CN100482283C - 新型嵌合cd154 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了编码嵌合CD154的分离的多核苷酸序列，其包括第一核苷酸序列，编码非人类CD154，优选地鼠CD154的胞外亚域，其替换了人CD154上的一个切割位点，和第二核苷酸序列，编码人CD154的胞外亚域，其可以结合人CD154受体。第一核苷酸序列优选地进一步编码非人类CD154的胞外亚域，其对于细胞表达所述的CD154是关键的，例如人CD40+细胞，并且编码另一个胞外结构域，其通过结合抗鼠抗体来检测嵌合CD154的表达。第二核苷酸序列优选地进一步编码人CD154的胞外亚域，其功能上抑制抗CD154抗体的结合。本发明也提供了嵌合CD154，其由以上所述的多核苷酸序列编码，也提供了含有该多核苷酸序列的表达载体和基因载体，含有该表达载体或者基因载体的宿主细胞，用于产生嵌合CD154的工艺过程，以及利用含有嵌合CD154多核苷酸序列的该表达载体和遗传学构建物的方法。

Description

新型嵌合CD154
技术领域
【0001】本发明涉及生物化学，免疫学，遗传工程，以及医学领域。特别地，本发明与新型的嵌合配体有关，当表达于细胞表面时，嵌合配体比相应的天然配体更加稳定，但其仍保持了天然配体的受体结合功能，并且不具有免疫原性。
发明背景
【0002】免疫系统通过消除恶性肿瘤细胞，是通过识别恶性肿瘤细胞为外源的，随后从身体中清除之。为了完成该任务，免疫系统激活了抗体应答以及细胞应答。这两种应答需要免疫系统的很多不同细胞的相互作用(Abbas，Cellular and Molecular Immunology，2000)。
【0003】免疫反应一般起始于T淋巴细胞(T细胞)，T淋巴细胞在其表面具有T细胞受体(TCR)，可结合与II类主要组织相容性复合物(MHC)分子相关的抗原肽(antigen derived peptide)。T细胞在其表面也表达多种多肽，由于它们结合细胞上的与免疫介导应答相关的受体，它们被作称为“配体”，如以下详细说明的。当T细胞受体结合一个MHC-相关抗原时，这样的一种抗原来自一种恶性肿瘤细胞，它被活化并且在它的表面上表达一种配体。该配体仅仅存在于该细胞表面一段短的时间，并且一旦将它从细胞的表面去除，T细胞结合受体承载细胞的能力也将丧失。一种这样的配体被称为CD154。
【0004】CD154是配体的一个较大家族中的一个成员，集体地被称作TNF超家族(肿瘤坏死因子超家族)(Gruss et al，Cytokines Mol Ther，1：75-105，1995以及Locksley et al，Cell，104：487-501，2001)。TNF超家族的成员包括Fas配体(“FasL”)，TNFα，LTα，淋巴毒素(TNFβ)，CD154，TRAIL，CD70，CD30配体，4-1BB配体，APRIL，TWEAK，RANK配体，LIGHT，AITR配体，外胚层发育不良因子(ectodysplasin)，BLYs，VEGI，和OX40配体。TNF超家族成员具有保守的二级结构，含有四个结构域：结构域I，胞内结构域；结构域II，其跨越细胞膜，已知为跨膜结构域；结构域III，其由与细胞膜最接近的胞外氨基酸组成；和，结构域IV，远端的细胞外结构域(Kipps et al.，WO98/26061，1998年6月18日出版)。典型地，结构域IV的至少一部分可以从母体分子(parent molecule)上切除。经切割的片段一般表现出完整配体的同样生物活性，并且传统上被指称为TNF家族成员的“可溶形式(soluble form)”。
I)CD154的生物学活性
【0005】在CD154(也称作为CD40配体)和它的相应受体，CD40，之间的相互作用对于免疫识别是很关键的。(Banchereau J.et.，Annu. Rev.Immunol.12：881-922，1994；Laman J.D.et al.，Crit.Rev.Immunol.，16：59-108，1996)。经过抗原呈递细胞通过MHC II类分子的T细胞受体结合，CD154在CD4+T细胞中瞬时表达。(Roy M.et al.，J.Immunol.，151：2497-2510，1993；Hepmann P et al.，Eur.J.Immunol.，23：961-964，1993；Castle B.E.et al.，J.Immunol.，151：1777-1788，1993；Cantwell M.et al.，Nat.Med.，3：984-989，1997)。这样，反过来，可以引起表达CD40的抗原呈递细胞(APCs)的活化，包括B细胞，树状细胞，单核细胞，和巨噬细胞。(Ranheim E.A.et al.，J.Exp.Med.，177：925-935，1993；Ranheim E.A.et al.，Cell.Immunol.，161：226-235，1995)。这样的CD40活化细胞可以引发免疫激活事件的瀑布效应，其可以导致特异性和有效的免疫应答，针对外源抗原，例如病毒或肿瘤。CD40和CD154之间的相互作用的重要性通过如下发现而受到强调，对于CD40配体具有遗传学缺陷的个体具有极度的免疫缺陷。(Korthauer J.et al.，Nature，361：539-541，1993；Aruffo A.et al.，Cell.，72：291-300，1993)。这样的病人具有免疫缺陷综合征，与损伤的生发中心形成、缺陷的同种型转换、以及对于各种细菌和病毒病原体的显著易感性相关。
【0006】由于CD154在免疫调控中是如此关键的一种分子，存在几种机制控制人CD154的表达。首先，膜表达的CD154可以被切割，并且CD154的胞外部分以可溶分子的形式被释放，其可以结合CD154受体，CD40。已经表明，蛋白水解剪切酶沿着配体的不同位点切割人CD154，并且释放可以结合CD40的CD154可溶形式，刺激免疫应答。(Pietravalle F.et al.，J.Biol.Chem.，271：5965-5967，1996；Pietravalle F.et al.，Eur.J.Immunol.，26：725-728，1996)。例如，一种研究结果表明，CD154的切割在Phe 111和Ala 123之间进行(Pietravalle F.et al.，Eur.J.Immunol.，26：725-728，1996)，并且也报导了在Met 113上切割。第二，CD154与其相关受体之间的相互作用，可以引发CD154表面表达的快速下调作用(rapid downmodulation)。(Cantwell M.et al.，Nat.Med.，3：984-989，1997)。第三，TCR连接以后，CD154的基因转录被最大量的配体表达紧密调控4到6小时，然后CD154的RNA和蛋白质合成急剧下降(ld.)总的来说，这些调控机制保证了对于一个特异抗原的免疫应答的特异性。保持CD154表达的严紧控制的重要性通过患有系统性红斑狼疮(SLE)的个体可以予以说明。这些病人似乎过度表达CD154，并且在他们的血浆中具有增高水平的可溶性CD154，这说明未受控制的CD154表达对SLE疾病活动有作用。(Kato K.et al.，J.Clin. Invest.，101：1133-1141，1998；Vakkalanka R.K.，Arthritis Rheum.，42：871-881，1999)。
【0007】应用CD154进行免疫治疗的可能性是在积极研究之中。因为CD154是潜在的免疫激活剂，作为癌症治疗的CD154是研究的一个主要热点，由于赘生性细胞(neoplastic cells)一般呈递抗原较差并且不能刺激强有力的抗肿瘤应答。例如，应用复制缺陷型腺病毒载体修饰慢性淋巴细胞白血病(CLL)B细胞，以便表达CD154，这可以增强CLL抗原呈递，并且诱发针对非修饰CLL B细胞的自身T细胞毒性(Kato K.et al.，J.Clin.Invest.，101：1133-1141，1998)。此外，应用Ad-CD154修饰的CLL B细胞的I期临床研究显示出前途有望的治疗结果。(Wierda W.G.et al.，Blood，96：2917-2924，2000)。相似地，其它研究表明修饰多种肿瘤类型(tumor types)以便表达CD154可以在动物模型中诱发有效的抗肿瘤免疫应答(anti-tumor immune response)。
【0008】操作B细胞和其它肿瘤的研究证实，通过增强赘生性细胞(neoplastic cell)自身的抗原递呈，如同在CLL和B细胞淋巴瘤中的情形那样，或者通过激活旁立者抗原递呈细胞(bystander antigenpresenting cells)，诸如可以起始抗肿瘤免疫应答的树状细胞，如同在CD40阴性肿瘤中的情形那样。然而，另外的研究也表明了CD154可能对于某些肿瘤，特别是乳腺癌，具有直接的生长抑制效应。(Tong A.W.et al.，Clin.Cancer Des.，7：691-703，2001；Hirano A.，Blood，93：2999-3007，1999)。此外，有证据表明某些类型的淋巴瘤的生长可以直接通过CD40连接(CD40 ligation)予以抑制。(Wilsey J.A.et al.，J. Immunol.，158：2932-2938，1997)。正是这样，CD154免疫治疗对于很广范围的肿瘤应当是适合的。
II)目前CD154构建物的缺点
【0009】尽管CD154是潜在的强有效的治疗剂，用于临床治疗的CD154形式很可能对安全性和效率有主要影响。
