ES2321246T3 - Nuevos vectores de expresion que contienen genes de ligandos de moleculas accesorias y su uso para inmunomodulacion y tratamiento de tumores malignos y enfermedades autoinmunes. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNOS GENES QUE CODIFICAN PARA LIGANDOS DE MOLECULAS ACCESORIAS Y SU USO CON FINES DE INMUNOMODULACION, VACUNACION Y TRATAMIENTO DE VARIAS ENFERMEDADES HUMANAS, INCLUYENDO TUMORES MALIGNOS Y LAS ENFERMEDADES AUTOINMUNES. ESTA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN AL USO DE LIGANDOS DE MOLECULAS ACCESORIAS CONSTITUIDOS POR PARTES DE CAMPOS Y SUBCAMPOS DE MOLECULAS DERIVADAS DE LA FAMILIA DEL FACTOR DE NECROSIS TUMORAL. LAS MOLECULAS QUIMERAS DE ESTA INVENCION TIENEN PROPIEDADES UNICAS QUE LLEVAN A LA ESTABILIZACION DE SU ACTIVIDAD Y TIENEN POR TANTO UNA UTILIDAD MAYOR EN EL TRATAMIENTO DE LAS ENFERMEDADES. ESTA INVENCION SE REFIERE ADEMAS A UNOS VECTORES QUE EXPRESAN GENES QUE CODIFICAN PARA LAS MOLECULAS DE LA INVENCION.

Description

Nuevos vectores de expresión que contienen genes de ligandos de moléculas accesorias y su uso para inmunomodulación y tratamiento de tumores malignos y enfermedades autoinmunes.

Solicitud relacionada

Esta solicitud reivindica prioridad respecto a Kipps y col., NOVEL EXPRESSION VECTORS CONTAINING ACCESSORY MOLECULE LIGAND GENES AND THEIR USE FOR IMMUNOMODULATION AND TREATMENT OF MALIGNANCIES, solicitud provisional de Estados Unidos nº 60/132145, presentada el 9 de diciembre de 1996.

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a nuevos vectores de expresión que contienen genes que codifican un ligando de CD40 quimérico y el uso de esos vectores para inmunomodulación y composiciones farmacéuticas que comprenden esas construcciones, que pueden usarse para protocolos de vacunación mejorados y el tratamiento de tumores malignos y enfermedades autoinmunes. Más particularmente, esta invención proporciona vectores de expresión y composiciones farmacéuticas para tratar diversas células neoplásicas o tumorales y vectores de expresión y composiciones farmacéuticas para tratar enfermedades autoinmunes. Esta invención también contempla la producción y expresión de ligandos de CD40 quiméricos con una mayor estabilidad y una función mejorada.

Antecedentes de la invención

Se conocen bien leucemias, linfomas, carcinomas y otros tumores y se describen, por ejemplo, en Harrison's Principles of Internal Medicine, Wilson y col., eds., McGraw-Hill, Nueva York, págs. 1599-1612. Estos tumores malignos parecen haber escapado de algún modo de los mecanismos de vigilancia del sistema inmune que eliminan rápidamente y de forma continua células proliferantes. Se desconoce el mecanismo exacto por el que estos tumores malignos escapan a la vigilancia del sistema inmune.

Algunas de estas células tumorales del sistema inmune son células presentadoras de antígenos tumorales que no funcionan apropiadamente dentro de la cascada inmune. Por ejemplo, las células B neoplásicas ni siquiera pueden inducir reacciones mixtas de linfocitos alogénicas o autólogas débiles in vitro. Pruebas adicionales de que los tumores malignos sobreviven debido al fracaso del mecanismo de vigilancia inmune incluyen la frecuencia aumentada de dichos tumores malignos en individuos inmunocomprometidos, tales como destinatarios de aloinjertos y los que reciben una terapia inmunosupresora a largo plazo. Además, la frecuencia de estos tumores malignos se aumenta en pacientes que tienen el síndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y pacientes con síndromes de inmunodeficiencia primaria, tales como el síndrome linfoproliferativo ligado al cromosoma X o el síndrome de Wiscott-Aldrich (Thomas y col., Adv. Cancer Res. 57: 329, 1991).

El sistema inmune funciona normalmente eliminando células tumorales por reconocimiento de las células tumorales como células extrañas y eliminación de esas células del cuerpo. Una reacción inmune depende tanto de la respuesta de anticuerpos del sistema inmune como de la respuesta inmune celular en el interior de un paciente. Más específicamente, la respuesta inmune celular que actúa reconociendo las células tumorales como extrañas requiere varias células diferentes del sistema inmune y la interacción entre esas células. Una reacción inmune comienza con un linfocito T (célula T) que tiene en su superficie celular el receptor de célula T. La célula T también tiene la capacidad de expresar en su superficie diversas moléculas accesorias que interaccionan con moléculas accesorias sobre el linfocito B (célula B). Cuando el receptor de célula T de la célula T se une específicamente a un antígeno extraño, tal como una célula tumoral, se activa y se expresa el ligando de molécula accesoria, ligando de CD40, en su superficie celular. El ligando de molécula de célula accesoria sólo está presente sobre las células T activadas durante un periodo corto de tiempo y se elimina rápidamente de la superficie celular. Después, el ligando de molécula de células accesorias se elimina de la superficie de la célula T activada, destruyéndose su capacidad para unirse a células B a través del ligando de molécula accesoria.

Cuando está presente sobre la superficie de una célula T activada, el ligando de células accesorias puede unirse específicamente a la molécula de célula accesoria presente en la célula B. Esta interacción específica de células T-B causa que las células B y T expresen moléculas accesorias superficiales coestimuladoras y citoquinas que dan como resultado una activación inmune que conduce a células T citolíticas que destruyen y eliminan específicamente la célula tumoral del cuerpo.

La interacción con una célula T activada no se limita solamente a células B, sino que más bien puede llevarse a cabo por cualquier célula que sea capaz de presentar antígenos a la célula T (una célula presentadora de antígenos). Estas células incluyen linfocitos B, macrófagos, células dendríticas, monocitos, células de Langerhans, células interdigitantes, células dendríticas foliculares o células de Kupffer. Se sabe que todas estas células tienen diversas moléculas accesorias en la superficie celular que las permite interaccionar con otras células del sistema inmune. Por ejemplo, todas estas células presentadoras de antígenos tienen la molécula accesoria CD40 en su superficie celular. La presencia de estas moléculas accesorias permite que estas células presentadoras de antígenos se unan específicamente a un ligando de molécula accesoria complementario y, por lo tanto, interaccionen directamente con otras células inmunes.

Un gran número de ligandos de moléculas accesorias son miembros de la superfamilia del factor de necrosis tumoral. (Fanslow y col., Sem. Immun., 6: 267-268 (1994)). Se han clonado e identificado los genes para varios de estos ligandos de moléculas accesorias. Estos genes de ligandos de moléculas accesorias codifican moléculas accesorias, teniendo todas la configuración de proteínas de membrana de Tipo II y presentando grados variables de homología con otros genes de ligandos de moléculas accesorias. Por ejemplo, se han aislado los genes de ligandos de moléculas accesorias que codifican tanto el ligando de CD40 murino como el ligando de CD40 humano. Véase, Armitage y col., Nature, 357: 80-82 (1992) y Hollenbaugh y col., EMBO J., 11: 4313-4321 (1992).

CD40 y su ligando, el ligando de CD40, son componentes críticos de una respuesta inmune normal. Las señales mediadas por CD40 inducen a los linfocitos inmunes a proliferar y diferenciarse y convertirse en células presentadoras de antígenos potentes. Las células B tumorales o neoplásicas son malas células presentadoras de antígenos y son incapaces de estimular una reacción mixta de linfocitos alogénica enérgica. El entrecruzamiento con éxito de moléculas CD40 en células inmunes da como resultado una reacción mixta de linfocitos alogénica fuerte, sugiriendo una reacción inmune fuerte. Se han usado diversos ligandos solubles de CD40 o anticuerpos específicos para CD40 para entrecruzar potencialmente CD40. Estos ligandos solubles de CD40 y anticuerpos específicos de CD40 no son óptimos para el entrecruzamiento de las moléculas CD40 en células presentadoras de antígenos y no funcionan tan eficazmente como el ligando de CD40 expresado en una membrana celular para producir una estimulación fuerte de células presentadoras de antígenos. Estos procedimientos también son difíciles de aplicar porque deben aislarse grandes cantidades de construcciones o anticuerpos de ligando de CD40, siendo un trabajo difícil y que requiere mucho tiempo. Otras estrategias para utilizar ligando de CD40 en solución o como una molécula unida a membrana, incluyendo la transformación de fibroblastos con ligando de CD40 para producir células cultivadas que después se usan para presentar antígenos, no son adaptables a protocolos clínicos humanos in vivo.

La interacción de CD95 (Fas) con su ligando (ligando de Fas o FasL) funciona limitando la duración de la respuesta inmune y/o la vida útil de linfocitos activados. La apoptosis inducida por la unión de Fas-FasL sirve para eliminar linfocitos autorreactivos activados. Se han demostrado problemas causados por alteración de esta ruta en animales con deficiencias en interacciones de Fas<->ligando de Fas. Los ratones que tienen mutaciones que inactivan CD95 o FasL desarrollan numerosos trastornos incluyendo una patología autoinmune que se asemeja a la observada en pacientes con artritis reumatoide (AR) o lupus sistémico. Zhang, y col., en J. Clin. Invest. 100: 1951-1957 (1997) muestran que la inyección de virus que expresa FasL en las articulaciones de ratones con artritis inducida por colágeno da como resultado la apoptosis de células sinoviales y el alivio de síntomas de artritis. La expresión de ligando de Fas permite la eliminación de células activadas que desempeñan un papel en la patogénesis de enfermedades autoinmunes. Por lo tanto, una estrategia de terapia génica para introducir FasL en las articulaciones de pacientes con artritis reumatoide podría funcionar mejorando la patología de la enfermedad, conduciendo a la destrucción de las células mononucleares infiltrantes.

La administración de moléculas accesorias y ligandos de moléculas accesorias solubles se ha demostrado que desencadena o se asocia con efectos fisiológicos adversos. Por ejemplo, el tratamiento de ratones que tienen expresión de receptor CD40 de tipo silvestre con proteína de fusión CD40L-CD8 soluble daba como resultado una respuesta inflamatoria pulmonar. Esto no se observó en ratones en los que se había anulado el gen para el receptor CD40. Estos experimentos, descritos en Wiley, J. A. y col., Journal of Immunology 158: 2932-2938 (1997), confirman los datos in vitro que sugieren que la ligación de CD40 puede dar como resultado respuestas inflamatorias.

La administración directa de factor de necrosis tumoral soluble recombinante purificado (\alpha o \beta) da como resultado choque y lesiones tisulares, como se describe en Tracey, K. J., y A. Cerami, Annu. Rev. Med. 45: 491-503 (1994). En cuestión de minutos después de la administración aguda intravenosa o intraarterial de TNF, se produce como resultado un síndrome de choque, lesión tisular, síndrome de fuga capilar, hipoxia, edema pulmonar e insuficiencia multiorgánica asociada con una alta mortalidad. Una dosis baja crónica de TNF causa anorexia, pérdida de peso, deshidratación y reducción de proteínas y lípidos corporales totales.

También se ha demostrado que el ligando de Fas soluble y el receptor están asociados con lesiones tisulares y otros efectos adversos. CD95, el receptor Fas, es un mediador de la apoptosis. El ligando de Fas induce la apoptosis por unión al receptor Fas. Como se muestra en Galle, P. R., y col., J. Exp. Med. 182: 1223-1230 (1995) la administración de un anticuerpo agonista anti-Fas daba como resultado lesiones hepáticas en ratones. Los ratones que recibieron inyecciones por vía intraperitoneal con el anticuerpo agonista morían en cuestión de varias horas y los análisis demostraron que la causa más probable de muerte eran lesiones hepáticas graves por apoptosis.

El papel del ligando de Fas soluble (FasL) en la patogénesis de las lesiones tisulares sistémicas en un linfoma agresivo se describe en Sato, K. y col., British Journal of Haematology, 94: 379-382 (1996). Los descubrimientos presentados en este informe indican que el FasL soluble está directamente asociado con la patogénesis de lesiones hepáticas y pancitopenia.

CD27, el receptor para el ligando de molécula accesoria CD70, se demostró en un informe escrito por van Oers, y col., en Blood 82: 3430-3436 (1993), que estaba asociado con tumores malignos de células B.

Todos los descubrimientos anteriores contraindican la administración de ligandos de moléculas accesorias solubles, resaltando la necesidad de terapias que aumenten los niveles de estas moléculas sin dar como resultado una elevación de sus formas solubles.

A pesar de la abundancia de información con respecto a genes de ligandos de moléculas accesorias y su expresión en la superficie de diversas células inmunes, todavía no se conoce el mecanismo exacto por el que los genes de ligandos de moléculas accesorias están regulados en células presentadoras de antígenos. Sin conocimientos específicos de la regulación de la expresión de genes de ligandos de moléculas accesorias en estas células presentadoras de antígenos, hasta la fecha no ha sido posible la alteración de la respuesta inmune variando la expresión de un gen de ligando de molécula accesoria. Sin ningún conocimiento específico sobre cómo regular la expresión de un gen de ligando de molécula accesoria en una célula presentadora de antígeno, no es posible alterar la respuesta inmune hacia células tumorales. Por lo tanto, existe la necesidad de un procedimiento para aumentar la expresión de un gen de ligando de molécula accesoria en células normales y tumorales, incluyendo células presentadoras de antígeno.

Además, sin la capacidad de regular la expresión de ligandos de moléculas accesorias no es posible alterar la eliminación inmune de estas células.

Sumario de la invención

La presente invención satisface estas necesidades proporcionando un gen de ligando de CD40 quimérico constituido por secuencias de nucleótidos que codifican dominios en el siguiente orden: un domino citoplasmático (Dominio I), un dominio transmembrana (Dominio II), un dominio extracelular proximal (Dominio III) y un dominio extracelular distal (Dominio IV), caracterizado por que al menos uno de dichos dominios procede de un gen de ligando de CD40 murino y los otros dominios proceden de un gen de ligando de CD40 humano. La presente invención proporciona además un gen de ligando de CD40 quimérico constituido por secuencias de nucleótidos que codifican dominios en el siguiente orden: un dominio citoplasmático (Dominio I), un dominio transmembrana (Dominio II), un dominio extracelular proximal (Dominio III) y un dominio extracelular distal (Dominio IV), caracterizado por cualquiera de

a)

los Dominios III y IV proceden de un gen de ligando de CD40 humano y los Dominios II y I proceden de un gen de ligando de CD40 murino, o

b)

los Dominios III y IV proceden de un gen de ligando de CD40 murino y los Dominios II y I proceden de un gen de ligando de CD40 humano, o

c)

los Dominios II, III y IV proceden de un gen de ligando de CD40 humano y el Dominio I procede de un gen de ligando de CD40 murino, o

d)

los Dominios II, III y IV proceden de un gen de ligando de CD40 murino y el Dominio I procede de un gen de ligando de CD40 humano, o

e)

los Dominios I, III y IV proceden de un gen de ligando de CD40 humano y el Dominio II procede de un gen de ligando de CD40 murino, o

f)

el Dominio III procede de un gen de ligando de CD40 murino y los Dominios I, II y IV proceden de un gen de ligando de CD40 humano. En un aspecto, los genes de ligandos de CD40 quiméricos descritos anteriormente están constituidos por la SEC ID Nº: 3, o SEC ID Nº: 4, o SEC ID Nº: 5, o SEC ID Nº: 6, o SEC ID Nº: 7 o SEC ID Nº: 20. En otro aspecto, el sitio o sitios de escisión de proteasas de secuencias de nucleótidos del Dominio III se ha o han eliminado de los genes de ligandos de CD40 quiméricos de la presente invención. En otro aspecto más, la invención se refiere a un vector que comprende el gen de ligando de CD40 quimérico de la presente invención. En otro aspecto, la invención se refiere a una célula huésped que comprende una secuencia de nucleótidos o un vector de la presente invención. En otro aspecto más, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un gen de ligando de CD40 quimérico o un vector de la presente invención. En un aspecto, la presente invención también se refiere al uso de un gen de ligando de CD40 quimérico o un vector de la presente invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una neoplasia. La presente invención también se refiere en un aspecto a un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos o un vector de la presente invención. En otro aspecto más, la presente invención se refiere a un procedimiento in vitro de alterar la inmunorreactividad de células humanas, comprendiendo dicho procedimiento introducir un gen de ligando de CD40 quimérico o un vector de la presente invención en dichas células humanas, de modo que se exprese dicho ligando de CD40 quimérico en la superficie de dichas células.

La presente invención también proporciona nuevos vectores de expresión que contienen genes de ligandos de CD40 quiméricos y una composición farmacéutica que puede usarse para introducir esos genes en células presentadoras de antígenos normales y tumorales, permitiendo de este modo la alteración de una respuesta inmune, el tratamiento de enfermedades autoinmunes y el tratamiento de diversas neoplasias. Esta invención proporciona vectores incluyendo vectores de terapia génica que contienen genes de ligandos de CD40 quiméricos. Estos vectores también contienen los elementos genéticos adicionales, tales como promotores, potenciadores, señales de poliadenilación (extremos 3') que permiten que el vector se sitúe con éxito en el interior de la célula y dirijan la expresión del gen de ligando de CD40 quimérico en una célula. Dichos vectores de terapia génica son capaces de transformar células animales directamente y, por lo tanto, introducir el gen de ligando de CD40 quimérico en las células de ese animal de una forma que pueda utilizarse para producir ligandos de CD40 quiméricos en el interior de esa célula.

En otros aspectos de la presente invención, la función de un ligando de molécula accesoria se modifica por alteración de la semivida de la molécula en la superficie celular o por cambio del nivel de expresión de esa molécula en la superficie celular. En realizaciones preferidas, la presente invención proporciona ligandos de CD40 quiméricos que están modificados para mejorar la estabilidad de esos ligandos en la superficie celular. Dicha estabilidad aumentada puede conseguirse usando cualquiera de los procedimientos descritos que se describen en esta solicitud, incluyendo moléculas quiméricas y moléculas en las que se han introducido mutaciones al menos en una localización. La presente invención también contempla aumentar la expresión de dicha molécula.

También se describen en este documento genes de ligandos de moléculas accesorias que incluyen genes que codifican moléculas de la familia del factor de necrosis tumoral (TNF). Las moléculas que componen la familia del TNF incluyen TNF_{\alpha}, TNF_{\beta}, ligando de CD40, ligando de Fas, CD70, ligando de CD30, ligando de 41BB (4-1BBL), factor de crecimiento nervioso y ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL). Otros genes de ligandos de moléculas accesorias quiméricos descritos en este documento contienen al menos una porción de un gen de ligando de molécula accesoria murino junto con porciones de genes de ligandos de moléculas accesorias procedentes de ratón, seres humanos u otras especies. Algunas moléculas accesorias utilizan genes de ligandos de CD40 murinos y genes de ligandos de CD40 quiméricos que contienen al menos un segmento del gen de ligando de CD40 murino junto con al menos un segmento del gen de ligando de CD40 humano. También se describen en este documento genes de ligandos de moléculas accesorias quiméricos en los que segmentos del gen de ligando de molécula accesoria de una especie se han intercambiado con segmentos de un segundo gen de ligando de molécula accesoria que opcionalmente puede ser de una especie diferente. En una realización preferida de la presente invención, los dominios transmembrana y citoplasmático del gen de ligando de CD40 murino se han unido a los dominios extracelulares del gen de ligando de CD40 humano como se describe en la reivindicación 2a).

La presente invención contempla vectores de terapia génica que son capaces de infectar directamente a la célula humana, de mamífero, insecto u otra célula. El uso de dichos vectores de terapia génica simplifica enormemente la inserción de un gen de ligando de CD40 quimérico en esas células. Los vectores de terapia génica contemplados pueden usarse in vivo o in vitro para infectar la célula deseada y son particularmente útiles para infectar células tumorales para efectuar la expresión sostenida de alto nivel de un ligando de CD40 quimérico fisiológi-
co.

La presente invención también contempla células huésped de animales, mamíferos y humanos que contienen un vector de terapia génica que incluye un gen de ligando de CD40 quimérico y suficiente información genética para expresar ese ligando de molécula accesoria en el interior de esa célula. En realizaciones preferidas, la presente invención también contempla células presentadoras de antígenos neoplásicas humanas que contienen los vectores de terapia génica de la presente invención o contienen un gen de ligando de CD40 quimérico junto con un promotor y una región de extremo 3'.

La presente invención también contempla células humanas y células neoplásicas humanas que contienen un vector de terapia génica que incluye un gen de ligando de CD40 quimérico. La presente invención también contempla células bacterianas o células animales que contienen genes de ligandos de CD40 quiméricos, los vectores de terapia génica de la presente invención, los vectores de la presente invención y un gen de ligando de CD40 quimérico junto con un promotor, potenciador o secuencia de poliadenilación heteróloga.

La presente invención también contempla composiciones farmacéuticas que comprenden un gen de ligando de CD40 quimérico o un vector de la presente invención, que puede usarse para alterar una respuesta inmune en el interior de un paciente humano o la inmunorreactividad de células humanas in vivo por introducción de un gen que codifica un gen de ligando de CD40 quimérico en las células humanas, de modo que el ligando de molécula accesoria se expresa en la superficie de esas células humanas, incluye la introducción del gen de ligando de CD40 quimérico como parte de un vector de terapia génica o junto con un promotor, potenciador o señal de poliadenilación heteróloga nativa. También se describe utilizar la introducción de genes de ligandos de Fas y genes de ligandos de Fas quiméricos construidos como se ha contemplado anteriormente para CD40 en células humanas para alterar su inmunorreactividad. La presente invención también incluye procedimientos en los que dichos genes de ligandos de CD40 quiméricos se insertan en células que tienen la molécula accesoria con la que se une el ligando de molécula accesoria en la superficie de la célula en la que se inserta el gen de ligando de molécula accesoria.

Los agentes farmacéuticos de la presente invención que pueden usarse para alterar la inmunorreactividad son aplicables a todos los tipos de células humanas, animales y murinas incluyendo células neoplásicas humanas tales como linfomas, leucemias y otros tumores malignos humanos. En realizaciones preferidas, este agente farmacéutico se usa para introducir el gen que codifica el ligando de CD40 quimérico en células presentadoras de antígeno potenciales de un paciente o célula humana que puede estimular células presentadoras de antígeno testigo. Dichas células presentadoras de antígeno incluyen monocitos, macrófagos, células B, células de Langerhans, células interdigitantes, células dendríticas foliculares, células de Kupffer y similares. Las diversas células presentadoras de antígeno pueden estar presentes como parte de un tumor maligno conocido en un paciente humano tal como leucemias, linfomas, leucemia monocítica aguda (AML), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia mielomonocítica aguda (AMML), leucemia mielógena crónica o mielomonocítica crónica (CMML) y por lo tanto incluiría todos los tumores de cualquier célula capaz de presentar antígenos al sistema inmune humano o animal o ser capaz de estimular células presentadoras de antígeno testigo. La presente invención también contempla modular el sistema inmune por introducción de genes que codifican un gen de ligando de la presente invención en cualquier número de células diferentes que se encuentran en un paciente, incluyendo células musculares, células cutáneas, células estromales, células de tejido conectivo, fibroblastos y similares.

La presente invención también contempla un gen de ligando de CD40 quimérico o un vector de la presente invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de neoplasias en un paciente humano o un paciente animal. En una realización preferida, la presente invención se refiere a un procedimiento in vitro de alterar la inmunorreactividad de células humanas, comprendiendo dicho procedimiento introducir un gen de ligando de CD40 quimérico o un vector de la presente invención en dichas células humanas de modo que dicho ligando de CD40 quimérico se exprese en la superficie de dichas células.

Las células neoplásicas se infunden después de nuevo en el paciente humano o animal y entonces pueden participar en una respuesta inmune mejorada.

La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un gen de ligando de CD40 quimérico o un vector de la presente invención que puede usarse para la coinfección o cointroducción del gen de ligando de CD40 quimérico junto con un gen que codifique un antígeno específico de tumor o carcinoma. Esta combinación de moléculas se expresa después en la superficie de las células neoplásicas y cuando esas células se introducen en el paciente conducen a la respuesta inmune rápida, dando como resultado la destrucción de esas células.

La composición farmacéutica de la presente invención también puede usarse para introducir directamente el vector de terapia génica u otro vector que lleve el gen de ligando de CD40 quimérico directamente en el tumor o lecho tumoral de un paciente. Tras introducirse en el lecho tumoral del paciente, el vector de terapia génica u otro vector se introduce en las células presentes en el tumor o lecho tumoral y después expresa el gen de ligando de CD40 quimérico en la superficie de esas células. Después, estas células son capaces de participar completamente en la respuesta inmune humana o inmune animal.

