JP2003515569A - ワクチンアジュバントとして有用なインターロイキン−１ムテイン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はヒトまたは動物に投与した場合、制御された免疫応答を刺激するためのアジュバントとして有用なIL-1βムテインからなる組成物に関する。たとえばIL-1βのムテインは本発明に従って使用することができる。ムテイン組成物にはワクチン抗原たとえば不活性化または減弱した全ウイルス、組換えまたは合成ペプチド、および他の抗原性材料を包含させることができる。本発明はまた、免疫応答が所望の抗原または他の抗原性材料に対する免疫応答を増大させるための、アジュバントとして有用なヒトまたは動物におけるIL-1βムテインの使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （関連出願の相互参照） 本出願は、１９９９年１２月３日付けにて出願の米国特許仮出願60/168,928号
の利益を請求する。

【０００２】 （技術分野） 本発明は、ワクチンアジュバントとして有用な組成物および方法に関する。

【０００３】 （背景技術） 免疫システムは一部分、化学シグナルの複雑なネットワークによって調節され
ている。これらのシグナルは、インターロイキンたとえばIL-1αおよびIL-1βを
包含する。IL-1βは刺激された単球によって合成され、分泌されるポリペプチド
ホルモンである。IL-1βの初期翻訳産物は生物活性が比較的低い31 kDaの前駆体
ポリペプチドである。合成後、IL-1βの31 kDa前駆体は、約17.5 kDaのサイズを
有するその高度に活性な成熟型に酵素的に切断される。ヒトの活性化単球に由来
する成熟IL-1βのN-末端はAla-Proで始まるN-末端アミノ酸配列によって特徴づ
けられる。ヒト成熟IL-1βのN-末端Ala残基はヒト前駆体IL-1βポリペプチドのN
-末端から数えて117位置にあり、Asp残基は116位置にある。成熟IL-1βは前駆体
ポリペプチドのC-末端153残基から構成される。

【０００４】 IL-1βの多くの生理学的作用および生物学的作用が同定されている。IL-1βの
生物学的活性は、多くの場合、胸腺細胞増殖の刺激をアッセイすることにより測
定される。IL-1βの活性には、また、B-リンパ球成熟の刺激、リンパ球の増殖、
線維芽細胞増殖の刺激および肝細胞による急性相タンパク質の合成の誘導が包含
される。

【０００５】 他の生物学的活性もIL-1βポリペプチドに帰せられている。これらにはリンパ
球の分化および活性化のコントロール、リンホカインおよびプロスタグランジン
産生の刺激、炎症の促進、急性相タンパク質の誘導、骨吸収の刺激、ならびに血
中鉄および亜鉛レベルの変更が包含される。さらに、IL-1βは視床下部-下垂体-
副腎軸の刺激が可能であることが見出され、IL-1βはホメオスタシスをコントロ
ールする複雑な神経内分泌ネットワークにインテグレートされていることが示唆
される。

【０００６】 成熟およびマクロファージからの成熟IL-1βの放出は、前駆体IL-1βポリペプ
チドが疎水性シグナル配列を欠くので、大部分の分泌タンパク質に通常関連する
慣用手段によっては進行しない。さらにIL-1βは単球における膜結合コンパート
メントと会合しない。大部分の分泌タンパク質はシグナル配列と呼ばれるアミノ
酸の疎水性ストレッチの存在を特徴とする。シグナル配列はタンパク質合成の間
に小胞体の膜を横切るタンパク質の輸送を指示する。タンパク質はついでエキソ
サイトーシスにより細胞の外部に導かれる。大部分の分泌タンパク質は、輸送後
に除去されるアミノ末端にシグナル配列を有する。他のタンパク質たとえばオバ
ルブミンは輸送後に除去されない内部シグナル配列を有する。前駆体型のIL-1β
にはシグナル配列として適当な十分の疎水性および長さをもつ領域はどこにも（
アミノ末端または内部のいずれにも）ない。

【０００７】 IL-1βの生物学的活性がタンパク質分子の構造的無欠に緊密に連結しているこ
とは、成熟タンパク質からのアミノ酸の欠失は生物活性の重大な減弱を伴うこと
からきわめて考えやすい。幾つかのグループは、受容体リガンド相互作用を証明
する試みで点突然変異を導入した（Jobling等,1988; Dechiara, T.M. 等[1986]
Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83: 8303-8307; Mosley, B., S.K.Dower, S.Gillis,
D. Cosman [1987] Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84: 4572-4576）。Huang等（Huang
, J.J. 等[1987] FEBS Letters 223: 294-298）は、IL-1βの生物活性がネイテ
ィブなNH₂-末端配列をala-pro-val-arg-serからthr-met-val-arg-serに変えるこ
とによって４倍〜７倍上昇するが、アルギニン₁₂₀をさらに変化させてthr-met-v
al-glu-serを発生させると生物活性は効果的に消失することを報告している。円
偏光二色性データはタンパク質の間に主要な構造的差異はないことを示した。Gr
onenborn等（Gronenborn, A.M., P.T.Wingfield, H.F.McDonald, U.Schmeissner
, G.M. Clore [1988] FEBS Letters 231: 135-138）は受容体結合親和性に対し
て影響を与えることなく、IL-1αのヒスツジンおよびトリプトファン残基を突然
変異させ、一方、MacDonald等（MacDonald, H.R. 等 [1986] FEBS Letters 209:
295-298）には、野生型タンパク質より2〜100倍小さい競合的結合活性をもつIL
-1ヒスチジンムテインが報告されている。

【０００８】 過剰のまたは規制されないIL-1が様々な疾患に関係づけられている。これらに
は慢性関節リウマチ（たとえばFontana等[1982] Arthritis Rheum. 22: 29-53参
照）；骨関節炎（たとえばWood等[1983] Arthritis Rheum. 26: 975参照）；毒
素ショック症候群（たとえばIkejima & Dinarello [1985] J.Leukocyte Biology
37: 714参照）；および他の急性または慢性炎症疾患状態たとえばエンドトキシ
ンによって誘発される炎症反応（たとえばHabicht & Beck [1985] J. Leukocyte
Biology 37: 709参照）、他の慢性炎症疾患状態たとえば肺結核（たとえばChes
que等 [1985] J.Leukocyte Biology 37: 690）が包含される。Benjamin等（ [19
85] "Annual Reports in Medicinal Chemistry−20", 18章, 173-183頁, Academ
ic Press, Inc.）は過剰なIL-1の産生が乾癬性関節炎、ライター症候群、慢性関
節リウマチ、骨関節炎、痛風、外傷性関節炎、風疹関節炎、および急性滑膜炎に
関係することを開示している。

【０００９】 Dinarello ([1985] J. Clinical Immunol. 5(5): 287-297) は、IL-1に帰せら
れる生物活性を総説している。

