 restriktionsstederne for restriktionsenzymerne EcoRI og BamHI til opnåelse af enkeltstrenget (ss) DNA (M13-GIF- o), som dernæst anvendtes som mutagenesetemplat. Det syntetiske oligonucleotid [5'-CTGAACTCGACTCTC-3' (primer)] phosphoryleredes med T4-polynucleotidkinase og 15 hybrideseredes med ss M13-GIF-oDNA. Hybridet blev annea-let, derefter behandlet med DNA-polymerase I (Klenow fragment) og T4 DNA-ligase i tilstedeværelse af dNTPS og inkuberet ved 15°C i 18 timer.

Det opnåede DNA indføjedes i JM105 kompetentcelle 20 til transformation. Den resulterende phagplak (100 kolonier) inokuleredes på en agarplade og inkuberedes ved 37°C i 18 timer. Et filter indeholdende kulturen behandledes med en base på sædvanlig måde til denaturering, tørredes og opvarmedes dernæst ved 80°C i 2 timer.

25 DNA’et prehybridiseredes og hybridiseredes dernæst ved stuetemperatur med 32p-probe, fremstillet ved mærkning af primeren med 32p-r-ATP. Filteret opnået ved hybridi-sering vaskedes med 6 x SSC-puffer ved stuetemperatur i 10 minutter og desuden ved 37°C i 10 minutter, tørredes 30 og underkastedes dernæst autoradiografi ved -70°C i 18 timer.

M13-GIF-8s udvalgtes som en typisk klon blandt fire mutantkloner, inficeredes med JM105 og inkuberedes til dannelse af ssDNA og RF DNA.

35 Ml3-dideoxynucleotidsekvensbestemmelse udførtes for ssDNA for at bekræfte det omhandlede gens mutering.

53 DK 171648 B1

Nyligt dannede restriktionssteder for restriktionsenzymet Hinfl identificeredes også i RF DNA.

EcoRl/BamHI fragment fremstilledes ud fra RF DNA dannet i JM105, indføjedes i ekspressionsplasmidet, som 5 i Referenceeksempel 2-(l) til opnåelse af det ønskede polypeptid IV-ekspressionsplasmid, ptrpGIF-a-8S.

En celleekstraktsupernatant fremstilledes ved anvendelse af plasmidet på samme måde som i referenceeksempel 2-(2) og undersøgtes for GIF-aktivitet. Aktivite-10 ten var 1,2 x 105 enheder/ml kultur, når E. coli HB101 anvendtes som vært, eller 6,2 x 10^ enheder/ml kultur, når E. coli W3110 anvendtes.

Det Ønskede polypeptid IV isoleredes fra celleekstrakt supernatanten, hvorefter det rensedes ved samme 15 fremgangsmåde som i eksempel 2-(3).

(3) Fremstilling af polypeptid V.

Plasmid ptrpGIF-a-71S og ptrpGIF-a-8S opnået ved fremgangsmåderne beskrevet i det foregående blev skåret 20 over med restriktionsenzymerne EcoRI og HindiII til isolation af ca. 400-bp DNA-fragment fra ptrpGIF-a8S og ca. 4600-bp DNA-fragment fra ptrpGIF-a-71S. Disse fragmenter blev ligeret til opnåelse af plasmid ptrpGIF-o-8S71S til ekspression af det ønskede polypeptid V med aminosyre-25 sekvensen for IL-1B (polypeptid I), hvori den 8. og 71. aminosyre, Cys, fra N-terminalen begge var erstattet af Ser.

På samme måde som i Referenceeksempel 2-(2) fremstilledes en celleekstraktsupernatant ved anvendelse af 30 plasmidet. (GIF-aktiviteten var 1,4 x 10^ enheder/ml kultur, når E. coli HB101 anvendtes som vært, og 5 x 10^ enheder/ml kultur, når E. coli W3110 anvendtes). Det Ønskede plypeptid V isoleredes fra celleekstraktsuper-natanten og rensedes på samme måde som i Referenceek-35 sempel 2-(3).

54 DK 171648 B1 (4) Fremstilling af polypeptid II.

På samme måde som ved fremgangsmåden (1), som beskrevet i det foregående, opnåedes polypeptid II-eks-pressionsplasmid ptrpGIF-a-4G ved anvendelse af 5 5'-GCTCCTGTAGGTTCTCTG-3' som primer.

E. coli HB 101-transformant indeholdende plasmi-det, beskrevet i det foregående, deponeredes under FERM nr. BP1297 som "Escherichia coli HB 10l/ptrp GIF-o-4G" ved Fermentation Research Institutte, Agency of Indu— 10 strial Sciense and Technology (FERM).

På samme måde som i Referenceeksempel (2), fremstilledes en celleekstraktsupernatant ved anvendelse af plasmidet. (GIF-aktiviteten var 2,8 x 10® enheder/ml kultur, når E. coli HB101 anvendtes som vært). Det Øns-15 kede polypeptid II blev isoleret fra celleekstraktsuper-natanten og renset på samme måde som beskrevet i Referenceeksempel 2-(3).

Ved denne rensningsmetode opnåedes polypeptid XXXXVIII ved rensning ved rechromatografering ved den 20 første halvdel af hovedtoppen af CM-HPLC. Polypeptidet XXXXVIII havde i det væsentlige samme virkning til at fremme produktionen af CSF og havde lav GIF- og LAF-aktivitet og lav virkning til at fremme dannelsen af PGE som polypeptid II.

25 (5) Fremstilling af polypeptid III.

Ved samme fremgangsmåde som i det foregående (1) opnåedes polypeptid III-ekspressionsplasmid ptrpGIF-a-11Q ved anvendelse af 5'-GCACTCTCCAGGACTCACA-3' som pri-30 mer.

På samme måde som i Referenceeksempel 2-(2) fremstilledes en celleekstraktsupernatant ved anvendelse af plasmidet. (GIF-aktiviteten var 2,8 x 10® enheder/ml kultur, når E. coli HB101 anvendtes som vært). Det øns-35 kede polypeptid III isoleredes fra celleekstraktsuperna-tanten og rensedes på samme måde som i Referenceeksempel 55 DK 171648 B1 2-(3).

(6) Fremstilling af polypeptid VII.

Ved den samme fremgangsmåde som i det foregående 5 (1) opnåedes polypeptid VII-ekspressionsplasmid ptrpGIF- a-102CT ved anvendelse af 5'-TCTTCAACTAGATAGAA-3' som primer.

På samme måde som i Referenceeksempel 2-(2) fremstilledes en celleekstraktsupernatant ved anvendelse af 10 plasmidet. (GIF-aktiviteten var 7,4 x 104 enheder/ml kultur, når E. coli HB101 anvendtes som vært). Det ønskede polypeptid VII isoleredes fra celleekstraktsuperna-tanten og rensedes på samme måde som i Referenceeksempel 2—(3).

15 (7) Fremstilling af polypeptid VIII.

Ved den samme fremgangsmåde som i det foregående (1) opnåedes polypeptid VIII-ekspressionsplasmid ptrpGIF-a-140CT ved anvendelse af 5'AAAGGCGGCTAGGATATAA-3' som primer.

20 På samme måde som i Referenceeksempel 2-(2) frem stilledes en celleekstraktsupernatant ved anvendelse af plasmidet. (GIF-aktiviteten var 5,8 x 10·* enheder/ml kultur, når E. coli W3110 anvendtes som vært). Det ønskede polypeptid VIII isoleredes fra celleekstraktsuper— 25 natanten og rensedes på samme måde som i Referenceeksempel 2- (3).

Plasmidet ptrpGIF-a-140CT indføjedes til ekspression endvidere i E. coli HB101 som vært, hvorved der opnåedes en celleekstraktsupernatant (med en GIF-aktivitet 30 på 1,3 x 106 enheder/ml kultur) på samme måde som i det foregående. Polypeptid I isoleredes fra supernatanten og rensedes på samme måde.

Når E. coli HB101 anvendes som vært i det ovenstående tilfælde, virker supE som en nonsense-suppres— 35 sor, og UAG-stopcodon læsses gennem som Gin til ekspri-mering af polypeptid I. På den anden side virker UAG, 56 DK 171648 B1 når E. coli W3110 anvendes som vært, som stopcodon, idet der ikke er kodet for supE genet, med det resultat, at polypeptid VIII eksprimeres, hvilket omfatter en sekvens på 140 aminosyrer.

5 (8) Identifikation af polypeptiderne I til VIII.

IL-18-derivater (polypeptiderne I til VIII) ifølge opfindelsen fremstillet ved de foregående fremgangsmåder (1) til (7) underkastedes SDS-PAGE (18* polyacryl-10 amidgel, 2ME+) på samme måde som i Referenceeksempel 2-(4).

Ved denne vandrede hver af polypeptiderne I til VII som et enkelt bånd til positionen for ca. 17,5 kd, og polypeptid VIII vandrede på samme måde til positio-15 nen for ca. 16 kd.

Western blotting (Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 76, 1420 (1979)) udførtes for polypeptiderne I til VIII ved anvendelse af neutral antiserum for GIF-aktivitet for polypeptid I (fremstillet ved immunisering af en ka-20 nin med polypeptid I, opnået i Referenceeksempel 2-(3) ved den sædvanlige fremgangsmåde), hvorved hver af disse polypeptider identificeredes som et enkelt bånd ved den tilsvarende position.

25 Eksempel 2 (1) Transformanten (E. coli HB10l/ptrpGIF-a) opnået i Referenceeksempel 2—(1) inkuberedes natten over ved 37°C i 400 ml LB-medium indeholdende 50 yg/mg ampicillin og 20 yg/ml L-tryptophan. M9-minimummedium (20 liter) inde-30 holdende 1% casaminosyre inokuleredes med kulturen (400 ml), hvorefter der blev inkuberet ved 37°C i 8,5 timer.

Den resulterende kultur centrifugeredes til opsamling af cellerne, som suspenderedes i 1M Na2HP04 og henstod natten over i kølerum. Suspensionen dialyseredes 35 dernæst mod 10 mM tris-HCl-puffer (pH 8,0) i 2 dage.

Det opnåede dialysat centrifugeredes (10000 omdr./min, 30 min.) til opnåelse af en supernatant.’ 57 DK 171648 B1

Supernatanten opsamledes i en mængde svarende til 300 1 E. coli kultur, instilledes til en pH-værdi på 5,0 med 100 mM eddikesyre og ledtes gennem en Zeta Prep SP-250-indsats (produkt fra LKB) med en strømningsha-5 stighed på 30 ml/min. Elueringen udførtes med 10 mM natriumacetat (pH 5,3) i 100 minutter, derefter med 50 mM natriumacetat (pH 5,5) indeholdende 0,1 M NaCl i 220 min., og endvidere med 50 mM natriumacetat (pH 5,5) indeholdende 0,1 M NaCl. Fraktionerne undersøgtes ved HPLC 10 til opsamling af fraktionerne indeholdende det ønskede materiale, dvs. fraktionerne nr. 8 til nr. 10 af 50 mM natriumacetat (pH 5,5) indeholdende 0,1 M NaCl.