La presente invención también incluye la composición farmacéutica de la presente invención que puede usarse como una vacuna. Una vacuna tiene un vector genético que contiene un gen de ligando de CD40 quimérico. Otras realizaciones de la composición farmacéutica de la presente invención usan la vacuna por administración de dos vectores genéticos separados, conteniendo uno los antígenos del organismo contra los que se desea inmunidad por aislamiento de las células del animal diana y poniendo en contacto con esas células un vector que codifica al menos un antígeno de un organismo predeterminado, de modo que el antígeno se exprese por las células y también poniendo en contacto a esas células con un vector diferente que exprese el gen de ligando de CD40 quimérico en la superficie de las células presentadoras de antígeno del animal. En conjunto estos dos vectores separados producen una vacunación que es mucho más fuerte y de mayor duración que la vacunación con un antígeno en solitario.

La composición farmacéutica de la presente invención que es útil como vacuna es aplicable a vacunaciones diseñadas para producir inmunidad contra un virus, una célula, una bacteria, cualquier proteína o un hongo. Estas vacunas también son aplicables a la inmunización contra diversos carcinomas y neoplasias. En estas realizaciones, el antígeno tumoral contra el que se desea inmunidad se introduce en el animal junto con el vector genético que contiene el gen de ligando de CD40 quimérico.

La presente invención también contempla composiciones farmacéuticas que pueden usarse para tratar artritis utilizando un vector de terapia génica que codifica un ligando de CD40 quimérico. También se describe en este documento para el uso con artritis la molécula de ligando de Fas en la que se ha aumentado la expresión de actividad de ligando de Fas en la articulación y/o la estabilidad del ligando de Fas en células en el interior de la articulación mejorada. Se describen adicionalmente procedimientos de tratamiento de artritis utilizando ligandos de moléculas accesorias quiméricos y genes de ligandos de moléculas accesorias quiméricos. La presente invención también contempla una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 12, que puede usarse tanto para terapia ex vivo como terapia in vivo de artritis utilizando los vectores de expresión de la presente invención junto con el ligando de Fas y versiones modificadas de esa molécula incluyendo moléculas quiméricas.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. La Figura 1 es un diagrama que muestra varios genes de ligandos de moléculas accesorias y los Dominios I-IV de esos genes como se deducen a partir de datos de secuencia.

Figura 2. La Figura 2 es un diagrama que muestra genes de ligandos de moléculas accesorias quiméricos de ejemplo. Los dominios obtenidos del módulo accesorio murino se muestran sombreados.

Figura 3. La Figura 3 muestra la cantidad de ligando de CD40 de ratón o humano que se encuentra en la superficie de células Hela o CLL infectadas con vectores de terapia génica que contienen los genes que codifican estas moléculas. La Figura 3A muestra células Hela sin infectar (sombreadas) y células Hela infectadas con un vector de terapia génica que codifica ligando de CD40 murino. La Figura 3B muestra células Hela sin infectar (sombreadas) y células Hela infectadas con un vector de terapia génica que codifica ligando de CD40 humano. La Figura 3C muestra células CLL sin infectar (sombreadas) y células CLL infectadas con un vector de terapia génica que codifica ligando de CD40 murino. La Figura 3D muestra células CLL sin infectar (sombreadas) y células CLL infectadas con un vector de terapia génica que codifica ligando de CD40 humano.

Figura 4. La Figura 4 muestra histogramas de la expresión aumentada de CD54 (Figura 4B) y CD80 (Figura 4D) en células CLL en las que se ha introducido un vector de terapia génica que contiene el gen de ligando de molécula accesoria (gen de ligando de CD40 murino). La gráfica sombreada indica tinción de control en análisis de FACS y la gráfica blanca indica tinción con anticuerpos monoclonales inmunoespecíficos para CD54 (Figuras 4A y 4B) o CD80 (Figuras 4C y 4D).

Figura 5. La Figura 5 muestra la proliferación celular como se mide por incorporación de ^{3}H-TdR de células T alogénicas en respuesta a diversos regímenes de estimulación. Las células CLL que contienen un vector de terapia génica que expresa un gen de ligando de molécula accesoria (el gen de ligando de CD40 murino) se introdujeron, estimulando a las células T alogénicas a proliferar.

Figura 6. La Figura 6 muestra la producción de interferón gama (IFNg) por células T alogénicas estimuladas con células CLL que contienen un gen de ligando de molécula accesoria.

Figura 7. La Figura 7 muestra el tratamiento de una neoplasia en un animal usando un vector de terapia génica que contiene un gen de ligando de molécula accesoria de la presente invención. Los cuadrados blancos muestran ratones inmunizados con células neoplásicas que no expresan un ligando de molécula accesoria. Los ratones inmunizados con células neoplásicas que expresan un ligando de molécula accesoria se muestran como la línea horizontal en la parte superior de la Figura y no muestran morbilidad.

Figura 8. La Figura 8 muestra los niveles de producción y estabilidades de ligando de CD40 y transcrito de ligando de CD40 en células CLL (gráfica superior) y células mononucleares sanguíneas normales (gráfica inferior).

Figura 9. La Figura 9 muestra el curso de tiempo de expresión de transgén en células B CLL infectadas con el ligando de molécula accesoria (ligando de CD40). La MFIR (proporción de intensidad media de fluorescencia), en comparación con la intensidad de fluorescencia de células CLL CD19^{+} teñidas con ligando de CD40 marcado con PE frente a las mismas teñidas con un mAb de control de isotipo marcado con PE en cada punto de tiempo, se representa mediante los círculos oscuros conectados por líneas continuas de acuerdo con la escala proporcionada en el eje de ordenadas de la izquierda.

Figura 10. La Figura 10 muestra cambios en el fenotipo de antígeno de superficie de células B CLL infectadas con un vector de terapia génica que contiene un ligando de molécula accesoria, ligando de CD40. Los histogramas sombreados representan tinción de células CLL sin infectar (líneas finas) teñidas con anticuerpo de control inespecífico, los histogramas blancos dibujados con líneas finas representan células CLL sin infectar teñidas con mAb específico conjugado con FITC y los histogramas blancos dibujados con líneas gruesas (CD154-CLL marcadas) representan células CLL infectadas con el vector de terapia génica de ligando de molécula accesoria y teñidas con mAb específico conjugado con FITC.

Figura 11. La Figura 11 muestra niveles de CD27 producidos en células CLL infectadas con un vector de terapia génica que contiene un ligando de molécula accesoria. La Figura 11A muestra que las células CLL infectadas con CD40L (CD154-CLL) expresan niveles reducidos de CD27 superficial. Los histogramas blancos representan tinción de células CLL sin infectar (líneas finas) o CLL infectadas (líneas gruesas) con mAb aCD27 conjugado con FITC, respectivamente. La Figura 11B muestra producción de forma soluble de CD27 por células B CLL.

Figura 12. La Figura 12 muestra respuestas de células T alogénicas inducidas por células CLL infectadas con un vector de terapia génica que contiene un ligando de molécula accesoria (ligando de CD40, también denominado CD154). La Figura 12A indica la concentración de IFNg en los sobrenadantes después de la estimulación de células T alogénicas con células CLL que contienen el ligando de molécula accesoria. La Figura 12B muestra proliferación celular, como se evalúa por incorporación de ^{3}H-timidina. Las Figuras 12C y 12D muestran respuestas de células T alogénicas secundarias inducidas por CLL que contienen el ligando de molécula accesoria.

Figura 13. La Figura 13 representa respuestas de células T autólogas inducidas por células B CLL que contienen el ligando de molécula accesoria, ligando de CD40 o CD154 y controles. La Figura 13A muestra incorporación de ^{3}H-timidina por células T autólogas cocultivadas con las células CLL. La Figura 13B muestra los niveles de IFNg humano producido por células T autólogas cocultivadas con las células CLL. En la Figura 13C, se representan gráficamente las actividades de CTL de células T autólogas inducidas por células B CLL que contienen ligando de molécula accesoria.

Figura 14. La Figura 14 muestra la especificidad de CTL por células B CLL autólogas. Se evaluó la concentración de IFNg en los sobrenadantes después de 48 h de cultivo (Figura 14A) y se evaluó la actividad citolítica a 3 h de cultivo (Figura 14B). En la Figura 14C, se añadieron mAb a las células diana de leucemia autólogas antes del ensayo de CTL.

Figura 15. La Figura 15 muestra que la estimulación intercelular desempeña un papel en la producción de los cambios fenotípicos observados en células CLL que expresan el ligando de molécula accesoria. En la Figura 15A, se muestra el efecto de la densidad de cultivo sobre la expresión inducida de CD54 y CD80 después de la infección con un vector de terapia génica que contiene el ligando de molécula accesoria (ligando de CD40, CD154). Los histogramas sombreados representan tinción de células B de leucemia con un mAb de control de isotipo conjugado con FITC. Los histogramas blancos representan células B CD154-CLL cultivadas a alta o baja densidad (indicada mediante flechas) y teñidas con un mAb conjugado con FITC específico para CD54 o CD80. La Figura 15B muestra la inhibición de la activación celular de CD154-CLL por mAb anti-CD154. Las Figuras 15C y 15D representan la expresión de moléculas accesorias inmunes en células B CLL testigo sin infectar inducidas por células CLL que expresan el ligando de molécula accesoria. Los histogramas sombreados representan tinción con mAb de control de isotipo conjugado con PE.

Figura 16. La Figura 16 muestra que el vector que codifica un ligando de molécula accesoria potencia la inmunización contra \beta-gal en ratones. La Figura 16A muestra que los ratones que recibieron inyecciones intramusculares del vector pCD40L producían significativamente más anticuerpos contra \beta-gal que los ratones a los que se les inyectó el vector pCDNA3 sin modificar o pCD40L. La Figura 16B, análisis de ELISA de diluciones seriadas de sueros recogidos a d28, muestra que ratones a los que se les coinyectó placZ y pCD40L tenían un título medio ocho veces superior de anticuerpos anti-\beta-gal a d28 que los ratones tratados con placZ + pcDNA3.

Figura 17. La Figura 17 muestra el análisis de las respuestas inmunes de IgG_{1} e IgG_{2a} a inmunizaciones con ADN plasmídico intramuscular con y sin vector, pCD40L, que codifica un ligando de molécula accesoria. Los anticuerpos anti-\beta-gal IgG_{2a} predominaban sobre los anticuerpos de subclase IgG_{1} en los sueros de ratones a los que se les inyectó placZ y pCDNA3 o placZ y pCD40L. Por el contrario, los ratones BALB/c a los que se les inyectó proteína \beta-gal desarrollaron predominantemente anticuerpos anti-\beta-gal IgG_{1} y no desarrollaron anticuerpos anti-\beta-gal IgG_{2a} detectables.

Figura 18. La Figura 18 muestra la comparación entre inyección de ratones con un vector pCD40L, que codifica un ligando de molécula accesoria en el mismo y en sitios diferentes que placZ. El efecto adyuvante de pCD40L requiere la coinfección con placZ en el mismo sitio.

Figura 19. La Figura 19 muestra que la coinyección en la dermis de un vector que codifica un ligando de molécula accesoria, pCD40L, con placZ potencia la respuesta anti-\beta-gal de IgG en ratones BALB/c.

Figura 20. La Figura 20 muestra que un vector que codifica un ligando de molécula accesoria, pCD40L, potencia la capacidad de placZ para inducir CTL específicos para células diana que expresan \beta-gal singénicas. Células efectoras de esplenocitos obtenidas de ratones que habían recibido inyecciones de placZ y pCD40L, lisaban específicamente significativamente más células que esplenocitos de ratones que recibieron inyecciones de control.

Figura 21. La Figura 21 muestra la modulación negativa de CD40L humano pero no de CD40L murino, en líneas celulares de tumor de pulmón que expresan CD40.

Figura 22. La Figura 22A muestra que la unión de CD40 induce la expresión aumentada de los marcadores de superficie celular tumorales CD95 (Fas), CD54 (ICAM-1) y MHC-1 en líneas celulares de tumor de pulmón. La Figura 22B muestra la modulación negativa de CD40L humano por células tumorales positivas a CD40.

Figura 23. La Figura 23 muestra la inhibición de la expresión de ligando de Fas por linfocitos en presencia de líquido sinovial de AR.

Figura 24. La Figura 24 muestra un perfil de un ensayo clínico de un tratamiento de terapia génica con ligando de molécula accesoria (CD40L) para células B CLL.

Figura 25. La Figura 25 muestra un alineamiento de secuencia de ligando de Fas humano con ligando de Fas humano en el que se ha sustituido el Dominio III por el Dominio III de ligando de Fas murino. La secuencia proteica superior es ligando de Fas humano nativo. El Dominio III está subrayado con la línea de puntos. El doble subrayado indica un sitio de escisión de MMP supuesto. La secuencia proteica inferior es la del ligando de Fas humano-de ratón quimérico. El Dominio III del ligando de Fas humano se sustituye por el Dominio III del ligando de Fas de ratón (subrayado con una línea de puntos). Los números se corresponden con el número de la secuencia de aminoácidos usando el 1 para el inicio de la secuencia polipeptídica. El número de la primera base de nucleótido para el codón que codifica el aminoácido es 1 + 3x(n - 1), donde n es el número de secuencia de aminoácidos.

Figura 26. La Figura 26 muestra un alineamiento de secuencia de ligando de Fas humano con ligando de Fas humano en el que se ha sustituido el Dominio III con el Dominio III de CD70 humano. La secuencia proteica superior es ligando de Fas humano nativo y la secuencia inferior es la del ligando de Fas quimérico, en el que el Dominio III de Fas se ha sustituido por el Dominio III de CD70 humano. Otra señales se usan de forma similar a la de la Figura 25.

Figura 27. La Figura 27 muestra un alineamiento de secuencia de ligando de Fas humano con ligando de Fas humano en el que se ha sustituido el Dominio I con el Dominio III de CD70 humano. La secuencia proteica superior es ligando de Fas humano nativo y la secuencia inferior es la del ligando de Fas quimérico, en el que el Dominio III se ha sustituido con el Dominio I de CD70 humano. Otra señales se usan de forma similar a la de la Figura 25.

Figura 28. La Figura 28 muestra los aminoácidos alrededor de y en sitios de escisión de metaloproteinasa de la matriz (MMP) conocidos como se describen en Smith, M. M. y col., Journal of Biol. Chem. 270: 6440-6449 (95) y Nagase, H., y G. B. Fields, Biopolymers (Peptide Science) 40: 399-416 (96). El sitio de escisión se indica con una flecha.

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Descripción detallada de la invención I. Definiciones

Un "gen de ligando de molécula accesoria" es un gen que codifica todo o parte de un ligando de molécula accesoria. El gen comprende al menos la secuencia de nucleótidos necesaria para codificar la porción funcional de un ligando de molécula accesoria. El gen puede incluir opcionalmente elementos genéticos tales como promotores, potenciadores y extremos 3'. El gen de ligando de molécula accesoria procede de un ligando que es un miembro de la familia del factor de necrosis tumoral (TNF), incluyendo ligando de CD40, ligando de Fas, CD70, TNF_{\alpha}, TNF_{\beta}, ligando de CD30, ligando de 4-1BB (4-1BBL), factor de crecimiento nervioso y ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL). Como se usa en este documento, la expresión "gen de ligando de molécula accesoria" incluye genes de ligandos de moléculas accesorias quiméricos como se definen a continuación.

Como se usa en este documento, la expresión "células tumorales o células neoplásicas", se define para referirse a células tumorales o cancerosas que se encuentran en un paciente humano o un animal. Los tipos preferidos de células tumorales o neoplásicas incluyen cualquier célula presentadora de antígeno tumoral. En algunas realizaciones preferidas, estas células presentadoras de antígenos tumorales tienen al menos bajos niveles de CD40 presentes en la superficie celular.

Como se usa en este documento, la expresión "células humanas neoplásicas" se define para referirse a células humanas que son neoplásicas incluyendo, pero sin limitación, células presentadoras de antígeno, cualquier célula neoplásica que pueda funcionar como célula presentadora de antígeno o funcione facilitando la presentación de antígenos, monocitos neoplásicos, macrófagos neoplásicos, células B neoplásicas, células dendríticas neoplásicas, células de Langerhans neoplásicas, células interdigitantes neoplásicas, células dendríticas foliculares neoplásicas o células de Kupffer neoplásicas y similares. La definición de células humanas neoplásicas incluye las células que se asocian con células neoplásicas en el lecho tumoral de pacientes humanos. Típicamente, las células humanas neoplásicas son leucemias, linfomas, AML, ALL, AMML, CML, CMML, CLL u otros tumores de células presentadoras de antígeno o células neoplásicas de mama, ovario o pulmón. También se contempla que los genes de ligandos de moléculas accesorias o genes de ligandos de moléculas accesorias quiméricos de la presente invención puedan insertarse en células somáticas. Estas células somáticas pueden generarse mediante un procedimiento de ingeniería genética que ha introducido en esas células genes que codifican moléculas que hacen a esas células capaces de presentar antígenos al sistema inmune.

Como se usa en este documento, la expresión "gen quimérico" se define para referirse a un gen en el que parte del gen procede de un segundo gen diferente y combinado con el primer gen, de modo que al menos una porción de cada gen esté presente en el gen quimérico resultante. Un gen puede ser quimérico si cualquier porción de la secuencia que codifica la proteína resultante procede de un segundo y diferente gen. Los genes quiméricos típicos incluyen genes en los que dominios funcionales específicos de un gen se han transferido a un segundo gen y sustituyen los dominios análogos de ese segundo gen. Por ejemplo, el gen quimérico resultante puede tener un dominio procedente de un gen murino y varios dominios procedentes de un gen humano como el descrito en las reivindicaciones de la presente invención. Estos dominios pueden variar en tamaño de 5 aminoácidos a varios cientos de aminoácidos. Otros ejemplos de genes de ligandos de moléculas accesorias quiméricos incluyen genes que contienen nucleótidos que codifican aminoácidos que no se encuentran en ningún gen de ligando de molécula accesoria de origen natural. Los ejemplos de genes quiméricos y diversas combinaciones de dominios potenciales son numerosos y un especialista en la técnica entenderá
que no se establece límite en la cantidad de un gen que debe estar presente en un segundo gen para volverlo quimérico.

Como se usa en este documento, la expresión "gen de ligando de CD40 murino" se define para referirse a un gen de ligando de molécula accesoria que procede de un gen de ligando de CD40 murino. Los ejemplos de dichos genes de ligandos de CD40 murinos incluyen el gen aislado por Armitage y col., Nature, 357: 80-82 (1992) y otros genes procedentes de origen murino que hibridan con el gen descrito por Armitage y col. en condiciones de hibridación de baja rigurosidad.

Como se usa en este documento, la expresión "vector o vector genético" se define para referirse a un ácido nucleico que es capaz de replicarse por sí mismo en el interior de un organismo tal como una célula bacteriana o animal. Los vectores genéticos típicos incluyen los plásmidos que se usan comúnmente en la tecnología de ADN recombinante y diversos virus capaces de replicarse en el interior de células bacterianas o animales. Los tipos preferidos de vectores genéticos incluyen plásmidos, fagos, virus, retrovirus y similares.

Como se usa en este documento, la expresión "vector de terapia génica" se define para referirse a un vector genético que es capaz de infectar directamente células en el interior de un animal, tal como un paciente humano. Se han descrito varios vectores de terapia génica en la bibliografía e incluyen el vector de terapia génica descrito en Cantwell y col., Blood, en prensa (1996) titulado "Adenovirus Vector Infection of Chronic Lymphocytic Leukemia B Cells". Dichos vectores se han descrito por ejemplo por Woll, P. J. y I. R. Hart, Ann. Oncol., 6 Supl. 1: 73 (1995); Smith, K. T., A. J. Shepherd, J. E. Boyd, y G. M. Lees, Gene Ther., 3: 190 (1996); Cooper, M. J. Semin. Oncol., 23: 172 (1996); Shaughnessy, E., D. Lu, S. Chatteriee, y K. K. Wong, Semin. Oncol., 23: 159 (1996); Glorioso, J. C., N. A. De Luca, y D. J. Fink, Annu. Rev. Microbiol., 49: 675 (1995); Flotte, T. R. y B. J. Carter, Gene Ther., 2: 357 (1995); Randrianarison-Jewtoukoff, V. y M. Perricaudet, Biologicals., 23: 145 (1995); Kohn, D. B., Curr. Opin. Pediatr., 7: 56 (1995); Vile, R. G y S. J. Russell, Br. Med. Bull., 51: 12 (1995); Russell, S. J., Semin. Cancer Biol., 5: 437 (1994); y Ali, M., N. R. Lemoine, y C. J. Ring, Gene Ther., 1: 367 (1994). Todas las referencias citadas en este documento se incorporan en el mismo como referencia.

II. Vectores genéticos y construcciones que contienen un gen de ligando de molécula accesoria A. Genes de ligandos de moléculas accesorias

Se describen en este documento vectores de terapia génica que contienen un gen de ligando de molécula accesoria. Este gen de ligando de molécula accesoria puede proceder de cualquier fuente y puede incluir moléculas que sean sintéticas y no aparezcan en la naturaleza. También se describen en este documento genes de ligandos de moléculas accesorias que proceden de los genes que codifican moléculas dentro de la familia del factor de necrosis tumoral (TNF) que incluye los genes que codifican: ligando de CD40 murino, ligando de CD40 humano, ligando de Fas, TNF_{\alpha}, TNF_{\beta}, ligando de CD30, ligando de 4-1BB, factor de crecimiento nervioso, CD70, ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL) y ligandos de moléculas accesorias quiméricos. La secuencia de nucleótidos de un ligando de molécula accesoria, la secuencia de al menos una forma del gen de ligando de CD40 murino, se ha determinado y se enumera como SEC ID Nº: 1. Se describe en este documento el uso de cualquier gen de ligando de molécula accesoria que sea homólogo a la secuencia presente en la SEC ID Nº: 1 y por lo tanto hibride con esta secuencia en condiciones de hibridación de baja rigurosidad. Un especialista en la técnica entenderá que los genes de ligandos de moléculas accesorias, incluyendo un gen de ligando de CD40 murino, útiles para la construcción de los genes de ligandos de CD40 quiméricos de la presente invención, pueden aislarse a partir de diversas cepas murinas diferentes.

La secuencia de nucleótidos de un gen de ligando de CD40 humano se ha determinado y se muestra como SEC ID Nº: 2. Se describe en este documento el uso de cualquier gen de ligando de molécula accesoria que sea homólogo a la SEC ID Nº: 2 y por lo tanto hibride con esta secuencia en condiciones de baja rigurosidad. Un especialista en la técnica entenderá que los genes de ligandos de moléculas accesorias, incluyendo los genes de ligandos de CD40 humanos, útiles para la construcción de los genes de ligandos de CD40 quiméricos de la presente invención, pueden variar dependiendo del individuo a partir del que se aísle el gen y dichas variaciones pueden demostrar utilidad en la producción de genes de ligandos de moléculas accesorias únicos. La presente invención contempla el uso de los dominios, subdominios, secuencia de aminoácidos o nucleótidos del ligando de CD40 humano y/o del gen de ligando de CD40 humano como parte de un ligando de molécula accesoria quimérico o gen de ligando de molécula accesoria quimérico.

La secuencia de nucleótidos de un gen de ligando de CD40 bovino se ha determinado y se muestra como SEC ID Nº: 8. Se describe en este documento el uso de cualquier gen de ligando de molécula accesoria que sea homólogo a la SEC ID Nº: 8 y por lo tanto hibride con la secuencia en condiciones de baja rigurosidad. Un especialista en la técnica entenderá que los genes de ligandos de moléculas accesorias incluyendo los genes de ligandos de CD40 bovinos pueden variar dependiendo del animal individual a partir del que se aísle el gen y que dichas variaciones pueden demostrar utilidad en la producción de genes de ligandos de moléculas accesorias únicos.

La secuencia de nucleótidos de TNF_{\alpha} humano y TNF_{\beta} se ha determinado y se muestran como SEC ID Nº: 9 y 10, respectivamente. Se describe en este documento el uso de cualquier gen de ligando de molécula accesoria que sea homólogo a TNF_{\alpha} humano o TNF_{\beta} humano (SEC ID Nº: 9 y 10, respectivamente) y por lo tanto hibride con estas secuencias en condiciones de baja rigurosidad. Los genes de ligandos de moléculas accesorias, incluyendo los genes de TNF_{\alpha} y TNF_{\beta}, humanos pueden variar dependiendo del individuo particular a partir del que se haya aislado el gen y estas variaciones pueden demostrar utilidad en la producción de genes de moléculas accesorias únicas.

