JP2001503014A

JP2001503014A - 防御免疫応答を増強するための方法

Info

Publication number: JP2001503014A
Application number: JP09501532A
Authority: JP
Inventors: ジー．リード，スティーブン
Original assignee: コリクサコーポレイション
Priority date: 1995-06-06
Filing date: 1996-06-05
Publication date: 2001-03-06
Also published as: WO1996039524A1; US5879687A; NZ309659A; MX9709737A; NO975730D0; NO975730L; BR9608898A; EP0832236A1; AU5988096A; CA2223421A1; CN1194000A; KR19990022654A

Abstract

(57)【要約】腫瘍抗原および／またはDNAワクチンを含む抗原に対する免疫応答を誘起または増強する方法が提供される。この方法は、真核生物開始因子4AのLeishmania BraziliensisまたはLeishmania majorホモログまたはその改変体の少なくとも生物学的に活性な部分を含むポリペプチドまたは核酸組成物を用いる。このようなポリペプチドおよび組成物は、例えば、腫瘍を処置するための方法の範囲内の、患者の細胞性および／または体液性免疫応答を増強または誘起するために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】防御免疫応答を増強するための方法関連出願の前後参照本出願は、1996年２月23日に出願された米国特許出願第08/607,509号の一部継続出願であり、これは1995年６月６日に出願された米国特許出願第08/488,386号の一部継続出願であり、これは1994年４月22日に出願された米国特許出願第08/2 32,534号の一部継続出願である。技術分野本発明は、一般的に、患者においてならびに単離された細胞および細胞培養物において免疫応答を増強するための化合物および方法に関する。本発明は、より特定には、真核生物開始因子4A（eIF4A）のホモログであるLeishmania抗原の全部または一部を含む化合物に、および免疫応答を刺激するためのワクチンにおけるこのような化合物の使用に関する。発明の背景ワクチンは、通常、感染または病気に関連する特定の抗原に対する患者における免疫応答を生成することによって、感染または病気に対する免疫を誘導する。適切な抗原の同定および使用についての現代の技術は、普通の感染（細菌、ウイルス、および原生動物感染を含む）ならびにガンのような病気に特異的な大量のワクチンのテストおよび開発を導くための可能性を有する。しかし、多くの場合、精製された抗原は弱い免疫原であり、すなわち、特定の抗原によって生成されるが、所望の標的に対する免疫応答は、免疫を与えるために十分な程度ではない。このような場合、アジュバントまたは免疫刺激物のような免疫調節剤は、免疫応答を増強するために用いられなければならない。アジュバントは、抗原とともにまたは抗原として同じ部位に注入される場合、抗原に対する特異的免疫応答を増強する物質である。このような物質は、種々のメカニズムによって機能し、これには、(1)抗原を捕獲し、そしてそれをゆっくり放出すること、(2)注入部位への細胞の移動を刺激すること、(3)リンパ球を刺激するまたは捕獲すること、あるいはリンパ球増殖を刺激すること、および(4)患者の体内での抗原分散を増進することが含まれる。例えば、油、ポリマー、鉱酸塩、およびリポソームは、これに関してアジュバントとして使用されている。比較すると、免疫剌激物は、抗原とともにまたは別々に投与されるのいずれにせよ、患者の免疫応答における一般的な一時的な増加を誘導する物質である。代表的な免疫剌激剤は、BCG（Mycobacterium tuberculosisの弱毒化株）またはCorynebacteri umparvumの無生育性形態のような細菌である。いずれかのメカニズムによって、アジュバントまたは免疫刺激剤は、非特異的手段によって所望の特異的免疫応答を増強するために役立つ。現在利用可能な多くのアジュバントの重要な欠点は、それらの毒性である。一般的に、最良のアジュバント（すなわち、所望の免疫応答の最大増強を提供するもの）はまた最も毒性である。したがって、医者はアジュバントの毒性に対する刺激のレベルを連続的に均衡を保たなければならない。したがって、特異的免疫応答の所望の増強を提供するが、低レベルの毒性を有する化合物の同定について、当該分野での必要がある。本発明は、これらの必要を満たし、そしてさらに他の関連の有利点を提供する。発明の要旨簡単にいうと、本発明は、真核生物リボソームタンパク質eIF4Aに相同であるL eishmania抗原LbeIF4AまたはLmeIF4Aに関する化合物および方法を提供する。本発明の１つの局面では、患者において、抗原および／またはDNAワクチンによってコードされる抗原に対する免疫応答を増強または誘起するための方法が提供され、この方法は、抗原および／またはDNAワクチン、ならびに(a)配列番号１のヌクレオチド115〜1323；および(b)中程度のストリンジェント条件下で配列番号１のヌクレオチド115〜1323に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズするDNA 配列、からなる群より選択されるDNA配列によってコードされるアミノ酸配列を含むLbeIF4Aポリペプチドを患者に投与する工程であって、ここでこのDNA配列が、 Leishmania感染した個体から得られる末梢血単核細胞中でTh1免疫応答を刺激するポリペプチドをコードする工程を包含する。本発明の他の局面では、患者において、抗原および／またはDNAワクチンによってコードされる抗原に対する免疫応答を増強または誘起するための方法が提供され、この方法は、抗原および／またはDNAワクチン、ならびに(a)配列番号３のヌクレオチド117〜1325；および(b) 中程度のストリンジェント条件下で配列番号３のヌクレオチド117〜1325に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズするDNA配列、からなる群より選択されるDNA配列によってコードされるアミノ酸配列を含むLmeIF4Aポリペプチドを患者に投与する工程であって、ここでこのDNA配列が、Leishmania感染した個体から得られる末梢血単核細胞中でTh1免疫応答を刺激するポリペプチドをコードする工程を包含する。関連の局面では、本発明は、患者において、抗原および／またはDNAワクチンによってコードされる抗原に対する免疫応答を増強するための方法を提供し、この方法は、抗原および／またはDNAワクチンによってコードされる抗原、および配列番号２のアミノ酸49〜403を含むLbeIF4Aポリペプチド、または保存的置換および／または改変のみ異なるその改変体、あるいは抗原および／またはDNAワクチンによってコードされる抗原、および配列番号４のアミノ酸49〜403を含むLme IF4Aポリペプチド、または保存的置換および／または改変のみ異なるその改変体を、患者に投与する工程を包含する。他の関連の局面では、生物学的試料中の免疫応答を増強する方法が提供され、この方法は、生物学的試料を、抗原および／またはDNAワクチンによってコードされる抗原、および上記のLbeIF4Aポリペプチドと接触させる工程であって、ここで生物学的試料が、末梢血単核細胞、単球、Ｂ細胞、樹枝状細胞、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される細胞を含む工程を包含する。さらに他の関連の局面では、生物学的試料中の免疫応答を増強する方法が提供され、この方法は、生物学的試料を、上記のLmeIF4Aポリペプチドと接触させる工程であって、ここで生物学的試料が、末梢血単核細胞、単球、Ｂ細胞、樹枝状細胞、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される細胞を含む工程を包含する。他の局面では、患者において腫瘍に対する免疫応答を増強する方法が提供され、この方法は、患者に、１つまたは複数の腫瘍抗原および／またはDNAワクチン、ならびに上記のようなLbeIF4AまたはLmeIF4Aポリペプチドを投与する工程を包含する。さらに他の局面では、患者において腫瘍を処置する方法が提供され、この方法は、上記のようにLbeIF4AまたはLmeIF4Aポリペプチドを患者に投与する工程を包含する。上記の局面のそれぞれの中で、LbeIF4AまたはLmeIF4Aポリペプチドを利用することの代替として、核酸組成物で感染またはトランスフェクトされた患者の細胞中でのポリペプチドの発現を指示するウイルスベクターまたは核酸分子（集合的には、「核酸組成物」）を利用し得る。核酸組成物を投与する工程は、インビボまたはエクスビボで行われ得、後者は感染した／トランスフェクトした細胞の続いての投与を包含する。さらに、抗原または腫瘍抗原が投与される場合、核酸組成物がまた、（同じまたは異なるベクターまたは分子のいずれかにおける）このような抗原の発現を指示するように設計され得ることが明らかである。本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照にして明らかになる。本明細書に開示されるすべての参考文献は、それぞれがここに援用されるように、その全体が参考として本明細書に援用される。図面の簡単な説明図１は、Leishmania spp．DNAのサザンブロット分析の結果を示し、これは、L eishmania eIF4Aホモログが保存され、そしてL．braziliensisゲノムDNAがLebIF 4Aの少なくとも２つのコピーを含むことを示す。図２は、イムノブロット分析の結果を示し、これは、LbeIF4A免疫ウサギ血清が、種々のLeishmania種における約45kDaサイズの１つの優勢なタンパク質種と反応することを証明する。図３は、L．braziliensis感染した個体からのPBMCの増殖を刺激するための精製した組換えLbeIF4Aの能力を示す。図４Ａおよび４Ｂは、L．braziliensis感染の確認された症例の患者からのPBM CのサイトカインmRNA発現パターンの分析によって得られた結果を示す。図５は、LbeIF4Aまたは寄生虫溶解物での刺激後にL．braziliensis感染した個体からのPBMCから分泌されたIFN-γの上清レベルを示す。図６は、LbeIF4Aまたは寄生虫溶解物での刺激後にL．braziliensis感染した個体からのPBMCの上清中で検出されるTNF-αのレベルを示す。図７、パネルＡからＤは、LbeIF4Aもまた、患者のPPBMCを刺激して、寄生虫溶解物によって刺激されるIL-12レベルよりも著しく高い程度で、培養された上清中にIL-12を分泌すること、およびIL-10がこのIL-12産生を阻害することを示す。図８、パネルＡおよびＢは、テストしたすべての患者のPBMCにおいて、IFN-γ 産生がIL-12依存的であり、そしてIL-10によって阻害されたことを示す。図９Ａおよび９Ｂは、培養されたヒトマクロファージおよび付着したPBMCにおいて、LbeIF4AがIL-12産生を刺激することを示す。図10は、ヒト骨髄性白血病細胞株THP-1においてLbeIF4AがIL-12 p40産生を刺激し、そしてIFN-γと相乗作用してTHP-1細胞を刺激してIL-12を分泌することを示す。図11は、LbeIF4Aで抗原投与したマウスのリンパ腺細胞が、ほとんど排他的にT h1サイトカインプロフィルを増殖および分泌することを示す結果を示す。図12は、ヒト病気に関連を有するとして認識された動物モデルにおいて、Lbe1 F4Aが、L．major感染に対する顕著な防御を提供することを示す。図13は、代表的なLmeIF4Aポリペプチドを使用する抗オバルブミンCTLの誘起を示す。図14は、トリニトロフェノールに特異的な抗体の誘導のためのアジュバントとしての代表的なLmeIF4Aポリペプチドの使用を示す。図15は、代表的なLmeIF4Aポリペプチドによる抗MUC-1抗体の産生の増強を示す。図16は、培養された細胞における代表的なLmeIF4Aポリペプチドによる特異的C TL活性の増強を示す。図17は、LmeIF4Aポリペプチドを含むおよび含まない、IL-2でのCTL活性のインビトロ刺激を示す。図18は、LmeIF4Aポリペプチドによるマウスアロ反応性CTLの誘導を示す。図19は、マイクロスフェアに含まれる腫瘍抗原およびLmeIF4Aポリペプチドの投与後の腫瘍退行を示す。図20は、マイクロスフェアに含まれる腫瘍抗原およびLmeIF4Aポリペプチドの投与後の腫瘍退行を示す。図21は、マイクロスフェアに含まれる可溶性LmeIF4Aポリペプチドおよび腫瘍抗原の投与後の腫瘍退行を示す。発明の詳細な説明上記のように、本発明は、一般的に、患者または細胞培養物における、体液性および／または細胞媒介され得る、免疫応答の増強に関する。本発明の状況内では、免疫刺激抗原（すなわち、患者がそれに対して免疫応答を惹起する抗原）を含む抗原に対する免疫応答は、抗原および本明細書に記載の１つ以上のLbeIF4A 由来またはLmeIF4A由来のポリペプチドを患者に投与することによって開始または増強され得る。抗原および免疫剌激抗原は、一般的にはタンパク質分子であり、そしてウイルス（例えば、HIV、HBV、インフルエンザウイルス、呼吸シンシチウムウイルス）、細菌（例えば、インフルエンザ菌(Hemophilus influenza)、肺炎菌(Pneumoccocus pneumoniae)）、および寄生虫（例えば、Leishmania、およびTrypanosoma）に由来する分子を含む。さらに、腫瘍に対する免疫応答は、腫瘍抗原（すなわち、腫瘍に対する免疫応答（例えば、CTL）を刺激する抗原）を患者に投与することによって増強または誘起され得る。本発明の状況内で、腫瘍抗原は、ウイルスにコードされた分子、MAGE-l、Her-2、PSA、および他の分子を含む。したがって、本発明の方法は、特異的抗原または免疫刺激抗原と、本明細書に開示されるようなLeIF4A由来のポリペプチドとの同時投与を包含する。腫瘍はまた、このような外因的に投与された腫瘍抗原の非存在下で、LbeIF4AまたはL meIF4Aポリペプチドを患者に投与することによって処置され得る。本発明のLbeIF4AおよびLmeIF4Aはまた、DNAワクチンによってコードされる抗原遺体する免疫応答を誘起または増強するために使用され得る。DNAワクチンは、１つ以上の免疫剌激抗原をコードし、そのため抗原はインサイチュで生成される。例えば、DNAワクチンは、腫瘍抗原を、および必要に応じて、本明細書に記載されるようなLeIF4A由来のポリペプチドをコードし得る。このようなワクチンでは、DNAは、当業者に公知の種々の送達システムのいずれかの中に存在し得、核酸発現系、細菌およびウイルス発現系を含む。適切な発現系は、患者における発現のための必要なDNA配列（例えば、適切なプロモーター）を含む。細菌送達システムは、細胞表面上に前立腺細胞抗原のエピトープを発現する細菌（例えば、Ba cillus-Calmette-Guerrin）の投与を包含する。DNAは、ウイルス発現系（例えば、ワクシニアまたは他のポックスウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルス）を使用して導入され得、これは非病原性（不完全な）複製適応ウイルスの使用を包含する。適切なシステムは、例えば、Fisher-Hochら、PNAS86:317-321, 1989；Flexnerら、Ann．N.Y．Acad．Sci．569:86-103，1989；Flexnerら、Vacci ne 8:17-21，1990；米国特許第4,603,112号、第4,769,330号、および第5,017,48 7号;WO 9/01973；米国特許第4,777,127号；GB2,200,651；EP 0,345,242;WO 91/0 2805：Berkner、Biotechniques 6:616-627，1988；Rosenfeldら、Science 252:4 31-434，1991；Kollsら、PNAS 91:215-219，1994；Kass-Eislerら、PNAS 90:114 98-11502，1993;Guzmanら、Circulation 88:2838-2848，1993;およびGuzmanら、 Cir．Res．73:1202-1207，1993に開示される。このような発現系中にDNAを組み込むための技法は当業者に周知である。DNAはまた、例えば、公表されたPCT出願 WO 90/11092、およびUlmerら、Scinece 259:1745-1749，1993に記載され、Cohen 、Science 259:1691-1692，1993に総説されるように、「ネイクド（naked）」であり得る。naked DNAの取り込みは、生分解性ビーズ上にDNAをコートすることによって増加し得、これらは細胞中に効率的に輸送される。本発明の化合物は、一般的に、末梢血単核細胞（PBMC）中でTh1またはCTL（細胞障害性Ｔリンパ球）免疫応答を刺激するポリペプチドを含む。特に、真核生物リボソームタンパク質eI F4AのLeishmania braziliensisまたはLeishmania majorホモログの全部または刺激部分を含むポリペプチド（本明細書ではLbeIF4AおよびLmeIF4Aという）が開示される。本明細書で使用される場合、用語「PBMC」とは、末梢血に存在する核細胞の調製物をいう。本発明の状況において、用語「ポリペプチド」は、アミノ酸残基が共有ペプチド結合によって連結される、全長のタンパク質およびその部分を含む任意の長さのアミノ酸鎖を包含する。したがって、「LbeIF4Aポリペプチド」は、LbeIF4A、またはその一部、あるいは刺激活性を保持するその他の改変体を包含する。同様に、「LmeIF4Aポリペプチド」は、LmeIF4A、またはその一部、あるいは刺激活性を保持するその他の改変体を包含する。本明細書で使用される場合、「LeIF4A」は、LbeIF4AまたはLmeIF4Aのいずれかをいう。LbeI F4Aは例示の目的で本明細書に記載されるが、本発明の状況では、LmeIF4A、その部分、およびポリペプチド（またはその部分）の改変体もまた使用され得る。Le IF4Aポリペプチドは、もっぱらLeIF4Aの１つ以上の剌激部分からなり得、または、刺激部分は、追加のLeIF4A配列および／またはLeIF4Aとは異種性のアミノ酸配列を含む、より大きなタンパク質の状況に供給され得る。好ましくは、ポリペプチドは、夾雑する外因性材料を実質的に含まない。本発明のポリペプチドは、PBMCにおいてTh1またはCTL免疫応答を刺激する能力を保持するLbeIF4Aの改変体を包含する。このような改変体は、一次タンパク質の種々の構造形態を包含する。イオン化可能なアミノ基およびカルボキシル基の存在のため、例えば、LbeIF4Aポリペプチドは、産生または塩基声援の形態であり得、あるいは中性形態であり得る。