【００１０】 他の型のIL-1、天然に存在する受容体アンタゴニストタンパク質（IL-1ra）（
Carter, D.B., M.R. Deibel, C.J. Dunn等 [1990] Nature 344: 633-638; Hannu
m, C.H., C.J. Wilcox, W.P. Arend等[1990] Nature 343: 336-340; Seckinger,
P.K. Williamson, J.-F. Balavoine等[1987] J. Immunol. 139: 1541-1545）は
IL-1の作用の修飾に重要な役割を果たしている可能性がある。インターロイキン
-1の生物活性はI型またはII型細胞性IL-1受容体のいずれかとの相互作用により
開始され（Dower, S.R., S.R. Kronheim, C.J. March等 [1984] J.Exp.Med. 162
: 501; Sims, J.E., S.K.Dower [1990] Year in Immunology 6: 112-126; Sims,
J.E., C.J. March, D. Cosman等 [1988] Science 241: 585-588; Spriggs, M.K
., P.J. Lioubin, J.Slack等 [1990] J.Biol.Chem. 265: 22499-22505）、その
過程のそれぞれは３免疫グロブリン細胞外リガンド結合ドメインを有する。IL-1
raもIL-1受容体に結合するが、このタンパク質が生物学的応答を誘発することは
報告されたことがない（Dripps, D.J., B.J.Brandhuber, R.C. Thompson, S.P.
Eisenberg [1991] J.Biol.Chem. 266: 10331-10336）。IL-1αおよびIL-1β両者
の三次元構造が報告され（Clore,G.M., P.T.Wingfield, A.M.Gronenborn [1991]
Biochemistry 30: 2315-2323; Driscoll,P.C., G.M.Clore, D.Marion等 [1990]
Biochemistry 29: 3542-3556; Graves 等[1990] 前出; Priestle等 [1988] 前
出; Priestle,J.P., Schar,H.P., M.G.Grutter [1990] Cytokines and Lipocort
ins 349: 297-307）、両受容体タイプが分子的にクローニングされ、発現されて
いる（McMahan,C.J., J.L.Slack, B.Mosely等 [1991] EMBO J. 10: 2821; Sims
等 [1988] 前出; Spriggs等, 前出）。

【００１１】 ネイティブなIL-1βのβ-ストランド1におけるR₁₂₇をグリシンに変化させるこ
とにより、このタンパク質の受容体結合および生物学的活性ドメインは少なくと
も部分的に異なることが分かっている。以後の他の報告では、IL-1βの水素結合
した逆平衡β-ストランド1および12に位置する他のアミノ酸を突然変異させるこ
とによっても同様な効果が生じた（Ju, G., E.Labriolatompkins, C.A.Campen等
[1991] Proc. Natl. Acad.Sci. USA 88: 2658-2662; Young, P., V.Kumar, J.Li
llquist等, [1990] Lymphokine Res. 9: 599）。Ju等，前出は、またIL-1raタン
パク質は同様の構造的位置における残基を突然変異させることによって部分アゴ
ニストに変換できることを示した。

【００１２】 動物に投与された抗原に対する細胞性および／または体液性免疫応答の両者が
ある種のアジュバントと接合させた抗原で動物を免疫することにより増強または
増大できることは多くの場合について知られている。広い意味でのアジュバント
は抗原または免疫原に対する動物の免疫応答を増強または増幅できる化合物また
は組成物と考えられている（たとえば、抗体力価における上昇）。本技術分野で
はフロインドのアジュバント（完全または不完全）、ムラミルジペプチド（MDP
）、および明礬を含めて様々なアジュバントが知られている。

【００１３】 粘膜免疫処置は通常、「経口トレランス」もしくはさらに正確には粘膜誘導ト
レランスとして知られる免疫学的無反応状態を誘導する。ヒト病原体（HIV, HSV
, 風疹、おたふくかぜ、RSV等）に対する適当な粘膜免疫応答の誘導は感染に対
し優れた全身免疫応答を提供できる。粘膜免疫は、全身免疫が感染を融解した場
合（それらが感染を防止しない）に、感染を防止する。

【００１４】 最も強力な、最もよく研究された粘膜アジュバントはコレラ毒素（CT, Elson
等[1994] in Handbook of Mucosal Immunology, 391頁）である。しかしながら
、CTはヒト志願者に胃内投与した場合、5マイクログラム（μg）という少量で大
量の下痢を生じることから、ヒト粘膜アジュバントとしての使用は安全ではない
（Levine等 [1983] Microbiological Reviews 47: 510）。しかも、研究動物に
おけるCTの使用は、場合により抗原特異的IgE応答および致命的なアナフィラキ
シー反応の産生を伴うことがあった（たとえば、Snider等 [1994] J.Immunol. 1
53: 647; Marinaro等[1995] J.Immunol. 155: 4621参照）。

【００１５】 毒素アジュバントに伴う毒性を抑えるため、減弱したまたは検出不能な毒素活
性を示すが粘膜アジュバント活性は維持する突然変異CT, LT, およびPT分子を産
生させた（O'Hagan [1997] Journal of Pharmacy and Pharmacology 49: 1）。
これらの分子は強力なアジュバント活性を有し、毒性は減弱しているが、実験動
物に投与した場合、それらは免疫学的性質を維持している。たとえば、Douce等[
1977] Infection & Immunity 65: 2821参照。すなわち、これらの突然変異体の
免疫原性はまた、CTに対する既存の免疫がそれらのアジュバント活性を低下させ
る点で粘膜アジュバントとしての広範な反復使用は妨げられる（Wu等[1994] Va
ccine 12: 215）。

【００１６】 Pillai等に対するPCT国際公開公報WO 91/01143には、懸濁液中抗原とアジュバ
ント量のインターロイキン（IL）を鉱質に吸着させた混合物および防腐剤からな
るIL-含有ワクチン組成物が記載されている。明礬はILの生物学的活性を安定化
すると記載されている。ILの例にはIL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5,
IL-6およびIL-7が包含される。明礬がないとILの貯蔵寿命は短いことは注目され
る。癌細胞上に独特に見出され、またアレルゲンに伴って見出される炭水化物含
有ユニットはとくに抗原として記載されている。しかしながら、経口または粘膜
誘発トレランスに伴う問題は処理されていない。

