ES2341331T3 - Cd 154 quimerico. - Google Patents
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Abstract
Una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID NOS. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 1
Description
CD154 quimérico.
La presente invención se refiere a los campos de
bioquímica, inmunología, ingeniería genética, y medicina. En
particular, se refiere a ligandos quiméricos novedosos que, cuando
se expresan sobre la superficie de una célula, son más estables que
el correspondiente ligandos nativo pero que retiene la función de
unión al receptor del ligando nativo y no son inmunogénicos.
El sistema inmune elimina las células malignas
reconociéndolas como extrañas y después eliminándolas del cuerpo.
Para llevar a cabo esto, el sistema inmune induce tanto una
respuesta de anticuerpo como una respuesta celular. Estas
respuestas requieren la interacción entre un número de células
diferentes del sistema inmune (Abbas, Cellular and Molecular
Immunology, 2000).
Una reacción inmune típicamente comienza con un
linfocito T (célula T) que tiene sobre su superficie un receptor de
células T (TCR) que se une a un péptido derivado de antígeno
asociado a una molécula de complejo de histocompatibilidad
principal de la clase II (MHC). La Célula T también expresa sobre
su superficie diversos polipéptidos, que se denominan
"ligandos" debido a que se unen a receptores sobre las células
asociadas con una respuesta mediada inmune, como se describe en más
detalle más adelante. Cuando el receptor de células T se une a un
antígeno asociado a MHC, tal como un antígeno derivado de una
célula maligna, se llega a activar y expresa un ligando sobre su
superficie. El ligando se presenta solamente sobre la superficie de
la célula durante un tiempo corto, y una vez que se ha eliminado de
la superficie de la célula, la capacidad de las células T para
unirse a una célula que lleva un receptor se pierde. Uno de tales
ligandos se llama CD154.
CD154 es un miembro de una familia mayor de
ligandos, denominados de manera colectiva como la superfamilia TNF
(Gruss et al, Cytokines Mol Ther, 1: 75-105,
1995 y Locksley et al, Cell, 104: 487-501,
2001). Los miembros de la superfamilia TNF incluyen ligando Fas
("FasL"), TNF\alpha, LT\alpha, linfotoxina (TNF\beta),
CD154, TRAIL, CD70, ligando CD30, ligando 4-1BB,
APRIL, TWEAK, ligando RANK, LIGHT, ligando AITR, ectodisplasina,
BLYS, VEGI, y ligando OX40. Los miembros de la superfamilia de TNF
comparten una estructura secundaria conservada que comprende cuatro
dominios: dominio I, el dominio intracelular; dominio II, que se
extiende sobre la membrana celular y se conoce como el dominio
transmembrana; dominio III, que consta de los aminoácidos
extracelulares próximos a la membrana celular; y el dominio IV, el
dominio extracelular distal (Kipps et al., documento
WO98/26061 publicado el 18 de junio de 1998). Típicamente, al menos
una parte del dominio IV se puede escindir a partir de la molécula
precursora. El fragmento escindido a menudo muestra la misma
actividad biológica del ligando intacto y se denomina de manera
conveniente como una "forma soluble" del miembro de la familia
de TNF.
Las interacciones entre CD154 (también conocido
como ligando CD40) y su receptor afín, CD40, son críticas para el
reconocimiento inmune. (Banchereau J. et al., Annu. Rev.
Immunol. 12: 881-922, 1994; Laman J.D. et
al., Crit. Rev. Immunol., 16: 59-108, 1996).
CD154 se expresa de manera transitoria sobre células CD4^{+} T
después del acoplamiento del Receptor de células T mediante células
que presentan antígeno a través de las moléculas de clase II de
MHC. (Roy M. et al., J. Immunol., 151:
2497-2510, 1993; Hepmann P. et al., Eur. J.
Immunol., 23: 961-964, 1993; Castle B.E. et
al., J. Immunol., 151: 1777-1788, 1993; Cantwell
M. et al., Nat. Med., 3: 984-989, 1997).
Esto, a su vez, puede provocar la actividad de células que presentan
antígeno (APC) que expresan CD40, incluyendo células B, células
dendríticas, monocitos, y macrófagos. (Ranheim E.A. et al.,
J. Exp. Med., 177: 925-935, 1993; Ranheim E.A. et
al., Cell. Immunol., 161: 226-235, 1995). Tales
células activadas por CD40 pueden comenzar una cascada de episodios
activadores inmunes que conducen a una respuesta inmune específica
e inmune contra antígenos extraños, tales como virus o tumores. La
importancia de las interacciones entre CD40 y CD154 se subraya por
el hallazgo de los individuos que han heredado defectos en el
ligando para CD40 que tienen deficiencia inmune profunda. (Korthauer
J. et al., Nature, 361: 539-541, 1993;
Aruffo A. et al., Cell., 72: 291-300, 1993).
Tales pacientes tienen un síndrome de deficiencia inmune asociado a
la formación del centro germinal alterada, intercambio del isotipo
defectuosa, y susceptibilidad marcada a diversos patógenos
bacterianos y virales.
Debido a que CD154 es tal molécula crítica en la
regulación inmune, varios mecanismos controlan la expresión de
CD154 humano. Primero, CD154 expresado en membrana se puede escindir
y una parte extracelular de capaz de unirse al receptor CD154,
CD40, se libera como una molécula soluble. Las enzimas de escisión
proteolíticas se ha mostrado que escinden CD154 humano en
diferentes sitios a lo largo del ligando, y libera una forma a
soluble de CD154 que es capaz de unirse a CD40 y estimular una
respuesta inmune. (Pietravalle F. et al., J. Biol. Chem.,
271: 5965-5967, 1996; Pietravalle F. et al.,
Eur. J. Immunol., 26: 725-728, 1996). Por ejemplo,
un estudio ha mostrado que CD154 se escinde entre Phe 111 y Ala 123
(Pietravalle F. et al., Eur. J. Immunol., 26:
725-728, 1996), y la escisión también se ha reseñado
en Met 113. Segundo, la interacción de CD154 con su receptor afín
puede inducir una modulación hacia abajo rápida de la expresión en
la superficie de CD154. (Cantwell M. et al., Nat. Med., 3:
984-989, 1997). Tercero, la transcripción del gen de
CD154 está regulada fuertemente con la expresión máxima de ligandos
4 a 6 horas después del ligamiento de TCR seguido de una rápida
disminución de síntesis de ARN ARN y proteína de CD154. (Id.)
Conjuntamente, estos mecanismos reguladores aseguran la
especificidad la especificidad de una respuesta inmune a un antígeno
específico. La importancia de mantener un fuerte control de la
expresión de CD154 se manifiesta en individuos con lupus sistémico
eritematoso (SLE). Estos pacientes parece que hiperexpresan CD154
así como que poseen niveles elevados de CD154 soluble en su
plasma, que sugiere que la expresión de CD154 no controlada
contribuye a una actividad de la enfermedad de SLE. (Kato K. et
al., J. Clin. Invest., 101: 1133-1141, 1998;
Vakkalanka R.K., Arthritis Rheum., 42: 871-881,
1999).
El potencial para uso de CD154 para
inmunoterapia está bajo investigación activa. Debido a que CD154 es
un potente activador inmune, CD154 como una terapia de cáncer es un
foco principal de investigación de debido a que las células
neoplásicas son pobres presentadores de antígenos e incapaces de
estimular respuestas vigorosas antitumorales. Por ejemplo,
leucemia linfocítica crónica (CLL) las células B modificadas para
expresar CD154 usando un vector de adenovirus defectuoso de
replicación puede potenciar la presentación de antígeno de CLL e
inducir la citotoxicidad de células T antólogas hacia células B de
CLL no modificadas. (Kato K. et al., J. Clin. Invest., 101:
1133-1141, 1998). Además, un estudio de fase I
clínico que usa células B de CLL modificadas por
Ad-CD154 mostró resultados terapéuticos
prometedores. (Wierda W.G: et al., Blood, 96:
2917-2924, 2000). De manera similar, otros estudios
mostraron que la modificación de una gama de tipos de tumores que
expresan CD154 puede inducir respuestas inmunes antitumorales
eficaces en modelos animales.
Los estudios de manipulación de Células B y
otros tumores trabajan mediante o bien la potenciación de la
presentación de antígeno de la propia célula neoplásica, como es el
caso para CLL y linfoma de células B, o mediante activación de las
células que presentan antígeno espectadoras, tales como células
dendríticas que pueden iniciar una respuesta inmune antitumoral,
como es el caso para tumores negativos a CD40. Sin embargo,
estudios adicionales también sugieren que CD154 puede tener un
efecto inhibidor de crecimiento directo sobre ciertos tumores,
especialmente carcinomas de mama. (Tong A.W. et al., Clin.
Cancer Des., 7: 691-703, 2001; Hirano A., Blood,
93: 2999-3007, 1999). Además, existe evidencia que
el crecimiento de algunos tipos de linfoma se puede inhibir
directamente por la ligación a CD40. (Wilsey J.A. et al.,
J. Immunol., 158: 2932-2938, 1997). Como tal, una
amplia gama de tumores debe ser tratable por inmunoterapia de
CD154.