ここのアミノ酸残基はまた、酸化または還元によって改変され得る。本発明の範囲内の改変体はまた、LbeIF4Aの一次アミノ酸構造またはそのフラグメントが、他のポリペプチド、またはグリコシル基、脂質、ホスフェート、アセチル基などのような化学部分との共有または凝集結合体を形成することによって改変されるポリペプチドを包含する。共有結合誘導体は、例えば、アミノ酸側鎖へあるいはN-またはC-末端で特定の官能基を連結することによって調製され得る。あるいは、ポリペプチドがLbeIF4Aポリペプチドに接合される誘導体については、融合タンパク質が、以下に記載のように組換えDNA技法をしようして調製され得る。１つのこのような実施態様では、LbeIF4Aポリペプチドは、合成部位から細胞膜もしくは壁の内部もしくは外部の機能部位への、タンパク質の輸送を翻訳と同時または翻訳後に指示するタンパク質のN-末端領域で、シグナル（またはリーダー）ポリペプチド配列に結合され得る（例えば、酵母α-ファクターリーダー）。本発明の範囲内のタンパク質融合物はまた、LbeIF4Aポリペプチドの精製または同定を促進するために付加されたペプチドを含み得る（例えば、ポリ-His）。例えば、Hoppら、Bio/Technology 6:1204(1988)によって記載されるペプチドは、同定を促進するために使用され得る非常に抗原性のペプチドである。このようなペプチドは、特異的モノクローナル抗体によって可逆的に結合されるエピトープを提供し、発現した組換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。Hoppらの配列はまた、ウシ粘膜エンテロキナーゼによって特異的に切断され、精製されたタンパク質からペプチドを取り出すことを可能にする。このようなペプチドでキャップされた融合タンパク質はまた、E．coliにおける細胞内分解に抵抗性であり得る。本発明に包含されるタンパク質融台物は、例えば、免疫グロブリンFc領域に連結されたLeIF4Aポリペプチドをさらに含む。LbeIF4A融合タンパク質が抗体の重鎖および軽鎖の両方で作成される場合、４つものLbeIF4Aタンパク質領域でタンパク質オリゴマーを形成することが可能である。ロイシンジッパードメインに連結されたLbeIF4Aポリペプチドもまた、本発明の範囲内である。ロイシンジッパードメインは、例えば、公表されたPCT出願WO 94/10308に記載される。ロイシンジッパーを含むLbeIF4Aポリペプチドは、例えば、オリゴマー、ダイマー、またはトリマーであり得る。上記のすべてのタンパク質融合物は、以下に記載のように、化学的連結によってまたは融合タンパク質として調製され得る。好ましいタンパク質融合物は、感染性病原体（例えば、抗原）に対する免疫を刺激するために有用な配列を含むポリペプチドを含む。このような配列は、例えば、ウイルス、腫瘍細胞、寄生虫、または細菌に由来し得る。本発明はまた、関連した天然のパターンのグリコシル化とともにまたは伴わないLeIF4Aポリペプチドを包含する。酵母または哺乳動物発現系で発現したポリペプチドは、発現系に依存して、天然の分子と分子量およびグリコシル化パターンが同様であるかまたはわずかに異なり得る。例えば、E．coliのような細菌におけるLbeIF4AポリペプチドをコードするDNAの発現は、非グリコシル化分子を提供する。真核生物タンパク質のN-グリコシル化部位は、アミノ酸トリプレットAsn- Ａ₁-Ｚによって特徴づけられ、ここでＡ₁はPro以外の任意のアミノ酸であり、そしてＺはSerまたはThrである。不活性化したN-グリコシル化部位を有するLbeI F4Aポリペプチドの改変体は、オリゴヌクレオチド合成およびライゲーション、または部位特異的変異誘発技法のような、当業者に公知の技法によって産生され得、そして本発明の範囲内である。あるいは、N-連結したグリコシル化部位が、 LbeIF4Aポリペプチドに付加され得る。本発明のポリペプチドはまた、１つ以上の欠失、挿入、置換、または他の改変のため、天然のLeIF4Aタンパク質とは異なるアミノ酸配列を有するLeIF4Aポリペプチドの改変体を包含する。このような改変体は、天然のLeIF4Aに実質的に相同であるべきであり、そしてPBMCにおけるTh1またはCTL免疫応答を刺激する能力を保持すべきである。本明細書で使用される場合、「実質的に相同」とは、中程度のストリンジェント条件下で、例えば、LbeIF4Aをコードする天然に存在するDNA 配列にハイブリダイズし得るDNA配列によってコードされ得るアミノ酸配列をいう。適切な中程度のストリンジェント条件には、５×SSC、0.5％ SDS、1.0mM ED TA(pH8.0)の溶液中で予め洗浄すること；50℃〜65℃、５×SSCで一晩ハイブリダイズすること；次いで２×、0.5×、および0.2×の0.1％ SDSを含むSSCのそれぞれで65℃にて20分間を２回洗浄することを包含する。このようなDNA配列をハイブリダイズすることもまた本発明の範囲内である。LbeIF4Aポリペプチドの活性における何らかのこのような改変の効果は、例えば、本明細書に記載の方法のいずれかを使用してTh1またはCTL応答を誘導するための変異したLbeIF4Aポリペプチドの能力を分析することによって容易に決定され得る。LbeIF4Aの好ましい改変体は、LbeIF4AのLeishmania majorホモログ（LmeIF4A）である。一般的に、アミノ酸置換は、保存的に行われるべきである、すなわち、置換アミノ酸は、同様の特性を有するアミノ酸を置き換えるべきであり、そのためペプチド化学の当業者は、実質的に変化されないポリペプチドの二次構造およびハイドロパシー性質を予測する。一般的に、以下のアミノ酸の群は保存的変化を示す：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr ；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；および(5)phe、tyr、 trp、hls。本発明の範囲内の改変体はまた、またはあるいは、ポリペプチドの刺激特性、二次構造、およびハイドロパシー性質への最小の影響を有する、アミノ酸の欠失または付加を含む他の改変を含み得る。一般的に、LbeIF4Aのフラグメントは、末端または内部の残基または配列を欠失することによって構築され得る。適切な改変に関する追加の指針は、他のeIF4Aファミリーメンバーの配列および構造に対するLbeIF4Aの配列の比較によって得られ得る。例えば、生物学的活性に必要とされないLbeIF4Aの末端または内部の残基または配列は、欠失され得る。システイン残基は、再生における不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防ぐために、欠失または他のアミノ酸と置換され得る。変異誘発への他のアプローチは、KEX2プロテアーゼ活性が存在する酵母系における発現を増強するための、隣接する二塩基性アミノ酸残基の改変を包含する。 LeIF4A全長タンパク質は、一般的に、タンパク質をコードするゲノムまたはcD NAクローンを使用して得られ得る。全長LbeIF4Aをコードするゲノム配列を配列番号１に示し、そして推定アミノ酸配列を配列番号２に示す。全長LmeIF4Aをコードするゲノム配列を配列番号３に示し、そして推定アミノ酸配列を配列番号４に示す。粘膜レーシュマニア症で苦しむ患者からの血清と反応する抗原を発現するクローンについて、適切なLeishmania braziliensisまたはLeishmania major 発現ライブラリーをスクリーニングすること、次いで、患者のＴ細胞アッセイにおける増殖性応答および優先的Th1サイトカイン産生を刺激する能力について、または患者のＴ細胞におけるCTL応答を剌激する能力について、反応性抗原を分析することによって、このようなクローンが単離され得る。ライブラリー調製物およびスクリーニングは、一般的に、Sambrookら、Molecular Cloning:A Labora tory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold Spring Harbor，N.Y.,1 989（参考として本明細書に援用される）に記載の方法のような、当業者に公知の方法を使用して行われ得る。簡単にいうと、バクテリオファージ発現ライブラリーが播種されてフィルターに移され得る。次いで、フィルターは、血清および検出試薬とインキュベートされ得る。本発明の状況では、「検出試薬」は、抗体 −抗原複合体に結合し得る任意の化合物であり、次いでこれは当業者に公知の種々の手段のいずれかによって検出され得る。代表的な検出試薬は、プロテインＡ、プロテインＧ、IgG、またはレクチンのような、リポーター基にカップリングされる「結合薬剤」を含む。好ましいリポーター基には、酵素、基質、補因子、インヒビター、染料、放射性核種、発光基、蛍光基、およびビオチンが挙げられる。より好ましくは、リポーター基は、西洋ワサビペルオキシダーゼであり、これは、テトラメチルベンジジンまたは2,2’-アジノ-ジ-3-エチルベンズチアゾリンスルホン酸のような基質とのインキュベートによって検出され得る。血清中で抗体に結合するタンパク質を発現するゲノムまたはcDNA配列を含むプラークは、当業者に公知の技法によって単離および精製される。適切な方法は、例えば、Sa mbrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Labo ratories，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989に見られ得る。患者のＴ細胞アッセイは、一般的に、反応性抗体で患者PBMCを処置すること、および適切な応答について細胞を分析することによって行われ得る。例えば、PB MC上清は、分泌されるサイトカインのレベルについてアッセイされ得る。好ましくは、アッセイされたサイトカインは、インターフェロン-γ、インターロイキン-2、インターロイキン-12（p40サブユニットまたは生物学的に活性なp70のいずれか）、インターロイキン-1、または腫瘍壊死因子-αである。これらの代表的Th2タイプサイトカインのレベルが、一般的に、本明細書に記載されるようなポリペプチドとの処理に応じて減少するので、サイトカインのインターロイキン -4およびインターロイキン-10もまたアッセイされ得る。サイトカインは、例えば、ELISAフォーマットで目的のサイトカインに特異的な市販の入手可能な抗体を使用してアッセイされ得、製造者に指示に従って陽性の結果が決定される。適切な抗体は、例えば、Chemicon，Temucula，CAおよびPharMingen，San Diego，C Aから得られ得る。あるいは、処理したPBMCは、サイトカインのインターフェロン-γ、インターロイキン-2、インターロイキン-12 p40サブユニット、インターロイキン-1、または腫瘍壊死因子-αの１つ以上をコードするmRNAについてアッセイされ得、または、PBMCは本明細書に記載されるように増殖性応答についてアッセイされ得る。あるいは、サイトカインは、サイトカイン特異的生物学的活性についてPBMC上清をテストすることによって測定され得る。 PBMCにおけるTh1免疫応答を刺激する能力を保持するLbeIF4Aの改変体は、一般的に、上記の１つ以上の局面において配列を改変すること、およびTh1 応答を刺激する能力について得られるポリペプチドをアッセイすることによって同定され得る。このようなアッセイは、一般的に、上記のように、改変されたペプチドで患者のPBMCを処理すること、および応答をアッセイすることによって行われ得る。LbeIF4Aの天然に存在する改変体もまた、例えば、LbeIF4Aまたはその改変体をコードするDNA配列で適切なcDNAまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、他のLeishmania種から単離され得る。上記の配列改変は、標準的組換え技法を使用してまたは改変されたポリペプチドの自動化合成によって導入され得る。例えば、変異は、天然の配列のフラグメントへのライゲーションを可能にする制限部位によって隣接される、変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって、特定の遺伝子座に導入され得る。ライゲーションの後、得られる再構築された配列は、所望のアミノ酸挿入、置換、または欠失を有するアナログをコードする。あるいは、オリゴヌクレオチド部位特異的変異誘発手順は、特定のコドンが、必要とされる置換、欠失、または挿入にしたがって変更される遺伝を提供するために用いられ得る。上記の変更を作成する方法の例は、Walderら、Gene 42:133 ，1986；Bauerら、Gene 37:73，1985；Craik、BioTechniques，1985年１月，12- 19；Smithら、Genetic Engineering:Principles and Methods，Plenum Press，1 981；および米国特許第4,518,584号および第4,737,462号によって開示される。このようなLbeIF4Aポリペプチドの発現について構築されたヌクレオチド配列における変異は、もちろん、コーディング配列のリーディングフレームを保存しなければならず、そして好ましくは、レセプターmRNAの翻訳に有害な影響を与えるループまたはヘアピンのような、mRNAの二次構造を生じるためにハイブリダイズし得る相補的領域を生成しない。変異部位は予め決定され得るが、変異それ自体の性質が予め決定され得る必要はない。例えば、所定の部位で変異体の最適特徴について選択するために、ランダム変異誘発は、標的コドンおよび所望の活性についてスクリーニングされた発現したLbeIF4Aタンパク質変異体で行われ得る。 LbeIF4Aタンパク質をコードするヌクレオチド配列におけるすべての変異が最終産物中に発現されるわけではない。例えば、ヌクレオチド置換は、主として転写されたmRNA中の二次構造ループを避けるために（例えば、欧州特許出願75,444 Aを参照のこと）、またはE．coli発現のための周知のE．coli優先コドンのような、選択された宿主によってより容易に翻訳されるコドンを提供するために、発現を増強するために作成され得る。本発明のポリペプチドは、天然に存在するおよび改変された両方とも、好ましくは組換えDNA法によって産生される。このような方法には、組換え発現ベクター中にLbeIF4AポリペプチドをコードするDNA配列を挿入すること、および、発現を促進する条件下で組換え細菌、哺乳動物、または昆虫細胞発現系でDNA配列を発現することを包含する。本発明によって提供されるポリペプチドをコードする DNA配列は、cDNAフラグメントおよび短いオリゴヌクレオチドリンカーから、または一連のオリゴヌクレオチドから組み立てられ得、組換え発現ベクターに挿入されそして組換え転写ユニット中で発現され得る合成遺伝子を提供する。組換え発現ベクターは、哺乳動物、細菌、ウイルス、または昆虫遺伝子に由来する適切な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結されるLeIF4AポリペプチドをコードするDNA配列を含む。このような調節エレメントには、以下に詳細に記載するように、転写プロモーター、転写を制御するための任意のオペレーター配列、適切なmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、および転写および翻訳の停止を制御する配列が挙げられる。形質転換体の認識を容易にするための複製起点および選択可能マーカーがさらに組み込まれ得る。 DNA領域は、それらが互いに機能的に関連する場合、作動可能に連結される。例えば、ポリペプチドの分泌に関係する場合、シグナルペプチド（分泌リーダー）についてのDNAは、ポリペプチドについてのDNAに作動可能に連結される；配列の転写を制御する場合、プロモーターはコーディング配列に作動可能に連結される；または、翻訳を可能にするように配置される場合、リボソーム結合部位は、コーディング配列に作動可能に連結される。一般的に、作動可能に連結されるとは、隣接して、および分泌リーダーの場合はリーディングフレーム中であることを意味する。微生物中で発現されるべきであるLeIF4Aポリペプチドをコードする DNA配列は、好ましくは、DNAのmRNAへの転写を早まって停止し得るイントロンを含まない。細菌の使用のための発現ベクターは、周知のクローニングベクターpBR322の遺伝子エレメントを含む市販の入手可能なプラスミド（ATCC 37017）に由来する選択可能マーカーおよび細菌の複製起点を含み得る。このような市販のベクターには、例えば、pKK223-3（Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden）およびp GEMl（Promega Biotec，Madison，WI，USA）が挙げられる。これらのpBR322「骨格」セクションは、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と合わされる。代表的には、E．coliは、E．coli種に由来するプラスミドであるpBR322の誘導体を使用して形質転換される（Bolivarら、Gene 2:95，1977）。pBR322は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含み、したがって形質転換された細胞を同定するための簡単な手段を提供する。組換え微生物発現ベクターで通常使用されるプロモーターには、β-ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Changら、Nature 27 5:615，1978；およびGoeddelら、Nature 281:544，1979）、トリプトファン（tr p）プロモーター系（Goeddelら、Nucl．Acids Res．8:4057，1980；および欧州特許出願36,776）、およびtacプロモーター（Maniatis、Molecular Cloning:ALa boratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，412頁，1982）が挙げられる。特定の有用な細菌発現系は、ファージλP_LプロモーターおよびcI857ts熱不安定リプレッサーを用いる。λP_Lプロモーターの誘導体を組み込むアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手可能なプラスミドベクターには、E.coll株 JMB9に存在するプラスミドpHUB2（ATCC37092）およびE．coliRRIに存在するpPLc 28(ATCC 53082)が挙げられる。酵母ベクター中の適切なプロモーター配列には、メタロチオネイン、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ（Hitsemanら、J．Biol．Chem．255:2073，1980）、または他の解糖系酵素（Hessら、J．