KR20000022445A - 수상돌기 세포의 활성화 방법 - Google Patents

수상돌기 세포의 활성화 방법 Download PDF

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유진 마라스코프스키
힐러리 제이. 맥케나
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크리스토퍼 엘. 와이트, 스코트 지. 홀퀴스트, 스티븐 엘. 말라스카
임뮤넥스 코포레이션
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Abstract

본 명세서에서는 항원을 발현하는 활성화된 수상돌기 세포가 개시되어 있다. 상기와 같은 수상돌기 세포는 T 세포에 종양, 바이러스 또는 박테리아 항원을 제시하기 위하여 사용되고 백신 접종 프로토콜에 유용할 수 있다. 다른 사이토카인들이 활성화된, 항원 펄싱된 수상돌기 세포와 별개로, 이 세포에 이어서 또는 이 세포와 조합되어 동시에 사용될 수 있다. 본 명세서에서는 또한 항원을 발현하는 활성화된 수상돌기 세포를 사용하여 면역 응답을 자극하는 방법이 개시되어 있다.

Description

수상돌기 세포의 활성화 방법
백신 접종은 감염성 질병으로부터 사망 또는 장애를 방지하는 유효한 방법이다. 감염성 질병 분야에서의 상기 방법의 성공은 또한 종양성 질병의 치료 또는 예방에 있어서의 백신 접종법을 사용하는 것에 대한 관심을 불러일으켰다. 그러나 백신의 사용으로 성취된 성공에도 불구하고 백신 개발 분야에서는 여전히 많은 문제가 있다. 비경구 투여 루트, 상이한 백신 접종의 필요한 수 및 추가 항원 자극 면역화의 필요성 및 빈도 모두는 질병을 제어하거나 제거하려는 노력을 방해한다.
상기와 같은 한 어려움은 항원에 있어서의 면역원성의 결핍이다 (즉, 항원이 병원균에 대한 효과적인 면역 응답을 촉진할 수 없음). 또한 특정 항원은 단지 특정 형태의 면역 응답, 예를 들어 세포 매개성 응답 또는 체액성 응답만을 유도할 수 있다. 보조약은 면역 응답을 증강시키거나, 증대시키거나 또는 가능하게 하는 물질이고 몇몇 경우 다른 것에 우선하여 한 형태의 면역 응답을 촉진시키는데 사용될 수 있다. 다수의 백신 보조약이 공지되어 있다 해도 명반이 사람에 있어서 광범위하게 사용되는 유일한 보조약이다.
수상돌기 세포는 특유의 형태 및 광범한 조직 분포를 갖는 이종성 세포 집단이다 (스타인만 (Steinman, R.M.)의 문헌 [Annu. Rev. Immunol., 9: 271-296, 1991] 참조). 수상돌기 세포는 "전문적인" 항원 제시 세포로서 칭해지고 MHC-제한 T 세포를 감작시키는 고도의 역량을 갖는다. 따라서 종양 또는 감염성 질병 백신 보조약으로서 엑스 비보 (ex vivo)에서 수상돌기 세포를 사용하는 것에 대한 관심이 증가되고 있다 (예를 들어 로마니 (Romani) 등의 문헌 [J. Exp. Med., 180: 83, 1994] 참조). 따라서 수상돌기 세포의 면역 응답 자극 능력을 증강시키는 약제가 일반적으로 중요하다.
발명의 요약
본 발명은 수상돌기 세포를 활성화시켜 그의 항원 제시 역량을 증강시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 활성화된 항원 제시 수상돌기 세포는 백신 보조약으로서 유용하다.
본 발명은 또한 엑스 비보에서 다량의 항원 제시 수상돌기 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 개인의 CD34＋조혈 프로제니터 (progenitor) 및 스템 (stem) 세포의 수집 후, 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자 (granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF)) 및 flt-3 리간드 (flt3-L)와 같은 사이토카인을 사용하여 시험관 내에서 세포를 확장시키고 상기 세포가 수상돌기 세포 계통의 세포로 분화되게 할 수 있다. 또한 사이토카인을 사용하여 수집 직전에 순환계에서의 CD34＋세포의 수를 증가시킬 수도 있다. 생성된 수상돌기 세포는 면역 응답이 유도되기를 원하는 항원에 노출시키고, 항원이 처리되게 한다 (이 방법은 때로 당 업계에서 "항원 펄싱 (pulsing)"으로 칭해짐). 이어서 항원 펄싱된 (또는 항원 표현) 수상돌기 세포는 CD40 결합 단백질로 활성화되고 그 후 개인에게 투여된다.
