PT1509253E - Cd154 quimérico novo - Google Patents

Description

1 DESCRIÇÃO "CD154 QUIMÉRICO"

Campo técnico da invenção A presente invenção refere-se aos campos da bioquimica, imunologia, engenharia genética e medicina. Em particular, refere-se a novos ligandos quiméricos que, quando expressos na superfície de uma célula, são mais estáveis do que o ligando nativo correspondente, mas retêm a função de ligação do receptor do ligando nativo e não são imunogénicos.

Antecedentes da invenção 0 sistema imunitário elimina células malignas reconhecendo-as como estranhas e eliminando-as do corpo, Para tal, o sistema imunitário desencadeia uma resposta de anticorpos e uma resposta celular. Ambas estas respostas exigem interacção entre várias células diferentes do sistema imunitário (Abbas, Cellular and Molecular

Immunology, 2000). Uma reacção imunitária começa tipicamente com um linfócito T (célula T) que tem na respectiva superfície um receptor de células T (TCR) que se liga a um peptídeo derivado de antigénio associado a uma molécula do complexo major de histo-compatibilidade (MHC) de classe II. A célula T expressa igualmente na sua superfície vários polipeptídeos que são designados como "ligandos" porque se ligam a receptores em células associadas a uma resposta mediada imunologicamente, como descrito mais detalhadamente em seguida. Quando o receptor 2 de célula T se liga a um antigénio associado a MHC, tal como um antigénio derivado de uma célula maligna, torna-se activo e expressa um ligando na sua superfície. 0 ligando apenas está presente na superfície da célula por pouco tempo e assim que é removido da superfície da célula, perde-se a capacidade da célula T se ligar a uma célula com receptor. Um ligando desses é designado CD154 CD154 é um membro de uma grande família de ligandos, chamada colectivamente a superfamília TNF (Gruss et al, Cytokines Mol Ther, 1:75-105, 1995 e Locksley et al, Cell, 104:487-501, 2001). Os membros da superfamília TNF incluem o ligando ("FasL"), TNFa, LTa, linfotoxina (ΤΝΒβ), CD154, TRAIL, CD7 0, ligando CD30, ligando 4-1BB, APRIL, TWEAK, ligando RANK, LIGHT, ligando AITR, ectodisplasina, BLYS, VEGI, e ligando 0X40. Os membros da superfamília TNF partilham uma estrutura secundária conservada, compreendendo quatro domínios: O domínio I, o domínio intracelular; o domínio II, que estende a membrana celular e é conhecido como domínio transmembranar, domínio III, que consiste nos aminoácidos extracelulares mais próximos da membrana celular e domínio IV, o domínio extracelular distai (Kipps et al., WO98/26061 publicado a 18 de Junho de 1998). Tipicamente, pelo menos uma parte do domínio IV pode ser clivada da molécula progenitora. O fragmento clivado exibe frequentemente a mesma actividade biológica do ligando intacto e é convencionalmente designado por a "forma solúvel" do membro da família TNF.I) Actividade biológica de CD154

As interacções entre o CD154 (também conhecido por ligando CD40) e respectivo receptor cognato CD40 são críticas para o reconhecimento imunológico. (Banchereau J. 3 et al., Annu. Rev. Immunol. 12:881-922, 1994; Laman J.D. et al., Crit. Rev. Immunol., 16:59-108, 1996). CD154 é expresso temporariamente em células T CD4+ depois de activação do receptor das células T por células apresentadoras de antigénios através de moléculas de classe II MHC. (Roy M. et al., J. Immunol., 151:2497-2510, 1993; Hepmann P. et al., Eur. J. Immunol., 23:961-964, 1993; Castle B.E. et al., J. Immunol., 151:1777-1788, 1993; Cantwell M. et al., Nat. Med., 3:984-989, 1997). Por seu lado, pode-se assim provocar a activação de células apresentadoras de antigénios que expressam CD40 (APCs), incluindo células B, células dendriticas e macrófagos. (Ranheim E.A. et al., J. Exp. Med., 177:925-935, 1993; Ranheim E.A. et al., Cell. Immunol., 161:226-235, 1995). Estas células activadas CD40 podem desencadear uma cascata de eventos imunoactivadores que conduzem a uma resposta imunitária especifica e eficaz contra antigénios estranhos, tais como vírus e tumores. A importância das interacções entre CD40 e CD154 é subestimada pela descoberta de que os indivíduos com deficiências herdadas do ligando para CD40 têm uma deficiência imunológica profunda. (Korthauer J. et al., Nature, 361:539-541, 1993; Aruffo A. et al., Cell., 72:291-300, 1993). Estes doentes têm uma síndroma de imunodeficiência herdada associada a uma formação de centro germinal deficiente, permuta de deficiente e susceptibilidade marcada a vários agentes patogénicos bacterianos e virais.

Porque a CD154 é uma molécula crítica na imuno-regulação existem vários mecanismos que controlam a expressão da CD154 humana. Primeiro, a CD154 expressa na membrana pode ser clivada e é libertada sob forma de 4 molécula solúvel uma porção extracelular de CD154 capaz de ligar o receptor CD154, CD40. Tem-se demonstrado que as enzimas de clivagem proteolítica clivam o CD154 em locais diferentes ao longo do ligando e libertam uma forma solúvel de CD154 que é capaz de ligar a CD40 e estimular uma resposta imunitária. (Pietravalle F. et al., J. Biol. Chem., 271:5965-5967, 1996; Pietravalle F. et al., Eur. J. Immunol., 26:725-728, 1996). Por exemplo, Um estudo demonstrou que CD154 é clivado entre Phe 111 e Ala 123 (Pietravalle F. et al., Eur. J. Immunol., 26:725-728, 1996), e foi também descrita a clivagem em Met 113. Segundo, a interacção de CD154 com o seu receptor cognato pode induzir uma rápida diminuição da modulação da expressão de superfície de CD154. (Cantwell M. et al., Nat. Med., 3:984-989, 1997). Terceiro, a transcrição do gene CD154 é rigorosamente regulada com a expressão máxima do ligando 4 a 6 horas após a ligação TCR seguida de rápidas diminuições do ARN CD154 e síntese proteica, (ld.)

Em conjunto, estes mecanismos reguladores garantem a especificidade de uma resposta imunitária a um antigénio específico. A importância de manter um controlo rigoroso da expressão de CD154 encontra-se ilustrada em indivíduos com lúpus sistémico eritematoso (SLE). Estes doentes aparentemente hiper-expressam CD154 e possuem ainda níveis elevados de CD154 solúvel no seu plasma, sugerindo que uma expressão descontrolada de CD154 contribui para a actividade da doença SLE. (Kato K. et al., J. Clin. Invest., 101: 1133-1141, 1998; Vakkalanka R.K., Arthritis Rheum., 42:871-881, 1999). 0 potencial da utilização de CD154 para imunoterapia está a ser activamente investigado. Porque a CD154 é um 5 potente activador imunológico, a CD154 enquanto terapia do cancro está no centro das atenções da investigação porque as células neoplásicas são geralmente fracos apresentadores do antigénio e incapazes de estimular vigorosamente respostas anti-tumorais. Por exemplo, a leucemia linfocitica crónica (CLL), células B modificadas para exprimir CD154 utilizando um vector adenovirus de replicação deficiente pode intensificar a apresentação do antigénio CLL e induzir a citotoxicidade das células T autólogas para com células B CLL não modificadas- (Kato K. et al., J. Clin. Invest., 101:1133-1141, 1998). Além disso, um estudo clinico de fase I com células B modificadas Ad-CD154 revelou resultados terapêuticos promissores. (Wierda W.G: et al., Blood, 96:2917-2924, 2000). De modo semelhante, outros estudos revelaram que as modificações de uma série de tipos de tumores para expressar CD154 podem induzir respostas imunitárias anti-tumor eficazes em modelos animais.

Estudos envolvendo a manipulação de células B e outros tumores funcionam seja intensificando a apresentação de antigénios da própria célula neoplásica, como no caso de CLL e linfoma das células B, ou activando células apresentadoras de antigénios próximas, tais como células dendriticas que podem iniciar uma resposta imunitária anti-tumor, tal como é o caso dos tumores CD4O-negativos. No entanto, estudos adicionais sugerem também que CD154 poderá ter um efeito directo inibidor do crescimento em certos tumores, especialmente na mama. (Tong A.W. et al., Clin. Câncer Des., 7:691-703, 2001; Hirano A., Blood, 93:2999-3007, 1999) . Além disso, há sinais que o crescimento de alguns tipos de linfoma pode ser inibidos directamente por 6 ligação D40. (Wilsey J.A. et al., J. Immunol., 158:2932-2938, 1997). Assim, uma vasta gama de tumores deverá ser sensível a imunoterapia com CD154. II) Desvantagens das actuais construções CD154

Embora CD154 seja potencialmente ponderosa do ponto de vista terapêutico, a forma de CD154 utilizada em terapias clínicas terá provavelmente um grande impacto na segurança e eficácia.

Por exemplo, CD154 solúvel recombinante (rsCDl543), constituído apenas pelo domínio extracelular, de ligação ao receptor de CD1543 é funcional. (Armitage R.J., Eur. J.Immunol., 23:2326-2331, 1993; Lane P., J. Exp. Med., 177: 1209-1213, 1993) . No entanto, rsCD154 não é tão eficaz quanto o CD154 nativo expresso na membrana celular para induzir a sinalização de CD40, porque a sinalização óptima exige multimerização dos receptores Cd40 na superfície da célula. (Schwabe R.F. et al., Hybridoma, 16:217-226, 1997). Em resultado, os domínios de multimerização do ligando foram manipulados tal como zippers leucina ou domínios CD8, no domínio n-terminal de rsCD154 para intensificar a sinalização do receptor. (Lans P., et al., J. Exp. Med. 177:1209-1213, 1993; Morris A.E., J. Biol. Chem. 274:418-423, 1999). Do mesmo modo, CD154 solúvel não é óptimo para interligar CD40, uma vez que não proporciona uma estimulação tão intensa das células apresentadoras de antigénio em comparação com o CD154 expresso na membrana-

Além disso, reagentes solúveis que medeiam a sinalização CD40 podem desencadear efeitos fisiológicos adversos. Por exemplo, ratinhos injectados com a proteína de fusão CD154-Cd8 desenvolveram inflamação pulmonar. 7 (Wiley J.A. et al., J. Immunol., 158:2 932-2 938, 1997). Do mesmo modo, a administração de anticorpos monoclonais activadores de CD40 a ratinhos imunocomprometidos induziu lesões intestinais que foram fatais. (Hixon J.A. et al., Biol. Blood Marrow Transplant., 7:136-143, 2001). A toxicidade associada à administração sistémica de CD154 solúvel parece ser uma caracteristica geral da família TNF, uma vez que os efeitos negativos são também observados na sequência da administração de TNF-cx, FasL e TRAIL.

Outra desvantagem do CD154 solúvel reside no curto tempo de semivida dos membros da família TNF solúveis na sequência da administração sistémica. (Spriss D.R. et al., Ciba Found. Symp., 131:206-227, 1987; Funahashi I. et al., Br. J. Câncer, 67:447-455) . Este tempo de semivida implicaria a administração de doses maiores de rsCD154 ou perfusão contínua por um período de tempo, o que não só aumenta as hipótese de toxicidade como também exigiria o isolamento de grandes quantidades de proteína rsCD154, um processo difícil e moroso.

Devido a problemas inerentes da utilização de CD154 solúvel, CD154 humano integral expresso na membrana parece ser a melhor alternativa. No entanto, CD154 humano native possui também características que podem limitar a sua eficácia ou segurança. Como anteriormente mencionado, CD154 integral é clivado e liberta uma molécula solúvel, permitindo potencialmente níveis de toxicidade semelhantes aos descritos para rsCD154. Além disso, a clivagem proteolítica de CD154 ligado à membrana poderá diminuir a sua actividade funcional. Embora a eliminação de locais de clivagem putativos de CD154 possa diminuir o seu metabolismo, não elimina completamente o processamento de 8 CD154 uma vez que existem múltiplos locais de clivagem proteolíticos. (Mazzei G.J. et •D i—1 (ΰ Biol. Chem., 270:7025-7028, 1995; Pistravalle F. et al., J. Biol. Chem., 271:5965-5967, 1996). Além disso, um problema menos evidente associado à utilização de CD154 integral humano reside na sua expressão específica do tipo de células. Por exemplo, certos tipos de células, especialmente células de origem célula B, excluem a expressão de CD1543 humano. (Kato K. et al., J. Clin. Invest., 101:1133-1141, 1998; Cantwell M. et al., Nat. Med., 3:984-989, 1997).

Curiosamente, CD154 de murino (mCD154) aparenta ser mais vantajoso do que o CD154 humano nativo ou rsCD154 para usos terapêuticos. O CD154 de murino é relativamente resistente à clivagem proteolítica em comparação com CD1543 humano. Além diss, mCD154 é expresso pela maioria dos tipos de células, incluindo células de origem célula B que excluem a expressão de CD154 humanos, frequentemente designado por células CD40+. (Id.) Assim, mCD154 foi expresso no ensaio clínico da terapia genética de CD154 de um tipo de células CD40+, uma célula CLL. (Wierda W.G., Blood, 96:2917-2924 (2000). WO 98/26061 A apresenta moléculas CD154 quiméricas em que domínios inteiros de CD154 foram trocados. Alguns domínios são de murino, enquanto outros são de origem humana. Além disso, algumas moléculas CD154 apresentadas em WO 98/26061 A compreendem um domínio extracelular desprovido de local de clivagem metaloprotease.

Ainda assim, mCD154 utilizado em seres humanos apresenta os seus próprios problemas. Por exemplo, após repetidas injecções de células CLL modificadas Ad-CD154 a 9 doentes, a redução de células leucémicas diminuiu a cada injecção subsequente. Três em quarto doentes com CLL tornaram-se refractários à actividade das células expressoras de mCD154 por altura da quinta injecção repetida. Esta perda de actividade deve-se provavelmente ao desenvolvimento de anticorpos contra a molécula CD154 de murino, impossibilitando a continuação dos tratamentos. As analises para determinar a formação de anticorpos de liqação e neutralização contra CD154 revelaram anticorpos CD154 anti-murino desenvolvidos por altura da terceira injecção repetida DE células CLL transduzidas Ad-mCD154. Além disso, os anticorpos anti-CD154 podiam também neutralizar a função CD154 de murino. Deste modo, apesar a sequrança global, estabilidade da expressão e eficácia a curto prazo de mCD154, a administração repetida a longo prazo de mCD154 em seres humanos será dificil.