Adv．EnzymeReg．7:149，1968；およびHolland ら、Biochem．17:4900，1978）（例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド-3- リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼ）についてのプロモーターが挙げられる。酵母発現での使用に適切なベクターおよびプロモーターは、R．Hitzema nら、欧州特許出願73,657にさらに記載される。好ましい酵母ベクターは、E．coli中の選択および複製のためのpBR322からのD NA配列（Ampr遺伝子および複製起点）、ならびにグルコース抑制性ADH2プロモーターおよびα-ファクター分泌リーダーを含む酵母DNA配列を使用して組み立てられ得る。ADH2プロモーターは、Russellら（J．Biol．Chem．258:2674，1982）およびBeierら（Nature 300:724，1982）によって記載されている。酵母α-ファクターリーダーは、異種タンパク質の分泌を指示し、これは、プロモーターと発現されるべき構造遺伝子との間に挿入され得る（例えば、Kurjanら、Cell 30:933 ，1982；およびBitterら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:5330，1984を参照のこと）。リーダー配列は、3'末端の近くに、リーダー配列の外来遺伝子への融合を促進するための１つ以上の有用な制限部位を含むように改変され得る。脊椎動物細胞を形質転換することに使用される発現ベクター中の転写および翻訳制御配列は、ウイルスソースによって提供され得る。例えば、通常使用されるプロモーターおよびエンハンサーは、ポリオーマ、アデノウイルス２、シミアンウイルス 40（SV40）、およびヒトサイトメガロウイルスに由来する。SV40ウイルスゲノム、例えば、SV40起点、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライス、およびポリアデニル化部位、に由来するDNA配列は、異種DNA配列の発現に必要とされる他の遺伝子エレメントを提供するために使用され得る。初期および後期プロモーターは、両方ともSV40ウイルス複製起点も含むフラグメントとしてウイルスから容易に得られるので、特に有用である（Fiersら、Nature 273: 113，19 78）。ウイルスの複製起点に位置するHindIII部位からBglII部位への範囲におよぶ約250bp配列が含まれるとすれば、より小さいまたはより大きいSV40フラグメントもまた使用され得る。さらに、このような制御配列が選択された宿主細胞に適合可能であるならば、ウイルスゲノムプロモーター、制御および／またはシグナル配列が利用され得る。OkayamaおよびBerg，Mol．Cell．Biol．3:280，1983 によって開示されるように、例示のベクターが構築され得る。 C127マウス乳腺上皮細胞における哺乳動物レセプターcDNAの安定な高レベル発現のための有用な系は、Cosmanら（Mol．Immunol．23:935，1986）によって記載されるように、実質的に構築され得る。LbeIF4Aタンパク質DNAの発現のための好ましい真核生物ベクターはpDC406であり（McMahanら、EMBO J．10:2821，1991）、そしてSV40、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、およびエプスタイン・バーウイルス（EBV）由来の調節配列が挙げられる。他の好ましいベクターには、pDC409およびpDC410が含まれ、これらはpDC406に由来する。pDC410は、EBV複製起点をSV4 0ラージT抗原をコードする配列で置換することによってpDC406に由来した。pDC4 09は、複数のクローニング部位の外のBglII制限部位が欠失されており、複数のクローニング部位内のBglII部位を独自に作成する点で、pDC406とは異なる。 EBV複製起点を含む、pDC406およびpDC409のような発現ベクターをエピソーム複製させるために有用な細胞株は、CV-1/EBNA（ATCC CRL 10478）である。CV-L/ EBNA細胞株は、エプスタイン・バーウイルス核抗原-I（EBNA-1）をコードする遺伝子でのCV-1細胞株のトランスフェクションによって誘導されており、そしてヒトCMV中期-初期エンハンサー／プロモーターから作動されるEBNA-1を構成的に発現する。形質転換した宿主細胞は、組換えDNA技法を使用して構築された発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされている細胞であり、そしてこれは本発明のLbeIF4Aポリペプチドをコードする配列を含む。形質転換した宿主細胞は、所望のLbeIF4Aポリペプチドを発現し得るが、LbeIF4A DNAをクローニングまたは増幅する目的で形質転換された宿主細胞は、LbeIF4Aタンパク質を発現する必要がない。発現されたLbeIF4Aタンパク質は、好ましくは、選択されたDNAに依存して、培養上清中に分泌されるが、また細胞膜に堆積され得る。組換えタンパク質の発現に適切な宿主細胞には、適切なプロモーターの制御下の原核生物、酵母、または高等真核生物細胞が挙げられる。原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、E．coliまたはBacilliが挙げられる。高等真核生物細胞には、以下に記載のような昆虫または哺乳動物起源の樹立細胞株が挙げられる。無細胞翻訳系もまた、本明細書に開示されるDNA構築物に由来するRNAを使用してLbeIF4Aタンパク質を産生するために用いられ得る。細菌、菌類、酵母、および哺乳動物細胞性宿主との使用に適切なクローニングおよび発現ベクターは、例えば、Pouwelsら、Cloning Vectors:A Laboratory Manual，Elsevi er，New York，1985に記載される。原核生物発現宿主は、大規模なタンパク質分解およびジスルフィドプロセシングを必要としないLeIF4Aポリペプチドの発現に使用され得る。原核生物発現ベクターは、一般的に、１つ以上の表現型選択可能マーカー、例えば、抗生物質耐性を与えるまたは独立栄養必要性を供給するタンパク質をコードする遺伝子、および宿主内での増幅を確実にするために宿主によって認識される複製起点を含む。形質転換に適切な原核生物宿主には、E．coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium、およびPseudomonas、Streptomyces、およびStaphylococcus属内の種々の種が挙げられるが、他の宿主も用いられ得る。組換えLbeIF4Aポリペプチドはまた、酵母宿主で、好ましくはS．cerevisiaeのようなSaccharomyces種から発現され得る。PichiaまたはKluyveromycesのような他の属の酵母もまた用いられ得る。酵母ベクターは、一般的に、２μ酵母プラスミドからの複製起点または自己複製配列（ARS）、プロモーター、LbeIF4AポリペプチドをコードするDNA、ポリアデニル化のための配列、ならびに転写終結および選択遺伝子を含む。好ましくは、酵母ベクターは、複製起点および酵母および E．coliの両方の形質転換を可能にする選択可能マーカー（例えば、E．coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS．cerevisiae trp1遺伝子、これは、トリプトファン中で増殖する能力のない酵母の変異株のために選択マーカーを提供する）、および構造配列の転写を下流に誘導するための光度に発現される酵母遺伝子に由来するプロモーターを含む。次いで、酵母宿主細胞ゲノム中のtrp1障害の存在は、トリプトファンの非存在下での増殖による形質転換を検出するために有効な環境を提供する。適切な酵母形質転換プロトコルは当業者に公知である。Hindら（Proc．Natl.A cad．Sci．USA 75:1929，1978）によって記載された技法の例は、0.67％酵母窒素ベース、0.5％カサミノ酸（casamino acid）、２％グルコース、10mg/mlアデニン、および20mg/mlウラシルからなる選択培地中でTrp⁺形質転換体について選択することを包含する。ADH2プロモーターを含むベクターによって形質転換された宿主株は、80mg/mlアデニンおよび80mg/mlウラシルを追加した１％酵母エクストラクト、２％ペプトン、および１％グルコースからなるリッチ培地中での発現のために増殖され得る。ADH2プロモーターの脱抑制は、培地グルコースの消耗が生じる。粗酵母上清は、濾過によって採取され、そしてさらなる精製前に４℃で保たれる。種々の哺乳動物または昆虫（例えば、SpodopteraまたはTrichoplusia）細胞培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために用いられ得る。昆虫細胞における異種タンパク質の産生のためのバキュロウイルス系は、例えば、Luckowおよび Summers、Bio/Technology6:47，1988に総説される。適切な哺乳動物宿主細胞株の例は、Gluzman（Cell 23:175，1981）に記載されるサル腎細胞のC0S-7株、ならびに適切なベクターを発現し得る他の細胞株を含み、例えば、CV-1/EBNA（ATC C CRL 10478）、Ｌ細胞、C127、3T3、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）、COS 、NS-1、HeLa、およびBHK細胞株が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、翻訳されないエレメントを含み、これは、例えば、複製起点、発現すべき遺伝子に連結された適切なプロモーターおよびエンハンサー、および他の5'または3'フランキング非転写配列、および5'または3'非翻訳配列、例えば、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、および転写終結配列である。精製されたLeIF4Aポリペプチドは、本発明のDNAの組換え翻訳産物を発現するために適切な宿主／ベクター系を培養することによって調製され得、次いで、これらは培養培地または細胞抽出物から精製される。例えば、培養培地中に組み換えタンパク質を分泌する系からの上清は、まず、AmiconまたはMillipore Pellic on超濾過ユニットのような市販の入手可能なタンパク質濃縮フィルターを使用して濃縮され得る。濃縮工程の後、濃縮物は、適切な精製マトリクスに適用され得る。例えば、適切なアフィニティーマトリクスは、カウンター構造タンパク質（すなわち、LeIF4Aが構造に基づく特定の相互作用で結合するタンパク質）またはレクチンまたは適切な指示体に結合した抗体分子を含み得る。あるいは、陰イオン交換樹脂が、例えば、ペンダントジエチルアミノエチル（DEAE）基を有するマトリクスまたは基板に用いられ得る。マトリクスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、またはタンパク質精製に通常用いられる他のタイプであり得る。あるいは、陽イオン交換工程が用いられ得る。適切な陽イオン交換体には、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリクスが含まれる。スルホプロピル基が好ましい。ゲル濾過クロマトグラフィーもまた、LeIF4Aを精製する手段を提供する。アフィニティークロマトグラフィーは、LbeIF4Aポリペプチドを精製する特に好ましい方法である。例えば、免疫グロブリンFc領域を含む融合タンパク質として発現されるLbeIF4Aポリペプチドは、プロテインＡまたはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製され得る。さらに、ロイシンジッパードメインを含むLbeIF4Aタンパク質は、ロイシンジッパードメインに特異的な抗体を含む樹脂上で精製され得る。LbeIF4Aタンパク質に対するモノクローナル抗体もまた、当該分野で周知である方法を利用することによって、アフィニティークロマトグラフィー精製に有用であり得る。最後に、疎水性RP-HPLC媒体（例えば、ペンダントメチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲル）を用いる１つ以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（RP -HPLC）工程が、LbeIF4Aタンパク質組成物をさらに精製するために用いられ得る。種々の組み合わせにおいて、上記精製工程のいくつかまたはすべてはまた、同種の組換えタンパク質を提供するために用いられ得る。細菌培養物中で産生される組換えLbeIF4Aポリペプチドは、好ましくは、細胞ペレットからの最初の抽出、次いで、１回以上の濃縮、塩析、水性イオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィー工程によって単離される。高速液体クロマトグラフィー（HPLC）が、最終精製工程に用いられ得る。組換えLbeIF4Aタンパク質の発現に用いられる微生物細胞は、凍結−融解サイクル、ソニケーション、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を含む何らかの好都合な方法によって破砕され得る。分泌されるタンパク質としてLbeIF4Aポリペプチドを発現する酵母の発酵は、精製を非常に簡単にする。大規模発酵から得られる分泌される組換えタンパク質は、Urdalら（J．Chromatog．296:171，1984）に開示されたものと類似の方法によって精製され得る。この参考文献は、調製用HPLCカラムでの組換えヒトGM-CSF の精製についての２つの連続的逆相HPLC工程を記載する。組換え培養物で合成されたLbeIF4Aポリペプチドの調製物は、非LbeIF4A細胞成分を含み得、これは培養物からLbeIF4Aタンパク質を回収するために行われる精製工程に依存する量および特徴でタンパク質を含む。これらの成分は、通常、酵母、原核生物または非ヒト真核生物起源である。このような調製物は、代表的には、起源の種で天然に見られるLbeIF4Aタンパク質に通常付随し得る他のタンパク質を含まない。自動化合成は、約100よりも少ないアミノ酸、代表的には約50よりも少ないアミノ酸を有する本発明のポリペプチドを調製する代替の方法を提供する。例えば、Merrifield固相合成法のような市販の利用可能な固相技法のいずれかが用いられ得、そこではアミノ酸は成長するアミノ酸鎖に連続して付加される。（Merrif ield、J.Am．Chem．Soc．85:2149-2146，1963を参照のこと）。ポリペプチドの自動化合成のための設備は、Foster City，CAのApplied Biosystems，Inc.のような供給業者から市販で入手可能であり、そして一般的に製造業者の指示に従って操作され得る。 LeIF4Aポリペプチドの提示の代替として、本発明は、LeIF4Aポリペプチドまたはその部分をコードする核酸分子を送達し得る組成物を包含する。このような組成物には、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス（WO 90/07936、W O 91/02805、WO 93/25234、WO 93/25698、およびWO 94/03622を参照のこと）、アデノウイルス（Berkner、Biotechniques 6:616-627，1988;Liら、Hum．Gene T her．4:403-409，1993;Vincentら、Nat.Genet．5:130-134，1993;およびKollsら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:215-219，1994を参照のこと）、ポックスウイルス（米国特許第4,769,330号；米国特許第5,017,487号；および桧089/01973 を参照のこと））、naked DNA（WO 90/11092を参照のこと）、ポリカチオン性分子に複合体化される核酸分子（WO 93/03709を参照のこと）、およびリポソームに関連する核酸（Wangら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:7851，1987を参照のこと）が含まれる。ある実施態様では、DNAは、殺したまたは不活性化したアデノウイルスに連結され得る（Curielら、Hum．Gene Ther．3:147-154，1992；Cot tonら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:6094，1992を参照のこと）。他の適切な組成物には、DNA-リガンド（Wuら、J．Biol．Chem．264:16985-16987，1989を参照のこと）および脂質-DNA組み合わせ（Felgnerら、Proc．Natl．Acad．Sci.U SA 84:7413-7417，1989を参照のこと）が含まれる。さらに、細胞へのnaked DNA 取り込みの効率は、生分解性ラテックスビーズ上にDNAをコーティングすることによって増加し得る。直接的インビボ手順の他に、細胞が動物から取り出され、改変され、そして同じまたは他の動物中に配置されるエクスビボ手順が使用され得る。エクスビボ状況で組織細胞中へのLeIF4A核酸分子の導入のために上記の組成物のいずれかを利用し得ることが明らかである。ウイルスの、物理的、および化学的取り込みの方法についてのプロトコルは、当該分野で周知である。上記のように、本発明は、免疫応答を増強または誘起するために本命最初に開示されたポリペプチドまたは関連の核酸組成物を使用する方法を提供する。LbeI F4Aが、Leishmania感染した個体からのPBMCの増殖を刺激する１つまたは複数のエピトープを含むことが、本発明の範囲内で見いだされた。LbeIF4Aはまた、感染した個体からのPBMCを刺激して、排他的Th1サイトカインプロフィルを生成する。Th1応答は、サイトカインのインターロイキン-1（IL-1）、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-12（IL-12）、またはインターフェロン-γ（I FN-γ）、ならびに腫瘍壊死因子-α（TNF-α）の産生によって特徴づけられる。 IL-12は、p40およびp35サブユニットを含むヘテロダイマー分子であり、これは生物学的に活性なIL-12p 70の産生について同時発現されなければならない。p40 サブユニットは、IL-12産生細胞によってのみ産生され、そして細菌および寄生虫刺激後にインビトロおよびインビボで誘導されるが、p35サブユニットは、遍在的におよび構成的にの両方で発現される。