JP3529815B2 - Ｃｄ４０のための可溶性リガンド - Google Patents
Ｃｄ４０のための可溶性リガンドInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｂ細胞抗原、ＣＤ４
０、のための可溶性リガンドに関し、とくに、Ｂ細胞増
殖を促進する方法において使用することができるヒトｇ
ｐ３９タンパク質およびそれから誘導された可溶性リガ
ンドに関する。
０、のための可溶性リガンドに関し、とくに、Ｂ細胞増
殖を促進する方法において使用することができるヒトｇ
ｐ３９タンパク質およびそれから誘導された可溶性リガ
ンドに関する。
【０００２】
２．１．Ｂ細胞抗原、ＣＤ４０
ＣＤ４０はＢ細胞、小胞樹状突起の細胞、正常の基底上
皮、およびいくつかの癌および黒色腫誘導細胞の表面上
に発現される、ほぼ５０kDa の糖タンパク質である（Ｐ
ａｕｌｉｅら、１９８５，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｉｍｍｎｏｔｈｅｒ．２０：２３−２８；Ｃｌａｒ
ｋおよびＬｅｄｂｅｔｔｅｒ，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３：４４９４−４４９
８；Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒら、１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．１３８：７８８−７９４；Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ
ら、１９８７、「白血球の型別（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ
Ｔｙｐｉｎｇ III ）」、ＭｃＭｉｃｈａｅｌ編、オッ
クスフォード大学出版局、ｐｐ．４３２−４３５；Ｐａ
ｕｌｉｅら、１９８９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：
５９０−５９５；Ｙｏｕｎｇら、１９８９，Ｉｎｔ．
Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４３：７８６−７９４；Ｇａｌａｙ
ら、１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：７７
５）。
皮、およびいくつかの癌および黒色腫誘導細胞の表面上
に発現される、ほぼ５０kDa の糖タンパク質である（Ｐ
ａｕｌｉｅら、１９８５，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｉｍｍｎｏｔｈｅｒ．２０：２３−２８；Ｃｌａｒ
ｋおよびＬｅｄｂｅｔｔｅｒ，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３：４４９４−４４９
８；Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒら、１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．１３８：７８８−７９４；Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ
ら、１９８７、「白血球の型別（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ
Ｔｙｐｉｎｇ III ）」、ＭｃＭｉｃｈａｅｌ編、オッ
クスフォード大学出版局、ｐｐ．４３２−４３５；Ｐａ
ｕｌｉｅら、１９８９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：
５９０−５９５；Ｙｏｕｎｇら、１９８９，Ｉｎｔ．
Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４３：７８６−７９４；Ｇａｌａｙ
ら、１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：７７
５）。
【０００３】ＣＤ４０をコードするヒトｃＤＮＡの分離
により、このタンパク質は神経成長因子のレセプターの
族の構成員に有意に関係するＩ型膜タンパク質であるこ
とが示された（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、１９８９，
ＥＭＢＯ Ｊ．８：１４０３−１４１０）。
により、このタンパク質は神経成長因子のレセプターの
族の構成員に有意に関係するＩ型膜タンパク質であるこ
とが示された（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、１９８９，
ＥＭＢＯ Ｊ．８：１４０３−１４１０）。
【０００４】Ｂ細胞の活性化におけるＣＤ４０の役割は
よく確立されている。ＣＤ４０と抗ＣＤ４０モノクロー
ナル抗体（ｍＡｂ）との架橋はＬＦＡ−Ｉを経るＢ細胞
の凝集を誘発し（Ｇｏｒｄｅｎら、１９８８，Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１４０：１４２５−１４３０；Ｂａｒｒｅ
ｔら、１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：１７２
２−１７２９）、ある数の細胞内基質のセリン／スレオ
ニン（Ｅｉｎｆｅｌｄら、１９８８，ＥＭＢＯ Ｊ．
７：７１１−７１７）およびチロシン（Ｕｃｋｕｎら、
１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１７４７
８−１７４８５）のリン酸化を増加し、そして「能力」
シグナルを提供し、このシグナルは適当な第２シグナル
で刺激したとき、Ｂ細胞が増殖しかつクラスのスイッチ
を行うことができるようにする。
よく確立されている。ＣＤ４０と抗ＣＤ４０モノクロー
ナル抗体（ｍＡｂ）との架橋はＬＦＡ−Ｉを経るＢ細胞
の凝集を誘発し（Ｇｏｒｄｅｎら、１９８８，Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１４０：１４２５−１４３０；Ｂａｒｒｅ
ｔら、１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：１７２
２−１７２９）、ある数の細胞内基質のセリン／スレオ
ニン（Ｅｉｎｆｅｌｄら、１９８８，ＥＭＢＯ Ｊ．
７：７１１−７１７）およびチロシン（Ｕｃｋｕｎら、
１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１７４７
８−１７４８５）のリン酸化を増加し、そして「能力」
シグナルを提供し、このシグナルは適当な第２シグナル
で刺激したとき、Ｂ細胞が増殖しかつクラスのスイッチ
を行うことができるようにする。
【０００５】例えば、抗ＣＤ４０ｍＡｂはホルボルミリ
スチルアセテート（ＰＭＡ；Ｇｏｒｄｅｎら、１９８
７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１５３５−１
５３８）または抗ＣＤ２０Ｍａｂ（ＣｌａｒｋおよびＬ
ｅｄｂｅｔｔｅｒ，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．８３：４４９４−４４９８）と協同し
てＢ細胞の増殖を誘発し、ＩＬ−４と協同してＢ細胞の
増殖（Ｇｏｒｄｅｎら、１９８７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１７：１５３５−１５３８；Ｒｏｕｓｓｅｔ
ら、１９９１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：７０５−
７１０）およびＩｇＥの分泌（Ｊａｂａｒａら、１９９
０，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１８６１−１８６
４；Ｒｏｕｓｓｅｔら、１９９１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．１７３：７０５−７１０；Ｇａｓｃａｎら、１９９
１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８−１３；Ｚｈａｎ
ｇら、１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：１８３
６−１８４；Ｓｈａｐｉｒａら、１９９２，Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．１７５：２８９−２９２）を誘発し、そし
てＩＬ−１０およびＴＧＦ−βと協同してｓＩｇＤ+ Ｂ
細胞によるＩｇＡの分泌を誘発する（ＤｅＦｒａｎｃｅ
ら、１９９２，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：６７１−
６８２）。
スチルアセテート（ＰＭＡ；Ｇｏｒｄｅｎら、１９８
７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１５３５−１
５３８）または抗ＣＤ２０Ｍａｂ（ＣｌａｒｋおよびＬ
ｅｄｂｅｔｔｅｒ，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．８３：４４９４−４４９８）と協同し
てＢ細胞の増殖を誘発し、ＩＬ−４と協同してＢ細胞の
増殖（Ｇｏｒｄｅｎら、１９８７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１７：１５３５−１５３８；Ｒｏｕｓｓｅｔ
ら、１９９１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：７０５−
７１０）およびＩｇＥの分泌（Ｊａｂａｒａら、１９９
０，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１８６１−１８６
４；Ｒｏｕｓｓｅｔら、１９９１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．１７３：７０５−７１０；Ｇａｓｃａｎら、１９９
１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８−１３；Ｚｈａｎ
ｇら、１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：１８３
６−１８４；Ｓｈａｐｉｒａら、１９９２，Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．１７５：２８９−２９２）を誘発し、そし
てＩＬ−１０およびＴＧＦ−βと協同してｓＩｇＤ+ Ｂ
細胞によるＩｇＡの分泌を誘発する（ＤｅＦｒａｎｃｅ
ら、１９９２，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：６７１−
６８２）。
【０００６】また、ＣＤ４０が出したシグナルが活性化
されたＢ細胞によるサイトカインの生産を変調すること
に関係するという証拠が存在する（Ｃａｉｒｎｓら、１
９８８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：３４９−
３５３；ＣｌａｒｋおよびＳｈｕ，１９９０，Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１４５：１４００−１４０６）。
されたＢ細胞によるサイトカインの生産を変調すること
に関係するという証拠が存在する（Ｃａｉｒｎｓら、１
９８８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：３４９−
３５３；ＣｌａｒｋおよびＳｈｕ，１９９０，Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１４５：１４００−１４０６）。
【０００７】プラスチック上に固定化された抗ＣＤ４０
ｍＡｂがＩＬ−４と組み合わせて激しいＢ細胞の増殖を
誘発することができないという観察により証明されるよ
うに、抗ＣＤ４０ｍＡｂ単独の架橋はＢ細胞の増殖を誘
発するために十分ではない（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、
１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７０−７２）。し
かしながら、Ｆｃレセプター、ＣＤｗ３２、で形質転換
されたネズミＬ細胞上に固定化された抗ＣＤ４０ｍＡｂ
はＩＬ−４の存在下にＢ細胞の増殖を誘発することがで
き（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２５１：７０−７２）、線維芽により提供されるシ
グナルがＣＤ４０シグナルおよびＩＬ−４と協同してＢ
細胞の増殖を推進することを示唆する。
ｍＡｂがＩＬ−４と組み合わせて激しいＢ細胞の増殖を
誘発することができないという観察により証明されるよ
うに、抗ＣＤ４０ｍＡｂ単独の架橋はＢ細胞の増殖を誘
発するために十分ではない（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、
１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７０−７２）。し
かしながら、Ｆｃレセプター、ＣＤｗ３２、で形質転換
されたネズミＬ細胞上に固定化された抗ＣＤ４０ｍＡｂ
はＩＬ−４の存在下にＢ細胞の増殖を誘発することがで
き（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２５１：７０−７２）、線維芽により提供されるシ
グナルがＣＤ４０シグナルおよびＩＬ−４と協同してＢ
細胞の増殖を推進することを示唆する。
【０００８】２．２．Ｔ細胞抗原、ＧＰ３９
ＣＤ４０のリガンドｇｐ３９が、活性化されたＣＤ４+
ネズミＴ細胞の表面上に発現されるほぼ３９kDa の糖タ
ンパク質であることを示すために、ヒトＣＤ４０、例え
ば、ＣＤ４０−Ｉｇの細胞外ドメインの可溶性の形態が
使用されている（Ａｒｍｉｔａｇｅら、１９９２，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３５７：８０−８２；Ｎｏｅｌｌｅら、１９
９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８９：６５５０−６５５４）。ｇｐ３９との相互作用
は休止するＢ細胞を細胞サイクルの中に入れさせ、そし
てリンホカインの成長および分化作用に対して応答性す
るようにさせる（Ａｒｍｉｔａｇｅら、１９９２，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３５７：８０−８２；Ｎｏｅｌｌｅら、１９
９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８９：６５５０−６５５４）。
ネズミＴ細胞の表面上に発現されるほぼ３９kDa の糖タ
ンパク質であることを示すために、ヒトＣＤ４０、例え
ば、ＣＤ４０−Ｉｇの細胞外ドメインの可溶性の形態が
使用されている（Ａｒｍｉｔａｇｅら、１９９２，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３５７：８０−８２；Ｎｏｅｌｌｅら、１９
９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８９：６５５０−６５５４）。ｇｐ３９との相互作用
は休止するＢ細胞を細胞サイクルの中に入れさせ、そし
てリンホカインの成長および分化作用に対して応答性す
るようにさせる（Ａｒｍｉｔａｇｅら、１９９２，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３５７：８０−８２；Ｎｏｅｌｌｅら、１９
９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８９：６５５０−６５５４）。
【０００９】最近、ネズミｇｐ３９をコードするｃＤＮ
Ａが分離され、そしてトランスフェクションされた細胞
上に膜タンパク質として発現されたとき、機能的に活性
であることが示された（Ａｒｍｉｔａｇｅら、１９９
２，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：８０−８２）。このｃＤＮ
ＡはII型膜タンパク質の典型的な特徴をもつ２６０アミ
ノ酸のポリペプチドをコードし、そしてネズミｇｐ３９
を発現するＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞は追加の共刺激なしに
ネズミおよびヒトＢ細胞の増殖を誘発することが示され
た。
Ａが分離され、そしてトランスフェクションされた細胞
上に膜タンパク質として発現されたとき、機能的に活性
であることが示された（Ａｒｍｉｔａｇｅら、１９９
２，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：８０−８２）。このｃＤＮ
ＡはII型膜タンパク質の典型的な特徴をもつ２６０アミ
ノ酸のポリペプチドをコードし、そしてネズミｇｐ３９
を発現するＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞は追加の共刺激なしに
ネズミおよびヒトＢ細胞の増殖を誘発することが示され
た。
【００１０】３．発明の要約
本発明は、ＣＤ４０のための可溶性リガンドに関し、と
くに、ヒトｇｐ３９タンパク質およびそれから誘導され
た可溶性リガンドに関する。それは、少なくとも一部
分、ヒトＴ細胞の抗原ｇｐ３９、ＣＤ４０レセプターの
リガンド、の発見、クローニングおよび発現に基づく。
それはまた、一部分、ヒトｇｐ３９の可溶性の形態の調
製に基づき、この可溶性の形態は共刺激因子と一緒にＢ
細胞の増殖および分化を促進することができる。
くに、ヒトｇｐ３９タンパク質およびそれから誘導され
た可溶性リガンドに関する。それは、少なくとも一部
分、ヒトＴ細胞の抗原ｇｐ３９、ＣＤ４０レセプターの
リガンド、の発見、クローニングおよび発現に基づく。
それはまた、一部分、ヒトｇｐ３９の可溶性の形態の調
製に基づき、この可溶性の形態は共刺激因子と一緒にＢ
細胞の増殖および分化を促進することができる。
【００１１】本発明は、実質的に図１に記載する配列を
有する本質的に精製および分離されたヒトｇｐ３９タン
パク質、ならびに実質的に図１に記載するおよび／また
は前記ヒトｇｐ３９タンパク質をコードする配列を有す
る本質的に精製および分離された核酸を提供する。本発
明は、さらに、ヒトならびにヒト以外のｇｐ３９の可溶
性の形態を提供する。本発明の好ましい非限定的実施態
様において、可溶性ｇｐ３９は発現ベクターＣＤ８−ｇ
ｐ３９を使用して生成することができる。
有する本質的に精製および分離されたヒトｇｐ３９タン
パク質、ならびに実質的に図１に記載するおよび／また
は前記ヒトｇｐ３９タンパク質をコードする配列を有す
る本質的に精製および分離された核酸を提供する。本発
明は、さらに、ヒトならびにヒト以外のｇｐ３９の可溶
性の形態を提供する。本発明の好ましい非限定的実施態
様において、可溶性ｇｐ３９は発現ベクターＣＤ８−ｇ
ｐ３９を使用して生成することができる。
【００１２】本発明の可溶性ｇｐ３９は共刺激因子と一
緒に使用して、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ
のＢ細胞の増殖を促進することができる。このような増
殖は、増強された免疫応答から利益を得る状態、例え
ば、後天性免疫不全症候群の処置において、あるいは長
期間のＢ細胞の成長のための細胞培養系の発生のために
望ましいことがある。
緒に使用して、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ
のＢ細胞の増殖を促進することができる。このような増
殖は、増強された免疫応答から利益を得る状態、例え
ば、後天性免疫不全症候群の処置において、あるいは長
期間のＢ細胞の成長のための細胞培養系の発生のために
望ましいことがある。
【００１３】５．発明の具体的な説明
説明の明瞭さのためにそして限定なしに、本発明の詳細
な説明を次のように分割する： （ｉ）ヒトｇｐ３９（ｈｇｐ３９）のクローニングおよ
び発現； （ii）可溶性ｇｐ３９（ｓｇｐ３９）の調製；および （iii ）本発明の実用性。
な説明を次のように分割する： （ｉ）ヒトｇｐ３９（ｈｇｐ３９）のクローニングおよ
び発現； （ii）可溶性ｇｐ３９（ｓｇｐ３９）の調製；および （iii ）本発明の実用性。
【００１４】５．１．ヒトｇｐ３９のクローニングおよ
び発現 本発明は、ｈｇｐ３９をコードする本質的に精製および
分離された核酸、本質的に精製および分離されたｈｇｐ
３９タンパク質、およびｈｇｐ３９を発現する方法を提
供する。ｈｇｐ３９の完全な核酸配列（ｃＤＮＡに相当
する）およびｈｇｐ３９の完全なアミノ酸配列は図１に
示されており、そしてプラスミドＣＤ８−ｇｐ３９の中
に含有されており、このプラスミドはアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ａ
ＴＣＣ）に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）、ＣＤＭ８ ＭＣ１０６１／ｐ３−ｈｇｐ３９とし
て受託され、そして受け入れ番号６９０５０を割り当て
られた。
び発現 本発明は、ｈｇｐ３９をコードする本質的に精製および
分離された核酸、本質的に精製および分離されたｈｇｐ
３９タンパク質、およびｈｇｐ３９を発現する方法を提
供する。ｈｇｐ３９の完全な核酸配列（ｃＤＮＡに相当
する）およびｈｇｐ３９の完全なアミノ酸配列は図１に
示されており、そしてプラスミドＣＤ８−ｇｐ３９の中
に含有されており、このプラスミドはアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ａ
ＴＣＣ）に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）、ＣＤＭ８ ＭＣ１０６１／ｐ３−ｈｇｐ３９とし
て受託され、そして受け入れ番号６９０５０を割り当て
られた。
【００１５】可溶性ｈｇｐ３９（ｓｈｇｐ３９）の生産
に使用することができる発現ベクターの例はプラスミド
ＣＤＭ７Ｂ- ＭＣ１０６１／ｐ３−ｓｈｇｐ３９であ
り、このプラスミドはＡＴＣＣに大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＣＤＭ７Ｂ- ＭＣ１０６１
／ｐ３−ｓｈｇｐ３９として受託され、そして受け入れ
番号６９０４９を割り当てられた。
に使用することができる発現ベクターの例はプラスミド
ＣＤＭ７Ｂ- ＭＣ１０６１／ｐ３−ｓｈｇｐ３９であ
り、このプラスミドはＡＴＣＣに大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＣＤＭ７Ｂ- ＭＣ１０６１
／ｐ３−ｓｈｇｐ３９として受託され、そして受け入れ
番号６９０４９を割り当てられた。
【００１６】特定の実施態様において、本発明は実質的
に図１に記載する配列を有する本質的に精製および分離
された核酸、および実質的に図１に記載する配列を有す
るタンパク質をコードする本質的に精製および分離され
た核酸を提供する。本発明は、さらに、実質的に図１に
記載する配列を有する本質的に精製および分離されたタ
ンパク質を提供する。
に図１に記載する配列を有する本質的に精製および分離
された核酸、および実質的に図１に記載する配列を有す
るタンパク質をコードする本質的に精製および分離され
た核酸を提供する。本発明は、さらに、実質的に図１に
記載する配列を有する本質的に精製および分離されたタ
ンパク質を提供する。
【００１７】用語「実質的に」は、ここにおいて使用す
るとき、図１に記載する配列が、図１に記載する配列を
有するタンパク質と機能的に同等な分子を生ずる突然変
異、例えば、置換、付加または欠失により変更できるこ
とを示す。例えば、遺伝暗号の縮重のために、図１に記
載する核酸の配列を変更することができ、ただし最終の
配列は図１に記載するのと同一の配列または機能的に同
等の配列を有するタンパク質をコードすること；すなわ
ち、機能的に同等のアミノ酸、例えば、同一の群（例え
ば、疎水性、塩基性または酸性）のアミノ酸がタンパク
質の中に置換されていること；を条件とする。
るとき、図１に記載する配列が、図１に記載する配列を
有するタンパク質と機能的に同等な分子を生ずる突然変
異、例えば、置換、付加または欠失により変更できるこ
とを示す。例えば、遺伝暗号の縮重のために、図１に記
載する核酸の配列を変更することができ、ただし最終の
配列は図１に記載するのと同一の配列または機能的に同
等の配列を有するタンパク質をコードすること；すなわ
ち、機能的に同等のアミノ酸、例えば、同一の群（例え
ば、疎水性、塩基性または酸性）のアミノ酸がタンパク
質の中に置換されていること；を条件とする。
【００１８】例えば、配列内の１または２以上のアミノ
酸残基を、機能的に同等のものとして作用する同様な極
性の他のアミノ酸と置換して、サイレントの変更を生ず
ることができる。配列内のアミノ酸の置換はそのアミノ
酸が属するクラスの他の構成員から選抜することができ
る。例えば、非極性（疎水性）のアミノ酸は、アラニ
ン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェ
ニルアラニン、トリプトファンおよびグルタミンを包含
する。
酸残基を、機能的に同等のものとして作用する同様な極
性の他のアミノ酸と置換して、サイレントの変更を生ず
ることができる。配列内のアミノ酸の置換はそのアミノ
酸が属するクラスの他の構成員から選抜することができ
る。例えば、非極性（疎水性）のアミノ酸は、アラニ
ン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェ
ニルアラニン、トリプトファンおよびグルタミンを包含
する。
【００１９】正に帯電した（塩基性の）アミノ酸はアル
ギニン、リジンおよびヒスチジンを包含する。負に帯電
した（酸性の）アミノ酸はアスパラギン酸およびグルタ
ミン酸を包含する。本発明のタンパク質は、また、翻訳
の間または後に、例えば、リン酸化、グリコシル化、架
橋、アシル化、タンパク質分解的切断などにより異なる