Den kombinerede fraktion instilledes til en pH-værdi på 4,5 med 100 mM eddikesyre, underkastedes HPLC 15 (TSK Gel SP-5PW, 5,5 x 20 cm, produkt fra Toyo Soda Mfg.

Co., Ltd.) og eluering under de følgende betingelser til opnåelse af fraktioner fra 65 til 72 minutter med hensyn til retentionstid (r.t.).

Elueringsmiddel A: 50 mM natriumacetat (pH 5,5) 20 Elueringsmiddel Bs 50 mM natriumacetat (pH 5,5) indeholdende 0,5 M NaCl.

Strømningshastighed: 30 ml/min.

Koncentrationsgradient: Tid (min) % B

0 0 25 30 0 84 9 104 100 124 100 134 0 30 180 0

Polypeptid I opnåedes således renset.

Ved ultrafiltrering (YM-5-membran), koncentreredes produktet til 20 mg/ml i form af en 20 mM natrium-35 phosphatpufferopløsning (pH 7,0) ved udskiftning af pufferen.

DK 171648 Bl 58

Koncentratet blev endvidere ledt gennem et filterapparat udstyret med Posidynfilter NFZ (produkt fra Nohon Pali) til sterilisation til opnåelse af et rent produkt, som havde et pyrogenindhold på indtil 100 pg/mg 5 protein.

Rensningsmetoden gav ca. 3 g polypeptid I ud fra 300 liter E. coli-kultur.

(2) Fraktionerne (r.t. 64 til 65 min) af den første 10 halvdel af hovedtoppen under den foregående (1) underkastedes igen chromatografi til opnåelse af polypeptid X.

2,7 x 10® GIF enheder/mg protein.

På samme måde gav fraktionerne (r.t. 72 til 76 min) af den anden halvdel af hovedtoppen polypeptid XI.

15 2,8 x 107 GIF-enheder/mg protein.

(3) Polypeptiderne I, X og XI opnået ved fremgangsmåderne (1) og (2) i det foregående underkastedes aminosyrea-nalyse på samme måde som i Referenceeksempel 2-(4).

20 Resultaterne vises i tabel 2 nedenfor.

Aminosyresekvensen af polypeptiderne X og XI analyseredes på samme måde som i Referenceeksempel 2-(4) til identifikation af sekvensen af disses N-terminaler.

59 DK 171648 B1

Tabel 2 Molforhold t . *

Aminosvro Polypeptid- I Polypeptid. X Polypeptid XI

5 Asp ng/elier

Asn 17,7 17,5 16,4

Ser 13,0 13,0 12,9

Thr 5,8 5,7 5,7

Glu og/elier 10 Gin 24,0 24,0 23,0

Gly 8,6 8,5 8,5

Ala 5,2 5,2 4,1

Val 10,3 10,2 10,1

Met 5,8 6,7 5,8 15

Ile 4,9 4,9 4,8

Leu 15,5 15,6 ' 15,6

Tyr 3,6 3,7 3,8

Phe (9) (9) (9) 20

Lys 14,9 14,7 14,3

Eis 1,0 1,0 1,0

Trp tilstede .tilstede tilstede

Arg 2,9 2,8 3,0 25 - (4) Polypeptid I har to Cys-rester (i 8- og 71-stilling-erne) i molekylet. Tilstanden af SH-gruppen, der er tilstede på sidekæden a£ disse Cys-rester undersøgtes ved den følgende fremgangsmåde.

30 a. Ca. 5 nmol polypeptid I opnået i Referenceeksem

pel 2-(3) (i form af en 100 yl opløsning af 50 mM natriumacetat (pH 5,5) indeholdende 0,1 M NaCl) anbragtes i hvert af tre testrør A, B og C. En portion på 300 jil af 6 M guanidinhydrochloridopløsning indeholdende 0,1 M

35 tris-HCl (pH 8,45) anbragtes desuden i hvert rør.

Dernæst anbragtes 25 μΐ 6 M guanidinhydrochloridopløsning i hvert af rørene A og B til fremstilling af 60 DK 171648 B1 blindprøver. I testrøret C anbragtes 25 μΐ 6 M guanidin-hydrochloridopløsning indeholdende 2 ymol dithiothrei— tol, der virkede som reduktionsmiddel. Nitrogengas tilførtes til hvert testrør i 1 minut, og røret henstod de-5 refter ved 50°C i 2 timer.

Dernæst anbragtes 25 yl 6 M guanidinhydrochlori-dopløsning i blindprøvetestrøret Ά, og 25 ymol 6 M gua-nidinchloridopløsning indeholdende 4 ymol iodacetamid anbragtes i hvert af testrørene B og C. Efter tilførsel 10 af nitrogengas til hvert testrør i 1 minut, henstod røret i mørke ved 25°C i 30 minutter.

Efter tilsætning af 5 yl TFA til blandingen i hvert af de således præparerede testrør A, B og C underkastedes blandingerne omvendt-fase-HPLC (C3) til rens-15 ning af proteinet.

Ca. l/lO af mængden af det rensede protein anbragtes i et testrør, tørredes, hydrolyseredes med 4 N methansulfonsyre og undersøgtes for aminosyresammensæt-ning.

20 Herved påvistes næsten lige store mængder carbo- xymethylcystein fra testrørene B og C, mens polypeptid I i testrøret A forblev uændret. Dette viser, at poly-peptidet i testrørene B og C blev omdannet til S-carboxamidmethyleret polypeptid I (idet polypeptidet i 25 testrøret B ikke var udsat for reduktionsmiddel), hvilket viser, at ingen disulfidbinding (S-S-binding) dannedes med Cys-resten i polypeptid I.

Endvidere blev produktet, der forblev i hvert af testrørene A, B og C tørret og dernæst opløst i 600 yl 30 ammoniumhydrogencarbonatopløsning. Opløsningens koncentration indstilledes til lyg/5 yl. En trypsinopløsning (7,5 yl) sattes til opløsningen til digestering af proteinet med enzymet ved 37°C i 20 timer.

Den enzymatiske reaktion afsluttedes ved tilsæt-35 ning af 10 yl 10% TFA til blandingen, og peptidfragmenterne skiltes fra ved omvendt-fase-HPLC (Cie)· 61 DK 171648 B1

Som et resultat heraf, udviste testrørene B og C næsten samme mønster, mens testrøret A udviste et mønster forskelligt derfra.

De således isolerede peptider undersøgtes for 5 aminosyresammensætning på samme måde som i det foregående. Peptidfragmentet i testrøret A viste tilstedeværelsen af peptid, som ikke ville forekomme uden tilstedeværelse af Cys.

Disse resultater viste, at der ikke dannedes di-10 sulfidbinding intramolekylært eller intramolekylært med polypeptidets Cys-rest.

b. Mængden af SH-grupperne i polypeptid I blev be stemt kvantitativt ved Ellman metoden (Arch. Biochem. Biophys., 82, 70 (1959)) på den følgende måde.

15 En portion på 200 pg (11,5 pmol) af polypeptid I

opnået i Referenceeksempel 2-(3) opløstes i 1 ml 0,1 M tris-HCl puffer (pH 8,0) indeholdende 6 M guanidinhy-drochlorid og 1 mM EDTA. På den anden side fremstilledes frisk 0,05 M phosphatpuffer (pH 7,0), som indeholdt 0,01 20 M DTNB (5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoesyre). (Pufferen vil i det følgende blive betegnet "Ellman pufferen").

En ml 0,1 M tris-HCl puffer (pH 8,0) indeholdende 6N guanidinhydrochlorid og 10 mM EDTA anbragtes i en kontrolcelle, og 1 ml af den ovennævnte opløsning inde-25 holdende polypeptid I i en prøvecelle. En portion på 40 yl af Ellman reagenset blandedes med indholdet af hver celle, hvorefter blandingens absorbans måltes ved 412 nm. Efter opnåelse af maksimal absorbans blev reduktionen af absorbansen på grund af sønderdelingen af DTNB 30 korrigeret til "0" ved bestemmelse af koncentrationen af SH-grupper.

Den faktisk opnåede absorbans til 412 nm var 0,328.

På den anden side var €412 for 3-carboxylat-4-35 nitrothiophenolationen i vandig opløsning indeholdende 6 M guanidinhydrochlorid 13880 M-lxcm~l (Eur. J. Biochem., 62 DK 171648 B1 30, 32 (1972)). Dette viste, at SH-grupperne i polypeptid I-oplØsning gav 0,0000245 M/e, og at 11,5 pmol poly-peptid I indeholdt 24,5 jjmol SH-grupper.

Det ovenstående resultat viser, at Cys-resterne i 5 polypeptid I havde en fri SH-gruppe.

Endvidere fandtes ingen eller kun lille ændring i GIF-aktivitet og i antallet af SH-grupper bestemt ved Ellman metoden, når en opløsning af polypeptid I i vand eller PBS (-) blev lyofiliseret 3 til 4 gange.

10 (5) Når et heteroprotein eksprimeres i en stor mængde i E. coli eller lignende ved en genrekombinantmetode akkumuleres proteinet ikke sjældent som et inklusionslegeme i E. coli celler. I et sådant tilfælde kræver opsamling 15 af proteinet fra cellerne en behandling under skrappe betingelser, der f.eks. omfatter anvendelse af et denatureringsmiddel, såsom 7 M guanidinhydrochlorid, 8 M urinstof, 0,1% SDS, eller lignende. En sådan behandling vil imidlertid med stor sandsynlighed forårsage irrever-20 sibel skade på det ønskede protein, herunder en højere struktur af dette. Følgelig er man ved genrekombinantme-toder meget interesseret i at isolere det ønskede protein under milde betingelser, og i så stor udstrækning som muligt uden anvendelse af denatureringsmiddel. I den 25 henseende er fremgangsmåden (1), beskrevet i det foregående, meget gunstige, idet det ønskede protein kan ek-straheres og isoleres under meget milde betingelser, dvs. ved osmotisk chok. Denne fremgangsmåde er også ønskelig, idet det opnåede protein har en højere struktur, 30 der ligner naturprodukters struktur.

(6) Ved anvendelse af plasmid ptrpGIF-α, fremstilledes polypeptiderne (IL-1β-derivaterne ifølge opfindelsen) opremset i tabel 3 i det følgende ved stedspecifik mu- 35 tagenese på samme måde som i eksempel 1-(1). Polypeptiderne blev eksprimeret og renset, og deres GIF-virkning 63 DK 171648 B1 blev målt ved den tidligere beskrevne fremgangsmåde (1)/ og SDS-PAGE udførtes på samme måde som i Referenceeksempel 2-(4). I de følgende eksempler anvendtes lignende fremgangsmåder, bortset fra, hvor andet er angivet.