Dadas as desvantagens das construções actuais de CD154, existe claramente a necessidade de uma construção de CD154 preferida para terapia de doenças, o qual possua as propriedades encontradas tanto no CD154 humano e CD154 de murino. Uma construção preferida de CD154 seria expressa em diversos tipos de células, incluindo células linfóides de origem em células B. Além disso, a construção CD154 seria estabilizada na membrana e resistente a clivagem proteolitica, tendo assim menos probabilidades de gerar a forma solúvel de CD154. No entanto, a construção de CD154 preferida iria manter a função de ligação do receptor de CD154 nativo. Encontram-se duas propriedades estas em mCD154. Além disso, uma construção de CD154 preferida não seria imunogénica no domínio crítico para a ligação do receptor na sequência de administração em seres humanos, 10 evitando assim neutralização funcional. A presente invenção proporciona uma construção CD154 assim.

Resumo da invenção A presente invenção refere-se a novos polipeptídeo CD154 quiméricos com as propriedades mais vantajosas do CD154 humano e CD154 de murino, e, enquanto tais, são seguros e eficazes para terapia de uma doença-Especificamente, a CD154 quimérica seria capaz de expressão em diversos tipos de células, incluindo células B. Seria menos resistente à clivagem proteolitica e, portanto, mais estável quando expressa em membranas celulares. Além disso, o CD154 quimérico não seria imunogénico e não seria, assim, neutralizado por anticorpos anti-CD154. Finalmente, manteria as capacidades de ligação ao receptor do CD154 humano e desencadearia o mesmo tipo de resposta imunitária em seres humanos.

Estes polipeptideos CD154 quiméricos novos são quiméricos na medida em que são constituídos por domínios subdomínios CD154 de pelo menos duas espécies diferentes, nomeadamente CD154 humano e de ratinho. Estes polipeptídeos foram designados "factores imunoestimulantes" ou ISFs porque combinam regiões CD154 humanas e não-humanas para maximizar a estimulação da resposta imunitária.

Especificamente, pelo menos um domínio oiu subdomínio de CD154 que contenha um local de clivagem de CD154 é substituído por um domínio ou subdomínio correspondente de CD154 não-humano, de preferência CD154 de murino. Além disso, o polipeptídeo quimérico é constituído por um domínio ou subdomínio de CD154 humano que é responsável por ligar um receptor CD154. A presente invenção refere-se 11 também a novas sequências de polinucleótidos codificadoras de CD154 quimérico, vectores de expressão compreendendo as sequências de polinucleótidos novas e métodos de produção de CD154 quimérico. Finalmente, a presente invenção refere-se à utilização de uma molécula de ácido nucleico da presente invenção para a preparação de um medicamento destinado a induzir a activação de uma célula do sistema imunitário, em que o CD154 quimérico é expresso na superfície da célula. Num primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico com uma sequência de nucleótidos seleccionada do grupo constituído por SEQ ID NOS. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12.

Noutro aspecto, a presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico da presente invenção, possuindo a molécula de ácido nucleico uma sequência de nucleótidos seleccionada do grupo constituído por SEQ ID NOS 2, 4, 6, 8, 10 e 12. Noutro aspecto, a presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico da presente invenção, possuindo a molécula de ácido nucleico uma sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo constituído por SEQ ID NOS 14, 16, 18, 20, 22 e 24.

Noutro aspecto, a presente invenção refere-se a um vector de expressão compreendendo a molécula de ácido nucleico da presente invenção.

Noutro aspecto, a presente invenção refere-se a um vector de expressão da presente invenção, compreendendo ainda ADN virai ou ADN bacteriano.

Noutro aspecto, a presente invenção refere-se a um vector de expressão da presente invenção, sendo o ADN virai 12 mencionado seleccionado do grupo constituído por ADN adenoviral e ADN retroviral.

Noutro aspecto, a presente invenção refere-se a um vector de expressão da presente invenção, em que pelo menos uma porção do vector compreende ADN adenoviral.

Noutro aspecto, a presente invenção refere-se a uma construção genética compreendendo a molécula de ácido nucleico da presente invenção ligada operacionalmente a uma sequência promotora e a uma sequência de sinal de poliadenilação.

Noutro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula hospedeira compreendendo um vector de expressão da presente invenção ou uma construção genética da presente invenção.

Noutro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula hospedeira da presente invenção, em que a célula é uma célula CD40+ humana.

Noutro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula hospedeira da presente invenção, em que a célula é uma célula de tumor. Noutro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula hospedeira da presente invenção, em que a célula é uma célula apresentadora de antigénio.

Noutro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula hospedeira da presente invenção, em que a célula é uma célula B. Noutro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo CD154 quimérico com uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo constituído por SEQ ID NOS. 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 e 24. 13

Noutro aspecto, a presente invenção refere-se a um processo de produção de um CD154 quimérico da presente invenção, compreendendo a cultura de uma célula hospedeira da presente invenção nas condições adequadas à realização da expressão da proteina. Noutro aspecto, a presente invenção refere-se à utilização de uma molécula de ácido nucleico codificadora de um polipeptídeo CD154 quimérico de acordo com a presente invenção para a preparação de um medicamento destinado à activação da indução de uma célula do sistema imunitário, sendo o CD154 expresso na superfície da célula, por exemplo uma célula humana CD40+.

Breve descrição das figuras

Figura 1 A figura 1 é um diagrama esquemático que mostra a titulo de exemplo polinucleótidos codificadores de CD154 quimérico da presente invenção e indica a localização de subdominios associados a propriedades especificas do CD154 quimérico. Os domínios ou subdominios derivados de CD154 de murino encontram-se apresentados a sombreado.

Figura 2 A figura 2 representa uma série de histogramas de selecção de células activadas por fluorescência (FACS) que mostram a expressão de polipeptídeos de CD154 quimérico de exemplo da presente invenção, isto é ISF 30-ISF 39 em comparação com CD154 de murino (mCD154) e um plasmídeo de controlo pcDNA3 que não contém CD154. A expressão foi medida na sequência da transfecção de células HeLa com plasmídeos pcADN3, contendo mCD154 e cada construção ISF. A área a sombreado mostra a expressão de células HeLa não transfectadas e a área sem sombreado representa a expressão de células HeLa transfectadas. 14

Figura 3 A figura 3 é uma série de histogramas FACS que mostram a capacidade funcional de células HeLa transfectadas com polipeptideos CD154 quiméricos de exemplo da presente invenção, isto é ISF30-ISF399 em comparação com CD154 de murino (mCD154) e um plasmideo de controlo sem CD154 para activar a expressão de marcadores de superfície fenotípicos CD70 e CD95 por células B Ramos. A área a sombreado revela a expressão do marcador de superfície por células não activadas, a área sem sombreado sob a linha fina descreve a expressão de marcador de superfície de células B activadas por célula HeLa que foram transfectadas com plasmideo de controlo pcDNA3 e a área sem sombreado sob a linha a negrito mostra a expressão do marcador de superfície de células B activada por células HeLa que foram transfectadas com mCD154 ou uma construção ISF.

Figura 4 A figura 4 é uma série de histogramas FACS que mostram a sensibilidade dos polipeptideos CD1543 quiméricos de exemplo da presente invenção, isto é ISF30 - ISF39 em comparação com CD154 de murino (mCD154) e CD154 (hCDl54), na ligação por anticorpo em plasma do doente capaz de neutralizar a função CD154 de murino nativo. Esta sensibilidade foi medida por co-incubação de células B Ramos com células HeLa transfectadas com plasmideo pcDNA3 contendo mCD1543 ou uma das contruções ISF de exemplo, adicionando plasma contendo anticorpo neutralizador e, passado cerca de um dia de incubação, colhendo e analisando as células Ramos para detectar o a expressão do marcador de superfície cd70 e CD95. A área a sombreado revela que a expressão do marcador de superfície não está activada porque as células Ramos foram incubadas com células HeLa não transfectadas, a área sem sombreado sob a linha fina 15 mostra a expressão do marcador de superfície em células que foram incubadas com plasma contendo anticorpos e a área sombreada sob a linha a negrito mostra a expressão do marcador de superfície em células que não foram incubadas com plasma.

Figura 5 A figura 5 é uma série de histogramas FACS que revelam a sensibilidade dos polipeptídeo CD154 quiméricos seleccionados da presente invenção, ISF 30 e ISF 35, em comparação com CD154 de murino (mCDl54) e um plasmídeo de controlo aos anticorpos do plasma do doente capazes de neutralizar a função CD154. Esta sensibilidade foi medida na sequência da transfecção de células HeLa com plasmídeo pcDAN3 contendo mCD1543, ISF 30 e ISF 35 e incubação das células transfectadas com plasma do doente contendo anticorpos neutrlaizadores. A área sombreada mostra a quantidade de anticorpos ligados às células que não foram incubadas com plasma e a área sem sombreado revela a quantidade de anticorpos encontrada nas células que foram incubadas com plasma.

Figura 6 A figura 6 é uma série de histogramas FACS que mostra a expressão de polipeptídeos CD154 quiméricos seleccionados da presente invenção, ISF 32 e 35 em comparação com CD154 de murino (mCD154) em células HeLa infectadas com uma relação de multiplicidade de infecção (MOI) crescente de vectores de adenovírus contendo mCD154, ISF 32 e ISF 35. A área a sombreado mostra a expressão de células HeLa não transf ectadas e a área sem sombreado representa a expressão de células HeLa transfectadas com os vectores de adenovírus anteriormente descritos. 16

Figura 7 A figura 7 é uma série de histogramas FACS que mostram a expressão de células B CLL de polipeptideos CD154 seleccionados da presente invenção, ISF 32 e 35 em comparação com CD154 de murino (mCD154) e células não infectadas, na sequência de infecção com vectores de adenovirus mCD154, ISF 32 e ISF 35. A área a sombreado mostra a expressão de células B CLL não transfectadas e a área sem sombreado representa a expressão de células B CLL transfectadas com os vectores de adenovirus anteriormente descritos.

Figura 8 A figura 8 representa uma série de histogramas FACS que mostram a activação de células B CLL co-cultivadas com células HeLa expressoras dos polipeptideos CD154 seleccionados da presente invenção, ISF 32 e 35, em comparação com CD154 de murino (mCD154). Esta activação foi medida por meio de alterações na expressão de marcadores de superfície fenotípicos, CD80, CD70, CD86, CD95, CD54 e CD27 que são característicos da activação CD40. A área sombreada mostra a expressão do marcador de superfície de células B CLL não activadas, a área sem sombreado sob a linha fina mostra a activação de células B CLL que foram co-cultivadas com células HeLa transfectadas com adenovirus de controlo AD-LacZ, que não contêm CD154 e a área não sombreada sob a linha a negrito mostra a activação de células B CLL co-cultivadas com células HeLa transfectadas com mCD154, ISF 23 e ISF 35.

Figura 9 A figura 9 é uma série de histogramas FACS que mostram a expressão de polipeptideos CD154 quiméricos seleccionados da presente invenção ISF 5, ISF 12, ISF 24 e ISF 32 em comparação com CD154 humano e de murino na sequência da transfecção em células HeLa e células B CLL. A 17 área sombreada mostra a expressão em células não transfectadas e a área sem sombreado mostra a expressão em células transfectadas com cada uma das construções ISF. Esta figura indica que CD145 humano e de murino, bem como as construções ISF seleccionadas são expressos em células HeLa. No entanto, esta figura confirma ainda que as células B CLL excluem tipicamente a expressão de CD145 humano, mas não CD145 de murino. As células B CLL expressam duas das construções ISF, isto é ISF 5, que tem um domínio IV constituído completamente por CD145 de murino e ISF 32, que possui um domínio IV que está compreendido numa grande parte de CD145 de murino. Este facto indica que o elemento regulador que permite a expressão de CD145 de murino em células B CLL está localizado numa região do domínio IV. Assim, ISF 12 e ISF 24 não foram bem expressos por células B CLL porque o domínio IV de ISF 12 é constituído exclusivamente pod CD145 humano, enquanto o domínio IV de ISF 24 inclui CD145 de murino, mas também possui uma região de CD145 humano que inclui a região reguladora da expressão da molécula por células CLL,

Figura 10: A figura 10 é um gráfico de barras da quantidade de ligando solúvel gerado dois dias depois da infecção de células HeLa com adenovírus com um polipeptídeo CD145 quimérico seleccionado da presente invenção, ISF 35 e CD145 humano. A quantidade de CD145 solúvel gerado foi detectada com ELISA específico de CD145 humano (análise imunoabsorvente ligada a enzima) e foi calculada com base na titulação de uma quantidade conhecida de ligando CD40-proteína de fusão CD8 solúvel em ELISA. O gráfico mostra a resistência de ISF 35 para clivagem em ISF 35 em comparação com a clivagem de CD145 humano em CD145 solúvel e a 18 ausência de CD145 solúvel gerada por células não infectadas. ISF 35 é significativamente mais resistente à clivagem, não gerando ISF35. Em contraste, CD145 humano é facilmente clivado em CD145 solúvel a níveis > 120 ng/ml.

Descrição Pormenorizada da Presente Invenção

Definições

Tal como presentemente utilizado, o termo "CD145" ou "construção ISF guimérica" refere-se a um ligando constituído por pelo menos um domínio ou subdomínio de CD145 de uma espécie e pelo menos um domínio ou subdomínio de CD145 de uma espécie diferente. As pelo menos duas espécies das quais é derivado o CD145 quimérico da presente invenção são CD145 humano e de murino.

Tal como presentemente utilizado, o termo "subdomínio" refere-se a uma sequência de pelo menos dois aminoácidos que fazem parte de um domínio de CD145. Um "subdomínio" inclui também uma sequência de aminoácidos da qual foi eliminado um ou mais do que um aminoácido, incluindo um ou vários aminoácidos truncados de uma extremidade da sequência.

Tal como presentemente utilizado, o termo "local de clivagem" refere-se a uma sequência de aminoácidos que é reconhecida por proteases, tipicamente metaloproteases de matriz (mmp) que clivam CD145 da superfície da célula expressora. O local de clivagem de CD145 encontra-se tipicamente em ou em torno dos limites dos domínios III e IV de CD145. De acordo com a invenção, um local de clivagem assim inclui a região aproximadamente entre os aminoácidos 108 e 116 de CD145 humano. 19

Tal como presentemente utilizado, o termo "correspondente" refere-se à sequência de nucleótidos ou aminoácidos de CD145 de uma espécie que é homóloga a uma sequência de nucleótidos ou aminoácidos de CD145 de outras espécies. Esta homologia baseia-se na semelhança da estrutura secundária, tal como a localização de limites do domínio, entre CD145 de espécies diferentes (vide quadro I seguinte).