【００１７】 Pillai等に1994年8月2日に発行された米国特許第5,334,379号には、複合ワク
チンのためのサイトカインおよびホルモン担体が記載されている。この特許に記
載された抗原は、免疫修飾活性を有するサイトカイン、リンホカイン、ホルモン
または成長因子に結合するかまたは遺伝子的に融合している。とくに意図された
抗原には細菌中にしばしば存在する炭水化物含有抗原が包含される。サイトカイ
ン、リンホカインおよびホルモンの例には、IL-1α, IL-1β, IL-12, プロラク
チン, EGF, TGF, GM-CSF, GCSF, IGF-1, ソマトトロピン, またはインスリンが
包含される。接合体は炭水化物含有抗原または他の抗原を担体にカップリングさ
せるための既知の生物学的に適合する任意の複合方法によって調製することがで
きる。共有結合によるカップリングは好ましい方法であると記載されている。実
際、実施例１および２には抗原をサイトカイン、リンホカイン、ホルモンまたは
成長因子に接合または結合させるために要求される精巧な反応が記載されている
。しかしながら、抗原の経口または粘膜誘発トレランスに関連する問題は処理さ
れていない。

【００１８】 Kramer等による最近の総説文献（"Cytokine Mediated Effects in Mucosal Im
munology" と題するKramer等, Immunology & Cell Biology 73: 389）には粘膜I
gA応答の誘導におけるIL-5, IL-6, およびTGF-βの役割が論じられている。とく
に、この文献は機能性IL-5またはIL-6遺伝子を欠くマウスにおいて行われた実験
からの公表された結果について考察している。また、生存ワクシニアウイルス中
でのワクチン抗原とIL-5またはIL-6の共発現を記載する文献およびIL-5またはIL
-6の共発現が粘膜IgA応答を増強することを記載する文献を考察している。しか
しながら、この文献はついで複合体の送達方法は粘膜へのサイトカインの送達を
要求するであろうことを示唆している。

【００１９】 O'Haganの "Recent Advances in Vaccine Ajuvants for Systemic and Mucosa
l Ajuvants" と題するJournal of Pharmacy and Pharmacology 49: 1（1997）の
他の最近の総説文献には、全身または粘膜投与のためのアジュバントの使用状態
を論じている。この総説には、粘膜投与されるワクチンのために使用される多く
の様々なアジュバントが粒子（すなわち、マイクロスフェア）、水中油型乳化液
、ならびに熱不安定性エンテロトキシン（LT）およびコレラ毒素（CT）の突然変
異型を含めて考察されている。しかしながら、この文献には粘膜ワクチンのアジ
ュバントとしてのサイトカインの使用については言及されていない。

【００２０】 Lin等による "Present Status of the Use of Cytokines as Ajuvants with V
accines to Protect Against Infectious Diseases" と題するClinical Infecti
ous Diseases 21: 1439（1995）の雑誌文献には、選択されたサイトカイン（IL-
1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, およびIL-12; 腫瘍壊死因子 (TNF); インタ
ーフェロン;およびGM-CSF）のアジュバントとしての使用が考察されている。し
かしながら、粘膜ワクチンアジュバントとしてのサイトカインの使用については
この文献には示唆されていない。

【００２１】 Nash等による "Recombinant Cytokines as 20 Immunological Ajuvants" と題
するImmunology and Cell Biology 71: 367 (1993) の雑誌文献には、組換えヒ
ツジIL-2, IL-1αおよび腫瘍壊死因子-α（TNF-α）のアジュバントとしての使
用が論じられている。IL-αおよび水酸化アルミニウム（明礬）の処方は二次体
液性応答を増強できるアジュバントとしての使用されることについて言及されて
いる。しかしながら、IL-αの粘膜投与についての示唆はない。

【００２２】 さらに最近になって、ポリペプチドおよび小さなペプチドがアジュバントとし
て使用されてきた。米国特許第5,503,841号にはワクチンとアジュバントとして
のインターロイキン-2（IL-2）の使用が開示されている。米国特許第5,206,014
号には免疫原性の低い抗原とのアジュバントとしてヒトIL-1βのペプチドフラグ
メントの使用を開示している。しかしながら、免疫修飾剤たとえばインターロイ
キンのアジュバントとしての全身投与は動物の免疫系の過剰刺激または機能不全
的活性化を生じることがある。IL-1βの全身的インビボ投与は発熱および悪心を
含む望ましくない副作用に関連している。

【００２３】 組換えヒツジインターロイキン-1βは、マウスまたはヒツジに粘膜内投与され
たとき、アジュバント活性を有するとの報告がある（Vaccine 13: 1277-1287）
。しかしながら、この研究ではIL-1の粘膜アジュバントとしての使用は取り扱わ
れなかった。インターロイキン１がタンパク質免疫原と共投与された場合、粘膜
および全身免疫応答に有効なアジュバントであることも報告されている（Staats
, H.F. & F.A.Ennis, Jr. [1999] J. of Immunology 162: 6141-6147）。現在、
よく働く唯一の粘膜アジュバントには、コレラ毒素、熱不安定性毒素または百日
咳毒素が包含される。多くのグループが細菌毒素を、毒性活性がなくアジュバン
ト活性を維持するように遺伝子的に修飾することを試みている。しかしながら、
異種タンパク質がなおアジュバントとして使用されなければならない。

【００２４】 免疫系の適格細胞を刺激または活性化し、過剰刺激または機能不全を生じない
アジュバントに対する本技術分野での必要性はなお残っている。

【００２５】 （発明の開示） 本発明はワクチンアジュバントとして有用な組成物および方法に関する。好ま
しい実施態様においては、本発明は、ヒトIL-1βムテインからなるアジュバント
組成物を提供する。さらに詳しくは、本発明のアジュバントは陽性に荷電した残
基（アルギニンまたはリジン）が他の17種の天然アミノ酸いずれかで置換されて
いるIL-1βムテインからなることが好ましい。

【００２６】 IL-1βワクチン組成物は、好ましくはさらに、抗原たとえば不活性化または減
弱全ウイルス、組換えまたは合成ペプチド、および／または他の抗原性材料から
構成される。これらのIL-1βムテインは母体分子に比較して、受容体結合親和性
を失うことなく生物学的活性が低下している。

【００２７】 本発明はまた、患者における免疫応答を増大させるための手段としての使用に
おけるIL-1ムテインの使用に関する。本発明の例示的実施態様においてはIL-1β
のムテインは免疫応答を増大させるための免疫修飾剤として使用することができ
る。

【００２８】 本発明によれば、脊椎動物対象における抗原に対する免疫応答を誘発する方法
が提供される。特殊な実施態様においては、方法は、抗原と実質的に非毒性分子
（単数または複数）からなる抗原-アジュバント組成物を提供し、上記抗原-アジ
ュバント組成物を脊椎動物対象に投与して免疫応答を誘発する工程からなる。好
ましくは、免疫応答は全身的および／または粘膜免疫応答からなる。

【００２９】 本発明のIL-1βムテインアジュバントは、ワクチン抗原の存在下または不存在
下、ワクチン抗原の前または後投与のいずれかによって投与することができる。

【００３０】 （発明の詳細な説明） 本発明はIL-1ムテインのアジュバントとしての使用に関する。本発明の好まし
い実施態様においては、アジバントはIL-1βのムテインである。

