KR100689739B1 - 단백질 및 펩티드 항원의 면역원성을 증강시키는 Ｆｃ융합 단백질 - Google Patents

단백질 및 펩티드 항원의 면역원성을 증강시키는 Ｆｃ융합 단백질 Download PDF

Info

Publication number
KR100689739B1
KR100689739B1 KR1020027000879A KR20027000879A KR100689739B1 KR 100689739 B1 KR100689739 B1 KR 100689739B1 KR 1020027000879 A KR1020027000879 A KR 1020027000879A KR 20027000879 A KR20027000879 A KR 20027000879A KR 100689739 B1 KR100689739 B1 KR 100689739B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antigen
adjuvant
fusion protein
delete delete
protein
Prior art date
Application number
KR1020027000879A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20020020794A (ko
Inventor
길리어스스테판디
로킨밍
웨솔로우스키존에스쥬니어
Original Assignee
이엠디 렉시겐 리서치 센터 코프.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 이엠디 렉시겐 리서치 센터 코프. filed Critical 이엠디 렉시겐 리서치 센터 코프.
Publication of KR20020020794A publication Critical patent/KR20020020794A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100689739B1 publication Critical patent/KR100689739B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A61K2039/55533—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6056—Antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
    • Y10S930/141—Interleukin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본원에 개시된 발명은 포유 동물에서 미리선택된 단백질 또는 펩티드 항원의 면역원성을 증강시키는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 면역원성은, 미리선택된 항원을 면역글로불린 중쇄 불변부에 융합시켜 Fc-항원 융합 단백질을 생산함으로써 증강된다. Fc-항원 융합 단백질은 항원 제시 세포의 표면상에서 Fc 수용체에 결합함으로써 포유 동물에서 항원을 항원 제시 세포로 표적화한다. 또한, 미리선택된 항원에 대한 특정 면역 반응을 증강시키거나 조절하는 Fc-항원 융합 단백질과 함께 사용하기 위한 아쥬반트류, 예를 들어, Fc-아쥬반트 융합 단백질을 개시하고 있다.