したがって、IL-12を産生する細胞はまた、大過剰（10〜100倍）の生物学的に不活性な遊離のp40鎖を有する。このサイトカインがTh1応答（IFN-γおよびIL-2産生）に対してＴ細胞に影響する能力を有するので、IL-12産生の刺激は特に顕著である。したがって、IL-12産生を刺激するタンパク質の能力は、重要なアジュバント特性である。 LbeIF4Aはまた、Leishmania感染した患者からのPBMCにおいて、IFN-γ、IL-2 、IL-12p40サブユニット、およびTNF-αをコードするmRNAのTh1プロフィルを刺激する。Th2応答の指標である検出可能なIL-4またはIL-10mRNAは、このような刺激されたPBMC中に存在しない。実際に、LbeIF4Aは、一般的に、数人のレーシュマニア症患者の新鮮なPBMC中に存在するIL-10mRNAの発現、ならびに患者および正常PBMCによるLPS誘導されたIL-10産生を、ダウンレギュレートする。LbeIF4A のこれらの特性は、レーシュマニア症患者において防御的または治療的免疫応答を生じることにおけるLbeIF4Aについての役割を示唆する。さらに、LbeIF4Aは、非感染コントロール個体から得られたPBMCにおいて、ならびに、培養したヒトマクロファージにおいて、ヒト骨髄白血病細胞株THP-1において、およいマウスにおいて、IL-12およびIL-2の産生を刺激する。LbeIF4Aはまた、IL-12を分泌するためのTHP-1細胞を剌激するようにIFN-γと相乗作用し、そして患者PBMCによるIFN-γ産生の誘導は、抗住-12抗体の存在によって廃棄される。IL-12およびIL-2産生を刺激する能力は、LbeIF4Aが免疫応答を誘導する能力を有すること、および本明細書に記載されたポリペプチドが免疫応答の非特異的増強に広い適応性を有することを示す。したがって、本発明は、患者または細胞培養物において、細胞性免疫応答（例えば、抗原特異的細胞溶解性Ｔ細胞の生成）を増強または誘起する方法を開示する。本発明はまた、上記のように、LbeIF4AまたはLmeIF4Aポリペプチドを使用して、抗原に対する体液性免疫応答（例えば、抗原反応性抗体産生）を増強または誘起する方法を開示する。本明細書で使用される場合、用語「患者」は任意の温血動物、好ましくはヒトをいう。患者は、レーシュマニア症（または他の感染性の病気）のような病気、または黒色腫、乳ガン、前立腺ガン、リンパ腫、結腸ガン、または他の腫瘍のようなガンで苦しみ得、あるいは正常であり得る（すなわち、検出可能な病気および感染がない）。「細胞培養物」は、PBMCの何らかの調製物または単離された成分細胞（マクロファージ、単球、Ｂ細胞、および樹枝状細胞を含むが、これらに限定されない）である。このような細胞は、当業者に周知の種々の技法（例えば、Ficoll-hypaque密度遠心分離）のいずれかによって単離され得る。細胞は、レーシュマニア症または他の障害に苦しむ患者から単離され得（しかし必要ではない）、そして処置後患者に再導入され得る。これらの方法のうち、LeIF4Aポリペプチド（または核酸組成物）は、抗原とともに患者または細胞に投与され、そのため抗原に対する免疫応答を増強または誘起するための免疫調節薬剤として機能する。LeIF4Aポリペプチドは、抗原として同じ調製物（例えば、ワクチン）内で投与され得、または別々に投与され得る。１つの実施態様では、抗原およびLeIF4Aポリペプチドは、同時におよび同じ部位に患者に投与される。このように、LeIF4Aポリペプチドは、例えば、異種の薬剤のためのワクチン調製物中のアジュバントとして使用され得る。他の実施態様では、抗原およびLeIF4Aポリペプチドは、患者の異なる部位に投与される。例えば、LeIF4Aポリペプチドは、一方の腕に投与（例えば、注射）され得、そして抗原は他方の腕に投与され得る。このような投与は、同じ時間に行われ得るが必要ではない。あるいは、LeIF4Aポリペプチドは、抗原の前または後に投与され得る。例えば、LeIF4Aポリペプチドは、抗原投与の24時間前に投与され得る。適切な用量および投与方法を以下に詳細に示す。 LeIF4Aポリペプチドが投与される患者によって生成される免疫応答は、患者の症状に依存して変化し得る。Leishmania感染した患者については、生成され得る免疫応答は、優先的Th1免疫応答（IL-12産生の刺激を含む）およびIL-10発現のダウンレギュレーションを含む。感染していない個体については、免疫応答はIL -12の産生、IL-2の産生、γＴ細胞の刺激、インターフェロンの産生、抗原反応性CTLの生成、抗原特異的抗体の産生、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いずれかのタイプの応答は、LeIF4Aポリペプチドとともに投与された抗原に対する患者の免疫応答の増強を提供する。さらに、黒色腫、乳ガン、リンパ腫、結腸ガン、前立腺ガンなどのような診断されたガンの患者について、免疫応答は優先的CTL応答を含み得る。腫瘍の処置について、免疫応答は、腫瘍塊において減少の結果になるべきである。 LeIF4Aポリペプチド（または核酸組成物）は、好ましくは、薬学的組成物またはワクチンとして上記の方法での使用のために処方される。薬学的組成物は、一般的には、生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または希釈剤と組み合わせて１つ以上のLbeIF4Aポリペプチドを含む。このようなキャリアは、用いられる投与量および濃度でレシピエントに非毒性である。ワクチンは、１つ以上のLbeI F4Aポリペプチドおよび指示のために適切な１つ以上の追加の抗原を含む。可溶性サイトカインレセプター、サイトカイン、および化学療法剤とともにLbeIF4A タンパク質の使用もまた意図される。投与経路および頻度ならびにポリペプチド（または核酸組成物）用量は個体から個体で変化し、そして他の感染の免疫または処置に現在使用されるものに近似し得る。一般的に、薬学的組成物およびワクチンは、注射（例えば、筋肉内、静脈内、または皮下）、鼻内（例えば、吸引）、または経口によって投与され得る。投与量および頻度は、当然、処置される徴候の性質および重篤度、所望の応答、患者の状態などのような因子に依存する。代表的には、１と４との間の用量が２〜６週間の期間投与され得る。好ましくは、最初よりも２〜４週後に第２の用量で、２つの用量が投与される。適切な用量は、患者においてIL-12の産生を刺激するLbeIF4Aポリペプチドの量であり、そのため患者から単離されたPBMCの上清中のIL-12の量は、１mLあたり約10ngと10μｇとの間である。一般的に、IL-12 の量は、本明細書に記載されるアッセイを含む、当業者に公知の任意の適切なアッセイを使用して決定され得る。用量中に存在するLbeIF4Aポリペプチドの量は、代表的には、宿主１kg当たり約１pg〜約100mg、代表的には約10pg〜約１mg、そして好ましくは約100pg〜約１μｇの範囲である。適切な用量サイズは、動物のサイズによって変化するが、代表的には、10〜60kg動物につき約0.01mL〜約５ mLの範囲である。特定の指示についての特異的な適切な投与量は、容易に決定され得る。あるいは、細胞、好ましくは末梢血単核細胞は、患者から取り出され、そして１つのLeIF4Aポリペプチドおよび抗原（腫瘍抗原を含む）でインビトロで刺激される。CTL応答のような抗原特異的免疫応答の生成において、細胞は拡大されそして患者に再注入され得る。当業者に公知の任意の適切なキャリアは本発明の薬学的組成物に用いられ得るが、キャリアのタイプは、投与の態様および持続放出投与が所望されるかどうかに依存して変化する。皮下注射のような非経口投与については、キャリアは、好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックス、または緩衝液を含む。経口投与については、上記のキャリアのいずれかまたは固体キャリア、例えば、マンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、および炭酸マグネシウムが用いられ得る。生分解性マイクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ガラクチド）もまた、本発明の薬学的組成物のためのキャリアとして用いられ得る。適切な生分解性マイクロスフェアは、例えば、米国特許第4,897,268号および第5,0 75,109号、ならびに米国特許出願第08/116,484号および第08/116,802号（参考として本明細書に援用される）に開示される。ポリペプチドまたはポリペプチド／抗原の組み合わせは、生分解性マイクロスフェア内にカプセル化され得、またはマイクロスフェアの表面に結合され得る。これに関して、マイクロスフェアが約25 ミクロンよりも大きいことが好ましい。薬学的組成物およびワクチンはまた、希釈剤（例えば、緩衝液）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、低分子量（約10残基より少ない）ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭水化物（グルコース、スクロース、またはデキストランを含む）、キレート化剤（例えば、EDTA）、グルタチオン、および他の安定化剤および賦形剤を含み得る。中性緩衝化生理食塩水または非特異的血清アルブミンと混合された生理食塩水は、適切な希釈剤の例である。好ましくは、産物は、希釈剤として適切な賦形剤溶液（例えば、スクロース）を使用して凍結乾燥物として処方される。必要に応じて、種々の追加の薬剤のいずれかが、LbeIF4Aの他に、免疫応答をさらに非特異的に増強するために、本発明のワクチンまたは薬学的組成物で用いられ得る。このような薬剤は、通常、迅速なカタボリズムから抗原を防御するように設計された物質（例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油）、および免疫応答の非特異的刺激剤（例えば、リピドＡ、Bortadella perutussis、またはMycob acterium tuberculosis）を含む。このような薬剤は、例えば、フロイントの不完全アジュバントおよび完全アジュバント（Difco Laboratories，Detroit，MI ）およびMerck Ajuvant 65（Merck and Company，inc.，Rahway，NJ）として市販で入手可能である。以下の実施例は例証によって提供され、限定によって提供されるものではない。当業者は、実施例で具体化される本発明の改変が、特に本明細書で引用された種々の参考文献の教示によって行われ得ることが認識される。実施例実施例１ LbeIF4A をコードするDNAの調製この実施例は、L．braziliensisリボソーム抗原LbeIF4AをコードするDNA配列の分子クローンを例示する。ゲノム発現ライブラリーを、バクテリオファージλZAPII（Stratagene，La Jo lla，CA）中にL．braziliensis（MHOM/BR/75/M2903）からの剪断されたDNAで構築した。発現ライブラリーを、粘膜レーシュマニア症のL．braziliensis感染した個体からのE．coli予備吸着された患者の血清でスクリーニングした。免疫反応性組換え抗原を含むプラークを精製し、そしてpBSK(-)ファージミドは製造業者にプロトコルを使用して切除した。ひとかたまりの（nested）欠失をエクソヌクレアーゼIIIで行って、一本鎖テンプレート調製物および配列決定のための重複欠失を生成した。一本鎖テンプレートを、製造業者（Stratagene，La Jolla， CA）によって推奨されるVCSM13ヘルパーファージでの感染後に単離し、そしてジデオキシ鎖ターミネーター法によってまたはApplied Biosystems Automated Seq uencer Model 373Aを使用するTaq染料ターミネーターシステムによって配列決定した。次いで、免疫反応性組換え抗原を、以下の実施例５に記載のように、患者のＴ細胞アッセイで増殖性応答を刺激する能力について、および以下の実施例７に記載のように、優勢なTh1サイトカインプロフィルについて分析した。組換えクローンを、他のタンパク質の配列と断定されたアミノ酸配列の配列比較に続いて、真核生物開始因子4A（eIF4A）のLeishmania braziliensisホモログとして同定した上記のアッセイで同定した。単離したクローン（pLeIF.1）は、全長タンパク質配列の最初の48アミノ酸残基（144ヌクレオチド）がなかった。続いて、pLeIF.1インサートを使用して、全長ゲノム配列を単離した。配列番号１は、全長LbeIF4Aポリペプチドの全体のヌクレオチド配列を示す。オープンリーディングフレーム（ヌクレオチド115〜1323）は、45.3kDの断定された分子量を有する403アミノ酸タンパク質をコードする。タバコ（TeIF4A）、マウス（MeIF4A）、および酵母（YeIF4A）からの同種タンパク質と、LbeIF4Aの断定されたタンパク質配列の比較は、最も可変性である最初の20〜30アミノ酸との広い配列相同性を示す。LbeIF4A、TeIF4A、MeIF4A、およびYeIF4Aの長さ（403 、413、407、および395アミノ酸）、分子量（45.3、46.8、46.4、および44.7kDa ）、および等電点（5.9、5.4、5.5、および4.9）はそれぞれ類似している。LbeI F4A は、TeIF4Aと75.5％（57％同一性、18.5％保存的置換）、MeIF4Aと68.6％（50％同一性、18.6％保存的置換）、およびYeIF4Aと67.2％（47.6％同一性、19.6％保存的置換）の全体の相同性を示す。実施例２ LbeIF4A 遺伝子の特徴付けこの実施例は、Leishmania種におけるLbeIF4A DNAのサザンブロット分析を記載する。Leishmania braziliensis（MHOM/BR/75/M2903）、L．guyanensis（MHOM /BR/75/M4147）、L．amazonensis（IFLA/BR/67/PH8）、L．chagasi（MHOM/BR/82 /BA-2,ClおよびMHOM/BR/84/Jonas）、L．donovani（MHOM/Et/67/HU3）、L．infa ntum(IPT-1)、L．major（LTMp-2）、L．tropica（1063C）、Trypanosoma cruzi （MHOM/CH/00/Tulahuen C2）、およびT．brucei（TREU 667）を使用し、そしてこれらは既に記載されている（Burnsら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．90:77 5-779，1993を参照のこと）。前鞭毛虫（promastigote）および上鞭毛虫（epima stigote）を無菌培地で培養した。L．chagasiおよびL．amazonensis無鞭毛虫（a mastigote）を、それぞれSyrianハムスターの脾臓およびBALB/c ByJマウスの足蹠から得、そしてBurnsら、J．Immunol．146:742-748，1991に記載のように精製した。 Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1989に記載のように、ゲノムDNAを調製し、LbeIF 4Aの内側（PstIおよびNotI）および外側（BamHI、EcoRI、EcoRV、HindIII、PvuI I、およびSstI）の両方で切断する酵素で切断し、0.7％アガロースゲル上で分離し、そしてNytran（ナイロン）膜上でブロットした。LbeIF4Aのコーディング領域の約0.94kbフラグメント（ヌクレオチド143〜1083）を含む制限フラグメントを、ランダムプライミング法によって放射標識し（FeinbergおよびVogelstein、 Anal．Biochem．137:266-268，1984を参照のこと）、そしてブロットを65℃にて一晩ハイブリダイズした。ブロットを、0.1％ SDSを含む２×、0.5×、および0. 2×SSCのそれぞれで20分間65℃で２回洗浄した。L．braziliensisゲノムDNAは、 BamHIおよびPvuIIレーンで２つのハイブリダイズしているバンドの存在によって例示されるように、LbeIF4Aの少なくとも２コピーを含んでいた（図１）。同じ図はまた、L．braziliensisのeIF4Aホモログと他のLeishmania種との間の交差種保存を示す。２つの主要なPstIのハイブリダイズしているフラグメントを、L．donovani複合体（L．chagasi、L．donovani、およびL．infantum）のメンバーでテストしたすべての他のLeishmania種で検出し、これは同一のハイブリダイゼーションパターンを示した。LbeIF4Aはまた、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、より離れた関連の寄生虫T．cruziと交差ハイブリダイズするが、T．bruceiとはハイブリダイズしない。これらのデータは、Leishmania eIF4Aホモログの広い交差種保存を示す。実施例３ LbeIF4A の調製この実施例は、約45kDa LbeIF4A抗原遺伝子産物の発現および精製を説明する。ゲノムクローンpLeIF4Aの45kDa組換え抗原（すなわち、N-末端の48残基のない抗原）を、500mlのIPTG誘導した培養物から精製した。封入体を単離し、続いて２、４、および８M尿素を含む10ml TNE（50mM Tris、pH8.0、100mM NaCl，および10mM EDTA）で洗浄した。溶解した組換え抗原を含む画分（通常４および８M尿素上清）をプールし、Tris緩衝化生理食塩水（TBS）に対して透析し、そして30 ％硫酸アンモニウムでの沈殿によって濃縮した。均質への精製を、調製用SDS-PA GE電気泳動、次いで組換え抗原の切り出しおよび電気溶出によって完了した。発明者らの研究に使用したすべての抗原は、Immunex Corp.，Seatle，WAによって行われるLimulus両性細胞（amebocyte）アッセイで、10pg/mlまたは１ng/mgタンパク質より少ないエンドトキシンを有した。これらのエンドトキシンの量は、サイトカイン誘導および／またはアジュバント活性についてはわずかである。組換え抗原を使用して、ポリクローナル抗血清の産生のためにウサギに免疫した。成熟ウサギ（ニュージーランドホワイト；R & R Rabbitry，Stanwood，WA）を、100μｇのムラミルジペプチド（アジュバントペプチド、Calbiochem-Novabi ochem Corp.，La Jolla，CA）とともに不完全フロイントアジュバント中の100μ ｇの精製LbeIF4Aでの皮下免疫、次いでIFA単独中の100μｇの組換え抗原での４週後の追加免疫によって免疫した。３週後、ウサギを、生理食塩水中の25μｇのLbeI F4Aで静脈内に追加免疫し、そして血清を１週後に採取した。初期、中期、または後期対数期の間、あるいは22〜35℃の培養の温度シフトの後に採取したpromastigoteからのL．