【００３１】 本明細書に記載するIL-1ムテイン組成物は、ワクチンの製造のための抗原性ま
たは免疫原性組成物と接合して有利に使用することができる。このような組成物
は、ヒトまたは動物に投与した場合、投与されたワクチンに対する免疫応答を、
通常野生型IL-1の投与に伴う過剰刺激または機能不全的活性化を生じることなく
、ワクチン抗原単独を投与した場合に比べて増大させる。

【００３２】 本発明のムテインアジュバントは抗原たとえば不活性化または減弱全ウイルス
、組換えまたは合成ポリペプチドまたはペプチド、ハプテン、および他の抗原性
または免疫原性材料と接合させて任意に包含し、使用することができる。本発明
の方法および材料の使用は、抗原の存在下または不存在下に、免疫系の抗原提示
細胞にIL-1βムテインの提示を提供するが、生物学的活性は減弱され、したがっ
て副作用も低下している。

【００３３】 本発明はまた、このような処置を必要とするヒトまたは動物にIL-1ムテインの
有効量を投与することにより、動物またはヒトにおける免疫応答を増大させる方
法に関する。好ましい実施態様においては、IL-1βムテインは、たとえばワクチ
ン組成物に用いられる免疫原または抗原に対する免疫応答を増大させるために、
アジュバントとして使用することが可能であり、野生型IL-1βの投与に伴う副作
用たとえば免疫系の過剰刺激または機能不全的活性化はない。本発明のワクチン
組成物は好ましくは不活性化または減弱した全ウイルス、ウイルス成分のサブユ
ニット、組換えまたは合成ポリペプチドまたはペプチド、ハプテン、および他の
抗原性または免疫原性材料からなる。IL-1βムテインは抗原の存在下または不存
在下に投与することができる。すなわち、本発明のIL-1βムテインは抗原投与の
前または後のいずれかに投与することができる。好ましくは、IL-1βムテインは
医薬的に許容される担体中で投与される。

【００３４】 本発明の方法により投与されるIL-1βムテインの量は、本開示の利益を享受す
る本技術分野の熟練者によって容易に決定することができる。

【００３５】 本発明のムテインアジュバントは動物またはヒトに非経口的に、たとえば筋肉
内または皮下注射によって投与することができる。

【００３６】 本発明の方法およびアジュバントは、細菌、ウイルス、腫瘍細胞、カビおよび
寄生虫に対して動物および／またはヒトを処置または免疫することを意図したワ
クチンとともに使用することができる。

【００３７】 本明細書に引用されたすべての参照文献は、引用することにより本明細書に導
入される。

【００３８】 特異的な残基の突然変異によるIL-1分子の変換は、アジュバントとしての有用
性を有するが、副作用は減弱したムテインを提供する。米国特許第5,286,847号
（引用により本明細書に導入される）に記載されたヒトIL-1βムテインがとくに
開示される。表１はこのムテインがネイティブな成熟IL-1βタンパク質（すなわ
ち、前駆体の残基117〜269に由来するタンパク質）と同様に効果的に結合するこ
とを示している。IL-1βペプチドは[³⁵S]メチオニンの存在下インビボ翻訳によ
って合成され、4RCにおいてEL.4細胞とインキュベートした。平衡解離定数はSca
tchardのプロット分析によって決定した（Jobling等, 1988）。比較のために、
プロIL-1βおよび２つのIL-1β欠失突然変異体の解離定数も示す。右のカラムは
成熟野生型IL-1β（100％）の関連で表した受容体結合親和性を例示する。

【００３９】

【表１】

【００４０】 図２は、この同じ突然変異体が、成熟IL-1βにより誘発される生物学的活性の
わずか１％しか誘導しないことを示している。したがってヒトIL-1βの位置127
におけるアルギニンのグリシンによる置換は、強力な活性を誘導することなく、
IL-1 受容体に結合する分子を発生させ、したがって活性型のIL-1の結合を妨害
し、それによってIL-1生物活性の量を低下させる。

【００４１】 本発明のムテインは好ましい免疫応答を誘導および／または増強するのに十分
な程度にIL-1受容体と相互作用するかまたは相互作用を引き起こすが、そのムテ
インは副作用を生じないかまたは野生型分子の投与から生じる副作用に比較して
副作用が低下した分子である。好ましい実施態様においては、本発明のムテイン
アジュバントは、天然には位置127に存在するアルギニンがグリシンで置換され
た突然変異を有するIL-1βである。

【００４２】 本明細書において使用される「免疫系」の語は、脊椎動物対象において可能性
のある病原を含めて「非自己」分子に対する防御を提供する非特異的および特異
的カテゴリーを含めて、すべての細胞、組織、システム、構造および過程を包含
する。

【００４３】 本技術分野では周知のように、非特異的免疫系には、貪食細胞たとえば好中球
、単球、組織マクロファージ、クップファー細胞、肺胞マクロファージ、樹状細
胞およびマイクログリアが包含される。特異的免疫系は、宿主内において特異的
免疫を付与する細胞および他の構造を意味する。これらの細胞中には、リンパ球
とくにB細胞リンパ球およびT細胞リンパ球が包含される。これらの細胞にはまた
、ナチュラルキラー（NK）細胞が包含される。さらに、B細胞のような抗体産生
細胞、および抗体産生細胞によって産生される抗体も「免疫系」の語に包含され
る。

【００４４】 「実質的に非毒性」の語は、脊椎動物に投与した場合、ほとんど有害な作用を
生じないアジュバント分子を意味する。有害な作用の例にはコレラ毒素のような
標準アジュバントの使用を通じて観察される悪心およびアナフィラキシーショッ
クが包含される。したがって「実質的に非毒性」の語は既知の標準としてのコレ
ラ毒素と比較することによって定量化することができる。さらに「実質的に非毒
性」とは、体重減少および長期の発熱を含む長期に続くまたは重大な副作用、例
えば、それらに限定されるものではないが、現在、本技術分野において用いられ
ている一部の予防接種で観察されるインフルエンザ様症候群たとえば発熱、長く
続く筋肉痛もしくは関節痛、または低血圧（ショック）がないことを意味する。

【００４５】 「粘膜投与」または「粘膜内投与」の語は、本発明による抗原-アジュバント
組成物が最初の接触は脊椎動物対象の粘膜組織において起こるような様式で投与
される投与方法を意味する。粘膜組織の例には、鼻粘膜、膣粘膜、直腸粘膜およ
び胃粘膜が包含される。すなわち、本発明の方法において意図される投与技術に
は他の粘膜内投与技術中とくに、鼻内投与、膣内投与および直腸内投与がある。