Description

단백질 및 펩티드 항원의 면역원성을 증강시키는 Ｆｃ 융합 단백질{FC FUSION PROTEINS FOR ENHANCING THE IMMUNOGENICITY OF PROTEIN AND PEPTIDE ANTIGENS}
본 발명은 일반적으로 포유류에서 미리선택된 단백질 또는 펩티드 항원의 면역원성을 증강하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 면역글로불린 중쇄 불변부 및 미리선택된 항원을 함유하는 융합 단백질을 나타내는 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 핵산을 포함하는 방법 및 조성물에 관한 것이며, 이때 융합 단백질의 미리선택된 항원은 미리선택된 항원 단독에 비해 포유류에서 더욱 강한 면역 반응을 이끌어 낼 수 있다.
종래의 백신의 발전은 병원균을 중화시킬 수 있는 보호 항체를 제조하는 것에 촛점이 맞추어져 있었다. 오늘날까지, 백신으로 사용된 제제는 통상 불활성화된 또는 약화된 미생물(예컨대, 박테리아 또는 바이러스), 그들의 생성물(예컨대, 독소) 또는 정제된 항원을 포함한다. 현대 분자 생물학 및 유전자 클로닝 방법론의 출현으로, 보다 순수하고 명백하게 보다 특이적인 백신을 제조할 수 있게 되었다. 더욱이, 분자 수준에서의 면역계의 지식은 병원균에 의해 자극된 면역 반응의 분리 및 성상을 가능하게 하였다. 면역 반응의 성공적인 생성에 대해 중심이 되는 것으 로 여겨지는 면역계의 2가지 요소로서 조절의 세포독성 T 세포의 중추적 역할 및 항원이 항원 제시 세포(APC)에 의해 이들 세포에 생성되는 방법을 들 수 있다. 예컨대, W.E.Paul,ed.(1993) FUNDAMENTALS OF IMMUNOLOGY, Raven Press, Ltd., New York을 참조하라.
통상, APC(외인성 항원)의 외부로부터 공여된 단백질 항원 또는 펩티드 항원은 APC의 엔도사이토시스의 소포 또는 엔도좀내에서 변성되고, 거기서 생성된 펩티드 단편이 주요 조직적합성 클래스(MHC) 클래스 II 단백질과의 복합체를 형성한다. 생성된 복합체는 세포 표면으로 이동하는데, 여기서 복합체는 APC에 이웃한 면역 세포에 나타난다. 펩티드 단편은 MHC 분자에 의해 한정된 홈에 일치하므로 복합체에 결합 특이성을 갖는 T 세포 수용체를 발현하는 T 세포에 의해 상기 복합체가 인식될 수 있다. 펩티드-부하 MHC 클래스 II 분자와 헬퍼 T 세포 사이의 상호작용(CD4 T 세포로서 당업계에서 언급됨)은 MHC 클래스 II 분자 그 자체와 CD4+ 수용체 사이의 다른 상호작용에 의해 T 세포의 표면상에 더욱 안정화될 수 있다. 따라서 APC 세포내에서 처리된 외인성 항원은 MHC 클래스 II 분자를 통해 세포 표면상에 나타난다. MHC 클래스 II 복합체는 CD4+ T 세포에 나타날 경우, B 세포가 펩티드에 대한 항체를 생산하도록 자극하는 CD4+ 헬퍼 세포 분비 사이토킨을 생성한다. Paul 참조(상동).
외인성 항원으로의 예방접종은 통상 항체가 생성되는 CD4-세포 매개 T 세포 반응을 일반적으로 생성한다. 세포독성 T 세포(CTL)는 통상 상기와 같은 경로에 의해 자극되지 않는다. CTL은 항원이 APC 그 자체의 내부(내인성 항원)로부터 유래하 는 경우에 자극되는 것이 명백하며, 예컨대 암 세포에서 암-특이적 단백질 또는 바이러스성 감염된 세포에서 바이러스 단백질의 생성을 통해 이루어진다. 사실상, 많은 바이러스성 질환에서 CTL의 생성은 바이러스 감염 세포를 제거하여 감염증으로부터 회복되는 점에서 중요하다고 여겨진다.
연구결과가 내인성 및 외인성 항원이 다르게 처리된다는 것을 보여준다. 신생 폴리펩티드의 합성 동안, 폴리펩티드의 일부가 프로테오좀으로 불리우는 세포내 구조에 의해 변성된다. MHC 클래스 II 분자가 아니라 새로이 합성된 MHC 클래스 I 과의 이러한 프로세싱 복합체로부터 유래된 단편에서, MHC 클래스 I 복합체를 포함하는 생성된 항원이 세포 표면으로 이동된다. 또한, 특정 펩티드 단편에 특이적인 T 세포는 T 세포와 결합하지만, 이 경우, MHC 클래스 I 분자와 CD8 분자 사이에서 필요한 공-수용체 상호작용이 발생한다. 따라서, APC 표면상의 내인성 항원이 CD8+ T세포에 나타난다. 세포독성이 아닌 CD8+ T 세포의 일부 형태가 존재함에도 불구하고, CD8+T 세포는 CTL의 대부분을 형성한다.
따라서, 항원성 분자(일반적으로 단백질)를 필요로 하는 것인, 강한 CTL 반응을 유도할 수 있는 백신의 디자인이 세포 내부에서 제조되거나 적절한 세포 구획으로 전달되어 MHC 클래스 I 프로세싱 경로로 진입할 수 있는 것으로 보인다. 한가지 전략은 관심있는 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 유전자를 바이러스로 삽입하여, 처리된 바이러스를 백신으로 사용하는 것이다(Lorenz et al. (1999) HUM. GENE THER. 10:623-631). 다른 전략은 단백질-암호화 DNA 벡터를 세포에게 주사한 후 상기 세포를 동물 또는 환자에게 투여하는 것인데, 이때 세포내에서부터 DNA가 발현되며 MHC 클래스 I 분자를 통해 세포 표면상에 나타난다(Donnelly et al. (1997) ANNU. REV.IMMUNOL. 15:617). DNA 벡터를 직접 근육 또는 피부에 주사하는 간단한 기술은 CTL 및/또는 몇개의 항원에 대한 항체 반응을 유도하는 것으로 보인다(Lai et al. (1988) CRIT.REV.IMMUNOL. 18:449-484 및 미국 특허 제5,589,466호). 항원을 취하여 APC로 처리하고 이것dl 면역계에 나타난다는 것이 연구되었다(Lai et al., 상동)
외인성 펩티드 또는 단백질의 MHC 클래스 I 경로로의 전달은 스쿠알렌 및 계면활성제의 혼합물과 프레운드(Freund) 아쥬반트와 같은 화학적 아쥬반트의 사용을 통해 (Hilgers et al. (1999) VACCINE 17:219-228), 보다 최근에는 마크로파지에 의한 식균되고 대안적인 MHC 클래스 I 경로를 통해 CTL 반응을 유도한 작은 항원-코팅 비즈를 사용함으로써(De Bruijin et al. (1995) EUR.J.IMMUNOL. 25:1274-1285) 부분적으로 성공하였다. 더욱이, 항원에 대한 면역 반응을 증강하기 위한 다른 방법은 재조합 면역자극 사이토킨, 예컨대, IL-2, IL-12, GM-CSF 등과 배합된 화학적 아쥬반트를 사용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 이 사이토킨을 합텐과 화학적으로 반응하는 단백질 항원에 연결하는 방식으로 IL-2에 융합된 항-합텐 항체를 이용하는 방법이 있다(Harvill et al. (1996) J.IMMUNOL. 157:3165).
다른 기술은 항체 "항원화"를 개발함으로써, 면역글로불린 가변부의 일부가 펩티드 항원으로 대체되는 것이다. 재조합 항체가 APC 표면상의 Fc 수용체와 상호작용하여 APC와 결합하면, 하이브리드 분자의 펩티드 항원이 APC에 나타난다(Lanza et al. (1993) PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 90:11683-11687). 이러한 시도를 확장하는 것으로 "항원화된" 면역글로불린 중쇄를 암호화하는 플라스미드 DNA의 비장 주사를 이용하며, 이후 면역글로불린 경쇄 파트너가 제공되면 비장-유도된 B 세포가 재조합 항체를 분비한다.
그러나, 항원 전달계의 면역원성은 현대 백신 발전 과정 중 주요한 기술적 장애물 중 하나이다. 예방접종의 목적은 강한 면역 반응을 이끌어내는 것이다. 그러나, 숙주 면역계가 박테리아 및 바이러스와 싸우도록 진화되었기 때문에, 박테리아 또는 바이러스를 벡터로 사용하면, 메신저는 통상 메세지에 따라 파괴될 것이다. 더욱이, 특정 바이러스성 벡터, 예컨대 백시니아 및 아데노바이러스와 같은 것에 대한 강한 면역 반응은 그들의 용도를 제한하여 단백질 벡터와 같이 박테리아성 독소를 이용하는 동안 유사한 문제점들이 일어난다는 것을 관찰하였다. 마찬가지로, 가변부를 이용하는 항체계 "단백질 벡터"(면역계에 의해 "자가"로 여겨지지 않음)는 그들의 성질에 따라, 잠재적으로 면역원성이 있다. 이들 담체 분자의 다양한 용도가 항-이디오타입성 반응을 유도할 수 있어서 그들의 효율적인 사용을 방해한다는 것을 관찰하였다. 따라서, 미리선택된 단백질 또는 펩티드 항원에 대해 강하고 지속적인 면역을 생성하는 백신을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
본 발명의 개요
본 발명은 부분적으로 미리선택된 항원을 면역글로불린 중쇄 불변부에 융합시킴으로써 포유류에서 미리선택된 펩티드 단백질 항원의 면역원성을 증강시킬 수 있는 발견에 기초한 것이다. 따라서 생성된 융합 단백질("Fc-항원 융합 단백질" 또는 "항원 융합 단백질"로도 언급) 또는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 백신 형태로 포유류에게 투여하여 미리선택된 항원에 대해 면역 반응을 이끌어내는 것이다. 또한, 미리선택된 항원에 대해 이끌어낸 면역 반응의 강도 및 형태가 Fc-항원 융합 단백질 또는 Fc-항원 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 함께 특이적 아쥬반트를 투여함으로써 조절할 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 포유류에서 미리선택된 항원의 면역원성을 증강하는 방법을 제공한다. 한 구체에에서, 본 방법은 면역 반응을 이끌어 내기에 충분한 양의 미리선택된 항원에 폴리펩티드 결합함으로써 연결된 면역글로불린 중쇄 불변부를 포함하는 Fc-항원 융합 단백질을 포유류에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 방법은 미리선택된 항원에 융합된 면역글로불린 중쇄 불변부를 포함하는 Fc-항원 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열, 예컨대 DNA 또는 RNA 서열을 포유류에게 투여하는 단계를 포함한다. Fc-항원 융합 단백질의 일부가 융합 단백질 또는 핵산으로 투여되어 숙주에서 발현되어 융합 단백질을 생성하는 경우, 미리선택된 항원은 상당한 양(예를 들면, 중량 기준 또는 분자 기준으로)의 단독의 미리선택된 항원(즉, 면역글로불린 중쇄 불변부에 융합되지 않은 미리선택된 항원)보다 강하게 포유류에서의 면역 반응을 자극할 수 있는 것을 특징으로 한다.
또한, Fc-항원 융합 단백질의 미리선택된 항원에 대해 이끌어낸 면역 반응은 Fc-항원 융합 단백질을 아쥬반트와 함께 투여함으로써 증강되거나 또는 조절될 수 있다. 다양한 아쥬반트, 프레운드 완전 아쥬반트 또는 메틸화되지 않은 CpG 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드와 같은 예컨대 화학적 아쥬반트는 본 발명의 실시에 유용하지만, Fc-항원 융합 단백질과 같이 사용되고 있는 현재의 바람직한 아쥬반트는 제2의 Fc-항원 융합 단백질(본원에서 "Fc-항원 융합 단백질" 또는 "아쥬반트 융합 단백질"로 언급) 또는 Fc-항원 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함한다. 바람직한 Fc-보조제 융합 단백질은 아쥬반트 단백질(예컨대, 사이토킨)에 폴리펩티드 결합으로 연결된 면역글로불린 중쇄 불변부를 포함한다. Fc-보조제 융합 단백질의 생성에 유용한 바람직한 사이토킨은 예를 들어, 인터페론-γ(IFN-γ), 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-12(IL-12), IL-18, 종양 괴사 인자(TNF), 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자(GMCSF)를 들 수 있다. Fc-보조제 융합 단백질의 다른 군은 일반적으로 부분적 또는 전체적으로 막에 결합된 단백질의 세포외 도메인에 상응하는 아쥬반트 부에 융합된 면역글로불린 중쇄부를 포함한다. 예를 들어, CD40 리간드는 Fc 부에 융합되어 증강된 아쥬반트 단백질로 사용된다.
Fc-항원 및 Fc-아쥬반트 융합 단백질을 동시에 또는 차례로 (예를 들어, Fc-항원 다음에 Fc-아쥬반트 또는 Fc-아쥬반트 다음에 Fc-항원) 함께 투여하여 미리선택된 항원에 대해 자극되는 면역 반응의 형태를 조절할 수 있다. 2종의 면역 반응 군(Th1 및 Th2로 표시)이 상이한 자극에 대한 반응으로 개시되어 상이한 사이토킨을 관련시킨다. Th1 매개된 면역 반응은 통상 성질상 세포성인 반면, Th2 매개된 면역 반응은 통상적으로 성질상 체액성이다. 따라서, Th1 반응은 변형 세포(예컨대 암세포 또는 바이러스 감염된 세포)를 공격하는 데 유용한 반면, Th2 반응은 기생충과 같은 세포외 제제를 공격하는 데 유용하다. 일반적인 면역 반응을 자극하기 위하여 또는 특이적 Th1 또는 Th2 반응을 개시하거나 조절하기 위하여 면역글로불린 중쇄 불변부에 융합된 사이토킨을 투여하는 것이 종종 유용하다.
예를 들면, GMCSF에 펩티드 결합으로 연결된 면역글로불린 중쇄 불변부를 포함하는 Fc-아쥬반트 융합 단백질은 Th1 및 Th2 반응 둘 다를 비롯한 면역 반응의 통상의 강력한 자극기이다. IL-12 또는 IFN-γ를 포함하는 Fc-아쥬반트 융합 단백질은 주로 세포성 또는 Th1 매개된 면역 반응을 자극하기 위하여 함께 투여될 수 있다. 대안적으로, IL-4를 포함하는 Fc-아쥬반트 융합 단백질을 투여하여 주로 채액성 또는 Th2 매개 면역 반응을 자극하기 위하여 투여될 수 있다.
또한, Fc-아쥬반트 융합 단백질에 존재하는 특정 사이토킨의 선택이 Fc-항원 융합 단백질의 미리선택된 항원에 대해 생성된 항체의 군에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, IL-12 함유 Fc-아쥬반트 융합 단백질은 헬퍼 T 세포를 자극할 수 있으며, IgG2a 항체군의 생성을 자극할 수 있다. 대안적으로, IL-4를 함유하는 아쥬반트 융합 단백질은 IgE 항체군의 생성을 자극할 수 있다.
전술한 바와 같이 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 Fc-항원 융합 단백질 또는 Fc-항원 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 Fc-아쥬반트 융합 단백질과 배합하여 투여하는 단계를 포함한다. 각각 면역글로불린 중쇄 불변부를 포함하는 2개의 융합 단백질을 사용함으로써, 미리선택된 항원 및 아쥬반트 단백질(예컨대, 사이토킨) 모두를 포유류에서 동일한 또는 유사한 세포 형태로 함께 편재화할 수 있다. 예를 들면, 마크로파지(B 세포), 과립구 및 수지상 세포는 그 세포 표면상에 Fc 수용체를 발현시킨다. 따라서, Fc 수용체를 결합시킬 수 있는 Fc-항원 및 Fc-아쥬반트 융합 단백질를 함께 투여함으로써, 동일한 세포 형태로 항원 융합 단백질의 항원 및 아쥬반트 융합 단백질의 아쥬반트를 함께 편재화할 수 있다. 이후, 아쥬반트는 미리선택된 항원의 주변에서 면역 반응을 자극, 증강 또는 그렇지 않으면 조절할 수 있다.
본 바람직한 구체예에서, 본 발명은 2개의 현저한 편재 형태 또는 집중화 형태를 사용한다. 첫째로, 본 발명은 항원 및 아쥬반트 둘다에 융합시킬 수 있는 공통부(이는 인체의 특정부에 집중되어 있음)를 사용한다. 이러한 방법으로, 아쥬반트의 이웃에 있는 항원의 효과적인 편재 집중화가 증가된다. 둘째로, 본 발명은 면역계의 항원 프로세싱 및 표현 기계장치에 대해 항원을 표적으로 한다. 제1집중화 단계는 항원 및 아쥬반트 단백질을 면역계에 접근하기 쉬운 인체의 일부분에 집중된 부로 융합시킴으로써 수행된다. 제2표적 단계는 항원 단백질의 항원 표현계로의 전달 또는 항원 표현계에 의한 프로세싱을 증강하는 임의의 부로 융합시킴으로써 수행한다.
따라서, 본 발명은 2개의 대안적인 방법에 의해 이들 집중화 효과를 수행한다. 한 방법은 2개의 상이한 융합 단백질(항원-편재화 단백질 융합 및 아쥬반트-편재화 단백질 융합)을 작제하고 투여하는 것이다. 두번째 방법은 항원, 아쥬반트, 및 편재화 단백질을 포함하는 융합물을 작제하고 투여하는 것이다. Fc 부는 편재화 단백질의 한 예이다.
면역글로불린 중쇄 불변부의 중요 성질은 Fc-항원 융합 단백질에서 미리선택된 항원과는 달리, 목적 수용체에서 전혀 면역원성이 없거나, 약하게 면역원성인 것이 바람직하다. 다시 말해서, Fc-항원 융합 단백질내에서 미리선택된 항원은 면역글로불린 중쇄 불변부보다 수용체에서 더 면역원성을 갖도록 하였다. 유사하게는, Fc-아쥬반트 융합 단백질 또한 목적 수용체에서 면역원성이 없거나 약해야 하는 것으로 관찰되었다. 면역글로불린 중쇄 불변부의 면역원성은 어떤 경우에는 목적 수용체로서 동일한 종들에 존재하는 것들과 유사한 또는 그들로부터 유래된 면역글로불린 불변부 서열을 이용하여 감소시키거나 제거시킬 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 중쇄 불변부, 바람직하게는 인간에서 유래된 상기 불변부를 사용하여 인간에게 투여되는 융합 단백질을 생성한다. 유사하게는, 목적 수용체가 인간인 경우, Fc-아쥬반트 융합 단백질의 아쥬반트 단백질 또한 인간에서 유래된 것이 바람직하다. 적절한 아미노산 서열 한정 면역글로불린 중쇄 불변부 및 아쥬반트 단백질을 선택함으로써 미리선택된 항원에 주로 직접적으로 면역 반응하는 것을 최적화할 수 있다.
바람직한 구체예에서, Fc-항원 융합 단백질의 면역글로불린 중쇄 불변부는 면역글로불린 힌지부, 및 임의로 CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인 또는 그의 배합물로 구성된 군으로부터 선택된 면역글로불린 불변부 영역을 포함한다. 그러나 면역글로불린 중쇄 불변부는 적어도 CH1 도메인을 결여하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 Fc 융합 단백질은 면역글로불린 중쇄 가변부 도메인(VH)을 결여하는 것이 바람직하다. 융합 단백질이 인간에게 투여되는 경우, 면역글로불린 중쇄 불변부는 힌지부 및 CH2 도메인 또는 CH3 도메인을 포함하는 것이 바람직하며, 힌지부 및 CH2 도메인과 CH3 도메인 모두를 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 실시에 유용한 면역글로불린 중쇄 불변부가 IgA(Igα), IgD(Igδ), IgE(Igε), IgG(Igγ), 및 IgM(Igμ)로 당업계에서 불리워지는 임의의 5개 면역글로불린 클래스에 속하는 면역글로불린으로부터 유래될 수 있다. 그러나, IgG 클래스로부터 유래된 면역글로불린 중쇄 불변부가 바람직하다.
관심있는 임의의 미리선택된 항원은 본 발명의 Fc-항원 융합 단백질에 포함될 수 있다는 것을 관찰하였다. 바람직한 구체예에서, 미리선택된 항원은 전립선-특이적 막 항원, 사이토킨 수용체의 엑토도메인, 바이러스성 단백질 및 암 또는 종양 특이적 항원으로 구성된 군으로부터 선택된다.
다양한 입체배치를 갖는 Fc-항원 융합 단백질이 본 발명의 실시에 유용할 수 있다. 예를 들면, 미리선택된 항원의 N-말단은 면역글로불린 중쇄 불변부의 C-말단에 폴리펩티드 결합함으로써 연결될 수 있다. 대안적으로, 미리선택된 항원의 C-말단은 면역글로불린 중쇄 불변부의 N-말단의 폴리펩티드 결합에 의해 연결될 수 있다. 또한, Fc-항원 융합 단백질은 서로에게 또는 면역글로불린 중쇄 불변부에 폴리펩티드 링커를 통해 또는 직접적으로 연결될 수 있는 다수의 1 이상의 미리선택된 항원을 포함할 수 있다는 것을 관찰하였다. 또한, 2 이상의 Fc-항원 융합 단백질은 비-공유적으로 또는 공유적으로 함께 연결될 수 있으며, 예컨대 1 이상의 2황화 결합으로 연결되어 2량체 또는 다량체 조성물을 생성한다. 2량체 구조에서 Fc-항원 융합 단백질이 서로 같거나 다를 수 있다는 것을 관찰하였다. 예를 들어, 2개의 Fc-항원 융합 단백질이 동일한 면역글로불린 중쇄 불변부를 포함하지만, 미리선택된 항원은 서로 다를 수 있다. 유사한 입체배치가 Fc-아쥬반트 융합 단백질에도 이용될 수 있다는 것을 관찰하였다.
또한, Fc-융합 단백질을 암호화하는 다양한 핵산 서열이 본 발명의 실시에 유용할 수 있다. 예를 들어, 핵산 서열은 5' 에서 3' 방향으로 면역글로불린 중쇄 불변부와 미리선택된 항원 또는 미리선택된 항원과 면역글로불린 중쇄 불변부 모두 암호화할 수 있다. 또한, 핵산 서열은 예컨대 면역글로불린 중쇄 불변부의 힌지부에 직접 융합된 면역글로불린 경쇄 서열에 기초한 "리더" 또는 "시그널" 서열을 임의로 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, Fc 부위가 IgG 서열에 기초하는 경우, Fc-부위는 5' 에서 3' 방향으로 적어도 면역글로불린 힌지부(즉, 제2면역글로불린 힌지부 서열과 2황화 결합을 형성할 수 있는 1 이상의 시스테인 아미노산을 포함하는 힌지부), 면역글로불린 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 암호화한다. 또한, Fc-항원 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열이 Fc 융합 단백질을 발현할 수 있는, 예를 들어 박테리아 숙주, 목적 수용체, 또는 둘 다를 발현할 수 있는 재조합가능한 발현 벡터 내에 삽입될 수도 있다.
Fc-항원 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열 단독 또는 Fc-아쥬반트 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 배합하여 주입하면 세포성 면역 반응, 체액성 면역 반응 또는 둘 다를 생성할 수 있게 된다. 핵산 기재의 면역화 및 단백질 기재의 면역화를 배합하면 (예를 들어, Fc-항원 융합 단백질을 암호화하는 핵산의 투여 이전, 투여 동안, 또는 그 이후 Fc- 항원 융합 단백질의 투여) 서로 상승작용을 하여 핵산 또는 단백질 단독으로 면역화하는 것에 비해 미리선택된 항원에 대한 더욱 강한 면역 반응을 이끌어 낼 수 있다.
본 발명의 전술한 여러 목적, 특징 및 장점은 다음의 상세한 설명, 도면 및 특허청구범위로부터 보다 명백해질 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 체액성(즉 항체 기재의) 또는 Th2 세포 매개 면역 반응, 세포성 또는 Th1 세포 매개 면역 반응, 및 어떤 경우에는 포유류에서 면역 반응의 두 형태 를 유도하기 위한 생체내 단백질 또는 펩티드 항원의 효과적인 전달에 관한 것이다. 미리선택된 항원을 면역글로불린 중쇄 불변부와 융합하여 Fc-항원 융합 단백질을 생성함으로써 포유류에서의 미리선택된 단백질 또는 펩티드 항원의 면역원성을 증강시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 생성된 Fc-항원 융합 단백질 또는 Fc-항원 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 이후에 포유류, 예를 들어 인간에게 백신의 형태로 투여하여 미리선택된 항원에 대한 면역 반응을 이끌어낼 수 있다.
Fc-항원 융합 단백질은 선택적으로 항원 제시 세포(APC)에 대한 항원을 표적으로 한다. 이론을 고수하려는 것은 아니지만, Fc-항원 융합 단백질의 APC로의 결합은 수많은 면역 세포 형태상에서, 예를 들어 수지상세포, 마크로파지, B-세포 및 과립구와 같은 세포 형태상에서 발현된 Fc 수용체를 통하여 매개된다고 여겨진다. Fc-항원 융합 단백질은 표유류에 투여되었을 때, Fc 수용체와 결합된 후, Fc-항원 융합 단백질이 APC에 의해 세포내에 편입된다. 미리선택된 항원을 비롯하여, 세포내에 편입된 융합 단백질은 이후 작은 펩티드로 변성되어 세포 표면상에 나타나는 것으로 여겨진다. 이후 나타난 펩티드는 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 매개한다. 자극된 면역 반응의 특정 형태는 Fc-항원 융합 단백질을 아쥬반트, 예를 들어 아쥬반트 융합 단백질과 함께 투여함으로써 조절될 수 있다.
투여의 한 형태로서, Fc-항원 융합 단백질을 수용체에게 투여한다. 다른 투여 형태로서, Fc-항원 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 수용체에게 투여한다. 미리선택된 항원은 투여된 Fc-항원 단백질 내에서 또는 투여된 핵산으로부터 발현됨으로써, 항원 단독(즉, 면역글로불린 중쇄 불변부에 폴리펩티드 결합함으로서 융합되지 않은 항원)보다 더 면역원성을 나타낸다. 또한, 특정 상황하에서는, 융합 단백질의 연속적인 투여후의 동일한 융합 단백질을 암호화하는 핵산의 투여 또는 대안적으로 융합 단백질을 암호화하는 핵산 투여 이후의 동일한 융합 단백질을 투여하여 미리선택된 항원의 면역원성을 최대화하는 데 사용할 수 있다. 광학 면역 반응은 Fc-항원 융합 단백질의 두 성분이 활성인 경우 이끌어내진다는 것을 알 수 있었다. 즉, Fc-항원 융합 단백질 중의 미리선택된 항원은 면역 반응을 이끌어낼 수 있고 면역글로불린 중쇄 불변부는 Fc 수용체를 APC 표면상에서 결합시킬 수 있다.
또한, 전술한 바와 같이, 미리선택된 항원에 대해 이끌어내진 면역 반응의 강도 및 형태는 Fc-항원 융합 단백질 및/또는 Fc-항원 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 가진 특이적 아쥬반트와 함께 투여함으로써 조절될 수 있다. 화학적 아쥬반트(예컨대, 알럼 또는 프레운드 완전 아쥬반트 또는 불완전 아쥬반트)가 특정 상황하에서 예컨대 수의학적 응용에서, 본 발명의 실시에 유용하지만, 그들의 부작용 예컨대 조직 상처와 같은 부작용이 그것을 인간에게 사용하기에는 부적절하게 할 수 있다. 따라서, 바람직한 아쥬반트는 면역글로불린 중쇄 불변부가 아쥬반트 단백질에 융합되어 Fc-아쥬반트 융합 단백질을 생성한 2차 Fc 융합 단백질을 포함한다. Fc-항원 융합 단백질이 있으면, Fc-아쥬반트 융합 단백질 2 성분이 활성인 경우 최적 면역 반응이 이끌어내진다는 것을 이해할 수 있다. 즉, Fc-아쥬반트 융합 단백질의 아쥬반트가 면역 반응을 조절할 수 있고, 면역글로불린 중쇄 불변부가 APC 표면상에서 Fc 수용체와 결합할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 항원 및 아쥬반트는 둘 다 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Fc 융합 단백질로 투여된다. 즉, 항원은 Fc-항원 융합 단백질로 투여되고 아쥬반트는 Fc-아쥬반트 융합 단백질로 투여된다. 본 발명의 실시에 유용한 Fc 융합 단백질의 바람직한 투여는 도1A 내지 도1G에 설명되어 있다.
도1A는 면역글로불린 중쇄 불변부(1)의 C-말단이 직접 또는 폴리펩티드 링커를 통해 미리선택된 항원 또는 아쥬반트(2)의 N-말단에 연결되는 Fc 융합 단백질을 예시적으로 나타낸다. 본원에서, "폴리펩티드 링커"는 2개의 단백질과 함께 결합하는 1 이상의 일련의 아미노산을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 폴리펩티드 링커는 종종 예컨대 반복적인 글리신 및/또는 세린 잔기를 포함하는 약 10 내지 15개의 잔기 길이의 아미노산 서열이다. 도1B는 미리선택된 항원 또는 아쥬반트(2)의 C 말단이 직접 또는 폴리펩티드 링커를 통해 면역글로불린 중쇄 불변부(1)의 N-말단에 연결된 Fc 융합 단백질을 예시적으로 나타낸다.
도1C는 2개의 이황화 결합을 통해 공유 결합된 2개의 Fc 융합 단백질을 함유하는 2량체 구조를 도시하고 있다. 상기 2량체 구조는 각각의 면역글로불린 중쇄 불변부(1)의 C-말단이 아쥬반트(2)의 미리선택된 항원의 N-말단에 연결된 것인 2개의 Fc 융합 단백질을 포함한다. 유사하게는, 도1D는 2개의 이황화 결합을 통해 공유 결합된 2개의 Fc 융합 단백질을 함유하는 2량체 구조를 도시하고 있다. 상기 2량체 구조는 각각의 미리선택된 항원 또는 아쥬반트(2)의 C-말단이 면역글로불린 중쇄 불변부(1)의 N-말단에 연결된 2개의 Fc 융합 단백질을 포함한다.
도1E는 2개의 이황화 결합을 통해 연결된 2개의 Fc 융합 단백질을 함유하는 2량체 구조를 도시하고 있다. 상기 2량체 구조는 각각의 면역글로불린 중쇄 불변부(1)의 C-말단이 직접 또는 폴리펩티드 링커를 통해 미리선택된 항원 또는 아쥬반트(2)의 N-말단에 연결된 2개의 Fc 융합 단백질을 포함하며, 상기 항원 또는 아쥬반트의 C-말단은 직접 또는 폴리펩티드 링커를 통해 2차 항원 또는 아쥬반트(2')에 부착된다.
도1F는 2개의 이황화 결합을 통해 연결된 2개의 Fc 융합 단백질을 함유하는 2량체 구조를 도시하고 있다. 상기 2량체 구조는 항원 또는 아쥬반트(2)의 C-말단이 직접 또는 폴리펩티드 링커를 통해 면역글로불린 중쇄 불변부(1)의 N-말단에 연결된 2개의 Fc 융합 단백질을 포함하며, 상기 면역글로불린 중쇄의 C-말단은 직접 또는 폴리펩티드 링커를 통해 다른 아쥬반트 또는 항원(2')의 N-말단에 연결된다. 예컨대, 상기 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단 방향으로 미리선택된 항원-면역글로불린 중쇄 불변부-아쥬반트를 포함할 수 있다.