Aunque CD154 es un agente terapéutico
potencialmente potente, la forma de CD154 usada en terapias clínicas
probablemente tendrá un impacto importante en tanto la seguridad
como eficacia.
Por ejemplo, CD154 soluble recombinante
(rsCD154) compuesto solamente del dominio extracelular, de unión al
receptor de CD154 es funcional. (Armitage R.J., Eur. J. Immunol.,
23: 2326-2331, 1993; Lane P., J. Exp. Med., 177:
1209-1213, 1993). Sin embargo rsCD154 no es tan
eficaz como el CD154 nativo expresado en la membrana celular para
inducir la señalización de CD40 debido a que la señalización óptima
requiere la multimerización de los receptores de CD40 en la
superficie de la célula. (Schwabe R.F. et al., Hybridoma, 16:
217-226, 1997). Como resultado, los dominios de
multimerización de ligandos se han modificado por ingeniería
genética, tales como cremalleras de leucina o dominios de CD8, en el
dominio n-terminal de rsCD154 para señalización del
receptor. (Lans P., et al., J. Exp. Med. 177:
1209-1213, 1993; Morris A.E., J. Biol. Chem. 274:
418-423, 1999). Del mismo modo, CD154 soluble no es
óptimo para la reticulación de CD40 ya que no proporciona tan fuerte
estimulación de células que presentan antígeno comparado con CD154
expresado en membrana.
Además, los reactivos solubles que median la
señalización de CD40 pueden activar efector fisiológicos adversos.
Por ejemplo, ratones inyectados con proteína de fusión
CD154-CD8 desarrollaron inflamación pulmonar. (Wiley
J.A. et al., J. Immunol., 158: 2932-2938,
1997). Del mismo modo, la administración de anticuerpo monoclonal
que activa CD40 a ratones inmunocomprometidos indujo lesiones
intestinales que eran fatales. (Hixon J.A. et al., Biol.
Blood Marrow Transplant., 7: 136-143, 2001) La
toxicidad asociada a la administración sistémica de CD154 soluble
parece ser una característica general de la familia de TNF ya que
también se observan efectos adversos después de la administración
de TNF-\alpha soluble, FasL, y TRAIL.
Otro inconveniente de CD154 soluble es la corta
semivida de los miembros de la familia de TNF soluble después de la
administración sistémica. (Spriss D.R. et al., Ciba Found.
Symp., 131: 206-227, 1987; Funahashi I. et
al., Br. J. Cancer, 67: 447-455). Esta corta
semivida requeriría la administración de cualesquiera dosis mayores
de rsCD154 o infusión continua durante el tiempo, que no solamente
incrementa las posibilidades de toxicidad sino que también
requerirían el aislamiento de grandes cantidades de proteína de
rsCD154, un proceso difícil y de larga duración.
Debido a los problemas inherentes usando CD154
soluble, CD154 humano de longitud completa expresado en la
membrana parece la mejor alternativa. Sin embargo CD154 humano
nativo también posee características que pudieran limitar su
eficacia o seguridad. Como se ha mencionado anteriormente CD154 de
longitud completa se escinde y se libera en forma de una molécula
soluble, permitiendo potencialmente toxicidades similares descritas
para rsCD154. Además, la escisión proteolítica de CD154 unida a
membrana podría disminuir su actividad funcional. Aunque la
supresión de los sitios de escisión supuestos de CD154 puede
disminuir su metabolismo, esto no elimina completamente el
procesamiento de CD154 ya que existen sitios de escisión
proteolítica múltiples. (Mazzei G.J. et al., J. Biol. Chem.,
270: 7025-7028, 1995; Pistravalle F. et al.,
J. Biol. Chem., 271: 5965-5967, 1996). Además, un
problema menos aparente asociado al uso CD154 humano de longitud
completa es su expresión específica del tipo de célula. Por ejemplo,
ciertos tipos de células, especialmente las células de origen de
células B, evitan la expresión de CD154. humano (Kato K. et
al., J. Clin. Invest., 101: 1133-1141, 1998;
Cantwell M. et al., Nat. Med., 3: 984-989,
1997).
De manera interesante, CD154 murino (mCD154)
parece más ventajoso que cualquier CD154 humano nativo o rsCD154
para usos terapéuticos. CD154 murino es relativamente resistente a
escisión proteolítica en comparación con el CD154 humano. Además,
mCD154 se expresa por la mayoría de los tipos de célula, incluyendo
los tipos de origen de célula B que evitan la expresión de CD154
humano, a menudo mencionado como células CD40^{+}. (Id.) Como
tal, mCD154 se expresó en el ensayo clínico de la terapia génica de
CD154 de un tipo de célula CD40^{+}, una célula de CLL. (Wierda
W.G., Blood, 96: 2917-2924 (2000). El documento WO
98/26061 A divulga moléculas de CD154 quiméricas en las que se han
cambiado los dominios completes de CD154. Algunos dominios son de
origen murino mientras que otros son origen humano. Además, algunas
moléculas de CD154 quiméricas descritas en el documento WO 98/26061
A comprenden un dominio extracelular desprovisto de un sitio de
escisión de metaloproteasa.
Además, el uso de mCD154 en seres humanos
presenta sus propios problemas. Por ejemplo, después de las
inyecciones repetidas de células de CLL modificadas por
Ad-CD154 a pacientes, la reducción en células
leucémicas disminuyó con cada inyección posterior. Tres de cuatro
pacientes de CLL se hicieron refractarios a la actividad de células
que expresan mCD154 por la quinta inyección repetida. Esta pérdida
de actividad de actividad es probablemente debida al desarrollo de
anticuerpos contra la molécula de CD154 murino haciendo además
tratamientos imposibles. Los ensayos para determinar la formación
de anticuerpos de unión y de neutralización contra CD154 mostró
anticuerpos murinos anti-CD154 desarrollados por la
tercera inyección repetida de células de CLL transducidas de
Ad-mCD154. Además, los anticuerpos
anti-CD154 pueden también neutralizar la función de
CD154 murino. De este modo, a pesar de la seguridad global,
estabilidad de expresión, y eficacia a largo plazo de mCD154, la
administración a largo plazo de mCD154 en seres humanos será
difícil.
Dadas las desventajas de las construcciones de
CD154 actuales, existe una clara necesidad de una construcción de
CD154 preferida para la terapia de la enfermedad que posea las
propiedades encontradas en tanto CD154 humano como CD154 murino.
Una construcción de CD154 debería expresarse en diversos tipos de
células, incluyendo células linfoides de origen de células B.
Además, la construcción de CD154 debería estar estabilizada en
membrana y resistente a la escisión proteolítica, y por lo tanto
ser menos probable que generen la forma soluble de CD154. Sin
embargo, la construcción de CD154 preferida mantendría la función de
unión al receptor de CD154 nativo. Ambas de estas propiedades se
encuentran en mCD154. Además, una construcción de CD154 preferida no
sería inmunogénica en el dominio crítico para la unión al receptor
después de la administración en seres humanos, evitando de esta
manera la neutralización funcional.
La presente invención proporciona tal
construcción de CD154.
La presente invención se refiere a polipéptidos
de CD154 quiméricos novedosos que tienen las propiedades más
ventajosas de CD154 humano y CD154 murino y, como tal, son seguros y
eficaces para la terapia de la enfermedad. De manera específica, el
CD154 quimérico sería capaz de expresión sobre tipos de células
diversos, incluyendo Células B. Sería menos resistente a la
escisión proteolítica y de este modo más estable cuando se expresa
en las membranas. Además, el CD154 quimérico no sería inmunogénico
y de este modo no se neutralizaría por ananticuerpos
anti-CD154. Finalmente, mantendría las capacidades
de unión al receptor de CD154 humano, y de este modo provocaría el
mismo tipo de respuesta inmunológica en seres humanos.
Estos polipéptidos de CD154 quiméricos novedosos
son quiméricos ya que están compuestos por dominios y subdominios
de CD154 de al menos dos dominios diferentes, a saber CD154 humano
y de ratón. Estos polipéptidos se han denominado "factores
estimuladores inmunes", o ISF, debido a que combinan regiones de
CD154 humano y no humano para maximizar la estimulación de la
respuesta inmune. De manera específica, al menos un dominio o
subdominio de CD154 que contiene un sitio de escisión de CD154
humano se reemplaza con un dominio o subdominio correspondiente de
CD154 no humano, preferiblemente CD154 murino. Además, el
polipéptido quimérico está compuesto de un dominio o subdominio de
CD154 humano que es responsable de la unión de un receptor de
Receptor de CD154. La presente invención también se refiere a
secuencias de polinucleótidos novedosos que codifican CD154
quimérico, los vectores de expresión que comprenden las secuencias
de polinucleótidos novedosos, y procedimientos de producción de
CD154 quimérico. Finalmente, la presente invención se refiere al uso
de una molécula de ácido nucleico de la presente invención para la
fabricación de un medicamento para inducir la activación de una
célula del sistema inmune, en la que se expresa CD154 quimérico en
la superficie de la célula. En un primer aspecto la presente
invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que tiene una
secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo constituido
por SEQ ID NOS. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a una molécula de ácido nucleico de la presente invención,
en la que molécula de ácido nucleico tiene una secuencia de
nucleótidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID NOS.