【００４６】 「生物学的活性」の語は、脊椎動物対象において生物学的または生理学的作用
を有する分子を指す意味である。アジュバント活性は生物学的活性の例である。
アジュバント活性を有する他の生物学的分子の活性化および産生誘発も意図され
る生物学的活性である。

【００４７】 「アジュバント活性」の語は、抗原に対する脊椎動物対象の免疫系の応答を増
大または他の修飾能を有する分子を指す意味である。

【００４８】 「免疫応答」の語は、脊椎動物対象の免疫系による抗原または抗原決定基に対
する任意の応答を指す意味である。免疫応答の例には、以下に定義するように、
体液性免疫応答（たとえば抗原特異的抗体の産生）および細胞性免疫応答（たと
えばリンパ球の増殖）が包含される。

【００４９】 「全身免疫応答」の語は、免疫系の細胞たとえばB細胞が発生するリンパ節、
脾臓、または消化管関連リンパ系組織における免疫応答を指す意味である。たと
えば、全身免疫応答は血清IgGの産生からなる。さらに、全身免疫応答は血流中
を循環する抗原特異的抗体および全身性コンパートメントたとえば脾臓およびリ
ンパ節におけるリンパ系組織の抗原特異的細胞を意味する。これに反し、消化管
関連リンパ系組織（GALT）は、消化管抗原／病原に応答する抗原特異的細胞がGA
LT中で誘導され検出可能なので、粘膜免疫系のコンパートメントである。

【００５０】 「粘膜免疫応答」の語は、脊椎動物対象の粘膜組織における免疫応答を指す意
味である。粘膜免疫応答は、本発明の抗原-アジュバント組成物の粘膜投与部位
から離れた脊椎動物対象の部位での粘膜組織におけるIgA, とくに分泌IgAの産生
からなる。

【００５１】 「体液性免疫」または「体液性免疫応答」の語は、抗体分子が抗原刺激に応答
して分泌される後天性免疫の形態を指す意味である。

【００５２】 「細胞性免疫」または「細胞性免疫応答」の語は、Tリンパ球によりそれらが
それらの犠牲細胞と近位に遭遇した場合に提供される防御のような、リンパ球に
より提供される免疫学的防御を指す意味である。細胞性免疫応答もリンパ球の増
殖からなる。「リンパ球の増殖」を測定すると、特異的な抗原に応答して増殖す
るリンパ球の能力が測定される。リンパ球の増殖はB細胞、T-ヘルパー細胞また
はCTL細胞の増殖を意味する。

【００５３】 「CTL応答」の語は、特異的抗原を発現する細胞を溶解または殺滅する抗原特
異的細胞の能力を指す意味である。標準の本技術分野で承認されたCTLアッセイ
がCTL活性の測定のために実施される。

【００５４】 サイトカインの組み合わせも、本発明の方法による使用のために意図される。
さらに、とくに意図される実施態様は、本発明の方法における粘膜アジュバント
としてIL-12およびIL-18の組み合わせからなる。サイトカインを組み合わせで用
いる場合、意図される投与量範囲は各サイトカインについて約0.3μg／ml〜約50
μg／ml からなる。さらに意図される投与量範囲は以下に記述する。

【００５５】 抗原-アジュバント組成物は、好ましくは医薬的に許容されるビヒクル中で投
与される。好ましいビヒクルは生理的食塩水であるが、蒸留水もビヒクルとして
使用することができる。さらに、抗原-アジュバント組成物は鉱質アジュバント
、防腐剤または安定剤たとえば明礬を含まないことが好ましい。また、抗原-ア
ジュバント組成物は接合していないことが好ましい。むしろ、抗原およびアジュ
バントはビヒクル中に単に溶解および／または懸濁させる。

【００５６】 本発明によれば、抗原は「保護」免疫応答を刺激するために、実質的に非毒性
の、生物学的に活性なアジュバントと組み合わせて、週毎にまたは２週間隔で計
３回の免疫処置が行われる。保護免疫応答は、細菌の毒性産物（破傷風毒素、コ
レラ毒素、大腸菌不安定毒素、ジフテリア毒素、百日咳毒素）ならびにワクチン
が向けられている特定の病原体（単数または複数）による増殖性感染に対して免
疫処置された生体を保護するのに十分な免疫応答である。

【００５７】 換言すれば、抗原-アジュバント組成物は１〜３週の期間にわたって１週に１
回または２〜６週にわたって２週に１回任意に投与される。別法として、抗原-
アジュバント組成物は第１週に１回投与し、ついで、第１週に続く１〜２週の期
間に１週に１回抗原のみをブースター免疫として投与する。さらに、抗原-アジ
ュバント組成物は最初の２週後の２〜４週にわたり２週に１回のブースター免疫
処置として任意に投与することができる。

【００５８】 アジュバントは、好ましくは脊椎動物対象の体重1 kg あたり約10〜約1000μg
の範囲の量で存在させる。さらに好ましくは、アジバントは抗原-アジュバント
組成物中に、脊椎動物対象の体重1 kg あたり約50〜約500μgの範囲の量で存在
させる。なおさらに好ましくは、アジュバントは抗原-アジュバント組成物中に
脊椎動物対象の体重1 kg あたり約60〜約200μgの範囲の量で存在させる。

【００５９】 本発明の方法に用いられるアジュバントの量は使用する抗原の本質に依存して
変動する。抗原の種類に適合させた上記アジュバントの投与量範囲の調整および
操作は本技術分野の熟練者の能力範囲にある。本発明のアジュバント-抗原組成
物またはワクチンは、未成熟および成熟温血動物を含む脊椎動物対象の処置にお
ける使用を意図している。温血脊椎動物の例には哺乳類および鳥類が包含される
。哺乳類は好ましい対象であり、ヒトは最も好ましい対象である。実際、本発明
によれば、感染に対する任意のワクチンをヒトまたは他の温血脊椎動物への投与
のために製剤化することができる。さらに、本方法の使用は予防的適用に限定さ
れるものではなく、治療的適用（たとえばAIDSの予防および治療）ならびに成長
、生産性または繁殖に焦点を当てた免疫も意図される。

【００６０】 本発明の抗原-アジュバント組成物に使用できる適当な抗原には、可溶性抗原
、たとえばタンパク質、ペプチド、ホルモンおよび糖タンパク質が包含される。
とくに興味がある抗原は、ウイルス、カビ、寄生虫または細菌抗原、アレルゲン
、自己免疫関連抗原または腫瘍関連抗原である。抗原は天然のソースから得るこ
とが可能で、また組換えDNA技術または他の人工的手段で製造することができる
。