도1G는 2개의 이황화 결합을 통해 연결된 2개의 Fc 융합 단백질을 함유하는 2량체 구조를 도시하고 있다. 상기 2량체 구조는 항원 또는 아쥬반트(2)의 C-말단이 직접 또는 폴리펩티드 링커를 통해 다른 아쥬반트 또는 항원(2')의 N-말단에 연결된 2개의 Fc 융합 단백질을 포함하며, 다른 아쥬반트 또는 항원의 C-말단은 직접 또는 폴리펩티드 링커를 통해 면역글로불린 중쇄 불변부(1)의 N-말단에 연결된다. 예컨대, 상기 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단 방향으로 미리선택된 항원-아쥬반트-면역글로불린 중쇄 불변부를 포함한다.
본 발명의 실시에 있어서, 아쥬반트 부에 대해 N-말단 내에 Fc 부를 배치하는 것이 일반적으로 바람직하다. 아쥬반트 부가 Fc 부에 대해 N-말단에 배치되면, 아쥬반트-Fc 융합은 포유류 세포상의 아쥬반트 수용체에 결합할 수 있고 항체가 세포 표면에 결합하는 경우 Fc 부는 채택된 동일한 방향에 존재할 것이다. ADCC 또는 보체 결합 반응이 일어날 수 있다. 그러나, Fc 부가 아쥬반트 부에 대해 N-말단에 배치되면, ADCC 및 보체 결합 반응이 일어나지 않을 것으로 보인다.
도1C 내지 도1G에 도시한 구조들은 이웃한 힌지부상의 시스테인들 사이에서 한 쌍의 2황화 결합에 의해 가교된 2량체로 나태난다. 도면에서, 2황화 다리는 이들 분자의 천연 형태의 힌지부 특성을 통해 2개의 면역글로불린 중쇄 불변부의 일부에 함께 연결되는 것으로 도시되어 있다. 면역글로불린 힌지부를 비롯한 구조가 바람직한 반면, 본 발명은 다른 위치에서의 가교를 원하는대로 선택할 수 있다는 것을 관찰하였다. 또한, 어떤 경우에는, 2 이상의 단량체가 비공유적으로 결합되어 본 발명의 실시에 유용한 2량체 또는 다량체를 생성할 수 있다.
본원에서 "면역글로불린 중쇄 불변부"는 "Fc 부위"와 교환가능하게 사용할 수 있으며, 면역글로불린 중쇄 불변부 또는 동족체의 카르복실 말단부 또는 Fc 수용체와 결합할 수 있는 부위를 의미한다. 공지된 바와 같이, 각각의 면역글로불린 중쇄 불변부는 4개 또는 5개의 도메인을 포함한다. 상기 도메인은 CH1-힌지-CH2-CH3(-CH4)의 순서로 부른다. CH4는 힌지부를 가지고 있지 않은 IgM에 존재한다. 본 발명의 실시에 유용한 면역글로불린 중쇄 불변부는 면역글로불린 힌지부를 포함하며, 바람직하게는 CH3 도메인을 포함한다. 면역글로불린 중쇄 불변부가 면역글로불린 힌지부, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 것이 가장 바람직하다. 본원에서, 면역글로불린 "힌지부"는 전체 면역글로불린 힌지부 또는 제2면역글로불린 힌지부와 1이상의 2황화 결합을 형성하기에 충분한 면역글로불린 힌지부의 적어도 일부를 의미하는 것이다.
적절한 면역글로불린 중쇄 불변부는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 나타내는 각각의 면역글로불린 군들에 속하는 항체들로부터 유래될 수 있으나, IgG 클래스로부터 유래된 면역글로불린 중쇄 불변부가 바람직하다는 것이 관찰되었다. 또한, 면역글로불린 중쇄 불변부가 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로서 당업계에서 불리워지는 임의의 IgG 항체 서브클래스로부터 유래될 수 있다는 것을 관찰하였다.
면역글로불린 중쇄 불변부 도메인은 면역글로불린 클래스들 중에서 교차-상동성(cross-homology)을 갖는다. 예를 들어, IgG의 CH2 도메인은 IgA 및 IgD의 CH2 도메인 및 IgM 및 IgE의 CH3 도메인에 대해 동종이다. 바람직한 면역글로불린 중쇄 불변부는 IgG의 CH2 부위 및 CH3 부위 또는 그들의 기능적인 부위 또는 유도체에 상응하는 단백질 도메인을 포함한다. 그러나 면역글로불린 중쇄 불변부는 적어도 CH1 도메인을 결여하는 것이 바람직하다. 더욱이, Fc-항원 또는 Fc-아쥬반트 융합 단백질은 면역글로불린 가변부위를 선택적으로 결여하고 있다. 보다 바람직한 태양에서, 면역글로불린 중쇄 불변부는 N 말단 방향에서 C 말단 방향으로 면역글로불린 힌지부, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하며, 이들 모두는 IgG 분자로부터의 서열들을 기초로 한다. 적절한 면역글로불린 중쇄 불변부를 선택하는 것에 관하여 미국 특허 제5,541,087호 및 제5,726,044호에 상세하게 기술되어 있다. 특정 면역글로불린 중쇄 불변부 서열을 특정 면역글로불린 클래스 및 서브클래스로부터 선택하여 특정 결과를 얻어내는 것은 당업계의 기술 수준내에 속하는 것으로 여겨지고 있다.
어떤 경우에는 면역글로불린 중쇄 불변부를, 예컨대 돌연변이, 결실 또는 기타의 유전 공학적 또는 기타의 시도들에 의한 변화로 개질시키는 것이 유용할 수 있으며, 이로서 특정 활성, 예컨대 보체 결합 반응 또는 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 자극이 감소되거나 제거된다. 그러나, 면역글로불린 중쇄 불변부의 Fc 수용체에의 결합 능력이 유지되어야 한다는 점을 고려해야 한다.
본 발명의 실시에 있어서, 면역글로불린 중쇄 불변부의 Fc-항원 또는 Fc-아쥬반트 융합 단백질 성분은 목적 수용체에서 면역원성이 아니거나 또는 약하게 면역원성을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 불변부가 면역글로불린 중쇄 불변부에 대한 방향으로 검출가능한 항체 반응을 생성하는 데 실패하는 경우 Fc 부위는 면역원성이 아니거나 또는 약하다는 것을 고려해야 한다. 따라서, 면역글로불린 중쇄 불변부는 융합 단백질의 목적하는 수용체와 동일한 종에 존재하는 면역글로불린 또는, 그러한 면역글로불린에 상응하는 아미노산 서열에 기초하는 면역글로불린으로부터 유래되어야 한다. 다시 말하면, 인간 면역글로불린 불변부 서열은 Fc 융합 구조(Fc 항원 및/또는 Fc-아쥬반트 융합 단백질)가 인간에게 투여되는 경우에 사용되어야 한다. 인간 Fc IgG의 뉴클레오티드와 아미노산 서열은 예를 들어 문헌[Ellison et al. (1982) NUCLEIC ACID RES. 10:4071-4079]에 개시되어 있다. 또한, 뮤린 Fc 서열은 Fc 융합체가 마우스에게 투여되는 경우에 사용되어야 한다. 뮤린 Fc IgG2a의 뉴클레오티드와 아미노산 서열은 예를 들어 문헌[Bourgois et al. (1974) EUR. J. BIOCHEM. 43:423-435]에 개시되어 있다. Fc 융합 단백질이 개와 고양이 등의 애완동물, 및 젖소와 말 등의 농장의 동물을 비롯한 기타 동물에게 투여되는 경우에도 동일한 논리가 적용될 것이다.
본원에 사용된 용어, "미리선택된 항원"은 단독으로 또는 기타 시약과 함께 포유 동물에서 면역 반응을 유도할 수 있는 임의의 단백질 또는 이것의 단편, 또는 폴리펩티드를 의미한다. 상기 임의의 미리선택된 항원은 본 발명의 Fc-항원 융합 단백질에 포함되는 것으로 해석된다. 바람직한 구체예에서는, 미리선택된 항원은 전립선-특이적인 항원(PSMA); 사이토킨 수용체의 엑토도메인(ectodomain), 예를 들어 인간 IL-4 수용체의 엑토도메인, 종양-특이적인 항원(예를 들어, 비조절되거나, 정상 세포에 비해 종양 세포에서 증가된 농도로 존재하는 항원); 및 바이러스 단백질, 예를 들어 인간 면역결핍 바이러스(HIV)의 게놈에 의해 암호화된 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 사용된 "아쥬반트"는 예를 들어 미리선택된 항원에 대한 면역 반응( 체액성 또는 세포성 면역 반응)을 증강시킴으로써 면역조절자로서 작용할 수 있는 임의의 물질을 의미한다. 본원에 사용된 "체액성" 면역은 예를 들어 혈장이나 림프 등의 체액에 존재하는 항체에 의해 매개되는 면역을 의미하는 반면, "세포성" 면역은 또한 T 림프구에 의해 시작되어 효과기 T 림프구 및/또는 대식 세포에 의해 매개되는 면역학적 반응을 의미한다.
전술한 바와 같이, 프레운드 완전 아쥬반트 등 다양한 화학적 아쥬반트는 인간을 제외한 포유 동물을 면역화하는 데 유용할 것이다. 상당한 세포독성 T 림프구(CTL) 반응 또는 항체의 높은 역가를 생산하기 위하여 동물에서 널리 사용되고는 있으나, 조직 상해 등 이것의 부작용으로 인해 인간에 대하여 사용하기에는 부적절하다. 그러므로, 주사 부위에서 염증을 동반하지 않으면서, 강력한 면역 반응을 유도할 필요성이 있다. 본 발명의 Fc 아쥬반트 융합 단백질의 사용에 따른 한가지 확실한 이점은 프레운드 아쥬반트 등의 화학적 아쥬반트를 필요로 하지 않으면서 강력한 면역 반응을 유도하는 능력이다.
본 발명의 실시에 유용한 바람직한 아쥬반트는 Fc-아쥬반트 융합 단백질 또는 이것을 암호화하는 핵산을 포함한다. Fc 융합 단백질 중에 포함되는 바람직한 아쥬반트 단백질은 사이토킨 등이다. 본원에 사용된 용어 "사이토킨"은 포유동물에서 T 세포; B 세포; 대식 세포; 호중성구; 호산성구; 호염기구; 수상 세포; 및 이들의 전구체 등의 면역 세포의 활성을 조절할 수 있는 임의의 단백질 또는 펩티드 유사체 또는 이의 작용성 단편을 의미한다. 바람직한 사이토킨으로는 예를 들어 IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-12, IL-18, TNF 및 GMCSF를 포함한다. CD40 리간드의 외부 도메인은 또한 Fc에 융합되어 Fc-아쥬반트를 제조하는 데 바람직한 단백질이다. Fc-아쥬반트와 함께 투여되는 경우, Fc-항원 융합 단백질 중의 항원은 Fc-아쥬반트 융합 단백질 없이 투여되는 것에 비해 더욱 강력한 면역 반응을 일으킬 수 있다. 일부 경우, Fc-아쥬반트로 Fc-항원을 단지 2차례 면역화한 후 도달되는 항원의 농도는 프레운드 아쥬반트를 사용하여 얻어지는 것과 동등하거나 더욱 높으며, 검출할 수 있는 피부 반응이 없다.
Fc-항원 또는 Fc-아쥬반트 융합 단백질의 면역글로불린 중쇄 불변부에 있어서, 아쥬반트 단백질은 의도된 수용체 중에 단지 약한 면역원성 또는 비면역원성인 것이 바람직하다. 이것은 Fc 아쥬반트 융합 단백질, 의도된 수용체와 동일한 종으로부터 분리가능한 사이토킨에 상응하는 아미노산 서열로 정의된 사이토킨으로의 혼입에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, Fc 아쥬반트 융합 단백질이 인간에게 투여되는 경우에, 아쥬반트 단백질(예를 들어, 사이토킨)은 인간 기원인 것이 바람직하다.
Fc-항원과 Fc-아쥬반트 융합 단백질을 동시에 또는 하나씩 함께 투여함으로써 미리선택된 항원에 대해 자극된 형태의 면역 반응을 조절할 수 있다. Th1 및 Th2로 명명되는 2 종류의 면역 반응은 상이한 부류의 감염증에 반응하여 자극되며, 상이한 사이토킨이 관계되어 있다. Th1 매개된 면역 반응은 통상적으로 원래 세포성인 반면에, Th2 매개 면역 반응은 통상적으로 원래 체액성이다. 따라서, Th1 반응은 종양 세포 또는 바이러스 감염된 세포와 같은 변형된 세포를 공격하는 데 유용할 수 있는 반면에, Th2 반응은 기생충과 같은 세포외부 물질을 공격하는 데 유 용할 수 있다. 면역글로불린 중쇄 불변부에 융합된, 사이토킨을 투여하여 일반적인 면역 반응을 자극하거나, 또는 Th1이나 Th2 특이 면역 반응을 개시하거나 조절하는 것이 바람직한 경우가 많다.
더욱이, Fc-아쥬반트 융합 단백질 중에 존재하는 특정 사이토킨의 선택은 Fc-아쥬반트 융합 단백질의 미리선택된 항원에 대항하여 생산된 부류의 항체에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, Fc-IL12는 Th1 사이토킨, 예를 들어 IFN-γ, IL-2 및 TNF로 공지된 물질의 생산을 자극함으로써 헬퍼 T 세포를 자극하는데, 이로써 IgG2a 부류 항원의 생산 및 강력한 세포성 면역을 증강시킨다. 역으로, Fc-IL-4는 Th2 사이토킨, 예를 들어 체액성 면역을 증강시키는 IL-5, IL-6, Il-10 및 IL-4의 생산을 자극한다.
전술한 바와 같이, 바람직한 구체예에서 방법은 Fc-아쥬반트 융합 단백질과 함께 Fc-항원 융합 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Fc-항원 융합 단백질를 투여하는 단계를 포함한다. 각각 면역글로불린 중쇄 불변부를 함유하는 2종류의 융합 단백질을 사용함으로써, 포유 동물에서 동일하거나 유사한 유형의 세포에서 아쥬반트 단백질(예를 들어, 사이토킨)과 미리선택된 항원을 둘다 함께 편재화하는 것이 가능하다. 예를 들어, 대식 세포, B 세포, 과립구 및 수상 세포는 이들의 세포 표면상에 Fc 수용체를 발현한다. 따라서, Fc 수용체에 결합할 수 있는 Fc-항원 및 Fc-아쥬반트 융합 단백질을 함께 투여함으로써 APC의 동일한 세포 분획에 아쥬반트 융합 단백질의 아쥬반트 및 항원-융합 단백질의 항원을 함께 편재화할 수 있다. 이어서, 아쥬반트를 미리선택된 항원 근처에서 면역 반응을 증강시키거나, 조절한다.
Fc-사이토킨의 조합은 상승적으로 사용되어 일반적인 반응을 자극하여 세포성(Th1) 또는 체액성(Th2) 반응 여부에 영향을 준다. 예를 들어, Fc-GMCSF는 면역 반응의 강력한 일반적인 자극제이다. 그러나, 세포성 또는 Th1 매개 면역에 대한 반응을 조절하기 위해, Fc-IL12 또는 Fc-IFNγ아쥬반트 단백질은 예를 들어 Fc-GMCSF와 함께 투여될 수 있다. 체액성 또는 Th2 매개 반응을 더욱 증강시키기 위해, Fc-IL4 아쥬반트 단백질은, 예를 들면 Th2 세포의 생산에 대한 반응을 조정하게 위해 Fc-GMCSF와 함께 투여될 수 있다. Fc에 대한 융합물로서 사용되는 기타 Th1- 또는 Th2- 증강 사이토킨은 목적하는 생리학적 반응의 정확한 특성에 따라 사용될 수 있다. 이러한 일반적인 접근법은 또한 상반되는 Th 형태의 새로운 반응에 대하여 면역함으로써 유해한 것으로부터 멀리, 그리고 항원이 보다 특정 항원을 지향하도록 조작하여 자가면역반응(Th1-매개 질병) 및 알러지(Th2-매개 질병)와 같은 존재하는 병원성 반응을 조절하기 위하여 사용될 수 있다.
어떤 상황에서는, Fc-항원 융합 단백질로 동물을 면역화할 때, 아쥬반트로서 핵산을 사용하는 것이 유용하다. 핵산, 예를 들어 시토신-인산디에스테르 결합-구아노신(Cpg)이 풍부한 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드는 Th1 반응에 대한 면역 반응을 선호하고, 선택적으로 사이토킨과 같은 기타 아쥬반트와 함께 사용될 수 있다. 예로서 문헌[Brazolot et al. (1998) PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A. 95:15553-8; Liu et al. (1998) BLOOD 92:3730-6; and Klinman et al. (1997) IMMUNOL. 159:3635-3639] 참조. 따라서, CpG를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 Fc-항원 융합체와 함께 투여되어, 증강되고 적절히 조절된 면역 반응을 얻을 수 있다. 이러한 핵산 분자는 임의의 길이일 수 있지만, 8 뉴클레오티드 이상의 길이를 가진 뉴클레오티드가 바람직하다. 핵산 서열은 퓨린-퓨린-C-G-피리미딘-피리미딘을 포함하는 것이 더욱 바람직한데, 여기서 중앙 Cpg에서 시토신은 메틸화되지 않는다. 아쥬반트 DNA 중 CpG 디뉴클레오티드의 빈도는 약 5% 이상인 것이 바람직하고, 약 10%인 것이 더욱 바람직하다. 예를 들어, 이중 나선 형태의 올리고데옥시뉴클레오티드 TCCATGACGTTCCTGACGTT(서열 번호 22)는 아쥬반트로서 사용될 수 있다. 목적하는 면역 반응의 형태에 따라서, 핵산을 명반과 혼합하는 것이 유용할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 실시에 유용한 Fc 융합 단백질을 생산하는 통상의 재조합 DNA 기법을 이용한다. Fc 융합 구조는 DNA 수준에서 생산되며, 생성된 DNA는 발현 벡터내로 삽입되고, 발현되어 본 발명의 Fc-항원 또는 Fc-아쥬반트 융합 단백질을 생산하는 것이 바람직하다. 본원에 사용된 용어 "벡터"는 숙주 세포로 삽입되어 재조합되어 숙주 세포 게놈내로 삽입되거나 에피좀으로서 독립적으로 복제하기에 적합한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 의미한다. 이러한 벡터는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 바이러스 벡터의 비제한적인 예는 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스를 포함한다. 본원에 사용된 Fc 융합 단백질의 "발현" 또는 "유전자 발현"은 DNA 서열의 전사, mRNA 주형의 번역, 및 Fc 융합 단백질 생성물의 분비를 의미한다. 각각 IL2, CD26, Tat, Rev, OSF-2, bIG-H3, IgE 수용체, PSMA, 또는 gp120을 포함하는 Fc 융합 단백질은 본원에 논의된 형태의 발현계를 사용하여 발현되었다. 동일하거나 유사한 발현 구조는 미국 특허 제5,541,089호 및 제5,726,044호에 개시되어 있다.
유전자 조작 기법에 의한 단백질의 융합에 대한 대안으로서, 통상의 화학적 가교제를 사용하여 화학적 접합법을 사용하여 단백질 부분을 융합시킬 수 있다.
본 발명이 실시에 유용한 기본 벡터는 선택적 마커, 예를 들어 이 콜리중에 플라스미드의 선택 및 유지를 위한 세균 플라스미드 서열 및 예를 들어 SV40 바이러스로부터 유래된 전사 조절 서열에 의해 조작되는 유전자 암호화 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)를 포함한다. Fc-융합 단백질 서열의 발현은 프로모터, 선택적으로 인핸서 서열, 예를 들어 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 인핸서 서열에 의해 조작된다.
Fc-융합 단백질 또는 이러한 융합 단백질을 암호화하는 핵산이 인간에게 투여되는 경우에, Fc 융합 단백질-암호화 서열은 프레임 중에서 면역글로불린 중쇄 또는 이것의 돌연변이 형태의 적어도 일부분(바람직하게는, 인간 면역글로불린 g1 유전자의 Fcγ1 도메인인 것)와 융합된 예를 들어 항체 경쇄(L)로부터 유래된 "리더 서열"을 사용하여 5'에서 3' 방향으로 시작되는 것이 바람직하다. 면역글로불린 Fcγ1 유전자의 Fcγ1 도메인은 힌지 도메인 및 CH3 도메인을 일부 이상 포함하는 것이 바람직하며, 최소한 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 것이 더욱 바람직하다. Fc 융합 단백질이 마우스에게 투여되는 경우, 면역글로불린 중쇄 불변부를 암호화하는 바람직한 핵산 서열은 5'에서 3' 방향으로 암호화하는 핵산 서열, 힌지 도메인, 마우스 IgG2a 항체로부터 CH3 도메인 및 CH2 도메인을 포함한다. 면역글로불린 중쇄 불변부의 카복실 말단은 필요에 따라 프레임에서 미리선택된 항원(Fc-항원의 경우) 또는 면역자극성 사이토킨(Fc-아쥬반트 사이토킨의 경우에)을 사용한 연결을 위해 핵산 레벨에서 개질된다. 분비 카세트를 암호화하는 DNA는 게놈 구조 또는 그것의 cDNA 구조일 수 있다.
시그날 서열을 암호화하는 DNA 부분은 Fc 융합 단백질의 분비를 지령하는 펩티드 단편을 암호하고, 그 후 나머지 Fc 융합 단백질로부터 분열되는 것이 바람직하다. 본 발명의 시그날 서열은 원형질내 세망의 멤브레인을 가로질러 단백질의 수송을 시작하는 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드이다. 본 발명에 유용한 시그날 서열은 항체 경쇄 시그날 서열, 예를 들어 항체 14.18 (Gillies et al. (1989) J, OF IMMUNOL. METH., 125:191), 항체 중쇄 시그날 서열, 예를 들어 MPOC141 항체 중쇄 시그날 서열 (Sakano et al. (1980) NATURE 286:5774), 및 당업계에 알려진 임의의 기타 시그날 서열 (예를 들어 문헌 (Watson (1984) NUCLEIC ACIDS RESEARCH 12:5145) 참조)을 포함한다.
시그날 서열은 당업계에서 그 특성이 잘 규명되어 있으며, 통상적으로 16 내지 30개의 아미노산 잔기를 함유하는 것으로 알려져 있고, 더 많거나 작은 아미노산 잔기를 가질 수도 있다. 통상의 시그날 펩티드는 3개의 영역으로 이루어져 있다 : 염기성 N-말단 영역, 중앙 소수성 영역 및 보다 극성인 C-말단 영역. 중앙의 소수성 영역은 4 내지 12개의 소수성 잔기를 함유하는데, 상기 소수성 잔기는 미성숙 폴리펩티드의 수송시에 멤브레인 지질 이중층을 가로지르는 시그날 펩티드를 고정시킨다. 개시에 이어, 시그날 펩티드는 일반적으로 시그날 펩티다아제로서 알려진 세포 효소에 의해 내형질 세망의 강 내에서 분열된다. 시그날 펩티드의 잠재적인 분열 위치는 일반적으로 "(-3, -1) 규칙"을 따른다. 따라서, 통상의 시그날 펩티드는 -1 및 -3 위치에 작은 중성의 아미노산 잔기를 가지는데, 이 부위에는 프롤린 잔기가 결핍되어 있다. 시그날 페티다아제는 -1과 +1 아미노산 사이의 이러한 시그날 펩티드를 분열시킬 것이다. 따라서, 시그날 서열은 분비시에 융합 단백질의 아미노산-말단으로부터 분열될 수 있다. 그 결과, Fc 융합 단백질의 분비가 일어난다. 본 발명의 실시에 유용한 시그날 펩티드 서열은 당업계에 잘 알려져 있다. 문헌[von Heijne (1986) NUCLEIC ACIDS RES. 14:4683] 참조.
당업자에게 잘 공지되어 있는 바와 같이, 분비 카세트에 사용하기 위한 특정한 시그날 서열의 적합성은 몇가지 정형화된 실험을 필요로 할 수 있다. 이러한 실험은 Fc 융합 단백질의 분비를 지령하는 시그날 서열의 능력을 측정하는 것 및/또는 Fc 융합 단백질의 유효한 분비를 얻기 위해 사용되는 게놈 또는 cDNA 최적의 배치를 측정하는 것을 포함한다. 또한, 당업자는 전술한 참고 문헌(von Heijne)에 개시된 규칙을 따르는 합성 시그날 서열을 생산할 수 있고, 정형화된 실험에 의해 이러한 합성 서열의 유효성을 시험할 수 있다. "시그날 서열", "시그날 펩티드", "리더 서열" 또는 "리더 펩티드"는 본원에서 호환적으로 사용된다.
Fc 융합 단백질 또는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 투여하는 다양한 다른 방법을 사용하여 미리선택된 항원에 대항하여 수용체를 면역화할 수 있다. 본 발명의 두가지 다른 적용법(하나는 Fc-항원 융합 단백질을 암호화하는 DNA의 주사에 근거하고, 두번째는 제1형 MHC 경로로 단백질을 전달할 수 있는 Fc-항원 융합 단백질의 투여에 근거함)을 사용하여 CTL 반응을 일으킬 수 있다.
단백질 항원의 주사를 사용하여 통상적으로 포유 동물에서 면역 반응을 유도한다. 그러나. 본 발명은 또한 DNA 주사에 의해 APC로 항원을 전달하는 방법을 제공한다. 통상적으로 사용되는 기법은 항원성 단백질을 암호화하는 DNA 발현 벡터를 근육내로 주사하는 것이다. 단백질 항원이 근육 세포에 의해 발현되지만, 항원은 이들 세포에 의해 면역계에 제시되지 않는다는 보고가 있다. 대신, 특정화된 APC, 예를 들어 대식 세포 및 수상 세포는 주사 부위로 이동하고, 항원을 포획하여, 아직 상세히 알려지지 않은 과정을 통해 항원을 제시하는 것으로 여겨진다. Fc-항원 융합 단백질 발현 벡터를 사용함으로써 이 공정이 효율적으로 될 수 있는데, 그 이유는 분비된 융합 단백질이 미경험 항원 단백질에 비해 APC에 보다 효율적으로 결합하기 때문이다.
DNA 주사 접근법의 한가지 결과는, 이것이 종종 체액성 및 세포성 반응 모두를 일으킬 수 있다는 것이다. 통상적으로, 외인적으로 투여된 단백질은 MHC 제1형 분자 상에 제시를 위한 경로에 들어가기 더욱 어렵다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 Fc 융합 단백질의 투여는 세포독성 세포의 생성을 증강시키는데, 이는 미리선택된 외인성 항원의 MHC 제1형 제시를 통해서일 것이다. DNA 면역화 및 단백질 면역화의 조합은 또한 상승적으로 작용하여 면역계를 먼저 항원처리한 후 항체 생산 및 세포독성 세포성 반응 둘다의 형태로 반응의 수준을 증강시킬 수 있다. Fc-아쥬반트 융합 단백질, 예를 들어 Fc-IL-2, Fc-GMCSF, Fc-IL-12 및 Fc-Flt3 리간드와 Fc-항원 융합 단백질을 함께 투여하는 것은 APC의 동일한 세포 분획으로 융합 단백질이 함께 편재화되는 것을 확실히 한다. 이로써 미리선택된 항원에 대항하는 보다 강력한 면역 반응을 자극하게 된다.
본 발명의 조성물(즉, Fc-항원 및/또는 Fc-아쥬반트 융합 단백질, 또는 이러한 단백질을 암호화하는 핵산 서열)은 임의의 수단으로 동물에게 직접적으로(예를 들어, 국소적으로, 주사에 의해, 이식 또는 조직 부위로의 국소 투여) 또는 전신적으로(예를 들어, 비경구적으로 또는 경구적으로) 제공된다. 조성물이 비경구적(예를 들어, 정맥내, 피하내, 눈내, 복막내, 근육내, 협측. 직장, 질내, 안와내, 경피내, 뇌내, 두개내, 척수내, 심실내, 수막강내(intrathecal), 시스터나내(intracisternal), 캡슐내, 비강내 또는 에어로졸 투여에 의해)으로 제공되는 경우, 조성물은 수용성 또는 생리학적으로 적합성인 유체 현탁액 또는 용액을 일부분 포함하는 것이 바람직하다. 따라서, 담체 또는 비히클은 생리학적으로 허용가능하여 목적하는 조성물을 환자에게 전달하는 것 이외에, 환자의 전해질 및/또는 체적 밸런스에 악영향을 주지 않아야 한다. 그러므로, 약제에 대한 유체 매질은 정상 생리 식염수(예를 들어 9.95% 수성 NaCl 0.15 M, pH 7-7.4)를 포함할 수 있다.
1회 투여시 Fc-항원 융합 단백질의 바람직한 용량은 50 ng/m2 내지 1 g/m2이고, 5 ㎍/m2 내지 200 mg/m2인 것이 바람직하고, 0.1 mg/m2 내지 50 mg/m2인 것이 가장 바람직하다. 1회 투여시 Fc-아쥬반트 융합 단백질의 바람직한 용량은 1 ng/m2 내지 0.1 g/m2이고, 0.5 ㎍/m2 내지 20 mg/m2인 것이 더욱 바람직하며, 10 ㎍/m2 내지 5 mg/m2인 것이 가장 바람직하다. Fc-항원 및 Fc-아쥬반트 융합 단백질을 암호화하는 핵산의 바람직한 용량은 1회 투여시 1 ㎍/m2 내지 100 mg/m2이고, 20 ㎍/m2 내지 10 mg/m2인 것이 더욱 바람직하며, 400 ㎍/m2 내지 4 mg/m2인 것이 가장 바람직하다.
최대 면역화는 다수의 각각의 면역화, 예를 들어 약 3주 내지 6주의 간격으로 1회 내지 3회 접종을 수행하는 것에 의해 달성될 수 있는 것으로 생각된다. 또한, 전술한 바와 같이, 최대 면역 반응은 Fc 융합 단백질과 이러한 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 번갈아 함으로써 특정 상황에서 얻어질 수 있다. 융합 단백질을 암호화하는 Fc-항원 융합 단백질 또는 이 융합 단백질을 암호화하는 핵산은, Fc-아쥬반트 융합 단백질 또는 이것을 암호화하는 핵산이 포유 동물에 투여되기 전, 후 또는 이것과 동시에 투여될 수 있다. 그러나, 최적의 투여 방식, 용량 및 면역화 방법은 당업계에 잘 정형화된 실험을 수행함으로써 결정될 수 있다.
본 발명은 후술하는 비제한적인 실시예에 의해 보다 상세하게 예시된다.
본 발명 그 자체 뿐 아니라 본 발명의 전술한 여러 목적, 특징 및 장점은 첨부된 도면을 참조하면 다음의 바람직한 구체예로부터 충분히 이해될 수 있을 것이다.
도1A 내지 도1G는 본 발명의 실시에 유용한 예시적인 Fc-융합 단백질의 개략도이다. 도1A는 Fc-항원 또는 Fc-아쥬반트 융합 단백질을 나타내며, 여기서 면역글로불린 중쇄 불변부(1)는 항원 또는 아쥬반트(2)의 N-말단 끝단에 부착되어 있다. 도1B는 Fc-항원 또는 Fc-아쥬반트 융합 단백질을 나타내며, 여기서 면역글로불린 중쇄 불변부(1)는 항원 또는 아쥬반트(2)의 C-말단 끝단에 부착되어 있다. 도1C 및 도1D는 2량체 단백질을 나타내는데, 이 때 폴리펩티드 체인 하나 또는 둘 모두 Fc-항원 또는 Fc-아쥬반트 융합 단백질을 포함한다. 도1C에서는, 1 이상의 폴리펩티드 체인에서 면역글로불린 중쇄 불변부(1)가 항원 또는 아쥬반트(2)의 N-말단 끝단에 부착되어 있으며, 도1D는 면역글로불린 중쇄 불변부(1)가 항원 또는 아쥬반트(2)의 C-말단 끝단에 부착되어 있다. 도1E는 2량체 단백질을 나타내는데, 이 때 폴리펩티드 체인 하나 또는 둘 모두는 Fc-항원-항원, Fc-아쥬반트-아쥬반트, Fc-아쥬반트-항원 또는 Fc-항원-아쥬반트 융합 단백질을 포함한다. 도1F는 2량체 융합 단백질을 나타내는데, 이 때 폴리펩티드 체인 하나 또는 둘 모두는 항원-Fc-아쥬반트 또는 아쥬반트-Fc-항원 융합 단백질을 포함한다. 도1G는 2량체 융합 단백질을 나타내는데, 이 때 폴리펩티드 체인 하나 또는 둘 모두는 항원-아쥬반트-Fc 또는 아쥬반트-항원-Fc 융합 단백질을 포함한다.
도2A 및 도2B는 본 발명의 실시에 유용한 DNA 서열의 개략도이다. 도2A는 인간 Fc 융합 단백질 발현 벡터를 나타낸다. 도2B는 마우스 IgG 2a Fc 융합 단백질의 발현을 위한 유전자 융합을 나태난다.