항원을 제시하는 수상돌기 세포의 다른 제조 방법은 항원 또는 그로부터 유래된 특정 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로 수상돌기 세포를 트랜스팩션시키는 것이다. 일단 수상돌기 세포가 MHC 환경에서 이 항원을 발현하면, 수상돌기 세포는 CD40 결합 단백질로 활성화되고, 그 후 개인에게 투여되어 항원에 대하여 더 강하고 향상된 면역 응답을 제공한다.
활성화된 항원 제시 수상돌기 세포는 또한 백신 보조약으로서 사용될 수 있고 항원 투여 전에, 항원 투여와 동시에 또는 항원 투여 후에 투여될 수 있다. 또한 수상돌기 세포는 면역 응답을 조절하는 사이토카인, 예를 들어 CD40 결합 단백질 (즉, 용해성 CD40L) 또는 용해성 CD83 분자의 투여 직전에, 투여와 동시에 또는 투여 후에 개인에게 투여될 수 있다. 추가의 유용한 사이토카인으로는 인터루킨 (IL) 1, 2, 4, 5, 6, 7, 10, 12 및 15, 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어 GM-CSF, 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF) 또는 GM-CSF/IL-3 융합 단백질, 또는 다른 사이토카인, 예를 들어 TNF-α 또는 c-kit 리간드가 있지만, 그에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 사이토카인의 생물학적으로 활성인 유도체, 및 그의 조합물이 또한 유용하다.
본 발명은 또한 항원 특이 T 세포의 엑스 비보에서의 제법을 제공한다. 상기의 엑스 비보에서의 다수의 항원 제시 수상돌기 세포의 제조 방법에 따라, 수집된 항원 제시 수상돌기 세포를 사용하여 개인으로부터 수집된 자연 T 세포로부터 항원 특이 T 세포를 생성시킨다. 항원을 생성된 T 세포에 적절하게 제시한 후 항원 특이 T 세포를 개인에게 투여할 수 있다.
본 발명은 수상돌기 세포의 활성화 인자, 생체 내에서의 림프구 매개 면역 응답의 증강 방법, 및 세포성 면역 응답 및 체액성 면역 응답의 촉진에 유용한 수상돌기 세포 집단에 관한 것이다.
도 1은 실시예 3에 기술된 바와 같이 MLR (혼합 림프구 반응)에서 수상돌기 세포를 사용하기 전에 상기 세포를 CD40L과 함께 인큐베이션시키면 이 수상돌기 세포가 T 세포의 증식을 자극하는 능력을 약 3배 증가시킨다는 것을 증명하는, 알로-항원 T 세포 증식 분석의 결과를 나타낸다.
도 2는 실시예 4에 기술된 바와 같이 CD40L과 함께 배양된 수상돌기 세포가 CD40L에 노출되지 않은 수상돌기 세포보다 항원 특이 T 세포에 대한 항원 제시에 있어서 덜 효과적이라는 것을 예시한다.
도 3은 실시예 5에 나타낸 바와 같이 항원으로 먼저 펄싱되고 이어서 CD40L과 함께 배양된 수상돌기 세포가 항원으로 펄싱되었지만 CD40L에는 노출되지 않은 수상돌기 세포보다 항원 특이 T 세포에 대한 항원 제시에 있어서 더 효과적이라는 것을 증명한다.
본 발명은 항원 펄싱된 수상돌기 세포를 활성화시키는 CD40L의 용도에 관한 것이다. 활성화는 림프구 세포에 대하여 항원을 제시하는 수상돌기 세포의 능력을 증강시키고, 따라서 항원에 대한 면역 응답을 증대시킨다. 본 발명의 다른 실시 형태는 백신 보조약으로서 활성화된, 항원 펄싱된 수상돌기 세포를 단리시키고 사용하는 것이다. 활성화된, 항원 펄싱된 수상돌기 세포는 또한 엑스 비보에서 사용되어 항원 특이 T 세포를 생성시킬 수 있다.