La secuencia de nucleótidos de TNF_{\alpha} y TNF_{\beta} porcinos se ha determinado y se muestra como SEC ID Nº: 11. Se describe en este documento el uso de cualquier gen de ligando de molécula accesoria que sea homólogo a la SEC ID Nº: 11 y por lo tanto hibridaría con estas secuencias en condiciones de baja rigurosidad. Un especialista en la técnica entenderá que los genes de ligandos de moléculas accesorias incluyendo los genes de TNF_{\alpha} y TNF_{\beta} porcinos, pueden variar dependiendo del animal particular a partir del que se aísle el gen y que dicha variación puede demostrar utilidad en la producción de genes de moléculas accesorias únicos.

La secuencia de nucleótidos de un gen de TNF_{\alpha} murino se ha determinado y se muestra como SEC ID Nº: 12. Se describe en este documento el uso de cualquier gen de ligando de molécula accesoria que sea homólogo a la SEC ID Nº: 12 y por lo tanto hibride con la secuencia en condiciones de baja rigurosidad. Un especialista en la técnica entenderá que los genes de ligandos de moléculas accesorias incluyendo el gen de TNF_{\alpha} murino pueden variar dependiendo del individuo a partir del que se aísle el gen y que esas variaciones pueden demostrar utilidad en la producción de genes de moléculas accesorias únicos.

La secuencia de nucleótidos de ligando de Fas humano y ligando de Fas murino (C57BL/6) se ha determinado y se muestran como SEC ID Nº: 13 y 14, respectivamente. La secuencia de nucleótidos del ligando de Fas Balb/c murino se muestra como SEC ID Nº: 31. Se describe en este documento el uso de cualquier gen de ligando de molécula accesoria que sea homólogo a cualquiera de las SEC ID Nº: 13, 14 y 31 y por lo tanto hibride con las secuencias en condiciones de baja rigurosidad. Un especialista en la técnica entenderá que los genes de ligandos de moléculas accesorias incluyendo los genes de ligando de Fas humano o ligando de Fas murino pueden variar dependiendo del individuo o animal particular a partir del que se aísle el gen y que dichas variaciones pueden demostrar utilidad en la producción de cualquier gen de molécula accesoria.

La secuencia de nucleótidos de un gen de CD70 humano se ha determinado y se muestra como SEC ID Nº: 15. La secuencia génica de CD70 murino también se ha determinado y se muestra como SEC ID Nº: 36 y se describió por Tesselaar y col, J. Immunol. 159: 4959-65 (1997). Se describe en este documento el uso de cualquier gen de ligando de molécula accesoria que sea homólogo a la SEC ID Nº: 15 ó 36 y por lo tanto hibride con esta secuencia en condiciones de baja rigurosidad. Un especialista en la técnica entenderá que los genes de ligandos de moléculas accesorias, incluyendo el gen de CD70 humano, pueden variar dependiendo del individuo a partir del que se aísle el gen y
que estas variaciones pueden demostrar utilidad en la producción de genes de ligandos de moléculas accesorias únicos.

La secuencia de nucleótidos del gen de ligando de CD30 humano se ha determinado y se muestra como SEC ID Nº: 16. Se describe en este documento el uso de cualquier gen de ligando de molécula accesoria que sea homólogo a la SEC ID Nº: 16 y por lo tanto hibride con esta secuencia en condiciones de baja rigurosidad. Un especialista en la técnica entenderá que el gen de ligando de molécula accesoria, incluyendo el gen de ligando de CD30 humano, puede variar dependiendo del individuo a partir del que se aísle el gen y que dichas variaciones pueden demostrar utilidad en la producción de genes de ligandos de moléculas accesorias únicos. También se describe en este documento y se contempla en las moléculas de ligandos de CD40 quiméricos de la presente invención variaciones y variantes de las secuencias de nucleótidos de los genes de ligandos de moléculas accesorias proporcionados en este documento que estén causadas por un corte y empalme alternativo del ARN mensajero. Este corte y empalme alternativo del ARN mensajero inserta secuencias de nucleótidos adicionales que pueden codificar uno o más segmentos de aminoácidos opcionales, que
a su vez permiten que el ligando de molécula accesoria codificado tenga propiedades o funciones adicionales.

La secuencia de nucleótidos de un 4-1BBL humano y de ratón se ha determinado y se muestran como SEC ID Nº: 17 y 18, respectivamente. Se describe en este documento el uso de cualquier gen de ligando de molécula accesoria que sea homólogo a cualquiera de las SEC ID Nº: 17 y 18 y por lo tanto hibride con estas secuencias en condiciones de baja rigurosidad. Un especialista en la técnica entenderá que los genes de ligandos de moléculas accesorias, incluyendo el gen de 4-1BBL humano, pueden variar dependiendo del individuo a partir del que se aíslen y que dichas variaciones pueden demostrar utilidad en la producción de genes de ligandos de moléculas accesorias únicos.

Se describen en este documento moléculas accesorias quiméricas que contienen cualquier dominio, porción de subdominio o secuencia de aminoácidos codificada por los siguientes genes: TNF-\alpha bovino (SEC ID Nº: 21), ligando de CD40 murino (SEC ID Nº: 22), factor de crecimiento nervioso humano-\beta (SEC ID Nº: 23), factor de crecimiento nervioso murino (SEC ID Nº: 24), ligando de Fas de rata (SEC ID Nº: 25), ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF humano (TRAIL) (SEC ID Nº: 41, número de acceso de Genbank U37518), ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF murino (TRAIL) (SEC ID Nº: 42, número de acceso de Genbank U37522), ligando de CD30 murino (SEC ID Nº: 43), 4-1BBL humano (SEC ID Nº: 17) y 4-1BBL murino (SEC ID Nº: 44 y 18). También se describen moléculas accesorias quiméricas que utilizan genes que codifican secuencias de aminoácidos homólogas a estas secuen-
cias y a los genes de ligandos de CD40 quiméricos de la presente invención que se describen en las reivindicaciones.

También se describen genes de ligandos de moléculas accesorias quiméricos que están compuestos por un segmento de nucleótidos procedente de un gen de ligando de molécula accesoria unido operativamente a una secuencia de nucleótidos procedente de un gen de ligando de molécula accesoria diferente u otro gen.

Por ejemplo, se describe un gen de ligando de molécula accesoria quimérico que está compuesto por un segmento del gen de ligando de CD40 murino que se ha unido operativamente a al menos otro segmento génico adicional procedente de un gen de ligando de molécula accesoria diferente. El tamaño del segmento particular procedente del gen de ligando de molécula accesoria diferente puede variar de una secuencia de nucleótidos que codifica unos pocos aminoácidos, un subdominio del ligando de molécula accesoria, un dominio del ligando de molécula accesoria o más de un dominio de un ligando de molécula accesoria. Los ligandos de moléculas accesorias quiméricos de la presente invención se describen en las reivindicaciones. Otras moléculas accesorias quiméricas están compuestas por un gen de ligando de molécula accesoria en el que se han insertado nucleótidos que codifican un segmento de aminoácidos que no se encuentra como parte de un ligando de molécula accesoria de origen natural. Este segmento de aminoácidos puede generarse artificialmente o proceder de una proteína que se encuentra en la naturaleza. El gen de ligando de molécula accesoria quimérico codifica una secuencia de aminoácidos quimérica y, por lo tanto, un ligando de molécula accesoria quimérico codificado puede poseer propiedades única además de las propiedades que se encuentran en los segmentos individuales procedentes de los diferentes genes de ligandos de moléculas accesorias. El gen de ligando de molécula accesoria quimérico puede codificar un ligando de molécula accesoria que tenga propiedades procedentes del ligando de molécula accesoria usado para construir el gen quimérico.

Cada uno de los genes de ligandos de moléculas accesorias que son miembros de la familia del factor de necrosis tumoral tienen una estructura secundaria similar constituida por varios dominios. Esta estructura de dominios incluyen un primer dominio que está codificado por la región 5' del gen de ligando de molécula accesoria. El segundo dominio (Dominio II) es el dominio que contiene los aminoácidos que atraviesan la membrana celular y por lo tanto se denomina dominio transmembrana. El tercer dominio (Dominio III) es el dominio extracelular proximal y estos aminoácidos son los aminoácidos que se encuentran proximales a la membrana celular. El cuarto dominio (Dominio IV) está codificado por el extremo 3' del gen de ligando de molécula accesoria y se ha denominado dominio extracelular distal. El dominio extracelular distal (Dominio IV) generalmente compone la forma soluble de la molécula de la familia del factor de necrosis tumoral. Basándose en la estructura cristalina de rayos x del TNF humano, la estructura secundaria predicha de la molécula accesoria, ligando de CD40, se ha deducido junto con la estructura de dominios de estas moléculas por M. Peitsch y C. Jongeneel, International Immunology, 5: 233-238 (1993). Las estructuras secundarias de los otros miembros de la familia del factor de necrosis tumoral se dedujeron usando análisis informático junto con la comparación con la estructura de dominios de ligandos de TNF y CD40 humanos. En la Tabla I, se muestran los límites de dominios de varios genes de ligandos de moléculas accesorias. Se muestra en la Figura 1 un diagrama de estos dominios para varios de estos ligandos moleculares de células accesorias. Las asignaciones de los límites de dominios son aproximadas y un especialista en la técnica entenderá que estos límites pueden variar y todavía proporcionar una identificación útil de los dominios.

TABLA I

1

2

Un especialista en la técnica entenderá que los genes de moléculas accesorias quiméricos típicos incluirían genes producidos por intercambio de segmentos de dominios o subdominios entre, por ejemplo, un gen de ligando de CD40 de ratón y un gen de ligando de CD40 humano. Por ejemplo, puede construirse un gen de molécula accesoria quimérico uniendo operativamente el Dominio I del gen de ligando de CD40 humano a los Dominios II-IV del ligando de CD40 murino. Un especialista en la técnica entenderá la diversidad de genes de ligandos de moléculas accesorias quiméricos que pueden producirse usando las moléculas accesorias identificadas en la Tabla I. Se describen también otros genes quiméricos en los que se intercambian segmentos más pequeños (segmentos de subdominios) entre, por ejemplo, un gen de ligando de CD40 murino y un gen de ligando de CD40 humano o un segundo gen de ligando de CD40 murino. Un especialista en la técnica entenderá que los genes que codifican moléculas accesorias tendrán al menos segmentos génicos que se corresponden con diversos segmentos funcionales de un ligando de molécula accesoria tal como el ligando de CD40 murino codificado por el gen de ligando de CD40 murino (SEC ID Nº: 1). También será evidente para un especialista en la técnica que los límites de nucleótidos identificados en la Tabla I pueden variar considerablemente de los identificados para el gen de ligando de CD40 murino (SEC ID Nº: 1) y todavía definir dominios que sean útiles en la presente invención.

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Como se describe en la reivindicación 2, en una realización preferida, el gen de ligando de molécula accesoria quimérico está compuesto por los nucleótidos que codifican dominios extracelulares (Dominios III y IV) de un ligando de CD40 humano unido operativamente a los nucleótidos que codifican el transmembrana (Dominio II) y los nucleótidos que codifican el dominio citoplasmático (Dominio I) del gen de ligando de CD40 murino. Se muestran ejemplos de dichas moléculas accesorias quiméricas preferidas en la Figura 2. Una secuencia de nucleótidos ejemplar para dicho gen es la SEC ID Nº: 7. En otros genes de ligandos de moléculas accesorias quiméricos de la presente invención, los nucleótidos que codifican los dominios extracelulares (Dominios III y IV) del gen de ligando de CD40 murino pueden unirse operativamente a nucleótidos que codifican el dominio transmembrana (Dominio II) y citoplasmático (Dominio I) del gen de ligando de CD40 humano. Una secuencia de nucleótidos ejemplar para dicho gen es la SEC ID Nº: 3. En otros genes de ligandos de moléculas accesorias quiméricos preferidos de la presente invención, los nucleótidos que codifican los dominios extracelulares (Dominios III y IV) y dominio transmembrana (Dominio II) de ligando de CD40 humano se acoplan con los nucleótidos que codifican el dominio citoplasmático (Dominio I) del gen de ligando de CD40 murino. Una secuencia de nucleótidos ejemplar para dicho gen es la SEC ID Nº: 6. Otros genes de moléculas accesorias quiméricos que se contemplan en la presente invención comprenden los nucleótidos que codifican los dominios extracelulares (Dominios III y IV) y el dominio transmembrana (Dominio II) del gen de ligando de CD40 murino unido operativamente a los nucleótidos que codifican el dominio citoplasmático del gen de ligando de CD40 humano. Una secuencia de nucleótidos ejemplar para dicho gen es la SEC ID Nº: 5. Se contemplan en la presente invención otros genes de ligandos de moléculas accesorias quiméricos en los que los dominios extracelulares del gen de ligando de CD40 humano (Dominios III y IV) están unidos operativamente al dominio transmembrana del gen de ligando de CD40 murino (Dominio I) que está unido operativamente al dominio citoplasmático del gen de ligando de CD40 humano (Domino I). Una secuencia de nucleótidos ejemplar para dicho gen es la SEC ID Nº: 4.

Un especialista en la técnica entenderá que son posibles muchas más combinaciones que utilizan dominios u otros segmentos seleccionados de cualquiera de los genes de ligandos de moléculas accesorias, incluyendo los genes de ligandos de CD40 humanos y los genes de ligandos de CD40 de ratón. Dichos genes de moléculas accesorias quiméricos adicionales incluirían los siguientes genes: genes de moléculas accesorias quiméricos en los que los nucleótidos que codifican el Domino I se seleccionan a partir de un gen de ligando de molécula accesoria particular y unido operativamente, directamente o mediante una secuencia de nucleótidos adicional, a los nucleótidos que codifican el Dominio II de un gen de ligando de molécula accesoria particular. Estos dominios estarían después unidos operativamente directamente o mediante una secuencia de nucleótidos adicional a los nucleótidos que codifican el Dominio III de un gen de ligando de molécula accesoria particular. Después, esta molécula se uniría operativamente directamente o mediante una secuencia de nucleótidos adicional a los nucleótidos que codifican el Dominio IV de un gen de ligando de molécula accesoria particular. El gen de ligando de molécula accesoria quimérico construido de esta forma puede tener nucleótidos adicionales en cualquier extremo o entre dominios que sean útiles para proporcionar diferentes aminoácidos en estas posiciones. Un especialista en la técnica entenderá que estas combinaciones particulares son simplemente ilustraciones y que podrían contemplares numerosas otras combinaciones en las que segmentos génicos que comprenden nucleótidos que codifican menos del dominio completo de una molécula accesoria se intercambian entre diferentes moléculas accesorias.

También se describen genes de ligandos de moléculas accesorias quiméricos que están compuestos por segmentos génicos de ligando de CD40 de ratón o humano en combinación con segmentos génicos procedentes de ligando de Fas, TNF_{\alpha}, TNF_{\beta}, CD70, CD30L, 4-1BBL, factor de crecimiento nervioso o ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL). Los genes de ligandos de moléculas accesorias quiméricos particularmente útiles comprenden al menos un segmento que procede de un gen de ligando de CD40 murino junto con segmentos génicos o un segmento génico procedente de un gen de ligando de molécula accesoria diferente.

La presente invención también contempla genes de ligandos de CD40 quiméricos en los que las moléculas accesorias producidas se han modificado para eliminar aminoácidos en el interior de la molécula accesoria quimérica que se usan por mecanismos postraduccionales para regular el nivel de expresión de la molécula accesoria o proteína molecular accesoria en una célula particular. Los sitios eliminados de las moléculas accesorias quiméricas o molécula quimérica pueden incluir aminoácidos o sitios que componen sitios de escisión de proteasas incluyendo metalotionina proteasas, serina proteasas y otras proteasas que reconocen una secuencia de aminoácidos específicamente o inespecíficamente. En realizaciones particularmente preferidas, se han modificado o eliminado aminoácidos en el Dominio III que componen un sitio o sitios de reconocimiento potenciales o reales usados por mecanismos reguladores postraduccionales.

También se describen genes de ligandos de moléculas accesorias quiméricos en los que los dominios, fragmentos de subdominios u otros restos aminoacídicos se han tomado de un gen de ligando de molécula accesoria y se han desplazado a un segundo gen de ligando de molécula accesoria de la misma especie. Por ejemplo, se describe que el Dominio I humano y el Dominio II humano de la molécula de ligando de CD40 pueden unirse operativamente a los nucleótidos que codifican el Dominio III humano de, por ejemplo, la molécula CD70, que a su vez está unida operativamente al Domino IV humano para la molécula de ligando de CD40. Esta molécula accesoria quimérica contiene por lo tanto los Dominios I, II y IV de CD40L humano y el Dominio III de CD70 humano. Una secuencia de nucleótidos ejemplar para dicho gen es la SEC ID Nº: 19. Un especialista en la técnica entenderá que varias de dichas combinaciones usando dominios de la misma especie de genes de ligandos de moléculas accesorias diferentes pueden generar varios genes de moléculas accesorias quiméricos, pudiendo todos tener actividades y propiedades específicas.

Se describen en este documento genes de ligandos de moléculas accesorias quiméricos en los que el Dominio III de un gen de ligando de molécula accesoria particular se ha sustituido con un Dominio III de un gen de ligando de molécula accesoria diferente. En una realización de la presente invención, el Dominio III de ratón se ha usado para sustituir el Domino III humano en la molécula de ligando de CD40. Esta molécula accesoria quimérica contiene por lo tanto el Dominio I de CD40L humano, el Dominio II de CD40L humano, el Dominio III de CD40L de ratón y el Domino IV de CD40L humano. Una secuencia de nucleótidos ejemplar para dicho gen es la SEC ID Nº: 20.

La presente invención también contempla el uso de ligandos de CD40 quiméricos que contienen secuencias de aminoácidos sintéticas insertadas en o en lugar de una porción de un dominio u otra secuencia de aminoácidos de un gen de molécula accesoria. En general, pueden generarse segmentos de aminoácidos sintéticos por selección de cualquier secuencia de aminoácidos que pueda usarse para dar a la molécula accesoria una función particular o eliminar otra función no deseada. Estos segmentos de aminoácidos sintéticos se producen por inserción en el gen de ligando de molécula accesoria o gen de ligando de molécula accesoria quimérico de las secuencias de nucleótidos necesarias para codificar esos segmentos de aminoácidos sintéticos particulares en las posiciones deseadas. Además, los genes de ligandos de moléculas accesorias quiméricos pueden contener segmentos de nucleótidos que comprenden segmentos de subdominios de otras moléculas o segmentos pequeños en los que se han modificado aminoácidos con un fin deseado. El uso de segmentos de nucleótidos de subdominios permite la introducción de secuencias de aminoácidos cortas procedentes de otras moléculas en moléculas accesorias quiméricas. La incorporación de dichos segmentos de subdominios cortos o modificaciones de aminoácidos en el ligando de molécula accesoria permite la introducción de características de esa moléculas deseadas o la eliminación de características no deseadas.

La identificación de estructuras de dominios en el interior de moléculas de células accesorias es bien conocida en la técnica y generalmente requiere la identificación de restos de cisteína en el interior de las moléculas accesorias y el posterior cartografiado de enlaces disulfuro entre diversos restos cisteína. El cartografiado de diversos segmentos de subdominios de una molécula accesoria es bien conocido en la técnica e implica el análisis de la secuencia de aminoácidos de las moléculas accesorias y generalmente implica una comparación de la estructura cristalina del factor de necrosis tisular con el uso de algoritmos predictivos, produciendo de este modo una estructura predicha de una molécula accesoria quimérica o una molécula accesoria. Esta estructura predicha de estas moléculas puede usarse después para seleccionar diversas porciones de subdominios de la molécula para usarlas para construir moléculas accesorias quiméricas adicionales. Los ejemplos de dichos estudios de cartografiado incluyen los estudios por M. Pitsch y C. V. Jongeneel, International Immunology, 5: 233-238 (1993) y el análisis que se muestra en la Figura 1.

También se describen genes de ligandos de moléculas accesorias y genes de ligandos de moléculas accesorias quiméricos que están truncados y codifican menos de la longitud completa de la secuencia de aminoácidos que se encuentra en el ligando de molécula accesoria nativo. Estos truncamientos pueden alterar las propiedades del gen de ligando de molécula accesoria pero se mantiene cierta actividad identificada. Dichos truncamientos pueden realizarse por eliminación de un segmento génico o segmentos génicos del gen de molécula accesoria y típicamente se realizarían por eliminación de nucleótidos que codifican dominios que no están directamente implicados en la unión del ligando de molécula accesoria con su molécula accesoria. Estos genes de ligandos de moléculas accesorias truncados o genes de ligandos de moléculas accesorias truncados quiméricos pueden contener segmentos génicos adicionales que codifican segmentos de aminoácidos o dominios que sustituyen los dominios eliminados de ese gen de molécula accesoria truncado. Sin embargo, no es necesaria dicha sustitución de las porciones de la molécula accesoria eliminadas por truncamiento.

Los genes de moléculas accesorias quiméricos descritos en este documento y los genes de ligandos de CD40 quiméricos de la presente invención pueden construirse usando procedimientos de ingeniería genética convencionales para unir operativamente una secuencia de nucleótidos particular de un gen de ligando de molécula accesoria a una secuencia de nucleótidos diferente derivada del mismo o de un gen de ligando de molécula accesoria diferente. Además, pueden usarse procedimientos de ingeniería genética convencionales para insertar secuencias de nucleótidos sintéticas o secuencias de nucleótidos de subdominios en el gen de ligando de molécula accesoria quimérico. Un especialista en la técnica entenderá que pueden utilizarse diversos procedimientos para producir dichos genes de moléculas accesorias quiméricos. Por ejemplo, puede usarse un procedimiento de conversión génica conocido como "SOEN" para producir un gen de molécula accesoria quimérico que contiene segmentos de nucleótidos procedentes de diferentes moléculas accesorias quiméricas. Los procedimientos para el uso de este procedimiento de conversión de genes son bien conocidos en la técnica y se han descrito, por ejemplo, en Horton, R. M., Mol. Biotechnol., 3: 93 (1995); Ali, S. A. y A. Steinkasserer, Biotechniques, 18: 746 (1995); Vilardaga, J. P., E. di Paolo, y A. Bollen, Biotechniques, 18: 604 (1995); Majumder, K., F. A. Fattah, A. Selvapandiyan, y R. K. Bhatnagar, PCR. Methods Appl., 4: 212 (1995); Boles, E. y T. Miosga, Curr, Genet. 28: 197 (1995); Vallejo, A. N., R. J. Pogulis, y L. R. Pease, PCR. Methods Appl., 4: S123 (1994); Henkel, T. y P. A. Baeuerle, Anal. Biochem., 214: 351 (1993); Tessier, D. C. y D. Y. Thomas, Biotechniques, 15: 498 (1993); Morrison, H. G. y R. C. Desrosiers, Biotechniques, 14: 454 (1993); Cadwell, R. C. y G. F. Joyce, PCR. Methods Appl., 2: 28 (1992); y Stappert, J., J. Wirsching, y R. Kemler, Nucleic Acids Res., 20: 624 (1992). Como alternativa, un especialista en la técnica entenderá que puede usarse mutagénesis dirigida para introducir cambios en una secuencia de nucleótidos particular para producir directamente o usarse indirectamente para producir un gen de molécula accesoria quimérico o un gen de ligando de CD40 quimérico de la presente invención. Por ejemplo, el kit de mutagénesis proporcionado por BioRad Laboratories puede usarse junto con los procedimientos y protocolos descritos en el interior de ese kit para producir los cambios deseados en la secuencia de nucleótidos. Estos procedimientos se describieron originariamente por Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 488-492 (1985) y Kunkel y col., Meth. Enzol. Mol., 154: 367-382 (1987). Mediante el uso de los protocolos de mutagénesis dirigida descritos en este documento y conocidos en la técnica, un investigador especialista puede inducir modificaciones de nucleótidos individuales que dan como resultado una secuencia de aminoácidos modificada o que conservan una secuencia de aminoácidos pero introducen una secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción deseada en el gen. Este nuevo sitio de reconocimiento por endonucleasa de restricción puede usarse después para cortar el gen en ese punto particular y usarlo en un gen o segmento de otro gen de ligando de molécula accesoria. Además de estos procedimientos, un especialista en la técnica entenderá que puede sintetizarse un gen de ligando de molécula accesoria quimérica usando procedimientos sintéticos conocidos en la técnica. Esta metodología sólo requiere que el especialista genere la secuencia de nucleótidos de un gen de ligando de molécula accesoria quimérico y proporcione esa secuencia a una compañía que sea capaz de sintetizar dicho gen.