【００６１】 興味ある細菌抗原にはヒトおよび動物細菌病原体に関連する抗原があり、それ
らに限定するものではないが、たとえば分類可能または分類不能のHaemophilus
influenzae, Esherichia coli, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneu
moniae, Streptococcus pyogenes, Branhamella catarrhalis, Vibrio cholerae
, Corynebacteria diphtheriae, Neisseria gonorrhoeae, Bordetella pertussi
s, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae
およびClostridium tetaniが包含される。一部の特異的細菌抗原には細菌表面お
よび外膜タンパク質（たとえばHaemophilus influenzae, Neisseria meningitid
es, Neisseria gonorrhoeaeまたはBranhamella catarrhalis）ならびに細菌表面
タンパク質（たとえばStreptococcus pyogenesからのMタンパク質）が包含され
る。

【００６２】 病原ウイルスからのウイルス抗原には、それらに限定されるものではないが、
HIV（I型およびII型）、ヒトT-細胞白血病ウイルス（I型, II型およびIII型）、
RSV, A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、非-A非-B肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイル
ス（I型およびII型）、サイトメガロウイルス、インフルエンザウイルス、パラ
インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、コロナウイルス、風
疹ウイルス、麻疹ウイルス、バリセラ、エプスタインバールウイルス、アデノウ
イルス、パピローマウイルスおよび黄色熱ウイルスが包含される。

【００６３】 これら病原ウイルスの幾つかの特異的なウイルス抗原には、RSVのFタンパク質
（Paradiso等によるWO89/02935に記載）ならびにNおよびGタンパク質；VP4（以
前にはVP3として知られた）；ロタウイルスのVP6およびVP7ポリペプチド；HIVの
エンベロープ糖タンパク質；ならびにB型肝炎の表面およびプレ表面およびヘル
ペス糖タンパク質BおよびDが包含される。

【００６４】 カビから誘導できるカビ抗原には、それらに限定されるものではないが、Cand
ida種 (たとえばalbicans)、Cryptococcus種（たとえばneoformans）、Blastomy
ces種（たとえばimmitis）、Paracoccidroides種（たとえばbrasiliensis）およ
びAspergillus種が包含される。寄生虫抗原の例には、それらに限定されるもの
ではないが、Plasmodium種、Eimeria種、Schistosoma種、Trypanosoma種、Babesia種
、Leishmania種、Cryptosporidia種、Toxoplasma種およびPneumo cystis種が包含さ
れる。

【００６５】 自己免疫疾患、たとえば慢性関節リウマチおよびループスエリテマトーデスに
関連する各種抗原も興味がある。

【００６６】 他の適用には、細胞修飾物質の安定性または相互作用を刺激または阻害する免
疫応答の誘発およびホルモンとそれらの相当する受容体または結合成分を含めて
包含される。この様式では、免疫応答は成長、繁殖、分化および総体的遂行能力
の阻害／増強に使用することができる。

【００６７】 上述の考察から、抗原の語の使用は全抗原またはその決定基の１つのいずれか
を含む意味である。上述の抗原の一覧は例示の目的のみのためである。本発明の
抗原-アジュバント組成物に使用できる他の抗原は、本技術分野の当業者によれ
ば容易に確認することができる。さらに、本発明の抗原-アジュバント製剤はワ
クチンの製造、輸送および保存を可能にする十分な期間安定である。

【００６８】 材料および方法 プラスミドの構築：インビトロ翻訳のためのIL-1βmRNAを発生するために用い
られるプラスミド構築体は図1にダイヤグラムとして示す。 IL-1β cDNAはプラ
スミドpSP64（Promega Biotec）中にサブクローニングし、86塩基ペアのIL-1βm
RNA非翻訳リーダー（UTL）配列を切り取り、アルファルファモザイクウイルスRN
A4の37塩基ペアのUTLで置換した。他に記載された（Jobling,S.A., L.Gehrke [1
987] Nature 325: 622-625）ように、IL-1βmRNAの翻訳効率はネイティブなUTL
の植物ウイルスRNAのUTLによる置換で増大する。非コードAMV RNA 4 UTLオリゴ
ヌクレオチドを、一番始めのATGコドンに位置するNcoI 部位（CCATGG）でIL-1β
cDNAにライゲートした。したがって、プロIL-1βのアミノ酸配列は変化しない。
欠失構築体はIL-1βcDNA配列を図１に示す適当な制限酵素部位で切断し、ついで
翻訳リーディングフレームを維持するために末端のライゲーション、または本技
術分野で周知の、Higuchi, R. (1990) "Recombinant PCR," In M.A.Innis等(編)
, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, In
c., San Diego, 177-183頁の詳細な記載により発生させることができる。Higuch
iの方法では、24ヌクレオチドの長さのDNAプライマーを欠失すべき部位のフラン
キングに使用し、ついで上流および下流付加的プライマーによって増幅する。

【００６９】 図１の右の数字は、参照としてプロIL-1β（269アミノ酸）を用いるアミノ酸
位置を意味する。IL-1（117-269）構築体のすべてに、翻訳を開始させるために
メチオニン（ATG）コドンの付加が必要であり、付加されたメチオニンは標識中
に認められ、番号を付したアミノ酸位置（たとえばM, 117-269）から分離される
。IL-1（M, 117-269）構築体は合成60-塩基ペアオリゴヌクレオチドをIL-1βcDN
AのHindIII部位にライゲートすることによって発生させた。本明細書に記載の位
置117, 118, 125および127におけるすべてのアミノ酸置換はこの60-bpオリゴヌ
クレオチドにおける変異体として発生させる。SP6 IL-1βを除いて、図１に示す
構築体から転写されたすべてのメッセンジャーRNAはアルファルファモザイクウ
イルスRNA4 UTLを含有する。

【００７０】 IL-1βプラスミドDNAの転写：プラスミドDNAはBamHIで線状化し、以前に記載
されたように（Jobling & Gehrke [1987], 前出）転写した。

【００７１】 インビトロ翻訳：キャップされたSP6 mRNAを線状化DNAから転写し、２つの連
続Sephadex G-50スパンカラムにDNAse-処理転写反応物を通過させて低分子量物
質を除去した。溶出液をついでフェノール／クロロホルムで２回、エーテルで１
回抽出し、核酸を2.5M酢酸アンモニウムからエタノールで沈殿させた。翻訳は製
造業者の説明書にほぼ従って実施した。麦芽翻訳は、105mMの酢酸カリウム、2 m
Ci ml^{-1 35}S-メチオニンを含有する10μl容量中ヌクレアーゼ処理麦芽抽出液（A
mersham）5μlを用いて調製し、反応混合物を１時間30RCでインキュベートした
。