2, 4, 6, 8, 10 y 12.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a una molécula de ácido nucleico de la presente invención,
en la que la molécula de ácido nucleico tiene una secuencia de
nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada
entre el grupo constituido por SEQ ID NOS. 14, 16, 18, 20, 22, y
24.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un vector de expresión, que comprende la molécula de ácido
nucleico de la presente invención.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un vector de expresión de la presente invención, que
comprende además ADN viral o ADN bacteriano.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un vector de expresión de la presente invención, en el
que dicho ADN viral se selecciona entre el grupo constituido por ADN
adenoviral y ADN retroviral.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un vector de expresión de la presente invención, en el
que al menos una parte del vector comprende ADN adenoviral.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a una construcción genética que comprende la molécula de
ácido nucleico de la presente invención unida de manera operativa
una secuencia promotora y a una secuencia de señal de
poliadenilación.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a una célula huésped, que comprende un vector de expresión
de la presente invención o una construcción genética de la presente
invención.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a una célula huésped de la presente invención, en la que la
célula es una célula CD40^{+} humana.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a una célula huésped de la presente invención, en la que la
célula es una célula tumoral.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a una célula huésped de la presente invención, en la que la
célula es una célula que presenta antígeno.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a una célula huésped de la presente invención, en la que la
célula es una célula B.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un polipéptido de CD154 quimérico que tiene una secuencia
de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID
NOS. 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 y 24.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un procedimiento para producir un CD154 quimérico de la
presente invención, que comprende el cultivo de una célula huésped
de la presente invención en condiciones adecuadas para efectuar la
expresión de la proteína.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un uso de una molécula de ácido nucleico que codifica un
polipéptido CD 154 quimérico de acuerdo con la presente invención
para la fabricación de un medicamento para inducir la activación de
una célula del sistema inmune, el CD154 quimérico se expresa en la
superficie de la célula, por ejemplo una célula humana
CD40^{+}.
Figura 1. La figura 1 es un diagrama esquemático
que muestra polinucleótidos ejemplares que codifican el CD154
quimérico de la presente invención, e indica la localización de los
subdominios asociados a propiedades específicas del CD154
quimérico. Los dominios o subdominios derivados de CD154 murino como
se muestra en sombreado.
Figura 2. La figura 2 es una serie de
histogramas de aislamiento de células en citofluorímetro (FACS) que
muestra la expresión de polipéptidos de CD154 quiméricos ejemplares
de la presente invención, es decir, ISF 30-ISF 39,
cuando se compara con CD154 murino (mCD154) y un plásmido de control
pcDNA3 que no contiene CD154. La expresión se midió después de la
transfección de células HeLa con plásmidos pcDNA3 que contienen
mCD154 y cada construcción de ISF. El área sombreada muestra la
expresión de células HeLa no transfectadas y el área no sombreada
muestra la expresión de células HeLa transfectadas.
Figura 3. La figura 3 es una serie de
histogramas FACS que muestra la capacidad funcional de Células HeLa
transfectadas con polipéptidos de CD154 quiméricos ejemplares de la
presente invención, es decir, ISF30-ISF39, cuando
se compara con CD154 murino (mCD154) y un plásmido de control que no
contiene CD154, para activar la expresión de marcadores de
superficie fenotípicos CD70 y CD95 por Células B Ramos. El área
sombreada muestra la expresión de marcadores de superficie por
células no activadas, el área no sombreada bajo la línea delgada
muestra la expresión de marcadores de superficie de las células B
activadas por células HeLa que se transfectaron con plásmido de
control pcDNA3, y el área no sombreada bajo la línea en negrita
muestra la expresión de marcadores de superficie de las células B
activadas por células HeLa que se transfectaron con mCD154 o una
construcción de ISF.
Figura 4. La figura 4 es una serie de
histogramas FACS que muestra la sensibilidad de polipéptidos de
CD154 quiméricos ejemplares de la presente invención, es decir,
ISF30-ISF39, cuando se compara con CD154 murino
(mCD154) y CD154 humano (hCD154), para unirse mediante anticuerpo en
el plasma del paciente capaz de neutralizar la función de CD154
murino nativo. Esta sensibilidad se midió mediante la incubación
conjunta de Células B Ramos con células HeLa transfectadas con
plásmido pcDNA3 de control que contiene mCD154 o una o más de las
construcciones de ISF ejemplares, añadir el plasma que contiene
anticuerpo neutralizante y, después de aproximadamente un día de
incubación, recoger y analizar las células Ramos para evaluar la
expresión del marcador de superficie de CD70 y CD95. El área
sombreada muestra la expresión de los marcadores de superficie no se
active debido a que las células Ramos se incubaron con células
HeLa no transfectadas, el área no sombreada bajo la línea delgada
muestra la expresión de los marcadores de superficie en células que
se incubaron con plasma que contiene anticuerpos, y el área
sombreada bajo la línea en negrita muestra la expresión de los
marcadores de superficie en las células que no se incubaron con
plasma.
Figura 5. La figura 5 es una serie de
histogramas FACS que muestra la sensibilidad de los polipéptidos de
CD154 quiméricos seleccionados de la presente invención, ISF 30 e
ISF 35, cuando se compara con CD154 murino (mCD154) y un plásmido
de control, para que los anticuerpos en plasma del paciente sean
capaces de neutralizar la función de CD154. Esta sensibilidad se
midió después de la transfección de células HeLa con plásmido pcDNA3
que contiene mCD154, ISF 30 e ISF35 e incubación de las células
transfectadas con plasma de paciente que contiene anticuerpos
neutralizantes. El área sombreada muestra la cantidad de anticuerpos
unidos a las células que no se incubaron con plasma, y el área no
sombreada muestra la cantidad de anticuerpos unida a las células
que se incubaron con plasma.
Figura 6. La figura 6 es una serie de
histogramas FACS que muestra la expresión de polipéptidos de CD154
quiméricos seleccionados de la presente invención, ISF 32 y 35,
cuando se compara con CD154 murino (m CD154), en células HeLa
infectadas con relación de multiplicidad creciente de infección
(MOI) de vectores de adenovirus que contienen mCD154, ISF32 e ISF
35. El área sombreada muestra la expresión de células HeLa no
transfectadas, y el área no sombreada muestra la expresión de
células HeLa transfectadas con los vectores de adenovirus descritos
anteriormente.
Figura 7. La figura 7 es una serie de
histogramas FACS que muestra la expresión por células B de CLL de
polipéptidos de CD154 seleccionados de la presente invención, ISF
32 y 35, cuando se compara con CD154 murino (mCD154) y células no
infectadas, después de la infección con vectores de adenovirus que
contienen mCD154, ISF 32 e ISF 35. El área sombreada muestra la
expresión de células B de CLL no transfectadas, y el área no
sombreada muestra la expresión de células B de CLL transfectadas con
los vectores de adenovirus mencionados anteriormente.
Figura 8. La figura 8 es una serie de
histogramas FACS que muestra la activación de Células B de CLL
cultivadas conjuntamente con células HeLa que expresan polipéptidos
de CD154 seleccionados de la presente invención, ISF 32 y 35,
cuando se compara con CD154 murino (mCD154). Esta activación se
midió mediante los cambios en la expresión de marcadores de
superficie fenotípicos, CD80, CD70, CD86, CD95, CD54 y CD27, que son
característicos de la activación de CD40. El área sombreada muestra
la expresión de los marcadores de superficie de Células B de CLL no
activadas, el área no sombreada bajo la línea delgada muestra kla
activación de células B de CLL que se cultivaron conjuntamente con
células HeLa transfectadas con adenovirus de control
AD-LacZ que no contiene CD154, y el área no
sombreada bajo la línea en negrita muestra la activación de células
B de CLL cultivadas conjuntamente con células HeLa transfectadas
con mCD154, ISF 23 e ISF35.
Figura 9. La figura 9 es una serie de
histogramas FACS que muestra la expresión de polipéptidos de CD154
quiméricos seleccionados de la presente invención, ISF 5, ISF 12,
ISF 24 e ISF 32, cuando se compara con CD154 murino y humano
después de la transfección en células HeLa y células B de CLL. El
área sombreada muestra la expresión en células no transfectadas, y
el área no sombreada muestra la expresión en células transfectadas
con cada una de las construcciones de ISF diseñadas. Esta figura
indica que CD154 murino y humano, así como las construcciones de
ISF diseñadas, se expresan en las células HeLa. Sin embargo, esta
figura también confirma que las células B de CLL típicamente impide
la expresión de CD154 humano, pero no CD154 murino. Las células B
de CLL expresan dos de las construcciones de ISF, es decir, ISF 5,
que tiene un dominio IV compuesto completamente de CD154 murino, e
ISF 32, que tiene un dominio IV que está compuesto en gran parte de
CD154 murino. Esto indica que el elemento regulador que permite la
expresión de CD154 murino en las células B de CLL se localiza en una
región del dominio IV. De acuerdo con lo anterior, ISF 12 e ISF 24
no se expresaban bien por las células B de CLL, debido a que el
dominio IV de ISF 12 está compuesto exclusivamente por CD154 humano,
mientras que el dominio IV de ISF 24 incluye CD154 murino, pero
también tiene una región de CD154 humano que abarca la región que
regula la expresión de la molécula de las células CLL.