B. Construcciones genéticas

La presente invención contempla el uso de genes de ligandos de CD40 quiméricos de la presente invención y describe el uso de otros genes de ligandos de moléculas accesorias o genes de ligandos de moléculas accesorias quiméricos que están presentes en diversos tipos de vectores genéticos. Un vector genético se refiere a una molécula de ADN capaz de la replicación autónoma en una célula en la que puede insertarse otro segmento de ADN para provocar que los segmentos de ADN adicionales se repliquen. Los vectores capaces de expresar genes contenidos en ese vector se denominan "vectores de expresión". Por lo tanto, los vectores genéticos y vectores de expresión de la presente invención son moléculas de ADN recombinante que comprenden al menos dos secuencias de nucleótidos que normalmente no se encuentran juntas en la naturaleza.

Los vectores genéticos útiles en la presente invención contienen un gen de ligando de CD40 quimérico de la presente invención o se describe que los vectores contienen otro gen de ligando de molécula accesoria que codifica un ligando de molécula accesoria que está opcionalmente unido operativamente a una secuencia de nucleótidos reguladora de la transcripción o traducción adecuada, tal como una procedente de un gen de mamífero, microbiano, viral o de insecto. Dichas secuencias reguladoras incluyen secuencias que tienen un papel regulador en la expresión de genes, tal como un promotor o potenciador de la transcripción, una secuencia operadora para controlar la transcripción, una secuencia que codifica un sitio de unión al ribosoma dentro del ARN mensajero y secuencias apropiadas que controlan la transcripción, el inicio de la traducción o la terminación de la transcripción.

Las secuencias reguladoras particularmente útiles incluyen las regiones promotoras de diversos genes de mamíferos, virales, microbianos y de insecto. La región promotora dirige un inicio de la transcripción del gen y provoca la transcripción completa del ADN e incluyendo el gen de ligando de molécula accesoria. Las regiones promotoras útiles incluyen el promotor que se encuentra en la repetición terminal larga (LTR) del virus de sarcoma de Rous (RSV), los promotores lac de la región potenciadora/promotora del citomegalovirus humano (HCMV) y promotores aislados de adenovirus y cualquier otro promotor conocido por un especialista en la técnica que entienda que sea útil para la expresión génica en eucariotas, procariotas, virus o células microbianas. Otros promotores que son particularmente útiles para expresar genes y proteínas en el interior de células eucariotas incluyen secuencias promotoras de células de mamíferos y secuencias potenciadoras tales como las derivadas de virus polioma, adenovirus, virus de los simios 40 (SV40) y el citomegalovirus humano. Son particularmente útiles los promotores temprano y tardío virales que se encuentran típicamente adyacentes al origen de replicación viral en virus tales como el SV40. Se han descrito ejemplos de diversos promotores que se han usado en vectores de expresión por Okiama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3: 280, 1983), el pMLSVN SV40 descrito por Kossman y col., Nature 312: 768 (1984). Un especialista en la técnica entenderá que la selección de un promotor útil particular depende de las líneas celulares exactas y de los otros diversos parámetros de la construcción genética que se va a usar para expresar el gen de ligando de molécula accesoria o el gen de ligando de molécula accesoria quimérico en el interior de una línea celular particular. Además, un especialista en la técnica seleccionará un promotor que se sepa que expresa genes en la célula diana a un nivel suficientemente alto para ser útil en la presente invención.

Los vectores genéticos y vectores de expresión de la presente invención contienen opcionalmente diversas secuencias reguladoras adicionales que incluyen sitios de unión al ribosoma que permiten la traducción eficaz de la ARN mensajero producido a partir de un vector de expresión en proteínas, la secuencia de ADN que codifica diversos péptidos señal que pueden unirse operativamente al gen de ligando de molécula accesoria o al gen de molécula accesoria quimérico. El péptido señal, si está presente, se expresa como un aminoácido precursor que permite una secreción extracelular mejorada del polipéptido de fusión de traducción.

Las construcciones genéticas contempladas por la presente invención incluyen por lo tanto diversas formas de genes de ligandos de CD40 quiméricos descritos anteriormente que están unidos operativamente a una secuencia promotora o a una secuencia promotora y potenciadora y también unidos operativamente a una secuencia de poliadenilación que dirige la terminación y la poliadenilación del ARN mensajero. También se contempla que las construcciones genéticas de la presente invención contendrán otras secuencias genéticas que permitan la replicación eficaz y la expresión de esa construcción en el interior de las células deseadas. Dicha secuencia puede incluir intrones que proceden de genes de ligandos de moléculas accesorias nativos o, por ejemplo, de un gen de virus.

La presente invención también contempla vectores de terapia génica que son capaces de infectar directamente células de mamíferos para introducir el gen de ligando de CD40 quimérico deseado en esa célula. Estos vectores de terapia génica son útiles para infectar directamente células que se han aislado de un animal o paciente o pueden introducirse directamente en un animal o paciente y por lo tanto infectar directamente la célula deseada en el interior de ese animal o paciente.

Se han desarrollado y descrito en la bibliografía muchos tipos de vectores de terapia génica que son capaces de transferir genes con éxito y causar la expresión de secuencias de ADN extrañas deseadas. Por ejemplo, el artículo titulado "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" en Current Comm. Mol. Biol., Cold Springs Harbor Laboratory, Nueva York (1987). Además, puede introducirse físicamente ADN desnudo en células eucariotas incluyendo células humanas por transvección usando gran cantidad de técnicas que incluyen transfección con fosfato de calcio (Berman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 7176 (1984)), transfección por DEAE-Dextrano, fusión de protoplastos (Deans y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1292 (1984)), electroporación, fusión de liposomas, transfección con polibreno y transferencia génica directa mediante micropunción por láser de la membrana celular. Además, un especialista en la técnica entenderá que cualquier técnica que sea capaz de introducir con éxito el ADN en una célula de tal forma que permita integrarlo en el genoma de una célula y permita la expresión del gen deseado sería útil en la presente invención.

En concreto, se han descrito ampliamente vectores de terapia génica que utilizan partículas de virus infeccioso recombinante para administración de genes. Véase, por ejemplo, Brody, S. L. y R. G. Crystal, Ann. N. Y. Acad. Sci., 716: 90 (1994); Srivastava, A., Blood. Cells, 20: 531 (1994); Jolly, D., Cancer Gene Ther., 1: 51 (1994); Russell, S. J. Cancer, 30A: 1165 (1994); Yee, J. K., T. Friedmann, y J. C. Burns, Methods Cell Biol., 43 Pt A: 99 (1994); Boris-Lawrie, K. A. y H. M. Temin, Curr. Opin. Genet. Dev., 3: 102 (1993); Tostoshev. P., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 33: 573 (1993); y Carter, B. J., Curr. Opin. Biotechnol., 3: 533 (1992). La presente invención contempla el uso de vectores de terapia génica que llevan a cabo la metodología deseada en la presente invención por introducción de un gen que codifica un gen de ligando de CD40 quimérico en la célula. Se han definido y usado muchos vectores virales como vectores de terapia génica e incluyen vectores de virus derivados del virus de los simios 40 (SV40), adenovirus, virus adenoasociados y retrovirus. Un especialista en la técnica entenderá que los vectores de terapia génica útiles son vectores que son capaces de introducir directamente en las células diana el ADN que codifica el ligando de CD40 quimérico y permitir que el ADN persista en la célula para expresar el ligando de CD40 quimérico de la forma deseada en el interior de la célula.

Los vectores de terapia génica de la presente invención son útiles para introducir genes de ligandos de CD40 quiméricos en una diversidad de células de mamífero incluyendo células humanas. Las células particulares infectadas por el vector de terapia génica dependerán de diversos detalles del vector y dichos vectores pueden usarse para introducir los genes de ligandos de CD40 quiméricos de la presente invención en células madre hematopoyéticas o linfoides, células presentadoras de antígeno, células madre embrionarias y otras células que son capaces de presentar antígenos dentro del sistema inmune incluyendo células que tienen CD40 en su superficie. Además, dichos vectores de terapia génica son capaces de introducir un gen que codifica un gen de ligando de CD40 quimérico en una célula neoplásica humana tal como de linfoma, leucemia, AML, CLL, CML, AMML, CMML, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de ovario o cualquier tumor capaz de actuar como célula presentadora de antígeno o células que pueden estimular células presentadoras de antígeno testigo. Además, los vectores de terapia génica contemplados pueden usarse para introducir los genes de ligandos de CD40 quiméricos de la presente invención en células que se han modificado por ingeniería genética para hacer a esas células capaces de presentar antígenos al sistema inmune.

III. Células que contienen construcciones genéticas que codifican un ligando de molécula accesoria o ligando de molécula accesoria quimérico

La presente invención también contempla diversas células que contienen las construcciones genéticas de la presente invención. Estas células contienen las construcciones que codifican el gen de ligando de CD40 quimérico y por lo tanto contienen los diversos elementos genéticos descritos en la sección II. B. anterior. Estas células pueden ser células microbianas, células eucariotas, células de insecto y diversas células de mamífero incluyendo células humanas. En realizaciones preferidas de la presente invención, estas células incluyen diversas células neoplásicas incluyendo células neoplásicas humanas. Estas células neoplásicas pueden ser de cualquier tipo celular e incluir células del sistema inmune y otras células sanguíneas. Se prefiere particularmente cualquier célula neoplásica que pueda funcionar como una célula presentadora de antígeno dentro del sistema inmune o que pueda estimular células presentadoras de antígeno testigo por expresión de una molécula de célula accesoria transgénica de la presente invención. Típicamente estas células neoplásicas que son capaces de funcionar presentando antígenos al sistema inmune tienen o han tenido una molécula accesoria, tal como la molécula CD40 en la superficie celular. Generalmente, estas células son naturalmente capaces de presentar antígenos al sistema inmune, pero la presente invención también contempla la introducción de genes de ligandos de CD40 quiméricos en una célula que no sea capaz de forma natural de presentar antígenos al sistema inmune pero que se haya modificado por ingeniería genética para hacer que la célula sea capaz de presentar antígenos al sistema inmune. Típicamente, estas células incluyen diversos tipos celulares conocidos tales como monocitos, macrófagos, células B, células de Langerhans, células interdigitantes, células dendríticas foliculares o células de Kupffer y similares que se han vuelto neoplásicas. Además, la presente invención también contempla células de diversos carcinomas, cánceres de mama, ovario y pulmón que contienen las construcciones genéticas descritas en este documento. En otras realizaciones preferidas, un gen de ligando de CD40 quimérico de la presente invención se introduce en células que puede inyectarse en un sitio de tratamiento tal como un lecho tumoral o articulación. Por ejemplo, el gen de ligando de CD40 quimérico de la presente invención puede insertarse en una célula fibroblástica y el ligando de molécula accesoria expresarse en la superficie de esa célula. Los fibroblastos se inyectan después en el sitio de tratamiento y causan el efecto inmune deseado debido a la presencia del ligando de CD40 quimérico en la superficie de esas células. Estas células estimulan otras células inmunes presentes en ese sitio de tratamiento (células testigo). Después, este procedimiento da como resultado el efecto deseado en el sistema inmune.

IV. Procedimientos que utilizan vectores genéticos y construcciones que contienen un gen de ligando de molécula accesoria

La presente invención contempla procedimientos de alteración de la inmunorreactividad de células humanas usando un procedimiento que incluye introducir un gen que codifica un gen de ligando de CD40 quimérico en las células humanas de modo que el ligando de CD40 quimérico codificado por ese gen se expresa en la superficie de esas células. La presente invención es útil para cualquier célula humana que participe en una reacción inmune como diana para el sistema inmune o como parte del sistema inmune que responde a la diana extraña. Se contemplan una amplia diversidad de procedimientos en los que el resultado final es que el gen de ligando de molécula accesoria o el gen de ligando de CD40 quimérico en la presente invención se introduzcan en las células deseadas. Estos procedimientos incluyen procedimientos ex vivo, procedimientos in vivo y diversos otros procedimientos que implican la inyección de ADN, vectores genéticos o vectores de terapia génica en el animal o ser humano, incluyendo la inyección directamente en el lecho tumoral presente en cualquier animal o ser humano.

Se contemplan procedimientos ex vivo en los que las células en las que se va a introducir el gen de ligando de molécula accesoria se aíslan del animal o paciente y después el gen se introduce en esas células aisladas usando procedimientos adecuados. Se han descrito ejemplos de procedimientos ex vivo útiles, por ejemplo, por Raper, S. E., M. Grossman, D. J. Rader, J. G. Thoene, B. J. Clark, D. M. Kolansky, D. W. Muller, y J. M. wilson, Ann. Surg., 223: 116 (1996); Lu, L., R. N. Shen, y H. E. Broxmeyer, Crit. Rev. Oncol. Hematol., 22: 61 (1996); Koc, O. N., J. A. Allay, K. Lee, B. M. Davis, J. S. Reese, y S. L. Gerson, Semin. Oncol., 23: 46 (1996); Fisher, L. J. y J. ray, Curr. Opin. Neurobiol., 4: 735 (1994); y Goldspiel, B. R., L. Green, y K. A. Calis, Clin. Pharm., 12: 488 (1993). D. Dilloo y col., en Blood 90: 1927-1933 (1997), describen un procedimiento usando células activadas por CD40L, para tratar la leucemia linfoblástica aguda B (ALL). Cocultivaron células de leucemia con fibroblastos infectados con un vector retroviral que codifica CD40L, después inyectaron la mezcla de células en ratones. Dicha estrategia, si se adopta en seres humanos, diferiría de la contemplada en este documento en el sentido de que las células terapéuticas se estimulan in vitro por otra línea celular que exprese el ligando de CD40 quimérico. Schultze, J. L. y col., en Blood 89: 3806-3816 (1997), describen un procedimiento para estimular T-TIL (células T infiltrantes de tumores) citotóxicas para células de linfoma folicular (FL) por exposición de las mimas, in vitro, a células B FL que se cultivaron previamente con fibroblastos que expresaban CD40L. Proponen una inmunoterapia adoptiva en la que T-TILS estimuladas de esta forma se transfunden a pacientes. Este procedimiento también requiere la estimulación in vitro de las células que se van a transfundir con otra línea celular que expresa una molécula accesoria.

Después de la introducción del gen, incluyendo cualquier etapa opcional para asegurar que el gen de ligando de molécula accesoria se ha introducido con éxito en esas células aisladas, las células aisladas se introducen en el paciente en un sitio específico o directamente en la circulación del paciente. En realizaciones preferidas de la presente invención, se usan marcadores de superficie celular, incluyendo moléculas tales como marcadores tumorales o antígenos para identificar las células, para aislar específicamente estas moléculas del paciente. Un especialista en la técnica entenderá que dichos procedimientos de aislamiento son bien conocidos e incluyen metodologías tales como separación de células activadas por fluorescencia (FACS), inmunoselección que implica una diversidad de formatos incluyendo selección, columnas y otros procedimientos similares.

La presente invención también contempla introducir el gen de ligando de molécula accesoria en las células deseadas en el interior del cuerpo de un paciente animal o humano sin retirar primero esas células del paciente. Se conocen bien procedimientos para introducir genes en células específicas in vivo o en el interior del cuerpo del paciente e incluyen el uso de vectores de terapia génica e inyección directa de diversas construcciones genéticas en el animal o paciente. Se han descrito ejemplos de procedimientos útiles por Danki, I. y J. A. Wolff, Vaccine, 12: 1499 (1994); Raz, E., A. Watanabe, S. M. Baird, R. A. Eisenberg, T. B. Parr, M. Lotz, T. J. Kipps, y D. A. Carson, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 4523 (1993); Davis, H. L., R. G. Whalen, y B. A. Demeneix, Hum. Gene Ther., 4: 151 (1993); Sugaya, S., K. Fujita, A. Kikuchi, H. Ueda, K. Takakuwa, S. Kodoma, y K. Tanaka, Hum. Gene Ther., 7: 223 (1996); Prentice, H., R. A. Kloner, Y. Li, L. Newman, y L. Kedes, J. Mol. Cell Cardiol., 28: 133 (1996); Soubrane, C., R. Mouawad, O. Rixe, V. Galvez, A. Ghoumari, O. Verola, M. Weil, y D. Khayat, Eur. J. Cancer, 32A: 691 (1996); Kass-Eisler, A., K. Li, y L. A. Leinwand, Ann. N. Y. Acad. Sci., 772: 232 (1995); DeMatteo, R. P., S. E. Raper, M. Ahn, K. J. Fisher, C. Burke, A. Radu, G. Widera, B. R. Claytor, C. F. Barker, y J. F. Markmann, Ann. Surg., 222-229 (1995); Addison, C. L., T. Braciak, R. Ralston, W. J. Muller, J. Gauldie, y F. L. Graham, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 92: 8522 (1995); Hengge, U. R., P. S. Walker, y J. C. Vogel, J. Clin. Invest., 97: 2911 (1996); Felgner, P. L., Y. J. Tsai, L. Sukhu, c. J. Wheeler, M. Manthorpe, J. Marshall, y S. H. Cheng, Ann. N. Y. Acad. Sci., 772: 126 (1995); y Furth, P. A., A. Shamay, y L. Hennighausen, Hybridoma, 14: 149 (1995). En una aplicación típica, un vector de terapia génica que contiene un gen de ligando de molécula accesoria se introduce en la circulación o en un sitio localizado del paciente para permitir que el vector de terapia génica infecte específicamente las células deseadas. En otras realizaciones preferidas, el vector de terapia génica se inyecta directamente en lecho tumoral presente en un animal que contiene al menos algunas de las células en las que se va a introducir el gen de ligando de molécula accesoria.

La presente invención también contempla la inyección directa de una composición farmacéutica que comprende ADN de una construcción genética de la presente invención que tiene un promotor y un gen de ligando de molécula accesoria seguido de una secuencia de poliadenilación en un paciente o animal. Se han descrito ejemplos de dichos procedimientos útiles por Vile, R. G. y I. R. Hart, Ann. Oncol., 5 Supl. 4: 59 (1994). La composición farmacéutica que comprende el ADN de la construcción genética de la presente invención se inyecta directamente en el músculo u otros sitios del animal o paciente o directamente en el lecho tumoral del animal o paciente. Como alternativa, una composición farmacéutica de la presente invención que comprende ADN de una construcción genética que contiene al menos un gen de ligando de molécula accesoria se usa y se inyecta directamente en el animal.

En realizaciones preferidas de la presente invención, la reacción o respuesta inmune de un paciente humano o animal se altera por introducción de una composición farmacéutica de la presente invención en células, incluyendo células humanas que tienen presente una molécula accesoria en la superficie celular. Dichas células incluyen células humanas, células presentadoras de antígeno humanas y opcionalmente estas células pueden ser células presentadoras de antígeno neoplásicas que tienen la capacidad de expresar la molécula accesoria en la superficie de la célula o células que son capaces de estimular. En algunas realizaciones, la cantidad de molécula accesoria presente en la superficie de las células en las que se va a introducir el gen de ligando de molécula CD40 quimérica es muy pequeña y dichas cantidades pequeñas del ligando de CD40 quimérico pueden ser el resultado de una regulación negativa de esa molécula accesoria en la superficie de dichas células. En algunas realizaciones, las células en las que se introduce el gen de ligando de CD40 quimérico tienen al menos bajos niveles de la molécula CD40 presentes en la superficie celular o proceden de células que expresaban la molécula de ligando de CD40 en la superficie celular pero han reducido o eliminado esa expresión.

Los procedimientos preferidos de alteración de la inmunorreactividad de una célula particular son aplicables a células de mamífero incluyendo células humanas. Estas células humanas pueden incluir células humanas neoplásicas tales como de linfomas, leucemias y otros tumores malignos humanos incluyendo cánceres de mama, pulmón y ovario. En algunas realizaciones preferidas, las células son células presentadoras de antígeno normales de un paciente humano tales como monocitos, macrófagos, células B, células de Langerhans, células interdigitantes, células dendríticas foliculares, células de Kupffer y otras células similares. En realizaciones preferidas, las células son linfocitos que adquieren una inmunorreactividad alterada cuando las moléculas accesorias de la presente invención se introducen en esas células. En otros realizaciones preferidas, las células pueden ser células neoplásicas o normales que son capaces de estimular células presentadoras de antígeno testigo cuando los genes de ligandos de moléculas accesorias de la presente invención se introducen esas células. La presente invención también contempla que células que de forma natural no son capaces de presentar antígenos al sistema inmune pueden modificarse por ingeniería genética para introducir los genes que codifican las moléculas necesarias para la presentación de antígenos, incluyendo genes que codifican una molécula de ligando de CD40 quimérica y por lo tanto permitir que esas células actúen como células presentadoras de antígeno artificiales. El gen de ligando de CD40 quimérico puede introducirse después en esas células presentadoras de antígeno artificiales. Se conocen bien diversos ensayos en la bibliografía para determinar si una célula particular es capaz de funcionar como una célula presentadora de antígeno, tales como la proliferación celular o la producción de linfoquinas y, por lo tanto, este aspecto de la presente invención puede determinarse fácilmente.

Además, de las células humanas normales anteriores, la presente invención también contempla introducir el gen de ligando de CD40 quimérico en diversas células neoplásicas o tumorales que opcionalmente son células presentadoras de antígeno. Dichas células neoplásicas humanas que se contemplan incluyen leucemias, linfomas, AML, AMML o CMML, CML, CLL y cualquier célula neoplásica que es capaz de estimular células presentadoras de antígeno testigo cuando se introduce un ligando de CD40 quimérico en esa célula. También se contemplan células neoplásicas tales como una célula de cáncer de mama, ovario o pulmón que es capaz de o que se modifica por ingeniería genética para actuar como una célula presentadora de antígeno. Sin embargo, la presente inmunomodulación también es aplicable a otros tumores malignos no identificados específicamente y, por lo tanto, incluiría cualquier tumor de cualquier célula capaz de presentar antígenos dentro del sistema inmune animal o humano o cualquier célula que es capaz de actuar como una célula presentadora de antígeno o capaz de estimular células presentadoras de antígeno testigo después de que se haya introducido un gen de ligando de molécula accesoria en esas células. Generalmente estas células presentadoras de antígeno tienen moléculas accesorias en la superficie de las células.

Los presentes procedimientos de alteración de la inmunorreactividad de una célula humana o animal contemplan la introducción de un gen de ligando de CD40 quimérico de la presente invención a las células para las que se desea una inmunorreactividad alterada. Los genes útiles en la presente invención incluyen los genes de ligandos de CD40 quiméricos a los que se ha referencia en las reivindicaciones. En realizaciones particularmente preferidas, el gen de ligando de CD40 quimérico introducido en las células usando los procedimientos de la presente invención se selecciona para concordar con la molécula accesoria presente en la superficie de las células para las que se desea una inmunorreactividad alterada. En una aplicación particular de la presente invención, se conseguirá la inmunorreactividad de una célula que expresa una molécula de CD40 en la superficie celular por introducción del gen que codifica la molécula de ligando de CD40 quimérica de la presente invención.

La presente invención también contempla alterar la inmunorreactividad de células humanas o animales por introducción de un gen de ligando de molécula accesoria que es un gen de ligando de molécula accesoria quimérico en la célula. Los diversos genes de ligandos de moléculas accesorias quiméricos útiles se han identificado anteriormente y podrían incluir una amplia diversidad de moléculas y permitir que se utilizasen las propiedades únicas de esos genes de ligandos de moléculas accesorias quiméricos para alterar la inmunorreactividad de las células diana. También se describen genes de ligandos de moléculas accesorias quiméricos útiles que son genes que codifican al menos una porción del ligando de molécula accesoria que es capaz de unirse a la molécula accesoria presente en la superficie de las células para las que se desea una inmunorreactividad alterada.

Los procedimientos de la presente invención para alterar la inmunorreactividad contemplan el uso de vectores genéticos y construcciones genéticas que incluyen vectores de terapia génica que codifican un ligando de CD40 quimérico y, por lo tanto, contienen un gen de ligando de CD40 quimérico. Típicamente, los vectores genéticos y construcciones genéticas que incluyen los vectores de terapia génica de la presente invención tienen un promotor que está unido operativamente al gen de ligando de CD40 quimérico seguido de una secuencia de poliadenilación. En otras realizaciones, el único requerimiento es que los vectores genéticos, construcciones genéticas y vectores de terapia génica de la presente invención contengan el gen de ligando de CD40 quimérico.

V. Procedimientos de tratamiento de neoplasias

La presente invención también contempla el uso de un gen de ligando de CD40 quimérico o un vector de la presente invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una neoplasia que comprende insertar en una célula neoplásica humana un gen que codifica un ligando de CD40 quimérico de modo que el ligando de CD40 quimérico se expresa en la superficie de las células neoplásicas. La presente invención contempla tratar una neoplasia humana tanto in vivo como ex vivo y por inyección directa de diversas moléculas de ADN que contienen un gen que codifica un ligando de CD40 quimérico en el paciente. Sin embargo, como mínimo, los usos de la presente invención para tratar una neoplasia humana implica insertar el gen que codifica el ligando de molécula accesoria en las células neoplásicas de tal forma que permita a esas células neoplásicas expresar el ligando de CD40 quimérico en la superficie celular. La expresión del gen de ligando de CD40 quimérico en estas células neoplásicas modula el sistema inmune para provocar que la neoplasia se reduzca o elimine.