도3A 내지 도3F는 Fc-항원 융합 단백질, 마우스 Fc-인간 IL-4 수용체 엑토영역(Fc-IL-4R) 융합 단백질로 면역화된 마우스에서 항체 생산시 화학적 및 Fc-사이토킨 아쥬반트의 효과를 나타내는 그래프이다. 도3A에서, 마우스는 프레운드 완전 아쥬반트(CFA) 중의 Fc-IL-4R 및 Fc-IL-2로 면역화하였다. 도3B에서, 마우스는 인산 완충 식염수(PBS) 중의 Fc-IL-4R 로 면역화하였다. 도3C에서, 마우스는 CFA 중의 Fc-IL-4R로 면역화하였다. 도3D에서, 마우스는 PBS 중의 Fc-IL-4R 및 Fc-IL-2로 면역화하였다. 도3E에서, CFA 중의 Fc-IL-4R 및 Fc-GMCSF로 면역화하였다. 도3F에서, 마우스는 PBS 중의 Fc-IL-4R 및 Fc-GMCSF로 면역화하였다. 도3A 내지 도3F에서, 사각, 다이아몬드형 삼각형 형태는 3 마리의 각각의 마우스로부터 나온 데이터를 나타낸다. 항원에 대한 항체 농도를 ELISA로 측정하고, Y-축은 ELISA 판독결과의 광학 밀도를 나타낸다.
도4A 내지 도4D는 아쥬반트로서 Fc-GMCSF의 양을 변화시켜 Fc-항원 융합 단백질의 형태로 인간의 암 항원, PMSA을 이용하여 마우스를 면역화시키는 효과를 나타낸다. 도4A에서, 마우스는 50 ㎍의 PSMA 융합 단백질 단독으로 면역화하였다. 도4B에서, 마우스는 50 ㎍의 PSMA 및 아쥬반트로서 0.05 ㎍의 Fc-GMCSF로 면역화하였다. 도4C에서, 마우스는 50 ㎍의 Fc-PSMA 및 0.5 ㎍의 Fc-GMCSF로 면역화하였다. 도4D에서, 마우스는 50 ㎍의 Fc-PSMA 및 5 ㎍의 Fc-GMCSF로 면역화하였다. 도4A 내지 도4D에서, 사각형, 다이아몬드형 및 삼각형 형태는 3 마리의 각각의 마우스로부터 나온 데이터를 나타낸다.
도5A 내지 도5F는 천연 단백질 (5A 내지 5C) 또는 마우스 Fc-PSMA 융합 단백질(5D-5F)로서 투여된 PSMA 항원에 특이적인 항체 반응과 비교한 그래프이다. 도5A에서, 마우스는 항원으로서 50 ㎍의 PSMA 로 면역화하였다. 도5B에서, 마우스는 50 ㎍의 PSMA 및 아쥬반트로서 0.2 ㎍의 GMCSF로 면역화하였다. 도5C에서, 마우스는 50 ㎍의 PSMA 및 아쥬반트로서 0.5 ㎍의 Fc-GMCSF로 면역화하였다. 도5D에서, 마우 스는 항원으로서 50 ㎍의 Fc-PSMA로 면역화하였다. 도5E에서, 마우스는 항원으로서 50 ㎍의 Fc-PSMA 및 아쥬반트로서 0.2 ㎍의 GMCSF로 면역화하였다. 도5F에서, 마우스는 항원으로서 50 ㎍의 Fc-PSMA 및 아쥬반트로서 0.5 ㎍의 GMCSF로 면역화하였다. 도5A 내지 도5F에서, 사각형, 다이아몬드형 및 삼각형 형태는 3 마리의 각각의 마우스로부터 나온 데이터를 나타낸다. 항원에 대한 항체 농도를 ELISA로 측정하고, Y-축은 ELISA 판독결과의 광학 밀도를 나타낸다.
도6은 인간 PSMA 에 대해 항체 생산시 Fc-PSMA와 함께 투여된 Fc-GMCSF 또는 Fc-F3L의 아쥬반트 효과를 비교한 차트이다. 모든 동물들은 50 ㎍의 Fc-PSMA 단독 또는 아쥬반트로서 표시된 Fc-사이토킨과 배합하여 공여받았다. 3마리의 마우스를 실험마다 테스트하였다.
도7A 및 도7B는 EpCAM 융합 단백질 단독 또는 Fc-GMCSF 아쥬반트와 배합한 개별적인 마우스의 면역원성을 나타내는 그래프이다. 도7A 및 도7B는 추가면역 7일 후 및 14일 후 측정된 항체가를 각각 나타낸다. 처음 면역화 3주 후에 추가면역 하였다. 두 도면에서, 개방형 다이아몬드는 10 ㎍의 Fc-EpCAM 단독으로 피하 면역된 마우스를 나타내고, 실선 삼각형은 10 ㎍의 Fc-EpCAM 및 아쥬반트로서 1 ㎍의 Fc-GMCSF로 피하 면역시킨 마우스를 나타낸다. 항원에 대한 항체 농도를 ELISA로 측정하고, Y-축은 ELISA 판독결과의 광학 밀도를 나타낸다.
도8A 및 도8B는 EpCAM-Fc(Fc 부위 및 항원의 역배향) 단독 또는 Fc-GMCSF 아쥬반트 융합 단백질과 배합하여 마우스에서의 면역원성을 나타내는 그래프이다. 도8A 및 도8B는 면역화 14일 후 및 21일 후(추가면역 7일 후) 측정된 항체가를 각 각 나타낸다. 두 도면에서, 개방형 다이아몬드는 25 ㎍의 EpCAM-Fc 융합 단백질로 면역된 3마리의 마우스의 평균 역가를 나타내고, 실선 삼각형은 25 ㎍의 EpCAM-Fc 및 아쥬반트로서 2.5 ㎍의 Fc-GMCSF로 면역시킨 마우스를 나타낸다. 항원에 대한 항체 농도를 ELISA로 측정하고, Y-축은 ELISA 판독결과의 광학 밀도를 나타낸다.
도9는 EpCAM-Fc-GMCSF 융합 단백질을 암호화하는 플라스미드 벡터를 작제하기 위한 차트이다. 이 경우, 항원 EpCAM이 면역글로불린 중쇄 불변부(Fc 부위)의 아미노 말단 끝단에 융합되고, 아쥬반트 GMCSF는 Fc 부위의 카르복시 말단 끝단에 융합된다.
도10A 내지 도10D는 담체로서 PBS 또는 25 %(w/w) 수크로스 용액을 사용하여 Fc-EpCAM 융합 단백질을 암호화하는 플라스미드 벡터로 주입된 마우스의 항체가를 나타내는 그래프이다. 도10A 내지 도10D는 최초 주입 14일 후, 27일 후, 55일 후 및 69일 후 기록된 항체가를 각각 나타낸다. 상기 도면들에서, 개방형 다이아몬드는 PBS 중의 Fc-EpCAM 암호화 플라스미드를 주입한 개별적인 마우스에 대한 역가를 나타내고, 실선 삼각형은 수크로스 중의 Fc-EpCAM 암호화 플라스미드를 주입하는 개별적인 마우스의 역가를 나타낸다. 항원에 대한 항체 농도를 ELISA로 측정하고, Y-축은 ELISA 판독결과의 광학 밀도를 나타낸다.
도11A 및 도11B는 DNA 예방접종 또는 단백질 주입에 의해 면역화된 마우스로부터 분리된 비장세포의 항원으로 실험실내 자극에 대한 반응으로서 3H-티미딘의 삽입을 자극하는 것을 나타내는 그래프이다. 도11B는 도11A의 하부 데이터의 확장도 이다. 상기 도면들에서, 실선형 다이아몬드는 100 ㎍의 CMV-Fc-EpCAM 융합 단백질을 암호화하는 플라스미드 DNA로 면역화한 마우스로부터 배양한 비장세포를 나타내고, 개방형 원은 100 ㎍의 CMV-EpCAM-Fc 융합 단백질을 암호화하는 플라스미드 DNA로 면역화한 마우스로부터 배양한 비장세포를 나타내며, 십자가는 10 ㎍의 Fc-EpCAM 단백질을 면역화한 마우스로부터 배양한 비장세포를 나타낸다. 이들 비장을 플라스미드 DNA 또는 단백질의 1차 주입하고 3주의 간격을 두고 추가 면역한 70일 후에 마우스로부터 제거하였다.
도12A 및 도12B는 플라스미드 DNA 또는 Fc-EpCAM 단백질 면역화된 마우스로부터 유래된 비장세포를 이용하여 세포독성 T 림프구(CTL) 치사 분석을 나타내는 그래프이다. 도12A는 인간의 EpCAM 단백질을 발현하는 마우스 CT26 종양 세포에 대해 비장세포의 활성을 나타낸다. 도12B는 부모 마우스 CT26 종양 세포에 대한 비장세포의 활성을 나타낸다. 두 도면에서, 개방형 다이아몬드는 (CMV-프로모터)-EpCAM 구조를 수반하는 DNA로 면역화한 비장세포를 나타내고, 개방형 사각형은 (CMV-프로모터)-Fc-EpCAM 융합 구조를 수반하는 DNA로 면역화한 마우스로부터 유래된 비장세포를 나타내며, 개방형 삼각형은 (CMV-프로모터)-EpCAM-Fc 융합 구조를 수반하는 DNA로 면역화한 마우스로부터 유래된 비장세포를 나타내고, 십자가는 Fc-EpCAM 융합 단백질로 면역화한 마우스로부터 유래한 비장세포를 나타낸다. CTL 분석은 10 U/㎖ 의 IL-2로 5일간 배양한 면역화된 마우스로부터 유래된 비장세포를 사용했다. 표지한 목적 세포를 지시된 작동인자와 혼합하여 4시간 동안 항온배양하였다. 방사능의 방출을 사용하여 특정 용해의 비율을 계산하였다.
도13은 PBS 중의 50 ㎍의 Fc-MCSP 융합 단백질 단독 또는 아쥬반트로서 5 ㎍의 Fc-GMCSF와 배합하여 피하 면역시킨 마우스에서 항체가를 나타내는 그래프이다. 실선 다이아몬드는 보통의 혈청에서의 항체가를 나타내고, 개방형 사각형은 Fc-MCSP 융합 단백질 단독으로 면역화한 마우스의 혈청에서의 항체가를 나타내며, 실선 삼각형은 Fc-MCSP 융합 단백질을 아쥬반트로서 Fc-GMCSF와 배합하여 면역화한 마우스의 혈청에서의 항체가를 나타낸다. 항원에 대한 항체의 농도를 ELISA로 측정하고, Y-축은 ELISA 판독결과의 광학 밀도를 나타낸다.
도14A 및 도14B는 Fc-gp41 pep 626 융합 단백질 단독 또는 Fc-사이토킨 아쥬반트와 배합하여 면역화한 마우스에서의 항체가를 나타내는 그래프이다. 도14A 및 도14B는 2차 추가면역 7일 후 및 33일 후 각각 달성된 항체가를 나타낸다. 상기 도면들에서, 개방형 다이아몬드는 25㎍의 Fc-gp41 pep 626 항원 단독으로 경피 주입함으로써 면역화한 마우스에서의 항체가를 나타내고, 개방형 사각형은 25㎍의 Fc-gp41 pep 626 항원을 2.5㎍의 Fc-GMCSF 아쥬반트와 배합하여 경피 주입함으로써 면역화한 마우스에서의 역가를 나타내고, 실선 삼각형은 25㎍의 Fc-gp41 pep 626 항원을 2.5㎍의 Fc-IL2 아쥬반트와 배합하여 경피 주입함으로써 면역화한 마우스에서의 항체가를 나타낸다. 항원에 대한 항체의 농도를 ELISA로 측정하고, Y-축은 ELISA 판독결과의 광학 밀도를 나타낸다.
실시예 1
Fc-항원 및 Fc-아쥬반트 발현 벡터의 작제
마우스 모델에서 Fc 융합 단백질의 면역원성을 적절하게 테스트하기 위하여, 마우스 IgG2a Fc 부위를 암호화하는 핵산 서열을 사용하여 발현 벡터를 작제하였다. 이는 포유 동물에서 면역 반응을 일으키는 각각의 융합 단백질의 Fc 부위의 위험을 감소시킨다. 또한, 마우스 사이토킨을 Fc-아쥬반트 융합 단백질 중에서 융합 파트너로서 사용하였는데, 그 이유는 이들의 생물학적 활성이 고도로 종 특이적일 수 있기 때문이었다. 따라서, 인간 IgG1 Fc 서열을 마우스 IgG2a Fc를 암호화하는 cDNA로부터의 서열(미국 특허 제5,726,044호)로 치환함으로써 이미 보고된 벡터(Lo et al. (1998) PROTEIN ENGINEERING 11:295-500)를 개질시켰다(도 2 참조).
마우스 IgG2a Fc 서열을 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 증폭에 의해 마우스 비장 세포 라이브러리로부터 클로닝하였다. PCR 프라이머는 항원 또는 아쥬반트 사이토킨을 암호화하는 서열과 연결시키기 위하여 3' 말단에 특정 Sma I/Xma I 제한 부위 및 5' 말단에 리더 서열을 결합시키기 위한 어답터(adapter) 서열을 포함하였다. 항원 및 아쥬반트(사이토킨) 서열은 5' Sma I 부위로 제조되었고, Fc와 항원 또는 아쥬반트 단백질 사이에 리딩 프레임 및 전사 중단 시그날 바로 뒤에 위치한 Xho I 부위를 유지하였다.
얻어진 DNA 구조는 마우스 IgG2a H 체인의 힌지 영역에 직접 융합되고 마우스 IgG2a CH2 및 CH3 엑손 및 융합 파트너(항원 또는 아쥬반트 사이토킨)를 통해 연속된 경쇄 리더 서열을 암호하였다. 전사는 CMV 프로모터/인핸서에 의해 조절되었으며, 이는 배양에서 대부분의 형태의 세포에서 발현, 및 DNA 생체내 주사 후 근육 및 기타 세포 형태 중에서의 발현에 유용한 것으로 밝혀졌다. 선택가능한 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 마커 유전자를 각각의 벡터내로 포함시켜 안정하게 형질감염된 클론의 선택을 촉진하였는데, 이는 이 콜리내에서 플라스미드 DNA의 유지에 필요한 서열이었다.
후술하는 예의 Fc-항원 구조는 적절하게 적응된 서열을 설계된 벡터 pdCs-muFc(여기서, "mu"는 Fc가 마우스 기원임을 나타낸다) 내에서 특정 Sma I 내지 Xho I 부위 사이에 적절하게 삼입함으로써 제조되었다.
인간 IL4 수용체(IL-4R)의 엑토도메인(세포외부 부분)을 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 PCR 증폭에 의해 클로닝하였다. 사용된 프라이머는 5' GTCCCGGGTATGAAGGTCTTGCAGGAGC(서열 번호 1) 및 5' CCCCTCGAGCTAGTGCTGCTCGAAGGGCTCCCTG(서열 번호 2)였고, 이것은 pdCs-muFc 벡터내로 삽입하기 위해 각각 Sma I 및 Xho I 부위를 함유하였다. 이를 위하여 PCR 반응 조건을 사용하였으며, 후술하는 클로닝은 다음과 같다. KlenTaq and Polymerase Mix(Clontech, Palo Alto, CA)의 이점 및 특정 프라이머를 사용하여 목적 유전자를 증폭시켰다. 반응 혼합물은 100 ml의 총 부피에 10 mM Treis-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.01 젤라틴(w/v), 각각 dNTP 0.2 mM 및 1.25 유닛의 KlenTaq를 함유하였다. PCR을 30회 반복하였는데, 각각의 주기는 94℃에서 1분간 열변성, 42℃에서 45초간 어니얼링, 및 72℃에서 1분간 프라이머 신장으로 구성되었다. 증폭된 생성물을 이어서 SK 벡터내로 서브클로닝시키고, 이것의 서열을 표준 서열화 기법에 의해 입증하였다.
인간 전립선 특이적 멤브레인 항원(PSMA)의 엑토도메인을, LnCAP 전립선 암종 세포주(ATCC CRL1740)로부터 센스 및 안티센스 체인 각각에 대하여 프라이머 5' AAGCTTAAATCCTCCAATGAAGC(서열 번호 3) 및 5' CTCGAGTTAGGCTACTTCACTCAAAG(서열 번호 4)를 사용하여 PCR에 의해 클로닝하였다. DNA 서열을 확인하고, PCR 단편을 pdCs-muFc 벡터내로 삽입하여 pdCs-muFc-PSMA 융합 구조를 제조하였다.
인간 EpCAM(KS 항원으로 알려져 있음)의 엑토도메인, 대부분의 carcinoma 세포에서 비조절된 상피 세포 표면 단백질을 LnCAP 세포로부터 센스 및 안티센스 체인 각각에 대하여 프라이머 5' CCCCGGGTAAACAAACAGGAAGAATGTGTCTGTG(서열 번호 5) 및 5' CTCGAGTCATTTTAGACCCTGCATTGAG(서열 번호 6)를 사용하여 PCR에 의해 클로닝하였다. 표준 서열화 기법에 의해 DNA 서열을 확인하고, PCR 단편을 pdCs-muFc 벡터내로 삽입하여 pdCs-muFc-EpCAM 융합 구조를 생산하였다. N-말단 융합 파트너로서 EpCAM 엑토도메인을 사용하여 또다른 벡터를 작제하고, 이 경우 PCR 생성물은 EpCAM cDNA의 천연 리더 및 멤브레인 신장(spanning) 도메인의 경계에 대한 성숙한 엑토도메인 서열을 포함하였다. PCR 생성물의 3' 말단은 뮤린 Fc 단편의 Afl II 부위로의 연결을 위해 조작된 Afl II 부위를 함유하였다. 사용된 PCR 프라이머는 5' TCTAGAGCAGCATGGCGCCCCCGC(서열 번호 7) 및 5' CCTTAAGCACCCTGCATTGAGAATTCAG(서열 번호 8)을 포함하였다. 이 경우, 뮤린은 융합 단백질 삽입을 위한 3' 삽입부가 결여되어 있었지만, Fc 암호화 서열의 말단에 전사 종료 시그날를 함유하였다.
HIV gp41의 멤브레인 인접부의 비교적 보존된 부위(Hind III 부위에서 멤브레인-스패닝 부위에 인접한 라이신 잔기까지임)는 짧은 폴리펩티드 항원 서열의 예로서 Fc 융합 단백질로서 발현되었다. HIV IIIB 균주로부터의 단백질 서열이 사용되었지만, 코딩 서열은 높은 함량의 GC의 코돈 편중을 사용하여 최적의 진핵 세포 발현에 대하여 최적화되었다. 하기 서열을 가진 아미노산 잔기 626 내지 669를 암호화하는 DNA 서열 : C CCG GGA TCC CTG ATC CAC TCC CTG ATC GAG GAA TCC CAG AAC CAG CAA GAG AAG AAC GAG CAG GAG CTG CTG GAG CTC GAC AAG TGG GCC TCC CTG TGG AAC TGG TTC AAC ATC ACC AAT TGG CTG TGG TAC ATC AAG TGA CTC GAG(서열 번호 9)를 화학적으로 합성하고 pdCs-muFc 벡터내로 연결하였다. 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SLIHSLIEESQUQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIK(서열 번호 10)이었다.
기타 HIV 단백질을 암호화하는 서열을 사용하여, 천연 인간 IgG1 Fc가 아닌 마우스 IgG2a를 이용해 전술한 바와 같은 Fc-항원 융합 단백질(미국 특허 제5,541,087호 및 제5,726,044호)을 작제하였다. 이들 구조는 본 발명의 또다른 구체예를 나타낸다.
마우스 IgG2a Fc 및 몇가지 마우스 사이토킨을 포함하는 일련의 Fc-아쥬반트(사이토킨) 융합 단백질을 Fc-항원 융합 단백질에서와 동이한 방법으로 작제하였다. 특정 사이토킨과 클로닝 프라이머에 대하여 후술한다.
마우스 IL-2는 PCR 프라이머(센스) 5' GGCCCGGGTAAATCACCCACTTCAAGCTCC(서열 번호 11) 및 (안티센스) 5' CCCTCGAGTTATTGAGGGCTTGTTG(서열 번호 12)를 사용하여 PCR에 의해 뮤린 PBMC로부터 클로닝되었다.
마우스 GMCSF는 PCR 프라이머 (센스) 5' CCCGGGAAAAGCACCCGCCGCTCACCC(서열 번호 13) 및 (안티센스) 5' CTCGAGTCATTTTTGGCTTGGTTTTTTGC(서열 번호 14)를 사용 하여 PCR에 의해 뮤린 PBMC로부터 클로닝하였다.
뮤린 Flt3 리간드는 PCR 프라이머(센스) 5' CAAGCTTACACCTGACTGTTACTTCAGC(서열 번호 15) 및 (안티센스) 5' CTCGAGTCAAGGCTCTGGGAGCTCCGTGGC(서열 번호 16)를 사용하여 PCR에 의해 뮤린 흉선으로부터 클로닝하였다.
마우스 IL-12p35는 PCR 프라이머(센스) 5' CCCCGGGTAGGGTCATTCCAGTCTCTGG(서열 번호 17) 및 (안티센스) 5' CTCGAGTCAGGCGGAGCTCAGATAGC(서열 번호 18)를 사용하여 PCR에 의해 뮤린 PBMC로부터 클로닝하였다.
마우스 IL-2 p40은 PCR 프라이머(센스) 5' TCTAGACCATGTGTCCTCAGAAGCTAAC(서열 번호 19) 및 (안티센스) 5' CTCGAGCTAGGATCGGACCCTGCAG(서열 번호 20)를 사용하여 PCR에 의해 뮤린 PBMC로부터 클로닝하였다.
마우스 IL-2 p40을 제외한 모든 PCR 생성물을 Sma I 내지 Xho I 단편로서 클로닝하여, 표준 DNA 서열화 기법에 의해 분석하여 Fc 부위로서 IgG2a의 뮤린 Fc를 함유하는 pdCs-muFc 벡터에 연결하였다. 마우스 IL-12 p40 PCR 생성물은 CMV 프로모터 인핸서, IL-12의 성숙한 마우스 p40 서브유닛에 직접 융합된 경쇄 리더 서열 및 pdCs-muFc 벡터에서 DHFR 선택성 마커 자리에 네오마이신 내성 유전자를 함유하는 벡터에서 각각 발현되었다(Fc 융합 단백질로서는 아님). 얻어진 벡터를 pNC-mp40으로 명명하는데, 여기서 "N"은 네오마이신 선택 유전자를 나타낸다.
모든 플라스미드 구조는 인간 신장 293 세포에서 일시적인 발현에 의해 특정 융합 단백질의 분비와 합성을 유도하였다. 간단히 말해, 플라스미드를 인산칼슘과의 공침에 의해 인간 신장 단층 세포 293내로 도입하였다[Sambrook et al. (1989) MOLECULAR CLONING - A LABORATORY MANUAL, Cold spring harbor, N.Y.]. 세포를 밤새 방치하고(16 시간), PBS로 세척하여, 새로운 세포 배양 배지(10% 태아 송아지 혈청(FBS)를 함유하는 DMEM)를 공급하였다. 2-3일이 더 경과한 후, 마우스 IgG-Fc 단백질에 대하여 특이적인 항체를 사용하여 분비된 융합 단백질에 대하여 Fc 특이적인 ELISA(Gillies et al. (1989) J. IMMUNOL. METHODS 125:191)에 의해 배양 배지를 시험하였다. 마우스 Fc-IL12의 경우에, Fc-p35 및 p40 발현 플라스미드 DNA 둘다가 동일한 세포 배양물 중에서 일시적으로 발현되어, 세포의 분비 배출 이전에, 헤테로이량체 사이토킨 융합 단백질이 조합되었다(Gillies et al. (1998) J. IMMUNOL. 160:6195).
그 이후에, Fc 융합 단백질을 발현하는 안정하게 형질감염된 세포는, 표준 전기영동 기법에 의해 마우스 NS/0 골수종 세포내로 선형화 DNA를 도입함으로써 생산하였다. 간단히 말해, 세포는 진 펄서 큐벳(Biorad) 중에서 107 세포수/ml로 현탁되고, 현탁액 0.5 ml를 DNA 10 ㎍과 혼합하여, 그 혼합물을 얼음상에서 10분간 냉각시켰다. 0.25 V 및 500 μF로 설정된 진 펄서(Biorad)를 사용하여 전기영동을 수행하였다. 세포를 10분동안 얼음상에서 회수하고, 그 후 이들을 성장 배지 중에서 재현탁킨 다음 96-웰 플레이트에 옮겼다. 전기 영동 후 2일째에서 시작하여, 0.1 μM 메토트렉세이트를 함유하는 선택 배지를 2-3일마다 세포를 공급하였다. 96-웰 플레이트 중에서 성장하는 약물-내성 콜로니는 Fc ELISA 프로토콜에 의해 그 발현을 시험하였다.
마우스 Fc-IL12 융합 단백질의 발현을 위하여, 전술한 바와 같이 이미 마우스 IL-12의 p40 서브유닛을 발현하는 형질감염된 NS/0 형질감염 세포주를 마우스 Fc-p35 서브유닛 발현 벡터로 형질감염시켰다. 전술한 바와 같은 마우스 pNC-mp40벡터에 의한 NS/0 세포의 전기영동, 및 네오마이신 유사체 G418(라이프 사이언스 테크놀러지)를 함유하는 배지 중에서의 선택에 의해 p40 발현 세포주를 얻었다. 제2의 형질감염 후, 생존한 세포 클론을 Fc ELISA 및 마우스 IL-12 ELISA(Genzyme, 캠브리지, 매사추세츠주)에 의해 스크리닝하였다. ,
얻어진 융합 단백질의 구조적 일체성을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 시험하였다. 초기에, 융합 단백질은 작은 체적(매질 당 10-20㎕)의 단백질 A 세파로즈(Repligaen, 니들햄, 매사추세츠주)에 결합되었다. 결합된 물질을, 트윈-20(0.01%)을 함유하는 PBS로 세척한 후, SDS를 함유하는 겔 완충액 중에서 용출시킨 다음, 5% 2-메르캅토에탄올의 존재하에 2분간 비등하였다. 이어서, 감소된 단백질을 pre-cast SDS-PAGE 겔 상에서 전개시키고, 쿠마지 블루로 염색하였다. 제조사의 지시에 따라 안정한 세포 클론으로부터 단백질 A 세파로즈 컬럼(Repligen, 니들햄, 매사추세츠주)를 사용하여 대규모 정제를 수행하였다.
실시예 2
Fc-항원의 면역원성 및 항체 생산에 대한 화학물질 또는 Fc-사이토킨 아쥬반트의 영향
실시예 1에서 제조한 마우스 Fc-huIL-4R 알파 서브유닛 구조를 항원으로 사용하여 동물 모델에서 이들 단백질의 잠재적인 APC-표적화 효과를 시험하였다. IL-4 알파 서브유닛의 엑토도메인은 인간과 마우스 사이에 50% 이상의 서열 동일성을 확보한, 종 사이에 잘 보존된 분자를 나타낸다.
마우스 군에 PBS 또는 프레운드 완전 아쥬반트(CFA) 중에 Fc-항원 융합 단백질(Fc-IL-4R) 50 ㎍을 피하 주사하였다. 일부 군에는 또한 Fc-IL2 또는 Fc-GMCSF의 Fc-아쥬반트 단백질 5 ㎍ 용량(Fc-IL-4R과 혼합됨)을 투여하였다. 2주 후, 마우스에 상기 혼합물을 복강내로 투여하였다. CFA 제제는 면역계의 연속적인 자극을 가능하게 하는 서방성 항원 공급원을 형성하는 미셀을 생성하였다. 또한, CFA 중의 마이코박테리아 단백질은 사이토킨 자극을 통해 강력한 염증 반응을 유도하였고, 이로써 면역 반응을 더욱 증강시켰다. 그러나, CFA는 피부 손상을 비롯한 심각한 부작용을 일으키므로, 인간에서는 사용할 수 없었다. PBS 중 Fc-아쥬반트 융합 단백질의 혼합물은 임의의 식별가능한 피부 반응, 또는 임의의 동물에서 임의의 독성 의 명백한 징후를 일으키지 않는 것으로 나타났다.
면역화 2주 후(즉, 첫번째 주사로부터 28일 후), 동물의 피를 뽑아, 마이크로퍼지 튜브중에 전혈을 응고시키고, 12000 RPM의 고속에서 5분간 응고된 물질과 세포를 회전시켜, 상청액을 수집하였다. 얻어진 혈청을 분석 완충액(0.01% 트윈-20을 함유하는 PBS)으로 희석하고, 인간 IL-4R과 반응성인 항체에 대하여 시험하였다. 인간 Fc-huIL-4R로 코팅된 96-웰 플레이트를 사용하여 항원 특이적 ELISA를 수행하였다. PBS 중 5 ㎍/ml 100 ㎕를 각각의 웰에 가하고, 4℃에서 밤새 배양하였다. 이어서, 항원으로 코팅된 플레이트를 세척하고, 사용전에 블로킹 완충액(1% BSA, PBS 중 1%, 0.01% 트윈-20)으로 블로킹시켰다. 시험 혈청 희석액을 웰 중에서 2시간동안 실온에서 배양하고, 이어서 웰을 분석 완충액으로 8회 세척하였다. 2차 항-마우스 Fc-특이적 호오스 래디시 퍼옥시다아제-접합 항체(1:2000 희석, Jackson ImmunoResearch)를 첨가한 후, 플레이트를 1시간 더 배양하였다. 분석 완충액을 사용하여 추가로 8회 세척한 후, 25 mM 시트르산, 50 mM Na2HPO4, pH5 및 0.03% 새로이 첨가된 H2O2를 함유하는 o-페닐렌디아민 이염산염(OPD) 용액을 첨가하였다. 100 ㎕의 4N H2SO4를 첨가함으로써 약 30분 후에 반응을 중단시켰다. 얻어진 플레이트를 650 nm에서 백그라운드 판독을 자동적으로 감하는 플레이트 판독기 중에서 490 nm에서 판독하였다. 결과를 최적 농도 대 혈청 희석으로서 플로팅하였다. 비교 항체 역가는, 예를 들어 1 O.D. 유닛의 임의의 수치 이하로 광학 농도가 떨어지기 전에 희석되어야 하는 양의 혈청에 의해 측정되었다.
면역화 프로토콜의 결과는 도 3에 제시되어 있다. 이 프로토콜에 의한 PBS 중 마우스 Fc-IL-4R 융합 단백질 단독 주사는 단지 한마리의 마우스에서 항체 반응을 유발하였다(도 3B). 그러나, CFA의 추가는 더 많은 마우스에서 반응을 일으켰으나, 역가는 PBS 중 Fc-IL4R 융합 단백질로 주사한 마우스에서의 반응과 거의 동일하였다(도 3C). PBS 중 Fc-IL4R과 마우스 Fc-IL2 보조제를 함께 투여한 결과 모든 동물에서 반응이 유도되었으나, 각각의 경우에 생산된 항체의 양은 달랐다(도 3D). CFA와 마우스 Fc-IL2 보조제의 병용(도 3A)은 각각 단독 투여에 비해 높은 역가는 가졌다(도 3C 및 3D). PBS 중 마우스 Fc-GMCSF 보조제의 병용은 모든 군에서 가장 강력한 면역 반응을 나타내였으며(도 3E), Fc-GMCSF 보조제 및 CFA 둘다의 조합물 로 면역화된 군을 포함하였다(도 3F). 환언하면, PBS 중 마우스 Fc-GMCSF 아쥬반트는 마우스 Fc-IL4R 항원과 함께 투여되었을 때, CFA의 사용을 필요로 한다는 것이 명백하였다. 이러한 방법은 인간에서 사용하기에 더욱 적합한 것으로 생각되었다.
실시예 3
암 항원, Fc-PSMA 융합 단백질 중 PSMA에 대하여 생산된 항체에 대한 Fc-GMCSF 아쥬반트 용량의 효과
PSMA는 제한된 정상 조직 분포에 의해 현재 관심의 대상이 되는 인간의 종양 관련 표적 항원을 나타낸다. PSMA는 현재 종양 백신 후보약물로서 임상 시험에서 시험되고 있다. 이 실시예에서는, Fc-PSMA 융합 단백질 중 PSMA 항원의 면역원성을 평가하였다.
마우스 Fc-PSMA 융합 단백질은 실시예 1에서와 동일하게 제조하였다. 마우스 군에 Fc-아쥬반트 융합 단백질 Fc-GMCSF의 농도를 달리하면서 PBS 중 마우스 Fc-PSMA 50 ㎍을 피하 주사한 후, 14일 후에 복막내 주사에 의해 면역화하였다. 항체 역가는 Fc-IL4E 융합 단백질에 대하여 실시예 2에 기재된 바와 같이 Fc-PSMA 항원 포획 ELISA에 의해 측정하였다. 그 결과는 도 4에 항체 역가(OD가 1로 감소되었을 때 희석) 대 최초 주사 후 시간으로서 플롯하였다.
Fc-GMCSF의 부재하에, 마우스는 1000 내지 약 20,000에 달하는 PSMA에 대한 항체 역가를 가졌다(도 4A). Fc-GMCSF 0.05 ㎍ 정도를 함께 투여한 결과 역가는 30,000 내지 140,000이 되었다(도 4B). Fc-GMCSF의 10배 증가는 이 암 항원에 대한 항체 역가를 증가시켰다(도 4C 및 4D). 주어진 가장 고용량(마우스 한마리당 Fc- GMCSF 융합 단백질 5 ㎍)은 한번 주사시 GMCSF 약 2 ㎍ 만을 나타내는데, 이 용량은 동물이 면역화되었다는 어떤 전신적 징후나, 마우스 피부상에 명백한 효과도 없었다(도 4D). 또한, CFA와 달리, 비장에서도 명백한 확대가 없었다.
실시예 4
면역화에 대한 항체 반응에 대한 Fc-매개 PSMA 전달의 효과
Fc-항원 및 Fc-아쥬반트 융합 단백질에서 Fc 성분의 특이적인 효과는, 융합 단백질, 비융합 항원 또는 아쥬반트 단백질, 또는 전술한 것의 혼합물을 주사한 마우스에서 유도된 면역 반응을 비교함으로써 시험되었다. 인간 PMSA 계를 이 목적에 사용하였다.
비융합 PSMA는 제조사의 지시에 따라 플라스민을 사용한 인간 Fc-PSMA 융합 단백질(Lo et al. (1998) PROTEIN ENGINEERING 11:295-500)의 단백질 가수 분해에 의해 제조하였다. 방출된 Fc 및 비분해된 Fc-PSMA는 단백질 A 세파로즈(Repligen, Needham, MA)에 흡착시켜 제거하였다.
마우스군(n=3)에 PSMA 50 ㎍ 단독(도 5A), 또는 GMCSF 0.2 ㎍(도 5B) 및 Fc-GMCSF 0.5 ㎍(도 5C)(Fc-GMCSF 0.5 ㎍은 GMCSF 0.2 ㎍을 함유한다)와 함께 피하로 투여하였다. 다른 세트의 마우스에서는, 각각의 마우스에 Fc-PSMA 융합 단백질 0.5 ㎍만을 단독으로(도 5D), 또는 유리 GMCSF 0.2 ㎍(도 5E) 또는 Fc-GMCSF 0.5 ㎍(도 5F)을 피하로 투여하였다. 모든 주사 제제는 화학적 아쥬반트가 없는 PBS 중에 존재하였다. 마우스 Fc-PSMA에 반응성인 항체는 면역화 후 14일에 측정하였다.