Figura 10: La figura 10 es un gráfico de barras
que representa gráficamente la cantidad de ligando soluble generado
dos días después de dos días de infección de células HeLa con
adenovirus que lleva un polipéptido CD154 quimérico de la presente
invención, ISF 35, y CD154 humano. La cantidad de CD154 soluble
generado se detectó usando un ELISA específico de CD154 humano
(ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) y se calculó basándose
en la valoración de una cantidad conocida de ligando de proteína de
fusión ligando CD40-CD8 en el ELISA. El gráfico
muestra la resistencia de ISF 35 para escindirse en ISF35 soluble,
cuando se compara con la escisión de CD154 humano en CD154 soluble
y la ausencia de CD154 soluble generado por células no infectadas.
ISF 35 es de manera significativa más resistente a la escisión,
generando ISF35 no soluble. Por el contrario, CD154 humano se
escinde fácilmente en CD154 soluble a niveles > 120 ng/ml.
Como se usa en el presente documento, el término
"CD154" o "construcción de ISF quimérica" se refiere a
un ligando compuesto de al menos un dominio o subdominio de CD154 de
una especie y al menos un dominio o subdominio de CD154 de una
especie diferente. Las al menos dos especies a partir de las cuales
se deriva el CD154 quimérico de la presente invención son CD154
humano y murino.
Como se usa en el presente documento, el término
"subdominio" se refiere a una secuencia de al menos dos
aminoácidos que es parte de un dominio de CD154. Un
"subdominio" también abarca una secuencia de aminoácidos de las
que se han suprimido uno o más aminoácidos, incluyendo uno o más
aminoácidos truncados de un extremo de la secuencia.
Como se usa en el presente documento, la
expresión "sitio de escisión" se refiere a una secuencia de
aminoácidos que está reconocida por proteasas, típicamente
metaloproteasas de matriz (mmp) que escinden CD154 de la superficie
de la célula que se expresa. El sitio de escisión de CD154 se
encuentra típicamente en o alrededor de los límites de los
dominios III y IV de CD154. De acuerdo con la invención, tal sitio
de escisión comprende la región aproximadamente entre los
aminoácidos 108 y 116 de CD154 humano.
Como se usa en el presente documento, el término
"correspondiente" se refiere a la secuencia de nucleótidos o
aminoácidos de CD154 de una especie que es homóloga una secuencia de
nucleótidos o aminoácidos de CD154 de otra especie. Esta homología
se basa en la similitud de estructura secundaria, tal como la
localización de los límites de dominio, entre CD154 de especies
diferentes (véase la Tabla I más adelante).
Como se usa en el presente documento, la
expresión "menos susceptible a escisión" se refiere a la mayor
resistencia de CD154 quimérico a escisión proteolítica comparado
con la de CD154 humano nativo, como se mide por la cantidad de
CD154 soluble generado por un número dado de las células durante un
período de tiempo. Preferiblemente, un CD154 quimérico de la
presente invención es "menos susceptible a escisión" debido a
que se escinde a una velocidad al menos 90% menor que el CD154
nativo.
Como se usa en el presente documento, la
expresión "vector de expresión" se refiere a un ácido nucleico
que expresa una secuencia de nucleótidos recombinante que es capaz
de infectar las células y replicarse ellas mismas allí. Los
vectores de expresión típicos incluyen los plásmidos usados en la
tecnología de ADN recombinante y diversos virus capaces de
replicarse dentro de las células bacterianas o virales. Se han
descrito numerosos vectores de expresión en la bibliografía.
Cantwell et al., Blood, en (1996) titulado "Adenovirus
Vector Infection of Chronic Lymphocytic Leukemia B Cells;" Woll,
P. J. y I. R. Hart, Ann. Oncol., 6 Suppl 1: 73 (1995); Smith, K.
T., A. J. Shepherd, J. E. Boyd, y G. M. Lees, Gene Ther., 3: 190
(1996); Cooper, M. J., Semin. Oncol., 23: 172 (1996); Shaughnessy,
E., D. Lu, S. Chatterjee, y K. K. Wong, Semin. Oncol., 23: 159
(1996); Glorioso, J. C., N. A. DeLuca, y D. J. Fink, Annu. Rev.
Microbiol., 49: 675 (1995); Flotte, T. R. y B. J. Carter, Gene
Ther., 2: 357 (1995); Randrianarison-Jewtoukoff, V.
y M. Perricaudet, Biologicals., 23: 145 (1995); Kohn, D. B., Curr.
Opin. Pediatr., 7: 56 (1995); Vile, R. G. y S. J. Russell, Br. Med.
Bull., 51: 12 (1995); Russell, S. J., Semin. Cancer Biol., 5: 437
(1994); y Ali, M., N. R. Lemoine, y C. J. Ring, Gene Ther., 1: 367
(1994).
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ha indicado anteriormente, ligandos de
la superfamilia de TNF ("ligandos TNF") tienen una estructura
secundaria similar que consta de un número de dominios (Kipps et
al., documento WO98/76061 publicado el 18 de junio de 1998). E
la Tabla I, se muestran los límites de dominio de un número de
ligandos de la superfamilia de TNF. Basándose en la estructura de
cristal de rayos X de TNF\alpha humano, se ha deducido la
estructura secundaria predicha de la parte que se une al receptor de
CD154 humano (Peitsch et al, Int Immunol, 5:
233-238, 1993). Las estructuras secundarias de las
partes que se unen al receptor de otros ligandos de TNF se
dedujeron mediante comparación con el TNF\alpha humano, usando
análisis de ordenador.
\vskip1.000000\baselineskip
Dadas las similitudes en las secuencias de
nucleótidos que codifican las moléculas de CD154 de especies
diferentes, tales como humano, de ratón y de vaca, una secuencia de
nucleótidos que codifica un dominio o subdominio de CD154 de una
especie es intercambiable con la secuencia de nucleótidos
correspondiente de CD154 de otra especie para dar como resultado
una secuencia de polinucleótidos híbrida que codifica un CD154
quimérico.
Las secuencias de nucleótidos que se cambian por
las secuencias correspondientes entre las especies se seleccionan
por razones funcionales, es decir, debido a que la secuencia
seleccionada codifica un dominio o subdominio que o bien
proporciona o modifica una función, o elimina una función no deseada
del gel del ligando diana.
Se sabe en la técnica que al menos parte de
CD154 humano se escinde a partir de la molécula precursora y se
hace una molécula soluble. Como se ha descrito anteriormente, la
forma soluble es en general indeseable. De este modo, cambiando un
aminoácido, o una secuencia de aminoácidos, de CD154 humano que
comprende un sitio escisión reconocido por las enzimas
proteolíticas con un aminoácido, o secuencia de aminoácidos, de
CD154 no humano, que no contiene este sitio de escisión, al menos
parcialmente mejoraría ese problema. Preferiblemente, el CD154 no
humano es CD154 murino.
De acuerdo con la invención, un dominio
extracelular de CD154 humano incluye al menos un aminoácido, o una
secuencia de aminoácidos, en o cerca del extremo del dominio III y
dominio IV que está reconocido y escindido por las proteasas de
escisión. De acuerdo con la presente invención, al menos uno de
tales sitios de escisión existe entre los nucleótidos 322 - 348,
aminoácidos 108 - 116, de CD154 humano.
Además, de acuerdo con la invención, un dominio
extracelular de CD154 humano incluye al menos un aminoácido, o una
secuencia de aminoácidos, que se une a un receptor de CD154 humano,
por ejemplo, CD40. Por esta razón, incluso la forma soluble de
CD154 es capaz de unirse a receptores de CD154 sobre las células que
presentan antígeno y pueden participar de manera activa en una
respuesta inmune. De este modo, esta región extracelular de CD154
humano se debe conservar con el fin de mantener la unión del
receptor de CD154 nativo.
De acuerdo con lo anterior, una realización
preferida actualmente de la presente invención es una secuencia de
polinucleótidos de CD154 quimérico como se define en la
reivindicación 14 Las moléculas reivindicadas se pueden describir
mediante referencia a una primera secuencia de nucleótidos y una
segunda secuencia de nucleótidos de las que están hechas. De
acuerdo con esta invención, reemplazando un subdominio de CD154
humano que contiene un sitio de escisión de CD154 con el subdominio
correspondiente de CD154 no humano da como resultado un CD154
quimérico que es notablemente menos susceptible a escisión que el
CD154 humano.
Esta primera secuencia de nucleótidos está unida
de manera operativa a una secuencia de nucleótidos que codifica un
subdominio extracelular de CD154 humano implicada en la unión a un
receptor de CD154 humano, tal como el ligando de CD40. De esta
forma, la secuencia de polinucleótidos proporcionada por la presente
invención codifica un CD154 quimérico que se une a células humanas
que expresan el Receptor de CD154.