ように修飾することができる。
ギニン、リジンおよびヒスチジンを包含する。負に帯電
した（酸性の）アミノ酸はアスパラギン酸およびグルタ
ミン酸を包含する。本発明のタンパク質は、また、翻訳
の間または後に、例えば、リン酸化、グリコシル化、架
橋、アシル化、タンパク質分解的切断などにより異なる
ように修飾することができる。
【００２０】ｈｇｐ３９をコードする配列を含有するゲ
ノムまたはｃＤＮＡのクローンは、例えば、図１に記載
するｈｇｐ３９配列の一部分を含有するオリゴヌクレオ
チドプローブを合成し、そしてＢｅｎｔｏｎおよびＤａ
ｖｉｓ（１９７７，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６：１８０）
またはＧｒｕｎｓｔｅｉｎおよびＨｏｇｎｅｓｓ（１９
７５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７２：３９６１−３９６５）の方法によりハイブリダ
イゼーション反応においてこのようなプローブを使用す
ることによって同定することができる。
ノムまたはｃＤＮＡのクローンは、例えば、図１に記載
するｈｇｐ３９配列の一部分を含有するオリゴヌクレオ
チドプローブを合成し、そしてＢｅｎｔｏｎおよびＤａ
ｖｉｓ（１９７７，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６：１８０）
またはＧｒｕｎｓｔｅｉｎおよびＨｏｇｎｅｓｓ（１９
７５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７２：３９６１−３９６５）の方法によりハイブリダ
イゼーション反応においてこのようなプローブを使用す
ることによって同定することができる。
【００２１】同様に、図１に記載するｈｇｐ３９配列の
一部分を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを調製
し、そして、例えば、活性化されたＴリンパ球からのｃ
ＤＮＡを鋳型として使用する、ポリメラーゼ連鎖反応
（Ｓａｉｋｉら、１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：
１３５０−１３５４）において使用して、ｈｇｐ３９配
列の断片を発生させ、それらの断片を一緒に寸断してｈ
ｇｐ３９をコードする全長の配列を形成するか、あるい
はそれを同定することができる。
一部分を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを調製
し、そして、例えば、活性化されたＴリンパ球からのｃ
ＤＮＡを鋳型として使用する、ポリメラーゼ連鎖反応
（Ｓａｉｋｉら、１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：
１３５０−１３５４）において使用して、ｈｇｐ３９配
列の断片を発生させ、それらの断片を一緒に寸断してｈ
ｇｐ３９をコードする全長の配列を形成するか、あるい
はそれを同定することができる。
【００２２】本発明の特定の非限定的実施態様におい
て、ｈｇｐ３９をコードするｃＤＮＡを次のようにして
分離しそして特性決定することができる。ＣＤ４０−Ｉ
ｇは、Ｎｏｅｌｌｅら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：Ｆｃレセプターへ
の結合を減少する３つの突然変異、すなわち、Ｌ２３４
Ｆ，Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７Ａを、免疫グロブリンの
ドメインの中に導入することによって修飾することがで
きる。修飾されたＣＤ４０−Ｉｇは、Ａｒｕｆｆｏ，１
９９０，Ｃｅｌｌ ６１：１３０３−１３１３に記載さ
れているようにＣＯＳ細胞の上澄み液から精製すること
ができる。
て、ｈｇｐ３９をコードするｃＤＮＡを次のようにして
分離しそして特性決定することができる。ＣＤ４０−Ｉ
ｇは、Ｎｏｅｌｌｅら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：Ｆｃレセプターへ
の結合を減少する３つの突然変異、すなわち、Ｌ２３４
Ｆ，Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７Ａを、免疫グロブリンの
ドメインの中に導入することによって修飾することがで
きる。修飾されたＣＤ４０−Ｉｇは、Ａｒｕｆｆｏ，１
９９０，Ｃｅｌｌ ６１：１３０３−１３１３に記載さ
れているようにＣＯＳ細胞の上澄み液から精製すること
ができる。
【００２３】ヒトｇｐ３９のｃＤＮＡは、ポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）により、フィトヘムアグリチニン活
性化ヒト末梢血液のＢ細胞から調製されたライブラリー
から増幅することができる（Ｃａｍｅｒｉｎｉら、１９
８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：７８−８２）。オリゴヌ
クレオチドのプライマーをネズミｇｐ３９の配列に基づ
いてデザインし（Ａｒｍｉｔａｇｅら、１９９２，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３５７：８０−８２）そしてＰＣＲ生成物の
サブクローニングにおいて使用すべき、制限酵素Ｘｂａ
ＩおよびＨｉｎｄIII のための切断部位を含めるように
操作することができる。
連鎖反応（ＰＣＲ）により、フィトヘムアグリチニン活
性化ヒト末梢血液のＢ細胞から調製されたライブラリー
から増幅することができる（Ｃａｍｅｒｉｎｉら、１９
８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：７８−８２）。オリゴヌ
クレオチドのプライマーをネズミｇｐ３９の配列に基づ
いてデザインし（Ａｒｍｉｔａｇｅら、１９９２，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３５７：８０−８２）そしてＰＣＲ生成物の
サブクローニングにおいて使用すべき、制限酵素Ｘｂａ
ＩおよびＨｉｎｄIII のための切断部位を含めるように
操作することができる。
【００２４】例えば、限定的ではなく、次のオリゴヌク
レオチドを使用することができる：５′−GCG AAG CTT
TCA GTC AGC ATG ATA GAA ACA −３′（配列番号：１
３）および５−CGC TCT AGA TGT TCA GAG TTT GAG TAA
GCC −３′（配列番号：１４）。増幅はＴａｑポリメラ
ーゼおよび製造業者（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅ
ｔｕｓ Ｃｏｒｐ．，ノーウォーク，コネチカット州）
が推奨する反応緩衝液を使用して次の温度のプログラム
の３０サイクルにより実施することができる：２分、９
５℃；２分、５５℃；３分、７２℃。
レオチドを使用することができる：５′−GCG AAG CTT
TCA GTC AGC ATG ATA GAA ACA −３′（配列番号：１
３）および５−CGC TCT AGA TGT TCA GAG TTT GAG TAA
GCC −３′（配列番号：１４）。増幅はＴａｑポリメラ
ーゼおよび製造業者（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅ
ｔｕｓ Ｃｏｒｐ．，ノーウォーク，コネチカット州）
が推奨する反応緩衝液を使用して次の温度のプログラム
の３０サイクルにより実施することができる：２分、９
５℃；２分、５５℃；３分、７２℃。
【００２５】ＰＣＲ生成物はＨｉｎｄIII およびＸｂａ
Ｉで消化することができ、そして内部のＨｉｎｄIII 制
限部位を含有することがわかるであろう。次いで生ずる
ＨｉｎｄIII −ＸｂａＩ断片を適当なベクター、例え
ば、ＣＤＭ８ベクターの中にサブクローニングすること
ができる。完全な遺伝子生成物は、ＨｉｎｄIII −Ｘｂ
ａＩ断片を含有するベクターの中にＨｉｎｄIII −Ｘｂ
ａＩ断片サブクローニングすることによって、構成する
ことができる。
Ｉで消化することができ、そして内部のＨｉｎｄIII 制
限部位を含有することがわかるであろう。次いで生ずる
ＨｉｎｄIII −ＸｂａＩ断片を適当なベクター、例え
ば、ＣＤＭ８ベクターの中にサブクローニングすること
ができる。完全な遺伝子生成物は、ＨｉｎｄIII −Ｘｂ
ａＩ断片を含有するベクターの中にＨｉｎｄIII −Ｘｂ
ａＩ断片サブクローニングすることによって、構成する
ことができる。
【００２６】次いで、生ずる構成体をＡｒｕｆｆｏら、
１９９０，Ｃｅｌｌ ６１：１３０３−１３１３に記載
されているようにＤＥＡＥ−デキストランを使用してＣ
ＯＳ細胞の中にトランスフェクションすることができ
る。トランスフェクション体をＣＤ４０−Ｉｇ（ＤＭＥ
Ｍ培地中の２５μｇ／ml）および引き続いてＦＩＴＣ接
合ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ抗体（ＤＭＥＭ中の１：５０希
釈、ＴＡＧＯ、バーリンゲイム，カリフォルニア州）で
染色し、そして免疫蛍光顕微鏡検査により可視化するこ
とができる。
１９９０，Ｃｅｌｌ ６１：１３０３−１３１３に記載
されているようにＤＥＡＥ−デキストランを使用してＣ
ＯＳ細胞の中にトランスフェクションすることができ
る。トランスフェクション体をＣＤ４０−Ｉｇ（ＤＭＥ
Ｍ培地中の２５μｇ／ml）および引き続いてＦＩＴＣ接
合ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ抗体（ＤＭＥＭ中の１：５０希
釈、ＴＡＧＯ、バーリンゲイム，カリフォルニア州）で
染色し、そして免疫蛍光顕微鏡検査により可視化するこ
とができる。
【００２７】完全なｈｇｐ３９配列を含有するクローン
は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、分子クローニン
グ：実験室のマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ）、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、コー
ルド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク州、に記載
されているように、コロニーのハイブリダイゼーション
により得ることができる。ＰＣＲ生成物のサブクローニ
ングしたＨｉｎｄIII −ＨｉｎｄIII 断片を使用して、
ランダムプライムドポリメリゼーションにより32Ｐ標識
されたプローブを発生させることができる。いくつかの
個々のクローンからのプラスミドのＤＮＡをＣＯＳ細胞
の中にトランスフェクションし、そしてトランスフェク
ション体をＣＤ４０−Ｉｇで染色することができる。次
いで、陽性に染色するトランスフェクション体を生ずる
クローンを、制限断片のマクロファージおよび配列決定
によりさらに特性決定することができる。
は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、分子クローニン
グ：実験室のマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ）、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、コー
ルド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク州、に記載
されているように、コロニーのハイブリダイゼーション
により得ることができる。ＰＣＲ生成物のサブクローニ
ングしたＨｉｎｄIII −ＨｉｎｄIII 断片を使用して、
ランダムプライムドポリメリゼーションにより32Ｐ標識
されたプローブを発生させることができる。いくつかの
個々のクローンからのプラスミドのＤＮＡをＣＯＳ細胞
の中にトランスフェクションし、そしてトランスフェク
ション体をＣＤ４０−Ｉｇで染色することができる。次
いで、陽性に染色するトランスフェクション体を生ずる
クローンを、制限断片のマクロファージおよび配列決定
によりさらに特性決定することができる。
【００２８】一旦得られると、ｈｇｐ３９遺伝子を任意
のこの分野において知られている方法によりクローニン
グまたはサブクローニングすることができる。この分野
において知られている多数のベクター−宿主系を使用す
ることができる。可能なベクターは次のものを包含する
が、これらに限定されない：コスミド、プラスミド、ま
たは修飾されたウイルス、しかしベクター系は使用する
宿主細胞と適合性でなくてはならない。このようなベク
ターは次のものを包含するが、これらに限定されない：
バクテリオファージ、例えば、ラムダ誘導体、またはプ
ラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２，ｐｕＣ、またはブル
ースクリプト（ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔR）（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｓ）プラスミド誘導体。組み換え分子を宿主細
胞の中に形質転換、トランスフェクション、感染、エレ
クトロポレイションなどにより導入することができる。
のこの分野において知られている方法によりクローニン
グまたはサブクローニングすることができる。この分野
において知られている多数のベクター−宿主系を使用す
ることができる。可能なベクターは次のものを包含する
が、これらに限定されない：コスミド、プラスミド、ま
たは修飾されたウイルス、しかしベクター系は使用する
宿主細胞と適合性でなくてはならない。このようなベク
ターは次のものを包含するが、これらに限定されない：
バクテリオファージ、例えば、ラムダ誘導体、またはプ
ラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２，ｐｕＣ、またはブル
ースクリプト（ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔR）（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｓ）プラスミド誘導体。組み換え分子を宿主細
胞の中に形質転換、トランスフェクション、感染、エレ
クトロポレイションなどにより導入することができる。
【００２９】ｈｇｐ３９遺伝子をクローニングベクター
の中に挿入することができ、このベクターを使用して適
当な宿主細胞を形質転換、トランスフェクションまたは
感染し、こうして遺伝子配列の多数のコピーを発生させ
ることができる。これはＤＮＡ断片を相補的粘着末端を
有するクローニングベクターの中に結合することによっ
て達成できる。しかしながら、ＤＮＡを断片化するため
に使用する相補的制限部位ｇａクローニングベクターの
中に存在しない場合、ＤＮＡ分子の末端を酵素的に修飾
することができる。
の中に挿入することができ、このベクターを使用して適
当な宿主細胞を形質転換、トランスフェクションまたは
感染し、こうして遺伝子配列の多数のコピーを発生させ
ることができる。これはＤＮＡ断片を相補的粘着末端を
有するクローニングベクターの中に結合することによっ
て達成できる。しかしながら、ＤＮＡを断片化するため
に使用する相補的制限部位ｇａクローニングベクターの
中に存在しない場合、ＤＮＡ分子の末端を酵素的に修飾
することができる。
【００３０】組み換えｈｇｐ３９を発現するために、ｈ
ｇｐ３９タンパク質またはその一部分をコードするヌク
レオチド配列を適当な発現ベクター、すなわち、挿入さ
れたペプチド／タンパク質をコードする配列の転写およ
び翻訳のために必要な要素を含有するベクター、の中に
挿入することができる。必要な転写および翻訳のシグナ
ルは、また、自然ｈｇｐ３９遺伝子および／またはその
フランキング領域により供給されることができる。種々
の宿主−ベクター系を利用して、タンパク質−コード配
列を発現することができる。
ｇｐ３９タンパク質またはその一部分をコードするヌク
レオチド配列を適当な発現ベクター、すなわち、挿入さ
れたペプチド／タンパク質をコードする配列の転写およ
び翻訳のために必要な要素を含有するベクター、の中に
挿入することができる。必要な転写および翻訳のシグナ
ルは、また、自然ｈｇｐ３９遺伝子および／またはその
フランキング領域により供給されることができる。種々
の宿主−ベクター系を利用して、タンパク質−コード配
列を発現することができる。
【００３１】これらは次のものを包含するが、これらに
限定されない：ウイルス（例えば、ワクシニアウイル
ス、アデノウイルスなど）で感染された、あるいはプラ
スミド発現ベクターでトランスフェクションされた哺乳
動物細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）で
感染された昆虫細胞系；微生物、例えば、酵母菌のベク
ターを含有する酵母菌、あるいはバクテリオファージＤ
ＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡで形質転
換されたバクテリア。これらのベクターの発現要素はそ
れらの強さおよび特異性において変化する。
限定されない：ウイルス（例えば、ワクシニアウイル
ス、アデノウイルスなど）で感染された、あるいはプラ
スミド発現ベクターでトランスフェクションされた哺乳
動物細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）で
感染された昆虫細胞系；微生物、例えば、酵母菌のベク
ターを含有する酵母菌、あるいはバクテリオファージＤ
ＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡで形質転
換されたバクテリア。これらのベクターの発現要素はそ
れらの強さおよび特異性において変化する。
【００３２】ｈｇｐ３９タンパク質またはその一部分を
コードする核酸配列の発現を第２核酸配列により調節
し、こうしてｈｇｐ３９のタンパク質またはペプチドが
組み換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主の中で発現さ
れるようにすることができる。例えば、ｈｇｐ３９の発
現はこの分野において知られているプロモーター／エン
ハンサー要素によりコントロールすることができる。ｈ
ｇｐ３９の発現をコントロールするために使用できるプ
ロモーターは次のものを包含するが、これらに限定され
ない：
コードする核酸配列の発現を第２核酸配列により調節
し、こうしてｈｇｐ３９のタンパク質またはペプチドが
組み換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主の中で発現さ
れるようにすることができる。例えば、ｈｇｐ３９の発
現はこの分野において知られているプロモーター／エン
ハンサー要素によりコントロールすることができる。ｈ
ｇｐ３９の発現をコントロールするために使用できるプ
ロモーターは次のものを包含するが、これらに限定され
ない：
【００３３】ＳＶ４０の早期のプロモーター領域（Ｂｅ
ｎｏｉｓｔおよびＣｈｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒ
ｅ ２９０：３０４−３１０）、サイトメガロウイルス
のプロモーター、ＲＳウイルスの３′の長い末端の反復
の中に含有されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、
１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７）；ヘルペ
スチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１
９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
>Ａ ７８：１４４１−１４４５）、メタロチオネイン
遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２，Ｎ
ａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）；原核生物の発現ベ
クター、例えば、β−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉ
ｌｌａ−Ｌａｍａｒｏｆｆら、１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：３７２７−
３７３１）；
ｎｏｉｓｔおよびＣｈｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒ
ｅ ２９０：３０４−３１０）、サイトメガロウイルス
のプロモーター、ＲＳウイルスの３′の長い末端の反復
の中に含有されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、
１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７）；ヘルペ
スチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１
９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
>Ａ ７８：１４４１−１４４５）、メタロチオネイン
遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２，Ｎ
ａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）；原核生物の発現ベ
クター、例えば、β−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉ
ｌｌａ−Ｌａｍａｒｏｆｆら、１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：３７２７−
３７３１）；
【００３４】酵母菌または他の菌類からのプロモーター
要素、例えば、Ｇａｌ４プロモーターまたはアルコール
デヒドロゲナーゼプロモーター；および動物の転写コン
トロール領域、例えば、リンパ系細胞の中で活性である
免疫グロブリン遺伝子のコントロール領域（Ｇｒｏｓｓ
ｃｈｅｄｌら、１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６４７−６
５８；Ａｄａｍｅｓら、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１
８：５３３−５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９８
７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４
４４）、骨髄細胞の中で活性であるベータ−グロビン遺
伝子のコントロール領域（Ｍａｇｒａｍら、１９８５，
Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−３４０；Ｋｏｌｌｉａ
ｓら、１９８６，Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４）、およ
び他の組織特異的または構成的プロモーター／エンハン
サー要素。
要素、例えば、Ｇａｌ４プロモーターまたはアルコール
デヒドロゲナーゼプロモーター；および動物の転写コン
トロール領域、例えば、リンパ系細胞の中で活性である
免疫グロブリン遺伝子のコントロール領域（Ｇｒｏｓｓ
ｃｈｅｄｌら、１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６４７−６
５８；Ａｄａｍｅｓら、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１
８：５３３−５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９８
７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４
４４）、骨髄細胞の中で活性であるベータ−グロビン遺
伝子のコントロール領域（Ｍａｇｒａｍら、１９８５，
Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−３４０；Ｋｏｌｌｉａ
ｓら、１９８６，Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４）、およ
び他の組織特異的または構成的プロモーター／エンハン
サー要素。
【００３５】このような系において発現された組み換え
ｈｇｐ３９のタンパク質またはペプチドを集め、そして
クロマトグラフィー（例えば、イオン交換；親和（例え
ば、リガンドとしてＣＤ４０を使用する）；およびサイ
ジングカラムクロマトグラフィー）、遠心および分別溶
解を包含する標準の方法によるか、あるいはタンパク質
の精製のための任意の他の標準の技術により精製するこ
とができる。本発明によれば、ｈｇｐ３９のタンパク質
またはペプチドをまた標準のタンパク質合成技術により
化学的に合成することができる。
ｈｇｐ３９のタンパク質またはペプチドを集め、そして
クロマトグラフィー（例えば、イオン交換；親和（例え
ば、リガンドとしてＣＤ４０を使用する）；およびサイ
ジングカラムクロマトグラフィー）、遠心および分別溶
解を包含する標準の方法によるか、あるいはタンパク質
の精製のための任意の他の標準の技術により精製するこ
とができる。本発明によれば、ｈｇｐ３９のタンパク質
またはペプチドをまた標準のタンパク質合成技術により
化学的に合成することができる。
【００３６】５．２．可溶性ｇｐ３９の調製
本発明は、また、ヒトおよびヒト以外の両者のｇｐ３９
を包含する、ｇｐ３９の可溶性の形態を提供する。この
ようなｇｐ３９の可溶性の形態は、ｇｐ３９をコードす
る核酸、例えば、ｈｇｐ３９をコードする核酸（節５．
１、前掲、および図１を参照のこと）、またはネズミｇ
ｐ３９をコードする核酸（Ａｒｍｉｔａｇｅら、１９９
２，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：８０−８２）の遺伝子操作
により生産して、ほぼアミノ酸残基４８からアミノ酸残