En un procedimiento preferido de tratamiento de una neoplasia humana, el procedimiento comprende además las etapas de obtener primero las células neoplásicas humanas a partir de un paciente humano y después insertar en las células neoplásicas humanas aisladas un gen que codifique un ligando de CD40 quimérico de modo que se exprese el ligando de CD40 quimérico en la superficie de las células neoplásicas. Las células neoplásicas humanas que tienen el ligando de CD40 quimérico en la superficie de esa célula se infunden después de nuevo en el paciente humano. Un especialista en la técnica entenderá que numerosos procedimientos son aplicables para infundir las células neoplásicas humanas alteradas que contienen el gen que codifica el ligando de CD40 quimérico de nuevo en el paciente y que esos procedimientos son bien conocidos en la técnica.

Los procedimientos contemplados de tratamiento de una neoplasia humana son aplicables a una amplia diversidad de neoplasias humanas incluyendo linfomas, leucemias y otros tumores malignos. En realizaciones preferidas, la neoplasia humana es una neoplasia que implica a las células presentadoras de antígeno del sistema inmune humano e incluye monocitos, macrófagos, células B, células de Langerhans, células interdigitantes, células dendríticas foliculares, células de Kupffer y similares. En otras realizaciones preferidas, la neoplasia humana es una leucemia, un linfoma, AML, AMML, CMML, CML o CLL, cáncer pulmonar, cáncer de mama, cáncer ovárico y otras neoplasias similares.

Los vectores genéticos, construcciones genéticas y vectores de terapia génica útiles en los procedimientos de tratamiento de una neoplasia humana de la presente invención se han descrito anteriormente e incluyen construcciones en las que un promotor está unido operativamente al gen de ligando de CD40 quimérico, que a su vez está unido operativamente a una secuencia de poliadenilación. Los procedimientos de tratamiento de una neoplasia humana contemplan el uso de construcciones genéticas, vectores genéticos y vectores de terapia génica como se describe en esta memoria descriptiva. Además, la presente invención contempla el uso de una composición farmacéutica de la presente invención que comprende ADN que contiene al menos un gen que codifica un gen de ligando de CD40 quimérico. Este gen puede o no contener un promotor y otras secuencias reguladoras.

En realizaciones preferidas de la presente invención, las células que comprenden la neoplasia humana se localizan en al menos un sitio definido denominado lecho tumoral dentro del paciente humano. Este lecho tumoral contiene típicamente la célula tumoral o neoplásica junto con varias otras células que están asociadas con las células tumorales o neoplásicas. La presente invención contempla una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 12 que puede usarse para tratar dicha neoplasia humana presente en un lecho tumoral por inyección en el lecho tumoral del paciente de un gen que codifica un ligando de CD40 quimérico, de modo que se exprese el ligando de CD40 quimérico en la superficie de las células tumorales causando de este modo que las células participen en una reacción inmune. El gen que codifica el ligando de CD40 quimérico puede estar presente como parte de un vector de terapia génica, construcción genética o vector genético.

En realizaciones preferidas, se usa un gen de ligando de CD40 quimérico de acuerdo con las reivindicaciones 1-5. En otras realizaciones preferidas, el ligando de CD40 quimérico codificado es capaz de unirse a una molécula accesoria presente en la neoplasia humana que se va a tratar.

Los diversos vectores de terapia génica usados en los procedimientos de tratamiento de la presente invención incluyen vectores que son capaces de infectar directamente células humanas. Dichos vectores se han descrito en la bibliografía y son fácilmente adaptables a los procedimientos descritos en la presente invención.

La composición farmacéutica de la presente invención contempla el uso de cualquier tipo de terapia génica incluyendo los procedimientos de Raper, S. E. y col., Ann. Surg., 223: 116 (1996); Lu, L. y col., Crit. Rev. Oncol. Hematol., 22: 61 (1996); Koc, O. N. y col., Semin. Oncol., 23: 46 (1996); Fisher, L. J. y col., Curr. Opin. Neurobiol., 4: 735 (1994); Goldspiel, B. R. y col., Clin. Pharm., 12: 488 (1993); Danko, I. y col., Vaccine, 12: 1499 (1994); Raz, E. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 4523 (1993); Davis, H. L. y col., Hum. Gene Ther., 4: 151 (1993); Sugaya, S. y col., Hum. Gene Ther., 7: 223 (1996); Prentice, H. y col., J. Mol. Cell Cardiol., 28: 133 (1996); Soubrane, C. y col., Eur. J. Cancer, 32A: 691 (1996); Kass-Eisler, A. y col., ann. N. Y. Acad. Sci., 772: 232 (1995); DeMatteo, R. P. y col., Ann Surg., 222: 229 (1995); Addison, C. L. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 92: 8522 (1995); Hengge, U. R. y col., J. Clin. Invest., 97: 2911 (1996); Felgner, P. L. y col., Ann. N. Y. Acad. Sci., 772: 126 (1995); Furth, P. A., Hybridoma, 14: 149 (1995); Yovandich, J. y col., Hum. Gene Ther., 6: 603 (1995); Evans, C. H. y col., Hum. Gene Ther., 7: 1261.

VI. Procedimientos de vacunación

La presente invención contempla procedimientos en los que la composición farmacéutica de la presente invención puede usarse para la vacunación de un animal contra un organismo predeterminado que comprende administrar a ese animal una vacuna que contiene antígenos animales inmunogénicos capaces de causar una respuesta inmune en ese animal contra el organismo deseado junto con un vector que contiene un gen que codifica un ligando de CD40 quimérico. La presente invención también contempla procedimientos de vacunación de un animal que incluyen administrar los genes que codifican el antígeno inmunogénico capaz de causar una respuesta inmune deseada o alterar la respuesta inmune contra un antígeno particular junto con un vector que contiene un gen que incluye el gen de ligando de CD40 quimérico. En esta realización particular, el vector o vectores introducidos codifican los antígenos inmunogénicos deseados y el ligando de CD40 quimérico deseado. La presente invención también contempla que el gen o genes que codifican el péptido o péptidos inmunogénicos pueden estar presentes en el mismo vector que el gen o genes que codifican el ligando de CD40 quimérico.

Los procedimientos de vacunación son generales en el sentido de que pueden usarse para producir una vacunación contra cualquier organismo predeterminado, tal como un virus, una bacteria, un hongo u otro organismo. Además, los presentes procedimientos de vacunación pueden usarse para producir una respuesta inmune contra una célula neoplásica.

En otras realizaciones preferidas, la composición farmacéutica de la presente invención que pude usarse para la vacunación utiliza un vector genético, una construcción genética o un vector de terapia génica que contiene un gen de ligando de CD40 quimérico de la presente invención. En otras realizaciones preferidas, la composición farmacéutica de la presente invención que puede usarse para la vacunación utiliza una molécula de ADN que codifica un gen de ligando de CD40 quimérico de la presente invención. Este ADN particular puede o no incluir una secuencia promotora que dirige la expresión del gen de ligando de CD40 quimérico.

La presente invención también contempla que esa composición farmacéutica de la presente invención que puede usarse para la vacunación puede utilizar un vector genético que es capaz de expresar un ligando de CD40 quimérico dentro de una célula u organismo particular junto con un vector que es capaz de expresar al menos un solo polipéptido de un andovirus. Este polipéptido de andovirus puede expresarse a partir del mismo o de un vector diferente que exprese el ligando de molécula accesoria en esa célula. En esta realización particular, el polipéptido de andovirus también se expresa en al menos un tipo celular dentro del organismo y sirve para modular la respuesta inmune que se encuentra en respuesta a este protocolo de vacunación.

La presente invención también contempla la composición farmacéutica de la presente invención para introducción de un gen de ligando de CD40 quimérico en células que están presentes en las articulaciones de pacientes con artritis reumatoide. También se describe que un gen de ligando de molécula accesoria introducido comprende al menos una porción del gen de ligando de Fas y que tras la expresión el ligando accesorio induce la muerte celular de células que expresan Fas en la superficie celular. Este procedimiento conduce a la reducción del procedimiento inflamatorio destructor.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar diversos aspectos de la presente invención y no limitan el alcance de esa invención.

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VII. Procedimientos de tratamiento de artritis

La presente invención también contempla una composición farmacéutica que puede usarse para el tratamiento de la artritis que comprende insertar en una articulación células que se han transformado con un ligando de CD40 quimérico. En realizaciones preferidas, la expresión de ese ligando de CD40 quimérico o la estabilidad de esa molécula en la superficie de las células se ha alterado. En estas realizaciones preferidas, las funciones de ligando de CD40 quimérico de una forma potenciada ayudan en el tratamiento de la artritis dentro de la articulación. La presente invención contempla una composición farmacéutica que puede usarse para tratar la artritis humana tanto in vivo, ex vivo, como por inyección directa de diversas moléculas de ADN que contienen genes que codifican el ligando de CD40 quimérico útil de la presente invención en los pacientes. Pueden diseñarse diversos protocolos útiles para la artritis reumatoide incluyendo los descritos en la sección de ejemplos a continuación.

La presente invención contempla una composición farmacéutica que puede usarse para el tratamiento de la artritis que utiliza genes de ligandos de CD40 quiméricos de la presente invención. Los ligandos de CD40 quiméricos resultantes tienen una estabilidad alterada en la superficie de células en las que se expresan. Esta estabilidad alterada modula la función del sistema inmune en el entorno local alrededor de las células en las que se expresan estos ligandos de CD40 quiméricos. También se describe en este documento que la estabilidad del ligando de Fas se altera en la superficie de células dentro de una articulación de un paciente que padece artritis. Esta estabilidad alterada modula el sistema inmune y provoca que las células se dirijan a apoptosis y reduciendo por lo tanto la respuesta inmune dentro de la articulación inflamada. Los genes de ligandos de moléculas accesorias descritos en su interior se alteran de modo que el ligando de molécula accesoria resultante tiene una estabilidad alterada y causa un efecto inmunomodulador que puede ser útil en el tratamiento de la artritis.

Se describe en este documento que pueden utilizarse en el tratamiento de la artritis genes de ligandos de moléculas accesorias quiméricos. Estos genes de ligandos de moléculas accesorias quiméricos contienen preferiblemente al menos una porción del Dominio IV del gen de ligando de Fas que lleva el efecto o la función para el ligando de Fas. En realizaciones preferidas, al menos está presente una porción de ese dominio que permite que el ligando de Fas tenga sus efectos biológicos. También se describe que esos ligandos contienen dominios de otros genes de ligandos de moléculas accesorias o de un dominio diferente del mimo ligando de molécula accesoria. Son particularmente preferidos genes de ligandos de moléculas accesorias quiméricos de Fas compuestos por el Dominio IV del ligando de Fas humano unido operativamente con el Dominio III del ligando de Fas de ratón. Esta combinación particular da como resultado un ligando de Fas más estable y, por lo tanto, por sustitución del Dominio III del ligando de Fas humano con el Dominio III del ligando de ratón se altera la actividad del gen de ligando de Fas humano.

Como alternativa, el gen de ligando de Fas murino se usa para codificar el ligando de Fas murino en la superficie de células en lugar del ligando de Fas humano. El ligando de Fas murino es más estable que el ligando de Fas humano y por lo tanto altera la actividad de ligando de Fas en la articulación. La actividad del ligando de Fas alterada resultante es útil en el tratamiento de la artritis reumatoide.

Se describe adicionalmente que el efecto o la función presentes en el Dominio IV del ligando de Fas humano se combina con otros dominios de otros ligandos de moléculas accesorias. Por ejemplo, el Domino III de CD70 es más estable que el Dominio III del ligando de Fas humano y por lo tanto el ligando de molécula accesoria quimérica compuesto por el Dominio III del CD70 humano y el Dominio IV del ligando de Fas junto con otros dominios secundarios sería más estable. La estabilidad aumentada conduce a aumentar la actividad del ligando de Fas. También se describe que el Dominio III del ligando de Fas se sustituye con múltiples copias de un dominio o dominios. Dichas múltiples copias de dominios incluyen dominios compuestos por dos o más copias de otros dominios tales como Dominios III o I de la molécula CD70.

También se describen genes de ligandos de moléculas accesorias tales como genes de ligandos de Fas en los que se ha eliminado un sitio de escisión para metaloproteinasa de la matriz (MMP) del ligando de molécula accesoria. Los sitios de escisión y reconocimiento de MMP, representados gráficamente en la Figura 28, se analizan en Smith, M. M. y col., Journal of Biol. Chem. 270: 6440-6449 (95) y Nagase, H., y G. B. Fields, Biopolymers (Peptide Science) 40: 399-416 (96). También se describe que al menos un sitio MMP se ha eliminado de al menos el Dominio III del gen de ligando de Fas. La eliminación del sitio MMP del gen de ligando de Fas hace que el ligando de Fas sea más estable y por lo tanto más eficaz en el tratamiento de la artritis.

Se describen adicionalmente genes de ligandos de moléculas accesorias quiméricos que están compuestos por porciones del gen de ligando de Fas humano con otros dominios de otros ligandos de moléculas accesorias humanas o dominios de moléculas accesorias procedentes de otras especies. Por ejemplo, se describe el uso de dominios del ligando de CD40, ligando de CD70, ligando de CD30, ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL), TNF-\alpha así como mutantes de ligando de Fas humano y ligando de Fas murino. La producción de dichos ligandos de moléculas accesorias quiméricos se consigue fácilmente por manipulación y producción de genes de ligandos de moléculas accesorias que son quiméricos y, por lo tanto, tienen porciones procedentes de al menos dos genes de ligandos de moléculas accesorias diferentes.

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Ejemplos 1. Expresión de Ligando de Molécula Accesoria Humano y de Ratón en Células CLL Humanas a. Construcción de una Construcción Genética y Vector de Terapia Génica que Contiene un Gen de Ligando de Molécula Accesoria Humana y de Ratón

El gen de ligando de molécula accesoria humano (ligando de CD40 humano) o el gen de ligando de molécula accesoria murino (ligando de CD40 murino) se construyeron utilizando los genes humanos y murinos respectivos. Cada uno de estos genes se clonó de la siguiente forma.

i. Clonación de CD40-L murino

Se aisló el ARN total usando el kit RNA STAT-60 (Tel-Test "B" Inc., Friendswood, TX) a partir de 1 x 10^{7} esplenocitos de ratón B6 que se activaron previamente durante 8 horas con mAb específico de CD3 inmovilizado. Después, se sintetizó ADNc con el kit de síntesis de ADNc Superscript (Gibco BRL, Grand Island, NY) usando cebadores oligo-dT. Después, el gen de ligando de CD40 murino (mCD40-L) se amplificó a partir del ADNc por PCR usando los siguientes cebadores específicos de mCD40-L. 5'-GT-TAAGCTTTTCAGTCAGCATGATAGAA (SEC ID Nº: 26), 5'-GTTTCTAGATCAGAGTTTGAGTAAGCC (SEC ID Nº: 27). El producto de PCR de mCD40-L amplificado se subclonó en los sitios HindIII y Xbal del vector de expresión eucariota pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA). Un fragmento de ADN que incluía el promotor de CMV, gen de mCD40-L y una señal de poliadenilación se liberó de esta construcción plasmídica después de la digestión de restricción con enzimas Bg1II y XhoI. Después este fragmento de ADN se subclonó en el plásmido lanzadera MCS(SK)pXCX2 (Spessot R, 1989, Virology 168: 378) que se designó mCD40-L pXCX2. Este plásmido se usó para producción de adenovirus como se describe a continuación.

ii. Clonación de CD40-L Humano

Se usó un plásmido que contenía el gen de CD40-L humano para producir el gen de CD40-L humano usado en este documento. La secuencia de este gen está disponible y por lo tanto se usó esta fuente del gen simplemente por comodidad. Véase el Nº de Acceso de GenBank X67878. Se usó este plásmido para amplificación por PCR del gen de CD40-L humano usando los cebadores específicos, cebador con sentido 5' CCAAGACTAGTTAACACAGCATGATCGAAA 3' (SEC ID Nº: 28) y cebador anti-sentido 5' CCAATGCGGCCGCACTCAGAATTCAACCTG 3' (SEC ID Nº: 29).

Estos cebadores contienen sitios de enzimas de restricción flanqueantes para subclonación en el plásmido de expresión eucariota pRc/CMV (Invitrogen). El fragmento de CD40-L amplificado por PCR se subclonó en los sitios SpeI y NotI de pRc/CMV y se designó hCD40-L pRc/CMV. Un fragmento de BglII y XhoI que incluía el promotor CMV, gen de hCD40-L y señal de poliadenilación se liberó después de este plásmido y se subclonó en el plásmido lanzadera MCS(SK)pXCX2 como se ha descrito anteriormente. Este plásmido se designó hCD40-L pXCX2. Se usó este plásmido para producción de adenovirus como se describe a continuación.

iii. Síntesis de Adenovirus

Cualquiera de los plásmidos mCD40-L pXCX2 o hCD40-L pXCX2 se co-transfectaron con pJM17 (Graham y Prevec, 1991, Methods in Molecular Biology, Vol 7) en células 293 (Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, MD) usando el método de fosfato de calcio (Sambrook, Fritsch y Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, capítulo 16: 33-34). Se escogieron placas de adenovirus aisladas y se expandieron infectando de nuevo células 293. Se obtuvieron preparaciones de adenovirus de título alto como se ha descrito (Graham y Prevec, 1991, Methods in Molecular Biology, Vol 7), excepto por las siguientes modificaciones. El gradiente de cloruro de cesio usado para concentrar partículas virales era un gradiente por etapas, con densidades de 1,45 g/cm^{3} y 1,2 g/cm^{3}. Las muestras se centrifugaron en un rotor SW41 (Beckman, Brea, CA) a 25.000 rpm a 4ºC. La banda viral se desalinizó usando una columna de calidad de ADN Sephadex G25 (Pharmacia, Piscat-away, NJ). El virus aislado se almacenó a 70ºC en solución salina tamponada con fosfato con glicerol al 10%. El título de virus se determinó por infección de células 293 con diluciones seriadas del adenovirus purificado y recuento del número de placas formadas. Los títulos virales variaban típicamente de 10^{10} a 10^{12} unidades formadoras de placas/ml (UFP/ml).

b. Introducción de un Gen de Ligando de Molécula Accesoria Murino y Humano en Células CLL y Células HeLa

Para infección con adenovirus, se suspendieron 10^{6} células CLL o células HeLa recién descongeladas y lavadas en de 0,5 a 1 ml de medio de cultivo para el cultivo a 37ºC en un incubador de CO_{2} al 5% en aire. Se añadió adenovirus a las células a una multiplicidad de infección variable (MOI) y las células infectadas se cultivaron durante 48 horas, a menos que se indique otra cosa, antes de analizarse para expresión del transgen.

c. Expresión de un Gen de Ligando de Molécula Accesoria en Células CLL y Células HeLa

Las células CLL y HeLa que se infectaron con el vector de adenovirus que contenía genes de ligando de CD40 de ratón o humanos preparados en el Ejemplo 1b, se tiñeron después con anticuerpos monoclonales inmunoespecíficos para ligando de CD40 humano o de ratón disponibles en el mercado (Pharmingen, San Diego, CA) usando las instrucciones del fabricante. Las células CLL y HeLa se lavaron en medio de tinción (SM) constituido por RPMI-1640, suero fetal de ternera al 3% y azida sódico al 0,05% y que contenía yoduro de propidio y después se analizó en un FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA). Se excluyeron las células muertas y residuos del análisis por perfiles de dispersión de luz frontal y lateral característicos y tinción con yoduro de propidio. Se midió la expresión de antígeno superficial como la proporción de intensidad de fluorescencia media (MFIR). La MFIR equivale a la intensidad de fluorescencia media (MFI) de células teñidas con un MoAb conjugado con FITC específico, dividida por la MFI de células teñidas con una IgG-FITC de control. Este procedimiento controla los aumentos inespecíficos en la autofluorescencia que se observan en células de mayor tamaño más activadas.

Los histogramas, generados para las células CLL y células HeLa que contenían un vector genético que contenía el gen de ligando de CD40 humano o el gen de ligando de CD40 murino y los controles apropiados, se muestran en las Figuras 3A-3D. La expresión tanto del gen de ligando de molécula accesoria murino como humano (ligando de CD40) en células HeLa se muestra en las Figuras 3A y 3B, respectivamente. La expresión del ligando de molécula accesoria murino y humano en células CLL se muestra en las Figuras 3C y 3D. La expresión de un gen de ligando de molécula accesoria en células CLL y la expresión del ligando de CD40 murino en la superficie de las células CLL se muestra en la Figura 3C. El fracaso en la expresión del ligando de molécula accesoria humano en la superficie de las células CLL se muestra en la Figura 3D.

La Figura 8 muestra datos de un experimento realizado para examinar si las células T CD4^{+} de pacientes con CLL podía inducirse para expresar el ARNm del ligando de molécula accesoria después del ligación de CD3. Se usó RT-PCR competitiva cuantitativa basada en ELISA para medir los niveles de transcripción del ligando de CD40. En este experimento, el ligando de CD40 y el ARN transcrito a partir del gen de ligando de CD40 en células CLL se compararon con niveles de ligando de CD40 y ARN generados en células de donante normal, después de la inducción por ligación de CD3. Para la activación de CD3, se prepararon revestimientos de placas de mAb de CD3 y se incubaron con CLL sembradas en placas o células mononucleares de donante normal durante la cantidad de tiempo indicada, después de lo cual se analizaron las células para la expresión de antígenos superficiales o niveles de ARN mensajero de CD154. Se añadió suero de CLL o donante normal a las células al comienzo del ensayo de activación para el examen de la modulación de la expresión superficial de ligando de CD40.

Para RT-PCR ELISA de CD154 cuantitativo, se extrajo el ARN total y se generó ARN competidor a partir del inserto que contiene ADNc de ligando de CD40 (CD154). Se añadieron cantidades variables de ARN competidor a pocillos separados de ARN total aislado que posteriormente se convirtió en ADNc. Se realizaron activación de CD3, reacciones de ELISA y PCR como se describe en Cantwell, M. y col., Nature Medicine 3: 984-989 (1997). Se capturaron productos de PCR biotinilados sobre placas de microtitulación (Becton Dickinson, Oxnard, CA) revestidas con estreptavidina (Sigma) y se incubaron. La placa se trató con NaOH para eliminar las cadenas sentido y posteriormente se lavó. Después el ADN se hibridó con oligonucleótidos de tipo silvestre específicos para gen o específicos para competidor. Usando transferasa terminal, cada sonda se marcó con una molécula de digoxigenina-11-dideoxiUTP (Boehringer Mannheim). La placa se incubó y se lavó con tampón HYBE y tampón de bloqueo, después se añadió anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con peroxidasa (150 U/ml; Boehringer Mannheim) en tampón de bloqueo. Se añadieron TMB (tetrametilbenzidina) y peroxidasa (Kirkegaard y Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) para el desarrollo del color y se midieron las densidades ópticas a 450 nm y se usó Deltasoft II (Biometallics, Princeton, NJ) para análisis de datos.

Se realizaron curvas patrón que representaban los moles de producto de ARN frente a la densidad óptica para las reacciones de ADNc convencionales. Las ecuaciones que describen estas curvas patrón se usaron después para calcular los moles de ADN de tipo silvestre o competidor presente en las reacciones de PCR desconocidas basándose en las densidades ópticas obtenidas en las lecturas de ELISA. La proporción de la cantidad de ADN de tipo silvestre con respecto a la cantidad de ADN competidor se representó después frente a la cantidad conocida de ARN competidor añadida en las muestras iniciales. Se tomó la proporción de 1 para la extrapolación de la cantidad de moles desconocidos de ARN diana en la muestra (una proporción de 1 significa que la cantidad de ARN diana frente al ARN competidor es igual). Las moléculas de ARN diana por célula CD4 se calcularon después basándose en la siguiente fórmula: [(moles de ARN de CD154 diana) x (6 X 10^{23} moléculas/mol) x (factor de dilución de ARN de ensayo)]/(% de células T CD4 en una población total de células).

La gráfica superior en la Figura 8 muestra que las células T de pacientes con CLL no expresan ligando de CD40 detectable después de la ligación de CD3. Se produce ARN de ligando de CD40, pero no es estable. Aunque tanto el ligando de CD40 como el ARN de ligando CD40 se expresa en células T de donante normal (gráfica inferior), los niveles de ninguna de las proteínas o ARN se mantienen de forma estable.