【0010】例如，仅仅包括CD154的胞外、受体结合结构域的重组可溶性CD154(recombinant soluble CD145，rsCD154)是具有功能性的。(Armitage R.J.，Eur.J.Immunol.，23：2326-2331，1993；Lane P.，J.Exp. Med.，177：1209-1213，1993)。然而rsCD154并不如在细胞膜上表达的天然CD154在诱发CD40的信号途径中有效，因为理想的信号系统需要在细胞表面的CD40受体的多聚化(Schwabe R.F.et al.，Hybridoma，16：217-226，1997)。作为结果，配体多聚化结构域已经通过基因工程，例如亮氨酸拉链或者CD8结构域，被连接到rsCD154的N端结构域来提高受体的信号传导。(Lans P.，et al.，J.Exp.Med.177：1209-1213，1993；Morris A.E..，J.Biol.Chem.274：418-423，1999)。同样地，可溶性CD154(soluble CD154)对于交联CD40并不是理想的，因为，与膜表达CD154(membrane-expressed CD154)相比，它并不能对抗原呈递细胞(antigen-presenting cells)提供强的刺激。
【0011】此外，介导CD40信号系统的可溶性试剂可以引发不利的生理学效应。例如，用可溶性的CD154-CD8融合蛋白注射的小鼠可以引起肺炎。(Wiley J.A.et al.，J.Immunol.，158：2932-2938，1997)。同样地，施用CD40-活化的单克隆抗体给免疫受损的小鼠诱发了致命的肠损害。(Hixon J.A.et al.，Biol.Blood Marrow Transplant.，7：136-143，2001)。与系统性施用可溶性CD154相关的毒性看起来是TNF家族的一般性特征，由于发现施用可溶性TNF-α，FasL，和TRAIL之后也观察到了逆效应。
【0012】可溶性CD154的另一个缺陷是TNF家族成员在系统性施用之后具有较短的半衰期。(Spriss D.R.et al.，Ciba Found.Symp.，131：206-227，1987；Funahashi I.Et al.，Br.J.Cancer.，67：447-455)。这一短的半衰期需要或者传送高剂量的rsCD154或者在一段时间内的连续输注，这不仅增加毒性的几率，而且需要分离大量的rsCD154蛋白质，这是一个困难的并且耗费时间的过程。
【0013】归因于应用可溶性CD154(soluble CD154)固有的问题，膜表达全长人CD154(membrane-expressed full-length human CD154)似乎是较好的选择。然而，天然的人CD154(native human CD154)也具有可能限制其效率或者安全性的特征。正如以前所提及的，全长CD154被切割，并且以可溶性分子释放，潜在地可能具有与所描述的rsCD154相似的毒性。此外，膜结合CD154的蛋白酶切割可能降低其功能活性。尽管来自CD154所推定的切割位点的缺失可能降低其代谢，但是由于存在多个蛋白酶切割位点，其并不能完全消除CD154加工(CD154processing)。(Mazzei G.J.et al.，J.Biol.Chem.，270：7025-7028，1995；Pistravalle F.et al.，J.Biol.Chem.，271：5965-5967，1996)。此外，与应用全长人CD154相关的一个不太明显的问题是它的细胞-类型特异性表达(cell-type specific expression)。例如，某些细胞类型，尤其是B-细胞来源的细胞，其排除了人CD154(human CD154)的表达。(Kato K.et al.，J.Clin.Invest.101：1133-1141，1998；Cantwell M.et al.，Nat.Med.，3：984-989，1997)。
【0014】令人感兴趣的是，对于治疗应用，鼠CD154(murine CD154，mCD154)比天然人CD154(native human CD154)或者rsCD154更具优势。相对于人CD154，鼠CD154对蛋白酶的切割具有相对抗性。此外，通过大多数细胞类型表达mCD154，包括排除人CD154表达的B-细胞来源的细胞，一般指作为CD40+细胞。(Id.)正如这样，mCD154在对于一种类型的CD40+细胞，CLL细胞的CD154基因治疗的临床试验中被予以表达。(Wierda W.G.，Blood，96：2917-2924(2000)。
【0015】在人中应用mCD154表现出其自身的问题。例如，在连续注射Ad-CD154修饰的CLL细胞给病人以后，白血病细胞随着每一次连续的注射而减少。通过第五次连续的注射，四个CLL病人中的三个变得对于表达mCD154的细胞的活性具有抵抗性。活性的损失很可能归因于产生了抗鼠CD154分子的抗体，使得不可能进行进一步的治疗。用于确定针对CD154的结合和中和抗体的形成的分析表明，通过三次重复注射Ad-mCD154转导CLL细胞产生了抗鼠CD154抗体。此外，抗-CD154抗体也可能中和鼠CD154的功能。这样，尽管存在mCD154总体上的安全性，表达稳定性，和短期有效性，在人中长期重复施用mCD154将很困难。
【0016】由于目前CD154构建物的缺点，很清楚需要优选的CD154构建物，用于疾病的治疗，该CD154构建物具有在人CD154(humanCD154)和鼠CD154(murine CD154)发现的特征。优选的CD154构建物(preferred CD154 construct)在不同的细胞类型上表达，包括B-细胞来源的淋巴细胞。此外，CD154构建物是膜稳定的(membrane-stabilized)，并且对于蛋白酶的切割有抗性，而且因此不太可能产生CD154的可溶形式(soluble form)。然而，优选的CD154构建物保持天然CD154的受体结合功能。在mCD154中，发现了这两种特征。此外，优选的CD154构建物在施用于人以后，在受体结合的重要结构域上没有免疫原性，这样避免了功能性中和(functionalneutralization)。本发明提供了这样的CD154构建物。
发明概述
【0017】本发明涉及具有人CD154和鼠CD154的大多数有益特征的新型的嵌合CD154多肽(chimeric CD154 polypeptides)，正是这样，对于疾病治疗是安全有效的。特别地，嵌合CD154(chimeric CD154)可以在不同的细胞类型中表达，包括B细胞。其对于蛋白酶的切割不太具有抗性，所以在表达于细胞膜上时更加稳定。此外，嵌合CD154没有免疫原性，并且因此不能被抗-CD154的抗体所中和。最后，其保持了人CD154的受体结合能力，并且因此可以引起在人中相同类型的免疫反应。
【0018】这些新型嵌合CD154多肽是嵌合的，原因在于它们由来自至少两个不同物种的CD154结构域(domains或者亚(结构)域(subdomains)所组成，优选地是人和鼠CD154。这些多肽已经被命名为“免疫刺激因子(immune stimulatory factors)”或者ISF’s，因为它们组合了人和非人CD154的区域来最大化地刺激免疫应答(immuneresponse)。特别地，含有人CD154切割位点的CD154的至少一个结构域或者亚结构域被非人CD154，优选鼠CD154相对应的结构域或者亚结构域替代。此外，嵌合多肽由负责结合CD154受体的人CD154的结构域或者亚结构域组成。本发明也与编码嵌合CD154的新型多核苷酸序列，含有新型多核苷酸序列的表达载体，以及产生嵌合CD154的方法相关。最后，本发明与应用表达载体来增强转染细胞的免疫反应性以及治疗瘤形成(neoplasia)的方法相关。
【0019】这样，本发明的一个方面与编码嵌合CD154的分离的多核苷酸有关，包括第一核苷酸序列，其编码非人动物CD154的胞外亚结构域，它替代了人CD154的一个切割位点，和第二核苷酸序列，其编码结合人CD154受体的人CD154的胞外亚结构域。
【0020】本发明的一方面是上述的分离多核苷酸序列(isolatedpolynucleotide sequence)，其中的第一核苷酸序列进一步编码非人动物CD154的胞外亚结构域，这对于在细胞中表达所述CD154具有关键作用。
【0021】本发明的一个方面是以上所述的分离多核苷酸序列，其中所述表达细胞是人CD40+细胞。
【0022】本发明的一个方面是以上所述的分离多核苷酸序列，其中所述表达细胞是人CLL细胞。
【0023】本发明的一个方面是以上的分离多核苷酸序列，正如以上所述的那些，其中的第一核苷酸序列另外编码用于检测由多核苷酸序列编码的配体表达的胞外结构域，由于其结合于抗鼠CD154抗体。
【0024】本发明的一个方面是以上的分离多核苷酸序列，正如以上所述的那些，其中的第一核苷酸序列编码非人类动物CD154的结构域IV的亚结构域。
【0025】本发明的一个方面是以上的分离多核苷酸序列，正如以上所述的那些，其中的第一核苷酸序列编码非人类动物CD154的结构域III或者结构域III的亚结构域。
【0026】本发明的一个方面是以上的分离多核苷酸序列，其中的第一核苷酸序列编码结构域III的亚结构域，它替换人CD154的切割位点的一部分。
【0027】本发明的一个方面是以上的分离的多核苷酸序列，正如以上所述的那些，其中的第一核苷酸序列进一步还编码非人类动物CD154的结构域II或者结构域II的亚结构域。
【0028】本发明的一个方面是以上的分离的多核苷酸序列，正如以上所述的那些，其中的第一核苷酸序列进一步还编码非人类动物CD154的结构域I或者结构域I的亚结构域。
【0029】本发明的一个方面是以上的分离的多核苷酸序列，正如以上所述的那些，其中的第一核苷酸序列进一步还编码非人类动物CD154的结构域I，II和III。
【0030】本发明的一个方面是以上的分离多核苷酸序列，正如以上所述的那些，其中的非人类动物CD154是鼠CD154。
【0031】本发明的一个方面是以上的分离多核苷酸序列，正如以上所述的那些，其中的第二核苷酸序列进一步还编码人CD154的胞外亚结构域，其替换功能性抑制抗-CD154抗体结合的区域。