【００７２】 グリシン（G）置換と同じ部位（位置127）をリジン（K）、グルタミン酸（E）
、トリプトファン（W）、およびアラニン（A）で置換したIL-1β突然変異タンパ
ク質の生物活性を検討した。R₁₂₇→G₁₂₇ムテインでは、突然変異タンパク質の生
物活性が著しく低下したが、K, E, W, およびA置換は突然変異タンパク質の生物
活性に有意な影響を与えなかった。127-位置が、側鎖水素結合または塩架橋の形
成が不可能な側鎖Cβ原子、たとえばアラニンをもつ置換のすべての様式に耐え
られる事実は、アミノ酸残基のパッキングがIL-1β機能の維持に中心的役割を果
たすことを示している。R₁₂₇はIL-1分子におけるクレフトを定義する他の残基を
構造的に支持する。このクレフトの一部は、受容体には結合するが生物活性は低
下するタンパク質を発生させるために突然変異させた（Clore等, 前出；Ju等,
前出）アスパラギン酸残基（D₂₆₁）をその中心に有する。この「D₂₆₁クレフト」
は異なる５種からのIL-1αおよびIL-1βタンパク質中に保存され、IL-1の生物学
的応答の開始に重要なアミノ酸クラスターを含有する。分子修飾は、β-炭素を
欠くグリシンを導入することにより、タンパク質の構造はストランド1, 2, およ
び4によって結合される水和空間中へのβ-ストランド1の崩壊により混乱するこ
とを示している。D₂₆₁クレフトに対する構造的支持のこの喪失は、R₁₂₇→G₁₂₇突
然変異タンパク質を用いて観察される遅いシグナル伝達の喪失に関係する。

【００７３】 （実施例） 以下は本発明を実施するための操作を例示する実施例である。これらの実施例
は限定と解釈すべきではない。すべての百分率は重量百分率であり、すべての溶
媒混合物の比率は他の指示がない限り容量比である。

【００７４】 実施例１−IL-1βタンパク質の合成 IL-1βタンパク質は、SP6またはT7メッセンジャーRNAのインビトロ翻訳によっ
て合成することができる。インビトロタンパク質合成は以前に記載されたように
実施することができる（Jobling等, 1988; Jobling, S.A., L.Gehrke [1987] Na
ture 325: 622-625）。すべての構築体mRNAの翻訳効率はIL-1βmRNAの非翻訳リ
ーダー配列をアルファルファモザイクウイルスのRNAのそれで置換することによ
り上昇した（Jobling等, 1988; Jobling等, 1987）。ここにとくに例示するIL-1
βタンパク質翻訳産物はタンパク質合成の開始時に付加したアミノ末端メチオニ
ン残基を含有する。翻訳産物の生物学的活性は、希釈した翻訳反応混合物の存在
下にインキュベートしたヘルパーT-細胞（D10.G4.1）による [³H]チミジンの取
り込みの定量（図２）によって試験した（Kaye, Y., S.Porcelli, J.Tite, B.Jo
nes, C.A. Janeway [1983] J.Exp.Med. 158: 836-856）。結果はR₁₂₇→G₁₂₇突然
変異タンパク質の最大生物学的活性の半分はプロIL-1βのそれよりも大きいが、
野生型成熟IL-1βのそれより少なくとも100倍小さかった。

【００７５】 実施例２−受容体結合特性 R₁₂₇→G₁₂₇突然変異タンパク質の受容体結合特性はScatchard分析および特異
的に結合したタンパク質のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリアクリルアミド
ゲル分析によって決定した（Dower等, 1986; Jobling等, 1988; Mosley等 [1987
] J. Biol. Chem. 262: 2941-2944）。ポリアクリルアミドゲル分析のためには
、IL-1βタンパク質を、EL 4 6.1C10ムリン胸腺腫細胞を用いる細胞表面受容体
結合アッセイの前のインビトロ翻訳時に[³⁵S]メチオニンで標識した（Jobling等
, 1988; Mosley等 [1987] Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 前出; MacDonald, H.R
., R.K. Lees, C. Bron [1985] J. Immunol. 135: 3944）。結合ネイティブ成熟
IL-1βおよび結合R₁₂₇→G₁₂₇突然変異IL-1βに相当するバンドの強度（図３）は
、タンパク質の生物活性は等しくなかったことの観察にもかかわらず、受容体結
合性は類似していたことが示唆された（図２）。平衡結合実験およびScatchard
のプロットデータ（表１）からは結合定数の同等性が確認された。

【００７６】 実施例３−アジュバントとしてのIL-1βムテインの使用 突然変異体IL-1βのアジュバント効果を野生型IL-1βおよび明礬と比較して評
価するために、マウスを様々な組成物で免疫した。突然変異体は位置127にアル
ギニンの代わりにグリシンを有する。 実験デザイン： グループ１：50μgの破傷風トキソイド（TT）鼻内 グループ２：1μgのCISTRON IL-1βと50μgのTT鼻内 グループ３：50μgのTTと明礬、皮下投与 グループ４：25μgの突然変異IL-1βと50μgのTT鼻内 グループ５：5μgの突然変異IL-1βと50μgのTT鼻内 グループ６：1μgの突然変異IL-1βと50μgのTT鼻内 マウスあたり200μlで皮下免疫。 マウスあたり15μlで鼻内免疫（7.5μl／外鼻腔）。 全グループを日0、21および42に免疫した。 有害作用：免疫処置の日および免疫処置の翌日にIL-1βの有害作用の指標とし
て体重をモニターした。 免疫応答：突然変異体IL-1βがアジュバント活性を表すかどうかを決定するた
め、血清抗-TT IgGおよびIgA応答をモニターした。結果は表２および３に示す。

【００７７】

【表２】

【００７８】

【表３】

【００７９】 結論 1. 突然変異体IL-1βはネイティブなIL-1βに匹敵する粘膜アジュバント活性
を有する。 2. モルベースでネイティブなIL-1βと比較した場合、突然変異IL-1βはネイ
ティブなIL-1βに観察される程度には体重減少を生じない。 3. TTおよびIL-1βまたは突然変異体IL-1βによる鼻内免疫処置は、明礬に吸
着させたTTによる皮下免疫処置により誘発される応答に匹敵する血清抗-TT IgG
応答を誘発する。