braziliensis溶解物のイムノブロットを、次いで、プローブとしてポリクローナルウサギ抗血清を用いて行った（図２）。図２のパネルＡは、分子量マーカー（レーンＭ）、誘導されていない（レーン１）および誘導された（レーン２）培養物のE．coli溶解物、および精製組換え抗原（レーン３）のイムノブロット分析を示す。図２のパネルＢは、L．brazilien sis promastigote溶解物（レーン１）、L．chagasi prostigote溶解物（レーン２）、およびL．amazonensis prostigote（レーン３）またはamastigote（レーン４）溶解物のイムノブロット分析を示す。寄生虫および哺乳動物細胞溶解物を、グリセロールおよびβ-メルカプトエタノールを含まないSDS試料緩衝液中でのペレットの凍結／融解溶解によって調製した。不溶性材料を、マイクロ遠心分離機での10K rpmでの遠心分離によって上清から分離した。タンパク質濃度を、Pierce BCAタンパク質アッセイきっとを使用して決定した。５〜10μｇの寄生虫または細胞抽出物あるいは0.5〜1.0μｇの組換え抗原を12.5％ SDS-PAGEで分離し、そしてニトロセルロース膜に電気泳動によって移した。抗血清の反応性を、[¹²⁵I]-プロテインＡ次いでオートラジオグラフィーを使用して、既に記載されているように（Skeikyら、J．Exp．Med．1 76:201-211，1992）評価した。ウサギ抗血清は、約45kDサイズの１つの優勢なタンパク質種を検出した。45kD eIF4Aホモログの相対強度は、分析したすべての溶解物について同様であった。したがって、これは、この抗原が、寄生虫の初期から中期対数増殖期の間あるいは細胞内amastigote期を模倣する温度移行後に、構成的に発現されることを示唆する。これは、産物が22〜35℃の温度移行後にアップレギュレートされるLeishm ania熱ショックタンパク質ファミリーのメンバーと同じではない。実施例４ LbeIF4A に結合するモノクローナル抗体の調製この実施例は、LbeIF4Aに対するモノクローナル抗体の調製を説明する。精製組換えLbeIF4Aまたは高レベルのLbeIF4Aを発現するトランスフェクトした細胞の調製は、米国特許第4,411,993号に開示されるように、従来の技法を使用してlbe IF4Aに対するモノクローナル抗体を生成するために用いられ得る。このような抗体は、LbeIF4Aについての診断または調査アッセイの成分として、あるいはLbeIF 4Aのアフィニティー精製において、PBMCのLbeIF4A活性化を妨害するために使用され得る。齧歯類を免疫するために、LbeIF4A免疫原を、アジュバント（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント、アラム）あるいはRibi adjuvant R700（Ri bi，hamilton，MT）のような他のアジュバントで乳化し、そして選択した齧歯類、例えば、BALB/cマウスまたはLewisラットに10〜100μｇの範囲の量で皮下に注入する。10日〜３週日後、免疫した動物を追加の免疫源で追加免疫し、そしてその後１週ごと、２週ごと、または３週ごとの免疫スケジュールで定期的に追加免疫する。血清試料を、ドットブロットアッセイ（抗体サンドイッチ）またはELIS A（酵素結合イムノソルベントアッセイ）によってテストするために後眼窩出血または尾先端切除によって定期的に採取する。Th1応答の誘起の阻害のような、他のアッセイ手順も適切である。適切な抗体価の検出後、ポジティブ動物に、生理食塩水中の抗原の静脈内注射をする。３〜４日後、動物を屠殺し、脾臓細胞を採取し、そしてマウス骨髄細胞株（例えば、NS1または好ましくはAg 8.653[ATCC CRL 1580]）に融合する。この手順によって生成したハイブリドーマ細胞株を、選択培地（例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培地、すなわちHAT）中、マルチプルマイクロタイタープレートに播種して、非融合細胞、骨髄−骨髄ハイブリッド、および脾臓細胞−脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害する。このように生成したハイブリドーマ株は、例えば、Engvallら（Immunochem．8 :871，1971）および米国特許第4,703,004号に開示される技法の適合によって、L beIF4Aとの反応性についてELISAによってスクリーニングされ得る。好ましいスクリーニング技法は、Beckmanら、J．Immunol．144:4212(1990)によって開示される抗体捕獲技法である。ハイブリドーマ株は、例えば、限定希釈によってまたは軟寒天でのクローニングによってクローニングされて、モノクローナル細胞株を得る。次いで、ポジティブクローンを、先天性齧歯類の腹腔に注入して、高濃度（＞１mg/ml）の抗LbeIF4Aモノクローナル抗体を含む腹水を生成する。得られるモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿、次いでゲル排除クロマトグラフィーによって精製され得る。あるいは、プロテインＡまたはプロテインＧへの抗体の結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーがまた使用され得、LbeI F4Aへの結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーも同様に使用され得る。実施例５ PBMC 増殖のLbeIF4A刺激この実施例は、L．braziliensis感染した個体からのPBMCの増殖を刺激するための精製組換えLbeIF4Aの能力を説明する。地方流行病学的、臨床的、および免疫学的研究が10年にわたって行われている、L．braziliensis伝搬の地方流行の領域（Corte de Pedra、Bahia、Brazil）に住んでいる個体から、末梢血を得た。患者の診断を、以下の少なくとも１つに関連する臨床的所見によって行った：病変からの寄生虫の単離、Leishmania溶解物での陽性皮膚テスト、または陽性血清学的テスト。末梢血を採取し、そしてPBMCをFicoll^TM（Winthrop Laboratories，New York ）による密度遠心分離によって単離した。インビトロ増殖アッセイについて、２〜４×10⁵細胞／ウェルを、10μｇ/mlの指示された抗原または５μｇ/ml PHA（S igma Immunochemicals，St．Louis，MO）とともにまたは含まずに、96ウェル平底プレートで、完全培地（ゲンタマイシン、2-ME、L-グルタミン、および10％スクリーニングされプールされたA+ヒト血清を追加したRPMI 1640；Trimar，Holly wood，CA）中で５日間培養した。次いで、細胞を、培養の最後の18時間、１μＣｉの[³H]チミジンでパルスした。データは、３連の培養物の平均cpmとして示され、そして刺激指数（SI）は、抗原を含む培養物の平均cpm／抗原を含まない培養物の平均cpmとして定義される。表Ｉおよび図３に示すように、ほとんどの（＞70％）粘膜のおよび活性または治癒した皮膚の患者からのPBMCは、それぞれ、12〜233および２〜64の範囲の刺激指数を有する外因性増殖パターンでLbeIF4Aに応答した。一般的に、刺激指数は、粘膜個体からのPBMCでより高かった。数名の粘膜患者からのPBMCは、寄生虫溶解物で観察されるものに匹敵する刺激指数でLbeIF4Aに応答した。興味深いことに、皮膚レーシュマニア症の数名の患者では、LbeIF4A に対する増殖性応答は、寄生虫溶解物によって誘起されるものより高かった。粘膜および皮膚患者に対比して、自己治癒する皮膚レーシュマニア症のすべての６名の個体からのPBMCは、粘膜個体のものに匹敵する刺激指数（16〜198）でLbeIF 4Aに応じて増殖した。自己治癒する個体の２名（MSおよびDJ）からのPBMCは、寄生虫溶解物で得られるものよりも著しく高い応答を有した。正常な感染していない個体からの細胞は、LbeIF4Aによって最低限にのみ刺激された。実施例６ PBMC におけるサイトカインmRNA発現のLbeIF4A刺激この実施例は、L．braziliensis感染の確認された症例の患者からのPBMCのサイトカインmRNA発現パターンの分析を示す。サイトカインmRNA分析について、0. 5〜１mlのPBMCを、配列番号２のN-末端の48残基がない10μｇ/mlのLbeIF4A抗原（実施例３に記載されるような）を含むまたは含まない１〜２×10⁶細胞／mlで、48および72時間培養した。上清および細胞を採取し、そしてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によってサイトカインmRNAについて分析した。サイトカインmRNA PC R分析については、トータルRNAを、ChomczynskiおよびSacchi（Anal．Biochem． 162:156-159，1987）に記載されるような、酸グアニジウムチオシアネート-フェノール-クロロホルム抽出法を使用して、PBMCから単離した。相補的DNA（cDNA）を、20μｌの最終容量中でポリ(dT)（Pharmacia）およびAMV逆転写酵素（Bethes da Research Laboratories，Gaithersburg，MD）を使用して合成した。cDNA試料を水で200μｌにした。 β-アクチンの規格化の後、12〜20μｌの希釈したcDNAを、50μｌの反応容量中で、0.2μＭのそれぞれの5'および3'外部プライマーとともにTaqポリメラーゼ（Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，CT）を使用するPCRによって増幅した。使用した条件は以下のとおりであった：94℃にて変性（β-アクチン、IL-2、およびIL- 4については１分；IFN-γについては45秒；およびIL-10については30秒）、55℃ にてアニーリング（β-アクチン、IL-2、およびIL-4については１分;IL-10については30秒）またはIFN-γについては60℃にて45秒、および72℃にて伸長。発明者らのPCR条件が、最初にcDNAの連続希釈を行うこと、およびPCRに使用されるサイクルの数を変えることによって、半定量的範囲内であることを確認した。すべての後の実験では、β-アクチン、IL-2、IL-4、およびIFN-γについての増幅反応では、30サイクルを使用した。IL-10 PCRの場合では、25サイクルを使用した。使用されるプライマー対およびPCR条件は、公表された情報からであった：β- アクチン、IL-2、IL-4、およびIFN-γ（Ehlersら、J．Exp．Med．173:23-36，19 91）およびIL-10（Vieraら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．88:1172-1176，19 91）。5'および3'オリゴヌクレオチドプライマーについてのヌクレオチド配列は、それぞれ、以下のとおりであった：(1)β-アクチン、TGACGGGGTCACCCACACTGTG CCCATCTAおよびCTAGAAGCATTGCGGTGGACGATGGAGGG；(2)IL-2、ATGTACAGGATGCAACTC CTGTCTTおよびGTCAGTGTTGAGATGATGCTTTGAC；(3)IL-4、ATGGGTCTCACCTCCCAACTGCT およびCGAACACTTTGAATATTTCTCTCTCAT；(4)IFN-γ、ATGAAATATACAAGTTATATCTTGGC TTTおよびGATGCTCTTCGACCTCGAAACAGCAT；(5)IL-10、TCTCAAGGGGCTGGGTCAGCTATCC CAおよびATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCA。ヒト配列IL-2、IFN-γ、およびIL-4（Lewisら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S. A．85:9743-9747，1988）およびβ-アクチン（65128号；アメリカンタイプカルチャーコレクション，Rockville，MD）を含むプラスミドを使用して、プローブを得、これらはそれぞれ、HindIII/EcoRI、EcoRI、SacI/HindIII、およびEcoRI で切断された。ヒトIL-10の全体のコーディング領域にわたる535塩基対フラグメントを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、正常ドナーからのマイトジェン刺激したPBMCからのPCRによって、ヒトIL-10 cDNA をクローニングした（Lewisら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．85:9743-9747 ，1988）。cDNAをpBluescript中にサブクローニングし、そしてBamHI/EcoRIで切断した。１％アガロースゲル上での分離後、挿入DNAフラグメントを切り出し、電気溶出し、そして精製した。放射標識した³²P-プローブを、ランダムプライミング法によって調製した。 PCR産物を1.5％アガロースゲルでの電気泳動によって分析し、ナイロン膜に移し、そして適切な³²P-標識したDNAインサートでプローブした。ハイブリダイゼーションは55℃にて一晩であった。ハイブリダイゼーション後洗浄は、0.2％SDS を含む２×および１×SSCでそれぞれ２回、55℃にて20分間であった。これらの分析の結果を、図4Aおよび4Bに示す。PCRサイトカイン分析を、培養前（レーン０）、抗原の不在下での培養後（レーン−）、または10μｇ/ml L．b raziliensis溶解物の存在下での培養後（レーンLb）、または10μｇ/ml LbeIF4A の存在下での培養後（レーンIF）の細胞で行った。図4Aは、分析した６名の粘膜患者のPBMCのうちの３名（JV、SZ、およびTE）および瀰漫性皮膚レーシュマニア症（DCL）として明らかにされたL．amazonensis感染の１名の患者（VA）についての、サイトカインmRNAのPCR結果を示す。６名の粘膜患者のうちの３名（TE、図4A；NOおよびE0、示していない）において、インビトロで培養されていないPB MCは、IFN-γおよびIL-4について、ならびにIL-2（患者TEおよびE0）について、 mRNAの検出可能なレベルを有した。IL-10 mRNAは、粘膜患者のいずれかからの「休止」PBMCにおいて検出されなかった。しかし、抗原刺激の不在下でのインビトロ培養後、IL-10m RNAの合成は、分析したほとんどの粘膜PBMCにおいてアップレギュレートされた。さらに、患者TE、NO、およびEOの「休止」PBMCで検出されたサイトカインmRNAのレベルは、バックグラウンドレベルに低下した。寄生虫溶解物は、Th1サイトカインIFN-γおよびIL-2のmRNAの発現、ならびにT h2サイトカインIL-4のmRNAの発現を刺激した（６名の患者のうち３名で）。増加したIL-10 mRNAは、寄生虫溶解物との培養後、患者のPBMのうち１つ（SZ）において検出された。LbeIF4A抗原および寄生虫溶解物の両方とも、排他的なTh1サイトカインプロフィルを誘起するLbeIF4Aでのすべての粘膜患者PBMCから、IFN-γ およびIL-2のmRNAの産生を誘起した。実際に、LbeIF4Aは、抗原刺激前のほとんどの粘膜患者の培養したPBMCで検出されるIL-10 mRNAの合成をダウンレギュレートした。興味深いことに、粘膜患者からのPBMCを使用する場合のように、LbeIF4 Aはまた、DCL患者VAにおいてIL-10 mRNAの合成をダウンレギュレートした。一般的に、IFN-γおよびIL-2についてのmRNAのレベルは、抗原刺激前の検出できない量から、エチジウムブロミド染色したゲルにおいて抗原刺激後に容易に見えるレベルに上昇した。しかし、サイトカインIL-4およびIL-10についてのmRNA は、解析されたPCR産物の放射活性プロービング後に検出されるのみであり、これらのサイトカインメッセージの低い豊富さを示した。同様のPCR分析を、皮膚患者由来のPBMCで行った（図4B）。分析した４名の患者のうちの３名（VS、JPおよびCA（示していない））からの新鮮なPBMCは、検査したTh1（IFN-γおよびIL-2）およびTh2（IL-4およびIL-10）の両方についてのm RNAの高いレベルを示した。４番目の皮膚患者（AS）の新鮮なPBMCにおいて、IFN -γおよびIL-2についてのmRNAは検出されたが、IL-10およびIL-4については検出されなかった。したがって、粘膜患者とは反対に、皮膚レーシュマニア症の患者は、その新鮮なPBMC中に、IL-4、IL-2、およびIFN-γの他に、IL-10 mRNAを有する。興味深いことに、IL-2およびIFN-γについてのmRNAは抗原の不在下でPBMCのインビトロ培養の後にわずかに検出可能なレベルにまで低下したが、IL-10についてのmRNAは影響を受けないかまたは上昇するかのいずれかのままであった。したがって、皮膚患者において、IL-10 mRNAの自然レベルは安定であるか、または彼らのPBMCは抗原刺激の不在下でIL-10を合成することを続けるかのいずれかである。皮膚レーシュマニア症患者についてのこのような応答の観察は、自己治癒病変を経験する個体から、慢性皮膚レーシュマニア症を発現する素因がある個体を区別することが開発され得る。テストしたすべての皮膚患者は、LbeIF4A抗原に対して、ならびにIL-2およびI FN-γについてのmRNAの合成をアップレギュレートすることによる寄生虫溶解物に対して応答し、そして４名の患者のうち２名（VSおよびAS）では、IL-4 mRNA のレベルはまた、寄生虫溶解物での刺激後上昇した。検出可能な自然レベルのIL -10 mRNAを有する３名の患者（VS、JP、およびCA）において、LbeIF4Aならびに寄生虫溶解物はIL-10 mRNAの発現をダウンレギュレートした。自己治癒するCLを有する患者からのPBMCのサイトカインmRNAプロフィルは、ML 患者のものと以下の点で同様であった：(a)IL-10 mRNAの検出可能なレベルを有する１名の患者を除いて、分析した４名の患者のうち３名からの新鮮なPBMCがIL -2、IFN-γ、およびIL-4の検出可能なレベルを有したが、ほとんどまたは全くIL -10 mRNAを有さなかった；(b)IL-10 mRNAは、抗原を含まないPBMCの培養後にアップレギュレートされたが、IL-2、IFN-γ、およびIL-4のmRNAは、バックグラウンドレベルに低下した；および(c)レーシュマニア溶解物は、混合したTh1/Th2サイトカインプロフィルのmRNA発現を刺激したが、誘起されたLbeIF4AはTh1タイプのサイトカインのみのmRNA発現を上昇させ、そしてほとんどの自己治癒する個体の培養したPBMCにおけるIL-10 mRNAの発現をダウンレギュレートした（示していない）。