【0032】本发明的一个方面是以上的分离多核苷酸序列，正如以上所述的那些，其中的第二核苷酸序列编码人CD154结构域IV的亚结构域。
【0033】本发明的一个方面是以上的分离的多核苷酸序列，正如以上所述的那些，其中的序列选自SEQ.ID.NOS.1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11和12。
【0034】本发明的一个方面是以上的分离的多核苷酸序列，正如以上所述的那些，其中的序列编码选自SEQ.ID.NOS.13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，和24的氨基酸序列。
【0035】本发明的一方面是嵌合CD154，其包括非人动物CD154的第一亚结构域，其中该亚结构域替换了人CD154的切割位点，以及人CD154的第二亚结构域，其结合CD154受体。
【0036】本发明的一方面是以上的嵌合CD154，其对于在细胞表面的切割相对于人CD154不敏感。
【0037】本发明的一方面是以上的嵌合CD154，其中的嵌合CD154的切割速率比人CD154的切割速率至少小90％。
【0038】本发明的一方面是以上的嵌合CD154，正如以上所述的那些，其中的第一亚结构域对于通过细胞表达多肽很重要。
【0039】本发明的一方面是以上的嵌合CD154，其中所述表达细胞是人CD40+细胞。
【0040】本发明的一方面是以上的嵌合CD154，其中的表达细胞是人CLL细胞。
【0041】本发明的一方面是以上的嵌合CD154，正如以上所述的那些，其中的第一亚结构域可以通过结合抗鼠CD154抗体来用于检测嵌合CD154的表达。
【0042】本发明一方面是以上的嵌合CD154，正如以上所述的那些，它不具有免疫原性，并且因此不能由抗CD154的抗体所中和。
【0043】本发明一方面是以上的嵌合CD154，正如以上所述的那些，其中的第一亚结构域包括非人类动物CD154的结构域IV的亚结构域。
【0044】本发明一方面是以上的嵌合CD154，正如以上所述的那些，其中的第一亚结构域进一步还包括非人动物CD154的结构域III，或者亚结构域或者结构域III。
【0045】本发明一方面是以上的嵌合CD154，其中的第一亚结构域替换了人CD154的切割位点的一部分。
【0046】本发明一方面是以上的嵌合CD154，正如以上所述的那些，其中的第一亚结构域进一步还包括非人动物CD154的结构域II，或者结构域II的亚结构域。
【0047】本发明一方面是以上的嵌合CD154，正如以上所述的那些，其中的第一亚结构域进一步还包括非人动物CD154的结构域I，或者结构域I的亚结构域。
【0048】本发明一方面是以上的嵌合CD154，正如以上所述的那些，其中的第一亚结构域进一步还包括非人动物CD154的结构域I，II和III。
【0049】本发明一方面是以上的嵌合CD154，正如以上所述的那些，其中的非人动物CD154是鼠CD154。
【0050】本发明一方面是以上的嵌合CD154，正如以上所述的那些，其中的第二亚结构域包括人CD154结构域IV的亚结构域。
【0051】本发明的一方面是含有以上的分离多核苷酸序列的一个的表达载体。
【0052】本发明的一方面是以上的表达载体，其中的多核苷酸序列编码嵌合CD154，含有鼠CD154结构域IV的亚结构域，其替换人CD154的切割位点，以及结合CD154受体的人CD154的结构域IV的亚结构域。
【0053】本发明的一方面是表达载体，正如以上所述的那些，进一步还包括多核苷酸序列，编码鼠CD154结构域IV的亚结构域，其对于在人细胞中表达鼠CD154是非常重要的。
【0054】本发明的一方面是表达载体，正如以上所述的那些，进一步还包括多核苷酸序列，编码鼠CD154的结构域III，或者结构域III的亚结构域。
【0055】本发明的一方面是表达载体，正如以上所述的那些，进一步还包括编码鼠CD154的结构域II，或者结构域II的亚结构域的多核苷酸序列。
【0056】本发明的一方面是表达载体，正如以上所述的那些，进一步还包括编码鼠CD154的结构域I，或者结构域I的亚结构域的多核苷酸序列。
【0057】本发明的一方面是表达载体，正如以上所述的那些，进一步还包括编码鼠CD154的结构域I，II和III的多核苷酸序列。
【0058】本发明的一方面是表达载体，如以上所述的那些，包括病毒DNA或者细菌DNA。
【0059】本发明的一方面是以上的表达载体，其中的病毒DNA是选自腺病毒DNA或者逆转录病毒DNA。
【0060】本发明的一方面是以上的表达载体，其中载体的至少一部分包括腺病毒DNA。
【0061】本发明的一方面是表达载体，如以上所述的那些，进一步包括一个启动子区域。
【0062】本发明的一方面是以上的表达载体，进一步包括多聚腺苷酸化的信号区域。
【0063】本发明的一方面是遗传学构建物(genetic construct)，包括以上的分离的多核苷酸序列，可操作地连接到启动子序列和多聚腺苷酸化信号序列上。
【0064】本发明的一方面是宿主细胞，包括以上的表达载体或者以上的遗传学构建物。
【0065】本发明的一方面是以上的宿主细胞，其中细胞是哺乳动物细胞。
【0066】本发明的一方面是以上的宿主细胞，其中细胞是人细胞。
【0067】本发明的一方面是宿主细胞，如上所述的那些，其中细胞是肿瘤细胞。
【0068】本发明的一方面是宿主细胞，如上所述的那些，其中细胞是抗原呈递细胞(antigen presenting cell)。
【0069】本发明的一方面是生产以上嵌合CD154的过程，包括，在适于实现蛋白质表达的条件下，培养以上的宿主细胞。
【0070】本发明的一方面是可以结合细胞表面的CD154受体的配体的浓度增加方法，包括引入细胞编码以上嵌合CD154的分离多核苷酸序列，其中所述嵌合CD154，相比人CD154，对于从细胞表面上切割更不敏感。
【0071】本发明的一方面是以上方法，用于增加配体浓度，配体可以结合在细胞表面上的CD154受体上，其中所述的分离多核苷酸序列包括以上的表达载体或者以上的遗传学构建物。
【0072】本发明的一方面是以上方法，用于增加可以结合细胞表面上的CD154受体的配体浓度，其中所述细胞在其表面表达CD154受体。
【0073】本发明的一方面是诱发免疫系统细胞活化的方法，包括引入细胞编码以上嵌合CD154的分离多核苷酸序列，以便它可以在细胞表面上表达。
【0074】本发明的一方面是一种在病人中处理瘤形成(neoplasia)的方法，包括将编码以上嵌合CD154的分离多核苷酸序列引入赘生性细胞，以便它被表达在细胞表面上。
【0075】本发明的一方面是以上用于在病人中处理瘤形成的方法，进一步还包括从病人中得到赘生性细胞，并且将以上编码嵌合CD154的上述多核苷酸序列已经引入细胞后，输注该赘生性细胞返回到病人身体中。
附图简要说明
【0076】图1。图1是说明示范性的编码本发明的嵌合CD154的多核苷酸的示意图，并且说明了与嵌合CD154的特异性特征相关的亚结构域的位置。来自鼠CD154的结构域或者亚结构域以阴影部分显示。
【0077】图2。图2是一系列的荧光活化细胞分拣(fluorescent activatedcell sorting，FACS)的直方图，说明了本发明的示范性嵌合CD154多肽的表达，即是，ISF 30-ISF 39，与鼠CD154(mCD154)和不含有CD154的对照质粒pcDNA3相比。表达的测定在用含有mCD154的pcDNA3的质粒和每一个ISF构建物转染HeLa细胞后进行。阴影区域表明了非转染HeLa细胞的表达，非阴影区域说明了转染HeLa细胞(海拉细胞)的表达。
【0078】图3。图3是一系列的FACS直方图，说明了用本发明示范性的嵌合CD154多肽转染的HeLa细胞的功能性能力，即是，ISF30-ISF39，与鼠CD154(mCD154)和不含有CD154的对照质粒比较，来活化Ramos B细胞表达表型表面标记CD70和CD95。阴影区表明非活化细胞的表面标记物的表达，在细线下的非阴影区说明了由HeLa细胞活化的B细胞表面标记物的表达，该HeLa细胞用对照pcDNA3质粒转染，并且在粗线下的非阴影区说明通过HeLa细胞活化的B细胞表面标记物的表达，该HeLa细胞用mCD154或者一种ISF构建物感染。
【0079】图4。图4是一系列FACS直方图，表明了对于本发明示范性嵌合CD154多肽的敏感性，即是，ISF30-ISF39，与鼠CD154(murinceCD154，mCD154)和人CD154(human CD154，hCD154)比较，通过在病人血浆中可以中和天然鼠CD154功能的抗体结合。这一敏感性通过共培养Ramos B细胞和用含有mCD154或者一个示范性的ISF构建物的pcDNA3质粒转染的HeLa细胞来测定，加入含有中和抗体的血浆，并且，在大约培养一天以后，收集并且分析Ramos细胞的CD70和CD95表面标记物的表达。阴影区域说明了表面标记物表达没有被活化，因为Ramos细胞与非转染HeLa细胞培养，在细线以下的非阴影区表明在与含有抗体的血浆共培养的细胞的表面标记物的表达，而在粗线下的阴影区域表明不与血浆共培养的细胞的表面标记物的表达。
【0080】图5。图5是一系列FACS直方图，表明选择的本发明嵌合CD154多肽，ISF30和ISF35对于可以中和CD154功能的病人血浆抗体的敏感性，与鼠CD154(mCD154)以及对照质粒进行比较。这一敏感性可以在用含有mCD154，ISF20和ISF35的pcDNA3质粒转染Hela细胞后、并且用含有中和抗体的病人血浆温育转染的细胞后进行测定。阴影区域的面积表明结合于不与血浆共温育的细胞的抗体的量，并且非阴影区域的面积表明结合于与血浆共温育的细胞的抗体的量。
【0081】图6。图6是一系列FACS直方图，其表明了所选择的本发明嵌合CD154多肽，ISF32和35的表达，与鼠CD154(mCD154)比较，是在用逐渐增加感染复数(MOI)比率的含有mCD154，ISF32和ISF35的腺病毒载体感染的Hela细胞中进行。阴影区域表明了非转染Hela细胞的表达，而非阴影区域说明了用以上所述的腺病毒载体转染的Hela细胞的表达。