Además, de acuerdo con la invención, un dominio
extracelular de CD154 murino y humano incluye al menos un
aminoácido, o una secuencia de aminoácidos, que permite la expresión
de la molécula en las membranas de células murinas y humanas. Por
ejemplo, la Fig. 9 muestra que tanto CD154 murino como humano se
expresan por las células HeLa. Sin embargo, como se ha descrito
anteriormente, CD154 murino se expresa por una mayor variedad de
células, incluyendo células humanas, cuando se compara con CD154
humano. De hecho CD154 murino se puede expresar en células humanas
que típicamente no expresan CD154 humano, tales como células
CD40^{+} humanas, particularmente células de CLL. Esta expresión
diferencial entre CD154 humano y murino también se confirma por
los datos mostrados en la Fig. 9. De este modo, el cambio de un
aminoácido, o su secuencia, de CD154 humano que está implicado en
la expresión de la molécula humana con un aminoácido, o su
secuencia, de CD154 murino implicado en la expresión de la
molécula no humana dirigiría al menos parcialmente este
problema.
De acuerdo con lo anterior, en la realización
preferida de la presente invención, la secuencia de polinucleótidos
de CD154 quimérico comprende una primera secuencia de nucleótidos
que además codifica un subdominio extracelular de CD154 murino que
es crítico para la expresión de la Molécula de CD154 murino por las
células murinas y humanas. De esta forma, la secuencia de
polinucleótidos proporcionada por la presente invención codifica un
CD154 quimérico que es capaz de la expresión por una variedad de
tipos de células, incluyendo células CD40^{+} humanas que
típicamente no expresan CD154 humano. Aunque esta realización
implica el uso de CD154 murino, también descrito en el presente
documento son diferentes de CD154 no humano que se pueden expresar
por células humanas.
Además, de acuerdo con la invención, un dominio
extracelular de CD154 murino incluye un aminoácido, o una secuencia
de aminoácidos, implicado en la detección de la expresión del
CD154 quimérico debido a que se une a anticuerpo específico de
CD154 murino. De esta forma, la expresión de la secuencia de
polinucleótidos de CD154 quimérico se puede detectar de manera
específica, típicamente por FACS o inmunohistoquímica, y por lo
tanto distinguirse de la expresión de CD154 humano nativo.
De acuerdo con lo anterior, en la realización
preferida de la presente invención, la Secuencia de polinucleótidos
de CD154 quimérico comprende una primera secuencia de nucleótidos
que además codifica un subdominio extracelular de CD154 no humano
que detecta la expresión de CD154 quimérico mediante la unión a
anticuerpos anti-CD154 murino.
En la realización preferida de la presente
invención, esta primera secuencia de nucleótidos codifica un
subdominio del dominio IV de CD154 murino. Este subdominio IV de
CD154 murino comprende las secuencias de aminoácidos que reemplazan
el sitio de escisión de CD154 humano, que son críticos para la
expresión de la molécula murina por células murinas y humanas, y
que están implicadas en la detección del CD154 quimérico de la
presente invención. Además, esta primera secuencia de nucleótidos
puede codificar un subdominio del dominio III de CD154 murino que
está en o inmediatamente adyacente al extremo de los dominios III y
dominio IV. De acuerdo con la presente invención, este subdominio
comprende una parte de un sitio de escisión de CD154 humano.
Preferiblemente, la primera secuencia de
nucleótidos además codifica los dominios I, II y III de CD154
murino, debido a que esta construcción se ha mostrado que da como
resultado la expresión mejorada de CD154 quimérico por células
humanas. También se describe en el presente documento una primera
secuencia de nucleótidos que puede codificar el dominio III o un
subdominio del mismo, de CD154 murino; y/o dominio II, o un
subdominio del mismo, de CD154 murino; y/o dominio I, o un
subdominio del mismo de CD154 murino.
Además, de acuerdo con la invención, un dominio
extracelular de CD1 54 imurino y humano incluye al menos un
aminoácido, o una secuencia de aminoácidos, que se puede unir a
anticuerpos anti-CD154, y por lo tanto neutralizar
el efecto de activación inmune del ligando. Este aminoácido o
secuencia de aminoácidos es típicamente igual o sustancialmente
similar a las regiones en la estructura terciaria de CD154 que se
une a CD40, el receptor afín de CD154. Como se ha descrito
anteriormente, CD154 murino induce una mayor respuesta en términos
de producción de anticuerpos anti-CD154. Como tal,
es más sensible que CD154 humano para la unión y neutralización por
anticuerpos anti-CD154, que dan como resultado
problemas a largo plazo con la administración repetida de CD154
murino en seres humanos. Esto es, la administración de CD154
murino, o de una construcción de CD154 en la que la región a la que
se unen los anticuerpos anti-CD154 es murina, da
como resultado una reacción inmunogénica contra el CD154
administrado y de esta manera la eficacia disminuida en la
estimulación de una respuesta inmune. De este modo,
preferiblemente, la región implicada en la unión de anticuerpos
anti-CD154 es CD154 humano para prevenir o
minimizar cualquier efecto inmunogénico tras la administración.
De acuerdo con lo anterior, una realización
actualmente preferida de la presente invención es una secuencia de
polinucleótidos de CD154 quimérico que comprende una segunda
secuencia de nucleótidos de CD154 humano que además codifica un
subdominio extracelular al que se unen los anticuerpos
anti-CD154. De esta forma, la secuencia de
polinucleótidos proporcionada por la presente invención codifica un
CD154 quimérico que no es inmunogénico tras la administración en
seres humanos.
La segunda secuencia de nucleótidos codifica un
subdominio del dominio IV de CD154 humano. De este modo, una
secuencia de polinucleótidos actualmente preferida codifica un
subdominio del dominio IV de CD154 humano unido de manera operativa
a otro subdominio del dominio IV de CD154 murino.
Como se ha descrito anteriormente, el dominio IV
está unido a los dominios I, II y III de CD154 murino. Los ejemplos
de tales secuencias de polinucleótidos preferidas se proporcionan
en el presente documento SEQ ID. NOS. 1, 3, 5, 7, 9 y 11 codifican
construcciones de CD154 quimérico que se han diseñado ISF 30, 32,
34, 36, 38 y 40, respectivamente. La homología de estas
construcciones quiméricas con CD154 murino y humano está
representado por la siguiente Tabla II.
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\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Como alternativa, el dominio IV se puede unir a
dominios I, II y III de CD154 humano. Los ejemplos de tales
secuencias de polinucleótidos se proporcionan como SEQ ID. NOS. 2,
4, 6, 8, 10 y 12, y codifican construcciones de CD154 quimérico que
se han designado ISF 31, 33, 35, 37, 39 y 41, respectivamente. La
homología de estas construcciones quiméricas con CD154 murino y
humano se representa por la siguiente Tabla III.
El CD154 quimérico codificado por lo tanto
comprende un primer subdominio de CD154 murino que reemplaza un
sitio de escisión de CD154 humano y un segundo subdominio de CD154
humano que se une a un receptor de CD154. Como resultado, el CD154
quimérico es menos susceptible a escisión de la superficie de las
células que el CD1 54 humano, pero no obstante mantiene la
capacidad de unirse al receptor afín de CD154 nativo. Esta
disminución de susceptibilidad a la escisión de la superficie
celular se refleja por una velocidad de escisión del CD1 54
quimérico que es al menos un 90% menor que el CD154 humano.
Además, el primer subdominio de CD154 murino es
crítico para la expresión de CD154 murino por células murinas y
humanas, y de este modo permite la expresión del CD154 quimérico por
células humanas. Como consecuencia, el CD154 quimérico es capaz de
expresarse por las células CD40^{+}, incluyendo células de CLL,
que no expresan típicamente CD1 54 humano.
Además, el primer subdominio de CD154 murino es
capaz de detectar la expresión de CD154 quimérico debido a que se
une a anticuerpo específico de CD154, y de este modo distingue su
expresión de la expresión de CD154 humano nativo.
El segundo subdominio de CD154 humano
preferiblemente comprende uno al que se unen anticuerpos
anti-CD154. Dada la disminución de la sensibilidad
de CD154 humano a estos anticuerpos, el CD154 quimérico resultante
no es inmunogénico y de este modo no da como resultado la
neutralización del anticuerpo.
El primer subdominio de CD154 murino comprende
un subdominio del dominio IV, y un subdominio del dominio III en o
inmediatamente adyacente al extremo de los dominios III y IV que
corresponde a una parte de un sitio de escisión de CD154. El
segundo subdominio de CD154 humano también comprende un subdominio
del dominio IV. En realizaciones preferidas, los dominios I - III
también comprenden CD154 murino. Los ejemplos de tales
construcciones quiméricas preferidas se proporcionan como SEQ ID.
NOS. 13, 15, 17, 19, 21 y 23, que corresponden a ISF 30, 32, 34,
36, 38 y 40. Esta homología de estas construcciones quiméricas con
CD154 murino y humano se representa por la siguiente Tabla
IV.:
Como alternativa, los dominios I - III pueden
comprender CD154 humano. Los ejemplos de tales construcciones
preferidas se proporcionan como SEQ ID. NOS. 14, 16, 18, 20, 22 y
24, correspondientes a ISF 31, 33, 35, 37, 39 y 41. La homología de
estas construcciones quiméricas con CD154 murino y humano se
representa por la siguiente Tabla V.