64 DK 171648 B1

Tabel 3

Polypeptid__Primer_ XII 5'-GAAAAGCTTTTTGTC-3 * XVII 5'-TGGCTCCTGTATCTCTGAA-31 XVIII 5'-ACTGCACTCTCGACTCACA-3' XIX 5'-AGATGGAAAAGTTTGTCTT-3' 10 XX 5 *-CTCTGAACGCCACTCTCC-3 * XXI 5'-GTTCTCTGAACACTCTCCG-3' XXII 5'-ACCTGTCCGCCGTGTTGA-3' XXIII 5‘-ACCTGTCCGTCGTGTTGA-3' XXIV 5'-TGTACCTGTCCGTGTTGAA-3' XXV 5'-CCAAAGCTGAAGATG-3' XXVI 5'-ATATAACTTAATTCACCA-3' XXVII 5'-TCACCATGTAATTTGTGT-3' XXVIII 5'-TTCCCCAACCGGTACATC-3' XXIX 5 *-AAAGCTCTCTACCTCCAG-3’ IX 5'-CCCAAGTGGTAGATCAGCA-3 * 20 XXXV 5'-CCCAAGTGGTAGATCAGCA-3' XXXIX 5'-ATCGATAATGCGTTCTCT-3' XXXX 5'-ATCGATAATGAACTGCAC-3' XXXXI 5'-ATCGATAATGCTCCGGGA-3' XXXXII 5’-ATGGCTCCTCGTTCTCTG-3' 25 XXXXIII 5'-CCTGTACGTCTGAACTGC-3' XXXXIV 5'-AAGATGGAACGATTTGTC-3' XXXXV 5'-GAAAAGCGAGTCTTCAAC-31 XXXXVI 5'-ATGCAATTTTAATCTTCCTA-3' XXXXVII 5'-TTGTGTCTTAATAAAGAG-3' 30 65 DK 171648 B1

Mol GIF-a^rtivitet

Poly- konstrueret V^rt juesgt (enhedér/ml peptid plasmid_ (E.coli) (kd) kultur)· XII ptrpGIF-e-98L W3110 17,5 2,0 x 103 XVII ptrpGIF-a-4R-d HB101 17,4 7,3 x 104 XVIII ptrpGIG-a-llR-d HB110 17,4 4,6 x 102 XIX ptrpGIF-a-98R-d W3110 17,4 2,3 x 103 10 XX ptrpGIF-a-8A HB101 17,5 2,4 x 106 XXI ptrpGIF-a-8C-d HB101 17,4 1,6 x 106 XXII ptrpGIF-a-71A HB101 17,5 1,6 x 10δ XXIII ptrpGIF-a-71V HB101 17,5 1,2 x 106 XXIV ptrpGIF-a-71C-d HB101 17,4 3,5 x 102 XXV ptrpGIF-o-93L HB101 17,5 5,5 x 105 XXVI ptrpGIF-a-144CT HB101 16,5 2,6 x 102 XXVII ptrpGIF-a-148CT HB101 16,9 2,4 x 102 XXVIII ptrpGIF-a-120R HB101 17,5 8,5 x 105 XXIX ptrpGIF-a-30Y HB101 17,5 3,2 x 105 IX ptrpGIF-a-121Q HB110 17,5 3,2 x 104 20 XXXV ptrpGIF-a-121Q W3110 13,7 3,9 x 102 XXXXIX ptrpGIF-a-NT3AA-d HB101 17,4 1,2 x 105 XXXX ptrpGIF-a-NT6AA-d HB101 16,8 9,4 x 102 XXXXI ptrpGIF-a-NT9AA-d HB110 16,5 2,4 x 102 XXXXII ptrpGIF-a-3V-d HB101 17,4 2,9 x 105 25 XXXXIII ptrpGIF-a-5S-d HB101 17,4 8,4 x 102 XXXXIV ptrpGIF-a-97K-d HB101 17,4 8,9 x 102 XXXXV ptrpGIF-a-99F-d HB101 17,4 2,7 x 102 XXXXVI ptrpGIF-a-150CT HB101 17,2 2,7 x 105 XXXXVII ptrpGIF-a-152CT HB101 17,4 8,0 x 105 30 66 DK 171648 B1 (7) Ved anvendelse af plasmid ptrpGIF-a-102CT opnået i eksempel l-(6) og E. coli W3110 som værtf fremstilledes polypeptid XXX, et IL-1ø-derivat ifølge opfindelsen, ved 5 lignende ekstraktions- og rensningsmetoder. Ca. 11,4 kd (ved SDS-PAGE).

(8) Ved anvendelse af pt rpGIF-a-4G og 5'-GCACTCTCCAGGACTCACA-3' som primer, fremstilledes po- 10 lypeptid XIV ekspressionsplasmid ptrpGIF-a-4GHQ på samme måde som fremgangsmåden (6).

Ved anvendelse af plasmidet og E. coli HB101 som vært, opnåedes polypeptid XIV, et IL-1Ø-derivat ifølge opfindelsen, ved lignende ekspressions- og rensningsme-15 toder. Ca. 17,5 kd (ved SDS-PAGE). 2,7 x 105 GIF-en-heder/ml kultur.

(9) På samme måde som i eksempel 1-(3), fremstilledes polypeptid XV ekspressionsplasmid ptrpGIF-a-4G98L ved 20 anvendelse af plasmid ptrpGIF-<x-4G og plasmid ptrpGIF- o-98L.

Nærmere betegnet blev de to plasmider skåret over med restriktionsenzymerne EcoRI og Hindlll. Dernæst blev et ca. 400-bp DNA-fragment skåret ud fra ptrpGIF-a-4G, 25 og et ca. 4,6-kbp DNA-f ragment blev skåret ud fra ptrpGIF-a-98L, og de to fragmenter blev ligeret.

Ved anvendelse af ptrpGIF-a-4G98L og E. coli W3110 som vært, fremstilledes polypeptid XV, et IL-lø-derivat ifølge opfindelsen, ved lignende ekspres-30 sions- og rensningsmetoder. Ca. 17,5 kd (ved SDS-PAGE).

(10) Plasmid ptrpGIF-a-llQ98L til ekspression af polypeptid XVI fremstilledes på samme måde som fremgangsmåden (9), bortset fra, at plasmid ptrpGIF-o-4G var er- 35 stattet af plasmid ptrpGIF-a-llQ (ved anvendelse af ca. 400-bp DNA-fragment deraf).

67 DK 171648 B1

Polypeptid XVI, et IL-LB-derivat ifølge opfindelsen, opnåedes på samme måde ved anvendelse af plasmidet.

Ca. 17,5 kd (ved SDS-PAGE).

5 (11) Plasmid ptrpGIF-a-4GllQ anvendtes i stedet for plasmid ptrpGIF-a-4G i fremgangsmåden (9) til opnåelse af et ca. 400-bp DNA-fragment fra plasmidet. Plasmid ptrpGIF-a-4GHQ98L til ekspression af polypeptid XIII opnåedes på samme måde ved anvendelse af fragmentet.

10 Polypeptid XIII, et IL-1B-derivat ifølge opfin delsen, opnåedes på samme måde ved anvendelse af dette plasmid. Ca. 17,5 kd (ved SDS-PAGE).

(12) Plasmid ptrpGIF-o-8A71S til ekspression af poly-15 peptid XXXVI fremstilledes på samme måde som i eksempel l-(3) ved anvendelse af plasmid ptrpGIF-a-8A og plasmid ptrpGIF-a-71S.

Mere specifikt blev de to plasmider skåret over med restriktionsenzymerne EcoRI og Hindlll. Dernæst blev 20 et ca. 400-bp DNA-fragment skåret ud fra ptrpGIF-a-8A, og et ca. 4,6-kbp DNA-fragment blev skåret ud fra ptrpGIF-o-71S, og de to fragmenter blev ligeret.

Ved anvendelse af plasmid ptrpGIF-a-8S71S og E. coli som vært, opnåedes polypeptid XXXVI, et IL-iP-deri-25 vat ifølge opfindelsen, ved samme ekspressions- og rensningsmetoder. Ca. 17,5 kd (ved SDS-PAGE). 8,7 x 10^ GIF/enheder/ml kultur.

(13) Plasmid ptrpGIF-a-8A71A fremstilledes på samme måde 30 som fremgangsmåden (12), bortset fra at plasmid ptrpGIF- a-71A anvendtes i stedet for plasmid ptrpGIF-a-71S (til anvendelse af et ca. 4,6-kbp DNA-fragment deraf). E. coli HB 101-transformant indeholdende det ovennævnte plasmid blev deponeret under FERM nr. BP1298 som 35 "Escherichia coli HB 101/ptrp GIF-o-8A71A" ved Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (FERM).

68 DK 171648 B1

Polypeptid XXXVII, et IL-1β-derivat ifølge opfindelsen, opnåedes på samme måde ved anvendelse af plasmi— det. Ca. 17,5 kd (ved SDS-PAGE). 1,6 x 106 GIF enhe- der/ml kultur.

5 (14) Plasmid ptrpGIF-e-71S anvendtes i stedet for plasmid ptrpGIF-a-71S ved fremgangsmåden (12) til opnåelse af et ca. 4,6-kbp DNA-fragment ud fra plasmidet. Plas-midet ptrpGIF-a-8A7 IV til ekspression af polypeptid 10 XXXVIII opnåedes på samme måde ved anvendelse af fragmentet .

Polypeptid XXXVIII, et IL-1β-derivat ifølge opfindelsen opnåedes på samme måde ved anvendelse af dette plasmid. Ca. 17,5 kd (ved SDS-PAGE). 2,1 x 106 15 GIF-eriheder/ml kultur.

(15) Po lypeptiderne II til VIII og XXXI til XXXIV, IL-iø-derivater ifølge opfindelsen, fremstilledes ved anvendelse af henholdsvis transformanterne ifølge eksem- 20 pierne 1-(1) til (7) og eksempel 3-(6) til (9), der gives i det følgende, ved fremgangsmåden (1).

Disse produkter vandrede som et enkelt bånd ved SDS-PAGE. Polypeptiderne II til VIII vandrede til de samme positioner som tidligere nævnt, mens polypeptider-25 ne XXXI til XXXIV gav de følgende resultater.

Polypeptid XXXI ca. 22 kd

Polypeptid XXXII ca. 23 kd

Polypeptid XXXIII ca. 27 kd 30 Polypeptid XXXIV ca. 31 kd

Eksempel 3 (1) Inkubation af U937-celler.