基２６１に延びる、ｇｐ３９の細胞外ドメインからなる
ｇｐ３９融合タンパク質を生産する。
を包含する、ｇｐ３９の可溶性の形態を提供する。この
ようなｇｐ３９の可溶性の形態は、ｇｐ３９をコードす
る核酸、例えば、ｈｇｐ３９をコードする核酸（節５．
１、前掲、および図１を参照のこと）、またはネズミｇ
ｐ３９をコードする核酸（Ａｒｍｉｔａｇｅら、１９９
２，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：８０−８２）の遺伝子操作
により生産して、ほぼアミノ酸残基４８からアミノ酸残
基２６１に延びる、ｇｐ３９の細胞外ドメインからなる
ｇｐ３９融合タンパク質を生産する。
【００３７】ｇｐ３９のアミノ酸配列に加えて、本発明
の融合タンパク質はさらに分子の「標識」を含むことが
でき、これはより大きいタンパク質の一部分であること
がありそしてｇｐ３９ｇｐ３９のトランスメンブレンお
よび細胞質のドメインを置換し、そして試薬と反応する
「ハンドル」を提供する。可溶性ｇｐ３９は、また、ｇ
ｐ３９の細胞質およびトランスメンブレンのドメインを
Ｉ型膜タンパク質または分泌されたタンパク質から誘導
されたアミノ末端のシグナルペプチドと置換することに
よって、「標識」なしで調製することができる。
の融合タンパク質はさらに分子の「標識」を含むことが
でき、これはより大きいタンパク質の一部分であること
がありそしてｇｐ３９ｇｐ３９のトランスメンブレンお
よび細胞質のドメインを置換し、そして試薬と反応する
「ハンドル」を提供する。可溶性ｇｐ３９は、また、ｇ
ｐ３９の細胞質およびトランスメンブレンのドメインを
Ｉ型膜タンパク質または分泌されたタンパク質から誘導
されたアミノ末端のシグナルペプチドと置換することに
よって、「標識」なしで調製することができる。
【００３８】ｇｐ３９はII型膜タンパク質であり、した
がってカルボキシ末端の細胞外ドメインをもって配向さ
れているので、標識は望ましくはｇｐ３９の細胞外ドメ
イン（ｇｐ３９ＥＣＤ）に対して配向されたアミノ末端
である。好ましくは、標識タンパク質は融合タンパク質
の輸出を可能とするアミノ末端の分泌シグナル配列を含
有する。
がってカルボキシ末端の細胞外ドメインをもって配向さ
れているので、標識は望ましくはｇｐ３９の細胞外ドメ
イン（ｇｐ３９ＥＣＤ）に対して配向されたアミノ末端
である。好ましくは、標識タンパク質は融合タンパク質
の輸出を可能とするアミノ末端の分泌シグナル配列を含
有する。
【００３９】適当な標識タンパク質はよく定められた３
次構造をもつ細胞外のタンパク質ドメインを含み、こう
してｇｐ３９ＥＣＤの３次構造に影響を与える可能性を
最小とすると同時に首尾よい発現および輸送の可能性を
増加する。例えば、発現系から高い収率で合成および輸
出された融合タンパク質の中に組み込まれたことが知ら
れているＥＣＤタンパク質は、可溶性ｇｐ３９のために
適当な標識タンパク質であるようである。
次構造をもつ細胞外のタンパク質ドメインを含み、こう
してｇｐ３９ＥＣＤの３次構造に影響を与える可能性を
最小とすると同時に首尾よい発現および輸送の可能性を
増加する。例えば、発現系から高い収率で合成および輸
出された融合タンパク質の中に組み込まれたことが知ら
れているＥＣＤタンパク質は、可溶性ｇｐ３９のために
適当な標識タンパク質であるようである。
【００４０】標識タンパク質の選抜のための他の基準
は、標識タンパク質と反応する試薬の入手可能性であ
る。例えば、それに対する１または２以上のモノクロー
ナル抗体が生産されてきている標識タンパク質は、モノ
クローナル抗体により検出または操作することができる
「ハンドル」を提供するという利点を与える。
は、標識タンパク質と反応する試薬の入手可能性であ
る。例えば、それに対する１または２以上のモノクロー
ナル抗体が生産されてきている標識タンパク質は、モノ
クローナル抗体により検出または操作することができる
「ハンドル」を提供するという利点を与える。
【００４１】適当な標識タンパク質は次のものを包含す
るが、これらに限定されない：Ｉ型膜タンパク質の細胞
外ドメイン、例えば、ＣＤ８、分泌されたタンパク質、
例えば、ＩＬ−４、免疫グロブリンのＦｃドメインな
ど。本発明の好ましい、特定の、非限定的実施態様にお
いて、標識タンパク質はその細胞外ドメイン（ＥＣＤ）
からなるネズミＣＤ８（Ｎａｋａｕｃｈｉら、１９８
５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８２：５１２６−５１３０に記載されている）またはヒ
トの同等体（Ｋａｖａｔｈａｓら、１９８４，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：７６
８８）である。
るが、これらに限定されない：Ｉ型膜タンパク質の細胞
外ドメイン、例えば、ＣＤ８、分泌されたタンパク質、
例えば、ＩＬ−４、免疫グロブリンのＦｃドメインな
ど。本発明の好ましい、特定の、非限定的実施態様にお
いて、標識タンパク質はその細胞外ドメイン（ＥＣＤ）
からなるネズミＣＤ８（Ｎａｋａｕｃｈｉら、１９８
５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８２：５１２６−５１３０に記載されている）またはヒ
トの同等体（Ｋａｖａｔｈａｓら、１９８４，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：７６
８８）である。
【００４２】ネズミＣＤ８のヌクレオチド配列およびア
ミノ酸配列は図１１に記載されている；ＥＣＤはアミノ
酸残基１と１７４の間に見いだされ（核酸配列の第１Ａ
ＴＧからの番号）、ヌクレオチド残基１２１と７０８の
間の核酸の部分によりコードされる。対応するヒトＣＤ
８のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は図１２に記
載されている；ＥＣＤはアミノ酸残基１と１６１の間に
見いだされ、ヌクレオチド残基１２９と６１１の間の核
酸の部分によりコードされる。例えば、限定的ではない
が、図３に描写されそして節７において後述する構成体
を使用して、可溶性ｇｐ３９（ｓｇｐ３９）を生産する
ことができる。この構成体は次のようにして調製するこ
とができる。
ミノ酸配列は図１１に記載されている；ＥＣＤはアミノ
酸残基１と１７４の間に見いだされ（核酸配列の第１Ａ
ＴＧからの番号）、ヌクレオチド残基１２１と７０８の
間の核酸の部分によりコードされる。対応するヒトＣＤ
８のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は図１２に記
載されている；ＥＣＤはアミノ酸残基１と１６１の間に
見いだされ、ヌクレオチド残基１２９と６１１の間の核
酸の部分によりコードされる。例えば、限定的ではない
が、図３に描写されそして節７において後述する構成体
を使用して、可溶性ｇｐ３９（ｓｇｐ３９）を生産する
ことができる。この構成体は次のようにして調製するこ
とができる。
【００４３】ｈｇｐ３９のＥＣＤは、フィトヘムアグリ
チニン（ＰＨＡ）活性化されたヒト末梢血液のリンパ球
からのｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡライブラリーか
ら増幅することができる。オリゴヌクレオチドのプライ
マーを図１に記載する配列に基づいてデザインし、そし
て制限酵素の切断部位（例えば、ＢａｍＨＩ切断部位）
を遺伝子の５′末端に配置するように操作し、こうして
キメラ遺伝子を構成するとき、リーディングフレームが
保存されるようにすることができる。
チニン（ＰＨＡ）活性化されたヒト末梢血液のリンパ球
からのｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡライブラリーか
ら増幅することができる。オリゴヌクレオチドのプライ
マーを図１に記載する配列に基づいてデザインし、そし
て制限酵素の切断部位（例えば、ＢａｍＨＩ切断部位）
を遺伝子の５′末端に配置するように操作し、こうして
キメラ遺伝子を構成するとき、リーディングフレームが
保存されるようにすることができる。
【００４４】例えば、使用できるオリゴヌクレオチドは
５′−CGA AGC TTG GAT CCG AGG AGG TTG GAC AAG ATA
GAA GAT −３′（配列番号：１５）および５′−CGC TC
T AGA TGT TCA GAG TTT GAG TAA GCC −３′（配列番
号：１４）である。ＰＣＲをＰｆｕポリメラーゼを製造
業者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラジョラ，カリフォルニ
ア州）とともに使用して次の温度のプログラムに従い実
施することができる：５分、９５℃；２分、７２℃、２
分、５５℃；４０サイクルの１分、９５℃；２分、５５
℃；３分、７２℃；１０分、７２℃から成る増幅。
５′−CGA AGC TTG GAT CCG AGG AGG TTG GAC AAG ATA
GAA GAT −３′（配列番号：１５）および５′−CGC TC
T AGA TGT TCA GAG TTT GAG TAA GCC −３′（配列番
号：１４）である。ＰＣＲをＰｆｕポリメラーゼを製造
業者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラジョラ，カリフォルニ
ア州）とともに使用して次の温度のプログラムに従い実
施することができる：５分、９５℃；２分、７２℃、２
分、５５℃；４０サイクルの１分、９５℃；２分、５５
℃；３分、７２℃；１０分、７２℃から成る増幅。
【００４５】ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ
で消化し、そしてネズミＣＤ８（Ｌｙｔ２ａ）ＥＣＤま
たはそのヒト同等体をコードする遺伝子を含有するベク
ターの中にサブクローニングすることができる。次いで
生ずる構成体をＣＯＳ細胞の中にトランスフェクション
し、次いで発現させてｓｇｐ３９を形成し、次いでこれ
を固体の支持体、例えば、セファローズのビーズ上に固
定化されたＣＤ４０−Ｉｇまたは抗ネズミＣＤ８ｍＡ
ｂ、例えば、５３−６を含有する親和カラムを使用する
吸収および溶離により精製することができる。
で消化し、そしてネズミＣＤ８（Ｌｙｔ２ａ）ＥＣＤま
たはそのヒト同等体をコードする遺伝子を含有するベク
ターの中にサブクローニングすることができる。次いで
生ずる構成体をＣＯＳ細胞の中にトランスフェクション
し、次いで発現させてｓｇｐ３９を形成し、次いでこれ
を固体の支持体、例えば、セファローズのビーズ上に固
定化されたＣＤ４０−Ｉｇまたは抗ネズミＣＤ８ｍＡ
ｂ、例えば、５３−６を含有する親和カラムを使用する
吸収および溶離により精製することができる。
【００４６】ｇｐ３９ＥＣＤおよび種々の標識から調製
されたｓｇｐ３９融合タンパク質がＣＤ４０に結合でき
ることを確証することが望ましいことがある。例えば、
限定せずに、ｓｇｐ３９のＣＤ４０への結合はＥＬＩＳ
Ａにおいて確証することができ、ここで９６ウェルのプ
レートのウェルを抗標識抗体で被覆し、０．０５％のツ
イーン２０を含有するリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）（ＴＰ
ＢＳ）で洗浄し、次いで１×検体希釈濃縮物でブロック
することができる（Ｇｅｂｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、
２２５μｌ／ウェル、２時間、室温）。次いでウェルを
ＴＰＢＳで洗浄することができる。
されたｓｇｐ３９融合タンパク質がＣＤ４０に結合でき
ることを確証することが望ましいことがある。例えば、
限定せずに、ｓｇｐ３９のＣＤ４０への結合はＥＬＩＳ
Ａにおいて確証することができ、ここで９６ウェルのプ
レートのウェルを抗標識抗体で被覆し、０．０５％のツ
イーン２０を含有するリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）（ＴＰ
ＢＳ）で洗浄し、次いで１×検体希釈濃縮物でブロック
することができる（Ｇｅｂｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、
２２５μｌ／ウェル、２時間、室温）。次いでウェルを
ＴＰＢＳで洗浄することができる。
【００４７】ｓｇｐ３９を発現するＣＯＳ細胞からの上
澄み液または陰性のコントロールを添加し（１５０μｌ
／ウェル）そしてプレートを４℃において一夜インキュ
ベーションすることができる。次いでウェルをＴＰＢＳ
で洗浄し、次いでＣＤ４０（例えば、ＣＤ４０−Ｉｇ融
合タンパク質の形態）または陰性の対照タンパク質を望
ましくは１mMのＣｕＣｌ2 および１mMのＭｇＣｌ2 を含
有するＰＢＳ中の系統的希釈物として添加することがで
きる（２０μｇ／ml〜０．６μｇ／ml、１００μｌ／ウ
ェル、１時間、室温）。
澄み液または陰性のコントロールを添加し（１５０μｌ
／ウェル）そしてプレートを４℃において一夜インキュ
ベーションすることができる。次いでウェルをＴＰＢＳ
で洗浄し、次いでＣＤ４０（例えば、ＣＤ４０−Ｉｇ融
合タンパク質の形態）または陰性の対照タンパク質を望
ましくは１mMのＣｕＣｌ2 および１mMのＭｇＣｌ2 を含
有するＰＢＳ中の系統的希釈物として添加することがで
きる（２０μｇ／ml〜０．６μｇ／ml、１００μｌ／ウ
ェル、１時間、室温）。
【００４８】次いでウェルをＴＰＢＳで洗浄し、そして
ｓｇｐ３９で被覆したウェルへのＣＤ４０の結合を検出
することができる；例えば、ｓｇｐ３９で被覆したウェ
ルへのＣＤ４０−Ｉｇの結合は、ペルオキシダーゼ接合
ヤギＦ（ａｂ′）2 抗ヒトＩｇＧを添加し、次いで発色
性基質（例えば、Ｇｅｂｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｅ
ＩＡ緩衝化基質の中で１：１００に希釈したクロモゲ
ン、Ｇｅｂｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１００μｌ／ウ
ェル）を添加することによって、検出することができ
る。
ｓｇｐ３９で被覆したウェルへのＣＤ４０の結合を検出
することができる；例えば、ｓｇｐ３９で被覆したウェ
ルへのＣＤ４０−Ｉｇの結合は、ペルオキシダーゼ接合
ヤギＦ（ａｂ′）2 抗ヒトＩｇＧを添加し、次いで発色
性基質（例えば、Ｇｅｂｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｅ
ＩＡ緩衝化基質の中で１：１００に希釈したクロモゲ
ン、Ｇｅｂｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１００μｌ／ウ
ェル）を添加することによって、検出することができ
る。
【００４９】発色反応を１０分後にストップ・バッファ
ー（Ｓｔｏｐ Ｂｕｆｆｅｒ）（Ｇｅｂｅｔｉｃ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ、１００μｌ／ウェル）の添加により停止さ
せ、そして吸収をＥＬＩＳＡのリーダーで２つの波長
（４５０nm、６３０nm）において測定することができ
る。あるいは、ＥＬＩＳＡは抗体（例えば、ヤギ抗ヒト
Ｆｃ）で被覆したプレート上にＣＤ４０（例えば、ＣＤ
４０−Ｉｇ）を固定化することによって実施することが
でき、そしてＣＯＳ細胞の上澄み液の増加する希釈物か
らのｓｇｐ３９の結合を抗標識抗体で検出することがで
きる。
ー（Ｓｔｏｐ Ｂｕｆｆｅｒ）（Ｇｅｂｅｔｉｃ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ、１００μｌ／ウェル）の添加により停止さ
せ、そして吸収をＥＬＩＳＡのリーダーで２つの波長
（４５０nm、６３０nm）において測定することができ
る。あるいは、ＥＬＩＳＡは抗体（例えば、ヤギ抗ヒト
Ｆｃ）で被覆したプレート上にＣＤ４０（例えば、ＣＤ
４０−Ｉｇ）を固定化することによって実施することが
でき、そしてＣＯＳ細胞の上澄み液の増加する希釈物か
らのｓｇｐ３９の結合を抗標識抗体で検出することがで
きる。
【００５０】さらに、ＣＤ４０に結合するｓｇｐ３９の
能力は次のようにしてＢ細胞の増殖により確認すること
ができる。リンパ球分離媒質（Ｌｉｔｔｏｎ Ｂｉｏｎ
ｅｔｉｃｓ、ケンシントン，マリイランド州）を通して
遠心することによって、末梢血液の単核細胞を分離でき
る。細胞をナイロンカラム（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．，リッチモンド，バージニア
州）に通過させ、そして付着性細胞を収穫することによ
って、ヒトリンパ球をＰＢＭＣから濃縮することができ
る。次いで細胞をｌｅｕ−ｌｅｕメチルエステル（Ｓｉ
ｇｍａ、セントルイス，ミゾリー州）で処理して、単球
およびＮＫ細胞を消耗させることができる。生ずる細胞
の集団をＥＰＩＣＳ Ｃ（Ｃｏｕｌｅｔｒ Ｅｌｅｃｔ
ｒｏｎｉｃｓ、ヒアリーヒ，フロリダ州）を使用するフ
ローサイトメトリーにより分析して、Ｂ細胞の百分率を
決定することができる。
能力は次のようにしてＢ細胞の増殖により確認すること
ができる。リンパ球分離媒質（Ｌｉｔｔｏｎ Ｂｉｏｎ
ｅｔｉｃｓ、ケンシントン，マリイランド州）を通して
遠心することによって、末梢血液の単核細胞を分離でき
る。細胞をナイロンカラム（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．，リッチモンド，バージニア
州）に通過させ、そして付着性細胞を収穫することによ
って、ヒトリンパ球をＰＢＭＣから濃縮することができ
る。次いで細胞をｌｅｕ−ｌｅｕメチルエステル（Ｓｉ
ｇｍａ、セントルイス，ミゾリー州）で処理して、単球
およびＮＫ細胞を消耗させることができる。生ずる細胞
の集団をＥＰＩＣＳ Ｃ（Ｃｏｕｌｅｔｒ Ｅｌｅｃｔ
ｒｏｎｉｃｓ、ヒアリーヒ，フロリダ州）を使用するフ
ローサイトメトリーにより分析して、Ｂ細胞の百分率を
決定することができる。
【００５１】扁桃Ｂ細胞を完全な扁桃から細かく刻むこ
とによって調製して、扁桃細胞懸濁液を生成する。次い
で細胞をリンパ球分離媒質を通して遠心し、２回洗浄
し、次いで不連続のパーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）勾配
で分別することができる。５０％より大きい密度をもつ
細胞を集め、２回洗浄し、そして増殖アッセイにおいて
使用することができる。
とによって調製して、扁桃細胞懸濁液を生成する。次い
で細胞をリンパ球分離媒質を通して遠心し、２回洗浄
し、次いで不連続のパーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）勾配
で分別することができる。５０％より大きい密度をもつ
細胞を集め、２回洗浄し、そして増殖アッセイにおいて
使用することができる。
【００５２】１０％の胎児仔ウシ血清を含有する完全な
ＲＰＭＩ培地中で５×１０4 細胞／ウェルで平底の９６
ウェルのマイクロタイタープレートにおいて、４倍の試
料の中のＢ細胞を培養することによって、増殖の測定を
実施することができる。ｓｇｐ３９または対照の構成体
を含有するＣＯＳ細胞の上澄み液を、１：４に希釈し
（ＰＭＡ〔１０ng／ml、ＬＣ Ｓｅｒｖｉｃｅ、ウバー
ン，マサチュセッツ州〕または１Ｆ５〔抗ＣＤ２０、１
μｌ／ml〕を含む）を培養物に添加し、次いで５日間の
培養および一夜のパルス後〔 3Ｈ〕−チミジン（６．７
ci／mmol；ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ、ボ
ストン，マサチュセッツ州）の吸収により測定すること
ができる（細胞をガラス繊維のフィルター上に収穫し、
そして放射能を液体シンチレーションカウンターで測定
することができる）。
ＲＰＭＩ培地中で５×１０4 細胞／ウェルで平底の９６
ウェルのマイクロタイタープレートにおいて、４倍の試
料の中のＢ細胞を培養することによって、増殖の測定を
実施することができる。ｓｇｐ３９または対照の構成体
を含有するＣＯＳ細胞の上澄み液を、１：４に希釈し
（ＰＭＡ〔１０ng／ml、ＬＣ Ｓｅｒｖｉｃｅ、ウバー
ン，マサチュセッツ州〕または１Ｆ５〔抗ＣＤ２０、１
μｌ／ml〕を含む）を培養物に添加し、次いで５日間の
培養および一夜のパルス後〔 3Ｈ〕−チミジン（６．７
ci／mmol；ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ、ボ
ストン，マサチュセッツ州）の吸収により測定すること
ができる（細胞をガラス繊維のフィルター上に収穫し、
そして放射能を液体シンチレーションカウンターで測定
することができる）。
【００５３】ｓｇｐ３９の特定の形態に関連する対照レ
ベル（好ましくは少なくとも抗体１００％）より上のＢ
細胞の増殖における促進は、ｓｇｐ３９がＢ細胞の表面
上のＣＤ４０と相互作用しそして生物学的に活性である
ことを示す。本発明は、本発明の融合タンパク質の生産
に使用することができる、ヌクレオチド残基１６０〜７
８７の実質的に図１に記載する配列からなる本質的に精
製および分離された核酸を提供する。
ベル（好ましくは少なくとも抗体１００％）より上のＢ
細胞の増殖における促進は、ｓｇｐ３９がＢ細胞の表面
上のＣＤ４０と相互作用しそして生物学的に活性である
ことを示す。本発明は、本発明の融合タンパク質の生産
に使用することができる、ヌクレオチド残基１６０〜７
８７の実質的に図１に記載する配列からなる本質的に精
製および分離された核酸を提供する。
【００５４】したがって、本発明は、また、ヌクレオチ
ド残基１６０〜７８７の実質的に図１に記載する配列か
らなり、そしてさらにｇｐ３９タンパク質以外のタンパ
ク質（すなわち、ヒトまたはヒト以外のｇｐ３９タンパ
ク質）の細胞外ドメインをコードする配列からなる、本
質的に精製および分離された核酸を提供する；好ましい
実施態様において、この他のタンパク質はネズミまたは
ヒトのＣＤ８タンパク質である。
ド残基１６０〜７８７の実質的に図１に記載する配列か
らなり、そしてさらにｇｐ３９タンパク質以外のタンパ
ク質（すなわち、ヒトまたはヒト以外のｇｐ３９タンパ
ク質）の細胞外ドメインをコードする配列からなる、本
質的に精製および分離された核酸を提供する；好ましい
実施態様において、この他のタンパク質はネズミまたは
ヒトのＣＤ８タンパク質である。
【００５５】本発明の特定の非限定的実施態様におい
て、この他のタンパク質の細胞外ドメインは、それぞ
れ、図１１に描写するヌクレオチド１２１−７０８と図
１２に描写する残基１２９−６１１との間の配列により
コードされる、アミノ酸残基１−１７４および１−１６
１からのネズミまたはヒトのＣＤ８の細胞外ドメインで
ある。本発明の好ましい、特定の、非限定的実施態様に
おいて、この本質的に精製および分離された核酸はＡＴ
ＣＣに受託されそして受け入れ番号６９０４９を割り当
てられた、ＣＤＭ７Ｂ- ＭＣ１０６１／ｐ３−ｓｈｇ
ｐ３９の中に含有される。本発明は、さらに、このよう
な核酸によりコードされるタンパク質を提供する。
て、この他のタンパク質の細胞外ドメインは、それぞ
れ、図１１に描写するヌクレオチド１２１−７０８と図
１２に描写する残基１２９−６１１との間の配列により
コードされる、アミノ酸残基１−１７４および１−１６
１からのネズミまたはヒトのＣＤ８の細胞外ドメインで
ある。本発明の好ましい、特定の、非限定的実施態様に
おいて、この本質的に精製および分離された核酸はＡＴ
ＣＣに受託されそして受け入れ番号６９０４９を割り当
てられた、ＣＤＭ７Ｂ- ＭＣ１０６１／ｐ３−ｓｈｇ
ｐ３９の中に含有される。本発明は、さらに、このよう
な核酸によりコードされるタンパク質を提供する。
【００５６】例えば、本発明は、アミノ酸残基４７−２
６１の実質的に図１に記載する配列からなる本質的に精
製および分離されたタンパク質、およびさらにｇｐ３９
タンパク質以外のタンパク質の細胞外ドメインからな
る、この本質的に精製および分離されたタンパク質を提
供する。好ましい実施態様において、この他のタンパク
質はネズミまたはヒトのＣＤＭ８タンパク質であり、そ
して本発明の特定の、非限定的実施態様において、この
他のタンパク質の細胞外ドメインは、それぞれ、アミノ
酸残基１−１７４および１−１６１のネズミまたはヒト
のＣＤ８の細胞外ドメインである。本発明の好ましい、
特定の、非限定的実施態様において、本質的に精製およ
び分離されたタンパク質は、ＡＴＣＣに受託されそして
受け入れ番号６９０４９を割り当てられた、プラスミド
ＣＤＭ７Ｂ- ＭＣ１０６１／ｐ３−ｓｈｇｐ３９によ
り生産される。
６１の実質的に図１に記載する配列からなる本質的に精
製および分離されたタンパク質、およびさらにｇｐ３９
タンパク質以外のタンパク質の細胞外ドメインからな
る、この本質的に精製および分離されたタンパク質を提
供する。好ましい実施態様において、この他のタンパク
質はネズミまたはヒトのＣＤＭ８タンパク質であり、そ
して本発明の特定の、非限定的実施態様において、この
他のタンパク質の細胞外ドメインは、それぞれ、アミノ
酸残基１−１７４および１−１６１のネズミまたはヒト
のＣＤ８の細胞外ドメインである。本発明の好ましい、
特定の、非限定的実施態様において、本質的に精製およ
び分離されたタンパク質は、ＡＴＣＣに受託されそして
受け入れ番号６９０４９を割り当てられた、プラスミド
ＣＤＭ７Ｂ- ＭＣ１０６１／ｐ３−ｓｈｇｐ３９によ
り生産される。
【００５７】５．３．本発明の実用性
本発明は、ＣＤ４０を有する細胞を有効濃度の可溶性ｇ
ｐ３９タンパク質、例えば、上の節５．２．に記載した
ヒトおよびネズミの両者の可溶性ｇｐ３９タンパク質に
暴露することからなる、前記細胞の増殖および／または
分化を促進する方法を提供する。
ｐ３９タンパク質、例えば、上の節５．２．に記載した
ヒトおよびネズミの両者の可溶性ｇｐ３９タンパク質に
暴露することからなる、前記細胞の増殖および／または
分化を促進する方法を提供する。
【００５８】好ましい実施態様において、本発明は、可
溶性ｇｐ３９タンパク質への暴露前に、可溶性ｇｐ３９
タンパク質への暴露と同時に、あるいは好ましさに劣る
が、可溶性ｇｐ３９タンパク質への暴露後に、活性化さ
れた、可溶性ｇｐ３９タンパク質がその中にまだ存在す
る、Ｂ細胞の増殖および／または分化を促進するために
使用される。Ｂ細胞の活性化は、任意のこの分野におい
て知られている方法により達成することができ、このよ
うな方法は次のものを包含するが、これらに限定されな