Tal como presentemente utilizado, a frase "menos susceptível à clivagem" refere-se a uma maior resistência de um CD145 quimérico à clivagem proteolítica em comparação com a de CD145 humano nativo, segundo medição da quantidade de CD145 solúvel gerado por um dado número de células durante um período de tempo. Preferivelmente, um CD145 quimérico da presente invenção é "menos susceptível à clivagem" porque é clivado a uma taxa pelo menos 90% inferior à do CD145 nativo.

Tal como presentemente utilizado, o termo "vector de expressão" refere-se a um ácido nucleico que expressa uma sequência de nucleótidos recombinante e que é capaz de infectar células e replicar-se nestas. Vectores de expressão típicos incluem plasmídeos utilizados na tecnologia de ADN recombinante e vários vírus capazes de se replicarem em células bacterianas ou animais. Vários vectores de expressão têm sido descritos na literatura. Cantwell et al., Blood, In (1996) entitled "Adenovirus Vector Infection of Chronic Lymphocytic Leukemia B Cells;" Woll, P. J. e I. R. Hart, Ann. Oncol., 6 Suppl 1:73 (1995); Smith, K. T., A. J. Shepherd, J. E. Boyd e G. M. Lees, Gene Ther., 3:190 (1996); Cooper, M. J., Semin. Oncol., 23:172 (1996); Shaughnessy, E., D. Lu, S. Chatterjee e K. K. Wong, 20

Semin. Oncol., 23:159 (1996); Glorioso, J. C., N. A. DeLuca e D. J. Fink, Annu. Rev. Microbiol., 49:675 (1995); Flotte, T. R. e B. J. Cárter, Gene Ther., 2:357 (1995);

Randrianarison-Jewtoukoff, V. e M. Perricaudet,

Biologicals., 23:145 (1995); Kohn, D. B., Curr. Opin.

Pediatr., 7:56 (1995); Vile, R. G. e S. J. Russell, Br.

Med. Buli., 51:12 (1995); Russell, S. J., Semin. Câncer

Biol., 5:437 (1994); e Ali, Μ., N. R. Lemoine, e C. J.

Ring, Gene Ther., 1:367 (1994).

Sequências De Nucleótidos Codificadoras De CD145 Quimérico

Como se indicou anteriormente, ligandos da superfamilia TNF ("ligandos TNF") possuem uma estrutura secundária semelhante, que consiste em vários domínios (Kipps et al., WO98/76061 publicado 18 Junho 1998). No quadro I, são apresentados os limites do domínio de vários ligandos da superfamilia TNF. Com base na estrutura cristalina ao raio-X do TNFa humano, foi deduzida a estrutura secundária prevista da porção de ligação ao receptor de CD145 humano (Peitsch et al, Int Immunol, 5: 233-238, 1993). As estruturas secundárias das porções de ligação do receptor de outros ligandos TNF foram deduzidas por comparação a TNFa humano, recorrendo a análise por computador. 21 21 QUADRO I Superfamília TNF*

Estrutura do Domínio de Ligandos da

Domínio I (Citoplasmático ) Domínio II (Transmembrana) Domínio III (Extracelular proximal) Domínio IV (Extracelular distai) CD14 5 humano 1-42 42-135 135-330 330-786 CD145 de murino 1-42 42-135 135-327 327-783 CD145 de bovino 1-42 42-135 135-330 330-786 TNFa humano 1-87 87-168 168-228 228-699 TNFa de murino 1-87 87-168 168-237 237-705 TNFa porcino 1-87 87-168 168-228 228-696 Ligando Fas Humano 1-237 237-315 315-390 390-843 Ligando Fas de Murino 1-237 237-309 309-384 384-837 22 CD7 0 humano 1-45 45-117 117-132 132-579 Humano Ligando CD30 1-117 117-186 186-240 240-702 TRAIL humano 1-42 42-111 111-345 345-843 * Os domínios são identificados por limites dos nucleótidos de cada domínio utilizando o primeiro nucleótido da metionina inicial do cADN como número de nucleótido 1. De acordo com a invenção, os limites que os nucleótidos revelam podem variar consideravelmente dos identificados e definir ainda os domínios que são úteis na presente invenção.

Dadas as semelhanças nas sequências de nucleótidos codificadoras das moléculas CD145 de espécies diferentes, tal como ser humano, ratinho e vaca, uma sequência de nucleótidos codificadora de um domínio ou subdomínio de CD145 de uma espécie é intermutável com a sequência de nucleótidos correspondente de CD145 de outra espécie para ter como resultado uma sequência de polinucleótidos híbrida que codifica um CD145 quimérico.

As sequências de nucleótidos que são trocadas por sequências correspondentes entre espécies são seleccionadas por razões funcionais, isto é porque a sequência seleccionada codifica um domínio ou subdomínio que proporciona ou modifica toda uma função ou elimina uma função indesejada do gene ligando alvo. 23

Na técnica sabe-se que a menor parte do CD145 humano é clivado da molécula progenitora e se torna uma molécula solúvel. Como anteriormente descrito, a forma solúvel é geralmente indesejável. Assim, a troca de um aminoácido ou uma sequência de aminoácidos de CD145 humano que inclui um local de clivagem reconhecido por enzimas proteoliticas com um aminoácido ou sequência de aminoácidos de CD145 não humano, que não contém este local de clivagem iria melhorar pelo menos parcialmente este problema. De preferência, o CD145 não humano é CD145 de murino.

De acordo com a invenção, um domínio extracelular de CD145 humano inclui pelo menos um aminoácido ou uma sequência de aminoácidos no ou próximo do limite do domínio III e domínio IV que é reconhecido e clivado por proteases de clivagem. De acordo com a invenção, pelo menos um local de clivagem assim existe entre os nucleótidos 322-348, aminoácidos 108-116 de CD145 humano.

Além disso, de acordo com a invenção, um domínio extracelular de CD145 humano inclui pelo menos um aminoácido ou uma sequência de aminoácidos que se liga ao receptor de CD145 humano, por exemplo CD40. Por este motivo, mesmo a forma solúvel de CD145 é capaz de ligar a receptores CD145 no antigénio apresentador de células e pode participar activamente numa resposta imunitária. Deste modo, esta região extracelular de CD145 humano tem de ser conservada a fim de manter a ligação do receptor CD145 nativo.

Assim, uma concretização presentemente preferida da presente invenção consiste numa sequência de polinucleótidos CD145 quimérica, tal como definido na 24 reivindicação 14. As moléculas reivindicadas podem ser descritas em comparação com uma primeira sequência de nucleótidos e uma segunda sequência de nucleótidos que as constituem. De acordo com a presente invenção, a substituição de um subdominio de CD145 humano contendo um local de clivagem CD145 pelo subdominio correspondente de CD145 não-humano tem como resultado um CD145 quimérico que é marcadamente menos susceptivel à clivagem do que o CD145 humano. A primeira sequência de nucleótidos está ligada de modo operacional a uma segunda sequência de nucleótidos que codifica um subdominio extracelular de CD145 humano envolvido na ligação a um receptor CD145 humano, tal como o ligando CD40. Deste modo, a sequência de polinucleótidos apresentada pela presente invenção codifica um CD145 quimérico que liga às células humanas expressoras do receptor CD145.

Além disso, de acordo com a invenção, um domínio extracelular de CD145 de murino e humano inclui pelo menos um aminoácido ou uma sequência de aminoácidos que permite a expressão da molécula nas membranas de células de murino e de ser humano. Por exemplo, a fig. 9 mostra que são expressos pelas células HeLa tanto CD145 de murino como de ser humano. No entanto, como anteriormente descrito, CD145 de murino é expresso por uma variedade de células maior, incluindo células humanas em comparação com CD145 humano. De facto, CD145 de murino pode ser expresso em células humanas que tipicamente não expressam CD145 humano, tal como células CD40+, particularmente células CLL. Esta expressão diferencial entre CD145 humano e de murino é ainda confirmada pelos dados apresentados na fig. 9. Assim, 25 a troca de um aminoácido ou uma sequência de aminoácidos de CD145 humano envolvido na expressão da molécula humana por um aminoácido ou sequência de aminoácidos de CD145 de murino, envolvido na expressão da molécula não humana iria melhorar pelo menos parcialmente este problema.

Assim, numa concretização preferida da presente invenção, a sequência de polinucleótidos CD145 quimérica compreende uma primeira sequência de nucleótidos que codifica ainda um subdominio extracelular de CD145 de murino que é crítico para a expressão da molécula de CD145 de murino por célula de murino e humanas. Deste modo, a sequência de polinucleótidos apresentada pela presente invenção codifica um CD145 quimérico capaz da expressão por uma variedade de tipos de células, incluindo células humanas CD40+ que não expressam tipicamente CD145. Embora esta concretização envolva a utilização de CD145 de murino, são igualmente descritos outros CD145 não humanos que podem ser expressos por células humanas.

Além disso, de acordo com a invenção, um domínio extracelular de CD145 de murino inclui um aminoácido ou uma sequência de aminoácidos envolvidos na detecção da expressão do CD145 quimérico porque este liga ao anticorpo específico de CD145 de murino. Deste modo, a expressão da sequência de polinucleótidos CD145 quimérica pode ser especificamente detectada tipicamente por FACS ou imuno-histoquímica, sendo assim distinguida da expressão de CD145 humano nativo.

Assim, numa concretização preferida da presente invenção, a sequência de polinucleótidos CD145 quimérica compreende uma primeira sequência de nucleótidos que 26 codifica ainda um subdominio extracelular de CD145 de murino que detecta a expressão de CD145 quimérico por meio de ligação a anticorpos CD145 anti-murino.

Numa concretização preferida da presente invenção, esta primeira sequência de nucleótidos codifica um subdominio do dominio IV de CD145 de murino. Este subdominio IV de CD145 de murino inclui as sequências de aminoácidos que substituem o local de clivagem de CD145 humano que são críticos para a expressão da molécula de murino por células de murino e humanas e que estão envolvidos na detecção de CD145 quimérico da presente invenção. Além disso, esta primeira sequência de nucleótidos pode codificar um subdominio do domínio III de CD145 de murino que está no limite ou está imediatamente adjacente ao limite dos domínios III e IV. De acordo com a presente invenção, este subdominio inclui uma porção do local de clivagem de CD145 humano.

De preferência, a primeira sequência de nucleótidos codifica ainda os domínios I, II e III de CD145 de murino, porque esta construção tem provado resultar numa melhor expressão do CD145 quimérico em células humanas. Descreve-se também uma primeira sequência de nucleótidos que podem codificar o domínio III ou um seu subdominio de CD 14 5 de murino e/ou domínio II ou um seu subdominio de CD 14 5 de murino e/ou domínio I ou um seu subdominio de CD14 5 de murino.

Além disso, de acordo com a invenção, um domínio extracelular de CD145 de murino e humano inclui pelo menos um aminoácido ou uma sequência de aminoácidos que pode ligar a anticorpos anti-CD145 e neutralizar assim o efeito 27 imunoactivador do ligando. Este aminoácido ou sequência de aminoácidos é tipicamente igual ou substancialmente semelhante às regiões na estrutura terciária de CD145 que ligam a CD40, o receptor cognato de CD145. Como anteriormente descrito, CD145 de murino desencadeia uma maior resposta em termos de produção de anticorpos anti-CD145. Assim, é mais sensível do que o CD145 humano à ligação e neutralização por anticorpos anti-CD145, resultando em problemas a longo-prazo com a administração repetida de CD145 de murino em seres humanos. Isto é a administração de CD145 de murino ou de uma construção de CD145 em que a região à qual se ligam os anticorpos anti-CD145 tem como resultado uma reacção imunogénica contra o CD145 administrado e, consequentemente, uma menor eficácia na estimulação de uma resposta imunitária. Assim, preferivelmente, a região envolvida na ligação de anticorpos anti-CD145 é CD145 humano para prevenir ou minimizar qualquer efeito imunogénico durante a administração.

Assim, uma concretização presentemente preferida da presente invenção consiste numa sequência de polinucleótidos CD145 quimérica compreendendo uma segunda sequência de nucleótidos de CD145 humano que codifica ainda um subdomínio extracelular ao qual se ligam os anticorpos anti-CD145. Deste modo, a sequência de polinucleótidos apresentada pela presente invenção codifica um CD145 quimérico que não é imunogénico quando administrado a seres humanos. A segunda sequência de nucleótidos codifica um subdomínio do domínio IV de CD145 humano. Assim, uma sequência de polinucleótidos presentemente preferida 28 codifica um subdominio do domínio IV de CD145 humano ligado operacionalmente a outro subdominio do domínio IV de CD145 de murino.

Como anteriormente descrito, o domínio IV está ligado aos domínios I, II e III de CD145 de murino. São apresentados exemplos destas sequências de polinucleótidos preferidas como SEQ ID. NOS. 1, 3, 5, 7, 9 e 11 e codificam construções CD145 quiméricas que foram designadas ISF 30, 32, 34, 36, 38 e 40 respectivamente. A homologia destas construções quiméricas com CD145 de murino e humanas está representada no quadro II seguinte. QUADRO II - Mapas de Nucleótidos da Série ISF com Numeração Par

Const rução ISF Fragmento 1 Homologia CD145 de murino Fragmento 2 Homologia CD145 de murino Fragmento 3 Homologia CD145 de murino Fragmento 4 Homologia CD145 de murino ISF30 1-447 448-543 544-666 667-783 ISF32 1-447 448-567 568-666 667-783 ISF34 1-447 448-567 568-654 655-783 ISF36 1-447 448-567 568-618 622-783 ISF38 1-447 448-543 544-654 655-783 ISF40 1-447 448-543 544-618 619-783 29

Em alternativa, o domínio IV pode estar ligado aos domínios I, II e III de CD145 humano. São apresentados exemplos destas sequências de polinucleótidos preferidas como SEQ ID. NOS. 2, 4, 6, 8, 10 e 12 e codificam construções CD145 quiméricas que foram designadas ISF 31, 33, 35, 37, 39 e 41 respectivamente. A homologia destas construções quiméricas com CD145 de murino e humanas está representada no quadro III seguinte. QUADRO III - Mapas de Nucleótidos da Série ISF com Numeração Impar*

Construção ISF Fragmento 1 Homologia CD145 de murino Fragmento 2 Homologia CD145 de murino Fragmento 3 Homologia CD145 de murino Fragmento 4 Homologia CD145 de murino Fragmento 5 Homologia CD145 de murino ISF31 1-321 322-423 424-519 520-642 643-759 ISF33 1-321 322-423 424-543 544-642 643-759 ISF35 1-321 322-423 424-543 544-630 631-759 ISF37 1-321 322-423 424-543 544-594 592-759 ISF39 1-321 322-423 424-519 520-630 631-759 ISF41 1-321 322-423 424-519 520-594 595-759 * Uma região de 27 nucleótidos presente no CD145 humano (nucleótidos (322-348), correspondendo aproximadamente a uma porção do domínio III e domínio IV de CD145 humano foi eliminada desta série de construções entre os nucleótidos 321 e 322 dos fragmentos 1 e 2 respectivamente. 30 III) Polipeptídeos CD145 quiméricos O CD145 quimérico codificado inclui assim um primeiro subdominio de CD145 de murino que substitui um local de clivaqem de CD145 humano e um segundo subdominio de CD145 humano que liga a um receptor de CD145. Em resultado, o CD145 quimérico é menos susceptivel à clivagem da superfície das células do que o CD145 humano, mas mesmo assim retém a capacidade de ligar ao receptor cognato de CD145 nativo. Esta menor susceptibilidade à clivagem da superfície celular reflecte-se na taxa de clivagem do CD145 quimérico que é pelo menos 90% menor do que a de CD145 humano.