Humane histiocytiskelymphoma-U937-celler (Ascen-35 so, J. L. et al., Blood, Vol. 57, side 170 (1981)), i et antal på 1,4 x 109 anbragtes i RPMI-1640 kulturmedium 69 DK 171648 B1 indeholdende 25 ng/ml 12-o-tetradecanoylphorbol-13— acetat (TPA, produkt fra Pharmacia), 10 pg/ml concanava— lin A (ConA, produkt fra Sigma) og 10% PCS til fremstilling af en cellesuspension med en koncentration på 4 x 5 10^ celler/ml.

Ti-ml’s portioner af cellesuspensionen anbragtes separat i skåle (Falcon 3003) med en diameter på 9 cm og inkuberedes i 5% carbondioxidgas ved 37°C i 3 dage. Efter fjernelse af kultursupernatanten ved sugning, an-10 bragtes 10 ml RPMI-1640 medium indeholdende 10 ug/ml bakterielt lipopolysaccharid (LPS, produkt fra Difco), 1 yg/ml muramyldipeptid (MDP, produkt fra Wako Junyaku Co., Ltd.) og 1 ng/ml TPA i hver skål. Cellerne blev inkuberet i dette medium i 5% carbondioxidgas i 37°C i 18 15 timer. U937-cellerne, der hæftede til bunden af skålen anvendtes til fremstilling af mRNA.

(2) Fremstilling af mRNA.

RNA blev udtaget ved en kombination af guanidi— 20 nium/varm phenolmetoden (Feramisco, J. R. et al., J.

Bio. Chem., Vol. 257, 11024 (1982)) og guanidinium/cae-siumchloridmetoden (Glisin, V, et al., Biochemistry,

Vol. 13, 2633 (1974)).

Til vaskning af U937 cellerne inkuberet ved frem-25 gangsmåden (1) blev skålene skyllet med 5 ml PBS(-) opløsning efter fjernelse af supernatanten. Cellerne opløstes dernæst med 1 ml 4 M guanidinisothiocyanatopløsning (4 M guanidinisothiocyanat (produkt fra Fluka), 50 mM

tris-HCl (pH 7,6), 10 mM EDTA og 2% natriumlauroylsarko-30 sinat) anbragtes i hver skål. Opløsningen qpsamledes med "gummipolisher" og Pasteurpipette til opnåelse af 420 ml celleopløsning, som holdtes ved 60°C og ledtes gennem en 18G injektionsnål til ituskæring af kromosom— DNAet ved forskydningskræfter. Dernæst sattes phenol op— 35 varmet til 60°C til opløsningen i en mængde, der var lige så stor som mængden af opløsningen, og blandingen om- 70 DK 171648 B1 rørtes med 18G-injektionsnål til yderligere ituskæring med forskydningskræfter. Dernæst tilsattes 210 ml 0,1 M natriumacetat-10 mM tris-HCl (pH 7,4)-1 mM EDTA-opløsning og 420 ml chloroform-isoamylalkoholblanding 5 (volumenforhold 24:1) til blandingen. Den resulterende blanding omrørtes kraftigt ved 60°C i 15 minutter, afkøledes dernæst med is og centrifugeredes ved 3000 omdr./min. ved 4°C i 20 minutter. Til det opsamlede vandige lag sattes ethanol i en mængde, der var 2 gange 10 mængden af det vandige lag. Man lod blandingen henstå natten over ved -70°C til opnåelse af råt RNA-precipi-tat. Det rå RNA opløstes i 48 ml 6M guanidinisothiocya-nat-5 mM natriumcitrat (pH 7,0)-0,1 M β-mercaptoethanol-0,5% natriumlauroylsarkosinatopløsning. Dernæst opløstes 15 19,2 g caesiumchlorid i opløsningen. Portioner af 7 ml af den resulterende opløsning anbragtes dernæst ovenpå 4 ml 5,7 M caesiumchlorid-0,1 M EDTA (pH 7,5). Blandingen centrifugeredes ved 31500 omdr./min. ved 25°C i 20 timer med Beckman SW40Ti-rotor til opsamling af RNA.

20 Således opnåedes 9,7 mg RNA.

Til opnåelse af mRNA ud fra RNAet, underkastedes RNAet kolonnechromatografi ved anvendelse af oligo (dT)-cellulose (produkt fra Collaborative Research Inc.). Til adsorption anvendtes 10 mM tris-HCl (pH 7,5)-0,5 M 25 NaCl-1 mM EDTA. Til eluering anvendtes 10 mM tris-HCl (pH 7,5)-1 mM EDTA.

Herved opnåedes 400 yg mRNA.

(3) Fremstilling af cDNA-bibliotek.

30 cDNA-bibliotek blev fremstillet ved Okayama-Berg- metoden, ved hvilken cDNA kan ekprimeres i dyreceller. dT-halevedhæftet vektorprimer til anvendelse ved cDNA-kloning blev således fremstillet ud fra pcDVl og dG-halevedhæftet linker-DNA ud fra plasmid pLl, begge ved 35 fremgangsmåden ifølge Okayama et al. (Okayama, H og P. Berg, Molecular og Cellular Biology, Vol. 3, side 280 (1983)).

71 DK 171648 B1 mRNA (15 yg) opnået ved fremgangsmåden (2) opløstes i 20 yl vandig 5 mM tris-HCl (pH 7,5)-0,5 mM EDTA (pH 7,5)-opløsning og inkuberedes ved 65°C i 5 minutter og derefter ved 37°C i 5 minutter. Reaktionsblandingen 5 blev justeret til en total mængde på 40 yl indeholdende 50 mM tris-HCl (pH 8,3), 8 mM MgCl2, 30 mM KC1, 0,3 mM dithiothreitol, 2 mM af hver af dATP, dGTP, dCTP og dTTP, 2,8 yg vektorprimer-DNA, 60 enheder RNase-inhibi-tor (produkt fra Promega Biotech) og 40 enheder omvendt 10 transferase (produkt fra Bio-Lad), hvorefter den blev inkuberet ved 37°C i 1 time. Reaktionen blev afsluttet ved tilsætning af 2 yl 0,5 M EDTA (pH 7,5) og 2 yl'10% SDS. Dernæst underkastedes blandingen phenol-chloro-formekstraktion og chloroformekstraktion, og ekstraktet 15 blev fældet fra ethanol til opsamling af vektor primer-cDNA:mRNA.

Det opsamlede vektor primer cDNArmRNA blev inkuberet ved 37°C i 5 minutter i 30 yl af en reaktionsblanding bestående af 140 mM natriumcacodylat, 30 mM tris-20 HC1 (pH 6,8), 1 mM CaCl2» 0,1 mM dithiothreitol, 0,3 yg poly A, 66 yM dCTP og 38 enheder terminal deoxynucleoti-dyltransferase (produkt fra Pharmacia), hvorefter 1,5 yl 0,5 M EDTA (pH 7,5) og 1,5 yl 10% SDS sattes til blandingen til afslutning af reaktionen. Blandingen underka-25 stedes phenol-chloroformekstraktion og chloroformeks-traktion, og ekstraktet blev fældet fra ethanol til opsamling af oligo dC-halevedhæftet cDNA:mRNA-vektor primer.

Den opsamlede nucleinsyre blev inkuberet ved 37°C 30 i 90 min. i 20 yl af en reaktionsblanding omfattende 7 mM tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl2> 60 mM NaCl, 100 yg/ml bovint serumalbumin og 12 enheder af restriktionsenzymet Hindlll (produkt fra Nippon Gene Col, Ltd.). Dernæst sattes 1 yl 0,5 M EDTA (pH 7,5) og 1 yl 10% SDS til 35 blandingen til afslutning af reaktionen, hvorefter der udførtes ekstraktion med phenol-chloroform og derefter 72 DK 171648 B1 roed chloroform og fældning fra ethanol til opsamling af Hindlll-sønderdelt, oligo dC-halevedhæftet cDNAsmRNA-vektor primer. Produktet opløstes i 10 yl 10 mM tris-HCl (pH 7,5)-1 mM EDTA (pH 7,5) (TE (pH 7,5)). Portioner af 5 opløsningen på en yl blev inkuberet i 10 yl af en reaktionsblanding indeholdende det ovennævnte TE (pH 7,5), 0,1 M NaCl og oligo dC-halevedhæftet linker-DNA (14 ng), ved 65°c i 2 minutter og derefter ved 42°C i 30 minut ter. Blandingen blev derefter afkølet til 0°C.

10 Reaktionsblandingens volumen blev justeret til 100 yl indeholdende 20 mM tris-HCl (pH 7,5), 4 nM MgCl2» 10 mM (NH4)2S04, 0,1 M KCl, 50 yg/ml bovint serumalbum— in, 0,1 mM β-NAD (nikotinamidadenindinucleotid, produkt fra Pharmacia) og 0,6 yg E. coli-DNA-ligase (produkt fra 15 Pharmacia) og inkuberet natten over ved 12°C. Til reak— tionsblandingen sattes 40 yM af hver af dATP, dGTP, dCTP og dTTP og 0,15 mM ø-NAD. Endvidere blev blandingen inkuberet ved 12°C i 1 time, og derefter ved 25°C i 1 time med tilsætning af 0,4 yg E. coli-DNA-ligase, 4,6 enheder 20 E. coli-DNA-polymerase I (produkt fra Boehringer Mannheim) og 1 enhed E. coli-RNase H (produkt fra Pharmacia) .

E. coli HB101 blev transformeret ved anvendelse af den således opnåede reaktionsblanding. De kompetente 25 celler af den anvendte stamme var et produkt fra Bethes-da Research Laboratories (BRL). Cellerne blev transformeret i overensstemmelse med BRL1s manual.

Herved opnåedes et cDNA-bibliotek, der indeholdt ca. 21000 kloner.

30 (4) Transfektion af abe Cos-l-celler.

cDNA-biblioteket opnået ved den foranstående fremgangsmåde (3) inddeltes i grupper, der hver i gennemsnit indeholdt ca. 70 kloner. Plasmid-DNA blev frem— 35 stillet fra hver gruppe.

Plasmid-DNAet blev fremstillet ved den alkaliske lysemetode (Molecular Cloning-A Laboratory Manual,'Cold

Spring Harbor Laboratory, 1982, s. 368).