수상돌기 세포
수상돌기 세포는 특유의 형태를 갖고 조직 분포가 광범위한 이종성 세포 집단을 포함한다. 수상돌기 세포 시스템 및 면역성에서의 그의 역할은 본 명세서에 참고 문헌으로 채택된 스타인만의 문헌 [Annu. Rev. Immunol., 9: 271-296 (1991)]에 기술되어 있다. 수상돌기 세포의 세포 표면은 진귀한, 독특한 베일상 돌기를 가지며 세포 표면 마커인 CD1a＋, CD4＋, CD86＋, 또는 HLA-DR＋를 갖는 것이 특징이다. 수상돌기 세포는 MHC 제한 T 세포를 감작시키는데 있어서 큰 역량을 가지며 T 세포 발달 및 내성 동안의 자가 항원 및 면역 동안의 외래 항원 모두를 T 세포에 원위치에서 제시함에 있어서 매우 효과적이다.
항원 제시에 있어서의 유효성 때문에 엑스 비보에서 종양 또는 감염성 질병 백신 보조약으로서 수상돌기 세포를 사용하는 것에 대한 관심이 증가하고 있다 (예를 들어 로마니 (Romani) 등의 문헌 [J. Exp. Med., 180: 83 (1994)] 참조). 면역자극제로서 수상돌기 세포를 사용하는 것은 말초 혈액에서의 낮은 수상돌기 세포 빈도, 한정된 임파 기관에 대한 접근성 및 수상돌기 세포의 최종 분화 상태 때문에 제한되어 왔다. 수상돌기 세포는 CD34＋골수 또는 말초 혈액 프로제니터 및 말초 혈액 단핵 세포로부터 생기며, 수상돌기 세포의 증식 및 성숙은 사이토카인인 GM-CSF (사그라모스팀 (sargramostim), 류카인 (Leukine, 등록상표), 미국 워싱톤주 시애틀 소재의 Immunex Corporation사), TNF-α, c-kit 리간드 (스템 세포 인자 (SCF), 스틸 인자 (steel factor, SF), 또는 마스트 세포 성장 인자 (MGF)로서도 또한 공지됨) 및 인터루킨-4에 의해 증강될 수 있다. 최근에 flt3-L은 생체 내 및 시험관 내 모두에서 다수의 기능적으로 성숙한 수상돌기 세포의 생성을 자극하는 것으로 밝혀졌다 (1995년 10월 4일에 출원된 미국 특허 제08/539,142호).
엑스 비보에서의 수상돌기 세포의 배양
조혈 스템 세포 및 프로제니터 세포의 엑스 비보에서의 확장 방법은 본 명세서에 참고 문헌으로 채택된 미국 특허 제5,199,942호에 기술되어 있다. 다른 적당한 방법이 당 업계에 공지되어 있다. 간단히 말해서 엑스 비보에서의 배양 및 확장은 (1) 환자의 말초 혈액 채취물 또는 골수 이식편으로부터 CD34＋조혈 스템 세포 및 프로제니터 세포를 수집하고; (2) 상기 세포를 엑스 비보에서 확장시키는 것을 포함한다. 상기 미국 특허 제5,199,942호에 기술되어 있는 세포 성장 인자 외에도, flt3-L, IL-1, IL-3 및 c-kit 리간드와 같은 다른 인자를 사용할 수 있다.
CD34 마커를 갖는 스템 세포 또는 프로제니터 세포는 골수에서 단핵 세포의 약 1% 내지 3%만을 구성한다. 말초 혈액에서의 CD34＋스템 세포 또는 프로제니터 세포의 양은 골수 세포에서보다 약 10 내지 100배 더 적다. flt3-L과 같은 사이토카인을 사용하여 생체 내에서 수상돌기 세포의 수를 증가 또는 동원시킬 수 있다. 개인의 수상돌기 세포의 양이 증가되면 환자 내에 이미 존재하는 항원(들), 예를 들어 종양 항원, 또는 박테리아 또는 바이러스 항원에 있어서 T 세포에 대한 항원 제시가 촉진될 수 있다. 별법으로, 면역화를 목적으로 하여 개인에게 항원 투여 전에, 항원 투여와 동시에 또는 항원 투여 후에 사이토카인을 투여할 수 있다.