Além disso, o primeiro subdominio de CD145 de murino é crítico na expressão de CD145 de murino por célula de murino e humanas, permitindo assim a expressão de CD145 quimérico por células humanas. Consequentemente, o CD145 quimérico é capaz de ser expresso por células CD40+ humanas, incluindo células CLL que não expressam tipicamente CD145 humano.

Além disso, o primeiro subdominio de CD145 de murino é capaz de detectar a expressão de CD145 quimérico porque liga ao anticorpo específico de CD145 de murino, distinguindo assim a sua expressão da expressão de CD145 humano nativo. O segundo subdominio de CD145 humano compreende preferivelmente um ao qual se ligam os anticorpos anti-CD145. Dada a menos sensibilidade do CD145 humano para estes anticorpos o CD145 quimérico resultante não é imunogénico e não resulta assim na neutralização de anticorpos. 31 0 primeiro subdomínio de CD145 de murino compreende um subdominio do domínio IV e um subdomínio do domínio III em ou imediatamente adjacente ao limite dos domínios II e IV, que corresponde a uma porção de um local de clivagem CD145. 0 segundo subdomínio de CD145 humano compreende ainda um subdomínio do domínio IV. Em concretizações preferidas, os domínios I-III compreendem ainda CD145 de murino. São apresentados exemplos destas construções quiméricas preferidas como SEQ ID. NOS. 13, 15, 17, 19, 21 e 23 correspondendo a ISF 30, 32, 34, 36, 38 e 40. A homologia destas construções quiméricas com CD145 de murino e humanas está representada no quadro IV seguinte: QUADRO IV: Mapas de Aminoácidos da Série ISF de Número

Par

Construção ISF Fragmento 1 Homologia CD145 de murino Fragmento 2 Homologia CD145 de murino Fragmento 3 Homologia CD145 de murino Fragmento 4 Homologia CD145 de murino ISF30 1-149 150-181 182-222 223-260 ISF32 1-149 150-189 190-222 223-260 ISF34 1-149 150-189 190-218 219-260 ISF36 1-149 150-189 190-206 207-260 ISF38 1-149 150-181 182-218 219-260 ISF40 1-149 150-181 182-206 207-260 32

Em alternativa, os domínios I-III podem ainda compreender CD145 humano. São apresentados exemplos destas construções preferidas como SEQ ID. NOS. 14, 16, 18, 20, 22 e 24 correspondendo a ISF 31, 33, 35, 37, 39 e 41. A homologia destas construções quiméricas com CD145 de murino e humanas está representada no quadro V seguinte. QUADRO V - Mapas de Aminoácidos da Série ISF com Numeração Impar*

Construção ISF Fragmento 1 Homologia CD145 de murino Fragmento 2 Homologia CD145 de murino Fragmento 3 Homologia CD145 de murino Fragmento 4 Homologia CD145 de murino Fragmento 5 Homologia CD145 de murino ISF31 1-107 108-141 142-173 174-214 215-252 ISF33 1-107 108-141 142-181 182-214 215-252 ISF35 1-107 108-141 142-181 182-210 211-252 ISF37 1-107 108-141 142-181 182-198 199-252 ISF39 1-107 108-141 142-173 174-210 211-252 ISF41 1-107 108-141 142-173 174-198 199-252 * Uma região de nove aminoácidos presente no CD145 humano (aminoácidos 108-116), correspondendo aproximadamente a uma porção do domínio III e domínio IV de CD145 humano foi eliminada desta série de construções entre os nucleótidos 107 e 108 dos fragmentos 1 e 2 respectivamente. 33

Construções Genéticas A presente invenção contempla ainda um vector de expressão ou qualquer outra construção genética que compreende uma sequência de polinucleótidos da presente invenção, capaz de expressar um CD145 quimérico numa célula alvo.

Um vector de expressão útil na presente invenção contém uma sequência de polinucleótidos codificadora de um CD145 ligado operacionalmente a uma sequência de nucleótidos reguladora transcricional ou traducional adequada, tal como uma derivada de um gene de mamífero, microbiano, virai ou de insecto. Estas sequências reguladoras incluem sequências com um papel regulador na expressão genética, tal como um promotor ou intensificador da transcrição, uma sequência operadora para controlar a transcrição, uma sequência codificadora de um local de ligação ribossomal dentro do ARN mensageiro e sequências apropriadas que controlam a transcrição, início da tradução ou fim da transcrição.

Sequências reguladoras particularmente úteis incluem as regiões promotoras de vários genes de mamíferos, virais, microbianos e de insectos. A região promotora orienta a iniciação da transcrição através e incluindo a sequência de polinucleótidos codificadora do CD145 quimérico da presente invenção. As regiões promotoras úteis incluem o promotor encontrado na repetição terminal longa (LTR) do Vírus do Sarcoma de Rous (RSV), região intensificadora/promotora do citomegalovírus humano, promotores lac, promotores isolados de adenovírus e qualquer outro promotor conhecido de alguém com formação ordinária na técnica, que entenderia a utilidade da expressão genética em células eucariotas, 34 procariotas, vírus ou microbianas. Outros promotores que são particularmente úteis na expressão de genes e proteínas com células eucariotas incluem sequências promotoras e sequências intensificadoras de células de mamífero, tais como as derivadas do vírus polioma, adenovírus, vírus símio 40 (SV 40) e o citomegalovírus humano. São particularmente úteis os promotores virais precoces e tardios que são encontrados tipicamente junto à origem virai de replicação de vírus tais como o SV40. Alguém com formação ordinária na técnica compreenderá que a selecção de um promotor particularmente útil depende das linhas de células exactas e outros parâmetros da construção genética que serão utilizados para expressar uma sequência de polinucleótidos dentro de uma linha de células especifica.

Certas construções genéticas contempladas pela presente invenção incluem, por conseguinte, uma sequência de polinucleótidos ligada operacionalmente a uma sequência promotora ou uma sequência promotora e intensificadora e ainda ligados operacionalmente a uma sequência de poliadenilação que orienta o ARN mensageiro de terminação e poliadenilação. Preferivelmente, a sequência de polinucleótidos é construída utilizando o promotor CMV e a sequência de poliadenilação da hormona do crescimento bovino. Células hospedeiras A presente invenção contempla ainda várias células hospedeiras que são transformadas ou transfectadas com um vector de expressão ou outra construção genética que contém uma sequência de polinucleótidos da presente invenção. Estas células podem ser células procariotas ou eucariotas. 35

Nalgumas concretizações preferidas as células são células apresentadoras de antigénio normais de um mamífero, tal como monócitos, macrófagos, células B e semelhantes. Noutras concretizações preferidas, as células podem ser células normais capazes de estimular células apresentadoras de antigénios não intervenientes quando uma sequência de polinucleótidos da presente invenção é introduzida nestas células. A presente invenção contempla ainda células somáticas que não são capazes naturalmente de apresentar antigénios ao sistema imunitários mas podem ser geneticamente modificadas com genes codificadores das moléculas necessárias para a apresentação de antigénios e permitir assim que estas células actuem como células apresentadoras de antigénios artificiais. Uma sequência de polinucleótidos codificadora de um CD145 quimérico pode então ser introduzida nestas células apresentadoras de antigénios artificiais. São bem conhecidos da literatura vários ensaios para determinar se uma célula específica é capaz de funcionar como célula apresentadora de antigénio, tal como proliferação celular ou produção de linfoquinas, e por conseguinte este aspecto da presente invenção pode ser facilmente determinado.

Para além das células humanas anteriores, a presente invenção contempla ainda a introdução de uma sequência de polinucleótidos codificadora de um CD145 quimérico em várias células neoplásicas ou malignas, tais como células do sistema imunitário e tumores sólidos. Estas células neoplásicas que são contempladas incluem células leucémicas, tais como leucemia monocítica aguda (AML) leucemia mielomonocítica aguda (AMML), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia miologénica crónica ou 36 mielomonocítica crónica (CMML). São também contempladas células derivadas de linfomas, gliomas, cancros da mama, cervicais, ovários, pulmão, bexiga ou próstata.

Finalmente, numa concretização preferida da presente invenção, uma sequência de polinucleótidos codificadora de CD145 quimérico é introduzida em células que expressam o respectivo receptor cognato, CD40, nas superfícies das células. Métodos que Utilizam Vectores de Expressão e Construções Contendo Sequências de Polinucleótidos de CD145 Quimérico

Reconhecendo a interacção de CD145 e respectivo receptor cognato na regulação da resposta imunitária, a presente invenção contempla ainda utilizações tal como definido nas reivindicações 16 e 17. 0 medicamento referido nas reivindicações 16 e 17 pode ser utilizado para aumentar a concentração de um ligando estabilizado na membrana, capaz de ligar a CD40 ou algum outro receptor cognato de CD145 introduzindo uma sequência de polinucleótidos codificadora de CD145 quimérico numa célula, sendo o CD145 quimérico menos susceptível à clivagem da superfície dessa célula comparativamente com CD145 nativo. Porque o CD145 quimérico é menos susceptível à clivagem proteolítica tem uma maior capacidade de ligar ao respectivo receptor cognato e induzir uma resposta citolítica ou uma resposta imunitária. 0 medicamento referido nas reivindicações 16 e 17 pode ser útil para qualquer célula humana que participe numa reacção imunitária, seja como alvo para o sistema imunitário seja como parte da resposta do sistema 37 imunitário ao alvo estranho. Um medicamento destes pode ser utilizado para métodos ex vivo, métodos in vivo, e vários outros métodos que envolvem a injecção de polinucleótidos ou vectores na célula hospedeira. 0 medicamento pode ainda ser utilizado para injecção directamente no tumor ou leito do tumor. São também descritos métodos ex vivo compreendendo o isolamento de células de um animal ou ser humano. Uma sequência de polinucleótidos codificadora de um CD145 quimérico da presente invenção é introduzida em células isoladas. As células são depois reintroduzidas num local especifico ou directamente na circulação do sujeito. Os marcadores da superfície celular, incluindo moléculas tais como marcadores de tumor ou antigénios que identificam as células podem ser utilizados para isolar especificamente estas células do sujeito. 0 medicamento referido nas reivindicações 16 e 17 pode ainda ser utilizado para introduzir uma sequência de polinucleótidos codificadora de CD145 quimérico nas células desejadas no interior do corpo de um sujeito animal ou humano sem primeiro remover estas células do sujeito. Os métodos de introdução de sequências de polinucleótidos em células específicas in vivo ou no interior do corpo do sujeito são bem conhecidas e incluem o uso de vectores de expressão e injecção directa de várias construções genéticas no sujeito. Numa aplicação típica, introduz-se um vector de expressão contendo uma sequência de polinucleótidos da presente invenção na circulação ou num ponto localizado do sujeito para permitir que o vector infecte especificamente as células desejadas. Noutros exemplos, o vector é injectado directamente no leito do 38 tumor presente num sujeito que contém pelo menos algumas das células nas quais a sequência de polinucleótidos da presente invenção será introduzida.

Como descrito, é a injecção directa num sujeito animal ou humano de uma construção genética da presente invenção que inclui uma sequência de polinucleótidos codificadora de um CD145 quimérico e pode ainda incluir uma sequência promotora e de poliadenilação. Foram descritos exemplos destes métodos úteis (Vile et al, Ann Oncol, 5:59-65, 1994). A construção genética pode ainda se directamente injectada no músculo ou outro local de um sujeito animal ou humano ou directamente no tumor ou leito do tumor do sujeito. Métodos de Tratamento de Neoplasias São também descritos métodos de tratamento da neoplasia compreendendo a inserção numa célula neoplásica de uma sequência de polinucleótidos da presente invenção, de forma que o CD145 quimérico codificado seja expresso na superfície das células neoplásicas. É também descrito o tratamento da neoplasia humana tanto in vivo como ex vivo.

Numa método preferido de tratamento da neoplasia, o método inclui ainda as etapas de obtenção em primeiro lugar de células neoplásicas de um sujeito, inserção destas numa sequência de polinucleótidos da presente invenção de forma a ser expresso um CD145 quiméricos na superfície das células neoplásicas e re-administração das células no sujeito Alguém com formação ordinária na técnica compreenderá que são aplicáveis muitos métodos de re-administração das células neoplásicas transformada no sujeito. 39

EXEMPLOS 1. Expressão de Ligando de Moléculas Acessórias Quiméricas Em Células Hela e Células CLL Humanas a. Construção de uma Construção Genética e Vector para Terapia Genética Contendo um Gene de Ligando de Molécula Acessória Quimérica

Os genes de ligando de molécula acessória quiméricos da SEQ ID n° 1 a SEQ ID N° 12 (também conhecidos como 30-ISF41) são preparados da seguinte forma:

Preparação de Gene de Ligando de Molécula Acessória Quimérica Utilizando Dominios de Duas Espécies Diferentes de Genes

As construções quiméricas da presente invenção foram designadas por dois métodos de fusão genética e mutagénese dirigida caracterizados pela trama. A substituição de grandes dominios, por exemplo fusão da região do dominio IV de ser humano nos dominios I-III de ratinho foi conseguida por meio de uma técnica de fusão genética descrita por Ho48. Substituições genéticas menores ou substituições de aminoácidos foram executadas por meio de um protocolo de mutagénese dirigida "quickchange"

descrito por Stratagene, Inc (La Jolla, CA). Foram subclonados genes ISF quiméricos no vector de expressão eucariota pcDNA3 (invitrogen, Inc. La Jolla, CA). A inserção ISF quimérica é flanqueada pelo promotor CMV e a sequência de poliadenilação da hormona do crescimento bovino. 40 Síntese do Adenovírus

Os plasmídeos quiméricos ISF-pcDNA3 foram digeridos com as enzimas de restrição NruI e Sma I para libertar um fragmento de ADN contendo o promotor CMV de pcDNA3, o gene CD145 quimérico e o sinal de poliadenilação de pcADN3. Depois de purificação em gel deste fragmento por meio de separação do ADN digerido num gel de agarose a 1%, o fragmento de ADN foi ligado ao local EcoRV do vector de vai-vem adenoviral MCS (SK) pXCX2. Este plasmídeo é uma modificação do plasmídeo pXCX2, de forma que a sequência poliligante pBluescript foi clonada na região EI (J. R. Tozer, UCSD, unpublished data, Setembro 1993). Na sequência da purificação de ISF-MCS (SK) pXCX2 plasmídeo, co-transf ectou-se 5 pg do plasmídeo de vai-vem com 5 pg de plasmídeo JM17 em células 293AC2, utilizando o Profection Kit de fosfato de cálcio da Promega de acordo com as instruções do fabricante. Na sequência da transfecção, as células foram cultivadas durante 5 dias para permitir a recombinação homóloga e síntese virai. A totalidade das células e sobrenadante foram colhidos e sujeitos por três vezes a congelação-descongelação para libertar o adenovírus associado às células.