い：抗免疫グロブリン抗体、Ｂ細胞の表面抗原（例え
ば、ＣＤ２０）に対して向けられた抗体、ホルボルミリ
スチルアセテート（ＰＭＡ）、イノマイシン、または可
溶性のまたは表面結合したサイトカイン（例えば、ＩＬ
−４）。
溶性ｇｐ３９タンパク質への暴露前に、可溶性ｇｐ３９
タンパク質への暴露と同時に、あるいは好ましさに劣る
が、可溶性ｇｐ３９タンパク質への暴露後に、活性化さ
れた、可溶性ｇｐ３９タンパク質がその中にまだ存在す
る、Ｂ細胞の増殖および／または分化を促進するために
使用される。Ｂ細胞の活性化は、任意のこの分野におい
て知られている方法により達成することができ、このよ
うな方法は次のものを包含するが、これらに限定されな
い：抗免疫グロブリン抗体、Ｂ細胞の表面抗原（例え
ば、ＣＤ２０）に対して向けられた抗体、ホルボルミリ
スチルアセテート（ＰＭＡ）、イノマイシン、または可
溶性のまたは表面結合したサイトカイン（例えば、ＩＬ
−４）。
【００５９】可溶性ｇｐ３９の有効濃度は、ｇｐ３９ま
たはＢ細胞の増殖の他の仲介体に暴露しない活性化され
たＢ細胞の増殖に関して、少なくとも１００％の活性化
されたＢ細胞の増殖の増加を生ずる濃度としてここにお
いて定義される（例えば、上の節５．１．および下の節
７．１．３．を参照のこと）。例えば、限定せずに、約
０．００５〜２．５μｇ／ml、最も好ましくは約０．１
〜０．２５μｇ／mlの濃度を使用することができる。
たはＢ細胞の増殖の他の仲介体に暴露しない活性化され
たＢ細胞の増殖に関して、少なくとも１００％の活性化
されたＢ細胞の増殖の増加を生ずる濃度としてここにお
いて定義される（例えば、上の節５．１．および下の節
７．１．３．を参照のこと）。例えば、限定せずに、約
０．００５〜２．５μｇ／ml、最も好ましくは約０．１
〜０．２５μｇ／mlの濃度を使用することができる。
【００６０】米国特許出願第７０８，０７５号（その開
示をここに引用によって加える）に記載されているよう
に、本発明の可溶性ｇｐ３９タンパク質はｉｎ ｖｉｔ
ｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの用途を包含する、ある数の
用途を有する。本発明の１つの実施態様に従い、可溶性
ｇｐ３９を使用して長期間のＢ細胞の成長のためのｉｎ
ｖｉｔｒｏ細胞培養系を生成することができる。これ
はとくに抗原特異的Ｂ細胞系の調製において有用である
ことがある。
示をここに引用によって加える）に記載されているよう
に、本発明の可溶性ｇｐ３９タンパク質はｉｎ ｖｉｔ
ｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの用途を包含する、ある数の
用途を有する。本発明の１つの実施態様に従い、可溶性
ｇｐ３９を使用して長期間のＢ細胞の成長のためのｉｎ
ｖｉｔｒｏ細胞培養系を生成することができる。これ
はとくに抗原特異的Ｂ細胞系の調製において有用である
ことがある。
【００６１】他のｉｎ ｖｉｔｒｏ実施態様において、
可溶性ｇｐ３９を使用してＣＤ４０抗原を発現する細胞
を同定および／または分離する、および／または脱落す
るか、あるいはしないことがあるＣＤ４０抗原の存在に
ついて体液をアッセイすることができる。例えば、ＣＤ
４０抗原への可溶性ｇｐ３９の結合は、可溶性ｇｐ３９
を直接または間接的に標識つけすることによって、例え
ば、放射線標識または発色体を可溶性ｇｐ３９タンパク
質の中に組み込む（直接の標識つけ）または抗ｇｐ３９
抗体を介して組み込むことによって検出することができ
る。この方法において、可溶性ｇｐ３９を診断的にｉｎ
ｖｉｔｒｏで使用して、腫瘍、悪性細胞、体液などの
中で発現されるＣＤ４０抗原を同定することができる。
可溶性ｇｐ３９を使用してＣＤ４０抗原を発現する細胞
を同定および／または分離する、および／または脱落す
るか、あるいはしないことがあるＣＤ４０抗原の存在に
ついて体液をアッセイすることができる。例えば、ＣＤ
４０抗原への可溶性ｇｐ３９の結合は、可溶性ｇｐ３９
を直接または間接的に標識つけすることによって、例え
ば、放射線標識または発色体を可溶性ｇｐ３９タンパク
質の中に組み込む（直接の標識つけ）または抗ｇｐ３９
抗体を介して組み込むことによって検出することができ
る。この方法において、可溶性ｇｐ３９を診断的にｉｎ
ｖｉｔｒｏで使用して、腫瘍、悪性細胞、体液などの
中で発現されるＣＤ４０抗原を同定することができる。
【００６２】関係する実施態様において、直接または間
接的に標識された可溶性ｇｐ３９をｉｎ ｖｉｖｏで使
用して、ＣＤ４０抗原を発現する細胞または腫瘍を造影
することができる。種々の他のｉｎ ｖｉｖｏ実施態様
において、可溶性ｇｐ３９を使用して免疫応答を増加す
ることができ、例えば、「アジュバント」の１つの型と
して効果的作用することによってワクチンに対する免疫
応答を増加させることができる。あるいは、可溶性ｇｐ
３９を使用して免疫抑制された個体、例えば、後天性免
疫不全症候群、悪性疾患に悩まされる人、あるいは乳児
または中年過ぎの人の免疫応答を増加することができ
る。
接的に標識された可溶性ｇｐ３９をｉｎ ｖｉｖｏで使
用して、ＣＤ４０抗原を発現する細胞または腫瘍を造影
することができる。種々の他のｉｎ ｖｉｖｏ実施態様
において、可溶性ｇｐ３９を使用して免疫応答を増加す
ることができ、例えば、「アジュバント」の１つの型と
して効果的作用することによってワクチンに対する免疫
応答を増加させることができる。あるいは、可溶性ｇｐ
３９を使用して免疫抑制された個体、例えば、後天性免
疫不全症候群、悪性疾患に悩まされる人、あるいは乳児
または中年過ぎの人の免疫応答を増加することができ
る。
【００６３】本発明のなお他の実施態様において、可溶
性ｇｐ３９を化学的に修飾し、こうしてそれに結合する
細胞が殺されるようにすることができる。すべてのＢ細
胞はＣＤ４０を発現するので、このアプローチは免疫応
答を抑制するであろう。例えば、可溶性ｇｐ３９に結合
した細胞障害性薬物をｉｎ ｖｉｖｏで使用して免疫抑
制を引き起こして、移植の患者における組織適合性のバ
リヤーを横切らせることができる；あるいは、これらの
修飾されたリガーゼを使用して自己免疫病をコントロー
ルすることができる。
性ｇｐ３９を化学的に修飾し、こうしてそれに結合する
細胞が殺されるようにすることができる。すべてのＢ細
胞はＣＤ４０を発現するので、このアプローチは免疫応
答を抑制するであろう。例えば、可溶性ｇｐ３９に結合
した細胞障害性薬物をｉｎ ｖｉｖｏで使用して免疫抑
制を引き起こして、移植の患者における組織適合性のバ
リヤーを横切らせることができる；あるいは、これらの
修飾されたリガーゼを使用して自己免疫病をコントロー
ルすることができる。
【００６４】他の実施態様において、可溶性ｇｐ３９を
使用して、Ｂ細胞ではないＣＤ４０を有する細胞、例え
ば、肉腫細胞の増殖および／または分化を、悪性疾患を
直接処置する手段としてまたは化学療法に対するアジュ
バントとして、促進することができる。本発明は、さら
に、標準の実験室の技術を使用して、ポリクローナルま
たはモノクローナルの抗ｈｇｐ３９抗体を提供する。
使用して、Ｂ細胞ではないＣＤ４０を有する細胞、例え
ば、肉腫細胞の増殖および／または分化を、悪性疾患を
直接処置する手段としてまたは化学療法に対するアジュ
バントとして、促進することができる。本発明は、さら
に、標準の実験室の技術を使用して、ポリクローナルま
たはモノクローナルの抗ｈｇｐ３９抗体を提供する。
【００６５】本発明は、また、治療的に有効濃度の上の
節５．２．に記載した可溶性ｇｐ３９および適当な薬理
学的担体からなる医薬組成物を提供する。このような医
薬組成物は、このような処置を必要とする被検体に、投
与の任意のモードにより投与することができ、このよう
なモードは次のものを包含するが、これらに限定されな
い：静脈内、局所的注射、皮下、筋肉内、経口的、鼻
内、直腸内、膣内、包膜内など。
節５．２．に記載した可溶性ｇｐ３９および適当な薬理
学的担体からなる医薬組成物を提供する。このような医
薬組成物は、このような処置を必要とする被検体に、投
与の任意のモードにより投与することができ、このよう
なモードは次のものを包含するが、これらに限定されな
い：静脈内、局所的注射、皮下、筋肉内、経口的、鼻
内、直腸内、膣内、包膜内など。
【００６６】６．実施例：ヒトＴ細胞抗原ｇｐ３９、腫
瘍壊死遺伝子の族の１構成員はＢ細胞上のＣＤ４０レセ
プターのためのリガンドである。 ６．１．材料および方法 ＣＤ４０−Ｉｇ（Ｎｏｅｌｌｅら、１９９２，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６５
５０−６５５４、に記載されている）を、３つの突然変
異、すなわち、Ｌ２３４Ｆ，Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７
Ａを免疫グロブリンのドメインの中に導入して、Ｆｃレ
セプターへの結合を減少することによって修飾した。修
飾されたＣＤ４０−ＩｇをＣＯＳ細胞の上澄み液から従
来記載されたように精製した（Ａｒｕｆｆｏら、１９９
０，Ｃｅｌｌ ６１：１３０３−１３１３）。
瘍壊死遺伝子の族の１構成員はＢ細胞上のＣＤ４０レセ
プターのためのリガンドである。 ６．１．材料および方法 ＣＤ４０−Ｉｇ（Ｎｏｅｌｌｅら、１９９２，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６５
５０−６５５４、に記載されている）を、３つの突然変
異、すなわち、Ｌ２３４Ｆ，Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７
Ａを免疫グロブリンのドメインの中に導入して、Ｆｃレ
セプターへの結合を減少することによって修飾した。修
飾されたＣＤ４０−ＩｇをＣＯＳ細胞の上澄み液から従
来記載されたように精製した（Ａｒｕｆｆｏら、１９９
０，Ｃｅｌｌ ６１：１３０３−１３１３）。
【００６７】ｈｇｐ３９のｃＤＮＡを、ポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）により、ＰＨＡ活性化されたヒト末梢
血液のＴ細胞から分離したｍＲＮＡから調製したライブ
ラリーから増幅した（Ｃａｍｅｒｉｎｉら、１９８９，
Ｎａｔｕｒｅ ３４２：７８−８２）。オリゴヌクレオ
チドのプライマーをネズミｇｐ３９の配列に基づいてデ
ザインし（Ａｒｍｉｔａｇｅら、１９９２，Ｎａｔｕｒ
ｅ ３５７：８０−８２）そしてＰＣＲ生成物のサブク
ローニングのために使用すべき制限酵素ＸｂａＩおよび
ＨｉｎｄIII のための部位を含めた。
鎖反応（ＰＣＲ）により、ＰＨＡ活性化されたヒト末梢
血液のＴ細胞から分離したｍＲＮＡから調製したライブ
ラリーから増幅した（Ｃａｍｅｒｉｎｉら、１９８９，
Ｎａｔｕｒｅ ３４２：７８−８２）。オリゴヌクレオ
チドのプライマーをネズミｇｐ３９の配列に基づいてデ
ザインし（Ａｒｍｉｔａｇｅら、１９９２，Ｎａｔｕｒ
ｅ ３５７：８０−８２）そしてＰＣＲ生成物のサブク
ローニングのために使用すべき制限酵素ＸｂａＩおよび
ＨｉｎｄIII のための部位を含めた。
【００６８】使用したオリゴヌクレオチドは次の通りで
あった：５′−GCG AAG CTT TCA GTC AGC ATG ATA GAA
ACA −３′（配列番号：１３）および５′−CGC TCT AG
A TGT TCA GAG TTT GAG TAA GCC −３′（配列番号：１
４）。増幅をＴａｑポリメラーゼおよび製造業者（Ｐｅ
ｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｃｏｒｐ．，ノー
ウォーク，コネチカット州）が推奨した反応緩衝液を使
用して、次の温度のプログラムの３０サイクルに従い実
施した：２分、９５℃；２分、５５℃；３分、７２℃。
ＰＣＲ生成物をＨｉｎｄIII およびＸｂａＩで消化し、
そして内部のＨｉｎｄIII 制限部位を含有することがわ
かった。
あった：５′−GCG AAG CTT TCA GTC AGC ATG ATA GAA
ACA −３′（配列番号：１３）および５′−CGC TCT AG
A TGT TCA GAG TTT GAG TAA GCC −３′（配列番号：１
４）。増幅をＴａｑポリメラーゼおよび製造業者（Ｐｅ
ｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｃｏｒｐ．，ノー
ウォーク，コネチカット州）が推奨した反応緩衝液を使
用して、次の温度のプログラムの３０サイクルに従い実
施した：２分、９５℃；２分、５５℃；３分、７２℃。
ＰＣＲ生成物をＨｉｎｄIII およびＸｂａＩで消化し、
そして内部のＨｉｎｄIII 制限部位を含有することがわ
かった。
【００６９】ＨｉｎｄIII −ＸｂａＩ断片をＣＤＭ８ベ
クターの中にサブクローニングした。ＨｉｎｄIII −Ｘ
ｂａＩ断片を含有するベクターの中にＨｉｎｄIII −Ｈ
ｉｎｄIII 断片をサブクローニングすることによって、
完全な遺伝子生産物を構成した。ＤＥＡＥ−デキストラ
ンを使用してＡｒｕｆｆｏら、１９９０，Ｃｅｌｌ６
１：１３０３−１３１３に記載されているように、生ず
る構成体をＣＯＳ細胞の中にトランスフェクションし
た。トランスフェクション体をＣＤ４０−Ｉｇ（ＤＭＥ
Ｍ培地中の２５μｇ／ml）および次いでＦＩＴＣ接合ヤ
ギ抗ヒトＩｇＧＦｃ抗体（ＤＭＥＭ中の１：５０希釈、
ＴＡＧＯ、バーリンゲイム，カリフォルニア州）で染色
し、そして免疫蛍光微鏡検査により可視化した。
クターの中にサブクローニングした。ＨｉｎｄIII −Ｘ
ｂａＩ断片を含有するベクターの中にＨｉｎｄIII −Ｈ
ｉｎｄIII 断片をサブクローニングすることによって、
完全な遺伝子生産物を構成した。ＤＥＡＥ−デキストラ
ンを使用してＡｒｕｆｆｏら、１９９０，Ｃｅｌｌ６
１：１３０３−１３１３に記載されているように、生ず
る構成体をＣＯＳ細胞の中にトランスフェクションし
た。トランスフェクション体をＣＤ４０−Ｉｇ（ＤＭＥ
Ｍ培地中の２５μｇ／ml）および次いでＦＩＴＣ接合ヤ
ギ抗ヒトＩｇＧＦｃ抗体（ＤＭＥＭ中の１：５０希釈、
ＴＡＧＯ、バーリンゲイム，カリフォルニア州）で染色
し、そして免疫蛍光微鏡検査により可視化した。
【００７０】完全なｈｇｐ３９を記載されているように
コロニーハイブリダイゼーションにより得た（Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら、１９８９、分子クローニング：実験室のマ
ニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド
・スプリング・ハーバー，ニューヨーク州）。ＰＣＲ生
成物のサブクローニングしたＨｉｎｄIII −ＨｉｎｄII
I 断片を使用して、ランダムプライムドポリメリゼーシ
ョンにより32Ｐ標識したプローブを発生させた。
コロニーハイブリダイゼーションにより得た（Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら、１９８９、分子クローニング：実験室のマ
ニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド
・スプリング・ハーバー，ニューヨーク州）。ＰＣＲ生
成物のサブクローニングしたＨｉｎｄIII −ＨｉｎｄII
I 断片を使用して、ランダムプライムドポリメリゼーシ
ョンにより32Ｐ標識したプローブを発生させた。
【００７１】３つの個々のクローンからのプラスミドＤ
ＮＡをＣＯＳ細胞の中にトランスフェクションし、そし
て細胞をＣＤ４０−Ｉｇで染色した。１つのクローンで
あるクローン１９はこの基準により陽性であり、そして
この研究の残部において使用した。セクエナーゼ（Ｓｅ
ｑｕｅｎａｓｅR ）（Ｕｎｉｔｅｄ ＳｔａｔｅｓＢｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．，クレブランド，オハイ
オ州）を使用するジデオキシ配列決定により、配列を決
定した。
ＮＡをＣＯＳ細胞の中にトランスフェクションし、そし
て細胞をＣＤ４０−Ｉｇで染色した。１つのクローンで
あるクローン１９はこの基準により陽性であり、そして
この研究の残部において使用した。セクエナーゼ（Ｓｅ
ｑｕｅｎａｓｅR ）（Ｕｎｉｔｅｄ ＳｔａｔｅｓＢｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．，クレブランド，オハイ
オ州）を使用するジデオキシ配列決定により、配列を決
定した。
【００７２】６．２．結果
ネズミｇｐ３９配列に基づく合成オリゴヌクレオチドを
使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ＰＨ
Ａ活性化ヒト末梢血液のＴ細胞から分離したｍＲＮＡか
ら調製したｃＤＮＡライブラリーから、ヒトｇｐ３９を
コードするｃＤＮＡを増幅した（Ａｒｍｉｔａｇｅら、
１９９２，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：８０−８２）。ＰＣ
Ｒ生成物を発現ベクターＣＤＭ８の中にサブクローニン
グした（Ｓｅｅｄ，１９８７，Ｎａｒｕｒｅ ３２９：
８４０−８４２）。ＣＤＭ８−ｇｐ３９でトランスフェ
クションしたＣＯＳ細胞はＣＤ４０−Ｉｇに結合したタ
ンパク質を生産した（Ｎｏｅｌｌｅら、１９９２，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６
５５０−６５５４）。
使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ＰＨ
Ａ活性化ヒト末梢血液のＴ細胞から分離したｍＲＮＡか
ら調製したｃＤＮＡライブラリーから、ヒトｇｐ３９を
コードするｃＤＮＡを増幅した（Ａｒｍｉｔａｇｅら、
１９９２，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：８０−８２）。ＰＣ
Ｒ生成物を発現ベクターＣＤＭ８の中にサブクローニン
グした（Ｓｅｅｄ，１９８７，Ｎａｒｕｒｅ ３２９：
８４０−８４２）。ＣＤＭ８−ｇｐ３９でトランスフェ
クションしたＣＯＳ細胞はＣＤ４０−Ｉｇに結合したタ
ンパク質を生産した（Ｎｏｅｌｌｅら、１９９２，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６
５５０−６５５４）。
【００７３】プローブとしてサブクローニングしたＰＣ
Ｒ生成物を使用してｇｐ３９のＰＣＲ増幅について使用
したのと同一のｃＤＮＡライブラリーから、完全なヒト
ｇｐ３９遺伝子をコロニーハイブリダイゼーションによ
り分離した。ある数の陽性のクローンを分離し、そして
制限酵素の消化により分析した。最大のインサート、
１．８−１．５kb、を含有するクローンに相当するＤＮ
ＡをＣＯＳ細胞の中にトランスフェクションし、そして
ＣＤ４０−Ｉｇの結合するタンパク質を直接発現するそ
れらの能力を検査した。
Ｒ生成物を使用してｇｐ３９のＰＣＲ増幅について使用
したのと同一のｃＤＮＡライブラリーから、完全なヒト
ｇｐ３９遺伝子をコロニーハイブリダイゼーションによ
り分離した。ある数の陽性のクローンを分離し、そして
制限酵素の消化により分析した。最大のインサート、
１．８−１．５kb、を含有するクローンに相当するＤＮ
ＡをＣＯＳ細胞の中にトランスフェクションし、そして
ＣＤ４０−Ｉｇの結合するタンパク質を直接発現するそ
れらの能力を検査した。
【００７４】１つのこのようなクローンをこの臨界的に
より陽性であり、そしてさらに分析し、そして以後ヒト
ｇｐ３９としてＴＯと呼ぶ。ＣＤ４０−Ｉｇを使用して
ｃＤＮＡコードされたヒトｇｐ３９をトランスフェクシ
ョンされたＣＯＳ細胞から免疫沈澱させると、約３２〜
３３kDa の分子の質量に相当する単一のバンドが示され
た。ＣＯＳ細胞誘導タンパク質は、ネズミｇｐ３９のわ
れわれの前の研究に基づいてわれわれが期待したものよ
り小さかったが、多くの場合において、ＣＯＳ細胞のト
ランスフェクション体から得られたある数の異なるＴ細
胞表面のタンパク質の見掛けの分子の質量がＴ細胞から
得られたものより小さいことをわれわれは観察した（Ａ
ｒｕｆｆｏおよびＳｅｅｄ，１９８７，ＥＭＢＯ Ｊ．
１１：３３１３−３３１６；Ａｒｕｆｆｏら、１９９
１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：９４９−９５２）。
これらの大きさの差は、ＣＯＳ細胞によるタンパク質の
不完全なグリコシル化の結果であることがある。
より陽性であり、そしてさらに分析し、そして以後ヒト
ｇｐ３９としてＴＯと呼ぶ。ＣＤ４０−Ｉｇを使用して
ｃＤＮＡコードされたヒトｇｐ３９をトランスフェクシ
ョンされたＣＯＳ細胞から免疫沈澱させると、約３２〜
３３kDa の分子の質量に相当する単一のバンドが示され
た。ＣＯＳ細胞誘導タンパク質は、ネズミｇｐ３９のわ
れわれの前の研究に基づいてわれわれが期待したものよ
り小さかったが、多くの場合において、ＣＯＳ細胞のト
ランスフェクション体から得られたある数の異なるＴ細
胞表面のタンパク質の見掛けの分子の質量がＴ細胞から
得られたものより小さいことをわれわれは観察した（Ａ
ｒｕｆｆｏおよびＳｅｅｄ，１９８７，ＥＭＢＯ Ｊ．
１１：３３１３−３３１６；Ａｒｕｆｆｏら、１９９
１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：９４９−９５２）。
これらの大きさの差は、ＣＯＳ細胞によるタンパク質の
不完全なグリコシル化の結果であることがある。
【００７５】ヒトｇｐ３９のｃＤＮＡは約１．８kbの長
さであり、そして約２９kDa の予測された分子の質量を
もつ２６１アミノ酸（ａａ）のポリペプチドをコード
し、このポリペプチドは２２アミノ酸のアミノ末端の細
胞質ドメイン、２４アミノ酸の疎水性トランスメンブレ
ンドメインおよび２１５アミノ酸のカルボキシ末端の細
胞外（ＥＣ）ドメインから成り、ＥＣの中に１つのＮ連
鎖グリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）お
よび細胞質ドメインの中に１つをもつ（コード配列に相
当するヌクレオチド配列および予測されたアミノ酸配列
を図１ａに示す）。細胞外のカルボキシ末端をもつ、タ
ンパク質の期待された配向は、それをII型膜タンパク質
として分類し、そして予測された分子質量と観察された
分子質量との間の差は、それが翻訳後の修飾を行い、炭
水化物基の付加を行う可能性が最も強いことを示唆す
る。
さであり、そして約２９kDa の予測された分子の質量を
もつ２６１アミノ酸（ａａ）のポリペプチドをコード
し、このポリペプチドは２２アミノ酸のアミノ末端の細
胞質ドメイン、２４アミノ酸の疎水性トランスメンブレ
ンドメインおよび２１５アミノ酸のカルボキシ末端の細
胞外（ＥＣ）ドメインから成り、ＥＣの中に１つのＮ連
鎖グリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）お
よび細胞質ドメインの中に１つをもつ（コード配列に相
当するヌクレオチド配列および予測されたアミノ酸配列
を図１ａに示す）。細胞外のカルボキシ末端をもつ、タ
ンパク質の期待された配向は、それをII型膜タンパク質
として分類し、そして予測された分子質量と観察された
分子質量との間の差は、それが翻訳後の修飾を行い、炭
水化物基の付加を行う可能性が最も強いことを示唆す
る。
【００７６】ヒトｇｐ３９の予測されたアミノ酸配列
を、ナショナル・バイオメデーイカル・リサーチ・ファ
ンデーション（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌＲｅｓｅａｅｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）（Ｎ
ＢＲＦ）のデータベースの中のそれと、ＦＡＳＴＰアル
ゴリズムを使用して比較し、そして腫瘍壊死因子（ＴＮ
Ｆ）α（Ｇｒａｙら、１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１
２：７２１−７２４）およびβ（Ｐｅｎｎｉｃａら、１
９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７２４−７２９；Ｗａ
ｎｇら、１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１４９−
１５４）と有意な相同性を有することが発見された（図
２）。ｇｐ３９の細胞外ドメインはＴＮＦαおよびβに
密接に関係し、互いに約２５％の相同性を有し、ちょう
どＴＮＦαおよびＴＮＦβと同じように約相同性を共有
する（Ｐｅｎｎｉｃａら、１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３
１２：７２４−７２９）。
を、ナショナル・バイオメデーイカル・リサーチ・ファ
ンデーション（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌＲｅｓｅａｅｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）（Ｎ
ＢＲＦ）のデータベースの中のそれと、ＦＡＳＴＰアル
ゴリズムを使用して比較し、そして腫瘍壊死因子（ＴＮ
Ｆ）α（Ｇｒａｙら、１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１
２：７２１−７２４）およびβ（Ｐｅｎｎｉｃａら、１
９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７２４−７２９；Ｗａ
ｎｇら、１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１４９−
１５４）と有意な相同性を有することが発見された（図
２）。ｇｐ３９の細胞外ドメインはＴＮＦαおよびβに
密接に関係し、互いに約２５％の相同性を有し、ちょう
どＴＮＦαおよびＴＮＦβと同じように約相同性を共有
する（Ｐｅｎｎｉｃａら、１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３
１２：７２４−７２９）。
【００７７】６．３．考察
シグナルをＢ細胞に供給する表面レセプターのＣＤ４０
の能力は、モノクローナル抗体を使用して確立された
（ＣｌａｒｋおよびＬａｄｂｅｔｔｅｒ，１９８６，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３：４４９４