PSMA의 면역원성을 위한 Fc-PSMA 융합 단백질 중 Fc-항원 융합 단백질의 Fc 성분의 중요성은, 동물에 화학적 아쥬반트가 없는 PBS 제제를 주사하였을 때, 현저하였다. PBS 중에 투여된 PSMA에 대한 제1회 면역 반응은 실질적으로 없었다(도 5A). 면역화에 GMSCF 또는 Fc-GMSCF를 첨가하는 것은, 한마리의 동물에서 약한 반응을 제외하고는(도 5B), 거의 효과를 가지지 않았다(도 5B 및 5C). 대조적으로, Fc-PSMA만을 주사한 동물은 모든 경우에 강력한 제1회 면역 반응을 보여주었다(도 5D). 유리 GMSCF를 Fc-GMSCF에 첨가하는 것은 효과를 약간 증강시켰으나(도 5E), Fc 융합 단백질로서 항원과 사이토킨 둘다를 함께 투여하는 것은 가장 높은 수준의 반응을 일으켰다(도 5F).
이러한 결과는 Fc-항원 및 Fc-아쥬반트의 조합이 면역 반응을 유도하는데 특히 유용하며, 항원과 자극성 사이토킨을 (가능하게는) APC로 생체내에서 함께 편재화하는 데 명백하게 유리함을 보여준다.
실시예 5
융합 단백질 Fc-GMSCF 또는 Fc-Flt3L의 아쥬반트 효과의 비교
Flt3 리간드(Flt3L)로서 알려진 Flt3에 대한 리간드는 수상 세포의 발생과 성숙에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Soligo et al. (1998) BR. J. HAEMATOL. 101:352-63). 조직 대식 세포와 함께 수상 세포는 가장 중요한 APC인 것으로 여겨진다. 마우스에서의 연구에서, 10일간 매일의 주사는 림프 조직으로부터 회수가능한 수상 세포의 APC 활성과 개수를 증가시키고 이들 세포는 항원을 CD4+ 및 CD8+ 세포에 제시하는 데 매우 강력한 것으로 나타났다. 피부의 랑게르한스 세포는 포획되어 국소 림프절로 이동한 후 항원을 제시할 수 있는 일정 형태의 수상 세포를 나타내는 것으로 여겨진다. 대부분의 수상 세포는 대식 세포(예를 들어, FcνRI) 상에 통상적으로 발견되는 Fc 수용체 어레이를 나타내지 않기 때문에, Fc 융합 단백질의 공편재 효과가 이러한 APC와 관계되어 있는가 여부를 예측할 수 없었다.
Flt-3L이 아쥬반트로서 작용을 하는지 여부를 시험하기 위하여, 마우스 군에 마우스 Fc-GMCSF 융합 단백질(대식 세포 및 과립구의 강력한 자극제)을 사용하기 보다는, Fc-PSMA 및 마우스 Fc-Flt3L을 주사하였다. 이 경우, 임의의 아쥬반트 효과는 활성화 및 수상 세포의 포획에 의해 매개되는 것으로 생각되었는데, 이것은 궁극적으로 PMSA에 대한 항체 반응을 일으킨다. 결과를 도 6에 제시하였다.
이 연구는 마우스 Fc-Flt3L이 적어도 동량의 Fc-GMCSF 및 항-PSMA 항체를 자극하는 강력한 아쥬반트임을 의미한다. 이 결과는, Fc-항원 및 Fc-보조제의 조합이 면역 반응을 유도하는 데 특히 강력할 수 있음을 의미한다. 또한, 그 결과는 수상 APC가 APC뿐 아니라 Fc-사이토킨과 Fc-항원에 의해 표적화될 수 있음이 명백함을 보여주는데, 이것은 Fc-수용체의 한가지 이상의 형태가 이들 세포 상에 존재함을 암시한다.
실시예 6
Fc-EpCAM 및 DpCAM-Fc 융합 단백질
또다른 잠재적으로 중요한 인간 암 항원인 EpCAM(또한 KSA 및 17-1A 항원)은, 실시예 1에 기재된 바와 같은 플라스미드 및 방법을 사용하여 마우스 IgG2a Fc 부위를 가진 융합 단백질로서 제조되었고, 단독으로, 또는 보조제로서 Fc-GMCSF와 함께 투여되었다. 마우스에게 피하 투여하고, 3주 후 PBS 중의 Fc-GMCSF 1 ㎍ 및 Fc-EpCAM 10 ㎍으로 추가 항원접종하였다. 대조 마우스에는 Fc-GMCSF를 투여하지 않았다. EpCAM에 대해 특이적인 항체의 역가는 추가 항원접종된 후 7일(도 7A) 및 14일(도 7B)에 측정하였다. 이 결과는, Fc-EpCAM이 단독으로 투여되었을 때 강력한 면역원이라는 것(개방 다이아몬드)과 Fc-GMSCF가 이 항원에 대한 반응을 추가로 증강시킬 수 있다는 것(막힌 삼각형)을 의미한다.
또한, EpCAM 항원은 EpCAM-muFc로서 Fc 단편에 대한 역방향으로 표현되었다( 실시예 1 및 도 1B 참조). 이 분자를 사용하여 피하 주사에 의한 Balb/c 마우스를 면역화하였다. 고용량의 EpCAM-Fc 융합 단백질이 사용되었고(투여 당 25 ㎍), 아쥬반트의 양(Fc-GMCSF 2.5 ㎍)은 또한 증가되었다. EpCAM에 대해 특이적인 항체의 역가를 면역화 후 14일(도 8A) 및 21일(도 8B)에서 측정하였다. EpCAM-Fc 융합 단백질 단독은 Fc-GMCSF이 없는 경우에 충분한 면역원성을 가졌다(도 8A 및 8B, 개방 다이아몬드). Fc-사이토킨의 첨가는 항체의 역가를 약 3배 향상시켰다(도 8A 및 8B, 검정색 삼각형)
EcCAM에 대한 면역 반응이 이러한 항원을 발현하는 종양 세포로부터 포유 동물을 보호할 수 있는가를 시험하기 위하여, 비면역화된 마우스 또는 EpCAM-Fc 융합 단백질(일부 경우에 있어서는 Fc-사이토킨)로 면역화된 마우스의 꼬리 정맥에 인간 EpCAM으로 형질감염된 105 CT26 마우스 대장 암 세포를 주사하였다(Gillies et al. (1998) J. IMMUNOL. 160:6195). 21일 후, 동물을 치사시키고, 폐 전이의 정도를 폐의 표면 코팅의 관점에서 단계화함으로써, 그리고 및 폐의 중량을 측정하고 이를 정상 동물의 폐와 비교하여 종양의 질량에 기여하는 중량 증가 차이를 측정함으로써 평가하였다. 표 1에 제시된 결과는 EpCAM-Fc 융합 단백질로 면역화된 동물을 포함하여, 대조 마우스에 비해 면역화된 마우스에서 종양 전이가 통계적으로 유의성 있게 감소되었음을 나타낸다. 항원으로서 Fc-EpCAM 융합 단백질을 사용하는 경우에도 동일한 결과가 얻어졌다.
처리 군 전이 스코어 Av 폐 중량(mg)
대조군 4, 4, 4, 1, 1 412 ±130
EpCAM-Fc 0, 0, 0, 0, 0 210 ±21
EpCAM-Fc + Fc-GM 0, 0, 0, 0, 0 240 ±19
EpCAM-Fc + Fc-IL2 0, 0, 0, 0, 0 230 ±19
전이 스코어는 하기 등위를 사용한 폐의 표면 코팅을 기초로 한 것이다 : 1 = 1-25% 코팅; 2 = 26-50% 코팅; 3= 51-75 코팅; 및 4 = 76-100% 코팅
실시예 7
단일 융합 단백질 중에 항원-Fc 및 사이토킨 아쥬반트의 조합
실시예 6에 기재된 단백질, EpCAM-Fc는 카복실 단백질 도메인과 같은 면역글로불린 Fc 부위에 연결된 N-말단 항원을 예시한다. 이 단백질 및 이와 유사한 기타 단백질을 Fc-융합 단백질, 예를 들어 Fc-사이토킨과 함께 투여하여 항원에 대한 면역 반응을 증강시킬 수 있다. 대안적으로, 항원, 면역글로불린 중쇄 불변부 및 아쥬반트 단백질(예를 들어, 사이토킨)은 하나의 융합 단백질, 예를 들어 EpCAM-Fc-GMCSF 융합 단백질로서 생산될 수 있다.
이 단백질의 발현 플라스미드는 뮤린 IgG2a Fc 및 GM-CSF 서열을 사용하여 구성되어, 구조는 마우스 모델에서 평가될 수 있었다. 리더-EpCAM-Fc 암호화 서열을 함유하는 작은 XbaI 내지 Sma I 단편을 천연 EpCAM-Fc 발현 벡터(실시예 1)로부터 얻어서, Fc-GMCSF 발현 벡터의 큰 Sma I 내지 Xba I의 단편에 연결하였다(도 9).
얻어진 벡터, pdCs-EpCAM-Fc-GMCSF는 일시적인 발현을 위해 인산칼슘 침전법을 사용하여 293 세포내로 도입하였고, 안정한 발현을 위해 전기영동을 사용하여 NS/0 세포내로 도입하였다. 세포를 메토트렉세이트(0.1 μM)을 함유하는 배지에서 배양하여 안정한 형질감염체를 선택하였다. 발현 클론은 Fc ELISA(실시예 1 참조)에 의해 확인하였고, 높은 수준의 생산자(producer)가 배양물에 널리 분포하고 있었다. EpCAM-Fc-GMCSF 단백질을 단백질 A 세파로즈(Repligen, 니들햄, 매사추세츠주)에 결합시키고 이로부터 용출시킴으로써 상태조절된 배지로부터 정제하고, 구조적인 일체성을 SDS-PAGE에 의해 분석한 후 2-메르캅토에탄올로 환원시켰다. 결과는, EpCAM 및 GMCSF의 단일 체인 융합에 대해 예측된 바와 같이, 단백질이 약 90 kDa의 분자량을 가졌음을 나타내었다.
결합된 융합 단백질의 상대적인 면역원성을 비교하기 위하여, 마우스에게 조합된 EpCAM-Fc-GMCSF 및 조합된 각각의 융합 단백질: EpCAM-Fc 및 Fc-GMCSF을 동량 피하 주사하였다. 14일 후 동일한 주사를 투여하고, 추가 항원 접종 후 7일째에 인간 EpCAM의 특이적인 항체 반응성을 시험하였다. 그와 동일한 접근법은 기타 자극성 사이토킨, 예를 들어 IL-2, IL-12 및 Flt3L 뿐 아니라 기타 단백질 또는 펩티드 항원에 사용되었다.
실시예 8
DNA 주사에 의한 Fc-항원의 면역화
포유 동물 세포에서 마우스 Fc-EpCAM 및 EpCAM-Fc의 형질감염 및 생산에 사용된 것과 동일한 발현 벡터를 Balb/c 마우스 군의 뒷다리 근육에 "네이키드" 플라스미드 DNA로서 주사하였다. DNA를 0.5 mg/ml의 농도로 주사하였고, 100 ㎍의 총량을 PBS 중 또는 25%(w/v) 수크로즈 용액 중에서 투여하였다. 주사는 총 3 회, 매 3주마다 반복되었다. 항체 반응은, 상이한 시간에서 측정되었고, 포획을 위해 인간 Fc-EpCAM으로 코팅된 96 웰 플레이트를 사용하였고, 검출을 위해 HRP-접합된 항-마우스 Fc 특이적인 폴리클로날 항체(잭슨 이뮤노리써치)를 사용하는 ELISA에 의해 정량되었다. 도 10에 제시된 데이타는 주사 후 14일(도 10A), 27일(도 10B), 55일(도 10C) 및 69일(도 10D)에 기록한 항체 역가를 나타낸다.
도 10에 제시된 결과는 특이 항체-EpCAM 항체의 낮은 역가가 두가지 제제 모두를 사용한 처음 1개월동안 유도되었음을 나타낸다(도 10A 및 10B). 더 높은 역가는 55일에서 얻어졌고(도 10C), 보다 높은 역가는 69일에 얻어졌다(도 10D). 비록 역가는 보다 낮았지만, 유사한 결과는 EpCAM-Fc 발현 벡터의 DNA 주사를 사용한 경우에도 얻어졌다. 이들 데이타는 단백질 항원 및 면역글로불린 Fc 부위를 포함하는 융합 분자로서 발현된 항원은 네이키드 DNA의 주사에 의해 도입된 경우에 면역 반응을 유도할 수 있으며, 지속적인 항원 노출은 대부분의 동물에서 지연된 반응을 유발한다는 것을 나타낸다.
세포성 면역 반응은 시험관내에서 다른 농도의 Fc-EpCAM 단백질에 의해 자극 된 단백질 면역화 마우스 또는 백신화 DNA로부터의 비장 세포를 배양함으로써 시험되었다. 도 11에 제시된 데이타(상부 판넬)은 CMV 프로모터-EpCAM-Fc(개방 원형) 또는 CMV 프로모터-Fc-EpCAM(폐쇄 다이아몬드) 발현 벡터를 사용한 Fc-EpCAM 단백질(십자) 및 DNA 백신화로 면역화된 동물에서 항원에 대한 증식적 반응(3H-티미딘 혼입에 의해 측정됨)을 나타낸다. 단백질로 면역화된 동물은 심지어 매우 낮은 용량에서도 항원에 대한 보다 큰 반응을 보였다. DNA로 백신화된 동물로부터의 반응(또한 도 11의 하부 판넬에서 다른 스케일 상에 도시됨)은 용량 의존적이었지만, 단백질이 주사된 마우스에 비해 낮았다. 이들 반응은 MHC 제2형에 의해 제한된 CD4+ T 세포 반응의 특성이다.
세포독성 활성(일반적으로 MHC 제1형에 의해 제한되는 T 세포 반응을 의미함)을 시험하기 위하여, DNA 또는 단백질로 면역화된 마우스로부터의 비장 배양물을 IL-2 약 10 U/ml의 존재하에 5일간 배양하였다. 효과기 세포는 배양된 비장세포였고, 표적 세포는 표지된, 인간 EpCAM-발현 CR26 대장 암종 세포(Balb/c 마우스에 대하여 상승적임) 또는 표지된 모세포(비형질감염된 CT26 세포)였다. 효과기 세포 및 표적 세포를 다른 비율로 혼합하여, 면역 정도를 측정하였다. 세정제의 존재하에 표지된 표적 세포를 배양함으로써 100% 면역치를 얻었고, 방출된 표지의 양을 측정하였다.
결과는 도 12에 제시되어 있는데, 도 12A는 인간 EpCAM을 발현하는 CT26에 대한 비장세포의 활성을 보여주는 반면, 도 12B는 CT26 모세포에 대한 비장세포의 활성을 보여준다. 두가지 도면에 있어서, 개방 다이아몬드는 EpCAM 구조를 보유한 DNA로 면역화된 마우스로부터 분리된 비장 세포를 나타내고, 개방 사각형은 Fc-EpCAM 융합 구조를 보유한 DNA로 면역화된 마우스로부터 분리된 비장 세포를 나타내며, 개방 삼각형은 EpCAM-Fc 융합 단백질을 보유한 DNA로 면역화된 마우스로부터 분리된 비장 세포를 나타내며, 십자가는 Fc-EpCAM 융합 단백질로 면역화된 마우스로부터 분리된 비장 세포를 나타낸다.
도 12는, DNA 백신이 표적 세포 둘다에 대한 약한 세포독성 반응을 유도하였지만, 상당히 높은 세포독성이 단백질로 면역화된 마우스에서 관찰되었다. 분석에서 EpCAM을 발현하는 CT26 종양 모세포 및 CT26 종양 세포 둘다가 사멸되었다. CT26 모세포에 대하여 관찰된 세포독성은, 이들 세포가 아미노산 수준에서 인간 단백질과 약 81% 동일한 마우스 EpCAM 동족체를 높은 수준으로 발현할 수 있기 때문일 수도 있다. 그럼에도 불구하고, Fc-EpCAM 단백질 면역화는 인간 EpCAM을 발현하는 CT26 종양 세포에 대하여 유의성 있는 정도의 세포독성 활성을 유도하였고, 이로써 실시예 6에 기재된 강력한 종양-보호 활성을 설명할 수 있다.
실시예 9
단백질 암 항원의 서브-영역을 함유하는 Fc-융합 단백질을 이용한 면역화
몇가지 전체 단백질이 면역 치료에 대한 항원으로서 유용하지 않다고 하더라도, 더 작은 서브 영역의 단백질이 보다 유효할 수 있다. 예를 들어, 단백질은 이들을 보다 덜 면역원성을 가지도록 전사 후 개질된 도메인을 함유할 수 있어서, 이로써 실제 폴리펩티드 성분에 대한 면역 반응성을 감소시킬 수 있다. 큰 단백질은 항체-의존성 세포독성(ADCC), 항-종양 면역 반응의 잠재적으로 중요한 성분을 매개하지 않으며, 항원의 비폴리펩티드 부분과만 반응하는 항체를 유도할 수 있다. 이러한 경우의 좋은 예는 몇가지 형태의 뇌암 및 거의 모든 흑색종 발현되는 인간 흑색종-특이적 콘드로이친 황산염 프로테오글리칸(MCSP)을 들 수 있다. 9.2.27로 알려진 항체(Bumol et al. (1982) PROC. NATL. ACAD. SCI. 79:1245-1249)는 높은 친화성으로 이 단백질에 결합하지만, 어떠한 효과기 작용, ADCC 또는 보체 매개 세포독성(CDC)을 매개하지 않는다. 매우 부분적으로 인간화된(키메라) 형태의 이 항체는 이러한 활성을 매개하지 않는다.
이 큰 분자의 보다 최적의 표적 부위에 대한 보다 집중된 반응을 유도하기 위하여, 단백질 서열 중 글리칸 부착 부위로 추정되는 곳을 동정하였다(Pluske et al. (1996) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 93:9710-9715). 세포 표면 멤브레인 스패닝 서열로부터 떨어지지 않고, 글리칸 부착 부위로부터 일정 거리에 있는 서브-영역을 선택하였다.
펩티드 서열:
QGATLRLDPTVLDAGELANRTGSVPRFRLLEGRHGRVVRVPRARTEPGGSQLVEQFTQQDLEDGRLGLEVGRPEGRAPGPAGD(서열 번호 21)를 역전사하고, 얻어진 DNA 서열을 화학적으로 합성하여, 전술한 실시예에 사용된 것과 동일한 제한 부위를 사용하여 pdCs-Fc-X 발현 벡터내로 연결시켰다. 전사 종료 부위를 3' 말단의, 최종 아미노산을 암호화하는 서열 바로 다음에 첨가하고, 특정한 Xho I 부위를 첨가하였다. 최종 발현 플라스미드는 NS/0 골수종 세포로 전기영동되어, 실시예 1에 기재된 바와 같은 목적하는 단백질을 발현하는 안정한 형질전환체를 얻었다.
단백질 A 세파로즈 크로마토그래피(Repligen, 니들햄, 매사추세츠주)를 이용한 배양 상청액으로부터 Fc-MCSP 단백질을 정제하였다. 항체 역가는 PBS 중 Gc-MCSP 융합 단백질 50 ㎍을 단독으로, 또는 보조제로서 5 ㎍의 Fc-GMCSF와 함께 피하로 면역화시킨 Balb/c 마우스에서 측정하였다. 이 결과를 도 13에 도시한다. 검정색 다이아몬드는 정상 혈청에서의 항체 역가를 나타내고, 개방된 사각형은 Fc-MCSP로 면역화된 마우스의 혈청 중 항체의 역가를 나타내며, 검정색 삼각형은 Fc-MCSP 및 Fc-GMCSF 아쥬반트로 면역화된 마우스의 혈청 중 항체 역가를 나타낸다.
이러한 MCSP 서브 영역에 대한 특정 면역 반응은 14일에 검출되었고, 추가 면역화 이후 상당히 증가되었다. 이 결과는 Fc-MCSP 단독으로 면역화된 마우스에 비해, Fc-GMCSF 및 Fc-MCSP 둘다로 면역화된 마우스가 MCSP(검정색 삼각형)에 대한 더욱 높은 항체 역가를 자극하였음을 나타낸다.
실시예 10
바이러스 항원을 함유하는 Fc-융합 단백질을 사용한 면역화
AIDS를 유발하는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에 대한 유효한 백신의 개발은 백신 연구의 가장 중요한 목적 중 하나이다. 최근에, 몇가지 보고는 바이러스 외치의 어떤 특성이 면역 반응을 부적절한 에피토프에 반응하도록 함으로써 바이러스 입자의 중요하고 잠재적인 중화 부위을 은폐시키는 역할을 한다고 하였다. 이들은 데코이(decoy)의 역할을 하는 고도의 면역우성(immunodominant) 항원의 존재, 중요한 에피토프의 면역원성을 물리적으로 은폐하고 감소시키는 광범위한 글리코실화를 포함한다(Wyagtt et al. (1998) NATURE 393:705-11).
데코이 메커니즘을 회피하는 한가지 가능성은 바이러스 외피 유전자의 작은 영역을 발현시켜 보호되지 않은 면역우성 반응을 피하거나 중화 반응을 유도하는 것이다. 작은 서브유닛 백신의 한가지 문제점은 합성 펩티드 또는 작은 단백질로서의 감소된 면역원성이다. 한가지 접근법은 단백질 또는 펩티드와 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)과 같은 면역원성 캐리어 단백질을 결합시키는 것이었다. 이것은 단백질 또는 펩티드에 기인하여 KLH에 대한 강력한 반응을 유발한다. 또다른 접근법은 엑토도메인 gp41(바이러스 외피의 고정화 도메인, gp160)의 서브-영역에 대하여 실시예 1에 기재된 바와 같은 Fc를 사용하여 융합 단백질을 제조하는 것이다. 기타 캐리어와는 달리, 면역글로불린 영역은 "자기"인 것으로 나타났으며, 이로써 임의의 면역우성 효과를 최소화한다.
Fc-gp41pep626 융합 구조는 마우스 면역글로불린 Fc 부위의 카복실 말단에 융합된 44개의 아미노산 폴리펩티드를 함유하였다. 이 부위의 HIV 균주 IIIB 서열은 N-결합된 글리코실화를 위한 시그날을 함유하고 있어서, 안정한 형질감염에 의해 NS/0 골수종 세포 중에, 또는 일시적인 발현에 의해 293 세포 중에서 생산된 Fc-gp41pep626 융합 단백질은 SDS-PAGE 분석 상에 고도의 운동성 변화를 보여주었는데, 이로써 글리코실화 영역에 있어서 이종성을 나타낸다.
이러한 바이러스 항원이 매우 작고(길이가 44 아미노산 잔기), 이종적으로 글리코실화되었다는 사실에도 불구하고, Balb/c 마우스에서 면역 반응을 유도하는 것이 가능하였다(도 14 참조). 이 경우, 제1일에 5마리의 마우스군에 Fc- gp41pep626 25 ㎍을 단독으로(개방된 다이아몬드), 또는 Fc-아쥬반트 융합 단백질, Fc-GMCSF(개방된 사각형) 또는 Fc-IL2(검정색 삼각형) 2.5 ㎍과 함께 경피내로 주사하였고, 2주의 간격으로 2번 더 주사하였다. 도 14A 및 14B는 2회째 추가 면역접종 후 7일 및 33일에서 각각 얻은 항체 역가를 나타낸다.
이 면역 반응은 Fc-사이토킨의 공투여에 더욱 의존하였고, 높은 역가에 도달하는 데 더 오래 걸렸다. 높은 면역 반응은 글리코실화 시그날을 함유하지 않은 이 서열의 개질에 의해(사실상, 다수의 균주는 이 부위를 암호하지 않는다) 또는 시험관내에서 탄수화물을 효소적으로 제거함으로써 유도될 수 있음을 생각할 수 있다.
실시예 11
세포 표면 분자의 세포외 도메인을 함유하는 Fc-융합 단백질의 아쥬반트 활성
Fc-아쥬반트 융합 단백질을 작제하기 위하여, 멤브레인에 결합될 수 있는 단백질의 Fc 세포외 도메인에 융합시키는 것이 때로 유용하다. 예를 들어, CD40 리간드(CD40L)는 Fc의 C 말단의 N 말단에서 융합된다. 링커(linker)는 선택적으로 사용된다.
CD40L은 그것의 수용체인 CD40이 B 세포의 표면상에 발현되고, T 세포에 의한 B 세포의 자극에 관계되어 있기 때문에 유용하다. 유사 종양 괴사 인자, CD40L은 세포 표면상에 그것의 수용체의 삼량체화 또는 이량체화를 유발하는 삼량체이다. 그 결과, 세포내 수용체 도메인이 접촉하게 되어 시그날 변환이 일어난다. 또한, 유사 TNF, CD40L은 멤브레인에 결합되어 있을 수 있지만, 세포 표면으로부터 분열될 수 있고, 사이토킨과 같은 작용을 할 수 있다.
Fc-CD40L 융합 단백질을 Fc-항원 융합 단백질과 함께 동물에게 투여한다. 대조 실험에서는, Fc-CD40L 단백질과 Fc-항원 단백질을 다른 세트의 동물들에게 투여한다. 융합 단백질을 주사한 동물들은 각각의 융합 단백질을 개별적으로 주사한 동물에 비해 보다 높은 역가의 항체를 생산함을 알 수 있다.
대안으로서, 항원 및 CD40L 부분을 함유하는 단일 Fc-융합 단백질을 Fc, CD40L, 및 항원 부분 사이에 선택적 링커(L)와 함께 사용한다. 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단의 순서 Fc-(L)-항원-(L)-CD40L, Fc-(L)-CD40L-(L)-항원, 항원)L)-CD40L-(L)-Fc, CD40L-(L)-항원-(L)-Fc, 항원-(L)-Fc-(L)-CD40L, 또는 CD40L-Fc-(L)-항원-(L)일 수 있다. Fc, 항원, 및 CD40L을 함유하는 융합 단백질을 동물에게 주사하고 항체 역가를 측정한다. CD40L과 항원 양자를 함유하는 융합 단백질의 주사에 의해 얻어진 항체 역가가 Fc 및 항원 또는 Fc 및 CD40L만을 함유하는 융합 단백질의 주사에 의해 얻어진 역가에 비해 높음을 알 수 있다.
전술한 융합 단백질의 전술한 투여에서, 동물에게 정맥내로, 피하로, 또는 기타 적당한 투여 방법에 의해 주사한다. 항원 및/또는 아쥬반트의 제1회 및 추가 투여 사이의 시간 및 항체 역가 측정은 상기 실시예에서 기재된 바와 같다. 대안적으로, 표준 용량 및 분석법을 사용한다.
등가물
본 발명은 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 기타 특정 형태로 예시될 수 있다. 따라서, 전술한 실시예는 본원에 기술된 발명을 제한하지 않고 예시적인 것으 로서 해석되어야 한다. 그러므로, 본 발명의 범위는 전술한 발명의 상세한 설명에 의해 제한되지 않고 특허청구범위에 의해서 정해지며, 특허청구범위와 동일성 범위내의 모든 변경은 본 발명의 범위에 포함되어야 한다.
참고 문헌
전술한 본원에 인용된 모든 특허 문서 및 과학 공개물에 교시된 내용은 본원에 참고로 포함된다.
<110> LEXIGEN PHARMACEUTICALS CORP. <120> FC FUSION PROTEINS FOR ENHANCING THE IMMUNOGENICITY OF PROTEIN AND PEPTIDE ANTIGENS <130> LEX-007PC <150> US 06/144,965 <151> 1999-07-21 <160> 22 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:IL-4R primer <400> 1 gtcccgggta tgaaggtctt gcaggagc 28 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:IL-4R primer <400> 2 cccctcgagc tagtgctgct cgaagggctc cctg 34 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PSMA primer <400> 3 aagcttaaat cctccaatga agc 23 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PSMA primer <400> 4 ctcgagttag gctacttcac tcaaag 26 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:EpCAM primer <400> 5 ccccgggtaa acaggaagaa tgtgtctgtg 30 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:EpCAM primer <400> 6 ctcgagtcat tttagaccct gcattgag 28 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:EpCAM primer <400> 7 tctagagcag catggcgccc ccgc 24 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:EpCAM primer <400> 8 ccttaagcac cctgcattga gaattcag 28 <210> 9 <211> 148 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA encoding amino acid residues 626-669 of HIV IIIB gp41 <400> 9 cccgggatcc ctgatccact ccctgatcga ggaatcccag aaccagcaag agaagaacga 60 gcaggagctg ctggagctcg acaagtgggc ctccctgtgg aactggttca acatcaccaa 120 ttggctgtgg tacatcaagt gactcgag 148 <210> 10 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Fused polypeptide from pdC-muFC vector <400> 10 Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys 1 5 10 15 Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn 20 25 30 Trp Phe Asn Ile Thr Asn Trp Leu Trp Tyr Ile Lys 35 40 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primers for mouse IL2 <400> 11 ggcccgggta aagcacccac ttcaagctcc 30 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer for mouse IL2 <400> 12 ccctcgagtt attgagggct tgttg 25 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer for mouse GMCSF <400> 13 cccgggaaaa gcacccgccc gctcaccc 28 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer for mouse GMCSF <400> 14 ctcgagtcat ttttggcttg gttttttgc 29 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer for mouse Flt3 ligand <400> 15 caagcttaca cctgactgtt acttcagc 28 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer for mouse Flt3 ligand <400> 16 ctcgagtcaa ggctctggga gctccgtggc 30 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer for mouse IL-12p35 <400> 17 ccccgggtag ggtcattcca gtctctgg 28 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer for mouse IL-12p35 <400> 18 ctcgagtcag gcggagctca gatagc 26 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer for mouse IL12 p40 <400> 19 tctagaccat gtgtcctcag aagctaac 28 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer for mouse IL12 p40 <400> 20 ctcgagctag gatcggaccc tgcag 25 <210> 21 <211> 83 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MSCP peptide <400> 21 Gln Gly Ala Thr Leu Arg Leu Asp Pro Thr Val Leu Asp Ala Gly Glu 1 5 10 15 Leu Ala Asn Arg Thr Gly Ser Val Pro Arg Phe Arg Leu Leu Glu Gly 20 25 30 Arg His Gly Arg Val Val Arg Val Pro Arg Ala Arg Thr Glu Pro Gly 35 40 45 Gly Ser Gln Leu Val Glu Gln Phe Thr Gln Gln Asp Leu Glu Asp Gly 50 55 60 Arg Leu Gly Leu Glu Val Gly Arg Pro Glu Gly Arg Ala Pro Gly Pro 65 70 75 80 Ala Gly Asp <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:oligodeoxynucleotide that may be used as an adjuvant <400> 22 tccatgacgt tcctgacgtt 20