【0082】图7。图7是一系列FACS直方图，其说明了所选择的本发明CD154多肽，ISF 32和35在CLL B细胞的表达，和鼠CD154(mCD154)和非感染细胞比较，是在用含有mCD154，ISF32和ISF35的腺病毒载体感染之后进行。阴影部分的区域说明的是非转染CLL B细胞的表达，而非阴影区域的面积说明的是用以上所述的腺病毒载体转染的CLL B细胞的表达。
【0083】图8。图8是一系列FACS直方图，其说明了与表达所选择的本发明CD154多肽，ISF 32和35的HeLa细胞共培养的CLLB细胞的活化，与鼠CD154(mCD154)进行比较。这一活化通过表型表面标记物CD80，CD70，CD86，CD95，CD54，和CD27的表达变化来测定，这些是CD40活化的特征。阴影区域说明的是非活化CLL B细胞的表面标记物表达，在细线下方的非阴影区说明的是与用不含有CD154的对照腺病毒AD-LacZ转染的HeLa细胞共培养的CLL B细胞的活化，而在粗线下的非阴影区说明的是与用mCD154，ISF32和ISF35转染的HeLa细胞共培养的CLL B细胞的活化。
【0084】图9。图9是一系列FACS直方图，其说明了所选择的本发明嵌合CD154多肽，ISF 5，ISF 12，ISF 24和ISF 32的表达，与人和鼠CD154比较，是在HeLa细胞和CLL B细胞中转染之后。阴影区域说明了非转染细胞的表达，而非阴影区域说明的是用所标示ISF构建物的每一个所转染的细胞中的表达。这一个图说明了人和鼠CD154，和所选择的ISF构建物，在HeLa细胞中被表达。而且，这一图也确证了CLL B细胞一般排除了人CD154的表达，而不是鼠CD154。CLL B细胞表达ISF构建物中的两个，也就是ISF 5，其含有完全由鼠CD154构成的结构域IV，和ISF 32，其含有结构域IV，包括在鼠CD154的大部分中。这说明使得鼠CD154在CLL B细胞中得以表达的调控元件是定位于结构域IV的区域中。同样地，ISF 12和ISF 24用CLL B细胞并不能很好地进行表达，因为ISF 12的结构域IV专门由人CD154组成，而ISF 24的结构域IV包括鼠CD154，并且还具有人CD154区域，其中包含调控CLL细胞表达该分子的区域。
【0085】图10，图10是条线图，该图表说明了在用载有所选择的本发明嵌合CD154多肽，ISF35和人CD154的腺病毒感染HeLa细胞两天后所产生的可溶性配体数量。产生的可溶性CD154的量通过应用人CD154特异的ELISA(酶联免疫吸附测定)来检测，并且根据在ELISA中的已知量的可溶性CD154配体-CD8融合蛋白的滴定度来计算。该图说明了ISF 35对于切割形成可溶性ISF35的抗性，与切割人CD154至可溶性CD154以及由非感染细胞产生的缺乏可溶性CD154的情况进行比较。ISF 35对于切割更加具有显著的抗性，不产生可溶性ISF35。相反地，人CD154在大于120ng/ml的水平很容易切割形成可溶性CD154。
发明祥述
【0086】所有引用的参考文献引入作为参考文献，包括任何附图，如同全文阐述于此一样。
定义
【0087】正如在此所应用的，术语“CD154”或者“嵌合ISF构建物(chimeric ISF construct)”是指一种配体(ligand)，其包括来自一个物种的CD154的至少一个结构域或者亚结构域，以及来自另一个不同的物种的CD154的至少一个结构域或者亚结构域。优选地，嵌合CD154来源的至少两个物种是人和鼠CD154。
【0088】正如在此所应用的，术语“亚结构域(subdomain)”是指由至少两个氨基酸构成的一个序列，它是CD154的一个结构域(domain)的一部分。“亚结构域”也包含了其中一个或者多个氨基酸已经缺失的氨基酸序列，包括一个或者多个氨基酸从序列的一端被截去。
【0089】正如在此所应用的，术语“切割位点(cleavage site)”是指蛋白酶识别的一段氨基酸序列，典型地，基质金属蛋白酶(mmp)从表达细胞的表面切割CD154。发现CD154的切割位点一般是在CD154的结构域III和IV的界线处或者附近。按照本发明，一个这样的切割位点包括人CD154的大约在氨基酸108和116之间的区域。
【0090】正如在此所应用的，术语“相对应(corresponding)”是指一个物种的CD154的核苷酸或者氨基酸的序列，其与另一个物种的CD154的核苷酸或者氨基酸序列具有同源性。同源性是基于二级结构的相似性，例如结构域边界的定位，在不同物种的CD154之间(参见以下的表1)。
【0091】正如在此的应用，短语“对于切割不太敏感(less susceptibleto cleavage)”是指嵌合CD154对于蛋白酶的切割与天然人CD154相比具有较高的抗性，它是通过在给定数目的细胞在一段时间内产生的可溶性CD154的量来进行测定。优选地，本发明的嵌合CD154是“对于切割不太敏感”，因为它被切割的速率比天然CD154低至少90％。
【0092】正如在此的应用，术语“表达载体”是指表达重组核苷酸序列的核酸，并且其可以感染细胞且在那里进行自我复制。一般的表达载体包括用于重组DNA技术的质粒，以及可以在细菌或者动物细胞中复制的多种病毒。很多表达载体在文献上已经有所说明。Cantwell et al.，Blood，In(1996)名称为：“腺病毒载体感染慢性淋巴细胞白血病B细胞(Adenovirus Vector Infection of Chronic Lymphocytic Leukemia BCells)；”Woll，P.J.和I.R.Hart，Ann.Oncol.，6 Suppl 1：73(1995)；Smith，K.T.，A.J.Shepherd，J.E.Boyd，和G.M.Lees，Gene Ther.，3：190(1996)；Cooper，M.J.，Semin.Oncol.，23：172(1996)；Shaughnessy，E.，D.Lu，S.Chatterjee，和K.K.Wong，Semin.Oncol.，23：159(1996)；Glorioso，J.C.，N.A.Deluca，和D.J.Fink，Annu.Rev.Microbiol.，49：675(1995)；Flotte，T.R.和B.J.Carter，Gene Ther.，2：357(1995)；Randrianarison-Jewtoukoff，V.和M.Perricaudet，Biologicals.，23：145(1995)；Kohn，D.B.，Curr.Opin.Pediatr.，7：56(1995)；Vile，R.G.和S.J.Russell，Br.Med.Bull.，51：12(1995)；Russell，S.J.，Semin.Cancer Biol.，5：437(1994)；和Ali，M.，N.R.Lemoine，和C.J.Ring，Gene Ther.，1：367(1994)。
编码嵌合CD154的核苷酸序列
【0093】正如以上所说明的，TNF超家族的配体(“TNF配体(TNFligands)”)具有相似的二级结构，包括很多结构域(Kipps et al.，WO98/76061，于1998年7月18日出版)。在表1中，已经说明了TNF超家族的很多配体的结构域界线。根据人类TNFα的X射线晶体结构，已经推断出了人CD154的受体结合部分的预测的二级结构(Peitsch etal.，Int Immunol，5：233-238，1993)。其它的TNF配体的受体结合部分的二级结构，通过应用计算机分析，与人TNFα的比较来推断。
表1  TNF超家族配体的结构域的结构※
 
结构域I(胞质)  结构域II(跨膜)   结构域III(胞外近端)       结构域IV(胞外远端)     
人CD154 1—42 42—135 135—330 330—786
鼠CD154 1—42 42—135 135—327 327—783
牛CD154 1—42 42—135 135—330 330—786
人TNFα 1—87 87—168 168—228 228—699
鼠TNFα 1—87 87—168 168—237 237—705
猪TNFα 1—87 87—168 168—228 228—696
人Fas配体 1—237 237—315 315—390 390—843
鼠Fas配体 1—237 237—309 309—384 384—837
人CD70 1—45 45—117 117—132 132—579
人CD30配体   1—117 117—186 186—240 240—702
 
人TRAIL 1—42 42—111 111—345 345—843
※应用cDNA的起始甲硫氨酸的第一核苷酸作为核苷酸编号1，通过每一个结构域的核苷酸边界确定结构域。按照本发明，显示的核苷酸边界可以从那些确定的和仍在确定中的本发明用到的结构域之间有相当程度的变化。
【0094】已知编码不同物种的CD154分子的核苷酸序列的相似性，如人，鼠和奶牛，编码一个物种的CD154的结构域或者亚结构域的核苷酸序列是与来自于另一个物种CD154的相对应的核苷酸序列是可互换的，从而导致杂合的多核苷酸序列，其编码嵌合的CD154。
【0095】根据功能原因，选择物种间对应序列交换的核苷酸序列，即是，因为所选择的序列编码一个结构域或者亚结构域，其或者提供或者修饰一个所需的功能，或者去除靶配体基因的一个不需要的功能。
【0096】本技术领域已知人CD154的至少一部分部分是从母体分子中切割并且成为可溶性分子(solubale molecule)。正如以上所说明的，可溶形式(solubale form)一般是不需要的。这样，人CD154的氨基酸或者氨基酸序列与非人CD154的交换将至少部分改善了这一问题，其中人CD154包括蛋白酶识别的切割位点，而非人CD154并不含有这一切割位点。优选地，非人CD154是鼠CD154。