La presente invención también contempla un
vector de expresión o cualquier otra construcción genética que
comprende una secuencia de polinucleótidos de la presente invención
capaz de expresar un CD154 quimérico en una célula diana.
Un vector de expresión útil en la presente
invención contiene una secuencia de polinucleótidos que codifica un
CD154 quimérico unido de manera operativa a una secuencia de
nucleótidos reguladora de transcripción o de traducción adecuada,
tal como la derivada de un gen de mamífero, microbio, viral, o
insecto. Tales secuencias reguladoras incluyen secuencias que
tienen un papel regulador en la expresión génica, tal como un
promotor o potenciador de la transcripción, una secuencia de
operador para controlar la transcripción, una secuencia que
codifica un sito de unión ribosomal dentro del ARN mensajero, y
secuencias apropiadas que controlan la transcripción, inicio de la
traducción, o terminación de la transcripción.
Las secuencias reguladoras particularmente
útiles incluyen las regiones promotoras de diversos genes de
mamíferos, virales, microbianos y de insectos. La región promotora
dirige un inicio de la transcripción de un lado a otro y que
incluye la secuencia de polinucleótidos que codifica el CD154
quimérico de la presente invención. Las regiones promotoras útiles
incluyen el promotor encontrado en la repetición terminal larga
(LTR) del Virus de Sarcoma de Rous (RSV), región
potenciadora/promotora de citomegalovirus humano (CMV), promotores
lac, promotores aislados de adenovirus, y otros promotores
conocidos por los expertos en la técnica se entendería que son
útiles para la expresión de genes en células de eucariotas,
procariotas, virus, o microbianas. Otros promotores que son
particularmente útiles para expresar genes y proteínas dentro de
células eucarióticas incluyen secuencias promotoras y secuencias
potenciadotas de células de mamífero tales como las derivadas de
virus polioma, adenovirus, virus del simio 40 (SV40), y el
citomegalovirus humano. Son particularmente útiles los promotores
tempranos y tardíos virales, que típicamente se encuentran
adyacentes al origen viral de replicación in virus tal como el
SV40. Los expertos en la técnica entenderán que la selección de un
promotor útil particular depende de las líneas celulares y otros
diversos parámetros de la construcción genética a usar para
expresar una secuencia de polinucleótidos dentro de una línea
celular particular.
Ciertas construcciones genéticas contempladas
por la presente invención por lo tanto incluyen una secuencia de
polinucleótidos unidos operativamente a o bien una secuencia
promotora o una secuencia promotora y potenciadora y también unida
operativamente a una secuencia de poliadenilación que dirige la
terminación y poliadenilación de ARN mensajero. Preferiblemente, la
secuencia de polinucleótidos se construye usando el promotor de CMV
y la secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento
bovina.
La presente invención también contempla diversas
células huésped que se transforman o se transfectan con un vector
de expresión u otra construcción genética que contiene una
secuencia de polinucleótidos de la presente invención. Estas
células pueden ser células procarióticas o eucarióticas.
En algunas realizaciones preferidas las células
son células que presentan antígeno normales de un mamífero, tal
como monocitos, macrófagos, Células B, y similares. En otras
realizaciones preferidas, las células pueden ser células normales
que son capaces de estimular células que presentan antígeno
espectadoras cuando una secuencia de polinucleótidos de la presente
invención se introduce en estas células. La presente invención
también contempla células somáticas que no son naturalmente capaces
de presentar antígeno sistema inmune pero puede estar modificada
por ingeniería genética con los genes que codifican las moléculas
requeridas para la presentación de antígeno, y de esta manera
permitir que estas células actúen como células que presentan
antígeno artificiales. Una secuencia de polinucleótidos que
codifican un CD154 quimérico se puede después introducir en estas
células que presentan antígeno artificiales. Se conocen bien en la
bibliografía diversos ensayos para determinar si una célula
particular es capaz de funcionar como una célula que presenta
antígeno, tal como proliferación de células o la producción de
linfoquinas, y por lo tanto este aspecto de la presente invención
se puede determinar fácilmente.
Además de las células humanas normales
anteriores, la presente invención también contempla introducir una
secuencia de polinucleótidos que codifican un CD154 quimérico en
diversas células neoplásicas o malignas, tales como células del
sistema inmune y tumores sólidos. Tales células neoplásicas que se
contemplan incluyen células de leucemia, tales como leucemia
monolítica aguda (AML), leucemia mielomonocítica aguda (AMML),
leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia mielógena crónica o
leucemia mielomonocítica crónica (CMML). También se contemplan
células derivadas de linfomas, gliomas, cánceres de mama, cervical,
ovario, pulmón, vejiga, o de próstata.
Finalmente, en una realización preferida de la
presente invención, una secuencia de polinucleótidos que codifica
un CD154 quimérico se introduce en las células que expresan su
receptor afín, CD40, sobre la superficie de las células.
Reconociendo la interacción de CD154 y su
receptor afín en la regulación de la respuesta inmune, la presente
invención también contempla los usos como se definen en las
reivindicaciones 16 y 17. El medicamento mencionado en las
reivindicaciones 16 y 17 se pueden usar para incrementar la
concentración de un ligando estabilizado de membrana capaz de
unirse a CD40, o algún otro receptor afín para CD154, mediante la
introducción de la secuencia de polinucleótidos que codifica un
CD154 quimérico en una célula, por lo cual el CD154 quimérico es
menos susceptible a la escisión de la superficie de esa célula con
relación a CD154. Debido a que el CD154 quimérico es menos
susceptible a escisión proteolítica, tiene una capacidad
incrementada de unirse a su receptor afín e inducir o una respuesta
citolítica o una respuesta inmune.
El medicamento mencionado en las
reivindicaciones 16 y 17 puede ser útil para cualquier célula humana
que participa en una reacción inmune o bien como una diana para el
sistema inmune o como parte de la respuesta del sistema inmune
para la diana extraña. Tal medicamento se puede usar para
procedimientos ex vivo, procedimientos in vivo, y
diversos otros procedimientos que implican la inyección de
polinucleótidos o vectores en la célula huésped. El medicamento
también se puede usar para la inyección directa en el tumor o capa
del tumor.
También se describen en el presente documento
procedimientos ex vivo que comprenden aislamiento de las
células de un animal o sujeto human. Una secuencia de
polinucleótidos que codifica un CD154 quimérico de la presente
invención se introduce en las células aisladas. Las células se
vuelven a introducir después en un sitio específico o directamente
en la circulación del sujeto. Los marcadores de superficie de la
célula, que incluyen moléculas tales como marcadores de tumor o
antígenos que identifican las células, se pueden usar para aislar de
manera específica estas células del sujeto.
El medicamento mencionado en las
reivindicaciones 16 y 17 también se puede usar para introducir una
secuencia de polinucleótidos que codifica un CD154 quimérico en las
células deseadas dentro del cuerpo de un animal o sujeto humano sin
retirar primero las células del sujeto. Los procedimientos para
introducir las secuencias de polinucleótidos en células específicas
in vivo, o dentro del cuerpo del sujeto se conocen bien e
incluyen el uso de vectores de expresión y dirige la inyección de
diversas construcciones genéticas en el sujeto. En una aplicación
típica, un vector de expresión que contiene una secuencia de
polinucleótidos de la presente invención se introduce en la
circulación o en un sitio localizado del sujeto para permitir que el
vector infecte de manera específica las células deseadas. En otros
ejemplos el vector se inyecta directamente en el la capa del tumor
presente en un sujeto que contiene al menos alguna de las células en
las que la secuencia de polinucleótidos de la presente invención se
va a introducir.
También se describe en el presente documento la
inyección directa en un animal o sujeto humano de una construcción
genética de la presente invención, de esta manera incluye una
secuencia de polinucleótidos que codifica un CD154 quimérico, y
puede adicionalmente incluir un promotor y una secuencia de
poliadenilación. Los ejemplos de tales procedimientos útiles se han
descrito (Vile et al, Ann Oncol, 5: 59-65,
1994). La construcción genética también se puede inyectar
directamente en el músculo u otros sitios de un animal o sujeto
humano o directamente en el tumor o capa del tumor del sujeto.
También se describen en el presente documento
procedimientos de tratamiento de neoplasia, que comprende la
inserción, en una célula neoplásica de una secuencia de
polinucleótidos de la presente invención, de manera que el CD154
quimérico se expresa sobre la superficie de las células neoplásicas.
También se describe en el presente documento el tratamiento de
neoplasia humana tanto in vivo como ex vivo.
En un procedimiento preferido de tratamiento de
neoplasia, el procedimiento además comprende las etapas de obtener
primero las células neoplásicas de un sujeto, que se inserta en
ellas un secuencia de polinucleótidos de la presente invención de
manera que un CD154 quimérico se expresa sobre la superficie de las
células neoplásicas, y la readministración de las células de
nuevo en el sujeto. Los expertos en la técnica entenderán que se
pueden aplicar numerosos procedimientos para la readministración de
las células neoplásicas en el sujeto.