Claims (48)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 하기를 포함하는, 포유동물에서 펩티드- 또는 단백질- 항원에 대한 강화된 면역 반응을 유도하는 조성물로서, 상기 Fc 부분이 동일한 종으로부터 유래하며, Fc 수용체에 결합하는 능력을 가지고 있는 것인 조성물:
    (i) 폴리펩티드 결합에 의하여 항원에 연결되어 있는, IgG1 또는 IgG2 의 Fc 부분을 포함하는 융합 단백질 [여기서, 항원은 전립선-특이적 막 항원(PSMA), EpCAM 또는 17-1A 항원, 흑색종-특이적 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸(MCSP) 항원, gp41 또는 gp160 항원 및 그 엑토도메인(ectodomain)으로 이루어진 군으로부터 선택됨], 및
    (ii) 폴리펩티드 결합에 의하여 아쥬반트 단백질에 연결되어 있는, IgG1 또는 IgG2 의 Fc 부분을 포함하는 융합 단백질 [여기서, 아쥬반트 단백질은 사이토킨이며, 상기 사이토킨은 IFN-감마, IL-2, IL-4, IL-12, IL-18, TNF 및 GMCSF 로 이루어진 군으로부터 선택됨].
  47. 제 46 항에 있어서, 상기 사이토킨이 GMCSF 또는 IL-2 인 것인 조성물.
  48. 제 46 항 또는 제 47 항에 있어서, 상기 항원이 EpCAM 또는 17-1A 항원인 것인 조성물.
KR1020027000879A 1999-07-21 2000-07-21 단백질 및 펩티드 항원의 면역원성을 증강시키는 Ｆｃ융합 단백질 KR100689739B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14496599P 1999-07-21 1999-07-21
US60/144,965 1999-07-21