73 DK 171648 B1

Inkuberede abeceller, COS-l-celler (Gluzman, Y., Cell, Vol. 23, s. 175 (1981)), blev inficeret med det således ud fra hver gruppe fremstillede plasmid-DNA til transfektion. Transfektionen udførtes ved DEAE-dextran-5 metoden (Yokota, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A., Vol. 81, s. 1070 (1984)). Mere specifikt blev COS-l-cellerne, der var behandlet med trypsin, suspenderet i RPMI-1640-medium indeholdende 10% FCS, og deres koncentration blev justeret til 1 x 10^ cel ler/ml. Der-10 næst blev portioner af 500 yl af suspensionen anbragt i 6 brønde i en plade, hvilke brønde hver indeholdt 2 ml RPMI-1640-medium indeholdende 10% FCS. Efter inkubation af cellerne ved 37°C natten over, fjernedes supernatanten, cellerne blev vasket med et medium, der var frit 15 for serum og 1 ml RPMI-1640-medium indeholdende 10 ug/ml plasmid-DNA, 0,4 mg/ml DEAE-dextran (produkt fra Pharmacia), 50 mM tris-HCl (pH 7,4) og 10% FCS blev placeret i hver brønd, hvorefter der blev inkuberet ved 37°C i 4,5 timer. Dernæst fjernedes supernatanten, cellerne vaske-20 des med et medium, der var frit for serum, og 2 ml RPMI-1640-medium indeholdende 150 yM chloroquin (produkt fra Sigma Chemical Co.) og 10% FCS anbragtes i hver brønd, hvorefter der inkuberedes ved 37°C i tre timer. Supernatanten fjernedes, og cellerne vaskedes med et me-25 dium, der var frit for serum, og inkuberedes derefter ved 37°C i 72 timer med tilsætning af 3 ml RPMI-1640 medium indeholdende 10% FCS til cellerne i hver brønd. Efter opsamling af supernatanten anbragtes 2 ml RPMI-1640-xnedium indeholdende 10% FCS i hver brønd, hvorefter der 30 gennemførtes to cycler af frysning og optøning. Dernæst opsamledes celleekstraktet. Kultursupernatanten og cel-leekstraktet undersøgtes for GIF-aktivitet.

Gruppen, der udviste GIF-aktivitet, inddeltes i 24 grupper af hver 10 kloner, og den samme fremgangsmåde 35 som ovenfor blev gentaget ved anvendelse af disse grupper til bestemmelse af GIF-aktivitet. Den samme frem- 74 DK 171648 B1 gangsmåde som ovenfor blev gentaget for klonerne indenfor gruppen, der udviste GIF-aktivitet, til identifikation af de kloner, der udviste GIF-aktivitet.

Følgelig opnåedes 2 slags kloner, dvs. pcD-GIF-16 5 og pcD-GIF-207.

I tabel 4 vises GIF-aktiviteten (GIF-enheder/ml) for disse kloner.

Tabel 4 10

Kloner Kultursupernatant Celleekstrakt pcD-GIF-16 48,3 120,7 pcD-GIF-207 62,6 196,9 pcDVl (kontrol) 0 0 15 (5) Analyse af kloner.

Til undersøgelse af, om de GIF-aktive materialer opnået ud fra disse to kloner var identiske, sattes serievist fortyndet antiserum til neutralisation af GIF— 20 aktivitet af polypeptid I til hver af kultursupernatanterne og celleekstrakterne af pcD-GIF-16 eller pcD-GIF-207, som udviste klar GIF-aktivitet, hvorved indflydelsen af antiserumet på supernatanten og celleekstraktet bestemtes.

25 Resultaterne er vist i fig. 3-a (pcD-GIF-16- kultursupernatant), fig. 3-b (pcD-GIF-16-celleekstrakt), fig. 3-c (pcD-GIF-207-kultursupernatant) og fig. 3-d (pcD-GIF-207 celleekstrakt). I hver af disse figurer er serumfortyndingsforholdet (antal gange) afbildet som ab-30 scisse versus GIF-aktiviteten (%) som ordinat, og (1) repræsenterer anti-polypeptid I-serum og (2) repræsenterer normal serum.

Som vist i figur 3-a og 3-b neutraliseredes GIF-aktiviteten opnået ud fra pcD-GIF-16 fuldstændig ved 35 koncentrationsafhængig tilsætning af antipolypeptid I-serum, mens figur 3-c og 3-d viser, at GIF-aktiviteten 75 DK 171648 B1 opnået ud fra pcD-GIF-207 var fuldstændigt upåvirket af anti-polypeptid I-serumet. Dette viser, at det GIF-akti-ve materiale fra pcD-GIF-207 adskiller sig immunologisk fra polypeptid I og det GIF-aktive materiale opnået ud 5 fra pcD-GIF-16.

Figur 4 viser et cDNA-restriktionsenzymkort for plasmid pcD-GIF-16 og for plasmid pcD-GIF-207. cDNA-basesekvensen af disse plasmider bestemtes ved den basespecifikke kemiske modifikationsmetode (Methods in Enxy-10 mology, Vol, 65, s 499 (1980)) og ved dideoxykædetermi-nering (Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., Vol. 74, s 5463 (1977)) ved anvendelse af phag M13-vektor (Gene, Vol, 19, s 269 (1982)).

Resultaterne viste, at cDNAet i pcD-GIF-16 var 15 identisk med cDNA-sekvensen i den kodende region af IL-lg, som bestemt af March et al., og at cDNAet i pcD-GIF-207 var identisk med cDNA-sekvensen i den kodende region af IL-Ια (Carl J. March et al.. Nature,

Vol, 315, s 641 (1985)).

20 (6) Fremstilling af polypeptid XXXIV.

cDNA-klonen pcD-GIF-16 af IL-18, der var næsten af fuld længde og opnået ved fremgangsmåden (5), blev skåret over med restriktionsenzymet PvuII, og derefter 25 delvist skåret over med restriktionsenzymet Ncol og udsat for elektroforese på agarosegel til isolation og rensning af et 380-bp Ncol-PvulI-DNA-fragment.

Man lod Mungbønnenuclease virke på DNA-fragmen-tet, hvorved den cohesive ende, der var dannet ved over-30 skæring med restriktionsenzymet Ncol, blev gjort glat.

Dernæst blev 5'-terminalerne af de syntetiske oligonucleotider (5'-GATAATG-31 og 5'-CATTAT-31) phosphoryleret med T4 polynucleotidkinase og ligeret med DNA-fragmentet med T4DNA-ligase. Den ligerede blok blev 35 skåret over med restriktionsenzymerne Clal og HindiII og dernæst underkastet elektroforese på agarosegel til qp- 76 DK 171648 B1 nåelse af et isoleret og renset ca. 400-bp Clal-Hindlll-DNA-fragment A.

På den anden side blev det tidligere fremstillede ekspressionsplasmid ptrpGIF-α skåret over med restrik-5 tionsenzymerne Clal og Hindlll. DNA-fragment B, der var større, blev isoleret og renset ved agarosegelelektrofo-rese.

Fragmenterne A og B blev ligeret med T4DNA-liga-se, og den ligerede blok blev transformeret ind i E.

10 coli HB101.

De resulterende transformanters plasmid-DNA blev udtaget, og kortlægningen af overskæring med restriktionsenzymer analyseredes til udvælgelse af den Ønskede transformant.

15 Den således isolerede, ønskede transformant (E.

coli HB101/ptrGIF-a-V) inkuberedes natten over under omrystning ved 37 °C i 10 ml LB-medium indeholdende 50 yg/ml L-tryptophan. 50 ml M9 minimummedium indeholdende 50 yg/ml ampicillin og 1% af Casaminosyre inokuleredes 20 med 1 ml af kulturen, hvorefter der inkuberedes ved 37°C under omrystning. Da kulturens absorbans nåede ca. 1,0 ved 550 nm, blev cellerne opsamlet og suspenderet i 5 ml 15% sucrose-50 mM tris-HCl-50 mM EDTA (pH 8,0). 500 yl af en opløsning af 10 mg/ml lysozym (opløst i 10 mM 25 tris-HCl (pH 8,0)) og 5 ml 0,3% Triton XI00-187,5 mM EDTA (pH 7,0)-150 mM tris-HCl (pH 8,0) opløsning sattes til suspensionen. Man lod blandingen henstå ved stuetemperatur i 15 minutter og behandlede dernæst med ultralyd og centrifugerede til opnåelse af en celleekstraktsuper-30 natant.

Supernatantens GIF-aktivitet fandtes at være 112 enheder/ml kultur.

77 DK 171648 B1 (7) Fremstilling af polypeptid XXXII.

Det tidligere opnåede plasmid pGIF-o blev skåret over med restriktionsenzymerne Ncol og Accl og underkastet elektroforese på agarosegel til isolation og rens-5 ning af et ca. 0,7-kb Ncol-Accl, DNA-fragment, der blev behandlet med DNA-polymerase I (Klenow fragment) for at gøre dets modsatte ender glatte. På den anden side blev plasmid pTMI skåret over med restriktionsenzymet Hindlll og behandlet med DNA-polymerase I (Klenow fragment) for 10 at gøre de udskårne ender glatte.

De to DNA-fragmenter blev ligeret med T4DNA-liga-se, og den ligerede blok blev transformeret ind i E. coli HB101. Plasmid-DNA blev udtaget fra transformanterne ved kogemetoden. Den ønskede transformant udvalgtes 15 ud fra ekstraktets restriktionsenzymkort.

Den således isolerede transformant (E. coli HB10l/ptrpGIF-o-III) inkuberedes på samme måde som E. coli HBlOl/ptrpGIF-a-V ved den foranstående fremgangsmåde (6) til opnåelse af en celleekstraktsupernatant.

20 Denne supernatants GIF-aktivitet var 190 enheder/ml kultur.

(8) Fremstilling af polypeptid XXXIII.

Plasmidet til ekspression af dette polypeptid 25 fremstilledes ved fjernelse af unødvendige dele af basesekvensen ved stedspecifik mutagenese, som beskrevet i detaljer i det følgende.

pGIF-α blev skåret over med restriktionsenzymerne PstI og Accl og derefter underkastet elektroforese på 30 agarosegel til isolation og rensning af ca. 0,9-kb Pstl-AccI-DNA-fragment, som behandledes med T4 DNA-polymerase for at gøre dets modsatte ender glatte.

Ved anvendelse af T4 DNA-ligase blev dette fragment ligeret til et DNA-fragment, der var fremstillet 35 separat ud fra plasmid pTMI ved overskæring med restriktionsenzymet HindiII og behandling med DNA-polymerase 78 DK 171648 B1 (Klenow fragment) til opnåelse af en glatskåret ende.

Den ligerede blok blev transformeret ind i E. coli HB101. Den ønskede transformant udvalgtes ud fra restriktionsenzymkortet for plasmid-DNA-ekstraktet ved ko-5 gemetoden. DNA-basesekvensen af det opnåede plasmid identificeredes også. Dette plasmid vil i det følgende blive betegnet "pTMl-I-2".

Dernæst blev plasmid pTMl-I-2 skåret over med restriktionsenzymerne EcoRI og Hindu I og underkastet 10 elektroforese på agarosegel til isolation og rensning af et ca. 740-bp EcoRI-Hindlll DNA-fragment, som dernæst blev ligeret til EcoRI- og HindiII-restriktionsenzymstederne af M13mpll-fag (RF) ved anvendelse af T4DNA-ligase. Enkelt-strenget DNA (mpll-trp-I-2(E/M)) opnåedes 15 ud fra produktet til anvendelse som templat for metage-nese.