−４４９８；Ｇｏｄｏｎら、１９８７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１７：１５３５−１５３８）。ＣＤ４０
の役割をさらに研究するために、ヒト源からのＣＤ４０
リガンドをコードするｃＤＮＡを分離し、そして特性決
定した。
の能力は、モノクローナル抗体を使用して確立された
（ＣｌａｒｋおよびＬａｄｂｅｔｔｅｒ，１９８６，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３：４４９４
−４４９８；Ｇｏｄｏｎら、１９８７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１７：１５３５−１５３８）。ＣＤ４０
の役割をさらに研究するために、ヒト源からのＣＤ４０
リガンドをコードするｃＤＮＡを分離し、そして特性決
定した。
【００７８】ヒトｇｐ３９をコードするｃＤＮＡクロー
ンの分離により、このII型の膜タンパク質はＴＮＦα
（Ｇｒａｙら、１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７２
１−７２４）およびβ（Ｐｅｎｎｉｃａら、１９８４，
Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７２４−７２９；Ｗａｎｇら、
１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１４９−１５４）
と密接に関係することが示された。ＴＮＦαおよびβ
は、主として分泌されたタンパク質として存在する多面
的サイトカインである。
ンの分離により、このII型の膜タンパク質はＴＮＦα
（Ｇｒａｙら、１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７２
１−７２４）およびβ（Ｐｅｎｎｉｃａら、１９８４，
Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７２４−７２９；Ｗａｎｇら、
１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１４９−１５４）
と密接に関係することが示された。ＴＮＦαおよびβ
は、主として分泌されたタンパク質として存在する多面
的サイトカインである。
【００７９】７．実施例：Ｂ細胞の共刺激活性をもつｇ
ｐ３９の可溶性の形態の発現 ７．１．材料および方法 ７．１．１．可溶性ｇｐ３９キメラの構成、特性決定お
よび調製 ヒトｇｐ３９の細胞外ドメインを、ＰＨＡ活性化ヒト末
梢血液のリンパ球からのｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡ
ライブラリーから増幅した。オリゴヌクレオチドのプラ
イマーを前述のＰＣＲ生成物から得られた配列の情報に
基づいてデザインしそして、キメラ遺伝子が構成される
ときリーディングフレームが保存されるように、遺伝子
の５′末端にＢａｍＨＩを配置するようにデザインし
た。
ｐ３９の可溶性の形態の発現 ７．１．材料および方法 ７．１．１．可溶性ｇｐ３９キメラの構成、特性決定お
よび調製 ヒトｇｐ３９の細胞外ドメインを、ＰＨＡ活性化ヒト末
梢血液のリンパ球からのｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡ
ライブラリーから増幅した。オリゴヌクレオチドのプラ
イマーを前述のＰＣＲ生成物から得られた配列の情報に
基づいてデザインしそして、キメラ遺伝子が構成される
ときリーディングフレームが保存されるように、遺伝子
の５′末端にＢａｍＨＩを配置するようにデザインし
た。
【００８０】使用したオリゴヌクレオチドは次の通りで
あった：５′−CGA AGC TTG GAT CCG AGG AGG TTG GAC
AAG ATA GAA GAT −３′（配列番号：１５）および５′
−CGC TCT AGA TGT TCA GAG TTT GAG TAA GCC −３′
（配列番号：１４）。ＰＣＲをＰｆｕポリメラーゼを使
用して製造業者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラジョラ，カ
リフォルニア州）により供給される緩衝液で次の温度の
プログラムで実施した：５分、９５℃；２分、７２℃、
２分、５５℃；４０サイクルの１分、９５℃；２分、５
５℃；３分、７２℃；１０分、７２℃から成る増幅。
あった：５′−CGA AGC TTG GAT CCG AGG AGG TTG GAC
AAG ATA GAA GAT −３′（配列番号：１５）および５′
−CGC TCT AGA TGT TCA GAG TTT GAG TAA GCC −３′
（配列番号：１４）。ＰＣＲをＰｆｕポリメラーゼを使
用して製造業者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラジョラ，カ
リフォルニア州）により供給される緩衝液で次の温度の
プログラムで実施した：５分、９５℃；２分、７２℃、
２分、５５℃；４０サイクルの１分、９５℃；２分、５
５℃；３分、７２℃；１０分、７２℃から成る増幅。
【００８１】ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ
で消化し、そしてＰＣＲにより発生したＢａｍＨＩ制限
部位をもつネズミＣＤ８（Ｌｙｔ２ａ）細胞外ドメイン
をコードする遺伝子を含有するベクターの中にサブクロ
ーニングした。同様に、ヒトＣＤ７２の細胞外ドメイン
をコードする遺伝子をＰＣＲによりＢａｍＨＩ制限部位
を含有するように発生させ、そしてＣＤ８を含有するベ
クターの中で同一方法においてサブクローニングした。
で消化し、そしてＰＣＲにより発生したＢａｍＨＩ制限
部位をもつネズミＣＤ８（Ｌｙｔ２ａ）細胞外ドメイン
をコードする遺伝子を含有するベクターの中にサブクロ
ーニングした。同様に、ヒトＣＤ７２の細胞外ドメイン
をコードする遺伝子をＰＣＲによりＢａｍＨＩ制限部位
を含有するように発生させ、そしてＣＤ８を含有するベ
クターの中で同一方法においてサブクローニングした。
【００８２】ＣＯＳ細胞がｓｇｐ３９およびｓＣＤ７２
を発現および輸出する能力を試験した。まず、ＣＯＳ細
胞をＤＥＡＥ−デキストランでトランスフェクションし
た。トランスフェクション後１日に、細胞をトリプシン
処理し、そして置換した。１日後、細胞をＰＢＳ中の２
％のホルムアルデヒドで固定し（２０分、室温）そして
０．１％のトリトンＸ−１００を含有するＰＢＳ中の２
％のホルムアルデヒドで透過性とした（２０分、室
温）。
を発現および輸出する能力を試験した。まず、ＣＯＳ細
胞をＤＥＡＥ−デキストランでトランスフェクションし
た。トランスフェクション後１日に、細胞をトリプシン
処理し、そして置換した。１日後、細胞をＰＢＳ中の２
％のホルムアルデヒドで固定し（２０分、室温）そして
０．１％のトリトンＸ−１００を含有するＰＢＳ中の２
％のホルムアルデヒドで透過性とした（２０分、室
温）。
【００８３】ｓｇｐ３９でトランスフェクションした細
胞をＣＤ４０−Ｉｇ（ＤＭＥＭ中の２５μｇ／ml、３０
分、室温）および引き続いてＤＭＥＭ中で１：５００に
希釈したＦＩＴＣ接合ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ抗体（ＴＡ
ＧＯ、バーリンゲイム，カリフォルニア州）で染色し
た。ｓＣＤ７２でトランスフェクションした細胞を抗Ｃ
Ｄ７２抗体ＢＵ４０（Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔ
ｅ、バーリンガム，英国）および引き続いてＤＭＥＭ中
で１：５００に希釈したＦＩＴＣ接合ヤギ抗ヒトＩｇＧ
Ｆｃ抗体（ＴＡＧＯ、バーリンゲイム，カリフォルニア
州）で染色した。
胞をＣＤ４０−Ｉｇ（ＤＭＥＭ中の２５μｇ／ml、３０
分、室温）および引き続いてＤＭＥＭ中で１：５００に
希釈したＦＩＴＣ接合ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ抗体（ＴＡ
ＧＯ、バーリンゲイム，カリフォルニア州）で染色し
た。ｓＣＤ７２でトランスフェクションした細胞を抗Ｃ
Ｄ７２抗体ＢＵ４０（Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔ
ｅ、バーリンガム，英国）および引き続いてＤＭＥＭ中
で１：５００に希釈したＦＩＴＣ接合ヤギ抗ヒトＩｇＧ
Ｆｃ抗体（ＴＡＧＯ、バーリンゲイム，カリフォルニア
州）で染色した。
【００８４】ｓｇｐ３９またはｓＣＤ７２構成体または
ベクター単独（モック）でトランスフェクションしたＣ
ＯＳ細胞を、〔35Ｓ〕−Ｌ−メチオニンおよび〔35Ｓ〕
−Ｌ−システインを添加したＣｙｓおよびＭｅｔ不含の
ＤＭＥＭの中で一夜成長させた（Ｔｒａｎ〔35Ｓ〕−標
識、ＩＣＮ、コスタメサ，カリフォルニア州、２７μCi
／ml）。上澄み液を収穫し、そして１krpmで１０分間遠
心した。ＣＤ４０−Ｉｇ，５３−６（抗ネズミＣＤ８）
＋ヤギ抗ラットＦｃ、ＢＵ４０，ＢＵ４１（Ｔｈｅ Ｂ
ｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ、バーリンガム，英国）＋ヤギ
抗マウスＩｇＭＦｃ、またはＪ３．１０２（ＡＭＡＣ
Ｉｎｃ．，ウェストブルック，メイン州）を使用して、
融合タンパク質を上澄み液から回収した。
ベクター単独（モック）でトランスフェクションしたＣ
ＯＳ細胞を、〔35Ｓ〕−Ｌ−メチオニンおよび〔35Ｓ〕
−Ｌ−システインを添加したＣｙｓおよびＭｅｔ不含の
ＤＭＥＭの中で一夜成長させた（Ｔｒａｎ〔35Ｓ〕−標
識、ＩＣＮ、コスタメサ，カリフォルニア州、２７μCi
／ml）。上澄み液を収穫し、そして１krpmで１０分間遠
心した。ＣＤ４０−Ｉｇ，５３−６（抗ネズミＣＤ８）
＋ヤギ抗ラットＦｃ、ＢＵ４０，ＢＵ４１（Ｔｈｅ Ｂ
ｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ、バーリンガム，英国）＋ヤギ
抗マウスＩｇＭＦｃ、またはＪ３．１０２（ＡＭＡＣ
Ｉｎｃ．，ウェストブルック，メイン州）を使用して、
融合タンパク質を上澄み液から回収した。
【００８５】ヤギ抗体はオルガノン・テクニカ・カンパ
ニー（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｃｏ．，ウェ
スト・チェスター，ペンシルベニア州）から購入した。
各試料について、１mlの上澄み液、７５μｌのプロテイ
ンＡ−セファローズ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、ケングリッ
ジ，マサチュセッツ州）および沈澱する１種または２種
以上の物質を混合し、そして４０℃において２時間イン
キュベーションした。セファローズを０．０１％のＮＰ
−４０を含有するＰＢＳでよく洗浄し、そして５％のβ
−メルカプトエタノールを含有する負荷緩衝液の中に再
懸濁させた。
ニー（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｃｏ．，ウェ
スト・チェスター，ペンシルベニア州）から購入した。
各試料について、１mlの上澄み液、７５μｌのプロテイ
ンＡ−セファローズ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、ケングリッ
ジ，マサチュセッツ州）および沈澱する１種または２種
以上の物質を混合し、そして４０℃において２時間イン
キュベーションした。セファローズを０．０１％のＮＰ
−４０を含有するＰＢＳでよく洗浄し、そして５％のβ
−メルカプトエタノールを含有する負荷緩衝液の中に再
懸濁させた。
【００８６】タンパク質を８％のポリアクリルアミドゲ
ルの中でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ゲルを固定し、乾
燥し、そしてフィルムに暴露した。ｓｇｐ３９またはｓ
ＣＤ７２を含有するＣＯＳ細胞の上澄み液を、ＣＯＳ細
胞のトランスフェクションにより発生させた。トランス
フェクション後１日に、細胞の培地を２％のＦＢＳを含
有するＤＭＥＭに変えた。上澄み液をトランスフェクシ
ョン後８日に収穫した。
ルの中でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ゲルを固定し、乾
燥し、そしてフィルムに暴露した。ｓｇｐ３９またはｓ
ＣＤ７２を含有するＣＯＳ細胞の上澄み液を、ＣＯＳ細
胞のトランスフェクションにより発生させた。トランス
フェクション後１日に、細胞の培地を２％のＦＢＳを含
有するＤＭＥＭに変えた。上澄み液をトランスフェクシ
ョン後８日に収穫した。
【００８７】７．１．２．結合アッセイ
ヒトｇｐ３９およびＣＤ４０がそれらのそれぞれのリガ
ンドの可溶性の形態に結合するのを、トランスフェクシ
ョンしたＣＯＳ細胞の染色により試験した。ＣＯＳ細胞
をＣＤ４０、ヒトｇｐ３９またはベクター単独（モッ
ク）でＤＥＡＥ−デキストランを使用してトランスフェ
クションした。トランスフェクション後１日に、細胞を
トリプシン処理し、そして置換した。細胞を次の日に染
色した。ｇｐ３９を発現する細胞またはモックトランス
フェクションした細胞をＣＤ４０−Ｉｇ（２５μｇ／m
l）および引き続いてＦＩＴＣ−接合ヤギおよび−ヒト
Ｆｃ抗体で染色した。
ンドの可溶性の形態に結合するのを、トランスフェクシ
ョンしたＣＯＳ細胞の染色により試験した。ＣＯＳ細胞
をＣＤ４０、ヒトｇｐ３９またはベクター単独（モッ
ク）でＤＥＡＥ−デキストランを使用してトランスフェ
クションした。トランスフェクション後１日に、細胞を
トリプシン処理し、そして置換した。細胞を次の日に染
色した。ｇｐ３９を発現する細胞またはモックトランス
フェクションした細胞をＣＤ４０−Ｉｇ（２５μｇ／m
l）および引き続いてＦＩＴＣ−接合ヤギおよび−ヒト
Ｆｃ抗体で染色した。
【００８８】ＣＤ４０を発現する細胞をｓｇｐ３９を含
有するＣＯＳ細胞の上澄み液および引き続いてｍＡｂ５
３−６（抗ネズミＣＤ８、２．５μｇ／ml）次いでＦＩ
ＴＣ接合ヤギ抗ラットＦｃ抗体（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅ
ｋｎｉｋａ Ｃｏ．，ウェストチェスター，ペンシルベ
ニア州、１．５μｇ／ml）とのインキュベーションによ
り染色した。対照として、ＣＤ４０を発現するＣＯＳ細
胞をＦＩＴＣ接合Ｇ２８−５（抗ＣＤ４０）またはｓＣ
Ｄ７２を含有するＣＯＳ細胞の上澄み液で染色した。す
べてのインキュベーションは室温において１mMのＣｕＣ
ｌ2 、１mMのＭｇＣｌ2 および２％のＦＢＳを含有する
ＰＢＳの中で実施し、そして同一の緩衝液をすべての洗
浄のために使用した。染色後、細胞をＰＢＳ中の１％の
パラホルムアルデヒドで固定した。
有するＣＯＳ細胞の上澄み液および引き続いてｍＡｂ５
３−６（抗ネズミＣＤ８、２．５μｇ／ml）次いでＦＩ
ＴＣ接合ヤギ抗ラットＦｃ抗体（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅ
ｋｎｉｋａ Ｃｏ．，ウェストチェスター，ペンシルベ
ニア州、１．５μｇ／ml）とのインキュベーションによ
り染色した。対照として、ＣＤ４０を発現するＣＯＳ細
胞をＦＩＴＣ接合Ｇ２８−５（抗ＣＤ４０）またはｓＣ
Ｄ７２を含有するＣＯＳ細胞の上澄み液で染色した。す
べてのインキュベーションは室温において１mMのＣｕＣ
ｌ2 、１mMのＭｇＣｌ2 および２％のＦＢＳを含有する
ＰＢＳの中で実施し、そして同一の緩衝液をすべての洗
浄のために使用した。染色後、細胞をＰＢＳ中の１％の
パラホルムアルデヒドで固定した。
【００８９】ＣＤ４０−Ｉｇへのｓｇｐ３９の結合をＥ
ＬＩＳＡアッセイにおいて研究した。９６ウェルのプレ
ート（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ−２，Ｄｙｎａｔｅｃｈ）の
ウェルを５３−６抗体で被覆した（抗ネズミＣＤ８、１
０μｇ／ml、１００μｌ／ウェル、５０mMの重炭酸ナト
リウム、pH９．６、１時間、室温）。ウェルを０．０５
％のツイーン２０を含有するリン酸塩緩衝液（ＴＰＢ
Ｓ）で洗浄し、そして１×検体希釈濃縮物（Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ、２２５μｌ／ウェル、２時
間、室温）でブロックした。ウェルを洗浄した（ＴＰＢ
Ｓ）。ｓｇｐ３９またはｓＣＤ７２を発現するＣＯＳ細
胞からの上澄み液を添加し（１５０μｌ／ウェル）そし
てプレートを４℃において一夜インキュベーションし
た。
ＬＩＳＡアッセイにおいて研究した。９６ウェルのプレ
ート（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ−２，Ｄｙｎａｔｅｃｈ）の
ウェルを５３−６抗体で被覆した（抗ネズミＣＤ８、１
０μｇ／ml、１００μｌ／ウェル、５０mMの重炭酸ナト
リウム、pH９．６、１時間、室温）。ウェルを０．０５
％のツイーン２０を含有するリン酸塩緩衝液（ＴＰＢ
Ｓ）で洗浄し、そして１×検体希釈濃縮物（Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ、２２５μｌ／ウェル、２時
間、室温）でブロックした。ウェルを洗浄した（ＴＰＢ
Ｓ）。ｓｇｐ３９またはｓＣＤ７２を発現するＣＯＳ細
胞からの上澄み液を添加し（１５０μｌ／ウェル）そし
てプレートを４℃において一夜インキュベーションし
た。
【００９０】ウェルを洗浄し（ＴＰＢＳ）そして融合タ
ンパク質ＣＤ４０−ＩｇまたはＬｅｕ８−Ｉｇを添加し
た（１mMのＣｕＣｌ2 および１mMのＭｇＣｌ2 を含有す
るＰＢＳの中で系統的に希釈した、２０μｇ／mlから
０．６μｇ／mlに、１００μｌ／ウェル、１時間、室
温）。ウェルを洗浄し（ＴＰＢＳ）そしてペルオキシダ
ーゼ接合ヤギＦ（ａｂ′）2 抗ヒトＩｇＧを各ウェルに
添加した（ＴＡＧＯ、バーリンゲイム，カリフォルニア
州、１×検体希釈の中で１：５０００の希釈、１時間、
室温）。
ンパク質ＣＤ４０−ＩｇまたはＬｅｕ８−Ｉｇを添加し
た（１mMのＣｕＣｌ2 および１mMのＭｇＣｌ2 を含有す
るＰＢＳの中で系統的に希釈した、２０μｇ／mlから
０．６μｇ／mlに、１００μｌ／ウェル、１時間、室
温）。ウェルを洗浄し（ＴＰＢＳ）そしてペルオキシダ
ーゼ接合ヤギＦ（ａｂ′）2 抗ヒトＩｇＧを各ウェルに
添加した（ＴＡＧＯ、バーリンゲイム，カリフォルニア
州、１×検体希釈の中で１：５０００の希釈、１時間、
室温）。
【００９１】ウェルを洗浄し（ＴＰＢＳ）そして発色性
基質を添加した（ＧｅｎｅｔｉｃｓＳｙｓｔｅｍｓ，Ｅ
ＩＡ緩衝化基質の中で１：１００に希釈した発色物質、
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１００μｌ／ウェ
ル）。反応を１０分後にストップ緩衝液（Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１００μｌ／ウェル）の添加に
より停止させ、そして吸収をＥＬＩＳＡリーダーで２つ
の波長、すなわち、４５０または６３０nmで測定した。
さらに、ヤギ抗ヒトＦｃで被覆したプレート上のＣＤ４
０−Ｉｇの固定化により、ＥＬＩＳＡを実施した。ＣＯ
Ｓ細胞の上澄み液の増加する希釈からのｓｇｐ３９の結
合を５３−６Ｍａｂおよび引き続くＦＩＴＣ接合ヤギ抗
ラットＦｃ抗体を使用して検出した。蛍光をマイクロプ
レートのリーダーで測定した。
基質を添加した（ＧｅｎｅｔｉｃｓＳｙｓｔｅｍｓ，Ｅ
ＩＡ緩衝化基質の中で１：１００に希釈した発色物質、
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１００μｌ／ウェ
ル）。反応を１０分後にストップ緩衝液（Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１００μｌ／ウェル）の添加に
より停止させ、そして吸収をＥＬＩＳＡリーダーで２つ
の波長、すなわち、４５０または６３０nmで測定した。
さらに、ヤギ抗ヒトＦｃで被覆したプレート上のＣＤ４
０−Ｉｇの固定化により、ＥＬＩＳＡを実施した。ＣＯ
Ｓ細胞の上澄み液の増加する希釈からのｓｇｐ３９の結
合を５３−６Ｍａｂおよび引き続くＦＩＴＣ接合ヤギ抗
ラットＦｃ抗体を使用して検出した。蛍光をマイクロプ
レートのリーダーで測定した。
【００９２】７．１．３．Ｂ細胞の増殖のアッセイ
末梢血液の単核細胞（ＰＢＭＣ）を、リンパ球分離媒質
（Ｌｉｔｔｏｎ Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ、ケンシントン，
マリイランド州）を通す遠心により分離した。ナイロン
カラム（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＵＳＡ，Ｉｎ
ｃ．，リッチモンド，バージニア州）に細胞を通過さ
せ、そして付着性細胞の収穫により、ヒトＢリンパ球を
ＰＢＭＣから濃縮した。次いでこれらの細胞をｌｅｕ−
ｌｅｕメチルエステル（Ｓｉｇｍａ、セントルイス，ミ
ゾリー州）で処理して、単球およびＮＫ細胞を消耗させ
た。生ずる細胞の集団をＥＰＩＣＳ Ｃ（Ｃｏｕｌｅｔ
ｒＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、ヒアリーヒ，フロリダ州）
を使用するフローサイトメトリーにより分析し、そして
５０％のヒト末梢血液のＢ細胞から成っていた。
（Ｌｉｔｔｏｎ Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ、ケンシントン，
マリイランド州）を通す遠心により分離した。ナイロン
カラム（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＵＳＡ，Ｉｎ
ｃ．，リッチモンド，バージニア州）に細胞を通過さ
せ、そして付着性細胞の収穫により、ヒトＢリンパ球を
ＰＢＭＣから濃縮した。次いでこれらの細胞をｌｅｕ−
ｌｅｕメチルエステル（Ｓｉｇｍａ、セントルイス，ミ
ゾリー州）で処理して、単球およびＮＫ細胞を消耗させ
た。生ずる細胞の集団をＥＰＩＣＳ Ｃ（Ｃｏｕｌｅｔ
ｒＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、ヒアリーヒ，フロリダ州）
を使用するフローサイトメトリーにより分析し、そして
５０％のヒト末梢血液のＢ細胞から成っていた。
【００９３】扁桃Ｂ細胞を完全な扁桃から細かく刻むこ
とによって調製して、扁桃細胞懸濁液を生成する。次い
で細胞をリンパ球分離媒質を通して遠心し、２回洗浄
し、次いで不連続のパーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）（Ｓ
ｉｇｍａ、セントルイス，ミゾリー州）勾配で分別する
ことができる。５０％より大きい密度をもつ細胞を集
め、２回洗浄し、そして増殖アッセイにおいて使用し
た。ｇｐ３９構成体またはベクター単独（モック−ＣＯ
Ｓ）でトランスフェクションしたＣＯＳ細胞を組織培養
プレートからＥＤＴＡで収穫し、ＰＢＳで２回洗浄し、
５×１０6 細胞／mlで懸濁させ、そして５０００ラドで
１３７Ｃｓ源から照射した。ＣＯＳ細胞を増殖アッセイ
において１：４の比（１×１０4 のＣＯＳ細胞／４×１
０4 のＢ細胞）で使用した。
とによって調製して、扁桃細胞懸濁液を生成する。次い
で細胞をリンパ球分離媒質を通して遠心し、２回洗浄
し、次いで不連続のパーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）（Ｓ
ｉｇｍａ、セントルイス，ミゾリー州）勾配で分別する
ことができる。５０％より大きい密度をもつ細胞を集
め、２回洗浄し、そして増殖アッセイにおいて使用し
た。ｇｐ３９構成体またはベクター単独（モック−ＣＯ
Ｓ）でトランスフェクションしたＣＯＳ細胞を組織培養
プレートからＥＤＴＡで収穫し、ＰＢＳで２回洗浄し、
５×１０6 細胞／mlで懸濁させ、そして５０００ラドで
１３７Ｃｓ源から照射した。ＣＯＳ細胞を増殖アッセイ
において１：４の比（１×１０4 のＣＯＳ細胞／４×１
０4 のＢ細胞）で使用した。
【００９４】１０％のＦＣＳを含有する完全なＲＰＭＩ
培地中で５×１０4 細胞／ウェルで平底の９６ウェルの
マイクロタイタープレートにおいて、４倍の試料の中の
Ｂ細胞を培養することによって、増殖の測定を実施し
た。使用した試薬は次の通りであった：１Ｆ５（抗ＣＤ
２０、１μｇ／ml）；ＰＭＡ（１０ng／ml、ＬＣ Ｓｅ
ｒｖｉｃｅ、ウバーン，マサチュセッツ州）；Ｇ２８−
５（抗ＣＤ４０、１μｇ／ml）；ＣＤ４０−Ｉｇ（末梢
血液Ｂ細胞のアッセイにおいて５μｇ／ml、扁桃Ｂ細胞
のアッセイにおいて２０μｇ／ml）；ｓｇｐ３９または
ｓＣＤ７２（１：４に希釈した）を発現するＣＯＳ細胞
の上澄み液。５日間の培養および一夜のパルス後
〔 3Ｈ〕−チミジン（６．７ci／mmol；Ｎｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ、ボストン，マサチュセッツ
州）の吸収により、細胞の増殖を測定した。細胞をガラ
ス繊維のフィルター上に収穫し、そして放射能を液体シ
ンチレーションカウンターで測定した。
培地中で５×１０4 細胞／ウェルで平底の９６ウェルの
マイクロタイタープレートにおいて、４倍の試料の中の
Ｂ細胞を培養することによって、増殖の測定を実施し
た。使用した試薬は次の通りであった：１Ｆ５（抗ＣＤ
２０、１μｇ／ml）；ＰＭＡ（１０ng／ml、ＬＣ Ｓｅ
ｒｖｉｃｅ、ウバーン，マサチュセッツ州）；Ｇ２８−
５（抗ＣＤ４０、１μｇ／ml）；ＣＤ４０−Ｉｇ（末梢
血液Ｂ細胞のアッセイにおいて５μｇ／ml、扁桃Ｂ細胞
のアッセイにおいて２０μｇ／ml）；ｓｇｐ３９または
ｓＣＤ７２（１：４に希釈した）を発現するＣＯＳ細胞
の上澄み液。５日間の培養および一夜のパルス後
〔 3Ｈ〕−チミジン（６．７ci／mmol；Ｎｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ、ボストン，マサチュセッツ
州）の吸収により、細胞の増殖を測定した。細胞をガラ
ス繊維のフィルター上に収穫し、そして放射能を液体シ
ンチレーションカウンターで測定した。
【００９５】７．２．結果
７．２．１．キメラ融合タンパク質としての組み換えｇ
ｐ３９の調製および特性決定 ｇｐ３９はII型膜タンパク質であり、そしてII型膜タン