【0097】按照本发明，人CD154的胞外结构域包括在位于或者靠近结构域III和结构域IV的界线处的至少一个氨基酸，或者氨基酸的一个序列，其被切割蛋白酶识别并且被切割。按照本发明，至少一个这样的切割位点存在于人CD154的核苷酸322—348，氨基酸108—116之间。
【0098】此外，按照本发明，人CD154的胞外结构域包括至少一个氨基酸，或者氨基酸的一个序列，其结合于人CD154受体，如，CD40。正是由于这一原因，CD154的可溶形式可以结合位于抗原呈递细胞上的CD154受体，并且可以积极地参与免疫应答。这样，人CD154的胞外区域必定是保守的，以便保持天然CD154受体的结合作用。
【0099】同样地，本发明目前优选的实施方案是嵌合CD154多核苷酸序列，其包括第一核苷酸序列(first nucleotide sequence)，编码非人CD154的胞外亚结构域，其对应于并且替换了人CD154的切割位点。按照本发明，用相对应的非人CD154的亚结构域替换含有CD154切割位点的人CD154的亚结构域而得到嵌合CD154(chimeric CD154)，这相比于人CD154对切割更加不具敏感性。
【00100】第一核苷酸序列可操作地连接于编码人CD154的胞外亚结构域的第二核苷酸序列(second nucleotide sequence)，人CD154的胞外亚结构域涉及结合人CD154受体，如CD154配体。以这一方式，本发明提供的多核苷酸序列编码嵌合CD154，嵌合CD154结合表达CD154受体的人类细胞。
【00101】此外，按照本发明，鼠和人CD154的胞外结构域包括至少一个氨基酸，或者氨基酸的一个序列，其允许在鼠和人细胞的细胞膜上表达该分子。例如，图9说明的是鼠和人CD154被HeLa细胞表达。然而正如以上所说明的，鼠CD154可以通过更多种的细胞表达，包括人细胞，与人CD154进行比较而言。实际上，鼠CD154可以表达于一般不表达人CD154的人细胞上，例如人CD40+细胞，特别是CLL细胞。人和鼠CD154的差别表达也由在图9所示结果得到确证。这样，用鼠CD154的一个氨基酸或者氨基酸序列交换人CD154的一个氨基酸或者氨基酸序列将至少部分地解决该问题，其中所述人CD154的一个氨基酸或者氨基酸序列涉及该人类分子的表达，所述鼠CD154的一个氨基酸或者氨基酸序列涉及该非人类分子的表达。
【00102】同样地，在本发明优选的具体实施方案中，嵌合CD154多核苷酸序列包括第一核苷酸序列，其进一步编码鼠CD154的胞外亚结构域，鼠CD154胞外亚结构域对于通过鼠细胞和人细胞表达鼠CD154起重要作用。以这种方式，本发明提供的多核苷酸序列编码嵌合CD154，嵌合CD154可以在多种细胞类型中进行表达，包括一般情况下并不表达人CD154的人CD40+细胞。尽管这一具体实施方案涉及应用鼠CD154，本发明也涉及应用可以被人细胞表达的其它非人类动物CD154。
【00103】更进一步，按照本发明，鼠CD154的胞外结构域包括氨基酸，或者氨基酸序列，涉及检测嵌合CD154的表达，因为它结合鼠CD154特异性抗体。以这种方式，嵌合CD154多核苷酸序列的表达可以特异性地被检测，典型地通过FACS(荧光激活细胞分类术)或者免疫组织化学，并且因此与天然人的CD154的表达区分开来。
【00104】同样地，在本发明优选的实施方案中，嵌合CD154多核苷酸序列包括第一核苷酸序列，其进一步编码非人类CD154的胞外亚结构域，并且通过结合于抗鼠CD154抗体来检测嵌合CD154的表达。
【00105】在本发明优选的实施方案中，第一核苷酸序列编码非人类CD154结构域IV的亚结构域，优选的是鼠的。鼠CD154的亚结构域IV包括替换人CD154切割位点的氨基酸序列，其对于用鼠和人的细胞表达鼠的分子是重要的，并且其涉及于检测本发明的嵌合CD154。此外，第一核苷酸序列可以编码非人类CD154结构域III的亚结构域，其位于或者直接邻近于结构域III和结构域IV的界线处。按照本发明，这一亚结构域包括了人CD154的切割位点的一部分。
【00106】优选地，第一核苷酸序列进一步包括鼠CD154的结构域I，II，和III，因为已经表明该构建物引起了人细胞表达嵌合CD154的增加。可选择地，第一核苷酸序列可以编码鼠CD154的结构域III或者其亚结构域；和/或鼠CD154的结构域II或者其亚结构域；和/或鼠CD154的结构域I或者其亚结构域。
【00107】更进一步，按照本发明，鼠和人CD154的胞外结构域包括至少一个氨基酸或者氨基酸序列，其可以结合于抗CD154的抗体，并且因此中和了配体的免疫活化效应。这一氨基酸或者氨基酸序列一般相同于或者实质上相似于，结合CD40，CD154相关受体的CD154的三级结构的区域。正如以上所述，鼠CD154以抗CD154的抗体的产生的方式引发较强烈的应答。如此而言，其比人CD154对于用抗CD154抗体结合和中和更具敏感性，引发了在人中重复施用鼠CD154的长期问题。这即是，施用鼠CD154，或者其中抗CD154抗体结合的部分是鼠的CD154构建物，从而引起抗所施用的CD154的免疫原性反应，并且因此在刺激免疫应答过程中降低了效率。这样，优选地，涉及结合抗CD154抗体的区域是人CD154，从而阻止或者最小化对于施用的任何免疫原性的效应。
【00108】所以，本发明目前优选的具体例子是嵌合CD154多核苷酸序列，其包括人CD154的第二核苷酸序列，它进一步编码抗CD154抗体结合的胞外亚结构域。以这一方式，本发明提供的多核苷酸序列编码嵌合CD154，对于施用于人类中，其并不具免疫原性。
【00109】优选地，第二核苷酸序列(second nucleotide sequence)编码人CD154的结构域IV的亚结构域。这样，目前优选的多核苷酸序列编码人CD154的结构域IV的亚结构域，其可操作地连接于另一个的鼠CD154结构域IV的亚结构域。
【00110】正如以上所述，结构域IV优选地连接于鼠CD154的结构域I，II和III。这样优选的多核苷酸序列的例子在SEQ ID.NOS.1，3，5，7，9和11中提供，并且编码嵌合CD154构建物，它们分别被命名为ISF30，32，34，36，38和40。这些嵌合构建物与鼠和人CD154的同源性列于以下的表II中。
表II—偶数编号的ISF系列的核苷酸图谱
 
ISF构建物 片段1鼠CD154同源性  片段2人CD154同源性  片段3鼠CD154同源性  片段4人CD154同源性 
ISF30 1-447 448-543 544-666 667—783
ISF32 1-447 448-567 568-666 667—783
ISF34 1-447 448-567 568-654 655—783
ISF36 1-447 448-567 568-618 622—783
ISF38 1-447 448-543 544-654 655—783
ISF40 1-447 448-543 544-618 619—783
【00111】可选择地，结构域IV可以连接于人CD154的结构域I，II，III。这样的多核苷酸序列的例子在SEQ ID.NOS.2，4，6，8，10和12中提供，并且编码嵌合CD154构建物，它们分别被命名为ISF31，33，35，37，39和41。这些嵌合构建物与鼠和人CD154的同源性列于以下的表III中。
表III—奇数编码的ISF系列的核苷酸图谱※
 
ISF构建物 片段1人CD154 片段2鼠CD154 片段3人CD154 片段4鼠CD154 片段5人CD154
 
同源性 同源性 同源性 同源性 同源性
ISF31 1-321 322—423 424-519 520—642 643—759
ISF33 1-321 322—423 424-543 544—642 643—759
ISF35 1-321 322—423 424-543 544—630 631—759
ISF37 1-321 322—423 424-543 544—594 592—759
ISF39 1-321 322—423 424-519 520—630 631—759
ISF41 1-321 322—423 424-519 520—594 595—759
※在人CD154上的含有27个核苷酸的区域(核苷酸322—348)，粗略地与人CD154的结构域III和结构域IV的部分对应，其已经从一系列构建物中删除，分别在片段1和2的核苷酸321到322中。
III)嵌合CD154多肽
【00112】编码的嵌合CD154因此包括非人CD154的第一亚结构域，并且优选是替换人CD154的切割位点的鼠CD154，和结合CD154受体的人CD154的第二亚结构域。结果，嵌合CD154比人CD154对于从细胞的表面切割更不太敏感，但是虽然如此，仍保持了结合天然CD154同源受体的能力。这一从细胞表面切割的敏感性的降低通过嵌合CD154的切割率来反应，嵌合CD154的切割率比人CD154的低至少90％。
【00113】此外，鼠CD154的第一亚结构域对于在鼠和人细胞中表达鼠CD154是重要的，并且因此使得嵌合CD154由人细胞表达。结果，嵌合CD154可以用人CD40+细胞表达，包括CLL细胞，其一般不表达人CD154。
【00114】此外，鼠CD154的第一亚结构域可以检测嵌合CD154的表达，因为其结合鼠CD154特异的抗体，并且因此可以从天然人CD154的表达分辩其表达。
【00115】人CD154的第二亚结构域优选地包括与抗-CD154抗体结合的分子。尽管人CD154对于这些抗体的敏感性降低，但所得到的嵌合CD154不具有免疫原性，并且因此并不引起导致抗体中和(antibodyneutralization)。