【００８０】 実施例４−製剤 ワクチンは本技術分野でよく知られた操作によって調製することができる。た
とえば、このようなワクチンは注射可能なたとえば液体溶液または懸濁液として
調製することができる。溶液または懸濁液用の固体剤形も注射前に液体に調製す
ることができる。所望により、製剤は乳化することもできる。ムテインアジュバ
ントおよび活性抗原成分（単数または複数）は、医薬的に許容され、活性成分と
適合性の賦形剤と混合することができる。適当な賦形剤の例には、水、食塩水、
デキストロース、グリセロール、エタノール等、およびそれらの混合物がある。
さらに、所望により、ワクチンには最少量の補助物質たとえば湿潤剤または乳化
剤、pH緩衝剤、またはアジュバントたとえば水酸化アルミニウムもしくはムラミ
ルジペプチドまたはそれらの変異体を含有させることができる。また、コレラ毒
素サブユニットBまたは粘膜部位において抗体産生を刺激する他の薬剤を使用す
ることもできる。ペプチドの場合、大きな分子たとえばKLHまたは破傷風トキソ
イドへのカップリングは免疫原性を増大させることがある。ワクチンは、たとえ
ば皮下または筋肉内のいずれかの注射によって慣用的に非経口投与される。他の
投与様式に適当な製剤には、坐剤および、ある場合には経口用製剤が包含される
。坐剤には、旧来からの結合剤および担体たとえばポリアルカレングリコールま
たはトリグリセライドが包含される。坐剤は活性成分を約0.5〜約10％、好まし
くは約１〜約２％の範囲で含有する混合物から形成させることができる。経口用
組成物には通常用いられる賦形剤たとえば医薬用のマンニトール、ラクトース、
デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭
酸マグネシウム等を包含させることができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液
、錠剤、丸剤、カプセル、持続放出製剤または粉末の形態とすることが可能であ
り、活性成分約10％〜約95％、好ましくは約25％〜約70％を含有する。

【００８１】 化合物は中性または塩の型としてワクチン中に製剤化することができる。医薬
的に許容される塩には、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基で形成）が包含され
、これらは無機酸たとえば塩酸もしくはリン酸、または有機酸たとえば酢酸、シ
ュウ酸、酒石酸、マンデル酸等で形成される。遊離カルボキシル基で形成される
塩も、無機塩基たとえばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまた
は鉄水酸化物、および有機塩基たとえばイソプロピルアミン、トリメチルアミン
、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等から誘導できる。

【００８２】 本発明のワクチンは、投与剤形に適合する様式で、治療的に有効で免疫原性を
示す量を投与することができる。投与される量は、処置される対象および所望の
保護の程度に依存する。免疫応答を最大にするため、粘膜免疫を促進することが
知られている方法を全身免疫の促進物質と組み合わせて使用することができる。
初期投与およびブースターショットに適当な投与基準もまた変動させることがで
きるが、通常は初期投与後１週または２週間隔で次の注射または他の投与が行わ
れる。

【００８３】 本明細書に記載の実施例および実施態様は、例示的な目的のみのものであって
、それらを参考にして様々な修飾および変化が本技術分野の熟練者には示唆され
るであろう。これらは本出願および添付された特許請求の範囲の精神および範囲
に包含されるものであることを理解すべきである。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒトIL-1β cDNAおよび欠失構築体の模式的表示。インターロイキン-1βcDNA
はプラスミドpSP64（Promega Biotec）中にサブクローニングした。SP6プロモー
ターは黒色の四角で表し、転写の方向は水平な矢印で示す。文字Uは非翻訳リー
ダー配列の記号であり、これらの実験においてはネイティブなIL-1β配列または
アルファルファモザイクウイルスRNA4のリーダー配列のいずれかである。白色の
三角はIL-1β前駆体コード領域を表し、これらの内部にホモロジー領域を示す（
a〜e）。欠失構築体を作成するために使用する関連制限酵素部位はIL-1β配列の
上部に示し、処理した成熟IL-1βタンパク質のアミノ末端の位置（Ala₁₁₇）は縦
の矢印で指示する。下方：数個の欠失構築体の模式的ダイヤグラム。末端アミノ
酸は大文字および下付きの数により指示する（M, メチオニン；A, アラニン；S,
セリン；T, スレオニン）。IL-1βコード領域ではなくベクター配列に由来する
アミノ酸は構築体のいずれかの末端に位置する斜線によって指示する。

【図２】 IL-1βタンパク質の生物学的活性。小胞体翻訳混合物は前に記載したようにイ
ンキュベートし、胸腺細胞共刺激アッセイでアッセイした（Jobling等, 1988）
。結果は翻訳混合物の様々な最終希釈における[³H]-チミジン取り込みとして表
す（カウント／分）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 シュターツ、ハーマン エフ アメリカ合衆国 ノースカロライナ、ダー ラム、 ベント オーク ドライブ 6106 Ｆターム(参考） 4C085 AA38 CC21 EE06 FF13 FF18 GG03 GG04 GG10

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 相当する野生型インターロイキン-1（IL-1）に比べてヒトに
   対する毒性が減弱したインターロイキン-1（IL-1）のムテインを含む、対象にお
   ける免疫応答を修飾するための組成物。
2. 【請求項２】 前記IL-1はIL-1βである、請求項１記載の組成物。
3. 【請求項３】 前記IL-1は成熟IL-1βである、請求項１記載の組成物。
4. 【請求項４】 前記IL-1はヒトIL-1である、請求項１記載の組成物。
5. 【請求項５】 前記IL-1の陽性に荷電した残基は他の17種の天然アミノ酸い
   ずれかで置換されている、請求項１記載の組成物。
6. 【請求項６】 前記陽性に荷電した残基はアルギニンまたはリジンである、
   請求項５記載の組成物。
7. 【請求項７】 前記IL-1は成熟ヒトIL-1βであり、前記陽性に荷電した残基
   は位置127におけるアルギニンである、請求項６記載の組成物。
8. 【請求項８】 ワクチン抗原に対する対象の免疫応答を修飾する方法におい
   て、前記ワクチン抗原と同時または連続的に組み合わせて、毒性の減弱したイン
   ターロイキン-1（IL-1）の有効量を投与することを含む、前記方法。
9. 【請求項９】 前記IL-1はIL-1βである、請求項８記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記IL-1は成熟IL-1βである、請求項８記載の組成物。
11. 【請求項１１】 前記IL-1はヒトIL-1βである、請求項８記載の組成物。
12. 【請求項１２】 前記IL-1の陽性に荷電した残基は他の17種の天然アミノ酸
    いずれかで置換されている、請求項８記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記陽性に荷電した残基はアルギニンまたはリジンである
    、請求項12記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記IL-1は成熟ヒトIL-1βであり、前記陽性に荷電した残
    基は位置127におけるアルギニンである、請求項13記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記ワクチン抗原は、タンパク質、ペプチド、ホルモンお
    よび糖タンパク質からなる群から選択される、請求項８記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記ワクチン抗原は、ウイルス抗原、カビ抗原、寄生虫抗
    原、細菌抗原、アレルゲン、自己免疫関疾患連抗原および腫瘍関連抗原からなる
    群から選択される、請求項８記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記IL-1ムテインは、粘膜内、筋肉内および皮下からなる
    群から選択される方法で投与される、請求項８記載の方法。
18. 【請求項１８】 前記IL-1ムテインは医薬的に許容されるビヒクル中で投与
    される、請求項８記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記対象は脊椎動物である、請求項８記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記対象はヒトである、請求項８記載の方法。