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Los genes de Ligando de Molécula Quimérica
Accesoria de SEQ ID NO. 1 - SEQ ID NO. 12 (aka ISF
30-ISF41) se preparan y se clonan como sigue:
Las construcciones quiméricas de la presente
invención se diseñaron mediante dos procedimientos caracterizados
de trama de fusión génica y mutagénesis dirigida al sitio. La
sustitución de dominios grandes, por ejemplo fusión de la región
del dominio IV seres humanos en los dominios I-III
se ratón, se llevó a cabo mediante la técnica de fusión génica
descrita por Ho48. Los reemplazos de genes más pequeños o
sustituciones de aminoácidos se realizaron mediante un protocolo de
mutagénesis dirigida al sitio de "cambio rápido" descrito por
Stratagene, Inc (La Jolla, CA). Los genes de ISF quiméricos se
subclonaron en el vector de expresión subcariótico pcDNA3
(invitrogen, Inc. La Jolla, CA). La inserción de ISF quimérica está
flanqueada por el promotor de CMV heterólogo y la secuencia de
poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina.
Los plásmidos ISF-pcDNA3 se
digirieron con las enzimas de restricción NruI y Sma I para liberar
un fragmento de ADN que contiene el promotor de CMV de pCDNA3, el
gen de CD154 quimérico, y la señal de poliadenilación de pCDNA3.
Después de la purificación en gel de este fragmento mediante
separación del ADN digerido sobre un gel de agarosa al 1%, el
fragmento de ADN se ligó en el sitio EcoRV del vector de
transferencia adenoviral MCS (SK) pXCX2. Este plásmido es una
modificación del plásmido pXCX2 de manera que la secuencia
poliengarce pBluescript se ha clonado en la región E1, (J. R.
Tozer, UCSD, datos no publicados, septiembre 1993). Después de la
purificación del plásmido ISF-MCS (SK) pXCX2
quimérico, 5 ug de este plásmido de transferencia se transfectó
conjuntamente con 5 ug de plásmido JM17 en las células 293AC2 usando
el fosfato de calcio El kit Profection de Promega de acuerdo con
las instrucciones del fabricante. Después de la transfección, se
cultivaron las células durante 5 días para permitir la
recombinación homóloga y síntesis viral. Las células totales y
sobrenadante se recogieron después y se congelaron - descongelaron
tres veces para liberar el adenovirus asociado a célula.
Después de la producción inicial viral, un
aislamiento clonal del virus se obtuvo mediante purificación en
placa. En resumen, el sobrenadante viral congelado - descongelado
se eliminó de los desechos mediante centrifugación a 1000 rpm en
una centrífuga de mesa durante 5 minutos. Las células 293AC2
desarrolladas hasta confluencia en placas de cultivo de 6 pocillos
se infectaron con diluciones en serie del sobrenadante viral durante
1-2 horas. Después de la infección, se aspiró el
medio y las células se cubrieron con medio DMEM que contenía suero
de ternera fetal al 4% y agarosa al 0,65% mantenido a 56ºC. Después
de 4-6 días de incubación, se recogieron las placas
aisladas en 1 ml de medio y se usó posteriormente para amplificación
viral.
Las preparaciones de adenovirus a gran escala se
prepararon mediante infección sucesiva de cantidades crecientes de
293AC2. El adenovirus purificado se purificó después sobre
gradientes por etapas de cloruro de sodio. Este procedimiento hace
uso de un gradiente de cloruro de cesio para concentrar las
partículas de virus mediante un gradiente por etapas, con las
densidades de 1,45 g/cm^{3} y 1,20 g/cm^{3}, en la que las
muestras de virus 293AC2 expandidos se centrifugaron durante 2
horas en un rotor SW40 (Beckman, Brea, CA) a 25,000 rpm a 4ºC. La
banda de virus se aísla usando una aguja de galga 27 y una jeringa y
se desaló usando una columna de calidad Sephadex
G-25 DNA (Pharmacia, Piscataway, NJ). El virus se
desala contra solución salina tamponada con fosfato que contenía
glicerol al 10% y se almacenó a -70ºC. La titulación final del virus
se determinó mediante HPLC de intercambio
aniónico.
aniónico.
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La Figura 3 muestra que la expresión de muchos
del panel de las construcciones de ISF, es decir,
ISF30-ISF39, sobre HeLa después de la transfección
de estas células con el plásmido pcDNA3 que contiene cada
construcción de ISF respectiva. Células HeLa se transfectaron de
manera transitoria con plásmido ISF-pcDNA3 usando
lipofectamina 2000 (Gibco-BRL), un reactivo de
transfección basado en liposoma que permite una transferencia de
genes eficaz en HeLa. Dos días después de la transfección, las
células se analizaron para determinar la expresión de la superficie
de la célula del CD154 quimérico mediante citometría de flujo. En
resumen, las células adherentes se separaron de los pocillos
mediante aspiración del medio y adición de la solución de separación
(PBS que contenía 10 mM EDTA, pH 8). Esta solución de separación
se usa en lugar del tampón de tripsinización más común para evitar
la escisión no específica de CD154 en los sitios sensibles a
tripsina, de esta manera conduciendo potencialmente a la falsa
determinación negativa de la expresión. Una vez que las células se
han separado de la placa, las células se lavan una vez en tampón de
tinción de FACS (compuesto por PBS que contiene 3% de FCS y 0,05%
de azida de sodio), se volvieron a suspender en tampón FACS hasta
aproximadamente 10^{7} células/ml, y 5x10^{5} (50 ul) células
se sembraron en placas de micopocillos de plástico de fondo en U de
96 pocillos. Anticuerpo conjugado a PE específico para CD154 (clon
de anticuerpo MR-1, Pharmingen, Inc.) se añade
durante 30 minutos a 4ºC. Las células se lavaron después dos veces
con tampón FACS, se volvieron a suspender en tampón FACS, y se
transfirieron a tubos FACS para la adquisición de datos. Para
controlar la unión a anticuerpos no específicos, todas las muestras
se tiñeron con anticuerpos de control de isotipos apropiados.
Además, las células muertas y desechos se excluyen de análisis
mediante la adición de 10 ng/ml de yoduro de propidio a todas las
reacciones de tinción. Las células se analizan mediante citometría
de flujo para determinar la expresión de CD154 usando un citómetro
de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson).
Los resultados dados en la figura 3 muestran que
los vectores de CD154 quiméricos se expresan todos como ligandos de
superficie de la célula que se pueden detectar con anticuerpo
específico de CD154, que sugiere que se mantiene la estructura
terciaria de la proteína global. Además, la expresión en superficie
es equivalente o mejor que CD154 murino.
La Figura 4 muestra la capacidad funcional de
varias construcciones del panel de ISF descrita en la figura 2
para activar las Células B Ramos, una línea de células positivas de
CD40. Las células Ramos se cubrieron sobre las células HeLa
transfectadas con ISF-pcDNA3 como se ha descrito
anteriormente. Un día después de recubrirlas, las Células Ramos no
adherentes se recogieron y se analizaron para la expresión de CD70 y
expresión de CD95 mediante citometría de flujo. Estos dos
marcadores de la superficie se expresan a niveles mayores después
de la activación de CD40. (Kato K. et al., J. Clin. Invest.,
104: 947-955, 1999.) Estos datos muestran que todos
los datos de ISF activan las Células Ramos con intensidad
equivalente a la de CD154 murino nativo. Esto además prueba que la
estructura de proteína terciaria de CD154 y especificidad de
receptor se mantiene en las construcciones de CD154 quimérico.
La Figura 5 muestra la sensibilidad de las
construcciones de ISF para el plasma del paciente de CLL, recogido
del ensayo clínico de fase I de CD154, que contiene anticuerpo capaz
de neutralizar la función de CD154 murino nativo. En resumen,
Células Ramos se cubrieron sobre las Células HeLa transfectadas con
ISF-pcDNA3 como se ha descrito en la figura 3.
Después del mismo tiempo, plasma de paciente que contiene
anticuerpo neutralizante de mCD154 se añadió durante la incubación
conjunta. Después de un día de incubación, las Células Ramos se
recogieron y se analizaron para determinar la expresión en
superficie de CD70 y CD95 como se describe en la figura 4. Estos
datos muestran que el plasma del paciente inhibe la activación de
mCD154 de Ramos, como se esperaba. Por el contrario, el plasma del
paciente no inhibía la función de ISF.
Además, las construcciones de ISF se ensayaron
para determinar la unión de anticuerpo específico de CD154 en un
plasma del paciente como otra medida de inmunogenicidad. De nuevo,
Células HeLa transfectadas con los plásmidos
ISF-pcDNA3 se incubaron con diluciones en serie del
plasma del paciente durante 30 minutos a 4ºC. Las células se
lavaron después de anticuerpo no unido y se tiñeron con anticuerpo
marcado fluorescente específico para inmunoglobulina (lg) humana.