【00116】优选地，非人CD154的第一亚结构域包括结构域IV的亚结构域，和位于结构域III和结构域IV的界线处或者立即附近处的结构域III的亚结构域，该区域与CD154切割位点的部分相对应。人CD154的第二亚结构域也包括结构域IV的亚结构域。在优选的实施方案中，结构域I-III也包括鼠CD154。这样优选的嵌合构建物的例子在SEQ ID.NOS.13，15，17，19，21和23中提供，对应于ISF 30，32，34，36，38和40。这些嵌合构建物与鼠和人CD154的同源性列于以下的表1V中。
表IV—偶数编号的ISF系列的氨基酸图谱
 
ISF构建物 片段1鼠CD154同源性  片段2人CD154同源性  片段3鼠CD154同源性  片段4人CD154同源性 
ISF30 1-149 150-181 182-222 223—260
ISF32 1-149 150-189 190—222 223—260
ISF34 1-149 150-189 190-218 219—260
ISF36 1-149 150-189 190-206 207—260
ISF38 1-149 150-181 182-218 219—260
ISF40 1-149 150-181 182-206 207—260
【00117】可选择地，结构域I-III可以包含人CD154。这样优选的嵌合构建物的例子在SEQ ID.NOS.14，16，18，20，22和24中提供，对应于ISF31，33，35，37，39和41。这些嵌合构建物与鼠和人CD154的同源性列于以下的表V中。
表V—奇数编号的ISF系列的氨基酸图谱※
 
ISF构建物 片段1人CD154同源性  片段2鼠CD154同源性  片段3人CD154同源性  片段4鼠CD154同源性  片段5人CD154同源性 
ISF31 1-107 108—141 142-173 174—214 215—252
ISF33 1-107 108—141 142-181 182—214 215—252
ISF35 1-107 108—141 142-181 182—210 211—252
ISF37 1-107 108—141 142-181 182—198 199—252
ISF39 1-107 108—141 142-173 174—210 211—252
ISF41 1-107 108—141 142-173 174—198 199—252
※在人CD154中的由9个氨基酸组成的区域(氨基酸108-116)，粗略地与人CD154的结构域III和结构域IV的部分对应，其已经分别从片段1和2的一系列构建物中从氨基酸107到108中去除。
基因构建物(genetic constructs)
【00118】本发明也打算应用表达载体或者任何其它的基因构建物，其中包括本发明的多核苷酸序列，可以在靶细胞中表达嵌合CD154。
【00119】用于本发明的表达载体含有编码嵌合CD154的多核苷酸序列，可操作地与合适的转录或者翻译调控核苷酸序列连接，例如来源于哺乳动物，微生物，病毒或者昆虫基因的转录或者翻译调控核苷酸序列。这样的调控序列包括在基因表达中起调控作用的序列，如转录启动子或者增强子，控制转录的操纵子序列，信使RNA中编码核糖体结合位点的序列，以及控制转录、翻译起始或者转录终止的合适序列。
【00120】特别应用的调控序列包括来自多种哺乳动物，病毒，微生物，和昆虫基因的启动子区域。该启动子区域(promoter region)引导全程转录的起始，并且包括编码本发明嵌合CD154的多核苷酸序列。应用的启动子区域包括在劳氏肉瘤病毒(RSV)中发现的长末端重复(LTR)的启动子，人巨细胞病毒(CMV)增强子/启动子区域，Lac启动子，分离自腺病毒的启动子，以及任何其它的专业上熟知的启动子，专业人士了解的用于真核生物，原核生物，病毒或者微生物细胞基因表达的启动子。在真核生物细胞中表达基因和蛋白特别应用的其它的启动子包括哺乳动物细胞启动子序列和增强子序列，如那些源于多瘤病毒，腺病毒，猿猴病毒40(SV40)，以及人巨细胞病毒的序列。特别应用的是病毒早期和晚期启动子，发现其一般邻近于病毒如SV40的复制起点。专业人员了解特别应用的启动子的选择依赖于确定的细胞系以及用于在特定的细胞系中表达多核苷酸序列的基因构建物的其它多个参数。
【00121】因此，本发明打算应用的某些基因构建物包括可操作地连接于启动子序列或者启动子和增强子序列的多核苷酸序列，并且也可操作地连接于多聚腺苷酸序列，其引发信使RNA的终止和多聚腺苷酸化。优选地，应用CMV启动子和牛生长激素多聚腺苷酸化序列构建的多核苷酸序列。
宿主细胞(host cells)
【00122】本发明也打算应用不同的宿主细胞，用含有本发明多核苷酸序列的表达载体或者其它的基因构建物来进行转化或者转染。这些细胞可以是原核或者真核细胞。
【00123】在一些优选的实施方案中，细胞是哺乳动物的正常抗原呈递细胞(normal antigen presenting cells)，如单核细胞，巨噬细胞，B细胞和类似细胞。在其它的优选的具体例子中，细胞可以是正常细胞，当本发明的多核苷酸序列引入到这些细胞后，能够刺激旁观者抗原呈递细胞(bystander antigen presenting cells)。本发明也打算应用体细胞，其不能天然呈递抗原至免疫系统，但是可以通过与编码抗原呈递所需分子的基因进行基因工程操作，从而使得这些细胞以人工抗原呈递细胞(artificial antigen presenting cells)而起作用。编码嵌合CD154的多核苷酸序列然后引入到这些人工的抗原呈递细胞。文献中已知有多种检测方法，来确定是否特定的细胞可以以抗原呈递细胞起作用，如细胞增殖或者产生淋巴因子，并且因此本发明的这一方面可以很容易地进行确定。
【00124】除了以上的正常人细胞，本发明也打算引入编码嵌合CD154的多核苷酸序列到多种瘤或者恶性细胞中，如免疫系统和实体瘤的细胞。这样的打算应用的瘤细胞包括白血病细胞，如急性单核细胞白血病(AML)，急性粒单核细胞白血病(AMML)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，慢性骨髓性或者慢性骨髓单核细胞白血病(CMML)。也打算应用的细胞源于淋巴瘤，神经胶质瘤，乳腺，颈部，卵巢，肺，膀胱，或者前列腺癌症。
【00125】最后，在本发明优选的实施方案中，编码嵌合CD154的多核苷酸序列引入到细胞中，其在细胞表面表达其同源性受体，CD40。
应用表达载体和含有嵌合CD145多核苷酸序列的构建物的方法
【00126】在调控免疫应答中识别CD145和其同源受体的相互作用，本发明也打算应用增加膜稳定配体浓度的方法，通过引入编码嵌合CD154的多核苷酸序列到细胞中，其中的嵌合CD154对于从细胞表面切割相对于天然CD154更加不敏感，该配体可以结合CD40，或者对于CD154的其它同源受体。因为嵌合CD154对于蛋白酶的切割不敏感，其增加了结合于其同源受体的能力并且诱发细胞溶解应答或者免疫应答。
【00127】本发明用于任何既可以作为免疫系统的靶或者免疫系统对于外源靶应答的一部分参与免疫反应的人细胞。该方法包括体外方法(ex vivo methods)，体内方法(in vivo methods)，以及多种涉及注射多核苷酸或者载体进入宿主细胞的其它方法。该方法也包括直接注射到肿瘤中或者肿瘤基底中。
【00128】本发明也打算应用体外方法，包括从动物或者人患者中分离细胞。将编码本发明的嵌合CD154的多核苷酸序列引入到分离的细胞中。该细胞随后再引入到特异的位点，或者直接引入到患者的循环系统。在本发明优选的具体例子中，可以应用细胞表面标记物，包括鉴定细胞的如肿瘤标记物或者抗原的分子来从患者中特异地分离这些细胞。
【00129】本发明也打算引入编码嵌合CD154的多核苷酸序列至存在于动物或者人对象体内的所需细胞中，而不需要首先从该对象中取出这些细胞。在体内，或者在对象的身体体内，引入多核苷酸序列至特异细胞的方法是熟知的，并且包括应用表达载体并且直接注射多种不同的基因构建物至对象中。在一般的应用中，含有本发明多核苷酸序列的表达载体引入到循环系统或者引入到患者特异性的位点来使得载体特异性地感染所需的细胞。在其它的优选的具体例子中，载体直接注射到在患者中存在的肿瘤基底中，其含有至少一些引入本发明的多核苷酸序列的细胞。
【00130】本发明也打算直接注射至动物或者人患者基因构建物，其包括编码嵌合CD154的多核苷酸序列，并且可以额外地包括启动子和多聚腺苷酸序列。已经说明了这些应用方法的例子(Vile et al，Ann Oncol，5：59-65，1994)。也可以直接注射基因构建物至动物或者人患者的肌肉中或者其它位点，或者直接引入到患者的肿瘤或者肿瘤基底中。
治疗肿瘤的方法(Methods of Treating Neoplasia)
【00131】本发明也涉及治疗肿瘤的方法，包括将本发明的多核苷酸序列插入瘤细胞，以便将被编码的嵌合CD154表达于瘤细胞的表面。本发明包括在体内和体外治疗人肿瘤。
【00132】在治疗肿瘤优选的方法中，该方法进一步包括从患者中首先得到瘤细胞的步骤，在其中插入本发明的多核苷酸序列，以便嵌合的CD154表达于瘤细胞的表面，并且再重新施用这些细胞回至患者中。专业人员了解很多可以应用于重新将转化的瘤细胞施用至患者的方法。
实施例
1.在人的HeLa细胞和CLL细胞中表达嵌合附件分子配体
a.构建含有嵌合附件分子配体基因的基因构建物和基因治疗载体SEQ ID NO.1-SEQ ID NO 12(aka ISF30—ISF41)的嵌合附件分子配体基因的制备和克隆如下：
i.应用来自两个不同基因物种的结构域制备嵌合附件分子配体基因
【00133】本发明的嵌合构建物通过基因融合(gene fusion)和定点突变(site-directed mutagenesis)两种熟知的方法设计进行。大结构域的取代，例如人的结构域IV区域与鼠的结构域I到III的区域融合，由Ho48说明的基因融合技术完成。较小的基因替换或者氨基酸取代按照Stratagene，Inc(La Jolla，CA)说明的“quickchange”定点突变的方法进行。嵌合ISF基因亚克隆到pcDNA3真核表达载体(Invitrogen，Inc.La Jolla，CA)中。在嵌合ISF插入物的两侧为异源的CMV启动子和牛生长激素多聚腺苷酸序列。