Det syntetiske oligonucleotid (5'-CACGTAAAAAGGGTATCGATAATGAAGTGCTCCT-3 * (primer)) pho-sphoryleredes med T4 polynucleotidkinase og hybridisere-20 des med ss mpll-trp-I-2(E/M). Hybridet blev annealed, behandlet med DNA polymerase I (Klenow-fragment) og med T4DNA-ligase i tilstedeværelse af dNTP'er og inkuberet ved 15°C i 2 dage.

Det opnåede DNA blev transformeret ind i kornpe-25 tente JM105 celler og en agarplade blev inokuleret med 200 af de resulterende kolonier, hvorefter der blev inkuberet ved 37°C i 18 timer. Et filter indeholdende de dyrkede kolonier behandledes med en base på sædvanlig måde til denaturering, tørredes og opvarmedes til 80°C i 30 2 timer. Filteret blev hybrid!seret og hybridiseret videre ved stuetemperatur med 32p-probe, fremstillet ved mærkning af primeren med 32ρ-ύ-ατρ ved dets 5'-ende. Det resulterende filter blev vasket med 6 x SSC-puffer ved stuetemperatur i 10 minutter og dermed med 0,25 x SSC-35 puffer ved 60°C i 5 minutter, hvorefter det blev tørret og underkastet autoradiografi ved -70°C i 18 timer.

79 DK 171648 B1 mpll-trp GIF-a-IV(E/M) Udvalgtes blandt mutantklonerne som et typisk eksempel, inficeredes med JM105 og inkuberedes til fremstilling af ss DNA og RF DNA.

Det resulterende DNAs M13-dideoxykædetermine-5 ringssekvens viste, at det Ønskede gen var udeladt.

Endvidere isoleredes et ca. 630-bp EcoRI-Hindlll-DNA-fragment fra det resulterende RF DNA, og dette blev renset ved agarosegelelektroforese.

På den anden side isoleredes og rensedes et ca.

10 4,2-kb EcoRI-HindIII-DNA-fragment på lignende måde fra plasmid pTMl-I-2, og dette blev ligeret med det ovennævnte fragment, dvs. et ca. 630-bp EcoRI-HindllI—DNA— fragment, ved anvendelse af T4DNA-ligase. De ligerede blokke blev transformeret ind i E. coli HB101.

15 Den ønskede transformant udvalgtes ud fra re striktionsenzymkortet for plasmider udtaget ved kogemetoden fra de opnåede transformanter.

Den således isolerede transformant (E. coli HB10l/ptrpGIF-a-IV) blev inkuberet på samme made som E.

20 coli HB10l/ptrpGIF-a-V ved fremgangsmåden (6) til opnåelse af en celleekstraktsupernatant, som fandtes at have en GIF-aktivitet på 336 enheder/ml kultur.

(9) Fremstilling af polypeptid XXXXI.

25 På samme måde som ved fremgangsmåden (8) frem stilledes en transformant indeholdende plasmid ptrpGIF— α-II til ekspression af det ønskede polypeptid.

Det anvendte templat var det samme som ss DNAmpll-trp-I-2(E/M) anvendt i det foregående. Den an-30 vendte primer var det syntetiske oligonucleotid (5'-CACGTAAAAAGGGTATCGATAATGCTGGTTCCCT-3').

Den plasmidholdige transformant (E. coli HB10l/ptrpGIF-a-II) blev ligeledes inkuberet til opnåelse af en celleekstraktsupernatant, som fandtes at have 35 en GIF-aktivitet på 112 enheder/ml kultur.

Skønt GIF-aktiviteten af IL-IS (polypeptid I) ifølge opfindelsen og derivaterne deraf ifølge opfindelsen er beskrevet, udførtes de følgende tests.

80 DK 171648 B1

Tabel 5 viser LAF-aktiviteten (U) pr. mg polypeptid, beregnet som protein, af polypeptid I, bestemt ved RIF-motoden ved anvendelse af det tidligere nævnte antiserum mod polypeptid I.

5

Tabel 5 _Polypeptid_ _LAF-aktivitet (U/mq)_

Polypeptid I 4, 5 x 10® 10 Polypeptid II 1,6 x 10®

Polypeptid III 6,2 x 10®

Polypeptid IV 2,6 x 10®

Polypeptid V 2,1 x 10®

Polypeptid VI 1,3 x 107 15 Polypeptid VII 8,0 x 103

Farmakologisk testeksempel 1

Testning af polypeptid I for evne til at fremkalde CSF-dannelse.

20 (1) Test af inducerende virkning på humane lungecellers CSF-dannelse.

Den følgende test udførtes ved anvendelse af humane embryoniske lungefibroblaster (HFL-1, ATCC regist-25 reret cellestamme nr. CLL-153), som danner CSF.

HFL-l-celler blev suspenderet i Ham's F-12K-kul-tur(Ham, R.G., Proc. Natl. Acad. Sci., 53, 288 (1965) indeholdende 10% FCS til en koncentration på 2 x 10® celler/ml.

30 Polypeptid I opnået i referenceeksemplet sattes til portioner af cellesuspensionen i varierende koncentrationer. Hver af blandingerne blev inkuberet i en carbondioxidgasinkubator ved 37°C i 24, 48 eller 72 timer. Kultursupernatanten opsamledes, og mængden af 35 dannet og akkumuleret CSF i supernatanten måltes ved anvendelse af musebenmarvceller (Lewis, I.C. et al, J. Immunol., 128, 168 (1982)).

81 DK 171648 B1

Figur 5 viser resultaterne opnået med polypeptid I ved forskellige inkubationstider. I diagrammet er koncentrationen (GIF-enheder/ml) af polypeptid I afbildet som abscisse versus CSF-aktiviteten (eriheder/ml) som or-5 dinat.

De opnåede resultater viser, at tilsætningen af polypeptid I Øger mængden af CSF dannet af HFl-l-celle-stamme til så meget som hundrede gange den mængde, der dannes uden tilstedeværelse af polypeptidet.

10 (2) Test af polypeptid I's inducerende virkning på CSF-dannelse ved hjælp af celler opnået ud fra human hud.

Den følgende test udførtes ved anvendelse af cel-15 lestamme CRT-1445 (ATCC nr.), opnået ud fra normal human hud. Celler fra den ovennævnte stamme suspenderedes i Dulbeco MEM-kulturmedium (Dulbeco, R. og Freeman, G., Virology, 8, 396 (1959)) indeholdende 10% FCS til en koncentration af 2 x 105 celler/ml.

20 Polypeptid I opnået i referenceeksemplet angivet tidligere sattes til portioner af cellesuspensionen i varierende koncentrationer. Hver af blandingerne blev inkuberet i en carbondioxidgasinkubator ved 37°C i 24, 48 eller 72 timer. Kultursupernatanten opsamledes, og 25 mængden af dannet og akkumuleret CSF i supernatanten måltes ved anvendelse af musebenmarvsceller, som i testen (1).

Fig. 6 viser ligesom fig. 5 de opnåede resultater.

30 Fig. 6 viser, at tilsætningen af polypeptid i en mængde på mindst 1 enhed/ml, beregnet som GIF-aktivitet, til fibroblaster opnået ud fra den normale humane hud bibringer cellerne en bemærkelsesværdigt forøget evne til at danne CSF.

DK 171648 Bl 82 (3) Test af inducerende virkning på CSF-dannelse in vivo.

Følgende dyreforsøg udførtes til godtgørelse af, at polypeptid I, når det administreres til dyret, virker 5 inducerende på CSF-dannelsen ΰι vivo.

Normale mus (BALB/C-stamme, fremskaffet fra

Experimental Animal Cooperative Association of Shizuoka Prefecture, Japan) fik indgivet polypeptid I, opnået i referenceeksempel 2, intravenøst i varierende mængde 10 (1θ3 til 105 enheder/dyr beregnet som GIF-aktivitet).

Blod opsamledes fra dyrene 2, 4, 8, 12 og 24 timer efter administreringen og undersøgtes for koncentrationen af CSF i serumet ved anvendelse af musebenmarvsceller.

Resultaterne er givet i fig. 7, hvori tiden 15 (timer) efter administreringen er afbildet som abscisse versus CSF-aktiviteten (enheder/ml serum) som ordinat. I diagrammet repræsenterer (1) en gruppe, til hvilken po-lypeptid I blev givet i en dosis på 100.000 GIF-erihe— der/dyr, (2) repræsenterer en gruppe med en dosis på 20 10.000 GIF-enheder/dyr, (3) repræsenterer en gruppe med en dosis på 1.000 GIF-enheder/dyr, og (4) repræsenterer en kontrolgruppe, til hvilken HSA blev givet i en dosis på 10 yg/dyr.

Fig. 7 viser, at polypeptid I, når det gives til 25 dyr, øger serumets CSF-koncentration bemærkelsesværdigt hurtigt hos dyret. Det ses, at polypeptid I fremmer CSF-dannelsen jLn vivo meget i forhold til dosen.

Farmakologiske testeksempel 2 30 Rotter med adjuvans-arthritis blev fremstillet ved fremgangsmåden ifølge Pearson (Pearson, C. M., Proc.

Soc. Exp. Biol. Med., 91, 95 (1956)), Ward og Jones (Ward, J. R. og Jones, R. S., Arthritis Rheumatism, 5, 557 (1962)). Mere specifikt blev 0,05 ml adjuvans frem-35 stillet ved suspension af døde Mycobacterium butyricum-celler i flydende paraffin, injiceret intracutant til DK 171648 Bl 83 roddelen af halen af hver af hanlige rotter af S.D.-stammen. Pa 14. dagen blev dyrene inddelt (n=6) efter hvilken grad af hævelse deres fødder havde. I løbet af de næste 5 dage blev polypeptid I opnået i referenceek-5 semplet eller opløsningsmidlet derfor (saltvand for kontrolgruppen) givet intracutant til dyrene. Fodens volumen blev målt fra dag til dag til bedømmelse af polypep-tidets indflydelse på arthritis.

Resultaterne er vist i fig. 8, i hvilken antallet 10 af dage efter administreringen af adjuvanset er afbildet som abscisse versus fodvolumenet (x 0,01 ml) som ordinat. I diagrammet er en gruppe, som fik indgivet poly-peptid I i en dosis på 100.000 GIF-enheder/dyr repræsenteret ved (1), en gruppe med en dosis på 10.000 GIF-en-15 heder ved (2), en gruppe med en dosis på 1.000 GIF-enheder/dyr ved (3), en gruppe med en dosis på 100 GIF-enheder/dyr ved (4), kontrolgruppen med saltopløsning ved (5) og en gruppe normale rotter ved (6).