La Figura 9 muestra un curso de tiempo para expresión superficial de ligando de CD40. La expresión alcanzaba un nivel máximo a 48 horas después de la infección y persistía a niveles altos durante al menos 6 días a partir de entonces. En este experimento, se infectaron células B CLL con un vector de terapia génica que contenía un ligando de molécula accesoria, a una MOI de 1000 a tiempo cero y después se evaluaron mediante citometría de flujo en diversos momentos a partir de entonces. En cada punto de tiempo enumerado en el eje de abscisas, las proporciones de células B CLL viables que expresaban CD154 detectable se indican mediante las barras verticales que se corresponden con la escala de porcentaje representada en el eje de ordenadas a la derecha.

d. Función de los Ligandos de Moléculas Accesorias Humanos y Murinos i. Inducción de CD80 y CD54 en Células que Contienen un Vector de Terapia Génica que Codifica una Molécula Accesoria

Las células CLL infectadas con el gen de ligando de molécula accesoria murino preparadas en el Ejemplo 1b, se cultivaron después en placas de cultivo de tejidos. Después las células CLL se analizaron usando análisis de FACS multiparámetro para detectar la inducción de expresión de CD80 y CD54 usando anticuerpos monoclonales conjugados con isotiocianato de fluoresceína inmunoespecíficos para cada uno de estos antígenos superficiales respectivos. Se usaron células CLL sin infectar como control. Las células se sometieron al análisis de FACS apropiado y se generaron histogramas. Se obtuvo mAb de CD80 de Dr. Edward Clark y se adquirió mAb de CD54 en CALTAG Inc. El CD80 se conjugó usando procedimientos convencionales que se han descrito en Kipps y col., Laboratory Immunology II, 12: 237-275 (1992).

Los resultados de este análisis se muestran en la Figura 4A-4D. Las Figuras 4A-4B comparan la cantidad de expresión de CD54 en células CLL que no se han transfectado (Figura 4A) o células CLL en las que se ha introducido un vector de terapia génica que contenía el gen de ligando de CD40 murino (Figura 4B). La gráfica sombreada indica el control de isotipo para tinción de FACS y la gráfica blanca indica las células teñidas con el anticuerpo anti-CD54. Estos resultados muestran que el nivel de expresión de CD54 aumenta en células CLL en las que se ha introducido el vector de terapia génica que contenía el ligando de CD40 murino.

Las Figuras 4C y 4D comparan la cantidad de expresión de CD80 en células CLL que no se han transfectado (Figura 4C) o células CLL en las que se ha introducido un vector de terapia génica que contenía el gen de ligando de CD40 murino (Figura 4D). La gráfica sombreada indica el control de isotipo para tinción de FACS y la gráfica blanca indica las células teñidas con el anticuerpo anti-CD80. Estos resultados muestran que el nivel de expresión de CD80 aumenta en las células CLL en las que se ha introducido el vector de terapia génica que contenía el ligando de CD40 murino.

En un experimento adicional, se evaluaron células CLL infectadas con un vector de terapia génica que contenía el gen de ligando de molécula accesoria murino mediante citometría de flujo para expresión inducida no solamente de CD54 y CD80, sino también de CD86, CD58, CD70 y CD95. Se adquirieron mAb conjugados con fluoresceína específicos para CD54 y CD70 humanos en CALTAG. Se obtuvieron mAb conjugados con fluoresceína específicos para CD27, CD58, CD80, CD86 o CD95 humanos y mAb conjugado con ficoeritrina específico para ligando de CD40 humano o de ratón en PharMingen. Los histogramas sombreados representan tinción de células B CLL con mAb inespecífico de isotipo conjugado con FITC. Al contrario que células CLL sin infectar (Figure 10, histogramas de línea fina), o células CLL infectadas con Ad-lacZ (datos similares a los obtenidos con células sin infectar, pero no se muestran), las células CLL infectadas con el vector de adenovirus que codifica el ligando de CD40 (CD154) expresaban altos niveles de CD54 (Figura 10, izquierda superior), CD80 (Figura 10, mitad superior), CD86 (Figura 10, derecha superior), CD58 (Figura 10, izquierda inferior), CD70 (Figura 10, mitad inferior) y CD95 (Figura 10, derecha inferior). Por otro lado, las CLL con ligando de CD40 (CD154 CLL) expresaban niveles significativamente más bajos tanto de CD27 de membrana superficial (Figura 11A, histograma de línea gruesa) como de CD27 soluble (Figura 11B) que células CLL sin infectar (Figura 11A, histograma de línea fina) (P < 0,01, prueba t de Bonferroni) o infectadas con Ad-lacZ (datos similares a los obtenidos con células sin infectar, pero no se muestran). En el experimento que se muestra en la Figura 11A, las células B CLL se examinaron para determinar la expresión de CD27 mediante citometría de flujo, tres días después de la infección. Los histogramas sombreados representan la tinción de células B CLL con mAb de control de isotipo conjugado con FITC. En la Figura 11B, se recogieron sobrenadantes sin células después de la infección o estimulación de células B CLL durante 72 horas y se ensayaron para determinar la concentración de CD27 humano mediante ELISA. La expresión reducida de CD27 (Figura 11B) es similar a la observada para células B de leucemia estimuladas mediante entrecruzamiento de CD40 con mAb G28-5 presentado por células L que expresan CD32, como se describe en Rassenti, L.Z. y T.J. Kipps, J. Exp. Med. 185: 1435-1445.

ii. Respuestas de Células T Alogénicas a Células CLL en las que se ha Introducido un Vector de Terapia Génica que Contiene un Gen de Ligando de CD40 Murino

La capacidad de células CLL que se han infectado con un vector de terapia génica que contiene el gen de ligando de CD40 murino para estimular células T alogénicas (es decir, de otro individuo) se analizó usando ensayos de proliferación celular. En resumen, las células de ensayo se cocultivaron con el vector de terapia génica que contenía el gen lac-Z o el gen de ligando de CD40 murino a una multiplicidad de infección de 1.000 en presencia de IL-4 a una concentración de 10 ng/ml. En otras muestras, las células CLL se estimularon con MOPC21 (una IgG de control) o G28-5 (un anticuerpo monoclonal anti-CD40) o se preincubaron en células CD32-L y al mismo tiempo se trataron con IL-4. La preincubación con las células CD32-L junto con el tratamiento con IL-4 ha demostrado ser una forma eficaz de entrecruzar la molécula CD40 distinta de la transfección génica directa.

Después de tres días de cultivo a 37ºC, estas células se trataron con mitomicina C para impedir su proliferación y después se usaron para estimular células T alogénicas. Antes de este cocultivo, las diferentes alícuotas de células CLL que se habían tratado con el anticuerpo monoclonal anti-CD40 o que se habían infectado con el vector de terapia génica que contiene el gen lac-Z o de ligando de CD40 murino a una proporción de estimulación de 1:10. Después de dos días de cultivo a 37ºC, se midió la producción de interferón gamma (IFNg) mediante ensayo de ELISA. Después de cinco días de cocultivo a 37ºC, se midió la incorporación de ^{3}H-timidina en células en replicación después de un marcaje por pulsos de ocho horas. Los resultados de este ensayo se muestran en la Tabla 2 a continuación y en la Figura 5.

En otro experimento, se evaluaron células B CLL infectadas con el vector de terapia génica que contiene el gen de ligando de CD40 para determinar su capacidad para actuar como células estimuladoras en una reacción de células T lifocíticas mixtas alogénicas (MLTR). En paralelo, también se examinó la capacidad estimuladora de células CLL infectadas con vector lac-Z de control y células B CLL que se habían cultivado con células CD32-L y un mAb anti-CD40 (G28-5) o una Ig de control de isotipo, como se describe en Ranheim, E.A. y T.J. Kipps, J. Exp. Med., 177: 925-935 (1993), Clark, E.A. y J.A. Ledbetter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 4494-4498 (1986), y Banchereau, J. y col., Science 251: 70-72 (1991). Se cocultivaron células T efectoras de un donante no relacionado con las células estimuladoras CLL a una proporción de efector con respecto a diana de 4:1. Después de 18 h de cultivo a 37ºC, se descubrió que más del 30% de las células CD3^{+} alogénicas expresaban el antígeno asociado con activación CD69 cuando se cultivaban con células CD154-CLL (no se muestran los datos). Por el contrario, menos del 4% de las células T expresaban CD69 cuando se cocultivaban con células CLL sin infectar o infectadas con Ad-lacZ (no se muestran los datos).

Dos días después del inicio de la MLTR, las concentraciones de IFNg en los sobrenadantes de cultivo se ensayaron mediante ELISA. Los sobrenadantes de la MLTR estimulados con células CLL infectadas con el ligando de molécula accesoria CD40L (Figura 12A, CD154-CLL) contenían niveles significativamente superiores de IFNg (306 \pm 5 ng/ml, m \pm ET, n = 3) que los de cultivos de MLTR estimulados con el mAb anti-CD40 (Figura 12A, aCD40-CLL) (23 \pm 3 ng/ml) (P < 0,05, prueba t de Bonferroni). Éste último no era significativamente diferente del de cultivos de MLTR estimulados con células CLL infectadas con Ad-lacZ de control (Figura 12A, lacZ-CLL) (43 \pm 10 ng/ml) (P > 0,1, prueba t de Bonferroni). Los sobrenadantes de células efectoras en solitario o de cultivos de MLTR estimulados con células CLL sin infectar (Figura 12A, CLL) o células CLL tratadas con Ig de control (Figura 12A, MOPC-CLL), no contenían cantidades detectables de IFNg (<2 ng/ml). De forma similar, ninguna de las poblaciones de células B de leucemia producían cantidades detectables de IFNg cuando se cultivaban en solitario, sin células T efectoras añadidas (no se muestran los datos).

Después de 5 días, se evaluó la proliferación celular por incorporación de ^{3}H-timidina. Los cultivos con células estimuladoras tratadas con IgG de control de isotipo (Figura 12B, MOPC-CLL) o sin infectar (Figura 12B, CLL) no incorporaban más ^{3}H-timidina que cultivos sin células estimuladoras de leucemia añadidas (Figura 12B, Ninguna). Las células B CLL infectadas con Ad-lacZ (Figura 12B, lacZ-CLL) también fueron incapaces de estimular células T alogénicas para incorporar cantidades de ^{3}H-timidina que eran mucho mayores que las de cultivos de control. Por el contrario, células de leucemia estimuladas con anti-CD40 o células CD154-CLL inducían ambas una proliferación celular efectora significativa (Figura 12B, aCD40-CLL o CD154-CLL) (P < 0,05, prueba t de Bonferroni). Además, la cantidad de ^{3}H-timidina incorporada por cultivos estimulados con células CD154-CLL (41.004 \pm 761 cpm (m \pm ET), n = 3) era significativamente superior que la de cultivos estimulados con números equivalentes de células aCD40-CLL (22.935 \pm 1.892 cpm, n = 3) (P < 0,05, prueba t de Bonferroni). Sin embargo, ninguna de estas poblaciones celulares de leucemia tratadas con mitomicina-C incorporaba ^{3}H-timidina cuando se cultivaban sin células T efectoras (no se muestran los datos). Además, como se describe para la MLTR entre células T alogénicas y células CLL estimuladas con CD40 {6549, 7167, 7168}, la proliferación de células T alogénicas en respuesta a CD154-CLL podía inhibirse por CTLA-4-Ig o mAb CD11a cuando se añadía al inicio de la MLTR, indicando que las interacciones respectivas entre CD80/CD86 y CD28 o CD54 y CD11a/CD18, contribuyen a la reacción de células T alogénicas observada (no se muestran los datos).

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TABLA II Respuestas de células T alogénicas a células CLL infectadas con adenovirus mCD40-L

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iii. Estimulación de Interferón Gamma por Células CLL que Contienen un Gen de Ligando de Molécula Accesoria

Se analizó la función de células CLL que contenían un gen de ligando de molécula accesoria (ligando de CD40 de ratón) por determinación de la capacidad de esas células para activar linfocitos T. El procedimiento se realizó de la forma siguiente: se purificaron linfocitos T alogénicos de un donante sano (más del 90% CD3^{+}) usando perlas magnéticas y anticuerpos monoclonales específicos para el antígeno CD14 y CD19. Después, estos linfocitos T alogénicos se cultivaron junto con células CLL tratadas con MMC que se infectaron con el gen de ligando de molécula accesoria (ligando de CD40 murino) o el gen lac-Z. Este cocultivo se realizó en medio RPMI-1640 que contenía suero fetal de ternera al 10%. Después del cultivo durante 24 horas, las células se recogieron y se analizaron para determinar la expresión del antígeno CD69 en los linfocitos T usando un protocolo de separación de FACS convencional. Los sobrenadantes de cultivo de células se recogieron después de dos días en cultivo y se ensayaron para determinar la concentración de interferón gamma humano usando un ensayo de ELISA. Una porción de las células CLL que contenían un gen de ligando de molécula accesoria (ligando de CD40 murino) y una porción de las células que contenían el adenovirus que expresa el lac-Z se cultivaron en presencia de interleuquina humana 4 IL-4 (5 ng/ml). También se analizó la producción de interferón gamma por linfocitos T alogénicos en presencia de esta cantidad de interleuquina humana 4. Los resultados de estos análisis se muestran en la Figura 6.

Como puede observarse, las células CLL humanas que contenían el gen de ligando de molécula accesoria (CD40 murino) producían concentraciones sustancialmente superiores de interferón gamma en el sobrenadante de cultivo celular cuando se comparaban con células CLL que contenían el gen lac-Z. La producción aumentada de interferón gamma (IFNg) por linfocitos T expuestos a células CLL que contenían el gen de ligando de molécula accesoria indica que estas células CLL que contienen los genes de ligandos de moléculas accesorias eran eficaces en la producción de una respuesta inmune aumentada.

iv. Estimulación de Células T Alogénicas Previamente Expuestas a Células B CLL no Modificadas que Contienen un Gen de Ligando de Molécula Accesoria

Estudios previos indicaban que la presentación de antígenos a células T, en ausencia de las señales procedentes de moléculas coestimuladas tales como CD28, puede conducir a anergia clonal de células T específica. Por esta razón, se ensayaron células T alogénicas que se habían cultivado previamente con células B CLL no modificadas que carecían de expresión de CD80 y otras moléculas accesorias inmunes, para determinar su capacidad para responder a células CLL que contenían el gen de ligando de CD40. Las células efectoras alogénicas no incorporaron más ^{3}H-timidina en respuesta a células CLL no modificadas (Figura 12C, CLL) o células CLL de control infectadas con Ad-lacZ (Figura 12C, lacZ-CLL), que cuando se cultivaron en solitario (Figura 12C, Ninguna). Por el contrario, incluso después de un cocultivo previo con células B CLL no modificadas, las células efectoras alogénicas todavía podían inducirse para proliferar (Figura 12C, CD154-CLL) o para producir IFNg (Figura 12D, CD154 CLL) en respuesta a células que expresan un ligando de molécula accesoria. Aunque se detectaron cantidades modestas de IFNg en los sobrenadantes de dichos cultivos secundarios cuando se usaron células de leucemia infectadas con Ad-lacZ como células estimuladoras (Figura 12D, lacZ-CLL), este nivel era significativamente inferior que el observado para cultivos secundarios con células CLL infectadas con Ad-ligando de CD40 (Figura 12D, CD154-CLL) (P < 0,05, prueba t de Bonferroni). De forma similar, los sobrenadantes de las células de leucemia en solitario (no se muestran los datos) y las células efectoras en solitario (Figura 12D, Ninguna) de los cultivos de MLTR estimulados con células CLL sin infectar (Figura 12D, CLL) contenían cantidades insignificantes de IFNg (<2 ng/ml). Estos resultados indican que no se excluye que células efectoras alogénicas cultivadas con células B CLL no modificadas respondan a células B CLL infectadas con un vector de terapia génica que contiene el gen de ligando de molécula accesoria.

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v. Respuestas de Células T Autólogas a Células CLL en las que se ha Introducido un Vector de Terapia Génica que Codifica un Gen de Ligando de Molécula Accesoria Murino

Se examinaron células T aisladas de la sangre de pacientes con CLL para determinar su capacidad para responder in vitro a células B CLL autólogas que contienen un vector de terapia génica que codifica la molécula accesoria murina, ligando de CD40. Se aislaron células T hasta una pureza de >95% y después se cocultivaron con células de leucemia autólogas tratadas con mitomicina-C en medio AIM-V sin suero complementado con interleuquina 2 exógena a 25 U/ml. Se detectó una incorporación de ^{3}H-timidina modesta (\leq10.000 cpm) en cultivos sin células estimuladoras añadidas, secundaria en parte a la IL-2 exógena (Figura 13A y no se muestran los datos). Sin embargo, el nivel de proliferación de células T no aumentó en respuesta a células CLL sin infectar (Figura 13A, CLL) o células CLL infectadas con Ad-lacZ (Figura 13A, lacZ-CLL). Por el contrario, las células CLL infectadas con un vector de terapia génica que contenía el ligando de molécula accesoria (Figura 13A, CD154-CLL) inducían que células T autólogas incorporaran significativamente más ^{3}H-timidina (17.368 \pm 1.093 cpm, n = 3) que cualquiera de los cultivos de control (P < 0,05, prueba t de Bonferroni). Además, la MLTR estimulada con células CLL infectadas con un vector que codifica un ligando de molécula accesoria (CD40L) también generaba significativamente más IFNg (165 \pm 3 ng/ml, n = 3) que cualquiera de los otros cultivos (Figura 13B) (P < 0,05, prueba t de Bonferroni).

Las células T se recogieron después de 5 días de la MLTR autóloga y se evaluaron para determinar la actividad de CTL contra células B CLL autólogas. Las células T cocultivadas con células CLL con ligando de CD40 autólogas desarrollaron actividad de CTL por células B CLL no modificadas efectuando una lisis del 40,1% (\pm 2,3%) a una proporción de E:T de 2:1 (Figura 13C, CD154). Sin embargo, dichas células T no desarrollaron una actividad de CTL detectable por las mismas células diana en las reacciones de control, cuando se cocultivaron con células CLL sin infectar o infectadas con Ad-lacZ (Figura 13C).

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vi. Especificidad de CTL Estimulados por Células B CLL con Ligando de CD40 Autólogas por Células B CLL Alogénicas

Se evaluaron células efectoras estimuladas con CLL con ligando de CD40 autólogas para determinar su capacidad para secretar IFNg o manifestar actividad de CTL contra células B CLL alogénicas (Figura 14). Después de 5 días de MLTR autóloga con CD154-CLL o lacZ-CLL, se aislaron células T mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll, se lavaron exhaustivamente y después se cultivaron en medios durante 24 h. Las células T lavadas se mezclaron con células B CLL diana autólogas ("Auto CLL", barra oscura) o alogénicas ("Allo-1 CLL" o "Allo-2 CLL", barras sombreadas o de rayado sencillo). Las células T estimuladas en la MLTR autóloga con células CLL con ligando de CD40, pero no con células lacZ-CLL, producían significativamente más IFNg en respuesta a cultivo secundario con células B CLL autólogas no modificadas que con células B CLL alogénicas (Figura 14A) (P < 0,05, prueba t de Bonferroni). Además, las células T estimuladas con células CLL con ligando de CD40, pero no con células lacZ-CLL, eran citotóxicas para células CLL autólogas, pero no para células CLL alogénicas (Figura 14B). Se obtuvieron resultados similares con las células T activadas por MLTR autóloga del donante alogénico, demostrando de nuevo citotoxicidad específica por células B CLL autólogas (no se muestran los datos). Por último, W6/32, un mAb contra antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (MHC I) podía inhibir significativamente la citotoxicidad de células T estimuladas con células CLL con ligando de CD40 por células B CLL autólogas (Figura 14C, \alphaHLA-clase I)) (P < 0,05, prueba t de Bonferroni). Dicha inhibición no se observó con mAb específicos para antígenos de MHC de clase II (Figura 14C, \alphaHLA-DP), mAb específicos para el ligando de Fas (Figura 14C, \alphaFasL) o un mAb de control de isotipo de especificidad irrelevante (Figura 14C, MOPC-21). En conjunto, estos estudios indican que las células CLL infectadas con Ad-ligando de CD40 pueden inducir una respuesta inmune celular anti-leucemia autóloga in vitro, conduciendo a la generación de CTL restringidos a MHC-clase I específicos para células B de leucemia no modificadas autólogas.

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e. Transactivación de Células B de Leucemia Testigo no Infectadas Mediante Células CLL Ad-CD40L

Para abordar los cambios en la expresión de marcadores tumorales (descritos en la sección 1 di.) que son el resultado de una estimulación intracelular frente a intercelular, se examinó el efecto de la densidad de cultivo sobre la expresión inducida de CD54 y CD80 después de la infección con un vector de terapia génica de adenovirus que codifica el ligando de molécula accesoria (CD40L o CD154). Después de la infección, se cultivaron células CLL a una alta densidad (por ejemplo, 1 x 10^{6} células/ml) o baja densidad (por ejemplo, 2 x 10^{5} células/ml) convencional durante 3 días a 37ºC. Las células sembradas en placas a alta densidad contenían agregados homotípicos, mientras que las células sembradas en placas a baja densidad permanecían uniformemente dispersas y sin un contacto célula-célula sustancial (no se muestran los datos). A pesar de expresar niveles similares de CD154 heterólogo, se indujeron células B CD154-CLL cultivadas a alta densidad para expresar niveles mayores de CD54 y CD80 que células CD154-CLL cultivadas a baja densidad (Figura 15A). La estimulación conseguida a alta densidad podía inhibirse por cultivo de las células con un mAb de hámster anti-CD154 de ratón capaz de bloquear las interacciones CD40<->CD154 (Figura 15B, aCD154 Ab). En conjunto, estos estudios indican que las células CD154-CLL pueden activarse entre sí en trans y que la expresión superficial de CD154 es necesaria para una estimulación de células de leucemia óptima.

Además, células CLL infectadas con Ad-CD154, sin infectar, infectadas con Ad-lacZ o estimuladas con G28-5 se marcaron con un colorante verde fluorescente para examinar si las CD154-CLL podían estimular células de leucemia testigo no infectadas. Se usaron células marcadas con colorante como células estimuladoras para números equivalentes de células B CLL singénicas no marcadas. Después de un cultivo de 2 días, las células estimuladoras cultivadas por sí mismas conservaban el colorante verde fluorescente, permitiendo diferenciar dichas células de células CLL sin marcar por citometría de flujo. Se indujeron células B CLL CD19^{+} testigo (negativas para fluorescencia verde) para expresar CD54 (Figura 15C, histograma a la derecha) o CD86 (Figura 15D, histograma a la derecha) cuando se cocultivaron con células B de leucemia infectadas con Ad-CD154 pero no con células CLL con infección simulada (Figuras 15C y 15D, histogramas a la izquierda), células CLL estimuladas con G28-5, células CLL infectadas con Ad-lacZ (no se muestran los datos). Como se esperaba, estas células CLL testigo (negativas para fluorescencia verde) también eran negativas para CD154 heterólogo.

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f. Tratamiento de Leucemia con Vectores de Terapia Génica que Codifican un Ligando de Molécula Accesoria

La Figura 24 muestra un perfil de un ensayo clínico para ensayar el tratamiento de CLL de células B con vectores de terapia génica de adenovirus que codifican un ligando de CD40 modificado. Se infectaron células de leucemia recogidas por féresis con vectores de replicación deficiente que codifican el ligando de CD40 modificado. Después de la expresión de esta proteína, las células se administraron de nuevo al paciente con el fin de estimular una respuesta inmune del huésped anti-célula de leucemia. Esta estrategia es mucho mejor que una que usa terapia génica para influir en la expresión de sólo una molécula estimuladora inmune en la superficie de células de leucemia. De hecho, esta estrategia da como resultado que las células de leucemia expresen una serie de moléculas accesorias inmunoestimuladoras y citoquinas, así como una molécula que puede influir en los mismos cambios en células de leucemia del paciente que nunca se recogieron.

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2. Expresión de Genes de Ligandos de Moléculas Accesorias Quiméricos de la presente invención

Los genes de ligandos de moléculas accesorias quiméricos que se describen a continuación se prepararon usando técnicas convencionales como se describen en este documento.

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a. Preparación de Genes de Ligandos de Moléculas Accesorias Quiméricos Utilizando Dominios de Dos Genes de Moléculas Accesorias Diferentes

Se aisló el gen de ligando de CD40 humano a partir de ARN preparado de células T que se habían activado mediante un anticuerpo monoclonal anti-CD3 usando cebadores 5' y 3' junto con procedimientos de PCR bien conocidos. Se construyeron genes de moléculas accesorias quiméricos de ligando de CD40 humano y ligando de CD40 murino a partir del gen de ligando de CD40 humano y del gen de ligando de CD40 de ratón recién clonados descritos en este documento como SEC ID Nº: 2. Los dominios transmembrana y citoplasmático de genes de ligandos de CD40 humanos se intercambiaron con los del gen de ligando de CD40 murino y se designaron ligando de CD40 H (Ex)-M(Tm-Ci). Estos genes de ligandos de moléculas accesorias quiméricos se producen usando la técnica de conversión génica descrita como SOEN que se ha descrito previamente por Horton, Mol. Biotechnol., 3: 93 (1995). En la Figura 4 se muestra un diagrama que representa los genes de ligandos de moléculas accesorias quiméricos que se producen. Las secuencias de nucleótidos de cada uno de estos genes de ligandos de moléculas accesorias quiméricos respectivos se designan SEC ID Nº: 3-7 como se indica en la Tabla a continuación.