パク質はカルボキシ末端ＥＣドメインをもって配向され
ているので、融合構成体は標識ポリペプチドがタンパク
質のＥＣ部分に対してアミノ末端に配置され、表面タン
パク質のトランスメンブレンおよび細胞質のドメインを
置換するようにデザインした。標識ポリペプチドはアミ
ノ末端の分泌シグナル配列を含有して、融合タンパク質
の輸出を可能とすべきである。
ｐ３９の調製および特性決定 ｇｐ３９はII型膜タンパク質であり、そしてII型膜タン
パク質はカルボキシ末端ＥＣドメインをもって配向され
ているので、融合構成体は標識ポリペプチドがタンパク
質のＥＣ部分に対してアミノ末端に配置され、表面タン
パク質のトランスメンブレンおよび細胞質のドメインを
置換するようにデザインした。標識ポリペプチドはアミ
ノ末端の分泌シグナル配列を含有して、融合タンパク質
の輸出を可能とすべきである。
【００９６】我々はネズミＣＤ８のＥＤドメイン（Ｎａ
ｋａｕｃｈｉら、１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１２６−５１３０）
を、次の４つの理由で、われわれの標識ポリペプチドと
して選択して、我々のII型膜タンパク質の融合タンパク
質を構成体した：（ｉ）標識ポリペプチドとしてよく定
められた３次構造をもつ完全な細胞外のタンパク質ドメ
インの使用は、標識ポリペプチドがそれを融合する表面
タンパク質の３次構造に影響を与える変化を最小にする
と同時に、融合タンパク質が発現されそして輸出される
可能性を最大とし、（ii）従来研究されたＣＤ８Ｉｇキ
メラは、ＣＤ８融合タンパク質がＣＯＳ細胞により高い
収率で生産および輸出されることを証明し、（iii ）Ｃ
Ｄ８に対して向けられた多数のｍＡｂが入手可能であ
り、そして組み換えＣＤ８融合タンパク質の操作に使用
することができ；そして（iv）ネズミＣＤ８とヒトＭＨ
Ｖ Ｉとの間の相互作用は検出可能ではない。
ｋａｕｃｈｉら、１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１２６−５１３０）
を、次の４つの理由で、われわれの標識ポリペプチドと
して選択して、我々のII型膜タンパク質の融合タンパク
質を構成体した：（ｉ）標識ポリペプチドとしてよく定
められた３次構造をもつ完全な細胞外のタンパク質ドメ
インの使用は、標識ポリペプチドがそれを融合する表面
タンパク質の３次構造に影響を与える変化を最小にする
と同時に、融合タンパク質が発現されそして輸出される
可能性を最大とし、（ii）従来研究されたＣＤ８Ｉｇキ
メラは、ＣＤ８融合タンパク質がＣＯＳ細胞により高い
収率で生産および輸出されることを証明し、（iii ）Ｃ
Ｄ８に対して向けられた多数のｍＡｂが入手可能であ
り、そして組み換えＣＤ８融合タンパク質の操作に使用
することができ；そして（iv）ネズミＣＤ８とヒトＭＨ
Ｖ Ｉとの間の相互作用は検出可能ではない。
【００９７】ＣＤ８−ｇｐ３９融合遺伝子を発生するた
めに、ｓｇｐ３９、ネズミＣＤ８のＥＣドメインをコー
ドするｃＤＮＡ断片を、材料および方法に記載するｇｐ
３９のＥＣドメインをコードするｃＤＮＡ断片と融合し
た（図３）。ｓｇｐ３９タンパク質をＣＯＳ細胞の中で
一時的発現により調製しそして、抗ＣＤ８ｍＡｂで、あ
るいはわれわれが早期のネズミｇｐ３９の研究において
使用した可溶性組み換えＣＤ４０−Ｉｇキメラで、ＣＯ
Ｓ細胞の上澄み液から回収した（図４）。ｓｇｐ３９タ
ンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより還元性条件下に分
析するとき、約５０kDa の分子質量を有する（図４）。
実験結果はｓｇｐ３９が溶液の中で２量体および３量体
を形成することを示す。
めに、ｓｇｐ３９、ネズミＣＤ８のＥＣドメインをコー
ドするｃＤＮＡ断片を、材料および方法に記載するｇｐ
３９のＥＣドメインをコードするｃＤＮＡ断片と融合し
た（図３）。ｓｇｐ３９タンパク質をＣＯＳ細胞の中で
一時的発現により調製しそして、抗ＣＤ８ｍＡｂで、あ
るいはわれわれが早期のネズミｇｐ３９の研究において
使用した可溶性組み換えＣＤ４０−Ｉｇキメラで、ＣＯ
Ｓ細胞の上澄み液から回収した（図４）。ｓｇｐ３９タ
ンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより還元性条件下に分
析するとき、約５０kDa の分子質量を有する（図４）。
実験結果はｓｇｐ３９が溶液の中で２量体および３量体
を形成することを示す。
【００９８】対照として、Ｂ細胞抗原ＣＤ７２の可溶性
組み換え形態をコードするキメラ遺伝子（Ｖｏｎ Ｈｏ
ｅｇｅｎら、１９９０，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：
４８７０−４８７７）である他のII型膜タンパク質を構
成体した（図３）。また、ｓＣＤ７２タンパク質をＣＯ
Ｓ細胞の中の一時的発現により生産し、そして抗ＣＤ８
ｍＡｂで、あるいはＣＤ４０−Ｉｇ融合タンパク質では
なく、試験した３つの抗ＣＤ７２ｍＡｂで、ＣＯＳ細胞
の上澄み液から回収した（図５）。
組み換え形態をコードするキメラ遺伝子（Ｖｏｎ Ｈｏ
ｅｇｅｎら、１９９０，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：
４８７０−４８７７）である他のII型膜タンパク質を構
成体した（図３）。また、ｓＣＤ７２タンパク質をＣＯ
Ｓ細胞の中の一時的発現により生産し、そして抗ＣＤ８
ｍＡｂで、あるいはＣＤ４０−Ｉｇ融合タンパク質では
なく、試験した３つの抗ＣＤ７２ｍＡｂで、ＣＯＳ細胞
の上澄み液から回収した（図５）。
【００９９】ＣＤ４０と可溶性組み換えヒトｇｐ３９と
の間の相互作用をさらに特性決定するために、全長のＣ
Ｄ４０タンパク質をコードするｃＤＮＡをＣＯＳ細胞を
トランスフェクションし（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、
１９８９，ＥＭＢＯ Ｊ．８：１４０３−１４１０）そ
してｓｇｐ３９，ｓＣＤ７２および抗ＣＤ４０ｍＡｂに
結合するそれらの能力を蛍光性の微鏡検査により検査し
た。両者のｓｇｐ３９および抗ＣＤ４０ｍＡｂはトラン
スフェクション体に結合したが、ｓＣＤ７２は結合しな
かった（図６）。
の間の相互作用をさらに特性決定するために、全長のＣ
Ｄ４０タンパク質をコードするｃＤＮＡをＣＯＳ細胞を
トランスフェクションし（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、
１９８９，ＥＭＢＯ Ｊ．８：１４０３−１４１０）そ
してｓｇｐ３９，ｓＣＤ７２および抗ＣＤ４０ｍＡｂに
結合するそれらの能力を蛍光性の微鏡検査により検査し
た。両者のｓｇｐ３９および抗ＣＤ４０ｍＡｂはトラン
スフェクション体に結合したが、ｓＣＤ７２は結合しな
かった（図６）。
【０１００】さらに、ＣＯＳ細胞を表面結合したｇｐ３
９をコードするｃＤＮＡでトランスフェクションし、そ
してＣＤ４０−Ｉｇ（Ｎｏｅｌｌｅら、１９９２，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６
５５０−６５５４）または無関係のＩｇ融合タンパク
質、Ｌｅｕ８−Ｉｇ（Ａｒｕｆｆｏら、１９９２，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：２
２９２−２２９６）に結合するそれらの能力を検査し
た。ＣＤ４０−Ｉｇはｇｐ３９を発現するＣＯＳ細胞に
結合したが、Ｌｅｕ８−Ｉｇは結合しなかった（図
６）。
９をコードするｃＤＮＡでトランスフェクションし、そ
してＣＤ４０−Ｉｇ（Ｎｏｅｌｌｅら、１９９２，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６
５５０−６５５４）または無関係のＩｇ融合タンパク
質、Ｌｅｕ８−Ｉｇ（Ａｒｕｆｆｏら、１９９２，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：２
２９２−２２９６）に結合するそれらの能力を検査し
た。ＣＤ４０−Ｉｇはｇｐ３９を発現するＣＯＳ細胞に
結合したが、Ｌｅｕ８−Ｉｇは結合しなかった（図
６）。
【０１０１】平行実験において、ｓｇｐ３９およびＣＤ
７２を９６ウェルのマイクロタイタープレートのウェル
の中に抗ＣＤ８ｍＡｂを介して固定化し、そして増加す
る濃度のＣＤ４０−Ｉｇまたは対照の免疫グロブリンの
融合タンパク質、Ｌｅｕ８−Ｉｇ、に対するそれらの結
合を検査した。固定化されたｓｇｐ３９へのＣＤ４０−
Ｉｇの結合は飽和可能であったが、ＣＤ４０−Ｉｇはｓ
ＣＤ７２に結合せず、そしてＬｅｕ８−Ｉｇはｓｇｐ３
９に結合しなかった（図７）。
７２を９６ウェルのマイクロタイタープレートのウェル
の中に抗ＣＤ８ｍＡｂを介して固定化し、そして増加す
る濃度のＣＤ４０−Ｉｇまたは対照の免疫グロブリンの
融合タンパク質、Ｌｅｕ８−Ｉｇ、に対するそれらの結
合を検査した。固定化されたｓｇｐ３９へのＣＤ４０−
Ｉｇの結合は飽和可能であったが、ＣＤ４０−Ｉｇはｓ
ＣＤ７２に結合せず、そしてＬｅｕ８−Ｉｇはｓｇｐ３
９に結合しなかった（図７）。
【０１０２】７．２．２．ヒトｇｐ３９はＢ細胞の増殖
を誘発するために共刺激を必要とする Ｂ細胞の活性化におけるｇｐ３９−ＣＤ４０の相互作用
の役割を検査するために、ヒトｇｐ３９をコードするｃ
ＤＮＡまたはベクター単独（モック）でトランスフェク
ションしたＣＯＳ細胞を、Ｂ細胞の増殖を刺激するそれ
らの能力について試験した。休止の末梢血液のＢ細胞
は、ヒトｇｐ３９を発現するＣＯＳ細胞単独とインキュ
ベーションしたとき、弱く増殖しただけであった（図
８）。
を誘発するために共刺激を必要とする Ｂ細胞の活性化におけるｇｐ３９−ＣＤ４０の相互作用
の役割を検査するために、ヒトｇｐ３９をコードするｃ
ＤＮＡまたはベクター単独（モック）でトランスフェク
ションしたＣＯＳ細胞を、Ｂ細胞の増殖を刺激するそれ
らの能力について試験した。休止の末梢血液のＢ細胞
は、ヒトｇｐ３９を発現するＣＯＳ細胞単独とインキュ
ベーションしたとき、弱く増殖しただけであった（図
８）。
【０１０３】しかしながら、ヒトｇｐ３９を発現するＣ
ＯＳ細胞に（ｉ）１Ｆ５ｍＡｂ（Ｃｌａｒｋら、１９８
５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８２：１７６６−１７７０）、Ｂ細胞の表面タンパク質
ＣＤ２０に対して向けられた、あるいは（ii）ＰＭＡと
組み合わせて暴露すると、激しいＢ細胞の増殖が観察さ
れた。両者の場合において、ヒトｇｐ３９推進Ｂ細胞の
増殖は可溶性ＣＤ４０−Ｉｇ融合タンパク質でバックグ
ラウンドのレベルに減少することができた（図８）。Ｂ
細胞は、抗ＣＤ２０ｍＡｂまたはＰＭＡの存在下にモッ
クトランスフェクションしたＣＯＳ細胞とインキュベー
ションしたとき、弱くだけ増殖し、そしてこの増殖はＣ
Ｄ４０−Ｉｇにより影響を受けなかった（図８）。共刺
激シグナルの不存在下にヒトｇｐ３９発現ＣＯＳ細胞を
使用して観察された弱いＢ細胞の増殖は、この場合にお
いて、ＣＯＳ細胞がまたＣＤ４０シグナルと協同してＢ
細胞の増殖を推進する共刺激シグナルを提供することを
示唆する。
ＯＳ細胞に（ｉ）１Ｆ５ｍＡｂ（Ｃｌａｒｋら、１９８
５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８２：１７６６−１７７０）、Ｂ細胞の表面タンパク質
ＣＤ２０に対して向けられた、あるいは（ii）ＰＭＡと
組み合わせて暴露すると、激しいＢ細胞の増殖が観察さ
れた。両者の場合において、ヒトｇｐ３９推進Ｂ細胞の
増殖は可溶性ＣＤ４０−Ｉｇ融合タンパク質でバックグ
ラウンドのレベルに減少することができた（図８）。Ｂ
細胞は、抗ＣＤ２０ｍＡｂまたはＰＭＡの存在下にモッ
クトランスフェクションしたＣＯＳ細胞とインキュベー
ションしたとき、弱くだけ増殖し、そしてこの増殖はＣ
Ｄ４０−Ｉｇにより影響を受けなかった（図８）。共刺
激シグナルの不存在下にヒトｇｐ３９発現ＣＯＳ細胞を
使用して観察された弱いＢ細胞の増殖は、この場合にお
いて、ＣＯＳ細胞がまたＣＤ４０シグナルと協同してＢ
細胞の増殖を推進する共刺激シグナルを提供することを
示唆する。
【０１０４】休止するヒト末梢血液のＢ細胞を、可溶性
組み換えヒトｇｐ３９，ｓｇｐ３９、または対照の可溶
性融合タンパク質、ｓＣＤ７２、と、抗ＣＤ２０ｍＡｂ
またはＰＭＡの不存在または存在下にインキュベーショ
ンした。非常に弱い増殖はｓｇｐ３９単独で観察された
が、抗ＣＤ２０ｍＡｂまたはＰＭＡが存在したとき、ｓ
ｇｐ３９は激しいＢ細胞の増殖を誘発した（図９）。Ｂ
細胞の増殖はｓＣＤ７２、抗ＣＤ２０ｍＡｂまたはＰＭ
Ａ単独で、あるいはｓＣＤ７２で抗ＣＤ２０ｍＡｂまた
はＰＭＡと組み合わせて観察されなかった（図９）。
組み換えヒトｇｐ３９，ｓｇｐ３９、または対照の可溶
性融合タンパク質、ｓＣＤ７２、と、抗ＣＤ２０ｍＡｂ
またはＰＭＡの不存在または存在下にインキュベーショ
ンした。非常に弱い増殖はｓｇｐ３９単独で観察された
が、抗ＣＤ２０ｍＡｂまたはＰＭＡが存在したとき、ｓ
ｇｐ３９は激しいＢ細胞の増殖を誘発した（図９）。Ｂ
細胞の増殖はｓＣＤ７２、抗ＣＤ２０ｍＡｂまたはＰＭ
Ａ単独で、あるいはｓＣＤ７２で抗ＣＤ２０ｍＡｂまた
はＰＭＡと組み合わせて観察されなかった（図９）。
【０１０５】平行実験において、休止するヒト扁桃のＢ
細胞を材料および方法の節に記載するように調製し、そ
してｓｇｐ３９およびｓＣＤ７２に応答して増殖するそ
れらの能力を検査した（図１０）。末梢血液のＢ細胞で
見られたように、扁桃Ｂ細胞はｓｇｐ３９に応答して増
殖したが、ｓｇｐ３９と抗ＣＤ２０ｍＡｂＩＦ５または
ＰＭＡの存在下にインキュベーションしたとき、強い増
殖を示した。細胞をｓＣＤ７２と単独であるいは１Ｆ５
ｍＡｂまたはＰＭＡの存在下にインキュベーションした
とき、バックグラウンドのレベルを越える有意の増殖は
観察されなかった。
細胞を材料および方法の節に記載するように調製し、そ
してｓｇｐ３９およびｓＣＤ７２に応答して増殖するそ
れらの能力を検査した（図１０）。末梢血液のＢ細胞で
見られたように、扁桃Ｂ細胞はｓｇｐ３９に応答して増
殖したが、ｓｇｐ３９と抗ＣＤ２０ｍＡｂＩＦ５または
ＰＭＡの存在下にインキュベーションしたとき、強い増
殖を示した。細胞をｓＣＤ７２と単独であるいは１Ｆ５
ｍＡｂまたはＰＭＡの存在下にインキュベーションした
とき、バックグラウンドのレベルを越える有意の増殖は
観察されなかった。
【０１０６】ｓｇｐ３９推進活性化の応答の特異性を検
査するために、ｓｇｐ３９／ＩＦ５またはｓｇｐ３９／
ＰＭＡ推進Ｂ細胞の増殖をブロックするＣＤ４０−Ｉｇ
の能力を検査した。ＣＤ４０−Ｉｇはｓｇｐ３９推進Ｂ
細胞の活性化を減少することができた（約２０μｇ／ml
は約５０％の阻止を与えた、図１０）が、対照の融合タ
ンパク質Ｌｅｕ−８−Ｉｇは作用をもたなかった（図１
０）。
査するために、ｓｇｐ３９／ＩＦ５またはｓｇｐ３９／
ＰＭＡ推進Ｂ細胞の増殖をブロックするＣＤ４０−Ｉｇ
の能力を検査した。ＣＤ４０−Ｉｇはｓｇｐ３９推進Ｂ
細胞の活性化を減少することができた（約２０μｇ／ml
は約５０％の阻止を与えた、図１０）が、対照の融合タ
ンパク質Ｌｅｕ−８−Ｉｇは作用をもたなかった（図１
０）。
【０１０７】７．３．考察
報告されたように、精製されたネズミ脾臓Ｂ細胞および
ヒト扁桃Ｂ細胞は、ネズミｇｐ３９を発現するＣＶ１／
ＥＢＮＡｃｌと共刺激の不存在下にインキュベーション
したとき、増殖した（Ａｒｍｉｔａｇｅら、１９９２，
Ｎａｔｕｒｅ３５７：８０−８２）。これらのデータに
基づいて、ｇｐ３９はＢ細胞に対して直接分裂促進性で
あると考えられた。ＣＤ４０に結合するｇｐ３９が、他
の共刺激シグナルの不存在下に、休止するＢ細胞を刺激
して増殖させることができるかどうか、および刺激にお
ける線維芽細胞の作用を決定するために、全長のｈｇｐ
３９またはｓｇｐ３９を発現するＣＯＳ細胞に応答する
Ｂ細胞の増殖を試験した。
ヒト扁桃Ｂ細胞は、ネズミｇｐ３９を発現するＣＶ１／
ＥＢＮＡｃｌと共刺激の不存在下にインキュベーション
したとき、増殖した（Ａｒｍｉｔａｇｅら、１９９２，
Ｎａｔｕｒｅ３５７：８０−８２）。これらのデータに
基づいて、ｇｐ３９はＢ細胞に対して直接分裂促進性で
あると考えられた。ＣＤ４０に結合するｇｐ３９が、他
の共刺激シグナルの不存在下に、休止するＢ細胞を刺激
して増殖させることができるかどうか、および刺激にお
ける線維芽細胞の作用を決定するために、全長のｈｇｐ
３９またはｓｇｐ３９を発現するＣＯＳ細胞に応答する
Ｂ細胞の増殖を試験した。
【０１０８】ｇｐ３９を活性化すべき膜と関連させなく
てはならないことを示唆するＡｒｍｉｔａｇａ、前掲、
の教示と対照的に、われわれの結果が示すように、ｈｇ
ｐ３９は膜に関連した形態および可溶性の形態の両者に
おいて活性であった；しかしながら、ｈｇｐ３９+ ＣＯ
Ｓ細胞とｓｇｐ３９との間の興味ある差が見られた。ｈ
ｇｐ３９を発現するＣＯＳ細胞は共刺激の不存在下にほ
んの弱いＢ細胞の増殖を誘発することができたが、共刺
激、例えば、抗ＣＤ２０ｍＡｂまたはＰＭＡと協同して
激しいＢ細胞の増殖を誘発することができた。すべての
場合において、Ｂ細胞の増殖は可溶性の組み換えｈｇｐ
３９レセプター、ＣＤ４０−Ｉｇ、でバックグラウンド
のレベルに減少することができた。
てはならないことを示唆するＡｒｍｉｔａｇａ、前掲、
の教示と対照的に、われわれの結果が示すように、ｈｇ
ｐ３９は膜に関連した形態および可溶性の形態の両者に
おいて活性であった；しかしながら、ｈｇｐ３９+ ＣＯ
Ｓ細胞とｓｇｐ３９との間の興味ある差が見られた。ｈ
ｇｐ３９を発現するＣＯＳ細胞は共刺激の不存在下にほ
んの弱いＢ細胞の増殖を誘発することができたが、共刺
激、例えば、抗ＣＤ２０ｍＡｂまたはＰＭＡと協同して
激しいＢ細胞の増殖を誘発することができた。すべての
場合において、Ｂ細胞の増殖は可溶性の組み換えｈｇｐ
３９レセプター、ＣＤ４０−Ｉｇ、でバックグラウンド
のレベルに減少することができた。
【０１０９】ｓｇｐ３９のみは末梢血液または扁桃から
分離された休止するＢ細胞を、共刺激、例えば、抗ＣＤ
２０ｍＡｂｍＡｂまたはＰＭＡと組み合わせて、誘発し
て増殖させることができた。ｈｇｐ３９を発現するＣＯ
Ｓ細胞で観察されたように、ｓｇｐ３９推進Ｂ細胞の活
性化をＣＤ４０−Ｉｇで阻止することができたが、無関
係のＩｇ融合タンパク質で阻止することができなかっ
た。
分離された休止するＢ細胞を、共刺激、例えば、抗ＣＤ
２０ｍＡｂｍＡｂまたはＰＭＡと組み合わせて、誘発し
て増殖させることができた。ｈｇｐ３９を発現するＣＯ
Ｓ細胞で観察されたように、ｓｇｐ３９推進Ｂ細胞の活
性化をＣＤ４０−Ｉｇで阻止することができたが、無関
係のＩｇ融合タンパク質で阻止することができなかっ
た。
【０１１０】これらのデータが示すように、ｈｇｐ３９
は最も効果的にＢ細胞の増殖を刺激するために共刺激の
シグナルを必要とし、そして活性のためにｈｇｐ３９の
細胞表面の発現のために厳格な要件は存在しない。さら
に、ＣＯＳ細胞の表面上で発現されたｈｇｐ３９が弱い
Ｂ細胞の増殖を刺激する能力は、ＣＯＳ細胞が、また、
低いレベルの共刺激シグナルを提供できるという考えを
示唆し、このようなシグナルは、まだ規定されないが、
ヒトｇｐ３９により提供されるもの同定することができ
る。
は最も効果的にＢ細胞の増殖を刺激するために共刺激の
シグナルを必要とし、そして活性のためにｈｇｐ３９の
細胞表面の発現のために厳格な要件は存在しない。さら
に、ＣＯＳ細胞の表面上で発現されたｈｇｐ３９が弱い
Ｂ細胞の増殖を刺激する能力は、ＣＯＳ細胞が、また、
低いレベルの共刺激シグナルを提供できるという考えを
示唆し、このようなシグナルは、まだ規定されないが、
ヒトｇｐ３９により提供されるもの同定することができ
る。
【０１１１】因子依存性の、長期間のＢ細胞の培養の開
発は、Ｂ細胞の成長および分化の研究および抗原特異的
Ｂ細胞系の開発のための重要な応用を有する（Ｔｉｓｃ
ｈら、１９８８，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ９：１
４５−１５０）。抗ＣＤ２０ｍＡｂを使用する実験にお
いて、ＣＤ４０シグナルは他の共刺激シグナル、例え
ば、抗ＣＤ２０ｍＡｂにより供給されるものと協同して
Ｂ細胞の増殖を推進すること、およびＢ細胞を抗ＣＤ２
０ｍＡｂで処理すると、Ｂ細胞の「変更性」の状態を誘
発し、この状態はＢ細胞が引き続く活性化シグナルに対
していっそう容易に応答できるようにすることが示され
た。ｓｇｐ３９が抗ＣＤ２０ｍＡｂまたはＰＭＡと組み
合わせてＢ細胞の増殖を刺激する能力は、それを長期間
のＢ細胞の成長のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ系をつくるた
めに使用できることを示唆する。
発は、Ｂ細胞の成長および分化の研究および抗原特異的
Ｂ細胞系の開発のための重要な応用を有する（Ｔｉｓｃ
ｈら、１９８８，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ９：１
４５−１５０）。抗ＣＤ２０ｍＡｂを使用する実験にお
いて、ＣＤ４０シグナルは他の共刺激シグナル、例え
ば、抗ＣＤ２０ｍＡｂにより供給されるものと協同して
Ｂ細胞の増殖を推進すること、およびＢ細胞を抗ＣＤ２
０ｍＡｂで処理すると、Ｂ細胞の「変更性」の状態を誘
発し、この状態はＢ細胞が引き続く活性化シグナルに対
していっそう容易に応答できるようにすることが示され
た。ｓｇｐ３９が抗ＣＤ２０ｍＡｂまたはＰＭＡと組み
合わせてＢ細胞の増殖を刺激する能力は、それを長期間
のＢ細胞の成長のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ系をつくるた
めに使用できることを示唆する。
【０１１２】ここに記載するＣＤ４０−Ｉｇ融合タンパ
ク質およびｓｇｐ３９の融合体を使用して、それぞれ、
Ｂ細胞におけるＣＤ４０の応答を阻止または刺激するこ
とができ、こうしてＢ細胞／Ｔ細胞の相互作用の研究お
よび臨床的応用において通常であることに注意すること
は興味あることである。
ク質およびｓｇｐ３９の融合体を使用して、それぞれ、
Ｂ細胞におけるＣＤ４０の応答を阻止または刺激するこ
とができ、こうしてＢ細胞／Ｔ細胞の相互作用の研究お
よび臨床的応用において通常であることに注意すること
は興味あることである。
【０１１３】８．微生物の寄託
次のものはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）米国マリイランド州２０８５
２，ロックビレ１２３０１に受託された： 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＣＤＭＢ
- ＭＣ１０６１／ｐ３−ｓｈｇｐ３９ ＡＴＣＣ識別
番号６９０４９ 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＣＤＭＢ
ＭＣ１０６１／ｐ３−ｈｇｐ３９ ＡＴＣＣ識別番号
６９０５０
ョン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）米国マリイランド州２０８５
２，ロックビレ１２３０１に受託された： 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＣＤＭＢ
- ＭＣ１０６１／ｐ３−ｓｈｇｐ３９ ＡＴＣＣ識別
番号６９０４９ 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＣＤＭＢ
ＭＣ１０６１／ｐ３−ｈｇｐ３９ ＡＴＣＣ識別番号
６９０５０
【０１１４】本発明は受託された微生物により範囲が限
定されない。なぜなら、受託された実施態様は本発明の
一つの面の例示を意図し、そして機能的に同等の任意の
微生物は本発明の範囲内に入るからである。本発明は本
発明の単一の面の例示を意図する例示された実施態様に
範囲が限定されず、そして機能的に同等の任意のクロー
ン、ＤＮＡまたはアミノ酸配列は本発明の範囲内に入
る。事実、本発明の種々の変更は上の説明および添付図
面から当業者にとって明らかである。このような変更は
添付する特許請求の範囲内に入ることを意図する。ま
た、ヌクレオチドについて与えたすべての塩基対の大き
さは概算であり、そして説明のために使用したことを理
解すべきである。種々の刊行物をここにおいて引用し、
それらの内容をここに引用によって加える。
定されない。なぜなら、受託された実施態様は本発明の
一つの面の例示を意図し、そして機能的に同等の任意の
微生物は本発明の範囲内に入るからである。本発明は本
発明の単一の面の例示を意図する例示された実施態様に
範囲が限定されず、そして機能的に同等の任意のクロー
ン、ＤＮＡまたはアミノ酸配列は本発明の範囲内に入
る。事実、本発明の種々の変更は上の説明および添付図
面から当業者にとって明らかである。このような変更は
添付する特許請求の範囲内に入ることを意図する。ま
た、ヌクレオチドについて与えたすべての塩基対の大き
さは概算であり、そして説明のために使用したことを理
解すべきである。種々の刊行物をここにおいて引用し、
それらの内容をここに引用によって加える。
【０１１５】
配列番号：１
配列の長さ：８４０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
特徴：
（Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：２２…８０７
配列
CCATTTCAAC TTTAACACAG C ATG ATC GAA ACA TAC AAC CAA ACT TCT CCC 51
Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro
1 5 10
CGA TCT GCG GCC ACT GGA CTG CCC ATC AGC ATG AAA ATT TTT ATG TAT 99
Arg Ser Ala Ala Thr Gly Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr
15 20 25
TTA CTT ACT GTT TTT CTT ATC ACC CAG ATG ATT GGG TCA GCA CTT TTT 147
Leu Leu Thr Val Phe Leu Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe
30 35 40