実施例７ PBMC におけるサイトカイン分泌のLbeIF4A刺激この実施例は、配列番号２のN-末端の48残基がないLbeIF4A抗原（実施例３に記載されるように）または寄生虫溶解物での刺激後に、L．braziliensis感染した個体からのPBMCの分泌されたサイトカインの上清レベルを示す。PBMC上清のアリコートをIFN-γ、TNF-α、IL-4、およびIL-10についてアッセイした。IFN-γ を、マウス抗ヒトIFN-γmAb（Chemicon，Temucula，CA）およびポリクローナルウサギ抗ヒトIFN-γ血清を使用する二重サンドイッチELISAによって定量した。ヒトrIFN-γ（Genentech Inc.，San Francisco，CA）を使用して標準曲線を作成した。IL-4を、マウス抗ヒトIL-4 mAb（M1）およびポリクローナルウサギ抗ヒト IL-4血清（P3）を使用して二重サンドイッチELISAによって上清中で定量した。ヒトIL-4（Immunex Corp.，Seatle，WA）を使用して、50pg/ml〜１ng/mlの範囲の標準曲線を作成した。分泌されたIL-10を「捕獲する」ためのラット抗ヒトIL- 10 mAb（PharMingen，San Diego，CA，Cat．# 18551D）、およびストレプトアビジン結合西洋ワサビペルオキシダーゼおよび基質としてのABTSと結合したIL-10 の検出のためのビオチン化ラット抗ヒトIL-10 mAb（PharMingen，San Diego，CA ，Cat．# 18562D）を使用して、IL-10を測定した。標準曲線を、30pg〜２ng/ml の範囲のヒトrIL-10（DNAX Research Institute，Palo Alto，CAから好意により提供された）を使用して得た。３つの患者群（すなわち、粘膜、皮膚、および自己治癒する皮膚）のすべてからの細胞は、10μｇ/ml LbeIF4A抗原または10μｇ/ml寄生虫溶解物のいずれかでの刺激後にIFN-γおよびTNF-αを分泌した（図５および６）。同様に、LbeIF4A は、IFN-γを増殖および分泌するようにL．tropica感染の患者（Desert Storm P atie nts）からのPBMCを刺激した（示していない）。患者のPBMCの上清中で検出されるIFN-γおよびTNF-αの両方のレベルは、感染していないコントロールからのものよりも著しく高かった。抗原刺激の不在下では、粘膜患者（６名のうち５名）からのPBMCのみが検出可能レベルの上清TNF-α（60〜190pg/ml）を産生した。IL -4またはIL-10は、分析したいずれの上清でもほとんどまたは全く検出されず（示していない）、用いたELISAアッセイの検出限界以下のレベルであることを示した。比較すると、レーシュマニア溶解物もまた、IFN-γおよびTNF-αを分泌するようにPBMCを刺激し、そして数名の患者では、IL-10も検出された（示していない）。ひとまとめにして考えると、この結果は、LbeIF4AはL．braziliensis感染した個体からのPBMCにおいて優勢なTh1サイトカインプロフィルを刺激したが、寄生虫溶解物は混合したTh1/Th2サイトカインプロフィルを刺激したことを示す。抗原刺激後に粘膜および自己治癒する個体からの患者PBMCの上清で検出された TNF-αのレベルは、皮膚患者からのものよりも高かった（図６）。５名のうちの４名の粘膜患者（JV、SZ、AB、およびMB）からのPBMCは、寄生虫での刺激後に感染していないコントロールからのPBMCの培養物で検出されたものよりも高いTNF- αの上清レベル（0.80〜2.20ng/ml）を有した。同様に、同じPBMCは、LbeIF4Aによって刺激されて0.66〜3.14ng/mlの範囲の値を有する上清レベルのTNF-αを産生した。感染していないコントロールと比較して、分析した６名の自己治癒する個体のうち３名（GS、HS、およびMCT）からのPBMCは、寄生虫溶解物に応じてより高いレベルのTNF-αを産生し、そして分析した６名の自己治癒する個体農地の６名すべて（GS、MS、AH、DJ、HS、およびMCT）は、LbeIF4Aに応じてより高いレベルのTNF-αを産生した。寄生虫溶解物に応じて皮膚レーシュマニア症患者からのPBMCによって産生されたTNF-αのレベルは、感染していないコントロールに匹敵した。しかし、LbeIF4Aは、これらの患者のうちの３名（RJ、AD、およびJS）においてPBMCを刺激して、TNF-αを産生した。このような患者は、急性皮膚レーシュマニア症を発現しているプロセスにあり得る。実施例８ LbeIF4AIL-12 産生の刺激この実施例は、LbeIF4Aが、L．braziliensis感染した個体からのPBMC、ならびに、正常ドナーの血液からのPBMCまたは培養したマクロファージ、接着性PBMC、およびヒト骨髄性白血病細胞株THP-1を刺激して、IL-12を分泌することを示す。 IL-12は、細胞内細菌または寄生虫感染における、細胞媒介免疫の発現、Th1応答の生成、およびIFN-γ産生において、重要な免疫調節の役割を演じることが示されている。使用されるLbeIf4Aポリペプチドは、配列番号２のN-末端の48残基がないLbeIF4A抗原（実施例３に記載されるような）であった。 IL-12 p40は、D'Andreaら（J．Exp．Med．179:1387-1398，1992）によって記載されるように、mAb対C11.79/8.6を使用してRIA（10pg/mlの検出限界）によって細胞を含まない上清中で測定した。生物学的に活性なIL-12 p70ヘテロダイマー（検出限界１pg/ml）を、Kubinら（Blood 83:1847-1855，1994）によって記載されるように測定した。図7Aは、10μｇ/ml LbeIF4A（LeIF）が、粘膜患者のPBMCを刺激して、抗原としての10μｇ/ml寄生虫溶解物（Lb）で観察されるIL-12 p40レベルよりも顕著に高い程度を有する培養した上清に、IL-12 p40を分泌したことを示す。溶解物または抗原の不在下で分泌されたIL-12 p40の量もまた示す（Med）。同じ図はまた、10μｇ/ml IL-10が、LbeIF4A（LeIF＋IL-10）または溶解物（Lb＋IL-10）での刺激後の患者PBMCによるIL-12 p40の産生をダウンレギュレートしたことを示す。感染していない個体からのPBMCはまた、LbeIF4Aで培養された場合にIL-12 p40 を産生するが（LeIF、図7B）、p40は寄生虫溶解物（Lb）に応じて検出されなかった。これは、患者PBMCで観察される溶解物で誘導されたp40においてIFN-γについての役割を示唆し、これは抗原刺激後に正常PBMCよりも５〜100倍多いIFN- γを産生した（図５を参照のこと）。抗原刺激したPBMC培養物で観察されるIL-12 p40が生物学的に活性なサイトカインを反映するかどうかを決定するために、IL-12 p70もまた、これらの培養物中でアッセイした（図7Cおよび7Ｄ）。一般的に、p70産生はp40の産生に近似しており、生物学的に活性なIL-12が患者および正常の両方のPBMCでLbeIF4Aに応じて産生されたことを示した。 LbeIF4Aもまた、培養したヒトマクロファージ（図9A）においておよび接着性P BMC（図9B）においてIL-12産生を刺激する。接着細胞を、正常ドナーの血液から Ficoll-hypaqueグラジエント遠心分離によって分離されたPBMCから調製した。２ ×10⁶PBMCを、500μｌ RPMI、２％ヒトAB血清中で２時間培養した。接着細胞を、PBSで３回プレートを洗浄することによって精製した。次いで、それぞれの刺激剤を含む500μｌのテスト培地（RPMI、２％ヒトAB血清）を添加した（IFN-100 0U/ml、LbeIF4A（Lf）10μｇ/ml）。上清を18時間後に採取した。接着性PBMCのIL-12産生を、５日齢のPHA芽細胞での捕獲バイオアッセイによって測定した。簡単にいうと、IL-12捕獲抗体C11.5.14（Wistar Instituteからの好意による贈与）を96ウェルプレートにコートした。誘導実験の上清および標準としての組換えIL-12を、４時間インキュベートした。数回の洗浄工程の後、５日齢のPHA芽細胞を添加し、そしてこれらの芽細胞の増殖を使用して接着細胞の上清中のIL-12濃度を決定した。マクロファージを、テスト培地中で５日間接着細胞（２×10⁶PBMC）を培養することによって生成した。次いで、マクロファージをPBSおよび500μｌ RPMI、２％ヒトAB血清で洗浄し、そして1000U/mL IFN-γを添加した。マクロファージをLbeIF4A（10μｇ/ml）で刺激するかまたは培地（Ｍ）単独中で培養した。１つのセットでは、LbeIF4Aコントロールマクロファージを、IFN-γを含まない500μ ｌ RPMI、２％ヒトAB血清中でLbeIF4Aとともにインキュベートした。上清を18時間後に採取し、そしてIL-12依存性増殖の誘導に使用した。簡単にいうと、５日齢芽細胞をマクロファージ上清とともに２日間インキュベートした。最後の18時間、³Hチミジンを添加した。中和抗IL-12ポリクローナルヤギ血清（５μｇ/ml）を指示されたように添加した。さらに、LbeIF4Aは、ヒト骨髄性白血病細胞株THP-1においてIL-12 p40産生を刺激する（図10）。細胞を、５％ウシ胎児血清を含むエンドトキシンを含まない RPMI培地中で24〜48時間10⁶細胞/mlで培養した。10μｇ/ml LbeIF4Aは、IL-12 p 40を分泌するようにTHP-1細胞を刺激するためにIFN-γで相乗作用した。これらの結果は、ワクチンアジュバントとしてのLbeIF4Aの有用性を示す。実施例９ IFN- γ産生のLbeIF4A誘導におけるIL-12およびIL-10の効果この実施例は、配列番号２のN-末端の48残基がないLbeIF4Aポリペプチド（実施例３に記載のような）に応じてのIL-12、IL-10、およびIFN-γ間の相互作用を検査する。図８に示すように、粘膜レーシュマニア症の患者からのPBMCを、10ng /ml抗IL-12（LeIF＋抗IL-12）またはIL-10（LeIF＋IL-10）の不在（LeIF）または存在下で、10μｇ/ml LbeIF4Aで刺激し、そして培養した上清をIFN-γ分泌についてアッセイした。抗IL-12 mAbおよびIL-10の両方とも、LbeIF4A誘導したIFN -γ分泌の生成を廃棄した。しかし、抗IL-12 mAbのみ、レーシュマン溶解物での刺激後のIFN-γの産生を部分的に低下した（図8B）。これらの結果は、IFN-γ産生がIL-12依存的であり、そしてIL-10によって阻害されるが、IL-12の産生がIFN -ガンマ依存的および非依存的経路によって調節されることを示す。実施例10 マウスにおけるTH1プロフィルのLbeIF4A刺激この実施例は、配列番号２のN-末端の48残基がないLbeIF4Aポリペプチド（実施例３に記載のような）が、BALB/cマウスにおいて優勢なTh1サイトカインプロフィルを刺激することを示す。動物を、アジュバントとしてquilAまたはCFAを使用して、LbeIF4Aまたは8E（L．braziliensisミトコンドリアhsp70のC-末端部分、これは患者PBMCを刺激して高レベルのIL-10を産生する）のいずれかで抗原投与した。抗原投与の10日後、リンパ節（LN）細胞を組換え抗原でインビトロで再刺激し、そして上清培養物を分泌されたサイトカインについて分析した。結果（図11）は、LbeIF4Aで抗原投与したマウスのLN細胞が増殖し、そして両方のタイプのアジュバントを使用するLbeIF4Aでのチャレンジ後にほとんど排他的なTh1サイトカイン（IFN-γ）を分泌したことを示す。反対に、8Eで抗原投与したマウスからのLN細胞は、8Eでのチャレンジへの特異的応答でTh2サイトカインのIL-4およびIL-10に対して強い偏りのある、Th0応答またはTh1/Th2タイプサイトカイン（アジュバントとしてquilAで）を生じた。同様に、寄生虫溶解物で抗原投与したマウスは、混合したサイトカインプロフィルを生じ、その結果は、ワクチン候補として寄生虫溶解物単独の使用に反対する議論をし得る（図11）。これらの結果は、LbeIF4Aが、アジュバントとして、ならびに特異的Ｔ細胞ワクチンとして、使用され得ることを示す。LbeIF4Aが、実験的レーシュマニア症における防御に最も明らかに関連する２つのサイトカイン、IFN-γおよびIL-12 を含む、強力なTh1応答を誘導したので、レーシュマニア症に対してマウスを防御するためのこの抗原の能力を研究した。BALB/cマウスを、アジュバントを含まないLbeIF4Aで１回免疫し、次いで７日後にL．majorでの皮下感染をした。コントロール群と比較して、LbeIF4Aは、L．major感染に対して顕著な防御を与えた（図12）。したがって、L．braziliensisに由来する異種抗原は、L．major感染に対するいくらかの防御を与え得、少なくともいくつかの「防御」エピトープが２つの寄生虫間で保存されることを示唆する。実施例11 LmeIF4A の調製この実施例は、Leishmania majorからのLbeIF4Aの新しい改変体の流用を説明する。 cDNA発現ライブラリーを、ZAP-cDNA無指向性クローニングキット（Stratagene ,La Jolla，CA）を使用して、L．majorのポリＡ⁺RNAで構築した。約500,000pfu を、配列番号１のヌクレオチド258〜1188を含む放射標識したDNAプローブでスクリーニングした。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、0.1％SDSを含む0.5×SSC で55℃であった。これによって、約2.5kbインサートを含むクローン（LmeIF4A）を同定した。pBSK(-)ファージミド配列の切り出しを、製造業者のプロトコルに従って行った。重複クローンをエクソヌクレアーゼIIIによってcDNAインサートから生成し、そしてTaq染料ターミネーターによって配列決定した。 LmeIF4Aの約2.7kb cDNAインサートが、完全なコーディング配列、ならびに5' スプライスしたリーダーおよび3'フランキング配列を含むことが見いだされた。 LmeIF4Aの完全なコーディング配列を含むフラグメントを、5'および3'特異的オリゴヌクレオチドを使用するPCRによって増幅した。5'オリゴヌクレオチドは、A TG開始部位の前にNdeI制限部位を含んでいた。pETベクター（Novagen，Madison, WI）のNdeI部位にクローニングされた場合、タンパク質の最初のアミノ酸は、非融合組換えLmeIF4Aの開始コード（Met）であった。非融合全長rLmeIF4Aを、pET プラスミドベクターおよびT7ポリメラーゼ発現系（Novagen，Madison，WI）を使用してE．coliで生成した。封入体を単離し、そして続いて、２、４、および8M 尿素を含む10mlのTNE（50mM TRIS、pH8.0、100mM NaCl、10mM EDTA）で２回洗浄した。組換え抗原を含む8M尿素画分を、調製用SDS-PAGEゲルに適用した。組換え LmeIF4Aを、調製用ゲルからの電気溶出によってまたはHPLCによってのいずれかで精製した。最終産物は、Limulusアッセイによって決定されたように、無視できるレベルの細菌のエンドトキシンを有した。 LmeIF4A cDNAの部分配列分析は、L．braziliensisから単離した抗原に対して実質的な相同性（ヌクレオチドおよびアミノ酸レベルで）（配列番号３および４）を示した（すなわち、90％以上のアミノ酸配列同一性）。実施例12 抗原特異的CTL応答の誘起この実施例は、上記のように調製したLmeIF4Aを使用する可溶性オバルブミンに対する特定のCTL応答の誘起を説明する。 C57BL/6マウス（H-2^b）を、30μｇの可溶性オバルブミン（Sigman St．Louis, MO）で、単独（オバ単独）でまたはポリラクチドグリセリドビーズ（Southern R esearch Institute，Birmingham，AL）にカプセル化した50μｇのLmeIF4A（Lmei f/PLG）と組み合わせてのいずれかで１回免疫した。マウスの群もまた、PLGビーズにカプセル化されたLmeIF4A（オバ＋Lmeif/PLG）またはPLG単独で免疫した。実験にしようしたビーズのサイズは、１〜10μｍの範囲であった。免疫の３週後、マウスを屠殺し、そして脾臓を取り出した。エフェクター細胞を生成するために、脾臓細胞を調製し、そして５日間の照射（20,000rad）後に、オバ発現EG7.ova細胞でインビトロで刺激した。EG7.ova細胞株を、記載されている（Mooreら、Cell 54:777-785(1988)）ようなβ-アクチンの制御下でオバcDN A含有プラスミドでEL4胸腺腫細胞株（H-2^b）（Infectious Disease Research In stitute，Seatle，WA）をトランスフェクトすることによって生成した。⁵¹Cr標識した非トランスフェクタント親EL4細胞を溶解せずに、⁵¹Cr標識したE G7.ovaを溶解し得るエフェクターの存在によって、抗原投与を評価した。結果を図13に示し、そしてエフェクター対標的細胞の比の関数としての％細胞傷害性として表した。これらの結果は、LmeIF4Aと組み合わせて可溶性オバルブミンで免疫したマウスが、標的細胞を特異的に殺した優れたCTL応答を示すことを証明する。特異的CTL誘起は、LmeIF4A，PLG、または可溶性オバルブミン単独のいずれかで免疫したマウスで検出され得なかった。実施例13 トリニトロフェノール特異的抗体の刺激この実施例は、LmeIF4Aを使用する抗トリニトロフェノール(TNP)抗体の増強を説明する。 C57BL/6マウスを、アラム、LmeIF4A（75μｇ）または生理食塩水のいずれかと組み合わせた３μｇのTNP-KLHで腹腔内に免疫した（０日目）。マウスを10日目に採血し、21日目に追加免疫し（初回と同様）、そして26日目に採血した。血清を、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）によってTNP特異的、イソタイプ特異的抗体応答についてテストした。データを、図14に、直線回帰分析によって算出されたように、各ELISAにおける最大ODの50％を与える各血清の希釈の対数として表す。これらの結果は、抗原単独での免疫と比較して、LmeIF4Aによる抗体応答の著しい増強を示す。特に興味あることは、Th2応答に最も関連する抗体クラスのIgE において顕著な増加が見られなかった。さらに、上記のように、LmeIF4A（75μ ｇ）とのTNP-KLH（３μｇ）の単回注入後に、一次IgMおよびIgG抗体応答を増強した。実施例14 MUC-1 特異的抗体の産生の増強この実施例は、MUC-1特異的抗体の産生を増強させるためのLmeIF4Aの使用を説明する。 C57BL/6マウスを、LmeIF4Aとの種々の組み合わせでヒト腫瘍抗原MUC-1で免疫した。群は、可溶性LmeIF4Aを含むまたは含まない可溶性MUC-1で、および可溶性 LmeIF4Aを含むまたは含まないPLGビーズ上に固定されたMUC-1で、免疫されたマウスを含んだ。