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20020020794A KR20020020794A (ko) 2002-03-15
KR100689739B1 true KR100689739B1 (ko) 2007-03-09

Family

ID=22510982

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020027000879A KR100689739B1 (ko) 1999-07-21 2000-07-21 단백질 및 펩티드 항원의 면역원성을 증강시키는 Ｆｃ융합 단백질

Country Status (22)

Country Link
US (2) US7955590B2 (ko)
EP (1) EP1198250B8 (ko)
JP (1) JP4764585B2 (ko)
KR (1) KR100689739B1 (ko)
CN (1) CN1308037C (ko)
AT (1) ATE374042T1 (ko)
AU (1) AU779388B2 (ko)
BR (1) BR0012569A (ko)
CA (1) CA2378866C (ko)
CZ (1) CZ304884B6 (ko)
DE (1) DE60036552T2 (ko)
DK (1) DK1198250T3 (ko)
ES (1) ES2292457T3 (ko)
HU (1) HUP0202796A2 (ko)
MX (1) MXPA02000746A (ko)
NO (1) NO20020255L (ko)
PL (1) PL201664B1 (ko)
PT (1) PT1198250E (ko)
RU (1) RU2248214C2 (ko)
SK (1) SK782002A3 (ko)
WO (1) WO2001007081A1 (ko)
ZA (1) ZA200200501B (ko)

Families Citing this family (115)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002094852A2 (en) * 2001-05-24 2002-11-28 Zymogenetics, Inc. Taci-immunoglobulin fusion proteins
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
DK1252192T3 (da) 2000-02-11 2006-11-20 Merck Patent Gmbh Forbedring af antistofbaserede fusionsproteiners serumhalveringstid
GB0102145D0 (en) 2001-01-26 2001-03-14 Scancell Ltd Substances
EP1363931A4 (en) * 2001-02-01 2004-04-07 Tanox Inc METHODS OF PRODUCING AND IDENTIFYING MONOCLONAL ANTIBODIES DIRECTED AGAINST A LARGE NUMBER OF HUMAN ANTIGENS
MXPA03008031A (es) 2001-03-07 2003-12-04 Merck Patent Gmbh Tecnologia de expresion para proteinas que contienen porcion de anticuerpo isotipo hibrida.
WO2002079415A2 (en) 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
BR0209177A (pt) 2001-05-03 2004-10-05 Merck Patent Gmbh Anticorpo especìfico a tumor recombinante e uso do mesmo
PL206975B1 (pl) 2001-12-04 2010-10-29 Merck Patent Gmbh Immunocytokiny o modulowanej selektywności oraz ich zastosowanie
DE10160248A1 (de) * 2001-12-07 2003-06-26 Alexander Cherkasky Fusionsproteinen enthaltend Fc-Regionen
US8029803B2 (en) * 2002-06-20 2011-10-04 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
US8025873B2 (en) * 2002-06-20 2011-09-27 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
CN1315536C (zh) * 2002-09-13 2007-05-16 李进 肿瘤抗原疫苗及其制备方法和疫苗组合物
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US8007805B2 (en) * 2003-08-08 2011-08-30 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens
US20050069521A1 (en) * 2003-08-28 2005-03-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins
US7744897B2 (en) 2003-12-23 2010-06-29 Dillon Susan B Human immunodeficiency virus gp41 mimetibody polypeptides
ATE393169T1 (de) 2003-12-30 2008-05-15 Merck Patent Gmbh Il-7-fusionsproteine mit antikörperportionen, deren herstellung und deren verwendung
EP1702069A2 (en) 2004-01-05 2006-09-20 EMD Lexigen Research Center Corp. Interleukin-12 targeted to oncofoetal fibronectin
US7670595B2 (en) * 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
JP4937132B2 (ja) * 2004-12-09 2012-05-23 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 免疫原性の低下したｉｌ−７変種
JP5620626B2 (ja) 2005-03-31 2014-11-05 中外製薬株式会社 会合制御によるポリペプチド製造方法
US7566456B2 (en) * 2005-06-23 2009-07-28 Haiming Chen Allergen vaccine proteins for the treatment and prevention of allergic diseases
US20070104689A1 (en) * 2005-09-27 2007-05-10 Merck Patent Gmbh Compositions and methods for treating tumors presenting survivin antigens
KR20080056301A (ko) * 2005-10-13 2008-06-20 바이렉스 메디칼 코포레이션 면역 반응을 유도시키기 위한, Ｃ형 간염 바이러스폴리펩티드 및 Ｆｃ 단편을 함유하는 키메라 항원
WO2007076950A1 (en) 2005-12-30 2007-07-12 Merck Patent Gmbh Anti-cd19 antibodies with reduced immunogenicity
EP1966238B1 (en) * 2005-12-30 2012-04-25 Merck Patent GmbH Interleukin-12p40 variants with improved stability
EA200870130A1 (ru) 2005-12-30 2009-02-27 Мерк Патент Гмбх Антитела против ил-6, предотвращающие связывание с gp130 комплекса ил-6 и альфа-рецептора ил-6
CN101479381B (zh) * 2006-03-31 2015-04-29 中外制药株式会社 调控抗体血液动力学的方法
JP5144499B2 (ja) * 2006-03-31 2013-02-13 中外製薬株式会社 二重特異性抗体を精製するための抗体改変方法
WO2008122039A2 (en) 2007-04-02 2008-10-09 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Selenocysteine mediated hybrid antibody molecules
EP2206775B1 (en) 2007-09-26 2016-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-il-6 receptor antibody
US9096651B2 (en) 2007-09-26 2015-08-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR
TWI563002B (en) 2007-09-26 2016-12-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibody constant region mutant
ES2834741T3 (es) 2007-12-05 2021-06-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-NR10 y uso del mismo
CN103251948A (zh) 2008-04-11 2013-08-21 中外制药株式会社 与多个分子的抗原反复结合的抗原结合分子
US8383767B2 (en) * 2008-06-27 2013-02-26 Academia Sinica Immunogenic protein carrier containing an antigen presenting cell binding domain and a cysteine-rich domain
TWI440469B (zh) * 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
WO2010107110A1 (ja) 2009-03-19 2010-09-23 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
EP3674317A1 (en) 2009-03-19 2020-07-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
CN102405230A (zh) 2009-04-22 2012-04-04 默克专利有限公司 具有修饰的FcRn结合位点的抗体融合蛋白
WO2010131733A1 (ja) 2009-05-15 2010-11-18 中外製薬株式会社 抗axl抗体
EA017172B1 (ru) * 2009-08-04 2012-10-30 Государственное Учреждение "Республиканский Научно-Практический Центр Трансфузиологии И Медицинских Биотехнологий" Способ получения изоиммунной плазмы крови
EP2481752B1 (en) 2009-09-24 2016-11-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant regions
GB0922209D0 (en) 2009-12-18 2010-02-03 Univ Nottingham Proteins, nucleic acid molecules and compositions
JP5889181B2 (ja) 2010-03-04 2016-03-22 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
CN103596587B (zh) * 2010-10-28 2016-09-07 健康和人类服务部秘书长代表的美利坚合众国政府 纤丝病毒融合蛋白及其应用
JP6013915B2 (ja) 2010-11-17 2016-10-25 中外製薬株式会社 血液凝固第ｖｉｉｉ因子の機能を代替する機能を有する多重特異性抗原結合分子
CN107973851A (zh) 2010-11-30 2018-05-01 中外制药株式会社 与多分子的抗原重复结合的抗原结合分子
US20140093496A1 (en) 2011-02-25 2014-04-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc-gamma-RIIb-SPECIFIC Fc ANTIBODY
CN102212139A (zh) * 2011-03-29 2011-10-12 中国人民解放军第二军医大学 森林脑炎病毒包膜E蛋白与人抗体Fc段融合蛋白及其用途
TW201817745A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
JP6322411B2 (ja) 2011-09-30 2018-05-09 中外製薬株式会社 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子
AR091902A1 (es) * 2012-07-25 2015-03-11 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulacion liquida de un conjugado de insulina de accion prolongada
MX2015012461A (es) * 2013-03-15 2016-08-08 Bioven 3 Ltd Proteinas sintéticas autoensamblables.
CN103212069B (zh) * 2013-05-13 2014-07-30 上海赛伦生物技术有限公司 可提高抗体滴度的免疫佐剂、其制备方法及应用
US10782290B2 (en) 2013-06-11 2020-09-22 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting post-therapy prognosis of relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS) patient, and method for determining applicability of novel therapy
US20150004161A1 (en) * 2013-07-01 2015-01-01 University Of Maryland Fc Coupled Compositions and Methods of Their Use
CN105848671B (zh) * 2013-08-28 2019-12-13 艾伯维施特姆森特克斯有限责任公司 位点特异性抗体缀合方法和组合物
PT3050896T (pt) 2013-09-27 2021-08-24 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Processo para a produção de heteromultímeros de polipéptidos
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
US9738702B2 (en) 2014-03-14 2017-08-22 Janssen Biotech, Inc. Antibodies with improved half-life in ferrets
HUE043038T2 (hu) 2014-08-11 2019-07-29 Delinia Inc Regulator T-sejteket szelektíven aktiváló, módosított IL-2-változatok autoimmun betegségek kezelésére
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
TW201627318A (zh) * 2014-10-22 2016-08-01 臺北醫學大學 膽固醇酯轉運蛋白抗原肽及其融合蛋白以及其組合物及應用
MA41294A (fr) 2014-12-19 2017-11-08 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticorps anti-myostatine, polypeptides contenant des variants de régions fc, et procédés d'utilisation
PL3233921T3 (pl) 2014-12-19 2022-01-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Przeciwciała anty-c5 i sposoby ich stosowania
WO2016125495A1 (en) 2015-02-05 2016-08-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibodies comprising an ion concentration dependent antigen-binding domain, fc region variants, il-8-binding antibodies, and uses therof
CA2972393A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Composition for treating il-6-related diseases
WO2016159213A1 (ja) 2015-04-01 2016-10-06 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
US10844122B2 (en) 2015-05-06 2020-11-24 Janssen Biotech, Inc. Prostate specific membrane antigen (PSMA) bispecific binding agents and uses thereof
EP3299810B1 (en) 2015-05-19 2021-07-07 National Center of Neurology and Psychiatry Method for determining application of novel therapy to multiple sclerosis (ms) patient
WO2016199904A1 (ja) * 2015-06-10 2016-12-15 国立大学法人東京大学 ワクチン用アジュバント、ワクチン、及び免疫誘導方法
US11359009B2 (en) 2015-12-25 2022-06-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
CA3004288A1 (en) 2015-12-28 2017-07-06 Nobuyuki Tanaka Method for promoting efficiency of purification of fc region-containing polypeptide
US20170204154A1 (en) 2016-01-20 2017-07-20 Delinia, Inc. Molecules that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases
SG11201807936VA (en) 2016-03-14 2018-10-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Cell injury inducing therapeutic drug for use in cancer therapy
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
CN106177932A (zh) * 2016-07-03 2016-12-07 查文娟 一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的疫苗
RU2766112C2 (ru) 2016-08-05 2022-02-08 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Композиция для профилактики или лечения связанных с il-8 заболеваний
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
US11779604B2 (en) 2016-11-03 2023-10-10 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses and methods
MX2019005400A (es) 2016-11-08 2019-08-05 Delinia Inc Variantes de il-2 para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11851486B2 (en) 2017-05-02 2023-12-26 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils
KR20200074160A (ko) 2017-10-20 2020-06-24 가꼬우호우징 효고 이카다이가쿠 항il-6 수용체 항체를 함유하는 수술 후의 유착을 억제하기 위한 의약 조성물
US11319355B2 (en) 2017-12-19 2022-05-03 Xencor, Inc. Engineered IL-2 Fc fusion proteins
CN110028588A (zh) * 2018-01-11 2019-07-19 上海细胞治疗研究院 抗原-Fc融合蛋白及其检测阳性CAR-T细胞的应用
WO2019160976A1 (en) * 2018-02-14 2019-08-22 Viela Bio, Inc. Antibodies to feline mcdonough sarcoma (fms)-like tyrosine kinase 3 receptor ligand (flt3l) and uses thereof for treating autoimmune and inflammatory diseases
KR20200132938A (ko) 2018-03-15 2020-11-25 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 지카 바이러스에 대해 교차-반응성을 갖는 항-뎅기 바이러스 항체 및 사용 방법
US11690907B2 (en) 2018-06-12 2023-07-04 Kbio Holdings Limited Vaccines formed by virus and antigen conjugation
US11529413B2 (en) 2018-06-12 2022-12-20 Kbio Holdings Limited Virus and antigen purification and conjugation
US10822591B2 (en) 2018-06-12 2020-11-03 Kentucky Bioprocessing, Inc. Virus purification
US11696948B2 (en) 2018-06-12 2023-07-11 Kbio Holdings Limited Vaccines formed by virus and antigen conjugation
AU2019290192A1 (en) * 2018-06-21 2021-01-07 Shattuck Labs, Inc. Heterodimeric proteins and uses thereof
JP2022512540A (ja) * 2018-08-29 2022-02-07 シャタック ラボ，インコーポレイテッド Ｆｌｔ３ｌ系キメラタンパク質
US20220002370A1 (en) 2018-09-27 2022-01-06 Xilio Development, Inc. Masked cytokine polypeptides
SG11202103192RA (en) 2018-10-03 2021-04-29 Xencor Inc Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
CN112166122A (zh) * 2018-12-13 2021-01-01 丁邦 抗体-肿瘤坏死因子α融合蛋白及其制法和应用
US12006345B2 (en) 2019-02-21 2024-06-11 Xencor, Inc. Untargeted and targeted IL-10 Fc-fusion proteins
JP2022529892A (ja) * 2019-03-28 2022-06-27 オリオニス バイオサイエンシズ，インコーポレイテッド Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ｆｌｔ３）に対するキメラタンパク質およびキメラタンパク質複合体
WO2020236655A1 (en) 2019-05-17 2020-11-26 Xencor, Inc. Il-7-fc-fusi0n proteins
AU2020358979A1 (en) 2019-10-03 2022-04-21 Xencor, Inc. Targeted IL-12 heterodimeric Fc-fusion proteins
CN114945586A (zh) * 2020-01-21 2022-08-26 张晋宇 一种药物组合物及其用途
US20230110839A1 (en) * 2020-02-28 2023-04-13 Celltrion Inc. Varicella zoster virus fusion protein and immunogenic composition comprising same
AU2021245922A1 (en) * 2020-04-01 2022-10-13 Xilio Development, Inc. Masked IL-2 cytokines and their cleavage products
JP2023523716A (ja) * 2020-04-21 2023-06-07 クビオ・ホールディングス・リミテッド ウイルス及び抗原のコンジュゲーションによって形成されるワクチン
CN113876938B (zh) * 2020-07-01 2024-04-19 中国科学院生物物理研究所 融合蛋白疫苗平台的构建与应用
TW202406932A (zh) 2020-10-22 2024-02-16 美商基利科學股份有限公司 介白素2-Fc融合蛋白及使用方法
CA3203239A1 (en) * 2020-12-23 2022-06-30 Ellen WU Immunocytokines and uses thereof
MX2023009995A (es) * 2021-03-04 2023-11-22 Helix Nanotechnologies Inc Composiciones que incluyen adyuvantes de sbi y metodos para usarlos.
WO2023125976A1 (zh) * 2021-12-31 2023-07-06 广州国家实验室 融合蛋白疫苗
WO2023178169A2 (en) * 2022-03-15 2023-09-21 Anemoi Biotech Holdings, Inc. Compositions and methods for treating the pathophysiology of severe viral infection
WO2023224914A1 (en) * 2022-05-16 2023-11-23 Mayo Foundation For Medical Education And Research Assessing and treating caveolinopathy diseases
CN114699521B (zh) * 2022-06-07 2023-02-24 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 基于金属硫蛋白家族的免疫佐剂及其应用