GCT GTG TAT CTT CAT AGA AGG TTG GAC AAG ATA GAA GAT GAA AGG AAT 195
Ala Val Tyr Leu His Arg Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn
45 50 55
CTT CAT GAA GAT TTT GTA TTC ATG AAA ACG ATA CAG AGA TGC AAC ACA 243
Leu His Glu Asp Phe Val Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr
60 65 70
GGA GAA AGA TCC TTA TCC TTA CTG AAC TGT GAG GAG ATT AAA AGC CAG 291
Gly Glu Arg Ser Leu Ser Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln
75 80 85 90
TTT GAA GGC TTT GTG AAG GAT ATA ATG TTA AAC AAA GAG GAG ACG AAG 339
Phe Glu Gly Phe Val Lys Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys
95 100 105
AAA GAA AAC AGC TTT GAA ATG CAA AAA GGT GAT CAG AAT CCT CAA ATT 387
Lys Glu Asn Ser Phe Glu Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile
110 115 120
GCG GCA CAT GTC ATA AGT GAG GCC AGC AGT AAA ACA ACA TCT GTG TTA 435
Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu
125 130 135
CAG TGG GCT GAA AAA GGA TAC TAC ACC ATG AGC AAC AAC TTG GTA ACC 483
Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr
140 145 150
CTG GAA AAT GGG AAA CAG CTG ACC GTT AAA AGA CAA GGA CTC TAT TAT 531
Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr
155 160 165 170
ATC TAT GCC CAA GTC ACC TTC TGT TCC AAT CGG GAA GCT TCG AGT CAA 579
Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln
175 180 185
GCT CCA TTT ATA GCC AGC CTC TGC CTA AAG TCC CCC GGT AGA TTC GAG 627
Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu
190 195 200
AGA ATC TTA CTC AGA GCT GCA AAT ACC CAC AGT TCC GCC AAA CCT TGC 675
Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys
205 210 215
GGG CAA CAA TCC ATT CAC TTG GGA GGA GTA TTT GAA TTG CAA CCA GGT 723
Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly
220 225 230
GCT TCG GTG TTT GTC AAT GTG ACT GAT CCA AGC CAA GTG AGC CAT GGC 771
Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly
235 240 245 250
ACT GGC TTC ACG TCC TTT GGC TTA CTC AAA CTC TGAACAGTGT CACCTTGCAG 824
Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu
255 260
GCTGTGGTGG AGCTGA 840
【０１１６】配列番号：２
配列の長さ：２６１アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列
Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu
20 25 30
Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg
35 40 45
Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val
50 55 60
Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys
85 90 95
Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu
100 105 110
Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser
115 120 125
Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly
130 135 140
Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln
145 150 155 160
Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr
165 170 175
Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser
180 185 190
Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala
195 200 205
Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His
210 215 220
Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn
225 230 235 240
Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe
245 250 255
Gly Leu Leu Lys Leu
260
【０１１７】配列番号：３
配列の長さ：１５１アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列
Phe Glu Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val
1 5 10 15
Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu
20 25 30
Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly
35 40 45
Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln
50 55 60
Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile
65 70 75 80
Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu
85 90 95
Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Leu Gly Gly Gln Gln Ser
100 105 110
Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe
115 120 125
Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr
130 135 140
Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu
145 150
【０１１８】配列番号：４
配列の長さ：１５１アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列
Phe Glu Met Gln Arg Gly Asp Glu Asp Pro Gln Ile Ala Ala His Val
1 5 10 15
Val Ser Glu Ala Asn Ser Asn Ala Ala Ser Val Leu Gln Trp Ala Lys
20 25 30
Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Lys Ser Asn Leu Val Met Leu Glu Asn Gly
35 40 45
Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Glu Gly Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Thr Gln
50 55 60
Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Pro Ser Ser Gln Arg Pro Phe Ile
65 70 75 80
Val Gly Leu Trp Leu Lys Pro Ser Ile Gly Ser Glu Arg Ile Leu Leu
85 90 95
Lys Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ser Gln Leu Cys Glu Gln Gln Ser
100 105 110
Val His Leu Gly Gly Tyr Phe Glu Leu Gln Ala Gly Ala Ser Val Phe
115 120 125
Val Asn Val Thr Glu Ala Ser Gln Tyr Ile His Arg Val Gly Phe Ser
130 135 140
Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu
145 150
【０１１９】配列番号：５
配列の長さ：１５７アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列
Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val
1 5 10 15
Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg
20 25 30
Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu
35 40 45
Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala
85 90 95
Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys
100 105 110
Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Ile Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys
115 120 125
Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe
130 135 140
Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
145 150 155
【０１２０】配列番号：６
配列の長さ：１５５アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列
Pro Lys Met His Leu Ala His Ser Thr Leu Lys Pro Ala Ala His Leu
1 5 10 15
Ile Asn Asp Pro Ser Lys Gln Asn Ser Leu Leu Trp Arg Ala Asn Thr
20 25 30
Asp Arg Ala Phe Leu Gln Asp Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn Asn Ser
35 40 45
Leu Leu Val Pro Thr Ser Gly Ile Tyr Phe Tyr Tyr Ser Gln Val Val
50 55 60
Phe Ser Gly Lys Ala Tyr Ser Pro Lys Ala Thr Ser Ser Pro Ile Tyr
65 70 75 80
Leu Ala His Glu Val Gln Leu Phe Ser Ser Gln Tyr Pro Phe His Val
85 90 95
Pro Leu Leu Ser Ser Gln Lys Met Val Tyr Pro Gly Leu Gln Glu Pro
100 105 110
Trp Leu His Ser Met Tyr His Gly Ala Ala Phe Gln Leu Thr Gln Gly
115 120 125
Asp Gln Leu Ser Thr His Thr Asp Gly Ile Pro His Leu Val Leu Ser
130 135 140
Pro Ser Thr Val Phe Phe Gly Ala Gly Ala Leu
145 150 155
【０１２１】配列番号：７
配列の長さ：１５アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Pro Asp Pro Arg Arg Leu Asp Lys Ile
1 5 10 15
【０１２２】配列番号：８
配列の長さ：１５アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Pro Asp Pro Arg Tyr Leu Gln Val Ser
1 5 10 15
【０１２３】配列番号：９
配列の長さ：９７２塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
配列
GCTGGCTAAA GGAGCAGTTT CCCCGACCCT ACACGCCTCC CCCACCGCAC CTCCTCCGCC 60
CTGTTCCTGG GCCCCTCCCC TAGAGCCCTA GCTTGACCTA AGCTGCTTGC TGGTGGAGAG 120
CACACCATGG CCTCACCGTT GACCCGCTTT CTGTCGCTGA ACCTGCTGCT GCTGGGTGAG 180
TCGATTATCC TGGGGAGTGG AGAAGCTAAG CCACAGGCAC CCGAACTCCG AATCTTTCCA 240
AAGAAAATGG ACGCCGAACT TGGTCAGAAG GTGGACCTGG TATGTGAAGT GTTGGGGTCC 300
GTTTCGCAAG GATGCTCTTG GCTCTTCCAG AACTCCAGCT CCAAACTCCC CCAGCCCACC 360
TTCGTTGTCT ATATGGCTTC ATCCCACAAC AAGATAACGT GGGACGAGAA GCTGAATTCG 420
TCGAAACTGT TTTCTGCCAT GAGGGACACG AATAATAAGT ACGTTCTCAC CCTGAACAAG 480
TTCAGCAAGG AAAACGAAGG CTACTATTTC TGCTCAGTCA TCAGCAACTC GGTGATGTAC 540
TTCAGTTCTG TCGTGCCAGT CCTTCAGAAA GTGAACTCTA CTACTACCAA GCCAGTGCTG 600
CGAACTCCCT CACCTGTGCA CCCTACCGGG ACATCTCAGC CCCAGAGACC AGAAGATTGT 660
CGGCCCCGTG GCTCAGTGAA GGGGACCGGA TTGGACTTCG CCTGTGATAT TTACATCTGG 720
GCACCCTTGG CCGGAATCTG CGTGGCCCTT CTGCTGTCCT TGATCATCAC TCTCATCTGC 780
TACCACAGGA GCCGAAAGCG TGTTTGCAAA TGTCCCAGGC CGCTAGTCAG ACAGGAAGGC 840
AAGCCCAGAC CTTCAGAGAA AATTGTGTAA AATGGCACCG CCAGGAAGCT ACAACTACTA 900
CATGACTTCA GAGATCTCTT CTTGCAAGAG GCCAGGCCCT CCTTTTTCAA GTTTCCTGCT 960
GTCTTATGTA TT 972
【０１２４】配列番号：１０
配列の長さ：２４９アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Met Ala Ser Pro Leu Thr Arg Phe Leu Ser Leu Asn Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Gly Glu Ser Ile Ile Leu Gly Ser Gly Glu Ala Lys Pro Gln Ala Pro
20 25 30
Glu Leu Arg Ile Phe Pro Lys Lys Met Asp Ala Glu Leu Gly Gln Lys
35 40 45
Val Asp Leu Val Cys Glu Val Leu Gly Ser Val Ser Gln Gly Cys Ser
50 55 60
Trp Leu Phe Gln Asn Ser Ser Ser Lys Leu Pro Gln Pro Thr Phe Val
65 70 75 80
Val Tyr Met Ala Ser Ser His Asn Lys Ile Thr Trp Asp Glu Lys Leu
85 90 95
Asn Ser Ser Lys Leu Phe Ser Ala Met Arg Asp Thr Asn Asn Lys Tyr
100 105 110
Val Leu Thr Leu Asn Lys Phe Ser Lys Glu Asn Glu Gly Tyr Tyr Phe
115 120 125
Cys Ser Val Ile Ser Asn Ser Val Met Tyr Phe Ser Ser Val Val Pro
130 135 140
Val Leu Gln Lys Val Asn Ser Thr Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr
145 150 155 160
Pro Ser Pro Val His Pro Thr Gly Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu
165 170 175
Asp Cys Arg Pro Arg Gly Ser Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala
180 185 190
Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Leu
195 200 205
Leu Leu Ser Leu Ile Ile Thr Leu Ile Cys Tyr His Arg Ser Arg Lys
210 215 220
Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Leu Val Arg Gln Glu Gly Lys Pro
225 230 235 240
Arg Pro Ser Glu Lys Ile Val Asn Gly
245
【０１２５】配列番号：１１
配列の長さ：１０６０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
配列
CGGCTCCCGC GCCGCCTCCC CTCGCGCCCG AGCTTCGAGC CAAGCAGCGT CCTGGGGAGC 60
GCGTCATGGC CTTACCAGTG ACCGCCTTGC TCCTGCCGCT GGCCTTGCTG CTCCACGCCG 120
CCAGGCCGAG CCAGTTCCGG GTGTCGCCGC TGGATCGGAC CTGGAACCTG GGCGAGACAG 180
TGGAGCTGAA GTGCCAGGTG CTGCTGTCCA ACCCGACGTC GGGCTGCTCG TGGCTCTTCC 240
AGCCGCGCGG CGCCGCCGCC AGTCCCACCT TCCTCCTATA CCTCTCCCAA AACAAGCCCA 300
AGGCGGCCGA GGGGCTGGAC ACCCAGCGGT TCTCGGGCAA GAGGTTGGGG GACACCTTCG 360
TCCTCACCCT GAGCGACTTC CGCCGAGAGA ACGAGGGCTA CTATTTCTGC TCGGCCCTGA 420
GCAACTCCAT CATGTACTTC AGCCACTTCG TGCCGGTCTT CCTGCCAGCG AAGCCCACCA 480
CGACGCCAGC GCCGCGACCA CCAACACCGG CGCCCACCAT CGCGTCGCAG CCCCTGTCCC 540
TGCGCCCAGA GGCGTGCCGG CCAGCGGCGG GGGGCGCAGT GCACACGAGG GGGCTGGACT 600
TCGCCTGTGA TATCTACATC TGGGCGCCCT TGGCCGGGAC TTGTGGGGTC CTTCTCCTGT 660
CACTGGTTAT CACCCTTTAC TGCAACCACA GGAACCGAAG ACGTGTTTGC AAATGTCCCC 720
GGCCTGTGGT CAAATCGGGA GACAAGCCCA GCCTTTCGGC GAGATACGTC TAACCCTGTG 780
CAACAGCCAC TACATTACTT CAAACTGAGA TCCTTCCTTT TGAGGGAGCA AGTCCTTCCC 840
TTTCATTTTT TCCAGTCTTC CTCCCTGTGT ATTCATTCTC ATGATTATTA TTTTAGTGGG 900
GGCGGGGTGG GAAAGATTAC TTTTTCTTTA TGTGTTTGAC GGGAAACAAA ACTAGGTAAA 960
ATCTACAGTA CACCACAAGG GTCACAATAC TGTTGTGCGC ACATCGCGGT AGGGCGTGGA 1020
AAGGGGCAGG CCAGAGCTAC CCGCAGAGTT CTCAGAATCA 1060
【０１２６】配列番号：１２
配列の長さ：２３５アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
配列の種類：ペプチド
配列
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ser Gln Phe Arg Val Ser Pro Leu Asp Arg Thr
20 25 30
Trp Asn Leu Gly Glu Thr Val Glu Leu Lys Cys Gln Val Leu Leu Ser
35 40 45
Asn Pro Thr Ser Gly Cys Ser Trp Leu Phe Gln Pro Arg Gly Ala Ala
50 55 60
Ala Ser Pro Thr Phe Leu Leu Tyr Leu Ser Gln Asn Lys Pro Lys Ala
65 70 75 80
Ala Glu Gly Leu Asp Thr Gln Arg Phe Ser Gly Lys Arg Leu Gly Asp
85 90 95
Thr Phe Val Leu Thr Leu Ser Asp Phe Arg Arg Glu Asn Glu Gly Tyr
100 105 110
Tyr Phe Cys Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe
115 120 125
Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
130 135 140
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
145 150 155 160
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
165 170 175
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
180 185 190
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His
195 200 205
Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val Lys Ser
210 215 220
Gly Asp Lys Pro Ser Leu Ser Ala Arg Tyr Val
225 230 235
【０１２７】配列番号：１３
配列の長さ：３０塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
配列
GCGAAGCTTT CAGTCAGCAT GATAGAAACA 30
【０１２８】配列番号：１４
配列の長さ：３０塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
配列
CGCTCTAGAT GTTCAGAGTT TGAGTAAGCC 30
【０１２９】配列番号：１５