TABLA III

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Se construyen vectores de adenovirus que codifican cada una de las moléculas accesorias quiméricas que se muestran en la Figura 2 usando los procedimientos descritos en el Ejemplo 1. Cada una de estas construcciones se usa después para transfectar células HeLa o células CLL de acuerdo con los procedimientos del Ejemplo 1.

b. Expresión de Ligandos de Moléculas Accesorias Quiméricos en Células CLL y HeLa

La expresión de cada uno de los genes de ligandos de moléculas accesorias quiméricos construidos anteriormente se analiza mediante el uso de análisis FACS como se especifica en el Ejemplo 1. Se selecciona el anticuerpo monoclonal apropiado inmunoespecífico para el dominio externo del ligando de CD40 humano o de ratón y se usa para determinar el nivel de expresión de las moléculas accesorias quiméricas en la superficie de estas células. Después del análisis apropiado y la preparación de los histogramas apropiados, se confirma la expresión de moléculas accesorias quiméricas que contienen al menos una porción del gen de ligando de CD40 murino.

c. Función de Ligandos de Moléculas Accesorias Quiméricos

Se infectan células CLL con diversas MOI del adenovirus mCD40L y después se cultivan en placas de cultivo de tejidos de 48 o 24 pocillos durante diversos tiempos después de la infección (48, 72 y 96 horas). Después, se analizan las células B CD19^{+} mediante análisis de FACS multiparámetro para inducir la expresión de CD80 y CD54 usando mAb conjugado con isotiocianato de fluoresceína específico para cada antígeno superficial respectivo como se describe en el Ejemplo 1. Se descubrieron cantidades aumentadas de CD54 y CD80 en células que tienen las moléculas accesorias quiméricas que contienen el dominio o dominios procedentes del gen de ligando de CD40 de ratón.

Se lleva a cabo un análisis adicional de las células que contienen los genes de moléculas accesorias quiméricos de acuerdo con el Ejemplo 1(d). Las células que contienen los genes de moléculas accesorias quiméricos que contienen los dominios procedentes del gen de ligando de CD40 murino son capaces de estimular la producción de interferón gamma y la proliferación de células T.

d. Expresión de Genes de Moléculas Accesorias Quiméricos que Contienen Dominios Extracelulares Proximales de Dos Moléculas Accesorias Diferentes de la Misma Especie

Se prepara un gen de ligando de molécula accesoria quimérico que contiene el dominio extracelular proximal del gen de CD70 humano (Dominio III) con el resto de los dominios procedentes del gen de ligando de CD40 humano. Este gen se preparó usando técnicas biológicas convencionales como se han descrito previamente en este documento. Este gen de ligando de molécula accesoria quimérico tiene la secuencia de ADN que se muestra como SEC ID Nº: 19. Se prepara un gen de ligando de molécula accesoria quimérico diferente que contiene el dominio extracelular proximal del gen de ligando de CD40 murino con el resto de los dominios procedentes del gen de ligando de CD40 humano. Este gen se prepara usando técnicas convencionales como se han descrito previamente en este documento. Este gen de ligando de molécula accesoria quimérico tiene la secuencia de ADN que se muestra como SEC ID Nº: 20.

Los genes de moléculas accesorias quiméricos que se muestran como SEC ID Nº: 19 y 20 se insertan en los vectores apropiados como se describe en el Ejemplo 1 y se introducen en células neoplásicas humanas. La expresión de ese gen de molécula accesoria quimérico en las células se determina como se ha descrito en el Ejemplo 1.

La molécula accesoria quimérica codificada por cada uno de estos genes de moléculas accesorias quiméricos se encuentra en la superficie de las células neoplásicas humanas usando el análisis de FACS descrito en el Ejemplo 1. Se encuentran cantidades aumentadas de CD54 y CD80 en las células que contienen los genes de moléculas accesorias quiméricos usando las técnicas descritas en el Ejemplo 1. Las células que contienen el gen de molécula accesoria quimérico son capaces de estimular la producción de interferón gamma y proliferación de células T como se describe y se ensaya de acuerdo con el Ejemplo 1.

3. Aumento de Vacunación Usando Vectores que Codifican Moléculas Accesorias

Se usaron los siguientes procedimientos para demostrar el aumento de un protocolo de vacunación usando un vector de terapia génica que codifica una molécula accesoria.

a. Aumento de la Respuesta de Anticuerpos en Ratones Co-inyectados con un Vector de Terapia Génica de Molécula Accesoria y placZ

Se prepararon tres construcciones de terapia génica diferentes usando técnicas convencionales incluyendo las técnicas que se describen en este documento. El primero era un vector de terapia génica de control, pcDNA3, que no contenía ningún gen. El segundo, placZ, contenía el gen lac-Z que codifica \beta-galactosidasa (\beta-gal). El tercero, p-mCD40L, contenía el gen de ligando de CD40 murino descrito en el Ejemplo 1.

Antes de cualquier inmunización, se aisló suero de ratones BALB/c de 6-8 semanas de edad para determinar la cantidad de cualquier anticuerpo inicial contra \beta-galactosidasa. Cada animal se inyectó i.m. con 100 \mug de ADN plasmídico por inyección. Se administraron cuatro inyecciones separadas a intervalos de una semana.

Antes de la tercera inyección, se extrajo sangre a los animales para controlar la respuesta temprana de anticuerpos contra \beta-gal. Una semana después de la inyección final de ADN plasmídico, se extrajo sangre a los animales para controlar la respuesta tardía de anticuerpos contra \beta-galactosidasa. Para ensayar la sensibilidad del ensayo, se ensayaron en paralelo cantidades conocidas de anticuerpos anti-\beta-gal aislados a partir de un anti-suero anti-\beta-gal.

Se ensayaron diluciones de suero de 1:40, 1:200 o 1:1000 en un ELISA para anticuerpos anti-\beta-gal. Para esto, se revistieron placas de ELISA de microtitulación de poliestireno con \beta-gal a 10 \mug/ml en solución salina tamponada con fosfato. Las placas se lavaron tres veces con tampón de bloqueo que contenía albúmina de suero bovino al 1% (BSA), Tween 20 al 0,2% en solución salina tamponada con borato (BBS) (borato 0,1 M, NaCl 0,2 M, pH 8,2). Se añadieron 50 \mul de suero diluido a pocillos separados. Después de al menos una hora a temperatura ambiente, las placas se lavaron tres veces con tampón de bloqueo y después se dejaron reaccionar con anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado con fosfatasa alcalina. Una hora después, las placas se lavaron de nuevo cuatro veces con tampón de bloqueo y se incubaron con 25 ml de sustrato de peroxidasa TMB (Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD). Se midió la absorbancia a 405 nm de cada pocillo usando un lector de microplacas (Molecular devices, Menlo Park, CA). Cuanto mayor la lectura de D.O., mayor la cantidad de anticuerpo específico en la muestra.

Los datos para cada uno de los dos experimentos se proporcionan en las Tablas IV y V que siguen en hojas separadas. Los resultados se resumen en las Tablas VI y VII, proporcionándose también un cotejo de los datos de los dos experimentos. En la página de resumen n representa el número de animales en cada uno de los cuatro grupos. D.T. representa la desviación típica y Prom. es la lectura de D.O. promedio para todos los animales en un grupo particular.

Los resultados del Grupo 4 demuestran que el uso de un vector de terapia génica que codifica un ligando de molécula accesoria (CD40L) aumenta la inmunización contra \beta-gal codificado por un vector de terapia genética o génica. La lectura promedio de D.O. de la dilución 1:40 de los sueros de animales de este grupo es significativamente superior que la de los grupos 1, 2 y 3 (P < 0,05, pruebas t de Bonferroni, véase la Tabla VII).

Datos de un experimento adicional refuerzan adicionalmente el descubrimiento de que el vector de terapia génica que codifica un ligando de molécula accesoria aumenta la inmunización contra \beta-gal (Figura 16). Aquí, se co-inyectaron pCD40L y placZ en músculo esquelético, para ensayar el aumento de la respuesta inmune contra placZ, un vector basado en pcDNA3 que codifica \beta-galactosidasa de E. coli. Se determinaron las actividades relativas de Ab anti-\beta-gal mediante ELISA. Como se esperaba, los ratones a los que se les inyectó el vector pcDNA3 no modificado o pCD40L en solitario no producían anticuerpos detectables contra \beta-gal (Figura 16A). A los ratones se les inyectó 100 \mug de pcDNA3 (barra de cuadros), 50 \mug de pcDNA3 + 50 \mug pCD40L (barra de rayas), 50 \mug de pcDNA3 + 50 \mug de placZ (barra rayada) o 50 \mug de pCD40L + 50 \mug de placZ (barra oscura). Por otro lado, los ratones que recibieron placZ y pcDNA3 desarrollaron anticuerpos anti-\beta-gal detectables una semana después de la cuarta y última inyección, el d28. Los ratones que recibieron placZ y pCD40L desarrollaron mayores títulos de anticuerpos anti-\beta-gal que ratones que recibieron inyecciones con placZ y pcDNA3. La Figura 16B, análisis de ELISA de diluciones seriadas de sueros recogidos el d28, muestra que los ratones a los que se les co-inyectó placZ y pCD40L tenían un título medio ocho veces superior de anticuerpos anti-\beta-gal en el d28 que los ratones tratados con placZ + pcDNA3.

i. Producción de Subclase de Inmunoglobulina Estimulada por Co-Inyección de Vector de Molécula Accesoria

A pesar de aumentar el título de la respuesta de anticuerpos anti-\beta-gal, la subclase de IgG anti-\beta-gal IgG inducida por inyección de placZ no se alteró por la co-inyección de pCD40L. Los anticuerpos anti-\beta-gal IgG_{2a} predominaban sobre los anticuerpos de subclase IgG_{1} en los sueros de ratones a los que se les inyectó placZ y pcDNA3 o placZ y pCD40L (Figura 17). Además, se representan las mediciones de D.O. de ELISA de IgG_{1} anti-\beta-gal e IgG_{2a} anti-\beta-gal presentes en los sueros preinmunes (barra rayada) o sueros post-inmunes (barra oscura) recogidos el d28) de cada grupo de ratones, inyectados como se indica en el eje de abscisas. Por el contrario, los ratones BALB/c a los que se les inyectó proteína \beta-gal desarrollaron predominantemente anticuerpos anti-\beta-gal IgG_{1} y no desarrollaron anticuerpos anti-\beta-gal IgG_{2a} detectables.

ii. Aumento de Vacunación Mediante Vector de Moléculas Accesorias Requiere Co-Inyección con placZ en el Mismo Sitio

El efecto adyuvante del plásmido pCD40L sobre la respuesta de anticuerpos anti-\beta-gal se observó solamente cuando se inyectaba en el mismo sitio que placZ (Figura 18). Grupos de ratones BALB/c (n=4) recibieron inyecciones intramusculares de placZ y pCD40L juntos en el mismo sitio o como inyecciones separadas simultáneas en sitios distantes (cuadriceps de la extremidad posterior derecha e izquierda). Un grupo de control recibió inyecciones intramusculares de placZ y pcDNA3 en el mismo sitio. Se extrajo sangre a los animales el d28 y los sueros se ensayaron para determinar Ab anti-\beta-gal a diferentes diluciones, como se indica en el eje de abscisas. La gráfica ilustra un experimento representativo que representa la D.O. media a 405 nm de pocillos por duplicado de cada una de las muestras de suero para cada grupo, a una dilución de 1:40, 1:200 o 1:1000. Los animales a los que se les inyectó simultáneamente placZ y pCD40L, pero en sitios diferentes, no desarrollaron anticuerpos anti-\beta-gal detectables hasta d28. Además, los títulos de anticuerpos anti-\beta-gal de los sueros de dichos animales el d28 eran similares a los de ratones que recibieron placZ y pcDNA3 y significativamente menores que los de animales que recibieron placZ y pCD40L juntos en el mismo sitio.

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iii. Aumento de vacunación cuando se Co-inyectan Vector de Moléculas Accesorias y placZ en la Dermis

El plásmido pCD40L también aumentaba la respuesta de anticuerpos anti-\beta-gal contra placZ cuando se inyectaba en la dermis. En el experimento que se muestra en la Figura 19, ratones recibieron inyecciones intradérmicas cerca de la base de la cola con 50 \mug de pcDNA3 (barra de cuadros), 25 \mug de pcDNA3 + 25 \mug de pCD40L (barra de rayas), 25 \mug de pcDNA3 + 25 \mug de placZ (barra rayada) o 25 \mug de pCD40L + 25 \mug de placZ (barra oscura). Las inyecciones, extracciones de sangre y análisis de ELISA se realizaron como en la Figura 16A. Los grupos de la barra de cuadros y la barra de rayas cada uno estaban constituidos por 8 ratones mientras que los grupos de la barra rayada y la barra oscura cada uno estaban constituidos por 12 ratones. La altura de cada barra representa la D.O. media de sueros a una dilución de 1:40 de cada grupo \pm E.T. Un análisis estadístico de los datos indicaba que los grupos de la barra rayada y barra oscura son independientes (P < 0,05). Como se observaba con la inyección intramuscular, los ratones a los que se les co-inyectó placZ y pCD40L desarrollaron anticuerpos anti-\beta-gal en suero detectable una semana después de la segunda inyección (d14) y dos semanas antes que los ratones a los que se les inyectó placZ y pcDNA3. Además, estos animales también tenían un título medio 8 veces superior de anticuerpos anti-\beta-gal que los ratones del grupo al que se le inyectó placZ en el d28. Los ratones a los que se les inyectó el vector pcDNA3 sin modificar o pCD40L en solitario no producían anticuerpos detectables contra \beta-gal.

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b. Aumento de la Respuesta de CTL en Ratones a los que se les Co-inyectó un Vector de Terapia Génica de Molécula Accesoria y placZ

Se ensayó la capacidad de pCD40L para aumentar la inducción, mediante placZ, de CTL específicos para células diana que expresan \beta-gal singénicas. Los ratones BALB/c a los que se les co-inyectó pCD40L y placZ en el músculo esquelético (Figura 20A) o dermis (Figura 20B) generaban mayores números de CTL específicos para P13.2, una línea celular P815 transfectada con placZ, que los ratones a los que se les co-inyectó placZ y pcDNA3. A una proporción de efector:diana de 5:1, las células efectoras de esplenocitos de ratones que recibieron inyecciones intramusculares de placZ y pCD40L consiguieron más del 20% de lisis específica de P13.2. Por el contrario, cuando se usaron esplenocitos de ratones que recibieron la inyección de control con placZ y pcDNA3, fue necesaria una proporción 9 veces mayor de células efectoras con respecto a diana para conseguir este nivel de lisis específica. De forma similar, las células efectoras de esplenocitos de ratones que recibieron inyecciones intradérmicas de placZ y pCD40L destruyeron más del 50% de las células P13.2 a proporciones de efector:diana de 4:1. Para conseguir niveles comparables de lisis específica se necesitaron proporciones de efector:diana 8 veces superiores usando esplenocitos de ratones que recibieron inyecciones intradérmicas de placZ y pcDNA3. No obstante, los esplenocitos de ratones a los que se les co-inyectó pCD40L y placZ no tenían una actividad de CTL inespecífica superior por células P815 que los ratones que recibieron placZ junto con pcDNA3 (Figura 20). Como se esperaba, los esplenocitos de ratones que recibieron inyecciones de pcDNA3 en solitario o pcDNA3 y pCD40L no mediaron la lisis específica de células P13.2 o P815.

TABLA IV Experimento nº 1 Inyecciones de ADN plasmídico i.m.: 4/3/96; 4/10/96; 4/17/96; 4/24/96

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TABLA V Experimento nº 2 Inyecciones de ADN plasmídico i.m.: 6/5/96; 6/12/96; 6/19/96; 6/26/96

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TABLA VI Resumen

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4. Tratamiento de Neoplasia Usando un Vector de Terapia Génica que contiene un Gen de Molécula Accesoria o Gen de Molécula Accesoria Quimérico a. Tratamiento de Neoplasia en Ratones

Se ha demostrado el tratamiento de una neoplasia en un sistema modelo de ratón usando los genes que codifican ligandos de moléculas accesorias de la presente invención. Se prepararon vectores de terapia génica que contenían un gen de ligando de molécula accesoria (ligando de CD40 murino) como se ha descrito previamente los ejemplos anteriores. Estos vectores de terapia génica se usaron para introducir ese gen de ligando de molécula accesoria en células neoplásicas, células Line1, de un tumor que se originó en ratones BALB/c. Las moléculas accesorias se introdujeron en las células neoplásicas de acuerdo con los ejemplos anteriores. La expresión de ligando de molécula accesoria en la superficie de estas células neoplásicas se confirmó usando citometría de flujo como se ha descrito en los ejemplos anteriores.

La eficacia de los genes de ligando de moléculas accesorias para tratar neoplasias se demostró de la forma siguiente. Se les inyectó i.p. a ratones BALB/c hembra (6-8 semanas de edad) 1,0 X 10^{5} células neoplásicas Line1 irradiadas. Las células Line1 neoplásicas proceden de un adenocarcinoma de pulmón espontáneo en un ratón BALB/c. Esta célula neoplásica se ha descrito por Blieden y col., Int. J. Cancer Supp., 6: 82 (1991). A otros ratones BALB/c hembra se les inyectó i.p. 1,0 X 10^{5} células tumorales Line1 irradiadas que se habían transducido previamente con el vector de terapia génica que codifica el gen de ligando de molécula accesoria (CD40 murino) como se ha descrito anteriormente.

Se dejó que cada grupo de ratones generará una respuesta inmune durante 10 días. Después de 10 días, cada ratón se expuso a 1,0 X 10^{4} células neoplásicas Line1 no irradiadas vivas. Después, estos ratones se controlaron para determinar la formación de tumores y después se sacrificaron cuando los tumores crecieron hasta 2,0 cm debido a la morbilidad. Los resultados de este control se muestran en la Figura 7. Como puede observarse mediante la Figura 7, los ratones inmunizados con la célula neoplásica que expresa los ligandos de moléculas accesorias en la superficie celular permanecieron libres de tumores durante todo el experimento. Los ratones inmunizados con las células neoplásicas que no tenían los genes de ligandos de moléculas accesorias sucumbieron al tumor 50 días después de la exposición a las células neoplásicas.

La Figura 21 demuestra la modulación negativa de CD40L humano, pero no de CD40L murino, en líneas de celulares de tumor de pulmón que expresan CD40. Se infectaron líneas celulares humanas HeLa (carcinoma cervical negativo para CD40, Figura 21A), A427 (carcinoma de pulmón negativo para CD40, Figura 21B), NCI 460 (carcinoma pulmonar de células grandes débilmente positivas a CD40, Figura 21C) y SK-Mes-1 (tumor pulmonar de células escamosas fuertemente positivas a CD40, Figura 21D) con adenovirus que codifica lac-Z (Ad-LacZ), CD40L murino (Ad-mCD40L) y CD40L humano (Ad-hCD40L) a una MOI de 0 (Blanco), 1 y 10. Cuarenta y ocho horas después de la infección, se determinó la expresión superficial de CD40L murino y CD40L humano. El porcentaje de células que expresaban ligandos se representó en el eje Y. CD40L humano y murino se expresan a niveles equivalentes en líneas celulares negativas para CD40. Sin embargo, sólo la expresión de CD40L murino es estable en líneas celulares que expresan CD40. Al contrario que mCD40L, CD40L humano está modulado negativamente en tumores positivos a CD40.

Los datos representados gráficamente en la Figura 22A muestran que la unión de CD40 induce la expresión de marcadores de superficie tumorales. El tratamiento de líneas celulares de cáncer de pulmón que expresaban CD40 con mAb \alphaCD40 daba como resultado la expresión aumentada de los marcadores de superficie celular tumorales CD95 (Fas), CD54 (ICAM-1) y antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (MHC I). NCI 460, un carcinoma pulmonar de células grandes débilmente positivo a CD40, se incubó con un anticuerpo monoclonal específico de CD40 (línea gruesa) o MOPC21, un mAb de control de isotipo (línea fina) en fibroblastos de ratón que expresaban CD32 durante 48 horas. Después de las 48 horas de incubación, las células de tumor de pulmón se analizaron para determinar la expresión de CD95, CD54 y MHC-I por FACS.

La Figura 22B muestra de nuevo una modulación negativa de CD40L humano por células tumorales positivas a CD40. Se co-cultivaron células tumorales HeLa (negativas para CD40), CLL (positivas para CD40) y SK-MES-1 (positivas para CD40) durante 24 horas con células T de donante normal activadas con CD3 a una proporción de célula tumoral: célula T de 2,5:1. Después de cocultivo, se analizaron células T que expresaban CD2 para determinar la expresión superficial de CD40L mediante FACS. Las líneas finas representan células T teñidas con anticuerpo de control de isotipo marcado con FITC (MOPC21) y las líneas gruesas representan células T activadas teñidas con anticuerpo \alphaCD40L marcado con FITC (anticuerpo \alphaCD154). Las líneas de células tumorales positivas a CD40, SK-MES-1 y CLL no expresan ligando de CD40 en sus superficies.