Family Cites Families (203)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US650064A (en) * 1898-11-14 1900-05-22 Kitson Hydrocarbon Heating And Incandescent Lighting Company System of liquid distribution.
US3941763A (en) * 1975-03-28 1976-03-02 American Home Products Corporation PGlu-D-Met-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 and intermediates
US4196265A (en) 1977-06-15 1980-04-01 The Wistar Institute Method of producing antibodies
US6936694B1 (en) * 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
US4469797A (en) 1982-09-23 1984-09-04 Miles Laboratories, Inc. Digoxigenin immunogens, antibodies, labeled conjugates, and related derivatives
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
KR850004274A (ko) 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US4703008A (en) 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
US5082658A (en) 1984-01-16 1992-01-21 Genentech, Inc. Gamma interferon-interleukin-2 synergism
EP0158198A1 (en) 1984-03-29 1985-10-16 Takeda Chemical Industries, Ltd. DNA and use thereof
US5189015A (en) 1984-05-30 1993-02-23 Alfa-Laval Agri International Ab Method for prophylactic treatment of the colonization of a Staphylococcus aureus bacterial strain by bacterial cell surface protein with fibronectin and fibrinogen binding ability
US5077204A (en) * 1984-06-21 1991-12-31 Chiron Corporation Yeast endopeptidase for basic amino-acid site cleavage, preparation and use
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
GR860984B (en) * 1985-04-17 1986-08-18 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
US4690915A (en) 1985-08-08 1987-09-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans
US5679543A (en) 1985-08-29 1997-10-21 Genencor International, Inc. DNA sequences, vectors and fusion polypeptides to increase secretion of desired polypeptides from filamentous fungi
US5643565A (en) 1985-09-20 1997-07-01 Chiron Corporation Human IL-2 as a vaccine adjuvant
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
DE3712985A1 (de) 1987-04-16 1988-11-03 Hoechst Ag Bifunktionelle proteine
US5359035A (en) 1985-12-21 1994-10-25 Hoechst Aktiengesellschaft Bifunctional proteins including interleukin-2 (IL-2) and granuloctyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF)
EP0237019A3 (en) 1986-03-14 1988-03-09 Toray Industries, Inc. Interferon conjugate and production thereof using recombinant gene
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
DK173067B1 (da) 1986-06-27 1999-12-13 Univ Washington Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa
US4894227A (en) 1986-08-01 1990-01-16 Cetus Corporation Composition of immunotoxins with interleukin-2
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5508031A (en) 1986-11-21 1996-04-16 Cetus Oncology Corporation Method for treating biological damage using a free-radial scavenger and interleukin-2
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US5019368A (en) 1989-02-23 1991-05-28 Cancer Biologics, Inc. Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2 Inc Geänderte antikörper.
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
AU612370B2 (en) 1987-05-21 1991-07-11 Micromet Ag Targeted multifunctional proteins
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
DE3853740T2 (de) 1987-06-10 1995-11-09 Dana Farber Cancer Inst Inc Bifunktionelle Antikörperkonstruktionen und Verfahren zur selektiven Tötung von Zellbeständen.
US5064646A (en) 1988-08-02 1991-11-12 The University Of Maryland Novel infectious bursal disease virus
ATE88900T1 (de) 1987-09-02 1993-05-15 Ciba Geigy Ag Konjugate von interferon alpha mit immunglobulinen.
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
EP0308936B1 (en) 1987-09-23 1994-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Antibody heteroconjugates for the killing of HIV-infected cells
NZ226414A (en) 1987-10-02 1992-07-28 Genentech Inc Cd4 peptide adhesion variants and their preparation and use
ZA888978B (en) 1987-12-04 1990-07-25 Du Pont Immobilized interleukin 2 and interleukin 2 containing a carboxylterminal extension
JP3040121B2 (ja) 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
CA1341588C (en) 1988-01-26 2009-01-06 Michel Revel Human ifn-beta2/i1-6, its purification and use
JP2643968B2 (ja) 1988-02-03 1997-08-25 サントリー株式会社 Ｋｅｘ２エンドプロテアーゼ及びその製造方法
US5234830A (en) 1988-02-03 1993-08-10 Suntory Limited DNA encoding a KEX2 endoprotease without a C-terminal hydrophobic region
US5120525A (en) 1988-03-29 1992-06-09 Immunomedics, Inc. Radiolabeled antibody cytotoxic therapy of cancer
IE62463B1 (en) 1988-07-07 1995-02-08 Res Dev Foundation Immunoconjugates for cancer diagnosis and therapy
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US5457038A (en) 1988-11-10 1995-10-10 Genetics Institute, Inc. Natural killer stimulatory factor
US5242824A (en) 1988-12-22 1993-09-07 Oncogen Monoclonal antibody to human carcinomas
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US6750329B1 (en) 1989-05-05 2004-06-15 Research Development Foundation Antibody delivery system for biological response modifiers
ZA902949B (en) 1989-05-05 1992-02-26 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
SE8901687D0 (sv) 1989-05-11 1989-05-11 Alfa Laval Agri Int Fibronectin binding protein as well as its preparation
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
DE69019609T2 (de) * 1989-07-07 1995-11-30 Takeda Chemical Industries Ltd Proteine und deren Herstellung.
EP0482076B1 (en) * 1989-07-14 1995-04-26 American Cyanamid Company Stable vaccine compositions containing interleukins
US5073627A (en) 1989-08-22 1991-12-17 Immunex Corporation Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
ATE236249T1 (de) 1989-09-12 2003-04-15 Hoffmann La Roche Tfn-bindende proteine
US5856298A (en) 1989-10-13 1999-01-05 Amgen Inc. Erythropoietin isoforms
ATE366311T1 (de) 1989-12-22 2007-07-15 Hoffmann La Roche Zytotoxischer lymphozyten-reifefaktor 35kd untereinheit und monoklonale antikörper spezifisch dafür
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
US5349053A (en) * 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
US7253264B1 (en) 1990-06-28 2007-08-07 Sanofi-Arentideutschland GmbH Immunoglobulin fusion proteins, their production and use
US5650150A (en) 1990-11-09 1997-07-22 Gillies; Stephen D. Recombinant antibody cytokine fusion proteins
US5709859A (en) 1991-01-24 1998-01-20 Bristol-Myers Squibb Company Mixed specificity fusion proteins
CA2105863A1 (en) * 1991-03-11 1992-09-12 Guy L. Reed Compositions and methods to inhibit the activation of active factor xiii
US6072039A (en) 1991-04-19 2000-06-06 Rohm And Haas Company Hybrid polypeptide comparing a biotinylated avidin binding polypeptide fused to a polypeptide of interest
DK0636173T3 (da) 1991-05-31 1999-05-31 Genentech Inc Behandling af HIV associeret immunthrombocytopenisk purpura
US5199942A (en) 1991-06-07 1993-04-06 Immunex Corporation Method for improving autologous transplantation
AU666866B2 (en) 1991-08-30 1996-02-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center Hybrid cytokines
US20020037558A1 (en) 1991-10-23 2002-03-28 Kin-Ming Lo E.coli produced immunoglobulin constructs
US6627615B1 (en) 1991-12-17 2003-09-30 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for in vivo gene therapy
RU2128709C1 (ru) 1992-01-23 1999-04-10 Мерк Патент Гмбх Способ получения димерного одноцепочечного слитого белка (варианты)
ES2215991T3 (es) 1992-04-01 2004-10-16 The Rockefeller University Procedimiento para la proliferacion (in vitro) de precursores de celulas dendriticas y su uso para producir inmunogenos.
WO1993024135A1 (en) 1992-05-26 1993-12-09 Immunex Corporation Novel cytokine that binds cd30
EP0646178A1 (en) 1992-06-04 1995-04-05 The Regents Of The University Of California expression cassette with regularoty regions functional in the mammmlian host
US5614184A (en) 1992-07-28 1997-03-25 New England Deaconess Hospital Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them
DE69332485T2 (de) 1992-08-11 2003-11-13 Harvard College Immunmodulierende peptide
DE4228839A1 (de) 1992-08-29 1994-03-03 Behringwerke Ag Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Mediatoren
JP4204642B2 (ja) 1992-11-05 2009-01-07 スローン − ケタリング・インスティテュート・フォー・キャンサー・リサーチ 前立腺に特異的な膜抗原
US5738849A (en) 1992-11-24 1998-04-14 G. D. Searle & Co. Interleukin-3 (IL-3) variant fusion proteins, their recombinant production, and therapeutic compositions comprising them
US5543297A (en) 1992-12-22 1996-08-06 Merck Frosst Canada, Inc. Human cyclooxygenase-2 cDNA and assays for evaluating cyclooxygenase-2 activity
US6096331A (en) 1993-02-22 2000-08-01 Vivorx Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions useful for administration of chemotherapeutic agents
JPH08509606A (ja) 1993-04-20 1996-10-15 ロビンソン，ウィリアム エス． 細胞内感染因子に感染した個体を処置する方法および物質
US5759551A (en) 1993-04-27 1998-06-02 United Biomedical, Inc. Immunogenic LHRH peptide constructs and synthetic universal immune stimulators for vaccines
KR960701650A (ko) 1993-04-29 1996-03-28 찰스 엠. 브룩 에리트로포이에틴 유사체 조성물 및 방법(Eythropoietin analog compositions and methods)
US5554512A (en) 1993-05-24 1996-09-10 Immunex Corporation Ligands for flt3 receptors
US6479055B1 (en) 1993-06-07 2002-11-12 Trimeris, Inc. Methods for inhibition of membrane fusion-associated events, including respiratory syncytial virus transmission
US5464933A (en) 1993-06-07 1995-11-07 Duke University Synthetic peptide inhibitors of HIV transmission
US6518013B1 (en) 1993-06-07 2003-02-11 Trimeris, Inc. Methods for the inhibition of epstein-barr virus transmission employing anti-viral peptides capable of abrogating viral fusion and transmission
US6017536A (en) 1993-06-07 2000-01-25 Trimeris, Inc. Simian immunodeficiency virus peptides with antifusogenic and antiviral activities
US6310180B1 (en) 1993-06-21 2001-10-30 Vanderbilt University Method for synthesis of proteins
CA2125763C (en) 1993-07-02 2007-08-28 Maurice Kent Gately P40 homodimer of interleukin-12
CN1057534C (zh) 1993-08-17 2000-10-18 柯瑞英-艾格公司 促红细胞生成素类似物
US5837682A (en) 1996-03-08 1998-11-17 The Children's Medical Center Corporation Angiostatin fragments and method of use
US5639725A (en) 1994-04-26 1997-06-17 Children's Hospital Medical Center Corp. Angiostatin protein
DE69535405T2 (de) 1994-04-26 2007-11-15 Children's Medical Center Corp., Boston Angiostatin und verfahren zu seiner nutzung zur vermeidung der angiogenese
US5648240A (en) 1994-05-24 1997-07-15 Texas A&M University MHC II analog from Staphylococcus aureus
US6429199B1 (en) 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
DK0772619T4 (da) * 1994-07-15 2011-02-21 Univ Iowa Res Found Immunmodulatoriske oligonukleotider
US6309853B1 (en) 1994-08-17 2001-10-30 The Rockfeller University Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US5541087A (en) 1994-09-14 1996-07-30 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Expression and export technology of proteins as immunofusins
EP0706799B1 (en) 1994-09-16 2001-11-14 MERCK PATENT GmbH Immunoconjugates II
CA2205572A1 (en) * 1994-12-12 1996-06-20 Beth Israel Hospital Association Chimeric cytokines and uses thereof
US6086875A (en) 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US6030613A (en) 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6485726B1 (en) 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US5691309A (en) 1995-01-31 1997-11-25 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5552524A (en) 1995-01-31 1996-09-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5891680A (en) 1995-02-08 1999-04-06 Whitehead Institute For Biomedical Research Bioactive fusion proteins comprising the p35 and p40 subunits of IL-12
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6169070B1 (en) 1995-03-10 2001-01-02 Genentech, Inc. Mer receptor activation by gas6
US5719266A (en) 1995-03-17 1998-02-17 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5591573A (en) 1995-04-10 1997-01-07 Alpha Therapeutic Corporation Method and system for testing blood samples
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5579277A (en) 1995-05-01 1996-11-26 Apple Computer, Inc. System and method for interleaving memory banks
US6184344B1 (en) 1995-05-04 2001-02-06 The Scripps Research Institute Synthesis of proteins by native chemical ligation
US6281010B1 (en) 1995-06-05 2001-08-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adenovirus gene therapy vehicle and cell line
CA2224008C (en) 1995-06-07 2009-08-18 Trimeris, Inc. The treatment of hiv and other viral infections using combinatorial therapy
CZ416797A3 (cs) 1995-06-30 1998-06-17 Eli Lilly And Company Použití leptinu nebo leptonových mimetik pro výrobu léčiv pro léčení nebo prevenci diabetes mellitus a kompozice s jeho obsahem
US6406689B1 (en) 1995-10-03 2002-06-18 Frank W. Falkenberg Compositions and methods for treatment of tumors and metastatic diseases
US5854205A (en) 1995-10-23 1998-12-29 The Children's Medical Center Corporation Therapeutic antiangiogenic compositions and methods
US6620413B1 (en) 1995-12-27 2003-09-16 Genentech, Inc. OB protein-polymer chimeras
US6080409A (en) 1995-12-28 2000-06-27 Dendreon Corporation Immunostimulatory method
US5723125A (en) * 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
US6096313A (en) * 1996-02-09 2000-08-01 Ludwig Institute For Cancer Research Compositions containing immunogenic molecules and granulocyte-macrophage colony stimulating factor, as an adjuvant
CA2198968C (en) 1996-03-04 2010-02-09 Toyofumi Masuda Process for production of secretory kex2 derivatives
CA2252557A1 (en) 1996-04-26 1997-11-06 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Antagonists of interleukin-15
CA2205757C (en) 1996-05-30 2006-01-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Pyridazinone derivatives and their use as inhibitors of prostaglandin g/h synthase i and ii(cox i and ii)
US5922685A (en) 1996-06-05 1999-07-13 Powderject Vaccines, Inc. IL-12 gene therapy of tumors
EP0826696B1 (de) 1996-09-03 2002-05-29 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Verwendung bi-und trispezifischer Antikörper zur Induktion einer Tumorimmunität
US5994104A (en) 1996-11-08 1999-11-30 Royal Free Hospital School Of Medicine Interleukin-12 fusion protein
US6737057B1 (en) * 1997-01-07 2004-05-18 The University Of Tennessee Research Corporation Compounds, compositions and methods for the endocytic presentation of immunosuppressive factors
US6100387A (en) 1997-02-28 2000-08-08 Genetics Institute, Inc. Chimeric polypeptides containing chemokine domains
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US5998598A (en) * 1997-03-10 1999-12-07 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Immunoadhesins and methods of production and use thereof
US6171588B1 (en) 1997-04-11 2001-01-09 G. D. Searle & Company Anti-αvβ3 integrin antibody antagonists
US6326468B1 (en) 1997-06-13 2001-12-04 Gryphon Sciences Solid phase native chemical ligation of unprotected or n-terminal cysteine protected peptides in aqueous solution
US6310183B1 (en) 1997-09-10 2001-10-30 Novo Nordisk A/S Coagulation factor VIIa composition
JP4336452B2 (ja) 1997-12-08 2009-09-30 メルク パテント ゲーエムベーハー 標的化免疫治療および一般の免疫刺激に対して有用である二量体融合タンパク質
GB9727262D0 (en) * 1997-12-24 1998-02-25 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US20030105294A1 (en) 1998-02-25 2003-06-05 Stephen Gillies Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins
US6008321A (en) 1998-03-16 1999-12-28 Pharmacopeia, Inc. Universal linker for combinatorial synthesis
US6281331B1 (en) 1998-03-23 2001-08-28 Trimeris, Inc. Methods and compositions for peptide synthesis
BR9909583A (pt) 1998-04-15 2002-01-15 Lexigen Pharm Corp Aumento da resposta imune mediado por uma proteìna de fusão anticorpo-citocina por co-administração com inibidor de angiogênese
WO1999053958A2 (en) 1998-04-17 1999-10-28 Lexigen Pharmaceuticals Corporation Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by co-administration with prostaglandin inhibitor
US6284536B1 (en) 1998-04-20 2001-09-04 The Regents Of The University Of California Modified immunoglobin molecules and methods for use thereof
WO1999058662A1 (fr) 1998-05-14 1999-11-18 Merck Patent Gmbh Proteine fusionnee
US6620382B1 (en) 1998-05-22 2003-09-16 Biopheresis Technologies, Llc. Method and compositions for treatment of cancers
US20020142374A1 (en) 1998-08-17 2002-10-03 Michael Gallo Generation of modified molecules with increased serum half-lives
PL202057B1 (pl) 1998-08-25 2009-05-29 Merck Patent Gmbh Homodimeryczne białko fuzyjne będące inhibitorem angiogenezy, sposób jego otrzymywania oraz cząsteczka DNA i wektor ekspresyjny zawierający to DNA
US6646113B1 (en) 1998-09-17 2003-11-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleic acid molecule encoding human survival of motor neuron-interacting protein 1 (SIP1) deletion mutants
US6335176B1 (en) 1998-10-16 2002-01-01 Pharmacopeia, Inc. Incorporation of phosphorylation sites
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US7488590B2 (en) * 1998-10-23 2009-02-10 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
ES2315022T3 (es) 1998-11-06 2009-03-16 Novo Nordisk Health Care Ag Metodo para la produccion de fvii.
BR0007414A (pt) 1999-01-07 2001-10-16 Lexigen Pharm Corp Expressão e exportação de proteìnas antiobesidade como proteìnas de fusão fc
AU4700100A (en) 1999-05-06 2000-11-21 Wake Forest University Compositions and methods for identifying antigens which elicit an immune response
US6348192B1 (en) 1999-05-11 2002-02-19 Bayer Corporation Interleukin-2 mutein expressed from mammalian cells
JP2003530070A (ja) 1999-05-19 2003-10-14 レキシジェン ファーマシューティカルズ コーポレイション Ｆｃ融合タンパク質としてのインターフェロン−αタンパク質の発現および搬出
WO2000078334A1 (en) 1999-06-17 2000-12-28 University Of Maryland Biotechnology Institute Chimeric chemokine-antigen polypeptides and uses therefor
CZ299516B6 (cs) 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
AU781618C (en) * 1999-07-02 2006-03-16 Genentech Inc. FVIIa antagonists
PE20010288A1 (es) 1999-07-02 2001-03-07 Hoffmann La Roche Derivados de eritropoyetina
US6469136B1 (en) 1999-07-07 2002-10-22 Trimeris, Inc. Methods and composition for peptide synthesis
US7067110B1 (en) 1999-07-21 2006-06-27 Emd Lexigen Research Center Corp. Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
SK782002A3 (en) * 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
BR0013231A (pt) 1999-08-09 2002-07-23 Lexigen Pharm Corp Complexos citocina-anticorpo múltiplos
WO2001029233A2 (en) * 1999-10-20 2001-04-26 The Johns Hopkins University School Of Medicine Chimeric immunogenic compositions and nucleic acids encoding them
CA2391080A1 (en) 1999-11-12 2001-05-25 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Erythropoietin forms with improved properties
DE19963859A1 (de) 1999-12-30 2001-07-12 Apotech Res & Dev Ltd Bi- oder Oligomer eines Di-, Tri-, Quattro- oder Pentamers von rekombinanten Fusionsproteinen
DK1252192T3 (da) 2000-02-11 2006-11-20 Merck Patent Gmbh Forbedring af antistofbaserede fusionsproteiners serumhalveringstid
JP4917232B2 (ja) 2000-02-24 2012-04-18 フィロジェン ソチエタ ペル アツィオニ 病理学的病変における脈管形成の処理のための組成物及び方法
US6586398B1 (en) 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
JP2004528001A (ja) 2000-05-12 2004-09-16 ネオーズ テクノロジーズ， インコーポレイテッド インビトロにおけるフコシル化組換えグリコペプチド
CA2412845C (en) 2000-06-29 2014-07-22 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by combined treatment with immunocytokine uptake enhancing agents
US7138119B2 (en) * 2000-09-15 2006-11-21 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibition of HIV-1 infection
CA2435037A1 (en) 2001-01-18 2002-07-25 Silke Schumacher Bifunctional fusion proteins with glucocerebrosidase activity
ES2309167T3 (es) 2001-02-19 2008-12-16 Merck Patent Gmbh Metodo para identificar epitotes de celulas t y metodo para preparar moleculas con inmunogenicidad reducida.
JP2004532620A (ja) 2001-02-19 2004-10-28 メルク　パテント　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフトング 免疫原性の低減された人工タンパク質
MXPA03008031A (es) 2001-03-07 2003-12-04 Merck Patent Gmbh Tecnologia de expresion para proteinas que contienen porcion de anticuerpo isotipo hibrida.
WO2002079415A2 (en) 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
DE10118308A1 (de) * 2001-04-12 2002-10-17 Bayer Ag Verfahren zur Herstellung von Hydroxybenzoesäurebenzylestern
BR0209177A (pt) 2001-05-03 2004-10-05 Merck Patent Gmbh Anticorpo especìfico a tumor recombinante e uso do mesmo
JP2005507870A (ja) 2001-08-13 2005-03-24 ユニバーシティ・オブ・サザン・カリフォルニア 低毒性のインターロイキン−２突然変異体
PL206975B1 (pl) 2001-12-04 2010-10-29 Merck Patent Gmbh Immunocytokiny o modulowanej selektywności oraz ich zastosowanie
DE60322513D1 (de) * 2002-02-27 2008-09-11 Immunex Corp Stabilisierte TNFR-Fc Formulierung mit Arginin
WO2003077834A2 (en) 2002-03-15 2003-09-25 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Central airway administration for systemic delivery of therapeutics
MXPA05006384A (es) 2002-12-17 2005-08-29 Merck Patent Gmbh Anticuerpo humanizado (h14.18) del anticuerpo 14.18 de raton enlazado a gd2 y su fusion con il-2.
EP3552627A1 (en) * 2003-05-06 2019-10-16 Bioverativ Therapeutics Inc. Clotting factor-fc chimeric proteins to treat hemophilia
WO2004108885A2 (en) * 2003-05-06 2004-12-16 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Fc chimeric proteins with anti-hiv drugs
US7348004B2 (en) 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
AU2004238263A1 (en) * 2003-05-06 2004-11-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Inhibition of drug binding to serum albumin
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US20050069521A1 (en) 2003-08-28 2005-03-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins
RU2251699C1 (ru) * 2003-09-25 2005-05-10 Киселев Всеволод Иванович Способ ранней и доклинической диагностики цервикального рака
CN102405230A (zh) * 2009-04-22 2012-04-04 默克专利有限公司 具有修饰的FcRn结合位点的抗体融合蛋白

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Journal of Immunology, 158(4), 1756-62. *

Also Published As

Publication number Publication date
CZ2002182A3 (cs) 2003-11-12
EP1198250B1 (en) 2007-09-26
DE60036552D1 (de) 2007-11-08
US20050261229A1 (en) 2005-11-24
AU779388B2 (en) 2005-01-20
US7955590B2 (en) 2011-06-07
EP1198250B8 (en) 2007-11-21
HUP0202796A2 (en) 2002-12-28
CN1308037C (zh) 2007-04-04
CA2378866A1 (en) 2001-02-01
WO2001007081A1 (en) 2001-02-01
DK1198250T3 (da) 2007-12-27
BR0012569A (pt) 2002-05-28
DE60036552T2 (de) 2008-06-26
US8043608B2 (en) 2011-10-25
MXPA02000746A (es) 2002-09-18
PL353344A1 (en) 2003-11-17
CA2378866C (en) 2011-06-07
NO20020255L (no) 2002-03-15
JP4764585B2 (ja) 2011-09-07
CZ304884B6 (cs) 2015-01-07
AU6358300A (en) 2001-02-13
KR20020020794A (ko) 2002-03-15
CN1374871A (zh) 2002-10-16
JP2003505431A (ja) 2003-02-12
ES2292457T3 (es) 2008-03-16
PT1198250E (pt) 2008-01-02
ATE374042T1 (de) 2007-10-15
ZA200200501B (en) 2003-03-26
RU2248214C2 (ru) 2005-03-20
NO20020255D0 (no) 2002-01-17
SK782002A3 (en) 2003-08-05
PL201664B1 (pl) 2009-04-30
EP1198250A1 (en) 2002-04-24
US20100068175A1 (en) 2010-03-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100689739B1 (ko) 단백질 및 펩티드 항원의 면역원성을 증강시키는 Ｆｃ융합 단백질
US7067110B1 (en) Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US6645500B1 (en) Method for down-regulating osteoprotegerin ligand activity
EP0680513B1 (en) Lysosomal targeting of immunogens
US8470560B2 (en) CR-2 binding peptide P28 as molecular adjuvant for DNA vaccines
ES2321246T3 (es) Nuevos vectores de expresion que contienen genes de ligandos de moleculas accesorias y su uso para inmunomodulacion y tratamiento de tumores malignos y enfermedades autoinmunes.
JPH10503379A (ja) Ｍｈｃ複合体およびその用途
JP2001503014A (ja) 防御免疫応答を増強するための方法
US20040091492A1 (en) Beta2 microglobulin fusion proteins and high affinity variants
US20050063952A1 (en) Immunogenic CEA
AU757310B2 (en) Mucosal cytotoxic T lymphocyte responses
US7011833B1 (en) Enhancing immune responses with B7-1 or B7-2 in the absence of a crosslinking agent
KR20210122196A (ko) 신규 코로나바이러스 예방 및 치료용 백신 조성물
ES2352745T3 (es) Cd86 de felino.
CA2307541A1 (en) Encapsulated immunomodulators useful as vaccine adjuvants

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130130

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140204

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150130

Year of fee payment: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160127

Year of fee payment: 10

LAPS Lapse due to unpaid annual fee