ii.腺病毒合成
【00134】嵌合的ISF-pcDNA3质粒用限制酶NruI和SmaI消化，以便从pCDNA3中释放含有CMV启动子的DNA片段，嵌合CD154基因，以及来自pCDNA3的多聚腺苷酸信号。随后通过用1％的琼脂糖凝胶分离消化的DNA，来凝胶纯化该片段。DNA片段连接至腺病毒穿梭载体(MCS(SK)pXCX2的EcoRV位点。该质粒是质粒pXCX2的修饰物，这样pBluescrip多聚接头序列已经克隆到E1区域，(J.R.Tozer，UCSD，未经出版的数据，1993年9月)。在纯化嵌合ISF-MCS(SK)pXCX2质粒后，应用Promega的磷酸钙转染试剂盒按照制造商的说明，将5ug的该穿梭载体与5ug的JM17质粒共转染到293AC2细胞中。转染后，细胞培养5天，以便进行细胞内的同源重组和病毒的合成。然后收集全细胞和上清，冻融三次来释放细胞内结合的腺病毒。
【00135】在病毒产生起始以后，通过噬斑纯化(plaque purification)得到的分离病毒克隆的分离物。简述如下，通过在台式离心机以1000rpm离心5分钟，清除去冻融的病毒中的碎片而变得澄清。生长于六孔组织培养平板的293AC2细胞汇合，随后用系列稀释度的病毒上清感染1到2个小时。感染后，培养基被吸去，用含有4％胎牛血清和0.65％琼脂糖的DMEM培养基覆盖细胞，保持在56℃下。在4到6天的培养以后，挑出单个的噬斑于1ml培养基中，随后用于病毒的扩增。
【00136】大规模腺病毒的制备是通过连续感染增加量的293AC2来进行的。纯化的腺病毒随后再通过氯化铯密度梯度离心纯化。该方法应用氯化铯梯度通过梯度密度进行浓缩病毒颗粒，密度为1.45g/cm3和1.20g/cm3，其中293AC2扩大的病毒样品被在SW40的转子中离心2个小时(Beckman，Brea，CA)，在4℃下以25,000rpm下离心。病毒带的分离应用27-gauge针头以及注射器，并且脱盐用Sephadex G-25的DNA梯度柱(Pharmacia，Piscataway，NJ)。该病毒用含有10％甘油(glycerol)的磷酸盐缓冲液进行脱盐，并且储存于-70℃。病毒的最终滴度通过阴离子交换高效液体色谱(HPLC)来确定。
b.嵌合附件分子配体基因在CLL细胞和HeLa细胞中的表达和功能
i.表达
【00137】(图3)说明了很多组的ISF构建物。即是，ISF30-ISF39，在用分别含有每一个ISF构建物的pcDNA3转染HeLa后，在HeLa细胞中的表达。应用Lipofectamine 2000(Gibco-BRL)，使用ISF—pcDNA3质粒瞬间转染HeLa细胞。Lipofectamine 2000是一种基于脂质体的转染试剂，用于基因有效地转入HeLa细胞中。转染两天以后，通过流式细胞术分析细胞，分析在于嵌合CD154在细胞表面的表达。简述如下，通过吸出培养基并且加入脱离溶液(含有10mM EDTA，pH8的PBS)将附着细胞从壁上脱离。应用脱离溶液来替代更常用的胰蛋白酶消化缓冲液，来避免CD154在胰蛋白酶敏感位点的非特异性切割，该切割潜在性地导致对于表达的假阴性判断。一旦细胞从平板上脱离，细胞用FACS染色缓冲液(由含有3％FCS和0.05％的叠氮化钠的PBS组成)洗涤一次，于FACS缓冲液中重新悬浮细胞至大约107个细胞/ml，并且将5×105个细胞(50ul)置于96孔u字形-底的塑料微孔板中。加入对于CD154特异的PE-偶联的抗体(抗体克隆MR-1，Pharmingen，Inc.)在4℃保持30分钟。然后，用FACS缓冲液洗涤细胞两次，重悬于FACS缓冲液中，并且转至FACS管中进行数据采集。为了对照非特异性抗体结合，所有的样品用适量的同种型对照抗体染色。更进一步，通过加入10ng/ml的碘化丙啶(propidium idodide)至所有的染色反应中，来排除死细胞和碎片对于分析的影响。应用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson)，采用流式细胞术分析细胞CD154的表达。
【00138】在(图3)的结果表明嵌合CD154载体作为细胞表面配体全部得到表达，其可以通过用CD154-特异的抗体来检测，这说明保持了总体的蛋白质三级结构。此外，表面表达等价于或者优于天然的鼠CD154。
ii.嵌合附件分子配体的功能分析
【00139】(图4)说明了在(图2)中所述的几组ISF的几个构建物活化Ramos B细胞的功能性能力，Ramos B细胞是一种CD40-阳性细胞系。Ramos细胞铺于如上所述的用ISF—pcDNA3转染的HeLa细胞的上面。覆盖一天以后，收集未附着的Ramos细胞，并且通过流式细胞术分析CD70和CD95的表达。在CD40活化以后，这两个细胞表面标记物以高水平表达。(Kato K.et al.，J.Clin.Invest.，104：947-955，1999.)这些数据表明所有的ISF构建物以与天然的鼠CD154等价的强度激活Ramos细胞。这一结果进一步证实，在嵌合CD154构建物中，总体的CD154三级蛋白质结构以及受体特异性得到保持。
1.CD154病人-抗体中和和结合数据
【00142】(图5)说明了ISF构建物对CLL病人血浆的敏感性，收集自I期CD154临床治疗，该血浆含有可以中和天然鼠CD154功能的抗体。简述如下，Ramos细胞铺于如(图3)所述的用ISF-pcDNA3转染的HeLa细胞的上面，同时，在温育过程中加入含有mCD154中和抗体的病人血浆。在一天的温育以后，收集Ramos细胞并且如(图4)所述分析CD70和CD95的表面表达。这一数据表明病人血浆抑制mCD154激活Ramos，这正如所期望的。相反地，病人血浆并不抑制ISF的功能。
【00142】此外，测试ISF构建物与病人血浆中CD154-特异抗体的结合，来作为免疫原性的另一种测定。又一次地，用ISF-pcDNA3质粒转染的HeLa细胞与系列稀释的病人血浆在4℃下温育30分钟。然后洗涤细胞去除非结合的抗体，并且用荧光标记的对人免疫球蛋白(Ig)特异的抗体染色。二次染色后，洗涤细胞并且通过FACS分析。(图6)说明了(图5)所述的病人血浆抗体对于代表性的ISF构建物结合性较弱，与mCD154相比而言。尽管可以检测到很少量的结合的抗体，根据图4的结果，这很明显对于ISF的功能没有不利的影响。此外，对于ISF35，检测到比ISF30更少的抗体结合。这些结果可以通过ISF35比ISF30含有更多的人CD154区域这一实际情况来进行解释(参见图2)。同时，从(图5和图6)得到的结果满足优化CD154构建物的标准，这是因为ISF构建物缺乏对由病人产生的抗体进行配体中和所起作用的免疫原性区域。
2.腺病毒介导的ISF表达和功能
【00142】测试编码每一个ISF转基因的重组腺病毒感染HeLa细胞并且导致ISF的膜上表达的能力。(图7)说明了，相比于用编码鼠CD154(Ad—mCD154)的腺病毒感染的细胞，在用逐渐增加感染滴度(M.O.I.)的腺病毒感染的HeLa细胞上表达所选择的ISF构建物。首先，这一数据说明了腺病毒载体是完整的，并且含有令人感兴趣的ISF转基因。其次，该数据进一步确证了ISF构建物与mCD154的水平表达是等价强度的。正是如此，ISF构建物的嵌合状态对于在高度允许腺病毒感染和CD154表达的细胞系中的表达没有不利的影响。
【00143】(图8)说明了在用以上所述的腺病毒载体感染后，ISF构建物在CLLB细胞中的表达。不像HeLa细胞，CLL很难用腺病毒感染，并且妨碍人CD154的表达。正如所能看到的，在用与mCD154表达强度类似的腺病毒感染后，ISF构建物可以表达于CLL细胞。如此，这些载体符合对于优化CD154构建物的另一个标准，即是在人CD154表达抗性的细胞类型中表达。
【00144】对于优选的CD154构建物的另一个标准，在用编码如(图8)所述的ISF构建物的腺病毒载体感染后，检测CLL B细胞的细胞活化。在感染后两天，对CLL细胞进行染色，用于显示调节CD40活化的一系列表面标记物的特征。(图9)说明了ISF的表达引起这些标记物的表达的变化。该变化等价于或者强于用Ad—mCD154感染的细胞。
【00145】最后，正如在图10所见，本发明嵌合CD154多肽中的至少一个，与人CD154相比很明显更加稳定并且对于蛋白酶的切割更加具有抗性，已知人CD154在细胞表达以后，可以通过蛋白酶切割至可溶性的分子。HeLa细胞既可以用编码人CD154或者ISF35的腺病毒以MOI为10感染也可以不用其感染。在感染两天后，收集培养基上清，并且用人CD154-特异性的ELISA(酶联免疫分析)测定可溶性配体的存在。可溶性CD154的量基于在ELISA(Ancell Inc.)中已知量的可溶性CD40配体-CD8融合蛋白的滴度来进行计算。在上清中检测的可溶性配体的量用图表说明，见图10。由于没有检测到可溶性的ISF35，该图表说明了ISF35对于蛋白酶切割形成可溶性的配体具有抗性。与之相反，人CD154易于在大于120ng/ml的水平切割成为可溶性的CD154。此外，不存在可溶性的ISF35并不是由于缺乏HeLa细胞中ISF35的表达，因为感染的HeLa细胞的FACS分析表明了ISF35的细胞表面表达的水平类似于在图9所示。
【00146】由于已经说明并且描述了优选的方法和仪器的具体例子，对于一个专业人士很明显可以在不离开本发明的精神和范围内的情况下进行很多的改变。本发明除了与以下的权利要求以及其法律等价物一致以外，其它的并不受到限制。
序列表
<110>C.E.普鲁萨克(Prussak，Charles E.)
     T.J.基普斯(Kipps，Thomas J.)
     M.J.坎特韦尔(Cantwell，Mark J.)
<120>新型嵌合CD154
<130>UCSD 263/094
<140>US10/154,759
<141>2002-5-23
<160>24