Después de esta tinción secundaria, las células se lavaron y se
analizaron mediante FACS. La Figura 6 menos unión de anticuerpos
del plasma del paciente descrito en la figura 5 a construcciones
representativas de ISF comparado con mCD154. Aunque una pequeña
cantidad de anticuerpo unido se puede detectar, obviamente esto no
es peligroso para la función de ISF basándose en los resultados de
la (figura 4). Además, se detecta menos unión de anticuerpo sobre
ISF35 que ISF30. Estos resultados se explican por el hecho que
ISF35 contiene más regiones de CD154 humano que ISF30 (véase la
figura 2). Conjuntamente, los resultados de la figura 5 y figura 6
satisfacen los criterios de la construcción optimizada de CD154 ya
que las construcciones de ISF carecen de regiones inmunogénicas
responsables de la neutralización del ligando por los anticuerpos
generados por el paciente.
Adenovirus recombinante que codifica cada
transgen de ISF se ensayó para determinar su capacidad de infectar
HeLa y que conducen a la expresión en membrana de ISF. La Figura 7
muestra la expresión de construcciones de ISF sobre Células HeLa
infectadas con multiplicidad creciente de relaciones de infección
(M.O.I) de adenovirus en comparación con las células infectadas con
adenovirus que codifican CD154 murino (Ad-mCD154).
Primero, estos datos muestran que los vectores de adenovirus están
intactos y contienen el transgen de ISF de interés. Segundo, estos
datos además confirman que las construcciones de ISF se expresan con
al menos capacidad equivalente a la de mCD154. Como tal, el estado
quimérico de las Construcciones de ISF no es perjudicial para la
expresión en una línea celular altamente permisiva para la
infección de adenovirus y expresión de CD154.
La Figura 8 muestra la expresión de
construcciones de ISF sobre Células B de CLL después de la infección
con los vectores de adenovirus descritos anteriormente. De manera
diferente HeLa CLL es difícil de infectar con adenovirus y evita la
expresión de CD154 humano. Como se puede observar, las
construcciones de ISF se pueden expresar sobre las células de CLL
después de la infección con adenovirus con intensidad de expresión
similar a la de mCD154. De esta manera, estos vectores satisfacen
otros criterios para una construcción de CD154 optimizada, a saber,
expresión en tipos de células resistentes a la expresión de CD154
humano.
Como otro criterio para una construcción
preferida de CD154, Células B de CLL se examinaron para la
activación de células después de la infección con los vectores de
adenovirus que codifican las construcciones de ISF descritas en la
Figura 8. Dos días después de la infección, células de CLL se
tiñeron para modulación de un panel de marcadores de superficie
característicos de la activación de CD40. La Figura 9 muestra la
expresión de ISF que da como resultado cambios en la expresión de
estos marcadores. Los cambios eran equivalentes o mayores que las
células infectadas con Ad-mCD154.
Finalmente, como se aprecia en la Figura 10, al
menos uno de los polipéptidos de CD154 quiméricos de la presente
invención es significativamente más estable y resistente a la
escisión proteolítica cuando se compara con CD154 humano que se
sabe que se escinde proteolíticamente en una molécula soluble
después de la expresión por las células. Las células HeLa estaban o
bien no infectadas o infectadas con adenovirus que codifican o bien
CD154 humano o ISF35 a una MOI de 10. Dos días después de la
infección, el sobrenadante del cultivo se recoge y se mide para
determinar la presencia de ligando soluble usando un ELISA (ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas) específico de CD154 humano. La
cantidad de CD154 soluble se calculó basándose en la valoración de
una cantidad conocida de proteína de fusión ligando deCD40 -CD8
soluble en el ELISA (Ancell Inc.). la cantidad de ligando soluble
detectado en el sobrenadante se representa gráficamente en el
gráfico de barras de la figura 10. Esta representación gráfica
muestra que ISF35 es resistente a escisión proteolítica en el
ligando soluble ya que se puede detectar ISF35 no soluble. Por el
contrario, CD154 humano se escinde fácilmente en CD154 soluble a
niveles > 120 ng/ml. Además, la ausencia de ISF35 soluble no se
debía a la carencia de expresión de ISF35 por las Células HeLa ya
que el análisis de FACS de las Células HeLa infectadas mostró la
expresión en la superficie de la célula de ISF35 a niveles similares
a los que se muestran en la figura 6.
Aunque se han mostrado y descrito las
realizaciones del procedimiento y aparatos, será evidente para los
expertos en la técnica que se puede realizar numerosas alteraciones
sin salirse del alcance de la invención.
La invención no se debe limitar excepto de
acuerdo con las siguientes reivindicaciones y sus equivalentes
legales.
<110> Prussak, Charles E.
\hskip1cm Kipps, Thomas J.
\hskip1cm Cantwell, Mark J.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> CD154 quimérico novedosos
\vskip0.400000\baselineskip
<130> UCSD 263/094
\vskip0.400000\baselineskip
<140> US 10/154,759
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2002-05-23
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 783
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción de ADN quimérica
ISF30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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<210> 2
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<211> 759
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Construcción de ADN quimérica
ISF31
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 783
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Construcción de ADN quimérica
ISF32
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 759
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Construcción de ADN quimérica
ISF33
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 783
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Construcción de ADN quimérica
ISF34
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 759
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Construcción de ADN quimérica
ISF35
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 783
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Construcción quimérica ISF36
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 759
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Construcción de ADN quimérica
ISF37
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 783
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Construcción de ADN quimérica
ISF38
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 759
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Construcción de ADN quimérica
ISF39
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 783
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Construcción de ADN quimérica
ISF40
\newpage
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<400> 11
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<210> 12
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<211> 759
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Construcción de ADN quimérica
ISF41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
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<210> 13
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<211> 260
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polipéptido de CD154 quimérico
codificado por la secuencia de ADN de SEQ ID NO.: 1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
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<211> 252
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polipéptido de CD154 quimérico
codificado por la secuencia de ADN de SEQ ID NO.: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 15
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<211> 260
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polipéptido de CD154 quimérico
codificado por la secuencia de ADN de SEQ ID NO.: 3
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
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<211> 252
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polipéptido de CD154 quimérico
codificado por la secuencia de ADN de SEQ ID NO.: 4
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<400> 16
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<210> 17
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<211> 260
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Polipéptido de CD154 quimérico
codificado por la secuencia de ADN de SEQ ID NO.: 5
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<400> 17
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<210> 18
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<211> 252
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Polipéptido de CD154 quimérico
codificado por la secuencia de ADN de SEQ ID NO.: 6
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<400> 18
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Polipéptidos de CD154 quimérico
codificados por la secuencia de ADN de SEQ ID NO.: 7
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Polipéptido de CD154 quimérico
codificado por la secuencia de ADN de SEQ ID NO.: 8
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<400> 20
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<213> Secuencia artificial
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<223> Polipéptido de CD154 quimérico
codificado por la secuencia de ADN de SEQ ID NO.: 9
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<213> Secuencia artificial
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<223> Polipéptido de CD154 quimérico
codificado por la secuencia de ADN de SEQ ID NO.: 10
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<400> 22
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Polipéptido de CD154 quimérico
codificado por la secuencia de ADN de SEQ ID NO.: 11
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<400> 23
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<213> Secuencia artificial
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<223> Polipéptido de CD154 quimérico
codificado por la secuencia de ADN de SEQ ID NO.: 12
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<400> 24
Claims (17)
1. Una molécula de ácido nucleico que tiene una
secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo constituido
por SEQ ID NOS. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12.
2. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1, en la que molécula de ácido nucleico tiene una
secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo constituido
por SEQ ID NOS. 2, 4, 6, 8, 10 y 12.
3. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1, en la que molécula de ácido nucleico tiene una
secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos
seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID NOS. 14, 16, 18,
20, 22, y 24.
4. Un vector de expresión, que comprende la
molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.
5. El vector de expresión de la reivindicación
4, que comprende además ADN viral o ADN bacteriano.
6. El vector de expresión de la reivindicación
5, en el que dicho ADN viral se selecciona entre el grupo
constituido por ADN adenoviral y ADN retroviral.
7. El vector de expresión de la reivindicación
6, en el que al menos una parte del vector comprende ADN
adenoviral.
8. Una construcción genética que comprende la
molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 unida de manera
operativa a una secuencia de promotor y a una secuencia de señal de
poliadenilación.
9. Una célula huésped, que comprende un vector
de expresión de la reivindicación 4 o una construcción genética de
la reivindicación 8.
10. La célula huésped de la reivindicación 9, en
la que la célula es una célula CD40^{+} humana.
11. La célula huésped de la reivindicación 9, en
la que la célula es una célula tumoral.
12. La célula huésped de la reivindicación 9, en
la que la célula es una célula que presenta antígeno.
13. La célula huésped de cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 12, en la que la célula es una célula B.
14. Un polipéptido de CD154 quimérico que tiene
una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido
por SEQ ID NOS. 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 y
29.
15. Un procedimiento para producir un CD154
quimérico de la reivindicación 14, que comprende cultivar una
célula huésped de la reivindicación 9 en condiciones adecuadas para
efectuar la expresión de la proteína.
16. Uso de una molécula de ácido nucleico que
codifica un polipéptido de CD154 quimérico de acuerdo con
reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para inducir
la activación de una célula del sistema inmune, en el que CD154
quimérico se expresa sobre la superficie de la célula.
17. Uso de acuerdo con reivindicación 16, en el
que la célula es una célula CD40^{+} humana.
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