Fig. 8 viser, at hævelsen af foden blev forværret 20 indtil 23. dagen i kontrolgruppen (5), og at plypeptid I viste sig at udvise en inhiberende virkning på hævelsen i grupperne (1) til (4), som fik indgivet polypeptidet, på 4. dagen (efter administreringen, dvs. 18. dagen efter administreringen af adjuvanset) og under den følgen-25 de periode. 4 dage efter administreringen af den sidste dosis (dvs. på 23. dagen efter administreringen af adjuvanset), viste polypeptidet sig stadigt at være effektivt til hindring af arthritis fremadskriden.

30 Farmakologisk testeksempel 3

Testning af derivaterne ifølge opfindelsen for virkning til inducering af CSF-dannelse.

Den følgende test udførtes ved anvendelse af cellestamme U-373MG (ATCC HTB17, glioblastoma, astrocytoma, 35 human).

Cellerne af den ovennævnte stamme suspenderedes i Eagles MEM-medium (produkt fra Nissui Pharmaceutical 84 DK 171648 B1

Co.) indeholdende 10% FCS (produkt fra GIBCO), MEM ikke-essentielle aminosyrer (produkt fra Flow) og MEM natri-umpyruvat (produkt fra Flow) til en koncentration på 2 x 1θ5 celler/ml. Materialet, der skulle testes, tilsattes 5 i varierende koncentrationer til portioner af suspensionen. Hver af blandingerne inkuberedes i en carbondioxi-dinkubator ved 37°C i 24 timer.

Kultursupernatanten opsamledes og mængden af dannet og akkumuleret CSF i supernatanten måltes ved anven-10 delse af musebenmarvsceller (Lewis, I. C. et al., J. Immunol, 128, 168 (1982)).

Resultaterne er givet i fig. 9, i hvilken koncentrationen (ng/ml) af testmaterialet er afbildet som abscisse versus CSF-aktiviteten (U/ml) som ordinat.

15 Kurverne (1) til (7) i figuren angiver resultaterne opnået med de følgende polypeptider som testmaterialer.

Kurverne (1): polypeptid VI

Kurverne (2): polypeptid II

20 Kurverne (3): polypeptid VIII

Kurverne (4)s polypeptid V

Kurverne (5): polypeptid IV

Kurverne (6): polypeptid III

Kurverne (7) polypeptid XXX

25

Farmakologisk testeksempel 4

Testning af derivater ifølge opfindelsen for an-tiinflammatorisk virkning.

Den følgende test udførtes ved fremgangsmåden 30 ifølge Winter et al. (Proc. Soc. Exptl. Biol. Med., 111, 544-547 (1962)).

Seks til otte uger gamle hanrotter (Spraque Daw-leystamme, Nippong Charles River Co., Ltd.) inddelt i grupper med hver 6 til 8 rotter efter kropsvsgt en dag 35 inden forsøget, anvendtes. En suspension af 1% Carrageenan (produkt fra Marine Colloid) i saltopløsning, virke- 85 DK 171648 B1 de som middel til fremkaldelse af inflammation og injiceredes subcutant i en mængde på 0,1 ml i fodsålen på rottens højre bagben til fremkaldelse af hævelse af foden. Til bedømmelse af hævelsen blev volumenet af fo-5 den målt et forudbestemt tidsrum før og efter injektionen ved anvendelse af et plethysmometer (produkt fra Ugo-Vasile). Forholdet mellem det øgede volumen på grund af injektionen og volumenet inden injektionen beregnedes som hævelsen i %.

10 Materialet, der skulle testes, opløstes i

Dulbeco's phosphatpuffersaltopløsing, og 0,1 ml af opløsningen blev injiceret subcutant i ryggen af rotten 1 time inden injektionen af det inflammationsfremkaldende middel. Man gav opløsningsmiddel til en kontrolgruppe.

15 Resultaterne er vist i fig. 10, hvori tiden (timer), der er forløbet efter injektionen af det inflammationsfremkaldende middel er afbildet som abscisse versus hævelsen i % som ordinat. I figuren er kontrolgruppen repræsenteret ved kurven (I), en gruppe til 20 hvilken 0,1 ug polypeptid VI blev indgivet ved kurven (2), en gruppe med 1 yg polypeptid VI ved kurve (3) og en gruppe med 10 yg polypeptid VI ved kurve (4).

Farmakologisk testeksempel 5 25 Testning af derivat ifølge opfindelsen for virk ning til forebyggelse af stråleskade.

1 yg eller 0,3 yg polypeptid VI blev indgivet in-traperitonealt til hver af 9-uger-gamle mus af BALB/c-stammen 20 timer inden musene udsattes for en lethal do-30 sis af røntgenstråler.

Musene udsattes systemisk for røntgenstråler i en dosis på 850 røntgen ved hjælp af en røntgenstrålekilde (MBR-1505R, produkt fra Hitachi Medico Co., Ltd.) og undersøgtes derefter dagligt for antal overlevende. Man 35 gav PBS til en kontrolgruppe.

Resultaterne er vist i fig. 11, i hvilken antallet af dage efter bestrålingen er afbildet som abscisse 86 DK 171648 B1 versus overlevelsesforholdet (%) som ordinat. Gruppen, til hvilken man gav 1 yg polypeptid VI er repræsenteret ved kurve (1), gruppen med 0,3 yg polypeptid VI ved kurve (2) og kontrolgruppen ved kurve (3).

5 Fig 11 viser, at alle musene i kontrolgruppen dø de på den 18. dag efter bestråling med røntgenstråler, mens polypeptid VI, afhængigt af dosen, viste sig effektiv til hindring af stråleskade. Det viste sig, at ca.

80% af musene i gruppen med en dosis på 1 yg blev reddet 10 fra døden på grund af stråleskade og overlevede.

Farmakologisk testeksempel 6

Testning af derivat ifølge opfindelsen for virkning til forebyggelse af opportunistisk 15 infektion.

Den følgende test udførtes ved anvendelse af mode lmus .

Den første dag gav man 100 mg/kg 5-fluoruracil (5-Fu, produkt fra Kyowa Hakko Co., Ltd.) intravenøst 20 til 6 uger gamle hanmus af ICR stammen (7 mus i hver gruppe). På 2. , 4. og 6. dagen blev polypeptid VI ifølge opfindelsen administreret subcutant til musene i en dosis på 1 yg/mus. På 7. dagen indgav man en bestemt mængde Pseudomonas aeruginosa E-2 intraperitonalt til 25 musene til inficering. På 10. dagen taltes antallet af overlevende dyr til bestemmelse af overlevelsesforholdet (%).

Resultaterne er givet i fig. 12, (1) til (3).

Fig. 12 (1) viser resultaterne opnået ved den således 30 behandlede gruppe. Fig. 12 (2) viser resultaterne opnået med en kontrolgruppe, til hvilken man ikke gav polypeptid VI (men kun 5-FU). Fig. 12 (3) viser resultaterne opnået med en anden kontrolgruppe, til hvilken man hverken gav 5-Fu eller polypeptid VI.

35 I fig. 12 er overlevelsesforhold (%) afbildet som ordinat versus grupperne A til E, som hver fik indgivet 87 DK 171648 B1 det følgende antal Pseudomonas organismer.

_Gruppe_ Antal celler/mus_ A 19.000 5 B 3.800 C 750 D 150 E 30 P 6 10

Præparateksempel 1

Til en opløsning af 1 x 10? enheder/ml, beregnet som GIF-aktivitet, af polypeptid VI i saltopløsning, sattes humant serum albumin (HSA) til en koncentration 15 på 0,5%. Blandingerne filtreredes (0,22 ym membranfilter) anbragtes i hætteglas, 1 ml i hver, i steril tilstand, og lyofiliseredes til opnåelse af et præparat til injektion.

Præparatet anvendes opløst i 1 ml destilleret 20 vand til injektion.

Fremgangsmåde til fremstilling af cytokiner fra dyreceller 25 (1) HSB-2C5B2 celler (J. Immunol., 131, 1682-1689 (1985)) i en mængde på 2 x 10^ celler/brønd inkuberedes i 24 timer i tilstedeværelse af varierende koncentrationer af polypeptid XXXVII og 0,01% PHA-P. IL-2-aktivi-teten af den opsamlede supernatant måltes ved fremgangs-30 måden ifølge K. A. Smith et al. ved anvendelse af IL-2-afhængige muse-T-celler (CTLL 2) (J. Immunol., 120, 2027 (1978)). Resultaterne vises i tabel 6 nedenfor.

88

Tabel 6 DK 171648 B1

Koncentration af polypeptid XXXVII IL-2 aktivitet (cpm x 10“3) 5 (mg/ml)_ middel (n=5)_ 0 0,2 0,0005 0,3 0,005 1,3 0,05 3,9 10 0,5 3,1 5 4,1 50 4,2 500 4,9 15 (2) Den humane astroglyomacellelinie U373MG dyrkedes til sammenflydning i RPMI-1640-medium suppleret med 10% feutalt kalveserum og inkuberedes derefter videre i frisk RPMI-1640-medium suppleret med 10% feutalt kalveserum og 20 ng/ml af polypeptidet XXXVII. Efter 18 timer blev me-20 diet kasseret, og total RNA blev udvundet ved anvendelse af guanidinium-CsCl-metoden, og poly(A)+ RNA udvalgtes ved oligo-dT-cellulose-chromatografi. 10 pg poly (A)+ RNA blev fraktioneret gennem 1,2% agarosegel ved Northern blotting-metoden og dernæst overført til nitro-25 cellulosefilter. Blottet blev opvarmet til 80°C under reduceret tryk og behandlet i 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) ved 100°C i 5 minutter og dernæst prebybridiseret ved 42°C i 50% formamid - 5 x SSC - 50 mM natriumphosphat (pH 6,5) - 4 x Denhardt's opløsning - 200 pg/ml denatu-30 reret laksesperm-DNA. Efter 5 timer blev det hybridise-ret ved 42°C i 20 timer med Pstl-NcoI-DNA-fragment af cDNA-insert af GM-CSF (Science, 228, 810 (1985)) eller KpnI-BamHI-DNA-fragment af cDNA-insert af BSF-2 (Nature, 324, 73 (1986)), hvilket fragment var radiomærket ved 35 nick-translation. Filtret blev vasket i 2 x SSC - 0,1% SDS ved stuetemperatur i 15 minutter og dernæst vasket i 89 DK 171648 B1 0,1 x SSC-0,1% SDS ved 50°C i 1 time. Autoradiografi udførtes ved -70°C natten over i tilstedeværelse af en forstærkende skærm.