Na sequência da produção virai inicial, obteve-se um isolado clonal do vírus por purificação em placa. Rapidamente, o sobrenadante virai sujeito a congelação-descongelação foi limpo dos resíduos por centrifugação a 1000 rpm, numa centrífuga de bancada durante 5 minutos. As células 293AC2 deixadas a crescer até confluência em placas de cultura de tecidos de 6 poços foram então infectadas com diluições em série do sobrenadante virai durante 1 a 2 horas. Na sequência da infecção, o meio foi aspirado e as 41 células foram sobrepostas com meio DMEM contendo 4% de soro fetal de bovino e 0,65% de agarose mantidos a 56 °C.

Passados 4-6 dias de incubação, as placas isoladas foram tomadas em 1 ml de meio e depois foram utilizadas para amplificação virai.

As preparações à escala industrial de adenovirus foram preparadas por meio de infecção sucessiva de quantidades crescentes de 293AC2. Os adenovirus purificados foram purificados por meio de gradientes faseados de cloreto de césio. Este método utiliza um gradiente de cloreto de césio para a concentração de partículas de vírus por gradiente faseado com as densidades de l,45g/cm3 e l,20g/cm3 em que amostras de vírus 293AC2 expandidas são centrifugadas durante 2 horas num rotor SW40 (Beckman, Brea, CA) a 25,000 rpm a 4o C. A banda do vírus é isolada com uma agulha e seringa de calibre 27 e foi dessalinizada com uma coluna de nível ADN Sephadex G-25 (Pharmacia, Piscataway, NJ). O vírus é dessalinizado novamente com soro fisiológico tamponado com fosfato, contendo 10% de glicerol e guardado a -70 °C. A titulação final do vírus foi determinada por HPLC de permuta aniónica. b. Expressão e Função de um Gene Ligando de Moléculas Acessórias Quiméricas em Células CLL Humanas e Células Hela i. Expressão (figura 3) mostra a expressão de muitas das construções do painel de ISF, isto é ISF30 - ISF39 em HeLa na sequência da transfecção destas células com plasmídeo pcDNA3 contendo cada construção ISF respectiva. As células HeLa foram transfectadas temporariamente com plasmídeo ISF-pcDNA3, utilizando lipofectamina 2000 (Gibco-BRL) um reagente de 42 transfecção à base de lipossomas permitindo uma transferência eficiente do gene em HeLa. Dois dias depois da transfecção, analisou-se a expressão de superfície celular de CD145 quimérico por citometria de fluxo. Rapidamente, as células aderentes foram separadas dos poços por aspiração do meio e adição da solução separadora (PBS contendo 10 mM de EDTA, pH 8) . Esta solução separadora é utilizada em vez do tampão de tripsinização mais comum para evitar a clivagem inespecífica de CD145 em locais sensíveis à tripsina, conduzindo assim potencialmente a uma avaliação negativa falsa da expressão. Assim que as células se separam da placa, as células são lavadas uma vez em tampão de coloração FACS (constituído por PBS contendo 3% FCS e 0,05% azida de sódio), ressuspensas em tampão FACS até aproximadamente 107 células/ml) e 5xl05 (50 μΐ) de células são colocadas em placas de 96 poços com fundo em u, de plástico, da microwell plates. Anticorpo conjugado com PE específico de CD145 (clone de anticorpo MR-1, Pharmingen, Inc.) é adicionado durante 30 minutos a 4°C. As células são depois lavadas duas vezes com tampão FACS, ressuspensas em tampão FACS e transferidas para tubos FACS para aquisição de dados. Para controlar ligação de anticorpos inespecífica, todas as amostras são coloridas com anticorpos de controlo isotipo apropriados. Além disso, as células mortas e resíduos são excluídos da análise por meio de adição de 10 ng/ml de iodeto de propídio em todas as reacções de coloração. As células são analisadas por citometria de fluxo por expressão de CD145 utilizando um citómetro de fluxo FACSalibur (Becton Dickinson).

Os resultados na (figura 3) mostram que os vectores quiméricos CD145 são todos expressos como ligandos de 43 superfície celular que podem ser detectados com anticorpo específico de CD145, sugerindo a permanência de uma estrutura terciária proteica geral. Além disso, a expressão de superfície é equivalente ou melhor que CD145 de murino nativo. ii. Análises Funcionais dos Ligandos de Molécula Acessória Quimérica A (figura 4) mostra a capacidade funcional de várias construções do painel ISF descritas na (figura 2) para activar células B Ramos, uma linha de células positiva a CD40. As células Ramos foram sobrepostas nas células HeLa transfectadas com ISF-pcDNA3, como anteriormente descrito. No dia seguinte à sobreposição, as células Ramos que não aderiram foram colhidas e analisadas quanto à expressão de CD70 e expressão de CD95 por citometria de fluxo. Estes dois marcadores da superfície celular são expressos a níveis superiores na sequência da activação de CD40. (Kato K. et al., J. Clin. Invest., 104:947-955, 1999). Estes dados revelam que todas as construções ISF activam células Ramos com intensidade equivalente como CD145 murino nativo. Este facto constitui uma prova adicional da permanência da estrutura proteica terciária de CD145 geral e especificidade do receptor nas construções CD145 quiméricas. 1. Dados sobre a neutralização de anticorpos do paciente CD145 A (figura 5) mostra a sensibilidade das construções ISF ao plasma de doentes CLL, colhidas do ensaio clínico CD145 de fase I contendo anticorpos capazes de neutralizar a função CD145 de murino nativo. Resumidamente, as células 44

Ramos foram sobrepostas nas células HeLa transfectadas com ISF-pcDNA3, como descrito na (figura 3) . Em simultâneo, o plasma de doentes contendo anticorpo de neutralização de mCD145 foi adicionado durante a co-incubação. No dia seguinte à incubação, as células Ramos foram colhidas e analisadas quanto à expressão de CD70 e de CD95 de superfície como descrito na (figura 4). Estes dados revelam que o plasma do doente inibe a activação de mCD145 das Ramos como previsto. Em contraste, o plasma do doente não inibiu a função ISF.

Além disso, as construções ISF foram testadas quanto à ligação de anticorpo específico CD145 em plasma do doente como medida extra de imunogenicidade. Novamente, as células HeLa transfectadas com os plasmídeos ISF-pcDNA3 foram incubadas com diluições em série de plasma do doente durante 30 minutos a 4 °C. As células foram depois lavadas do anticorpo desligado e coloridas com anticorpo com marcação fluorescente, específico de imunoglobulina humana (Ig). Na sequência destas coloração secundária, as células foram lavadas e analisadas por FACS. A (figura 6) revela menos ligação de anticorpos do plasma do doente descrita na (figura 5) a construções ISF representativas em comparação com mCD145. Embora se possa detectar uma pequena quantidade de anticorpo ligado, evidentemente esta não é prejudicial para a função ISF baseada no resultado da (figura 4). Além disso, detectou-se menos ligação de anticorpos em ISF35 do que em ISF30. Estes resultados são explicados pelo facto de ISF35 conter mais regiões CD145 humanas do que ISF30 (vide figura 2). Em conjunto, os resultados das (figura 5 e figura 6) satisfazem os critérios de uma construção de CD145 optimizada, uma vez que falta às construções regiões 45 imunogénicas responsáveis pela neutralização do ligando por anticorpos gerados pelo doente. 2. Expressão e Função ISF Mediada por Adenovirus

Testou-se o adenovirus recombinante que codifica cada transgene ISF quanto à sua capacidade de infectar HeLa e conduzir à expressão de membrana de ISF. A (figura 7) revela a expressão de construções ISF seleccionadas em células HeLa infectadas com uma multiplicidade crescente de taxas de infecção (M.O.I.) de adenovirus em comparação com células infectadas com CD145 de murino codificador de adenovirus (Ad-mCD145) . Em primeiro lugar, estes dados mostram os vectores de adenovirus estão intactos e contêm o transgene ISF de interesse. Em segundo lugar, estes dados confirmam ainda que as construções ISF são expressas com pelo menos intensidade equivalente como mCD145. Assim, o estado quimérico das construções ISF não é negativo para a expressão numa linha de células extremamente permissiva à infecção com adenovirus e expressão CD145. A (figura 8) mostra a expressão de construções ISF em células B CLL na sequência da infecção com os vectores de adenovirus descritos anteriormente. Ao contrário de HeLa CLL é dificil infectar com adenovirus e impede a expressão de CD145 humano. Como se pode observar, as construções ISF podem ser expressas em células CLL na sequência da infecção com adenovirus com intensidade de expressão semelhante a mCDl45. Assim, estes vectores satisfazem outros critérios de uma construção CD145 optimizada, nomeadamente a expressão em tipos de células resistentes à expressão de CD145 humanas. 46

Outro critério para uma construção CD145 preferida, as células B CLL foram examinadas para detectar activação de células na sequência da infecção com os vectores de adenovirus codificadores das construções ISF descritas na (figura 8). Dois dias depois da infecção, as células CLL foram coloridas para modulação de um painel de marcadores de superfície característicos da activação CD40. A (figura 9) mostra a que a expressão de ISF teve como resultado alterações na expressão destes marcadores. As alterações foram equivalentes ou maiores que as células infectadas com Ad-mCD145.

Finalmente, como se pode observar na figura 10, pelo menos um dos polipeptídeos CD145 quiméricos da presente invenção é significativamente mais estável e mais resistente à clivagem proteolítica em comparação com CD145 humano que é conhecido por ser clivado proteoliticamente numa molécula solúvel na sequência da expressão por células. As células HeLa ou não foram infectadas ou foram infectadas com adenovirus codificador de CD145 humano ou ISF35 num MOI de 10. Dois dias depois da infecção, o sobrenadante da cultura foi colhido e medido quanto à presença de ligando solúvel, utilizando um ELISA específico de CD145 humano (análise imunoabsorvente ligada a enzima). A quantidade de CD145 solúvel foi calculada com base na titulação de uma quantidade conhecida de ligando CD40-proteína de fusão CD8 solúvel em ELISA (Ancell Inc.). A quantidade de ligando solúvel detectado no sobrenadante está registada no gráfico de barras da figura 10. Este gráfico revela que ISF35 é resistente à clivagem proteolítica no ligando solúvel, uma vez que não foi possível detectar ISF35 solúvel. Em contraste, CD145 humano 47 é facilmente clivado em CD145 solúvel a níveis > 120ng/ml. Além disso, a ausência de ISF35 solúvel não se deveu à falta de expressão de ISF35 pelas células HeLa, uma vez que a análise FACS das células HeLa infectadas revelaram expressão na superfície celular de ISF35 a níveis semelhantes ao conhecido na figura 6.

Embora tenham sido apresentados e descritos métodos e concretizações de aparelhos preferidos, será evidente a alguém com formação específica na técnica a possibilidade de numerosas alterações sem fugir ao âmbito da invenção. Não se pretende limitar a invenção excepto de acordo com as reivindicações seguintes e respectivos equivalentes legais.

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Prussak, Charles E. Kipps, Thomas J. Cantwell, Mark J. <120> CD154 Quimérico Novo <130> UCSD 263/094 <140> US 10/154,759 <141> 2002-05-23 <160> 24 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 783 48

<212> ADN <213> Sequência artificial <22 0>. <223> ISF30 Construção quimérica de ADN <400> 1 atgatagaaa catacagcca accttccccc agatccgtgg caactggact tccaçfcgagc 60 atgaagattt ttatgtattt acttactgtt ttccttatca cecaaatgafc tggatctgtg 120 ctttttgctg tgtatcttca tagaagattg gataaggtcg aagaggaagt aaaccttcat 180 gaagattttg tattcataaa aaagctaaag agatgcaaca aaggagaagg atctttatce 240 ttgctgaact gtgaggagat gagaaggcaa tttgaagacc ttgtcaagga tataacgtta 300 aacaaagaag agaaaaaaga aaacagcttt gaaatgcaaa gaggtgatga ggatcctcaa 360 attgcagcac acgttgtaag cgaagccaac agtaatgcag catccgttct acagtgggcc 420 aagaaaggat attataccat gaaaagcaac ttggtaaccc tggaaaatgg gaaacagctg 480 acggttaaaa gacaaggact ctattatatc tatgetcaag fccaeetfcetg ctctaatcgg 540 gagccttcga gtcaacgccc attcatcgtc ggcctctggc tgaagcccag cagtggatct 600 gagagaatct tactcaaggc ggcaaatacc cacagttcct cccagctttg cgagcagcag 660 tctgttcact tgggcggagt gtttgaatta caaccaggtg cttcggtgtt tgtcaatgtg 720 actgatccaa gccaagtgag ccatggcact ggcttcacgt cctttggctt actcaaactc 780 tga. 783

<210>2 <211> 759 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> ISF31 Construção quimérica de ADN <400> 2 49 atgatcgaaa catacaacca aacttctccc cgatctgcgg ccactggact gcccatcagc 60 atgaaaattt ttatgtattt acttactgtt tttcttatca cccagatgat tgggtcagca 120 ctttttgctg tgtatcttca tagaaggctg gacaagatag aagatgaaag gaatcttcat 180 gaagattttg tattcatgaa aacgatacag agatgcaaca caggagaaag atccttatcc 240 ttactgaact gtgaggagat taaaagecag tttgaaggct ttgtgaagga tataatgtta 300 aacaàagagg agacgaagaa agatgaggat cctcaaattg cagcacacgt tgtaagcgaa 360 gccaacagta atgcagcatc cgttctacag tgggccaaga aaggatatta taccatgaaa 420 agcaacttgg taaccctgga aaatgggaaa cagctgacgg ttaaaagaca aggactctat 480 tatatctatg ctcaagtcac cttctgctct aatcgggagc cttcgagtca acgcccattc 540 atcgtcggcc tctggctgaa gcccagcagt ggatctgaga gaatcttact caaggcggca 600 aatacccaca gttcctccca gctttgcgag cagcagtctg ttcacttggg cggagtgttt 660 gaattacaac caggtgcttc ggtgtttgtc aatgtgactg atccaagcca agtgagccat 720 ggcactggct tcacgtcctt tggcttactc aaactctga 759