MUC-1/PLG実験について、２つの別のビーズサイズを使用した。１バッチのビーズを、１〜10μｍのサイズについて使用したが、他は40〜100μ ｍの範囲であった。免疫の10、20、および30日後、マウスを採血し、そして血清をMUC-1特異的抗体（IgGおよびIgM）の存在についてテストした。血清はまた、 μ、γ2a、γ2b、およびγ1イソタイプの存在についてテストした。図15に示す結果は、MUC-1またはMUC-1＋LmeIF4Aでの１回の免疫は抗MUC-1抗体応答を生じるために十分ではないが、MUC-1がPLGビーズにカプセル化された場合、LmeIF4Aは抗体応答を著しく増強したことを示す。小さなPLGビーズ中のMUC-1 は、初回免疫後10日もの早期に推論できる強い抗MUC-1応答を誘導し、そして調製物へのLmeIF4Aの添加はさらに抗体応答を増強した。大きなビーズ中のMUC-1での１回の免疫は、免疫の10日以内に検出可能な抗MUC-1抗体をなんら産生しなかったが、LmeIF4Aと組み合わせた大きなPLGビーズ中のMUC-1で免疫したマウスでは、増幅された応答が観察された。抗MUC-1抗体の放射性同位元素分布は、IgE応答が検出されないIgM、IgGγ2a，IgGγ2b、およびIgGT1からなった。実施例15 培養された細胞におけるCTL活性の増強この実施例は、培養された細胞におけるLmeIF4Aによる特異的CTL活性の増強を説明する。マウスを、30μｇの可溶性オバルブミンまたはPLGビーズ中にカプセル化された同じ濃度のオバルブミンで免疫した。２週後、脾臓細胞を免疫したマウスから取り出し、そして抗原なし、LmeIF4A単独（10μｇ/ml）、照射したEG7.ova、または照射したEG7.ova＋同じ濃度でのLmeIF4Aでインビトロで刺激した。結果を図 16に示す。これらの結果は、オバルブミン/PLG免疫したマウスが、EG7.ova刺激細胞で応答脾臓細胞を刺激することによって検出され得るオバルブミン特異的CTLをインビボでプライムし得ることを示す。さらに、オバルブミン/PLGプライムした脾臓細胞からのCTL生成は、EG7.ova含有培養物へのLmeIF4A（10μｇ/ml）の添加によって実質的に増大され得る。EG7.ovaまたはEG7.ova＋LmeIF4Aでの最初のインビトロ培養物において、合計の単核細胞カウントが異ならなかったことに注目すべきである（以下の表２および３を参照のこと）。 LmeIF4Aが、インビトロで抗原特異的CTL活性を増強しそして拡大するために使用され得るかどうかについても評価した。上述のオバルブミン/PLG免疫したマウスから生成したCTLを、照射したEG7.ova＋IL-2でまたはEG7.ova＋IL-2およびLme IF4Aでのいずれかで、インビトロで再刺激した。培養の５日後、エフェクター細胞を、⁵¹Cr標識したEL4細胞またはEG7.ova細胞に対してテストした。図17に示す結果は、EG7.ova＋LmeIF4AおよびIL-2で再刺激したオバルブミン特異的CTLが、EG7.ova＋IL-2単独で生成した同じエフェクターよりもよくEG7.ova 細胞を殺したが、差が有意ではないようであることを示す。しかし、細胞カウントが行われる場合、LmeIF4Aとの培養物は、LmeIF4Aを含まない培養物よりも2.5 倍高い細胞を産生した。以下の表４に示すこれらの結果は、培養物当たりの溶解ユニットで表され、そしてインビトロで特異的CTL数を広げるためのLmeIF4Aの全体にわたる強度を示す。実施例16 LmeIF4A によるアロ反応性CTLの誘導の増大この実施例は、LmeIF4Aによるマウスアロ反応性CTLの誘導を説明する。 2.5×10⁶BALB/c牌臓細胞を、10μｇ/mlゲル精製したLmeIF4Aの存在または非存在下での２mlのRPMI:FCS中で、５×10⁶照射した（3500R）C57BL/6脾臓細胞とともに培養した。培養物を５日目に採取し、洗浄し、そして200μｌ培養物中４時間の放出アッセイにおいて、⁵¹Cr標識したEL4細胞（2,000/ウェル）に対する細胞溶解活性について、種々のエフェクター細胞濃度（培養物画分）でテストした。データを、図18に、特異的放出の％として表し、これは以下のように算出する： 100 ×（CPM実験）−（CPM自然）（CPM最大）−（CPM自然）これらの結果は、LmeIF4Aがアロ反応性CTLを著しく増強し得ることを示す。上記の他の結果とともに、Leishmania eIF4Aホモログは、種々のアッセイシステムにおいて強力なアジュバント活性を有するようである。さらに、毒性がないことともに、IL-12を誘導するその能力は、これを独特のアジュバントにする。実施例17 LmeIF4A および抗原の投与後の腫瘍退行６〜８週齢の雌C57BL/6（H-2^b）マウスを、50μｇ LmeIF4Aの単独またはポリラクチドグリコリドビーズでカプセル化された30μｇ（LbeIF/PLG）、単独またはPLGビーズ中のVSVペプチド、PLGビーズ中のGM-CSF、またはベヒクル（PBS）のいずれかで、皮下注入で１回免疫した。N1細胞を、VSV（小水泡性口内炎ウイルス）ヌクレオキャプシドタンパク質遺伝子のトランスフェクションによって、EL 4細胞から生成した。VSVヌクレオキャプシドタンパク質の発現を指示するプラスミドが、選択可能マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を含むので、細胞株を、G418を含む選択培地中で維持した。組換えLmeIF4Aを、E．coliトランスフェクタントから産生し、そしてHPLC分画によって精製した。N1-特異的ペプチド抗原を化学的に合成し、そしてまたHPLCによって精製した。タンパク質を、Southern Research Institute（Birmingham，AL）によるPLGマイクロスフェア中にカプセル化した。約２×10⁵N1細胞を、C57BL/6マウスの右脇腹に皮内接種した。触知できる腫瘍を樹立した後、マウスを５匹の群にランダム化し、そして反対の脇腹に上記の種々のペプチドの皮下注入を与えた。腫瘍増殖を、２または３日毎に腫瘍の直径を測定すること、および式Ｖ＝4/3πr³に従って測定値を体積に変換することによってモニターした。腫瘍特異的抗原に対する免疫応答を誘起することにおけるLmeIF4Aの効率をテストした。マウス腫瘍N1において、オクタマー抗原性ペプチドエピトープRGYVYQ GLは、H-2K^b分子によって構成的に示される。図19に示すように、VSV/PLGおよび LmeIF4Aの注入された組み合わせの結果、腫瘍増殖を著しく抑制した。退行は、コントロールマウスにおいて、または抗原の他の組み合わせを受けているマウスにおいて、観察されなかった。第２の研究（図20）はこの結果を確認し、そしてまたLmeIF4AがGM-CSFよりも非常に良いアジュバントであることを示した。この実験において、腫瘍は、腫瘍特異的VSV/PLGおよびLmeIF4A/PLGとともに投与されたマウスにおける抗原注入の１週後に退行し始めた。実際に、５匹のうち３匹のマウスは、この特定の研究においてその腫瘍を完全に拒絶した。さらに、可溶性 LeIFはまた、PLGカプセル化したVSVペプチドと組み合わせて強力な抗腫瘍活性を有した（図21）。さらに、LmeIF4Aおよび腫瘍抗原の同時免疫によって生成した免疫応答は非常に特異的であった。N1細胞を完全には拒絶しなかったマウスにおける残りの腫瘍塊を、外科的に取り出した。これらの腫瘍細胞を、0.2mg/mlのG418を含む培地中で培養した場合、これらは２日後に死なした。反対に、腫瘍接種に使用された元のN1細胞はG418に耐性であった。したがって、残りの腫瘍は、抗原性VSV配列およびネオマイシン耐性遺伝子の両方を含む発現プラスミドを失っているN1変異体に由来した。したがって、LeIFは、所定の抗原に対する特異的免疫応答をブーストし得、これは順に、腫瘍に対する治療的効果に導き得る。実施例18 LmeIF での樹立された腫瘍の処置雌C57BL/6マウスに、２×10⁵Lewis肺ガン腫細胞を皮下注射した。注射の８日後、腫瘍をすべてのマウスで検出した。次いで、マウスを各５匹のマウスの２つの群に分けた。腫瘍接種の８、10、13、および16日後に、マウスに、0.2ml生理食塩水または0.2ml生理食塩水中50μｇ LmeIFを、腫瘍から離れた部位に皮下注射した。腫瘍増殖を、８、10、13、および16日目に測定した。以下の表に示すように、LmeIFを受けているマウスは、16日目までに実質的に腫瘍増殖を縮小した。上記のことから、本発明の特定の実施態様は例示の目的で本命最初に記載されているが、種々の改変が本発明の意図および範囲から逸脱せずに行われ得ることが理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 43/00 １２１ 43/00 １２１Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｑ 1/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号０８／６３４，６４２ (32)優先日平成８年４月18日(1996．4．18) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．抗原およびLbeIF4Aポリペプチドを含む組成物であって、該LbeIF4Aポリペプチドが、 (a)配列番号１のヌクレオチド115〜1323； (b)中程度のストリンジェント条件下で配列番号１のヌクレオチド115〜1323に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズするDNA配列であって、該DNA配列が、Leishmania感染した個体から得られる末梢血単核細胞中でTh1免疫応答を刺激するポリペプチドをコードするDNA配列、からなる群より選択されるDNA配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、患者において抗原に対する免疫応答を増強または誘起するための医薬品の製造への使用のための、組成物。２．前記LbeIF4Aポリペプチドが配列番号２のアミノ酸49〜403を含む、請求項１に記載の組成物。３．前記LbeIF4Aポリペプチドが配列番号２のアミノ酸１〜403またはその一部を含む、請求項１に記載の組成物。４．前記LbeIF4Aポリペプチドが免疫グロブリンFc領域をさらに含む、請求項１に記載の組成物。５．抗原およびLmeIF4Aポリペプチドを含む組成物であって、該LmeIF4Aポリペプチドが、 (a)配列番号３のヌクレオチド117〜1325； (b)中程度のストリンジェント条件下で配列番号３のヌクレオチド117〜1325に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズするDNA配列であって、該DNA配列が、LeiShmania感染した個体から得られる末梢血単核細胞中でTh1免疫応答を刺激するポリペプチドをコードするDNA配列、からなる群より選択されるDNA配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、患者において抗原に対する免疫応答を増強または誘起するための医薬品の製造への使用のための、組成物。６．前記LmeIF4Aポリペプチドが配列番号４のアミノ酸49〜403を含む、請求項５に記載の組成物。７．前記LmeIF4Aポリペプチドが配列番号４のアミノ酸１〜403またはその一部を含む、請求項５に記載の組成物。８．前記LmeIF4Aポリペプチドが免疫グロブリンFc領域をさらに含む、請求項５に記載の組成物。９．抗原およびLbeIF4Aポリペプチドを含む組成物であって、該LbeIF4Aが配列番号２のアミノ酸１〜403またはその改変体を含み、該改変体が保存的置換および／または改変においてのみ異なる、患者において抗原に対する免疫応答を増強または誘起するための医薬品の製造への使用のための、組成物。１０．抗原およびLmeIF4Aポリペプチドを含む組成物であって、該LbeIF4Aが配列番号４のアミノ酸１〜403またはその改変体を含み、該改変体が保存的置換および／または改変においてのみ異なる、患者において抗原に対する免疫応答を増強または誘起するための医薬品の製造への使用のための、組成物。１１．前記抗原および前記LbeIF4AまたはLmeIF4Aポリペプチドが、同じ組成物中に存在する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。１２．前記抗原が、生分解性マイクロスフェア中にカプセル化される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。１３．前記LbeIF4AまたはLmeIF4Aポリペプチドが、生分解性マイクロスフェア中にカプセル化されるかまたは表面に結合される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。１４．前記抗原および前記LbeIF4AまたはLmeIF4Aポリペプチドが、生分解性マイクロスフェア中にカプセル化される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。１５．DNAワクチンおよびLbeIF4Aポリペプチドを含む組成物であって、該LbeI F4Aポリペプチドが、 (a)配列番号１のヌクレオチド115〜1323； (b)中程度のストリンジェント条件下で配列番号１のヌクレオチド115〜1323に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズするDNA配列であって、該DNA配列が、Leishmania感染した個体から得られる末梢血単核細胞中でTh1免疫応答を刺激するポリペプチドをコードするDNA配列、からなる群より選択されるDNA配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、患者においてDNAワクチンに対する免疫応答を増強または誘起するための医薬品の製造への使用のための、組成物。１６．前記LbeIF4Aポリペプチドが配列番号２のアミノ酸49〜403を含む、請求項１５に記載の組成物。１７．前記LbeIF4Aポリペプチドが配列番号２のアミノ酸１〜403またはその一部を含む、請求項１５に記載の組成物。１８．前記LbeIF4Aポリペプチドが免疫グロブリンFc領域をさらに含む、請求項１５に記載の組成物。１９．DNAワクチンおよびLmeIF4Aポリペプチドを含む組成物であって、該LmeI F4Aポリペプチドが、 (a)配列番号３のヌクレオチド117〜1325； (b)中程度のストリンジェント条件下で配列番号３のヌクレオチド117〜1325 に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズするDNA配列であって、該DNA配列が、Leishmania感染した個体から得られる末梢血単核細胞中でTh1免疫応答を刺激するポリペプチドをコードするDNA配列、からなる群より選択されるDNA配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、患者においてDNAワクチンに対する免疫応答を増強または誘起するための医薬品の製造への使用のための、組成物。２０．前記LmeIF4Aポリペプチドが配列番号４のアミノ酸49〜403を含む、請求項１９に記載の組成物。２１．前記LmeIF4Aポリペプチドが配列番号４のアミノ酸１〜403またはその一部を含む、請求項１９に記載の組成物。２２．前記LmeIF4Aポリペプチドが免疫グロブリンFc領域をさらに含む、請求項１９に記載の組成物。２３．DNAワクチンおよびLbeIF4Aポリペプチドを含む組成物であって、該LbeI F4Aが配列番号２のアミノ酸１〜403またはその改変体を含み、該改変体が保存的置換および／または改変においてのみ異なる、患者においてDNAワクチンに対する免疫応答を増強または誘起するための医薬品の製造への使用のための、組成物。２４．DNAワクチンおよびLmeIF4Aポリペプチドを含む組成物であって、該LmeI F4Aが配列番号４のアミノ酸１〜403またはその改変体を含み、該改変体が保存的置換および／または改変においてのみ異なる、患者においてDNAワクチンに対する免疫応答を増強または誘起するための医薬品の製造への使用のための、組成物。２５．前記DNAワクチンおよび前記LbeIF4AまたはLmeIF4Aポリペプチドが、同じ組成物中に存在する、請求項１５〜２４のいずれか一項に記載の組成物。２６．前記DNAワクチンが、生分解性マイクロスフェア中にカプセル化される、請求項１５〜２４のいずれか一項に記載の組成物。２７．前記LbeIF4AまたはLmeIF4Aポリペプチドが、生分解性マイクロスフェア中にカプセル化されるかまたは表面に結合される、請求項１５〜２４のいずれか一項に記載の組成物。２８．前記DNAワクチンおよび前記LbeIF4AまたはLmeIF4Aポリペプチドが、生分解性マイクロスフェア中にカプセル化される、請求項１５〜２４のいずれか一項に記載の組成物。２９．LbeIF4Aポリペプチドを含む組成物であって、該LbeIF4Aポリペプチドが、 (a)配列番号１のヌクレオチド115〜1323； (b)中程度のストリンジェント条件下で配列番号１のヌクレオチド115〜1323に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズするDNA配列であって、該DNA配列が、Leishmania感染した個体から得られる末梢血単核細胞中でTh1免疫応答を刺激するポリペプチドをコードするDNA配列、からなる群より選択されるDNA配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、患者において抗原に対する免疫応答を増強または誘起するための医薬品の製造への使用のための、組成物。３０．LmeIF4Aポリペプチドを含む組成物であって、該LmeIF4Aポリペプチドが、 (a)配列番号３のヌクレオチド117〜1325； (b)中程度のストリンジェント条件下で配列番号３のヌクレオチド117〜1325に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズするDNA配列であって、該DNA配列が、Leishmania感染した個体から得られる末梢血単核細胞中でTh1免疫応答を刺激するポリペプチドをコードするDNA配列、からなる群より選択されるDNA配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、患者において抗原に対する免疫応答を増強または誘起するための医薬品の製造への使用のための、組成物。３１．