Pig. 13 viser de opnåede resultater, når DNA-5 fragmentet GM-CSF anvendtes. Bane A repræsenterer resultaterne opnået ved anvendelse af det nærværende polypeptid, og bane B viser resultaterne af kontrolforsøg uden det nærværende polypeptid. Fig. 14 viser, som figur 13, resultaterne opnået, når DNA-fragmentet af BSF-2 anvend-10 tes.

Disse resultater viser, at anvendelsen af poly-peptidet ifølge opfindelsen gør det muligt for dyreceller effektivt at danne cytokiner af naturlig type.

Mængden af polypeptidet ifølge opfindelsen, der 15 skal anvendes ved den ovenstående fremgangsmåde, kan være meget lille, sædvanligvis ca. 10 ng/ml, hvorved tilfredsstillende resultater kan opnås, idet anvendelsen af polypeptidet letter rensningen af de opnåede cytokiner.

20 (3) Når cytokiner skal fremstilles ud fra dyreceller, er det afgørende, at det polypeptid ifølge opfindelsen, der anvendes til inducering af produktionen, har stabil struktur under de herskende betingelser, og bindes til IL-l-receptoren på cellernes overflade. Nærmere betegnet 25 kræves det, at polypeptidet ifølge opfindelsen bindes til IL-l-receptoren og overfører det nødvendige signal for cytokinproduktionen til cellen.

Følgelig udførtes den følgende test i forbindelse med bindingen af polypeptidet ifølge opfindelsen til 30 IL-l-receptoren på fibroblaster.

Balb/3T3-celler (klon A31: ATCC, CCL-163, 1 x 106 celler/brønd), der var dyrket næsten ensartet over en 6-brøndes plade, omsattes ved 4°C i 2 timer med 50.000 cpm/brønd af 125-i-mærket polypeptid I (IL-Ιβ) og 20 35 ng/ml polypeptid I forinkuberet ved 37°C i D-MEM suppleret med 10% FCS. Den flydende reaktionsblanding blev 90 DK 171648 B1 fjernet med en Pasteur pipette, cellerne blev vasket forsigtigt med 1 ml D-MEM suppleret med 10% FOS, og su-pernatanten blev kasseret. Efter gentagelse af vaskeproceduren 2 gange, blev cellerne solubiliseret med 1 ml af 5 en blanding af 1 % SDS og 0,2 N NaOH. Radioaktiviteten (bundet radioaktivitet) af den solubiliserede celleopløsning og væsken anvendt til vask af cellerne måltes ved hjælp af en gammatæller.

Det anvendte 125i-mærkede polypeptid I fremstil-10 ledes og rensedes ved fremgangsmåden ifølge Bolton and Hunter (Biochem. J., 133, 529 (1973)). Specifik aktivitet: mindst 250 uCi/yg protein. Resultaterne vises i tabel 7 nedenfor.

15 Tabel 7

Forinkubationstid (timer) Inhiberingsaktivitet (%) 0 100 5 ca. 40 30 ca. 4 20

Inhiberingsaktivitet (%) = A - B x χοο

A - C

hvori A er bundet radioaktivitet uden tilstedeværelse af 25 ikke-mærket polypeptid I.

B er den eksperimentelle værdi for bundet radioaktivitet.

30 C er radioaktivitet, der uspecifikt er absorberet på pladen.

De foranstående indeks udtrykker bindingsaktiviteten af det samtidigt forekommende polypeptid I overfor 35 lL-1-receptor.

Tabel 7 viser at evnen af polypeptid I, dvs. IL-18 selv, til at binde til IL-l-receptoren bliver 91 DK 171648 B1 mindre med tiden under cytokinininduktionsforhold. Følgelig blev den samme testprocedure som i det foregående gentaget ved anvendelse af polypeptid I, VI eller XXXVII, som blev forinkuberet i 24 timer. Tabel 8 neden-5 for viser resultaterne.

Tabel 8

Polypeptid Inhiberingsaktivitet (%) I ca. 4 10 VI ca. 44 XXXVII ca. 87

De ovenfor givne resultater viser, at det er mere hensigtsmæssigt at anvende polypeptiderne ifølge opfin-15 delsen end IL-18 selv til fremstilling af cytokiner ud fra dyreceller.

Claims (12)

1. Polypeptid, kendetegnet ved, at det har en modificeret aminosyresekvens, der opfylder mindst ét af de følgende krav a) til d) i interleukin-1β aminosyresekvens gengivet i formlen (A):

2. Polypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det opfylder mindst én af betingelserne a) til c) eller mindst en af disse betingelser a) til c) sammen med betingelsen d). DK 171648 B1

3. Polypeptid ifølge krav ^kendetegnet ved, at Arg i 4-stillingen mangler eller er erstattet af en anden aminosyre.

4. Polypeptid ifølge krav 1, kendeteg-5 net ved, at Cys i 71-stillingen mangler eller er erstattet af en anden aminosyre.

5. Polypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at Cys i 8-stillingen og Cys i 71-stillingen mangler eller hver er erstattet af en anden aminosyre.

5 Formel (A) 5 10 Ala - Pro - Val - Arg - Ser - Leu - Asn - Cys - Thr - Leu - 15 20

70 Arg - Asp - Ser - Gin - Gin - Lys - Ser - Leu - Val - Met- 25 30 Ser - Gly - Pro - Tyr - Glu - Leu - Lys - Ala - Leu - His- 35 40 Leu - Gin - Gly - Gin - Asp - Met - Glu - Gin - Gin - Val- '5 45 50 Val - Phe - Ser - Met - Ser - Phe - Val - Gin - Gly - Glu- 55 60 Glu - Ser - Asn - Asp - Lys - Ile - Pro - Val - Ala - Leu- 65 70 20 dy _ Leu - Lys - Glu - Lys - Asn - Leu - Tyr - Leu - Ser- 75 80 Cys - Val - Leu - Lys - Asp - Asp - Lys - Pro - Thr - Leu- 85 90 Gin - Leu - Glu - Ser - Val - Asp - Pro - Lys - Asn - Tyr- 25 95 100 Pro - Lys - Lys - Lys - Met - Glu - Lys - Arg - Phe - Val- 105 110 Phe - Asn - Lys - Ile - Glu - Ile - Asn - Asn - Lys - Leu- 115 120

30 Glu - Phe - Glu - Ser - Ala - Gin - Phe - Pro - Asn - Trp- DK 171648 B1 125 130 Tyr - Ile - Ser - Thr - Ser - Gin - Ala - Glu - Asn - Met- 135 140 Pro - Val - Phe - Leu - Gly - Gly - Thr - Lys - Gly - Gly- 145 150 Gin - Asp - Ile - Thr - Asp - Phe - Thr - Met - Gin - Phe- Val - Ser - Ser 10 a) Mindst én aminosyrerest valgt blandt Ala i 1-stil-lingen, Val i 3-stillingen, Arg i 4-stillingen, Ser i 5-stillihgen, Cys i 8-stillingen, Arg i Il-stillingen, His i 3O-stillingen, Cys i 71-stillingen, Lys i 93-stil- 15 lingen, Lys i 97-stillingen, Arg i 98-stillingen, Phe i 99-stillingen, Lys i 103-stillingen, Trp i 120-stilling-en, Tyr i 121-stillingen og Ser i 153-stillingen mangler eller er erstattet af en anden aminosyre, b) Aminosyresekvensen fra Ala i 1-stillingen til Thr i 20 9-stillingen eller mindst én aminosyrerest i denne sekvens mangler (bortset fra at mindst én aminosyrerest valgt blandt Ala i 1-stillingen, Val i 3-stillingen, Arg i 4-stillingen, Ser i 5-stillingen og Cys i 8-stilllin-gen mangler som angivet under betingelsen a)), 25 c) Aminosyresekvensen fra Lys i 103-stillingen til Ser i 153-stillingen eller mindst én aminosyrerest i denne sekvens mangler (bortset fra at mindst én aminosyrerest valgt bland Lys i 103-stillingen, Trp i 120-stillingen, Tyr i 121-stillingen og Ser i 153-stillingen mangler som 30 angivet i betingelsen a)), d) Met, eller aminosyresekvensen fra Met i 1'-stillingen til Asp i 116'-stillingen gengivet i formlen (B), eller en del af sekvensen med formlen (B) mod dens C-terminal er hæftet til N-terminalen af formlen (A)

35 Formel (B) DK 171648 B1 5' 10’ Met - Ala - Glu - Val - Pro - Glu - Leu - Ala - Ser - Glu- 5 15' 20' Met - Met - Ala - Tyr - Tyr - Ser - Gly - Asn - Glu - Asp- 25' 30' Asp - Leu - Phe - Phe - Glu - Ala - Asp - Gly - Pro - Lys- 35' 40'

6. Polypeptid ifølge krav 1, kendeteg net ved, at det er et polypeptid valgt blandt poly-peptiderne II til XXXXVIII, defineret i eksemplerne, fortrinsvis et polypeptid valgt blandt polypeptiderne IX til IX, polypeptiderne XI til XXX og polypeptiderne XXXV 15 til XXXXVIII.

7. Polypeptid ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det er polypeptid II, polypeptid VI eller polypeptid XXXVII.

8· Gen, kendetegnet ved, at detkoder 2o for polypeptidet ifølge krav 2 eller 7.

9. Vektor, kendetegnet ved, at den indeholder genet ifølge krav 8.

10. Mikroorganisme, kendetegnet ved, at den indeholder vektoren ifølge krav 9. 25

11. Lægemiddel, kendetegnet ved, at det indeholder en farmakologisk effektiv mængde af et polypeptid ifølge krav l og et medicinsk hjælpestof.

10 Gin - Met - Lys - Cys - Ser - Phe - Gin - Asp - Leu - Asp- 45' 50’ Leu - Cys - Pro - Leu - Asp - Gly - Gly - Ile - Gin - Leu- 55' 60' Arg - Ile - Ser - Asp - His - His - Tyr - Ser - Lys - Gly- 15 65' 70' Phe - Arg - Gin - Ala - Ala - Ser - Val - Val - Val - Ala- 75' 80’ Met - Asp - Lys - Leu - Arg - Lys - Met - Leu - Val - Pro— 85' 90· 2q Cys - Pro - Gin - Thr - Phe - Gin - Glu - Asn - Asp - Leu- 95' 100' Ser - Thr - Phe - Phe - Pro - Phe - Ile - Phe - Glu - Glu- 105' 110’ Glu - Pro - Ile - Phe - Phe - Asp - Thr - Trp - Asp - Asn-25 115' Glu - Ala - Tyr - Val - His - Asp 30

12. Lægemiddel ifølge krav 11, kendetegnet ved, at det er et middel til stimulering af immu-30 nitet, helbredelse af en malign tumor, til at fremme cy-tokindannelse, til helbredelse af inflammation, til forebyggelse eller helbredelse af stråleskade eller til forebyggelse eller helbredelse af opportunistiske infektioner.