<210>3 <211> 783 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> ISF32 Construção quimérica de ADN <400> 3 atgatagaaa catacagcca accttccccc agatccgtgg caactggact tccagcgagc 60 atgaagattt ttatgtattt acttactgtt ttccttatca cccaaatgat tggatctgtg 120 ctttttgctg tgtatcttca tagaagattg gataaggtcg aagaggaagt aaaccttcat 180 gaagattttg tattcataaa aaagctaaag agatgcaaca aaggagaagg atctÉtatcc 240 ttgctgaact gtgaggagat gagaaggcaa tttgaagacc ttgtcaagga tataacgtta 300 aacaaagaag agaaaaaaga aaacagcttt gaaatgcaaa gaggtgatga ggatcctcaa 360 attgcagcac acgttgtaag cgaagccaac agtaatgcag catccgttct acagtgggcc 420 aagaaaggat attataccat gaaaagcaac ttggtaaccc tggaaaatgg gaaacagctg 480 acggttaaaa gacaaggact ctattatatc tatgctcaag tcaccttctg ctctaatcgg 540 gaggcttcga gtcaagcccc attcatcgtc ggcctctggc tgaagcccag cagtggatct 600 gagagaatct tactcaaggc ggcaaatacc cacagttcct cccagctttg cgagcagcag 660 tctgttcact tgggcggagt gtttgaatta caaccaggtg cttcggtgtt tgtcaatgtg 720 actgatccaa gccaagtgag ccatggcact ggcttcacgt cctttggctt actcaaactc 780 tga 783 50

<210>4 <211> 759 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> ISF33 Construção quimérica de ADN <400> 4 atgatcgaaa catacaacca aacttctccc cgatctgcgg ccactggact gcccatcagc 60 atgaaaattt ttatgtattt acttactgtt tttcttatca cccagatgat tgggtcagca 120 ctttttgctg tgtatcttca tagaaggctg gacaagatag aagatgaaag gaatcttcat 180 gaagattttg tattcatgaa aacgatacag agatgcaaca caggagaaag atccttatcc 240 ttactgaact gtgaggagat taaaagccag tttgaaggct ttgtgaagga tataatgtta 300 aacaaagagg agacgaagaa agatgaggat cctcaaattg cagcacacgt tgtaagcgaa 360 gccaacagta atgcagcatc cgttctacag tgggccaaga aaggatatta taccatgaaa 420 agcaacttgg taaccctgga aaatgggaaa cagctgacgg utaaaagaca aggactctat 480 tatatctatg ctcaagtcac cttctgctct aatcgggagg cttcgagtca agccccattc 540 atcgtcggcc tctggctgaa gcccagcagt ggatctgaga gaatcttact caaggcggca 600 aatacccaca gttcctcçca gctttgcgag cagcagtctg. fctcacttggg cggagtgttt 660 gaattacaae caggtgctte ggtgtttgtc aatgtgactg atccaagcca agtgagccat 720 ggcactggct tcacgtcctt tggcttactc aaactctga 759

<210>5 <211> 783 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> 51 <223> ISF34 Construção quimérica de ADN <400> 5 atgatagaaa catacagcca accttccccc agatccgtgg caactggact tccagcgagc 60 atgaagattt ttatgtattt acttactgtt ttccttatca cccaaatgat tggatctgtg 120 ctttttgctg tgtatcttca tagaagattg gataaggtcg aagaggaagt aaaccttcat 180 gaagattttg tattcataaa aaagctaaag agatgcaaca aaggagaagg atctttatcc 240 ttgctgaact gtgaggagat gagaaggcaa tttgaagacc ttgteaagga tataacgtta 300 aacaaagaag agaaaaaaga aaacagcttt gaaatgcaaa gaggtgatga ggatcctcaa 360 attgcagcac acgttgtaag cgaagccaac agtaatgcag catccgttct acagtgggcc 420 aagaaaggat attataccat gaaaagcaac ttggtaaccc tggaaaatgg gaaàcagctg 480 acggttaaaa gacaaggact ctattatatc tatgctcaag tcaccttctg ctctaatcgg 540 gaggcttcga gtcaagcccc attcatcgtc ggcctctggc tgaagcccag cagtggatct 600 gagagaatct tactcaaggc ggcaaatacc cacagttcct cccagcttfcg cgagcagcag 660 tctattcact tgggcggagt gtttgaatta caaccaggtg cttcggtgtt tgtcaatgtg 720 actgatccaa gccaagtgag ccatggcact ggcttcacgt cctttggctt actcaaactc 780 tga 783

<210>6 <211> 759 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> ISF35 Construção quimérica de ADN <400> 6 52 atgatcgaaa catacaacca aacttctccc cgatctgcgg ccactggact gcccatcagc 60 atgaaaattt ttatgtattt acttactgtt tttcttatca cccagatgat tgggtcagca 120 ctttttgctg tgtatcttca tagaaggctg gacaagatag aagatgaaag gaatcttcat 180 gaagattttg tattcatgaa aacgatacag agatgcaaca caggagaaag atccttatcc 240 ttactgaact gtgaggagat taaaagccag tttgaaggct ttgtgaagga tataatgtta 300 aacaaagagg agacgaagaa agatgaggat cctcaaattg cagcacacgt tgtaagcgaa 360 gccaacagta atgcagcatc cgttctacag tgggccaaga aaggatatta taccatgaaa 420 agcaacttgg taaccctgga aaatgggaaa cagctgacgg ttaaaagaca aggactctat 480 tatatctatg ctcaagtcac cttctgctct aatcgggagg cttcgagtca agccccattc 540 atcgtcggcc tctggctgaa gcccagcagt ggatctgaga gaatcttact caaggcggca 600 aatacccaca gttcctccca gctttgcgag cagcagtcCa ttcacttggg cggagtgttt 660 gaattacaac caggtgcttc ggtgtttgtc aatgtgactg atccaagcca agtgagccat 720 ggcactggct tcacgtcctt tggcttactc aaactctga 759

<210>7 <211> 783 <212> ADN <213> Sequência artificial <220>

<223> ISF36 Construção quimérica de ADN 53 <4 Ο 0> 7 ãtgatagaaa catacagcca atgaagattt ttatgtattt ctttttgctg tgtatettca gaagattttg tattcataaa ttgctgaact gtgaggagat aacaaagaag agaaaaaaga attgcagcac acgttgtaag aagaaaggat attataccat acggttaaaa gacaaggact gaggcttcga gtcaagcccc gagagaatct tactcaaggc tctattcact tgggcggagt actgatccaa gccaagtgag tga accttccccc agatccgtgg acttactgtt ttccttatca tagaagattg gataaggtcg aaagctaaag agatgcaaca gagaaggcaa tttgaagacc aaacagcttt gaaatgcaaa cgaagccaac agtaatgcag gaaaagcaac ttggtaaccc ctattatatc tatgctcaag attcatcgtc ggcctctggc ggcaaatacc cacagttccg gtttgaatta caaccaggtg ccatggcact ggcttcacgt caactggact tccagcgagc cccaaatgat tggatctgtg aagaggaagt aaaccttcat aaggagaagg atctttatcc ttgtcaagga tataacgtta gaggtgatga ggatcctcaa catccgttct acagtgggcc tggaaaatgg gaaacagctg tcaccttctg ctçtaatcgg tgaagcccag cagtggatct ccaagccttg cgggcagcag cttcgtgttt tgtcaatgtg cctttggctt actcaaactc 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 783

<210>8 <211> 759 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> ISF37 Construção quimérica de ADN <400> 54

atgatcgaaa catacaacca aacttctccc cgatctgcgg ccactggact gcccatcagc 60 atgaaaattt ttatgtattt acttactgtt tttcttatca cccagatgat tgggtcagca 120 ctttttgctg tgtatcttca tagaaggctg gacaagatag aagatgaaag gaatcttcat 180 gaagattttg tattcatgaa aacgatacag agatgcaaca caggagaaag atccttatcc 240 ttactgaact gtgaggagat taaaagccag tttgaaggct ttgtgaagga tataatgtta 300 aacaaagagg agacgaagaa agatgaggat cctcaaattg cagcacacgt tgtaagcgaa 360 gccaacagta atgcagcatc cgttctacag tgggccaaga aaggatatta taccatgaaa 42D agcaacttgg taaccctgga aaatgggaaa cagctgacgg ttaaaagaca aggactctat- 480 tatatctatg ctcaagtcac cttctgctct aatcgggagg cttcgagtca agccccattc 540 atcgtcggcc tctggctgaa gcccagcagt ggatctgaga gaatcttact caaggcggca 600 aatacccàca gttccgccaa gccttgcggg cagcagtcta ttcacttggg cggagtgttt 660 gaattacaac caggtgcttc ggtgtttgtc aatgtgactg atccaagcca agtgagccat 720 ggcactggct tcacgtcctt tggcttactc aaactctga 759

<210>9 <211> 783 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> ISF38 Construção quimérica de ADN <400> 9 atgatagaaa catacagcca accttccccc agatccgtgg caactggact tccagcgagc 60 atgaagattt ttatgtattt acfctactgtt ttccttatca cecaaatgat tggatctgtg 120 ctttttgctg tgtatcttca tagaagattg gataaggtcg aagaggaagt aaaccttcat 180 gaagattttg tattcataaa aaagctaaag agatgcaaca aaggagaagg atctttatcc 240 ttgctgaact gtgaggagat gagaaggcaa tttgaagacc ttgtcaagga tataacgtta 300 aacaaagaag agaaaaaaga aaacagcttt gaaatgcaaa gaggtgatga ggatcctcaa 360 attgcagcac aegttgtaag cgaagccaac agtaatgcag catccgttct acagtgggcc 420 aagaaaggat attataccat gaaaagcaac ttggtaaccc tggaaaatgg gaaacagctg 480 acggttaaaa gacaaggact ctattatatc tatgctcaag tcaccttctg ctctaatcgg 540 gagccttcga gtcaacgccc attcatcgtc ggcctctggc tgaagcccag cagtggatct 600 gagagaatct tactcaaggc ggcaaatacc cacagttcct cccagctttg cgagcagcag 660 tctattcact tgggcggagt gtttgaatta caaccaggtg cttcggtgtt tgtcaatgtg , 720 actgatccaa gccaagtgag ccatggcact ggcttcacgt cctttggctt actcaaactc 780 tga 783 55

<210> 10 <211> 759 <212> ADN <213> Sequência artificial <220>

<223> ISF39 Construção quimérica de ADN <4 0 0> 10 60 120 180 240 300 360 420 480 S40 600 660 720 7S9 atgatcgaaa catacaacca atgaaaattt ttatgtattt ctttttgctg tgtatcttca gaagattttg tattcatgaa ttactgaact gtgaggagat aacaaagagg agacgaagaa gccaacagta atgcagcatc agcaacttgg taaccctgga tatatctatg ctcaagtcac atcgtcggcc tctggctgaa aatacccaca gttcctccca gaattacaac caggtgcttc ggcactggct tcacgtcctt aacttctccc cgatctgcgg acttactgtt tttcttatca tagaaggctg gacaagatag aacgatacag agatgcaaca taaaagccag tttgaaggct agatgaggat cctcaaattg cgttctacag tgggccaaga aaatgggaaa cagctgacgg cttctgctct aatcgggagc gcccagcagt ggatctgaga gctttgcgag cagcagtcta ggtgtttgtc aatgtgactg tggcttactc aaactctga ccactggact gcccatcagc cccagatgat tgggtcagca aagatgaaag gaatcttcat caggagaaag atccttatcc ttgtgaagga tataatgtta cagcacacgt tgtaagcgaa aaggatatta taccatgaaa ttaaaagaca aggactctat cttcgagtca acgcccattc gaatcttact caaggcggca ttcacttggg cggagtgttt atccaagcca agtgagccat <210> 11 <211> 783 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> 56 <223> ISF40 Construção quimérica de ADN <4 0 0> 11 atgatagaaa catacagcca accttccccc agatccgtgg caactggact tccagcgagc 60 atgaagattt ttatgtattt acttactgtt ttccttatca cccaaatgat tggatctgtg 120 ctttttgctg tgtatcttca tagaagattg gataaggtcg aagaggaagt aaaccttcat 180 gaagattttg tattcataaa aaagctaaag agatgcaaca aaggagaagg atcttitatcc 240 ttgctgaact gtgaggagat gagaaggcaa tttgaagacc ttgtcaagga tataacgtta 300 aacaaagaag agaaaaaaga aaacagcttt gaaatgcaaa gaggtgatga ggatcctcaa 360 attgcagcac acgttgtaag cgaagccaac agtaatgcag catccgttct acagtgggcc 420 aagaaaggat attataccat gaaaagcaac ttggtaaccc tggaaaatgg gaaaoagctg 480 acggttaaaa gacaaggact ctattatatc tatgctcaag tcaccttctg ctctaatcgg 540 gagccttcga gtcaacgccc attcatcgtc ggcctctggc tgaagcccag cagtggatct 600 gagagaatct tactcaaggc ggcaaatacc cacagttccg ccaagccttg cgggcagcag 660 tctattcact tgggcggagt gtttgaatta caaccaggtg cttcggtgtt tgtcaatgtg 720 actgatccaa gccaagtgag ccatggcact ggcttcacgt cctttggctt actcaaactc 780 tga 783

<210> 12 <211> 759 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> ISF41 Construção quimérica de ADN <400> 12 57 atgatcgaaa catacaacca aacttctccc cgatctgcgg ccactggact gcccatcagc 60 atgaaaattt ttatgtattt acttactgtt tttcttatca cccagatgat tgggtcagca 120 ctttttgctg tgtatcttca tagaaggctg gacaagatag aagatgaaag gaatcttcat 180 gaagattttg tattcatgaa aacgatacag agatgcaaca caggagaaag atccttatcc 240 ttactgaact gtgaggagat taaaagccag tttgaaggct ttgtgaagga tataatgtta 300 aacaaagagg agacgaagaa agatgaggat cctcaaattg cagcacacgt tgtaagcgaa 360 gccaacagta atgcagcatc cgttctacag tgggccaaga aaggatatta taccatgaaa 42 0 agcaactegg taaccctgga aaatgggaaa cagctgacgg ttaaaagaca aggactctat 480 tatatctatg ctcaagtcac cttctgctct aatcgggagc cttcgagtca acgcccattc 540 atcgtcggcc tctggctgaa gcccagcagt ggafccfcgaga gaatcttact caaggcggca 600 aatacccaca gttccgccaa gccttgcggg cagcagtcta ttcacttggg cggagtgttt 660 gaattacaac eaggtgcttc ggtgtttgtc aatgtgactg atccaagcca agtgagccat 720 ggcactggct tcácgtcctt tggcttactc aaactctga 759