生物学的試料中で免疫応答を増強または誘起する方法であって、生物学的試料を抗原およびLbeIF4Aポリペプチドと接触させる工程を包含し、該LbeIF4A ポリペプチドが、 (a)配列番号１のヌクレオチド115〜1323； (b)中程度のストリンジェント条件下で配列番号１のヌクレオチド115〜1323に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズするDNA配列であって、該DNA配列が、Leishmania感染した個体から得られる末梢血単核細胞中でTh1免疫応答を刺激するポリペプチドをコードするDNA配列、からなる群より選択されるDNA配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、そして該生物学的試料が、末梢血単核細胞、単球、Ｂ細胞、樹枝状細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される細胞を含む、方法。３２．生物学的試料中で免疫応答を増強または誘起する方法であって、該生物学的試料を抗原およびLmeIF4Aポリペプチドと接触させる工程を包含し、該LmeIF 4Aポリペプチドが、 (a)配列番号３のヌクレオチド117〜1325； (b)中程度のストリンジェント条件下で配列番号３のヌクレオチド117〜1325に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズするDNA配列であって、該DNA配列が、Leishmania感染した個体から得られる末梢血単核細胞中でTh1免疫応答を刺激するポリペプチドをコードするDNA配列、からなる群より選択されるDNA配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、そして該生物学的試料が、末梢血単核細胞、単球、Ｂ細胞、樹枝状細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される細胞を含む、方法。３３．生物学的試料中で免疫応答を増強または誘起する方法であって、該生物学的試料をDNAワクチンおよびLbeIF4Aポリペプチドと接触させる工程を包含し、該LbeIF4Aポリペプチドが、 (a)配列番号１のヌクレオチド115〜1323； (b)中程度のストリンジェント条件下で配列番号１のヌクレオチド115〜1323に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズするDNA配列であって、該DNA配列が、Leishmania感染した個体から得られる末梢血単核細胞中でTh1免疫応答を刺激するポリペプチドをコードするDNA配列、からなる群より選択されるDNA配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、そして該生物学的試料が、末梢血単核細胞、単球、Ｂ細胞、樹枝状細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される細胞を含む、方法。３４．生物学的試料中で免疫応答を増強または誘起する方法であって、該生物学的試料をDNAワクチンおよびLmeIF4Aポリペプチドと接触させる工程を包含し、該LmeIF4Aポリペプチドが、 (a)配列番号３のヌクレオチド117〜1325； (b)中程度のストリンジェント条件下で配列番号３のヌクレオチド117〜1325に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズするDNA配列であって、該DNA配列が、Leishmania感染した個体から得られる末梢血単核細胞中でTh1免疫応答を刺激するポリペプチドをコードするDNA配列、からなる群より選択されるDNA配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、そして該生物学的試料が、末梢血単核細胞、単球、Ｂ細胞、樹枝状細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される細胞を含む、方法。３５．生物学的試料中で免疫応答を増強または誘起する方法であって、該生物学的試料をLbeIF4Aポリペプチドと接触させる工程を包含し、該LbeIF4Aポリペプチドが、 (a)配列番号１のヌクレオチド115〜1323； (b)中程度のストリンジェント条件下で配列番号１のヌクレオチド115〜1323に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズするDNA配列であって、該DNA配列が、Leishmania感染した個体から得られる末梢血単核細胞中でTh1免疫応答を刺激するポリペプチドをコードするDNA配列、からなる群より選択されるDNA配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、そして該生物学的試料が、末梢血単核細胞、単球、Ｂ細胞、樹枝状細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される細胞を含む、方法。３６．生物学的試料中で免疫応答を増強または誘起する方法であって、該生物学的試料をLmeIF4Aポリペプチドと接触させる工程を包含し、該LmeIF4Aポリペプチドが、 (a)配列番号３のヌクレオチド117〜1325； (b)中程度のストリンジェント条件下で配列番号３のヌクレオチド117〜1325に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズするDNA配列であって、該DNA配列が、Leishmania感染した個体から得られる末梢血単核細胞中でTh1免疫応答を刺激するポリペプチドをコードするDNA配列、からなる群より選択されるDNA配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、そして該生物学的試料が、末梢血単核細胞、単球、Ｂ細胞、樹枝状細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される細胞を含む、方法。３７．腫瘍抗原およびLbeIF4Aポリペプチドを含む組成物であって、該LbeIF4A ポリペプチドが、 (a)配列番号１のヌクレオチド115〜1323； (b)中程度のストリンジェント条件下で配列番号１のヌクレオチド115〜1323に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズするDNA配列であって、該DNA配列が、Leishmania感染した個体から得られる末梢血単核細胞中でCTL応答を刺激するポリペプチドをコードするDNA配列、からなる群より選択されるDNA配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、患者において腫瘍に対する免疫応答を増強または誘起するための医薬品の製造への使用のための、組成物。３８．前記LbeIF4Aポリペプチドが配列番号２のアミノ酸49〜403を含む、請求項３７に記載の組成物。３９．腫瘍抗原およびLmeIF4Aポリペプチドを含む組成物であって、該LmeIF4A ポリペプチドが、 (a)配列番号３のヌクレオチド117〜1325； (b)中程度のストリンジェント条件下で配列番号３のヌクレオチド117〜1325に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズするDNA配列であって、該DNA配列が、Leishmania感染した個体から得られる末梢血単核細胞中でCTL応答を刺激するポリペプチドをコードするDNA配列、からなる群より選択されるDNA配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、患者において腫瘍に対する免疫応答を増強または誘起するための医薬品の製造への使用のための、組成物。４０．前記LmeIF4Aポリペプチドが配列番号４のアミノ酸49〜403を含む、請求項３９に記載の組成物。４１．腫瘍抗原およびLbeIF4Aポリペプチドを含む組成物であって、該LbeIF4A が配列番号２のアミノ酸49〜403またはその改変体を含み、該改変体が保存的置換および／または改変においてのみ異なる、患者において腫瘍に対する免疫応答を増強または誘起するための医薬品の製造への使用のための、組成物。４２．腫瘍抗原およびLmeIF4Aポリペプチドを含む組成物であって、該LmeIF4A が配列番号４のアミノ酸49〜403またはその改変体を含み、該改変体が保存的置換および／または改変においてのみ異なる、患者において腫瘍に対する免疫応答を増強または誘起するための医薬品の製造への使用のための、組成物。４３．腫瘍抗原をコードするDNAワクチンおよびLbeIF4Aポリペプチドを含む組成物であって、該LbeIF4Aポリペプチドが、 (a)配列番号１のヌクレオチド115〜1323； (b)中程度のストリンジェント条件下で配列番号１のヌクレオチド115〜1323に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズするDNA配列であって、該DNA配列が、Leishmania感染した個体から得られる末梢血単核細胞中でCTL応答を刺激するポリペプチドをコードするDNA配列、からなる群より選択されるDNA配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、患者において腫瘍に対する免疫応答を増強または誘起するための医薬品の製造への使用のための、組成物。４４．前記LbeIF4Aポリペプチドが配列番号２のアミノ酸49〜403を含む、請求項４３に記載の組成物。４５．腫瘍抗原をコードするDNAワクチンおよびLmeIF4Aポリペプチドを含む組成物であって、該LmeIF4Aポリペプチドが、 (a)配列番号３のヌクレオチド117〜1325； (b)中程度のストリンジェント条件下で配列番号３のヌクレオチド117〜1325に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズするDNA配列であって、該DNA配列が、Leishmania感染した個体から得られる末梢血単核細胞中でCTL応答を刺激するポリペプチドをコードするDNA配列、からなる群より選択されるDNA配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、患者において腫瘍に対する免疫応答を増強または誘起するための医薬品の製造への使用のための、組成物。４６．前記LmeIF4Aポリペプチドが配列番号４のアミノ酸49〜403を含む、請求項４５に記載の組成物。４７．腫瘍抗原をコードするDNAワクチンおよびLbeIF4Aポリペプチドを含む組成物であって、該LbeIF4Aが配列番号２のアミノ酸49〜403またはその改変体を含み、該改変体が保存的置換および／または改変においてのみ異なる、患者において腫瘍に対する免疫応答を増強または誘起するための医薬品の製造への使用のための、組成物。４８．腫瘍抗原をコードするDNAワクチンおよびLmeIF4Aポリペプチドを含む組成物であって、該LmeIF4Aが配列番号４のアミノ酸49〜403またはその改変体を含み、該改変体が保存的置換および／または改変においてのみ異なる、患者において腫瘍に対する免疫応答を増強または誘起するための医薬品の製造への使用のための、組成物。４９．LbeIF4Aポリペプチドであって、 (a)配列番号１のヌクレオチド115〜1323； (b)中程度のストリンジェント条件下で配列番号１のヌクレオチド115〜1323に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズするDNA配列であって、該DNA配列が、Leishmania感染した個体から得られる末梢血単核細胞中でCTL応答を刺激するポリペプチドをコードするDNA配列、からなる群より選択されるDNA配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、患者において腫瘍に対する免疫応答を増強または誘起するための医薬品の製造への使用のための、ポリペプチド。５０．LmeIF4Aポリペプチドであって、 (a)配列番号３のヌクレオチド117〜1325； (b)中程度のストリンジェント条件下で配列番号３のヌクレオチド117〜1325に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズするDNA配列であって、該DNA配列が、Leishmania感染した個体から得られる末梢血単核細胞中でCTL応答を刺激するポリペプチドをコードするDNA配列、からなる群より選択されるDNA配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、患者において腫瘍に対する免疫応答を増強または誘起するための医薬品の製造への使用のための、ポリペプチド。５１．前記LbeIF4AまたはLmeIF4Aポリペプチドが、生分解性マイクロスフェア中にカプセル化されるかまたは表面に結合される、請求項３９〜５０のいずれか一項に記載の組成物。５２．サイトカインおよび化学療法剤からなる群より選択される治療薬剤をさらに含む、請求項４９または５０のいずれかに記載の組成物。５３．抗原およびウイルスベクターを含む組成物であって、該ウイルスベクターが、該ウイルスベクターで感染した患者細胞中でLbeIF4AまたはLmeIF4Aポリペプチドの発現を指示する、患者において抗原に対する免疫応答を増強または誘起するための医薬品の製造への使用のための、組成物。５４．抗原および核酸分子を含む組成物であって、該核酸分子が、該核酸分子でトランスフェクトされた患者細胞中でLbeIF4AまたはLmeIF4Aポリペプチドの発現を指示する、患者において抗原に対する免疫応答を増強または誘起するための医薬品の製造への使用のための、組成物。５５．DNAワクチンおよびウイルスベクターを含む組成物であって、該ウイルスベクターが、該ウイルスベクターで感染した患者細胞中でLbeIF4AまたはLmeIF 4Aポリペプチドの発現を指示する、患者においてDNAワクチンに対する免疫応答を増強または誘起するための医薬品の製造への使用のための、組成物。５６．DNAワクチンおよび核酸分子を含む組成物であって、該核酸分子が、該核酸分子でトランスフェクトされた患者細胞中でLbeIF4AまたはLmeIF4Aポリペプチドの発現を指示する、患者においてDNAワクチンに対する免疫応答を増強または誘起するための医薬品の製造への使用のための、組成物。５７．ウイルスベクターを含む組成物であって、該ウイルスベクターが、該ウイルスベクターで感染した患者細胞中でLbeIF4AまたはLmeIF4Aポリペプチドの発現を指示する、患者において抗原に対する免疫応答を増強または誘起するための医薬品の製造への使用のための、組成物。５８．核酸分子を含む組成物であって、該核酸分子が、該核酸分子でトランスフェクトされた患者細胞中でLbeIF4AまたはLmeIF4Aポリペプチドの発現を指示する、患者において抗原に対する免疫応答を増強または誘起するための医薬品の製造への使用のための、組成物。５９．腫瘍抗原およびウイルスベクターを含む組成物であって、該ウイルスベクターが、該ウイルスベクターで感染した患者細胞中でLbeIF4AまたはLmeIF4Aポリペプチドの発現を指示する、患者において腫瘍に対する免疫応答を増強または誘起するための医薬品の製造への使用のための、組成物。６０．腫瘍抗原および核酸分子を含む組成物であって、該核酸分子が、該核酸分子でトランスフェクトされた患者細胞中でLbeIF4AまたはLmeIF4Aポリペプチドの発現を指示する、患者において腫瘍に対する免疫応答を増強または誘起するための医薬品の製造への使用のための、組成物。６１．腫瘍抗原をコードするDNAワクチンおよびウイルスベクターを含む組成物であって、該ウイルスベクターが、該ウイルスベクターで感染した患者細胞中でLbeIF4AまたはLmeIF4Aポリペプチドの発現を指示する、患者において腫瘍に対する免疫応答を増強または誘起するための医薬品の製造への使用のための、組成物。６２．腫瘍抗原をコードするDNAワクチンおよび核酸分子を含む組成物であって、該核酸分子が、該核酸分子でトランスフェクトされた患者細胞中でLbeIF4A またはLmeIF4Aポリペプチドの発現を指示する、患者において腫瘍に対する免疫応答を増強または誘起するための医薬品の製造への使用のための、組成物。６３．ウイルスベクターを含む組成物であって、該ウイルスベクターが、該ウイルスベクターで感染した患者細胞中でLbeIF4AまたはLmeIF4Aポリペプチドの発現を指示する、患者において腫瘍を処置するための医薬品の製造への使用のための、組成物。６４．核酸分予を含む組成物であって、該核酸分子が、該核酸分子でトランスフェクトされた患者細胞中でLbeIF4AまたはLmeIF4Aポリペプチドの発現を指示する、患者において腫瘍を処置するための医薬品の製造への使用のための、組成物。６５．請求項５３〜６４のいずれか一項に記載の組成物であって、前記ポリペプチドが、 (a)配列番号１のヌクレオチド115〜1323； (b)中程度のストリンジェント条件下で配列番号１のヌクレオチド115〜1323に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズするDNA配列であって、該DNA配列が、Leishmania感染した個体から得られる末梢血単核細胞中でTh1免疫応答を刺激するポリペプチドをコードするDNA配列、からなる群より選択されるDNA配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、LbeIF4Aポリペプチドである、組成物。６６．前記LbeIF4Aポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸49〜403を含む、請求項６５に記載の組成物。６７．前記LbeIF4Aポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸１〜403またはその一部を含む、請求項６５に記載の組成物。６８．請求項５３〜６４のいずれか一項に記載の組成物であって、前記ポリペプチドが、 (a)配列番号３のヌクレオチド117〜1325； (b)中程度のストリンジェント条件下で配列番号３のヌクレオチド117〜1325に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズするDNA配列であって、該DNA配列が、Leishmania感染した個体から得られる末梢血単核細胞中でTh1免疫応答を刺激激するポリペプチドをコードするDNA配列、からなる群より選択されるDNA配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、LmeIF4Aポリペプチドである、組成物。６９．前記LmeIF4Aポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸49〜403を含む、請求項６８に記載の組成物。７０．前記LmeIF4Aポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸１〜403またはその一部を含む、請求項６８に記載の組成物。７１．前記ウイルスベクターもまた、前記抗原の発現を指示する、請求項５３または５９に記載の組成物。７２．前記核酸分子もまた、前記抗原の発現を指示する、請求項５４または６０に記載の組成物。