5. Expresión del Ligando de Molécula Accesoria Humano y de Ratón, Ligando de Fas, en Linfocitos de Sangre Humana a. Construcción de una Construcción Genética y Vector de Terapia Génica que Contiene el Gen de Ligando de Fas Humano y de Ratón

El gen de ligando de molécula accesoria humano (ligando de Fas humano) o el gen de ligando de molécula accesoria murino (ligando de Fas murino) se construyeron utilizando los genes humano y murino respectivos. Se generó una molécula de célula accesoria alterada en la que se eliminó un sitio de escisión por MMP supuesto y se designó \DeltaFasL-pcDNA3. La secuencia de nucleótidos de \DeltaFasL-pcDNA3 se enumera como SEC ID Nº: 40. Los nucleótidos 325 a 342 del ligando de Fas humano que codifican 6 aminoácidos están ausentes de \DeltaFasL. El diseño de \DeltaFasL se basa en el razonamiento de que el Dominio III contiene sitios más accesibles para MMP y por lo tanto podría ser la diana sobre la molécula para escisión de la superficie de la célula. Se han determinado las secuencias del gen de ligando de Fas humano y se enumeran como SEC ID Nº: 13 y 30 (acceso de Genbank U11821). Se han determinado las secuencias de genes de ligando de Fas de ratón y se enumeran como SEC ID Nº: 14 (C57BL/6, acceso de Genbank U10984) y 31 (Balb/c, acceso de Genbank U58995). La secuencia del gen de ligando de Fas de rata se ha determinado y se enumera como SEC ID Nº: 25 (acceso de Genbank U03470). Se generan construcciones quiméricas como se describe en el Ejemplo 2 para construcciones quiméricas del ligando de CD40 en las que el Dominio III del ligando de Fas humano se sustituye con Dominios de otras proteínas, particularmente proteínas de la familia de TNF. Las construcciones quiméricas incluyen, pero sin limitación, ligando de Fas humano con el Dominio III sustituido por el Dominio III del ligando de Fas murino (secuencia quimérica enumerada como SEC ID Nº: 37, se muestra el alineamiento de secuencia en la Figura 37) o sustituido por el Dominio III de CD70 humano (secuencia quimérica enumerada como SEC ID Nº: 38, mostrándose el alineamiento de secuencia en la Figura 38) o sustituido con el Dominio I de CD70 humano (secuencia quimérica enumerada como SEC ID Nº: 39, mostrándose el alineamiento de secuencia en la Figura 39). También se generan construcciones quiméricas en las que se insertan múltiples dominios, por ejemplo, dos copias del Dominio III de CD70 humano, en el ligando de Fas humano en lugar del Dominio III usando procedimientos descritos en el Ejemplo 1. También se generan construcciones quiméricas en las que se usan secuencias sintéticas para sustituir el Dominio III del ligando de Fas humano.

i. Clonación de Ligando de Fas Humano

El ADNc que codifica el ligando de Fas humano se subclonó en el vector de expresión eucariota pcDNA3. Se activaron linfocitos de sangre de donante normal durante 4 horas con PMA a 1 ng/ml más ionomicina 0,5 \muM. Se aisló el ARN total con el kit Qiagen Rneasy. Después se sintetizó el ADNc de ARN poli-A con cebadores oligo-dT usando el kit de síntesis de ADNc Superscript de Gibco-BRL. El gen que codifica ligando de Fas humano se amplificó después por PCR con los cebadores específicos de ligando de Fas (cebador sentido, SEC ID Nº: 32, cebador anti-sentido SEC ID Nº: 33). Después, el producto de PCR de ligando de Fas se subclonó en pcDNA3 usando técnicas de biología molecular convencionales. Los productos de RT-PCR, subclonados en pcDNA3, se designan hFasL-
pcDNA3.

ii. Clonación de Ligando de Fas murino

También se amplificaron los genes de ligando de Fas murino de cepas Balb/c y C57/BL6 de ratones después de la activación de esplenocitos de ratón con PMA más ionomicina como se ha descrito anteriormente y se amplificaron a partir de ADNc sintetizado con poli-A como se ha descrito anteriormente (cebador sentido, SEC ID Nº: 34, cebador anti-sentido, SEC ID Nº: 35). Estos genes se subclonaron en el vector de expresión pTARGET (Promega, Madison, WI). Los productos de RT-PCR, subclonados en pcDNA3, se designaron mFasL-pcDNA3.

iii. Construcción de Vector de Adenovirus

Para la construcción de vectores de adenovirus que codifican ligando de Fas humano, ligando de Fas murino o ligando de \DeltaFas, el inserto de ADNc clonado se subclonó en el plásmido pRc/RSV (Invitrogen, San Diego, CA) en el sitio HindIII-XbaI. Se subclonó un fragmento BgIII-XhoI con el promotor-potenciador de RSV y la secuencia de señal poli-A de la hormona de crecimiento bovino en el sitio BamHI-XhoI del plásmido MCS(SK) pXCX2. El plásmido MCS(SK)pXCX2 es una modificación del plásmido pXCX2, en el que se clonó la secuencia polienlazadora de pBluescript en la región E1. El plásmido resultante se cotransfectó después junto con pJM17 en células 293 usando el método de fosfato de calcio. Se escogieron placas aisladas de vectores de adenovirus y se expandieron por infección de células 293. Se obtuvieron preparaciones de adenovirus de título alto, como se ha descrito anteriormente, usando un gradiente de cloruro de cesio para concentrar partículas de virus mediante un gradiente por etapas con las densidades de 1,45 g/cm^{3} y 1,20 g/cm^{3}, centrifugándose las muestras durante 2 horas en un rotor SW41 (Beckman, Brea, CA) a 25.000 rpm a 4ºC. La banda de virus se desalinizó usando una columna de calidad de ADN Sephadex G-25 (Pharmacia, Piscataway, NJ) y el virus aislado se almacenó a -70ºC en solución salina tamponada con fosfato con glicerol al 10%. El título del virus se determinó por infección de células 293 permisivas a diversas diluciones y recuento del número de placas. Típicamente, los títulos varían de 10^{10} a 10^{12} unidades formadoras de placas/ml. Las construcciones de adenovirus se designaron Ad-hFasL, Ad-mFasL y Ad-\DeltaFasL.

b. Introducción de los Genes del Ligando de Fas Murino y Humano en Células Humanas

Las construcciones hFasL-pcDNA3, mFasL-pcDNA3 y \DeltaFasL-pcDNA3 se usaron para transfectar células 293 mediante electroporación. Las células transfectadas se seleccionan en medio que contiene G418. Los transfectantes de ligando de Fas se exploraron para determinar la expresión del transgen usando un anticuerpo anti-ligando de Fas y citometría de flujo. Los procedimientos usados son similares a los descritos para la transfección de CD40L en células CLL.

Para la infección con adenovirus de FasL, se suspendieron 10^{6} células CLL o células HeLa recién descongeladas y lavadas en de 0,5 a 1 ml de medio de cultivo para el cultivo a 37ºC en un incubador de CO_{2} al 5% en aire. Se añadieron adenovirus a las células a una multiplicidad de infección (MOI) variable y las células infectadas se cultivan durante 48 horas, a menos que se indique otra cosa, antes de analizarse para determinar la expresión del transgen.

c. Expresión de los Genes de Ligando de Fas en Células Humanas

Los ratones con el trastorno linfoproliferativo o linfoproliferativo generalizado son incapaces de suprimir células autorreactivas activadas fuera del timo. Esto está relacionado con el hecho de que, en estos ratones, las interacciones entre el receptor Fas y un ligando de molécula accesoria, ligando de Fas, son defectuosas. Estos animales desarrollan numerosos trastornos que incluyen linfadenopatía, esplenomegalia, nefritis y patología autoinmune sistémica que se asemeja a la observada en pacientes con lupus eritematoso sistémico o artritis reumatoide (AR). Es concebible que las interacciones normales entre el receptor Fas y el ligando de molécula accesoria que son responsables de la eliminación de linfocitos activados de articulaciones pueden estar afectadas en pacientes con AR.

Los linfocitos sinoviales de AR expresan el receptor Fas a una proporción mayor que la de los linfocitos de sangre de AR correspondientes con respecto a linfocitos de sangre de donante normal correspondientes. Por otro lado, los linfocitos sinoviales de AR expresan pocos o ningún ligando de molécula accesoria. Puesto que los linfocitos sinoviales de AR son sensibles a la apoptosis inducida por Fas, es posible que la expresión local de ligando de Fas en la articulación con AR sirva para eliminar las células mononucleares sinoviales que potencialmente median la patología autoinmune de AR.

La Figura 23 muestra que la expresión de ligando de Fas en linfocitos se inhibe por exposición a líquido sinovial de AR. Se activaron células T de sangre de donante normal durante 5 horas con PMA a 1 ng/ml más ionomicina 0,5 \muM. Se incubaron células en presencia de plasma sanguíneo de artritis reumatoide (círculos), líquido sinovial de AR (rombos) o ninguno (cuadrados). Además, se incubaron células con concentraciones crecientes del inhibidor de MMP BB94. Después de la activación, las células se analizaron para expresión superficial de ligando de Fas mediante FACS. El porcentaje de células que expresan ligando de Fas se representa en la Figura 23. Este experimento demuestra que existe un factor o factores presentes en el líquido sinovial de AR y suero que impide la expresión superficial de ligando de Fas.

d. Función de Ligando de Molécula Accesoria Humano, Murino y Quimérico, Ligando de Fas

Para determinar la capacidad de las construcciones de \DeltaFasL, las células transfectadas mencionadas anteriormente se mezclaron con la línea de células T humana sensible a ligando de Fas, JURKAT. Después de 4 horas de cocultivo, las células JURKAT no adherentes se recogieron y se evaluaron para determinar la apoptosis. El compuesto fluorescente yoduro de 3,3'-diohexiloxacarbocianina (DiOC_{6}) se usó para evaluar la apoptosis usando una modificación de un protocolo descrito anteriormente. Para esto, las células se lavaron una vez a temperatura ambiente en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,2). Las células se colocaron en pocillos separados de una placa de microtitulación de plástico de fondo en U de 96 pocillos a 10^{5} - 5 x 10^{5} células/pocillo en un volumen total de 50 ml. Si se indica, se añadieron cantidades saturantes de anticuerpos conjugados con PE seguido de la adición de DiOC_{6} y yoduro de propidio (PI). Se usaron DiOC_{6} y PI a concentraciones finales de 40 nM y 10 ng/ml, respectivamente. Después, las células se incubaron 15 minutos en un incubador de cultivo de tejidos a 37ºC y CO_{2} al 5%. Después, las células teñidas se lavaron dos veces en PBS enfriado en hielo y finalmente se suspendieron en 200 ml de SM y se analizaron mediante FACS. Se excluyeron del análisis las células muertas y residuos con perfiles de dispersión de luz frontal y lateral característicos y tinción con PI.

La capacidad de células que expresan \DeltaFasL-pcDNA3 para dirigir la apoptosis mediada por Fas de células que expresan CD95 se compara con la de células que expresan FasL-pcDNA3. La estabilidad relativa de los productos proteicos codificados por \DeltaFasL-pcDNA3 o FasL-pcDNA3 antes y después del cultivo con líquido sinovial de AR y con o sin los inhibidores de metaloproteinasa, se evalúan mediante citometría de flujo de células que expresan cualquier ligando.

6. Tratamiento de Artritis con Vectores de Terapia Génica que Codifican un Ligando de Molécula Accesoria, Ligando de Fas

Las construcciones de ligando de Fas heterólogas, generadas como se ha descrito anteriormente, que muestran la mayor estabilidad de expresión en combinación con la mayor capacidad para mediar la apoptosis inducida por Fas, se usan en terapia génica para AR. Se ensayan construcciones terapéuticas potenciales en modelos de ratón bien caracterizados de artritis para evaluar la eficacia y la función in vivo.

a. Tratamiento de Terapia Génica de Artritis en Ratones i. Modelos de Ratón para Artritis

Un modelo de artritis de ratón es artritis inducida por colágeno. Se sabe que la inyección de colágeno de tipo II en ratones DBA/1 en adyuvante completo de Freund (CFA) induce una artritis con sinovitis y erosiones que histológicamente se asemejan a AR. Para estos estudios, se inmunizaron ratones DBA/I macho con colágeno de tipo II bovino en adyuvante completo de Freund el día 0 y se reforzaron por vía intraperitoneal (i.p.) el día 21. El día 28, se administró a los animales una inyección i.p. adicional con lipopolisacárido (LPS) y/o el mismo tipo de colágeno o una inyección de ácido acético en solitario. La hinchazón y/o enrojecimiento de una pata delantera o trasera en animales inmunizados con colágeno típicamente se detecta en la tercera o cuarta semana después de la segunda inyección. Las vértebras se afectan sólo rara vez y después solamente semanas después del hinchamiento articular periférico inicial. Las articulaciones afectadas presentan cambios histológicos iniciales de edema sinovial seguido de hiperplasia sinovial.

Otro modelo animal, recientemente descrito por Kouskoff, V. y col., en Cell 87: 811-822 (1997) se generó fortuitamente por cruzamiento de una línea de ratón transgénico con receptor de células T (TCR) con la cepa de ratón diabético no obeso (NOD) para producir el modelo de ratón de AR KRN x NOD. La descendencia de dicho cruzamiento desarrolló en general una enfermedad articular que es muy similar a la de pacientes con AR. Además, la enfermedad en estos animales tiene un tiempo de comienzo temprano y reproducible y un curso altamente reproducible. La artritis se induce aparentemente por un reconocimiento casual de una molécula de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II procedente de NOD por el TCR transgénico, conduciendo a la descomposición de los mecanismos generales de autotolerancia y autorreactividad sistémica.

ii. Alivio de Síntomas de Artritis en Ratones Tratados con un Vector de Terapia Génica que Codifica un Ligando de Molécula Accesoria

Se ha adaptado y modificado un protocolo descrito originariamente por Sawchuk y colaboradores para microinyección de vectores de adenovirus en articulaciones de ratones. Usando este procedimiento se puede inyectar de forma reproducible un volumen de 5 \mul en el espacio articular de la rodilla del ratón. En este procedimiento, los ratones se anestesian con metofano. Se realiza una pequeña incisión de aproximadamente 2-3 mm con una hoja de bisturí de nº 11 en la piel a lo largo del aspecto lateral de la rodilla para visualizar el ligamento patelotibial. Se pueden inyectar hasta 5 \mul de líquido usando una microjeringa Hamilton de 100 \mul y una aguja de calibre 30. Después de la inyección, la incisión de la rodilla se cierra con Nexabond (Veterinary Products Laboratory). Los títulos de adenovirus exceden típicamente 10^{10} unidades formadoras de placas (ufp) por ml, haciendo posible administrar al menos 5 x 10^{8} ufp de virus en 5 ml en el interior de las articulaciones de la rodilla, como se ha descrito anteriormente. A los animales de control se les inyectó vector Ad-lacZ de control, un vector de adenovirus de replicación deficiente que carece de un transgen o el tampón usado para suspender el virus (Tris 10 mM, MgCl_{2} 1 mM, glicerol al 10%).

En otro procedimiento, se recogerán esplenocitos a partir de ratones que sean singénicos para el animal huésped destinado para la transferencia adoptiva de células transducidas. Se inducirá la proliferación celular con IL-12 exógena (100 unidades/ml) durante 48 h. Se recuentan células y después se vuelven a sembrar en placas a densidades de 5 x 10^{5} ó 1 x 10^{6} células por ml en una placa de 12 pocillos con 1 ml de medio de cultivo completo por pocillo. Se añadieron virus y ConA juntos en el momento de volver a sembrar en placas en presencia de polibreno (8 \mug/ml). El medio se cambia 24 horas después de la infección con medio completo que contiene 100 unidades de IL-2 recombinante por ml. Se examinan alícuotas de las células transducidas, para determinar la expresión de ligando de Fas, a 48 horas después de la infección mediante citometría de flujo.

Los animales recibirán números normalizados de células productoras de citoquinas o células de control con transfección simulada por vía intraperitoneal. Se inyectan suspensiones celulares concentradas directamente en la membrana sinovial del ratón, como se ha descrito en la sección 4A anterior. En paralelo, se mantienen alícuotas de las poblaciones celulares transferidas en cultivo de tejido complementado con IL-2 exógena.

Los ratones se controlan de una forma ciega para signos de artritis. La fecha de comienzo de la enfermedad se registra y se valora la gravedad clínica de cada articulación o grupo de articulaciones (dedos, tarsos, tobillo, muñeca, rodilla) de la forma siguiente: 0 (normal), 1 (eritema), 2 (hinchazón), 3 (deformidad), 4 (necrosis). Las puntuaciones se suman para dar la puntuación artrítica. La gravedad de la artritis se expresa tanto como la puntuación media observada en un día dado como la media de la puntuación artrítica máxima alcanzada por cada ratón durante el curso clínico de la enfermedad. En el momento de la muerte, se extirpan por disección las patas traseras y se procesan para examen histológico o para RT-PCR. La gravedad histológica de la artritis se puntúa en una escala de 0-3 para proliferación sinovial e infiltración de células inflamatorias, donde una puntuación de 0 = normal y 3 = grave.

Para ratones que reciben una inyección intrasinovial de control de vector de adenovirus de ensayo, se compara el nivel de artritis observado entre sitios contralaterales. Además, la puntuación articular global menos la de la articulación inyectada para el animal completo se compara con la observada en la articulación inyectada con el vector de control o adenovirus de ensayo.

La administración local de vectores de expresión de adenovirus de ligando de Fas dará como resultado una eliminación de células activadas, como se evalúa por medición de los niveles relativos de ARNm de CD80 por RT-PCR cuantitativa. Este tratamiento también conducirá a un nivel aumentado. Además, se evalúa dicho nivel de apoptosis identificado en tejido sinovial de ratones afectados mediante el ensayo de TUNEL ("Marcaje de Extremos con Mellas con dUTY mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT)"). Se realiza TUNEL por inmersión de las secciones en tampón de TdT (Tris-HCl 30 mM, pH 7,2, cacodilato sódico 140 nM, cloruro de cobalto 1 mM) y después adición de TdT (GIBCO BRL, Grand Island, NY) y dUTP biotinilado (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). La reacción se finaliza por inmersión de las secciones en tampón TB (cloruro sódico 300 mM, citrato sódico 30 mM). Posteriormente, las muestras se tratan con estreptavidina marcada con peroxidasa y después se visualizan usando el kit VECTASTAIN ABC (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA). Para la inmunohistoquímica, las secciones se bloquean con leche desnatada al 4% durante 30 minutos a temperatura ambiente, después se incuban con mAb biotinilados específicos para CD3, B220, CD80 o CD95 (Fas) de ratón. Estos anticuerpos están disponibles en Pharmingen (San Diego, CA).

b. Tratamiento de Pacientes con Artritis Reumatoide con un Vector de Terapia Génica que Codifica un Ligando de Molécula Accesoria, Ligando de Fas

Se usaron construcciones de ligando de Fas candidatas identificadas como que tienen un beneficio terapéutico potencial en protocolos humanos para tratar AR. Los protocolos humanos incluyen procedimientos in vivo o ex vivo para administrar las construcciones de ligando de Fas. Además, las construcciones de ligando de Fas se administran potencialmente mediante procedimientos virales o no virales. Se describen a continuación perfiles de estrategias terapéuticas.

Una terapia ex vivo es similar a un protocolo descrito para trasplante intraarticular de sinoviocitos autólogos transducidos retroviralmente para sintetizar antagonistas del receptor de interleuquina-1 (Evan, Christopher y col., Clinical Trial to Assess the Safety, Feasibility, and Efficacy of Transferring a Potentially Anti-Arthritic Cytokine Gene to Human Joints with Rheumatoid arhtritis, Human Gene Therapy, Vol. 7, 1261-1280). En este procedimiento, después del diagnóstico clínico de AR, se extirpa la membrana sinovial durante el reemplazo total de la articulación. Los sinoviocitos se vuelven a aislar y se expanden, después se transducen o transfectan con ligando de Fas heterólogo en sinoviocitos (mediante retrovirus, adenovirus, ADN desnudo, etc.). Los sinoviocitos modificados por genes se reinyectan después en el paciente, que se controla y se ensaya para determinar una mejoría de los síntomas asociados a AR y para determinar la expresión y función del ligando de Fas en sinoviocitos modificados.

En otro protocolo ex vivo, se administra una línea celular inmortalizada alogénica que expresa de forma estable el ligando de Fas heterólogo al paciente con AR. En este protocolo, se construye una línea celular inmortalizada estable que expresa el ligando de Fas (introducido por transfección del gen en la célula por procedimientos no virales, tales como electroporación o por transducción viral del gen en la célula). La línea celular modificada se inyecta en el paciente, que se controla y se ensaya para determinar una mejoría de los síntomas asociados a AR y para determinar la expresión y función del ligando de hFas en sinoviocitos modificados. Una terapia basada in vivo será similar en concepto a la mejoría de la artritis inducida por colágeno usando un vector de terapia génica de adenovirus de ligando de Fas murino, descrito en Zhang, y col., J. Clin. Invest. 100: 1951-1957 (1997). En este uso de dicha estrategia, la administración de la construcción de ligando de hFas o \DeltafasL quimérico directamente en las articulaciones de pacientes con AR se realiza usando procedimientos virales o no virales. En este procedimiento, la construcción de ligando de Fas (por ejemplo, adenovirus de ligando de hFas) se inyecta directamente en la membrana sinovial. Los pacientes se controlan y se ensayan para determinar una mejoría de los síntomas asociados con AR así como un ensayo biológico para determinar la expresión y función del ligando de hFas en sinoviocitos modificados.

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<110> Prussak, Charles E. Kipps, Thomas J. Cantwell, Mark J.

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<120> Nueva CD154 Quimérica

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<130> UCSD 263/094

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<140> US 10/154.759

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<141> 23-05-2002

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<160> 24

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 783

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Construcción de ADN quimérica ISF30

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<212> ADN

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<223> Construcción de ADN quimérica ISF31

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<223> Construcción de ADN quimérica ISF32

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<223> Construcción de ADN quimérica ISF38

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<223> Construcción de ADN quimérica ISF39

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<212> ADN

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<223> Construcción de ADN quimérica ISF40

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Construcción de ADN quimérica ISF41

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<212> PRT

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<223> Polipéptido CD154 quimérico codificado por la secuencia de ADN de la SEC ID Nº: 1

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<211> 252

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Polipéptido CD154 quimérico codificado por la secuencia de ADN de la SEC ID Nº: 2

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<400> 14

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26

27

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<210> 15

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<211> 260

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Polipéptido CD154 quimérico codificado por la secuencia de ADN de la SEC ID Nº: 3

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<400> 15

28

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<210> 16

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<211> 252

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Polipéptido CD154 quimérico codificado por la secuencia de ADN de la SEC ID Nº: 4

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<400> 16

29

30

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<210> 17

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<211> 260

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Polipéptido CD154 quimérico codificado por la secuencia de ADN de la SEC ID Nº: 5

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<400> 17

31

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<210> 18

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<211> 252

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Polipéptido CD154 quimérico codificado por la secuencia de ADN de la SEC ID Nº: 6

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<400> 18

32

33

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<210> 19

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<211> 260

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Polipéptido CD154 quimérico codificado por la secuencia de ADN de la SEC ID Nº: 7

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<400> 19

34

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<210> 20

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<211> 252

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Polipéptido CD154 quimérico codificado por la secuencia de ADN de la SEC ID Nº: 8

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<400> 20

35

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<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 260

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Polipéptido CD154 quimérico codificado por la secuencia de ADN de la SEC ID Nº: 9

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<400> 21

37

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<210> 22

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<211> 252

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Polipéptido CD154 quimérico codificado por la secuencia de ADN de la SEC ID Nº: 10

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<400> 22

38

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<210> 23

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<211> 260

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Polipéptido CD154 quimérico codificado por la secuencia de ADN de la SEC ID Nº: 11

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<400> 23

39

40

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<210> 24

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<211> 252

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Polipéptido CD154 quimérico codificado por la secuencia de ADN de la SEC ID Nº: 12

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<400> 24

41

Claims (21)

1. Un gen de ligando de CD40 quimérico constituido por secuencias de nucleótidos que codifican dominios en el siguiente orden: un dominio citoplasmático (Dominio I), un dominio transmembrana (Dominio II), un dominio extracelular proximal (Dominio III) y un dominio extracelular distal (Dominio IV), caracterizado por que

al menos uno de dichos dominios procede de un gen de ligando de CD40 murino y los otros dominios proceden de un gen de ligando de CD40 humano.

2. Un gen de ligando de CD40 quimérico constituido por secuencias de nucleótidos que codifican dominios en el siguiente orden: un dominio citoplasmático (Dominio I), un dominio transmembrana (Dominio II), un dominio extracelular proximal (Dominio III) y un dominio extracelular distal (Dominio IV), caracterizado por cualquiera de

a)

los Dominios III y IV proceden de un gen de ligando de CD40 humano y los Dominios II y I proceden de un gen de ligando de CD40 murino o

b)

los Dominios III y IV proceden de un gen de ligando de CD40 murino y los Dominios II y I proceden de un gen de ligando de CD40 humano o

c)

los Dominios II, III y IV proceden de un gen de ligando de CD40 humano y el Dominio I procede de un gen de ligando de CD40 murino o

d)

los Dominios II, III y IV proceden de un gen de ligando de CD40 murino y el Dominio I procede de un gen de ligando de CD40 humano o

e)

los Dominios I, III y IV proceden de un gen de ligando de CD40 humano y el Dominio II procede de un gen de ligando de CD40 murino o

f)

el Dominio III procede de un gen de ligando de CD40 murino y los Dominios I, II y IV proceden de un gen de ligando de CD40 humano.

3. El gen de ligando de CD40 quimérico de la reivindicación 2, constituido por la SEC ID Nº: 3 o SEC ID Nº: 4 o SEC ID Nº: 5 o SEC ID Nº: 6 o SEC ID Nº: 7 o SEC ID Nº: 20.

4. El gen de ligando de CD40 quimérico de la reivindicación 1 ó 2, en el que se ha o han eliminado el sitio o sitios de escisión de proteasas de secuencias de nucleótidos del Dominio III.

5. El gen de ligando de CD40 quimérico de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho gen está unido funcionalmente a una región promotora y una señal de poliadenilación.

6. Un vector que comprende un gen de ligando de CD40 quimérico de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

7. El vector de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho vector es un vector de expresión.

8. Una célula huésped que comprende una secuencia de nucleótidos o un vector como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

9. La célula huésped de la reivindicación 8, en la que dicha célula huésped es una célula eucariota.

10. La célula huésped de la reivindicación 8 ó 9, en la que dicha célula huésped es una célula neoplásica.

11. La célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en la que dicha célula huésped es una célula presentadora de antígeno.

12. Una composición farmacéutica que comprende un gen de ligando de CD40 quimérico o un vector como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

13. Una composición farmacéutica que comprende una célula huésped como se define en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11.

14. La composición farmacéutica de la reivindicación 12, que comprende además un antígeno inmunogénico.

15. La composición farmacéutica de la reivindicación 14, en la que dicho antígeno inmunogénico está codificado por un vector.

16. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 útil como vacuna.

17. Uso de un gen de ligando de CD40 quimérico o un vector como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una neoplasia.

18. El uso de la reivindicación 17, en el que la neoplasia se selecciona del grupo constituido por una leucemia, un linfoma, un cáncer de pulmón, cáncer de mama y cáncer de ovario.

19. El uso de la reivindicación 18, en el que la leucemia se selecciona del grupo constituido por leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mielomonoblástica aguda (AMML), leucemia mielomonocítica crónica (CMML), leucemia mielógena crónica (CML) y leucemia linfocítica crónica (CLL).

20. Un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos o un vector como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

21. Un procedimiento in vitro de alterar la inmunorreactividad de células humanas, comprendiendo dicho procedimiento introducir un gen de ligando de CD40 quimérico o un vector como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en dichas células humanas de modo que dicho ligando de CD40 quimérico se exprese en la superficie de dichas células.