配列の長さ：３９塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
配列
CGAAGCTTGG ATCCGAGGAG GTTGGACAAG ATAGAAGAT 39
【図１】ネズミｇｐ３９、ＴＮＦαおよびＴＮＦβに対
して相同性のヒトｇｐ３９のヌクレオチドおよび予測さ
れたアミノ酸配列を示す図である。ヌクレオチド配列
（配列番号：１）および翻訳されたオープンリーディン
グフレーム（配列番号：２）は左に番号が付されてい
る。潜在的なＮ−連鎖したグリコシル化部位はしるしが
付されており（ＣＨＯ）、予測されたトランスメンブレ
ンドメイン（ＴＭ）は下線が引かれており、そして予測
されたトランスメンブレンおよび細胞外のドメインの接
合部に位置するＡｒｇ残基は二重に下線が引かれてい
る。ヌクレオチドおよびアミノ酸の番号は左に記載され
ている。
して相同性のヒトｇｐ３９のヌクレオチドおよび予測さ
れたアミノ酸配列を示す図である。ヌクレオチド配列
（配列番号：１）および翻訳されたオープンリーディン
グフレーム（配列番号：２）は左に番号が付されてい
る。潜在的なＮ−連鎖したグリコシル化部位はしるしが
付されており（ＣＨＯ）、予測されたトランスメンブレ
ンドメイン（ＴＭ）は下線が引かれており、そして予測
されたトランスメンブレンおよび細胞外のドメインの接
合部に位置するＡｒｇ残基は二重に下線が引かれてい
る。ヌクレオチドおよびアミノ酸の番号は左に記載され
ている。
【図２】ヒトｇｐ３９（Ｈ−ｇｐ３９）（配列番号：
３）、ネズミｇｐ３９（Ｍ−ｇｐ３９）（配列番号：
４）、ヒトＴＮＦα（Ｈ−ＴＮＦα）（配列番号：５）
およびヒトＴＮＦβ（Ｈ−ＴＮＦβ）（配列番号：６）
の予測されたアミノ酸配列の整列を示す図である。少な
くとも３つのタンパク質が共有するアミノ酸はボックス
で示されている；タンパク質の少なくとも３つにより共
有されるアミノ酸は陰影を施されている。
３）、ネズミｇｐ３９（Ｍ−ｇｐ３９）（配列番号：
４）、ヒトＴＮＦα（Ｈ−ＴＮＦα）（配列番号：５）
およびヒトＴＮＦβ（Ｈ−ＴＮＦβ）（配列番号：６）
の予測されたアミノ酸配列の整列を示す図である。少な
くとも３つのタンパク質が共有するアミノ酸はボックス
で示されている；タンパク質の少なくとも３つにより共
有されるアミノ酸は陰影を施されている。
【図３】可溶性の組み換えヒトｇｐ３９およびＣＤ７
２，ｓｇｐ３９およびｓＣＤ７２の構造を示す図であ
る。ネズミＣＤ８の細胞外ドメインをコードするｃＤＮ
Ａ断片をｍｕ−ＣＤ８ ＥＣと表示する。ネズミＣＤ８
のアミノ末端の分泌シグナルの配列は斜線部で示されて
いる。ヒトｇｐ３９またはＣＤ７２の細胞外ドメインを
コードするｃＤＮＡ断片は、それぞれ、ｈｕ−ｇｐ３９
ＥＣおよびｈｕ−ＣＤ７２ ＥＣと表示されている。
ネズミＣＤ８およびヒトｇｐ３９（配列番号：７）（イ
タリック）またはＣＤ７２（配列番号：８）（イタリッ
ク）の細胞外ドメインの融合部位において予測されるア
ミノ酸配列は個々の線図の下に示されている。２つのｃ
ＤＮＡ断片の接合部に導入された残基は下線で示されて
いる。２つの遺伝子の接合部におけるユニークＢａｍＨ
Ｉ制限酵素の認識部位が示されている。
２，ｓｇｐ３９およびｓＣＤ７２の構造を示す図であ
る。ネズミＣＤ８の細胞外ドメインをコードするｃＤＮ
Ａ断片をｍｕ−ＣＤ８ ＥＣと表示する。ネズミＣＤ８
のアミノ末端の分泌シグナルの配列は斜線部で示されて
いる。ヒトｇｐ３９またはＣＤ７２の細胞外ドメインを
コードするｃＤＮＡ断片は、それぞれ、ｈｕ−ｇｐ３９
ＥＣおよびｈｕ−ＣＤ７２ ＥＣと表示されている。
ネズミＣＤ８およびヒトｇｐ３９（配列番号：７）（イ
タリック）またはＣＤ７２（配列番号：８）（イタリッ
ク）の細胞外ドメインの融合部位において予測されるア
ミノ酸配列は個々の線図の下に示されている。２つのｃ
ＤＮＡ断片の接合部に導入された残基は下線で示されて
いる。２つの遺伝子の接合部におけるユニークＢａｍＨ
Ｉ制限酵素の認識部位が示されている。
【図４】ＣＤ８−ｇｐ３９（レーン３および４）により
トランスフェクションしたＣＯＳ細胞又は代謝的に標識
したモック（レーン１および２）の上澄み液からの放射
線標識したタンパク質を、抗ネズミＣＤ８ｍＡｂ５３−
６（レーン１および３）またはＣＤ４０−Ｉｇ（レーン
２および４）とのそれらの相互作用に基づいて免疫沈澱
させ、そしてこのテキストに記載する還元性条件下にＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した電気泳動図であり図面に
代る写真である。示した質量（kDa ）の分子の質量標準
の電気泳動の移動度を左に示す。
トランスフェクションしたＣＯＳ細胞又は代謝的に標識
したモック（レーン１および２）の上澄み液からの放射
線標識したタンパク質を、抗ネズミＣＤ８ｍＡｂ５３−
６（レーン１および３）またはＣＤ４０−Ｉｇ（レーン
２および４）とのそれらの相互作用に基づいて免疫沈澱
させ、そしてこのテキストに記載する還元性条件下にＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した電気泳動図であり図面に
代る写真である。示した質量（kDa ）の分子の質量標準
の電気泳動の移動度を左に示す。
【図５】代謝的に標識したモック（レーン１〜４）およ
びＣＤ８−ＣＤ７２（レーン５〜８）トランスフェクシ
ョンしたＣＯＳ細胞の上澄み液からの放射線標識したタ
ンパク質を、抗ネズミｍＡｂ５３．６（レーン１および
５）、抗ＣＤ７２ｍＡｂＪ３Ｉ０１（レーン２および
６）、抗ＣＤ７２ｍＡｂＢＵ４１（レーン３および７）
およびＣＤ４０−Ｉｇ（レーン４および８）とのそれら
の反応性に基づいて回収し、そしてこの明細書に記載す
る還元性条件下にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した電気
泳動図であり、図面に代る写真である。示した質量（kD
a ）の分子の質量標準的電気泳動の移動度を左に示す。
びＣＤ８−ＣＤ７２（レーン５〜８）トランスフェクシ
ョンしたＣＯＳ細胞の上澄み液からの放射線標識したタ
ンパク質を、抗ネズミｍＡｂ５３．６（レーン１および
５）、抗ＣＤ７２ｍＡｂＪ３Ｉ０１（レーン２および
６）、抗ＣＤ７２ｍＡｂＢＵ４１（レーン３および７）
およびＣＤ４０−Ｉｇ（レーン４および８）とのそれら
の反応性に基づいて回収し、そしてこの明細書に記載す
る還元性条件下にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した電気
泳動図であり、図面に代る写真である。示した質量（kD
a ）の分子の質量標準的電気泳動の移動度を左に示す。
【図６】トランスフェクションしたＣＯＳ細胞へのｓｇ
ｐ３９またはＣＤ４０−Ｉｇの結合を示す、生物の形態
を表わす図面に代る写真である。ｇｐ３９（Ａおよび
Ｂ）またはＣＤ４０（Ｃ〜Ｆ）ｃＤＮＡ発現プラスミド
でトランスフェクションしたＣＯＳ細胞を、このテキス
トに記載するように、可溶性組み換えＣＤ４０（Ａおよ
びＢ）、または可溶性組み換えｇｐ３９（Ｃおよび
Ｄ）、または抗ＣＤ４０ｍＡｂＧ２８−５（Ｅおよび
Ｆ）に結合するそれらの能力について検査した。代表的
なフィールドの相（Ａ，ＣおよびＥ）および蛍光性
（Ｂ，ＤおよびＦ）画像が示されている。
ｐ３９またはＣＤ４０−Ｉｇの結合を示す、生物の形態
を表わす図面に代る写真である。ｇｐ３９（Ａおよび
Ｂ）またはＣＤ４０（Ｃ〜Ｆ）ｃＤＮＡ発現プラスミド
でトランスフェクションしたＣＯＳ細胞を、このテキス
トに記載するように、可溶性組み換えＣＤ４０（Ａおよ
びＢ）、または可溶性組み換えｇｐ３９（Ｃおよび
Ｄ）、または抗ＣＤ４０ｍＡｂＧ２８−５（Ｅおよび
Ｆ）に結合するそれらの能力について検査した。代表的
なフィールドの相（Ａ，ＣおよびＥ）および蛍光性
（Ｂ，ＤおよびＦ）画像が示されている。
【図７】ｓｇｐ３９／ＣＤ４０−Ｉｇの相互作用の特性
決定を示すグラフである。増加する濃度のＣＤ４０−Ｉ
ｇ（０．６μｇ／ml→２０μｇ／ml）および対照免疫グ
ロブリンの融合タンパク質、Ｌｅｕ８−Ｉｇ（０．６μ
ｇ／ml→２０μｇ／ml）が固定化されたｓｇｐ３９に結
合する能力を、この明細書に記載するようにＥＬＩＳＡ
により検査した。同様に、増加する濃度のＣＤ４０−Ｉ
ｇが固定化された対照の融合タンパク質ｓＣＤ７２に結
合する能力を、また、同一の方法で検査した。両者の場
合において、このテキストに記載するように抗ネズミＣ
Ｄ８ｍＡｂ５３−６で前以て被覆したプラスチック上に
ｓｇｐ３９およびｓＣＤ７２を固定化した。
決定を示すグラフである。増加する濃度のＣＤ４０−Ｉ
ｇ（０．６μｇ／ml→２０μｇ／ml）および対照免疫グ
ロブリンの融合タンパク質、Ｌｅｕ８−Ｉｇ（０．６μ
ｇ／ml→２０μｇ／ml）が固定化されたｓｇｐ３９に結
合する能力を、この明細書に記載するようにＥＬＩＳＡ
により検査した。同様に、増加する濃度のＣＤ４０−Ｉ
ｇが固定化された対照の融合タンパク質ｓＣＤ７２に結
合する能力を、また、同一の方法で検査した。両者の場
合において、このテキストに記載するように抗ネズミＣ
Ｄ８ｍＡｂ５３−６で前以て被覆したプラスチック上に
ｓｇｐ３９およびｓＣＤ７２を固定化した。
【図８】表面結合したｇｐ３９によるヒトＢ細胞の活性
化を示すグラフである。ｇｐ３９を発現するＣＯＳ細胞
（ｇｐ３９−ＣＯＳ）またはモックトランスフェクショ
ンしたＣＯＳ細胞（モックＣＯＳ）が休止するヒト末梢
血液のＢ細胞の増殖を単独であるいは抗ネズミＣＤ８ｍ
ＡｂＩＦ５（＋ＩＦ５）またはＰＭＡ（＋ＰＭＡ）の存
在下に、ＣＤ４０−Ｉｇの不存在下（充実のバー、単
独）または存在下（陰影を施したバー、＋ＣＤ４０−Ｉ
ｇ）に刺激する能力を、このテキストに記載するように
検査し、そして〔 3Ｈ〕−チミジンの組み込みにより評
価した。
化を示すグラフである。ｇｐ３９を発現するＣＯＳ細胞
（ｇｐ３９−ＣＯＳ）またはモックトランスフェクショ
ンしたＣＯＳ細胞（モックＣＯＳ）が休止するヒト末梢
血液のＢ細胞の増殖を単独であるいは抗ネズミＣＤ８ｍ
ＡｂＩＦ５（＋ＩＦ５）またはＰＭＡ（＋ＰＭＡ）の存
在下に、ＣＤ４０−Ｉｇの不存在下（充実のバー、単
独）または存在下（陰影を施したバー、＋ＣＤ４０−Ｉ
ｇ）に刺激する能力を、このテキストに記載するように
検査し、そして〔 3Ｈ〕−チミジンの組み込みにより評
価した。
【図９】ｓｇｐ３９によるヒト末梢血液のＢ細胞の活性
化を示すグラフである。可溶性組み換えｇｐ３９（ｓｇ
ｐ３９、陰影を施したバー）または対照の組み換え融合
タンパク質（ｓＣＤ７２、充実のバー）が休止するヒト
末梢血液のＢ細胞の増殖を単独であるいは抗ＣＤ２０ｍ
ＡｂＩＦ５（＋ＩＦ５）またはＰＭＡ（＋ＰＭＡ）と組
み合わせて刺激する能力を、このテキストに記載するよ
うに検査し、〔 3Ｈ〕−チミジンの組み込みにより評価
し、そして同等の時間の間に外因性刺激因子の不存在下
に（細胞単独、白抜きのバー）、あるいはＩＦ５単独ま
たはＰＭＡ単独の存在下に（白抜きのバー）インキュベ
ーションしたＢ細胞のそれと比較した。
化を示すグラフである。可溶性組み換えｇｐ３９（ｓｇ
ｐ３９、陰影を施したバー）または対照の組み換え融合
タンパク質（ｓＣＤ７２、充実のバー）が休止するヒト
末梢血液のＢ細胞の増殖を単独であるいは抗ＣＤ２０ｍ
ＡｂＩＦ５（＋ＩＦ５）またはＰＭＡ（＋ＰＭＡ）と組
み合わせて刺激する能力を、このテキストに記載するよ
うに検査し、〔 3Ｈ〕−チミジンの組み込みにより評価
し、そして同等の時間の間に外因性刺激因子の不存在下
に（細胞単独、白抜きのバー）、あるいはＩＦ５単独ま
たはＰＭＡ単独の存在下に（白抜きのバー）インキュベ
ーションしたＢ細胞のそれと比較した。
【図１０】ｓｇｐ３９による密なヒト扁桃Ｂ細胞の活性
化を示すグラフである。可溶性組み換えｇｐ３９（ｓｇ
ｐ３９、陰影を施したバーおよび充実のバー）が検出可
能の増殖を単独であるいは抗ＣＤ２０ｍＡｂＩＦ５（＋
ＩＦ５）またはＰＭＡ（＋ＰＭＡ）と組み合わせて刺激
する能力を、このテキストに記載するように検査し、〔
3Ｈ〕−チミジンの組み込みにより評価し、そして単独
で（細胞単独、白抜きのバー）あるいはＩＦ５単独また
はＰＭＡ単独の存在下に（白抜きのバー）インキュベー
ションしたＢ細胞のそれと比較した。ｓｇｐ３９推進し
たＢ細胞の活性化をブロックするＣＤ４０−Ｉｇ（充実
のバー）能力を２０mg／mlの濃度（Ａ）で検査し、そし
て等しい濃度の無関係の免疫グロブリンの融合タンパク
質、Ｌｅｕ−８−Ｉｇ（充実のバー、Ｂ）と比較した。
化を示すグラフである。可溶性組み換えｇｐ３９（ｓｇ
ｐ３９、陰影を施したバーおよび充実のバー）が検出可
能の増殖を単独であるいは抗ＣＤ２０ｍＡｂＩＦ５（＋
ＩＦ５）またはＰＭＡ（＋ＰＭＡ）と組み合わせて刺激
する能力を、このテキストに記載するように検査し、〔
3Ｈ〕−チミジンの組み込みにより評価し、そして単独
で（細胞単独、白抜きのバー）あるいはＩＦ５単独また
はＰＭＡ単独の存在下に（白抜きのバー）インキュベー
ションしたＢ細胞のそれと比較した。ｓｇｐ３９推進し
たＢ細胞の活性化をブロックするＣＤ４０−Ｉｇ（充実
のバー）能力を２０mg／mlの濃度（Ａ）で検査し、そし
て等しい濃度の無関係の免疫グロブリンの融合タンパク
質、Ｌｅｕ−８−Ｉｇ（充実のバー、Ｂ）と比較した。
【図１１】ネズミＣＤ８のアミノ酸（配列番号：１０）
および核酸配列（配列番号：９）を示す図である。
および核酸配列（配列番号：９）を示す図である。
【図１２】ヒトＣＤ８のアミノ酸（配列番号：１２）お
よび核酸配列（配列番号：１１）を示す図である。
よび核酸配列（配列番号：１１）を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ０７Ｋ 14/725 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ
Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
15/09 5/00 Ｅ
// Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02
(72)発明者 ダイアン ホレンバーフ
アメリカ合衆国，ワシントン 98117,
シアトル，トゥエルブス アベニュ ノ
ース ウエスト 9612
(72)発明者 ジェフリー エー．レドベター
アメリカ合衆国，ワシントン 98177,
シアトル，ノース ウエスト ワンハン
ドレットアンドサーティーンス プレイ
ス 306
(56)参考文献 特表 平７−504083（ＪＰ，Ａ)
Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．357，Ｎｏ.
6373（1992．Ｍａｙ）ｐ．80−82
Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．356，Ｎｏ.
6371（1992．Ａｐｒ．）ｐ．718−720
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏ
ｌ．22，Ｎｏ．８（1992．Ａｕｇ．)
ｐ．2071−2076
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (33)
- 【請求項１】 （ａ）配列番号：２の47位のアミノ酸〜
261位のアミノ酸のアミノ酸配列又はこのアミノ酸配列
において１個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び/又は
他のアミノ酸による置換により修飾されており且つタイ
プＩ膜タンパク質 CD8 の細胞外ドメインと共に B −細胞増
殖促進活性を維持しているアミノ酸配列並びに（ｂ）タ
イプＩ膜タンパク質CD8の細胞外ドメインを有するタン
パク質。 - 【請求項２】 （ａ）配列番号：２の47位のアミノ酸〜
261位のアミノ酸のアミノ酸配列及び（ｂ）タイプＩ膜
タンパク質CD8の細胞外ドメインを有するタンパク質。 - 【請求項３】 アメリカン・タイプカルチュア・コレク
ションにATCC 69049として寄託されているプラスミドCD
M7B-MC1061/p3-shgp39の発現により生産される、請求項
２に記載のタンパク質。 - 【請求項４】 （ａ）配列番号：２の47位のアミノ酸〜
261位のアミノ酸のアミノ酸配列又はこのアミノ酸配列
において１個〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び/又は
他のアミノ酸による置換により修飾されており且つタイ
プＩ膜タンパク質 CD8 の細胞外ドメインと共に B −細胞増
殖促進活性を維持しているアミノ酸配列並びに（ｂ）タ
イプＩ膜タンパク質CD8の細胞外ドメインを有するタン
パク質をコードする核酸。 - 【請求項５】 （ａ）配列番号：２の47位のアミノ酸〜
261位のアミノ酸のアミノ酸配列及び（ｂ）タイプＩ膜
タンパク質CD8の細胞外ドメインを有するタンパク質を
コードする請求項４に記載の核酸。 - 【請求項６】 （ａ）配列番号：１の160位のヌクレオ
チド〜787位のヌクレオチド配列及び（ｂ）タイプＩ膜
タンパク質CD8の細胞外ドメインを有するタンパク質を
コードするヌクレオチド配列を有する請求項５に記載の
核酸。 - 【請求項７】 アメリカン・タイプカルチュア・コレク
ションにATCC 69049として寄託されているプラスミドCD
M7B-MC1061/p3-shgp39に含まれる、請求項６に記載の核
酸。 - 【請求項８】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の少
なくとも１種のタンパク質に、活性化されたB-細胞を暴
露することを含んで成る、生体外でB-細胞の増殖を促進
する方法。 - 【請求項９】 （ｉ）請求項１〜３のいずれか１項に記
載の少なくとも１種のタンパク質及び（ii）共刺激物質
に、B-細胞を暴露することを含んで成る、生体外でB-細
胞の増殖を促進する方法。 - 【請求項１０】 前記共刺激物質が、抗−免疫グロブリ
ン抗体である、請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】 前記共刺激物質が、B-細胞抗原に向け
られた抗体である、請求項９に記載の方法。 - 【請求項１２】 前記B-細胞抗原がCD20である、請求項
11に記載の方法。 - 【請求項１３】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の
少なくとも１種のタンパク質を含んで成る免疫応答増強
剤。 - 【請求項１４】 （ｉ）請求項１〜３のいずれか１項に
記載の少なくとも１種のタンパク質及び（ii）共刺激物
質に、B-細胞を暴露することを含んで成る、生体外でB-
細胞の分化を促進する方法。 - 【請求項１５】 前記共刺激物質が、抗−免疫グロブリ
ン抗体である、請求項14に記載の方法。 - 【請求項１６】 前記共刺激物質が、B-細胞抗原に向け
られた抗体である、請求項14に記載の方法。 - 【請求項１７】 前記B-細胞抗原がCD20である、請求項
16に記載の方法。 - 【請求項１８】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の
タンパク質に、CD40を担持する細胞を暴露することを含
んで成る、生体外で前記細胞の増殖を促進する方法。 - 【請求項１９】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の
タンパク質に、CD40を担持する細胞を暴露することを含
んで成る、生体外で前記細胞の分化を促進する方法。 - 【請求項２０】 請求項１〜３いずれか１項に記載の少
なくとも１種のタンパク質を含んで成る、B-細胞増殖促
進剤。 - 【請求項２１】 共刺激物質を更に含んで成る、請求項
20に記載のB-細胞増殖促進剤。 - 【請求項２２】 前記共刺激物質が、抗−免疫グロブリ
ン抗体である、請求項21に記載のB-細胞増殖促進剤。 - 【請求項２３】 前記共刺激物質が、B-細胞抗原に向け
られた抗体である、請求項21に記載のB-細胞増殖促進
剤。 - 【請求項２４】 前記B-細胞抗原がCD20である、請求項
23に記載のB-細胞増殖促進剤。 - 【請求項２５】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の
少なくとも１種のタンパク質を含んで成る、B-細胞分化
促進剤。 - 【請求項２６】 共刺激物質を更に含んで成る、請求項
25に記載のB-細胞分化促進剤。 - 【請求項２７】 前記共刺激物質が、抗−免疫グロブリ
ン抗体である、請求項26に記載のB-細胞分化促進剤。 - 【請求項２８】 前記共刺激物質が、B-細胞抗原に向け
られた抗体である、請求項26に記載のB-細胞分化促進
剤。 - 【請求項２９】 前記B-細胞抗原がCD20である、請求項
28に記載のB-細胞分化促進剤。 - 【請求項３０】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の
タンパク質を含んで成る、CD40を担持する細胞の増殖及
び/又は分化促進剤。 - 【請求項３１】 前記細胞が肉腫細胞である、請求項30
に記載の増殖及び/又は分化促進剤。 - 【請求項３２】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の
少なくとも１種のタンパク質に活性化されたＢ細胞を暴
露することを含んで成る、生体外でＢ−細胞の分化を促
進する方法。 - 【請求項３３】 前記Ｂ細胞が肉腫細胞である、請求項
32 に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US940605 | 1992-09-04 | ||
| US07/940,605 US5540926A (en) | 1992-09-04 | 1992-09-04 | Soluble and its use in B cell stimulation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06315383A JPH06315383A (ja) | 1994-11-15 |
| JP3529815B2 true JP3529815B2 (ja) | 2004-05-24 |
Family
ID=25475138
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24358193A Expired - Lifetime JP3529815B2 (ja) | 1992-09-04 | 1993-09-06 | Ｃｄ４０のための可溶性リガンド |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5540926A (ja) |
| EP (1) | EP0585943B1 (ja) |
| JP (1) | JP3529815B2 (ja) |
| KR (1) | KR100319126B1 (ja) |
| AT (1) | ATE163195T1 (ja) |
| AU (1) | AU677788B2 (ja) |
| CA (1) | CA2105552C (ja) |
| DE (1) | DE69316948T2 (ja) |
| DK (1) | DK0585943T3 (ja) |
| ES (1) | ES2113980T3 (ja) |
| FI (1) | FI113969B (ja) |
| GR (1) | GR3026100T3 (ja) |
| HU (1) | HU215949B (ja) |
| IL (1) | IL106896A (ja) |
| NO (1) | NO311808B1 (ja) |
| NZ (1) | NZ248569A (ja) |
| ZA (1) | ZA936491B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| WO1993008207A1 (en) * | 1991-10-25 | 1993-04-29 | Immunex Corporation | Novel cytokine |
| US5961974A (en) * | 1991-10-25 | 1999-10-05 | Immunex Corporation | Monoclonal antibodies to CD40 ligand, pharmaceutical composition comprising the same and hybridomas producing the same |
| US5962406A (en) * | 1991-10-25 | 1999-10-05 | Immunex Corporation | Recombinant soluble CD40 ligand polypeptide and pharmaceutical composition containing the same |
| US5397703A (en) | 1992-07-09 | 1995-03-14 | Cetus Oncology Corporation | Method for generation of antibodies to cell surface molecules |
| US5540926A (en) * | 1992-09-04 | 1996-07-30 | Bristol-Myers Squibb Company | Soluble and its use in B cell stimulation |
| DE69433399T2 (de) * | 1993-01-22 | 2004-10-14 | Immunex Corp., Seattle | Detektion und behandlung von mutationen in einem gen für einen cd40-liganden |
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| DK0721346T3 (da) * | 1993-09-02 | 1999-03-22 | Dartmouth College | Fremgangsmåde til induktion af antigenspecifik T-celletolerance |
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