<210> 13 <211> 260 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Polipéptideo CD154 quimérico codificado pela sequência de ADN de SEQ ID.: 1 <400> 13 58

Met 1 Ile Glu Thr Tyr 5 Ser Gin Pro Ser Pro 10 Arg Ser Val Ala Thr Gly 15 Leu Pro Ala Ser 20 Met Lys Ile Phe Met Tyr 25 Leu Leu Thr Val 30 Phe Leu Ile Thr Gin 35 Met Ile Gly Ser Val 40 Leu Phe Ala Val Tyr 45 Leu- His Arg Arg Leu Asp 50 Lys Vai Glu Glu 55 Glu Val Asn Leu His 60 . Glu Asp Phe Val Phe 65 11e Lys Lys Leu Lys Arg 70 Cys Asn Lys Gly Glu 75 Gly Ser Leu Ser 80 Leu Leu Asn Cys Glu 85 Glu Met Arg Arg Gin 90 Phe Glu Asp Leu Val 95 Lys Asp Ile Thr Leu 100 Asn Lys Glu Glu Lys Lys 105 Glu Asn Ser Phe 110 Glu Met

Gin Arg Gly Asp Glu Asp Pro Gin Ile Ala Ala His Vai Vai Ser Glu 115 120 125

Ala Asn Ser Asn Ala Ala Ser Vai Leu Gin Trp Ala Lys Lys Gly Tyr 130 135 140

Tyr Thr Met Lys Ser Asn Leu Vai Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gin Leu

145 ISO 155 ISO

Thr Vai Lys Arg Gin Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gin Vai Thr Phe 165 170 175

Cys Ser Asn Arg Glu Pro Ser Ser Gin Arg Pro Phe Ile Vai Gly Leu 180 185 190

Trp Leu Lys Pro Ser Ser Gly Ser Glu Arg Ile Leu Leu Lys Ala Ala 195 200 205

Asn Thr His Ser Ser Ser Gin Leu Cys Glu Gin Gin Ser Vai His Leu 210 215 220

Gly Gly Vai Phe Glu Leu Gin Pro Gly Ala Ser Vai Phe Vai Asn Vai 225 230 235 240

Thr Asp Pro Ser Gin Vai Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly 245 250 255

Leu Leu Lys Leu 260 59

<210> 14 <211> 252 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> pela <223> Polipéptideo CD154 quimérico codificado sequência de ADN de SEQ ID.: 2 <4 0 0> 14 60

Met 1 Ile Glu Thr Tyr 5 Asn Gin Thr Leu Pro Ile Ser 20 Met Lys Ile Phe

Ser Pro 10 Arg Ser Ala Ala Thr 15 Gly Met 25 Tyr Leu Leu Thr Vai 30 Phe Leu

Ile Tbx Gin Met Ile Gly Ser Ala 35 40 Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu 50 55 Phe Met Lys Thr Ile Gin Arg Cys 65 70 Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys 85 Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu 100 Ile Ala Ala His Vai Vai Ser Glu 115 120 Leu Gin Trp Ala Lys Lys Gly Tyr 130 135 Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gin Leu 145 150 Tyr Ile Tyr Ala Gin Vai Thr Phe 165 Gin Arg Pro Phe Ile Vai Gly Leu 180 Glu Arg Ile Leu Leu Lys Ala Ala 195 . 200 Cys Glu Gin Gin Ser Vai His Leu 210 215 Gly Ala Ser Vai Phe Vai Asn Vai 225 230 Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly 245

Leu Phe Ala Vai Tyr Leu His Arg 45

Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Vai 60

Asn Thr Gly. Glu Arg Ser Leu Ser 75 80

Ser Gin Phe Glu Gly Phe Vai Lys 90 35

Thr Lys Lys Asp Glu Asp Pro Gin 105 110

Ala Asn Ser Asn Ala Ala Ser Vai 125

Tyr Thr Met Lys Ser Asn Leu Vai 140

Thr Vai Lys Arg Gin Gly Leu Tyr 1S5 160

Cys Ser Asn Arg Glu Pro Ser Ser 170 .175

Trp Leu Lys Pro Ser Ser Gly Ser 185 190

Asn Thr His Ser Ser Ser Gin Leu 205

Gly Gly Vai Phe Glu Leu Gin Pro 220

Thr Asp Pro Ser Gin Vai Ser His 235 240

Leu Leu Lys Leu 250 61

<210> 15 <211> 260 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> pela <223> Polipéptideo CD154 quimérico codificado sequência de ADN de SEQ ID.: 3 <4 0 0> 15 62 62 Ser Pro Arg Ser Val Ala Thr Gly 10 15 Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu 25 30 Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg 45 Val Asn Leu His Glu Asp Phe Val 60 Asn Lys Gly Glu Gly Ser Leu Ser 75 80 Arg Gin Phe Glu Asp Leu Val Lys 90 95 Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu Met 105 110 . Ile Ala Ala His Val Val Ser Glu 125 Leu Gin Trp Ala Lys Lys Gly Tyr 140 Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gin Leu 155 160 Tyr Ile Tyr Ala Gin Val Thr Phe 170 175 Gin Ala Pro Phe Ile Val Gly Leu 185 190 Glu Arg Ile Leu Leu Lys Ala Ala 205 Cys Glu Gin Gin Ser Val His Leu 220

Met He .Glu Thr Tyr Ser Gin. Pro 1 5

Leu Pro Ala Ser Met Lys II e Ph.e 20

Ile Thr Gin Met IIe Gly Ser Val 35 40

Arg Leu Asp Lys Val Glu Glu Glu 50 55'

Phe IIe Lys Lys Leu Lys Arg Cys 65 70

Leu Leu Asn Cys Glu Glu Met Arg 85

Asp Ile Thr. Leu Asn Lys Glu Glu 100

Gin Arg Gly Asp Glu Asp Pro Gin 115 120

Ala Asn Ser Asn Ala Ala Ser Val 130 135.

Tyr Thr Met Lys Ser Asn Leu Val 145 ISO

Thr Val Lys Arg Gin Gly Leu Tyr 165

Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser 180

Trp Leu Lys Pro Ser Ser Gly Ser . 135 200

Asn Thr His Ser Ser Ser.Gin Leu 210 215 63

Gly Gly Vai Phe Glu Leu Gin Pro Gly Ala Ser Vai Phe Vai Asn Vai 225 230 235 240

Thr Asp Pro Ser Gin Vai Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly

245 250 25S

Leu Leu Lys Leu 260

<210> 16 <211> 252 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Polipéptideo CD154 quimérico codificado pela sequência de ADN de SEQ ID.: 4 <400> 16 64

Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gin Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly 1 .5 10 15

Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Vai Phe Leu 20 25 30 .

Ile Thr Gin Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Vai Tyr Leu His Arg 35 40 45

Arg Leu Asp. Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Vai 50 .55 50

Phe Met Lys Thr Ile Gin Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser 65 70 75 80

Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gin Phe Glu Gly Phe Vai Lys 85 90 95

Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Asp Glu Asp Pro Gin 100 105 110

Ile Ala Ala His Vai Vai Ser Glu Ala Asn Ser Asn Ala Ala Ser vai 115 120 125

Leu Gin Trp Ala Lys Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Lys Ser Asn Leu Vai 130 135 140

Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gin Leu Thr Vai Lys Arg Gin Gly Leu Tyr 145 150 155 160

Tyr Ile Tyr Ala Gin Vai Thr Phe Cys. Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser 165 170 175

Gin Ala Pro Phe Ile Vai Gly Leu Trp Leu Lys Pro Ser Ser Gly Ser 180 185 190

Glu Arg Ile Leu Leu Lys Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ser Gin Leu 195 200 ' 205

Cys Glu Gin Gin Ser Vai His Leu Gly Gly Vai Phe Glu Leu Gin pro 210 215 220

Gly Ala Ser Vai Phe Vai Asn Vai Thr Asp Pro Ser Gin Vai Ser His 225 230 235 240

Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu 245 250 65 <210> 17

<211> 260 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Polipéptideo CD154 quimérico codificado pela sequência de ADN de SEQ ID.: 5 <4 0 0> 17

Met Ile Glu Thr Tγτ Ser Gin Pro Ser Pro Arg Ser Vai Ala Thr Gly 1 5 10 15

Leu Pro Ala Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Vai Phe Leu 20 25 10

Ile Thr Gin Met Ile Gly Ser Vai Leu Phe Ala Vai Tyr Leu His Arg 35 40 45

Arg Leu Asp Lys Vai Glu Glu Glu Vai Asn Leu His Glu Asp Phe Vai 50 55 60

Phe Ile Lys Lys Leu Lys Arg Cys Asn. Lys Gly Glu Gly Ser Leu Ser 65 70 75 80.

Leu Leu Asn Cys Glu Glu Met Arg Arg Gin Phe Glu Asp Leu Vai Lys 85 90 95 66 66 Lys 105 Lys Glu Asn Ser Phe 110 Glu Met Ile Ala Ala His Val 125 Val Ser Glu Leu Gin Trp Ala 140 Lys Lys Gly Tyr Thr Leu Glu Asn Gly 155 Lys Gin Leu 160 Tyr Ile Tyr Ala 170 Gin Val Thr 175 Phe Gin Ala Pro Phe Ile Val Glv — — J· T.P11 185 190

Glu Arg 11 e Leu Leu Lys Ala Ala 205 Cys Glu Gin Gin Ser Xle His Leu 220 Gly Ala Ser Vai Phe Vai Asn Vai . 235 240 Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly 250 255

Asp IIe Thr Leu Asn Lys Glu Glu 100

Gin Arg Gly Asp Glu Asp Pro Gin 115 120

Ais Asn Ser Asn Ala Ala Ser Vai 130 135

Tyr Thr Met Lys Ser Asn Leu Vai 145 150

Thr Vai Lys Arg Gin Gly Leu Tyr 165

Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser 180

Trp Leu Lys Pro Ser Ser Gly Ser 195 200

Asn Thr Kis Ser Ser Ser Gin Leu 210 215

Gly Gly Vai Phe Glu Leu Gin Pro 225 230

Thr Asp Pro Ser Gin Vai Ser His 245

Leu Leu Lys Leu 260 <210> 18 <211> 252

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> 67

Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gin Thr Ser.Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly 1 5 .10 15 <223> Polipéptideo CD154 quimérico codificado pela sequência de ADN de SEQ ID.: 6 <4 0 0> 18 68 68 Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe 20 Ile Thr Gin Met Ile Gly Ser Ala 35 40 Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu 50 55 Phe Met Lys Thr Ile Gin Arg Cys 65 70 Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys 85 Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu 100 Ile Ala Ala His Vai Vai Ser Glu 115 120 Leu Gin Trp Ala Lys Lys Gly Tyr 130 135 Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gin Leu 145 150 Tyr Ile Tyr Ala Gin Vai Thr Phe 165 Gin Ala Pro Phe Ile Vai Gly Leu 180 Glu Arg Ile Leu Leu Lys Ala Ala 195 200 Cys Glu Gin Gin Ser Ile His Leu 210 215 Gly Ala Ser. Vai Phe Vai Asn. Vai 225 230 Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly 245

Met Tyr Leu Leu Thr Vai Phe Leu 25 30

Leu Phe Ala Vai Tyr Leu His Arg 45

Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Vai 60

Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser 75 80

Ser Gin Phe Glu Gly Phe Vai Lys 90 95

Thr Lys Lys Asp Glu Asp Pro Gin 105 ’ 110

Ala Asn Ser Asn Ala Ala Ser Vai 125

Tyr Thr Met Lys Ser Asn Leu Vai 140'

Thr Vai Lys Arg Gin Gly Leu Tyr 155 160

Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser 170 175

Trp Leu Lys Pro Ser Ser Gly Ser 185 190

Asn Thr His Ser Ser Ser Gin Leu 205

Gly Gly Vai Phe Glu Leu Gin Pro 220

Thr Asp Pro Ser Gin Vai Ser His 235 240

Leu Leu Lys Leu 250 <210> 19 69

<211> 260 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> pela <223> Polipéptideo CD154 quimérico codificado sequência de ADN de SEQ ID.: 7 <4 0 0> 19 70

Met Ile Glu Thr Tyr Ser Gin Pro Ser Pro Arg Ser Vai Ala Thr Gly 1 S 10 15

Leu Pro Ala Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Vai Phe Leu 20 25 30

Ile Thr Gin Met Ile Gly Ser Vai Leu Phe Ala vai Tyr Leu His Arg 35 40 45

Arg Leu Asp Lys Vai Glu Glu Glu Vai Asn Leu His Glu Asp Phe Vai 50 55 60

Phe Ile Lys Lys Leu Lys Arg Cys Asn Lys Gly Glu Gly Ser Leu Ser 65 70 75 80

Leu Leu Asn Cys Glu Glu Met Arg Arg Gin Phe Glu Asp Leu Vai Lys 85 90 95

Asp Ile Thr Leu Asn Lys Glu Glu Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu Met 100 105 110

Gin Arg Gly Asp Glu Asp Pro Gin Ile Ala Ala His Vai Vai Ser Glu 115 120 125

Ala Asn Ser Asn Ala Ala Ser Vai Leu Gin Trp Ala Lys Lys Gly Tyr 130 135 140

Tyr Thr Met Lys Ser Asn Leu Vai Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gin Leu 145 150 155 160

Thr Vai Lys Arg Gin Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gin Vai Thr Phe 165 170 175 ·

Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gin Ala Pro Phe Ile Vai Gly Leu 180 185 190

Trp Leu Lys Pro Ser Ser Gly Ser Glu Arg Ile Leu Leu Lys Ala Ala 195 200 205 71

Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gin Gin Ser Ile His Leu 210 215 220

Gly Gly Vai Phe Glu Leu Gin Pro Gly Ala Ser Cys Phe Vai Asn Vai 225 230 235 240

Thr Asp Pro Ser Gin Vai Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly 245 250 255

Leu Leu Lys Leu 260

<210> 20 <211> 252 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Polipéptideo CD154 quimérico codificado pela sequência de ADN de SEQ ID.: 8 <400> 20 72

Mefc Ile Glu Thr Tyr ASn Gin Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly 15 10 15

Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Vai Phe Leu 20 25 30 lie Thr Gin Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Vai Tyr Leu His Arg 35 40 45

Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Vai 50 55 60

Phe Met Lys Thr Ile Gin Arg Cys Ásn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser 65 70 75 80

Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gin Phe Glu Gly Phe Vai Lys 85 90 95

Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Asp Glu Asp Pro Gin 100 . 105 110

Ile Ala Ala His Vai Vai Ser Glu Ala Asn Ser Asn Ala Ala Ser Vai 115 120 125

Leu Gin Trp Ala Lys Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Lys Ser Asn Leu Vai 130 135 140

Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gin Leu Thr Vai Lys Arg Gin Gly Leu Tyr 145 150 155 160

Tyr ile Tyr Ala Gin Vai Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser 165 170 175

Gin Ala Pro Phe II e Vai Gly Leu Trp Leu Lys Pro Ser Ser Gly Ser 180 185 190

Glu Arg Ile Leu Leu Lys Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro 195 200 205

Cys Gly Gin Gin Ser Ile His Leu Gly Gly Vai Phe Glu Leu Gin Pro 210 215 220

Gly Ala Ser Vai Phe Vai Asn Vai Thr Asp Pro Ser Gin Vai Ser His 225 230 235 240

Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu 245 250 73

<210> 21 <211>2 60 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Polipéptideo CD154 quimérico codificado pela sequência de ADN de SEQ ID.: 9 <400> 21

Met Ile Glu Thr. Tyr Ser Gin Pro Ser Pro Arg Ser Val Alá Thr Gly 1 5 10 15 Leu Pro Ala Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu 20 25 30 Ile Thr Gin Met Ile Gly Ser Val Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg 35 40 45 Arg Leu Asp Lys Vai Glu Glu Glu Val Asn Leu His Glu Asp Phe Val 50 55 60 Phe Ile Lys Lys Leu Lys Arg Cys Asn Lys Gly Glu Gly Ser Leu Ser 65 70 75 SO 74

Leu Leu Asn Cys Glu Glu Met Arg Arg Gin Phe Glu Asp Leu Vai Lys 85 90 95

Asp Ile Thr Leu Asn Lys Glu Glu Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu Met 100 105 110

Gin Arg Gly Asp Glu Asp Pro Gin Ile Ala Ala His Vai Vai Ser Glu 115 120 125

Ala Asn Ser Asn Ala Ala Ser Vai Leu Gin Trp Ala Lys Lys Gly Tyr 130 135 140

Tyr Thr Met Lys Ser Asn Leu Vai Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gin Leu 145 150 155 160

Thr. Vai Lys Arg Gin Gly Leu Tyr Tyr 11 e Tyr Ala Gin Vai Thr Phe 165, 170 175

Cys Ser Asn Arg Glu Pro Ser Ser Gin Arg Pro Phe Ile Vai Gly Leu 180 185 190

Trp Leu Lys Pro Ser Ser Gly Ser Glu Arg Ile Leu Leu Lys Ala Ala 195 200 205

Asn Thr His Ser Ser Ser Gin Leu Cys Glu Gin Gin Ser Ile His Leu 210 215 220

Gly Gly Vai Phe Glu Leu Gin Pro Gly Ala Ser Vai Phe Vai Asn Vai 225 230 235 240

Thr Asp Pro Ser Gin Vai Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly 245 250 255 r

Leu Leu Lys Leu 260

<210> 22 <211> 252 <212> PRT <213> Sequência artificial 75 <22 0> pela <223> Polipéptideo CD154 quimérico codificado sequência de ADN de SEQ ID.: 10 <400> 22 76

Met IIe Glu Thr Tyr Asn Gin Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly 1 5 Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe 20 Ile Thr Gin Met Ile Gly Ser Ala 35 40 Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu 50 55 phe Met Lys Thr Ile Gin Arg Cys 65 70 Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys 85 Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu 100 Ile Ala Ala His Vai Vai Ser Glu 115 120 Leu Gin Trp Ala Lys Lys Gly Tyr 130 135 Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gin Leu 145 150 Tyr Ile Tyr Ala Gin Vai Thr Phe 165 Gin Arg Pro Phe Ile Vai Gly Leu 180 Glu Arg Ile Leu Leu Lys Ala Ala 195 200 Cys Glu Gin Gin Ser Ile His Leu 210 215 Gly Ala Ser Vai Phe Vai Asn Vai 225 230 Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly 245 10 15

Met Tyr Leu Leu Thr Vai Phe Leu 25 30

Leu Phe Ala Vai Tyr Leu His Arg 45

Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Vai 60

Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser 75 80

Ser Gin Phe Glu Gly Phe Vai Lys 90 95

Thr Lys Lys Asp Glu Asp Pro Gin 105 110

Ala Asn Ser Asn Ala Ala Ser Vai 125

Tyr Thr Met Lys Ser Asn Leu Vai 140

Thr Vai Lys Arg Gin Gly Leu Tyr 155 160

Cys Ser Asn Arg Glu Pro Ser Ser 170 175 ,Trp Leu Lys Pro Ser Ser Gly Ser 185 190

Asn Thr His Ser Ser Ser Gin Leu 205

Gly Gly Vai Phe Glu Leu Gin Pro 220

Thr.Asp Pro Ser Gin Vai Ser His 235 240

Leu Leu Lys Leu 250 77

<210> 23 <211> 260 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> pela <223> Polipéptideo CD154 quimérico codificado sequência de ADN de SEQ ID.: 11 <400> 23 78

Met Ile Glu Thr Tyr Ser Gin Pro Ser Pro Arg Ser Vai Ala .Thr Gly 1 5 10 15

Leu Pro Ala Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Vai Phe Leu 20 25 30

Ile Thr Gin Met Ile Gly Ser Vai Leu Phe Ala Vai Tyr Leu His Arg 35 40 45

Arg Leu Asp Lys Vai Glu Glu Glu Vai Asn Leu His Glu Asp Phe Vai 50 55 . 60

Phe Ile Lys Lys Leu Lys Arg Cys Asn Lys Gly Glu Gly Ser Leu Ser 65. 70 75 80

Leu Leu Asn Cys Glu Glu Met Arg Arg Gin Phe Glu Asp Leu Vai Lys 85 90 95

Asp Ile Thr Leu Asn Lys Glu Glu Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu Met 100 105 110

Gin Arg Gly Asp Glu Asp Pro Gin Ile Ala Ala His Vai Vai Ser Glu 115 120 125

Ala Ásn Ser Asn Ala Ala Ser Vai Leu Gin Trp Ala Lys Lys Gly Tyr 130 135 140

Tyr Thr Met Lys Ser Asn Leu Vai Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gin Leu 145 150 . 155 160

Thr Vai Lys Arg Gin Gly Leu'Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gin Vai Thr phe 165 170 175

Cys Ser Asn Arg Glu Pro Ser Ser Gin Arg Pro Phe Ile Vai Gly Leu 180 185 190 79

Txp Leu Lys Pro Ser Ser Gly Ser Glu Axg Ile Leu Leu Lys Ala Ala 195 200 205

Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gin Gin Ser Ile His Leu 210 215 220

Gly Gly Vai Phe Glu Leu Gin Pro Gly Ala Ser Vai Phe Vai Asn Vai 225 230 235 240

Thr Asp Pro Ser Gin Vai Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly 245 250 255

Leu Leu Lys Leu 260

<210> 24 <211> 252 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Polipéptideo CD154 quimérico codificado pela sequência de ADN de SEQ ID.: 12 <400> 24 80

Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gin Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly 1 S 10 15

Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Vai Phe Leu 20 25 30

Ile Thr Gin Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Vai Tyr Leu His Arg 35 40 45

Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Vai 50 55 60

Phe Met Lys Thr Ile Gin Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser 65 70 75 80

Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gin Phe Glu Gly Phe Vai Lys 85 90 95

Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Asp Glu Asp Pro Gin 100 105 110

Ile Ala Ala His Vai Vai Ser Glu Ala Asn Ser Asn Ala Ala Ser Vai 1 115 120 125

Leu Gin Trp Ala Lys Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Lya Ser Asn Leu Vai 130 135 140

Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gin Leu Thr Vai Lys Arg Gin Gly Leu Tyr 145 150 155 160

Tyr Ile Tyr Ala Gin Vai Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Pro Ser Ser 165 170 175

Gin Arg Pro Phe Ile Vai Gly Leu Trp Leu Lys Pro Ser Ser Gly Ser 180 185 190

Glu Arg Ile Leu Leu Lys Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro 195 200 . 205

Cys Gly Gin Gin Ser Ile His Leu Gly Gly Vai Phe‘Glu Leu Gin Pro 210 215 220

Gly Ala Ser Vai Phe Vai Asn Vai Thr Asp Pro Ser Gin Vai Ser His 225 230 235 240

Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu . 245 250 2

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista das referências citadas pelo requerente serve apenas para conveniência do leitor. Não faz parte do documento da patente europeia. Apesar da compilação cuidadosa das referências, os erros ou as omissões não podem ser excluídos e o IEP rejeita toda a responsabilidade a este respeito.

Documentos de patente citados na descrição: WO 9826061 A, Kipps [0014] WO 9876061 A, Kipps [0035]

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Lisboa, 14/05/2010

Claims (17)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Molécula de ácido nucleico com uma sequência de nucleótidos seleccionada do grupo constituído pelas SEQ ID Ns°. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12.

2. Molécula de ácido nucleico da reivindicação 1, em que a molécula de ácido nucleico possui uma sequência de nucleótidos seleccionada do grupo constituído pelas SEQ ID Ns. 0 2, 4, 6, 8, 10 e 12.

3. Molécula de ácido nucleico da reivindicação 1, em que a molécula de ácido nucleico possui uma sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo constituído pelas SEQ ID Ns.° 14, 16, 18, 20, 22 e 24.

4. Vector de expressão compreendendo a molécula de ácido nucleico da reivindicação 1.

5. Vector de expressão da reivindicação 4, compreendendo ainda ADN virai ou ADN bacteriano.

6. Vector de expressão da reivindicação 5 em que o ADN virai mencionado é seleccionado do grupo constituído por ADN adenoviral e ADN retroviral.

7. Vector de expressão da reivindicação 6, em que pelo menos uma porção do vector compreende ADN adenoviral. 2

8. Construção genética compreendendo a molécula de ácido nucleico da reivindicação 1, ligada funcionalmente a uma sequência promotora e a uma sequência de sinal de poliadenilação.

9. Célula hospedeira compreendendo um vector de expressão da reivindicação 4 ou uma construção genética da reivindicação 8.

10. Célula hospedeira da reivindicação 9, em gue a célula é um célula CD40+ humana.

11. Célula hospedeira da reivindicação 9, em gue a célula é uma célula de tumor.

12. Célula hospedeira da reivindicação 9, em que a célula é uma célula apresentadora de antigénios.

13. Célula hospedeira de qualquer uma das reivindicações 9 a 12, em que a célula é uma célula B.

14. Polipeptideo CD154 quimérico com uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo constituído pelas SEQ ID Ns.° 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 e 29.

15. Processo de produção de um CD154 quimérico da reivindicação 14, compreendendo a cultura de uma célula hospedeira da reivindicação 9 nas condições adequadas à realização da expressão da proteína. 3

16. Utilização de uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo CD154 quimérico de acordo com a reivindicação 1 para a preparação de um medicamento para induzir a activação de uma célula do sistema imunitário, sendo o CD154 quimérico expresso na superfície da célula.

17. Utilização de acordo com a reivindicação 16, em que a célula é um célula humana CD40+. Lisboa 14/05/2010 1/5 DIVISÕES DO DOMÍNIO CD145 HUMANO NHg· REGIÃO EXTRACELULAR m IV -COOH CD145 DE MURINO I Π

QUIMERAS ISF - CONTRIBUIÇÃO DA SEQUENCIA CD145 HUMANO/RATINHO REGIÃO QUE CONTRIBUI PARA EXPRESSÃO SECUNDÁRIA DA MEMBRANA REGIÃO DE DETECÇÃO DE CLIVAGEM PROTEOLÍTICA REGIÃO DE E ANTICORPOS EXPRESSÃO DE CÉLULAS B REGIÃO DE NEUTRALIZAÇÃO DE ANTICORPOS ISF30 ISF31 ISF32 ISF33 ISF34 ISF35

ISF36 ISF37 ISF38 ISF39 ISF40 ÍSF41

Figura 2 2/5 P.CDNA3 mCD154 ISF3Q ISF31 1SF32

1SF33 ISF34 ISF35 ISF3B ISF39

INTENSIDADE RELATIVA DE FLUORESCÊNCIA Figura 3 Activação ISF de Ramos mCD154 ISF30 ISF31 ’ ISF32 ISF33 ISF34 ISF35 ISF38 ISF39

INTENSIDADE RELATIVA DE FLUORESCÊNCIA Figura 4 Actividade ISF de Neutralização Especifica do Anticorpo CD145 mCD154 hCD154 ISF30 ISF31 ISF32 ISF33 ISF34 ISF35 ISF38 ISF39

INTENSIDADE RELATIVA DE FLUORESCÊNCIA 3/5 Figura 5 Construções ISF de Ligação Especifica do Anticorpo CD14 5 CONTROL CONTROLO mCD154 SEM PLASMA

10° 101 102 103 104 10° 101 102 103 104 10° 101 102 103 104 10° 101 102 103 104 1SF30 ISF35 INTENSIDADE RELATIVA DE FLUORESCÊNCIA Figura 6 Infecção com Ad-ISF de Células HeLa Ad-mCD154 Ad-1SF32 Ad-ISF35

INTENSIDADE RELATIVA DE FLUORESCÊNCIA Figura 7 Infecção com Ad-ISF de Células B CLL 4/5

10° ΙΟ1 ΙΟ2 103 ΙΟ4· 10° 101 ΙΟ2 ΙΟ3 ΙΟ4 10° ΙΟ1 ΙΟ2 103 ΙΟ4 10° 101 ΙΟ2 ΙΟ3 ΙΟ4 INTENSIDADE RELATIVA DE FLUORESCÊNCIA Figura 8 Activação de Células B CLL de infectadas com Ad- ISF CD80 CD70 CD86 CD95 CD54 . CD27 Ad-LacZ

Ad-mCD154 Ad-ISF34 Ad-ISF35

; * «« * «* ^

« ..I

U4 I·’ 10* ,e* «0* INTENSIDADE RELATIVA DE FLUORESCÊNCIA Figura 9 Mapeamento do Elemento Regulador que Permite a Expressão ISF em Células CD40 positivas no Domínio IV de CD145 5/5 m iViuríno Π Humano He La CLL

INTENSIDADE RELATIVA DE FLUORESCÊNCIA hCD154 mCD154 ISF5 ISF12 ISF24 ISF32 Figura 10 Resistência a ISF Para Clivagem Em CD145 Solúvel SEM INFECCÃO Ad-hCD154

Ad-ISF35- 0 20 r ' ' I |—I 1—I 1—i 1—I 1—I r- 40 60 80 100CD145 SOLÚVEL (ne/mh Ί—I-r120 >—I—1—1 140