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>783
<212>DNA
<213>人工序列
<220>.
<223>嵌合DNA构建物 ISF30
<400>1
Figure C03817474D00341
<210>2
<211>759
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合DNA构建物ISF31
<400>2
Figure C03817474D00351
<210>3
<211>783
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合DNA构建物ISF32
<400>3
Figure C03817474D00352
<210>4
<211>759
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合DNA构建物ISF33
<400>4
Figure C03817474D00361
<210>5
<211>783
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合DNA构建物ISF34
<400>5
Figure C03817474D00362
<210>6
<211>759
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合DNA构建物ISF35
<400>6
Figure C03817474D00371
<210>7
<211>783
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合DNA构建物ISF36
<400>7
Figure C03817474D00372
<210>8
<211>759
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合DNA构建物ISF37
<400>8
Figure C03817474D00381
<210>9
<211>783
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合DNA构建物ISF38
<400>9
Figure C03817474D00382
<210>10
<211>759
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合DNA构建物ISF39
<400>10
Figure C03817474D00391
<210>11
<211>783
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合DNA构建物ISF40
<400>11
Figure C03817474D00392
<210>12
<211>759
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合DNA构建物ISF41
<400>12
<210>13
<211>260
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>由SEQ ID NO.：1所示DNA序列编码的嵌合CD154多肽
<400>13
<210>14
<211>252
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>由SEQ ID NO.：2所示DNA序列编码的嵌合CD154多肽
<400>14
Figure C03817474D00412
Figure C03817474D00421
<210>15
<211>260
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>由SEQ ID NO.：3所示DNA序列编码的嵌合CD154多肽
<400>15
Figure C03817474D00441
<210>16
<211>252
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>由SEQ ID NO.：4所示DNA序列编码的嵌合CD154多肽
<400>16
Figure C03817474D00451
<210>17
<211>260
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>由SEQ ID NO.：5所示DNA序列编码的嵌合CD154多肽
<400>17
Figure C03817474D00453
Figure C03817474D00461
<210>18
<211>252
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>由SEQ ID NO.：6所示DNA序列编码的嵌合CD154多肽
<400>18
Figure C03817474D00462
Figure C03817474D00471
<210>19
<211>260
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>由SEQ ID NO.：7所示DNA序列编码的嵌合CD154多肽
<400>19
Figure C03817474D00482
Figure C03817474D00491
<210>20
<211>252
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>由SEQ ID NO.：8所示DNA序列编码的嵌合CD154多肽
<400>20
Figure C03817474D00492
Figure C03817474D00501
<210>21
<211>260
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>由SEQ ID NO.：9所示DNA序列编码的嵌合CD154多肽
<400>21
Figure C03817474D00502
Figure C03817474D00511
<210>22
<211>252
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>由SEQ ID NO.：10所示DNA序列编码的嵌合CD154多肽
<400>22
Figure C03817474D00521
<210>23
<211>260
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>由SEQ ID NO.：11所示DNA序列编码的嵌合CD154多肽
<400>23
Figure C03817474D00531
Figure C03817474D00541
<210>24
<211>252
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>由SEQ ID NO.：12所示DNA序列编码的嵌合CD154多肽
<400>24
Figure C03817474D00542
Figure C03817474D00551

Claims (19)

1.核酸分子，其编码嵌合CD154多肽，其中所述核酸分子选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQID NO.10和SEQ ID NO.12的核酸分子。
2.核酸分子，其具有选自SEQ ID NOS.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12的核苷酸序列。
3.核酸分子，其编码多肽，所述多肽具有选自SEQ ID NOS.13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23和24的氨基酸序列。
4.如权利要求2所述的核酸分子，其中所述核酸分子具有选自SEQ ID NOS.2、4、6、8、10和12的核苷酸序列。
5.如权利要求3所述的核酸分子，其中所述核酸分子具有核苷酸序列，所述核苷酸序列编码选自SEQ ID NOS.14、16、18、20、22和24的氨基酸序列。
6.表达载体，包括权利要求1、2或3中的任一项所述的核酸分子。
7.如权利要求6所述的表达载体，进一步包含病毒DNA或者细菌DNA。
8.如权利要求7所述的表达载体，其中所述病毒DNA选自腺病毒DNA或者逆病毒DNA。
9.如权利要求8所述的表达载体，其中所述载体的至少一部分包含腺病毒DNA。
10.遗传构建物，包含权利要求1所述的核酸分子，其可操作地连接于启动子序列和连接于多聚腺苷酸化信号序列。
11.宿主细胞，包含权利要求6所述的表达载体或权利要求10所述的遗传构建物。
12.如权利要求11所述的宿主细胞，其中所述细胞是人CD40+细胞。
13.如权利要求11所述的宿主细胞，其中所述细胞是肿瘤细胞。
14.如权利要求11所述的宿主细胞，其中所述细胞是抗原呈递细胞。
15.如权利要求11至14中任一项所述的宿主细胞，其中所述细胞是B细胞。
16.嵌合CD154多肽，其具有选自SEQ ID NOS.13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23和24的氨基酸序列。
17.用于产生权利要求16所述的嵌合CD154多肽的方法，包括在适于所述多肽有效表达的条件下培养权利要求15所述的宿主细胞。
18.权利要求1所述的编码嵌合CD154多肽的核酸分子在制备用于诱导免疫系统细胞活化的药物中的用途，包括将所述的核酸分子引入所述细胞，其中所述嵌合CD154多肽被表达于细胞的表面上。
19.如权利要求18所述的用途，其中所述细胞是人CD40+细胞。
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