말초 혈액 세포는 당 업계에 공지되어 있는 분리반출법을 사용하여 수집된다 (예를 들어 비숍 (Bishop) 등의 문헌 [Blood, 제83권, 제2호, 610 내지 616페이지 (1994년)]을 참조). 간단히 말해서 말초 혈액 프로제니터 세포 (PBPC) 및 말초 혈액 스템 세포 (PBSC)는 통상의 장치, 예를 들어 헤모네틱스 모델 (Haemonetics Model) V50 분리반출 장치 (미국 매사추세츠주 브레인트리 소재의 Haemonetics사 제품)를 사용하여 수집된다. 4시간 동안의 수집을 일반적으로 단지 주 당 5회 수행하여 약 6.5 x 108개의 단핵 세포 (MNC)/kg을 수집한다. 이 세포를 표준 배지에 현탁시키고 이어서 원심분리하여 적혈구 세포 및 호중구를 제거한다. 2상 사이의 경계면에 위치하는 세포 (담황갈색의 코트)를 회수하여 HBSS에 재현탁시킨다. 재현탁된 세포는 주로 단핵세포이고 상당한 부분의 세포 혼합물은 초기 스템 세포이다.
세포 집단으로부터 CD34＋조혈 스템 세포 또는 프로제니터 세포를 동정 및 분리하기 위한 다양한 세포 선발 기술이 공지되어 있다. 예를 들어 단일클론 항체 (또는 다른 특정 세포 결합 단백질)가 스템 세포 또는 프로제니터 세포 상에서 발견되는 마커 단백질 또는 표면 항원 단백질에 대한 결합용으로 사용될 수 있다. 따라서 특정 결합 단백질과 마찬가지로 조혈 스템 세포의 상기와 같은 여러 마커 또는 세포 표면 항원 (즉, flt-3, CD34, My-10, 및 Thy-1)이 당 업계에 공지되어 있다 (예를 들어 1995년 10월 4일에 출원된 미국 특허 제08/539,142호 참조).
한 방법에 있어서, 항체 또는 결합 단백질을 표면, 예를 들어 유리 비드 또는 플라스크, 자성 비드, 또는 적당한 크로마토그래피 수지에 고정시키고, 세포 집단과 접촉시킨다. 이어서 스템 세포를 비드 매트릭스에 결합시킨다. 별법으로, 결합 단백질을 세포 혼합물과 함께 인큐베이션시키고 생성된 결합물을 항체-세포 복합체에 대하여 친화성을 갖는 표면과 접촉시킨다. 원하지 않는 세포 및 세포 물질을 제거하여 비교적 순수한 스템 세포 집단을 제공한다. 특정 세포 결합 단백질은 또한 형광성 표지물, 예를 들어 크로모포어 또는 플루오로포어를 사용하여 표지시킬 수 있고, 표지된 세포는 분류함으로써 분리한다. 바람직하게는 면역친화성 칼럼으로 단리시킨다.
면역친화성 칼럼은 임의의 형태를 취할 수 있지만, 일반적으로 패킹된 베드 반응기를 포함한다. 상기 생물반응기 내의 패킹된 베드는 바람직하게는 실질적으로 기재가 균일하게 코팅된 다공성 재료로 만들어진다. 높은 표면적 대 부피 비를 제공하는 다공성 재료는 세포 혼합물이 큰 접촉 면적에 걸쳐 유동되게 하는 반면, 베드 외부로의 세포의 유동은 저해하지 않게 한다. 기재는 그 자체의 특성에 의해, 또는 화학적 잔기의 첨가에 의해 세포 결합 단백질 상에서 발견되는 잔기에 대하여 큰 친화성을 나타내야 한다. 전형적인 기재로는 아비딘 및 스트렙타비딘이 있지만 다른 통상적인 기재가 사용될 수 있다.
유용한 한 방법에 있어서, 분리할 세포 상의 세포 표면 항원을 인지하는 단일클론 항체는 일반적으로 더 변경되어 바이오틴 잔기를 제시한다. 상기에 의해 아비딘에 대한 바이오틴의 친화성은 패킹된 베드의 표면에 대하여 단일클론 항체가 제거적으로 안정하게 한다 (베렌슨 (Berenson) 등의 문헌 [J. Immunol. Meth., 91: 11, 1986)] 참조). 패킹된 베드는 세척하여 비결합 물질을 제거하고 표적 세포는 통상의 방법을 사용하여 방출시킨다. 아비딘이 코팅된 패킹된 베드에 대하여 안정한 바이오티닐화 항-CD34 단일클론 항체를 사용하는 상기 형태의 면역친화성 칼럼은 예를 들어 국제 특허 출원 공개 제WO 93/08268호에 기술되어 있다.
침묵 (quiescent) 스템 세포를 선발하는 별법은 5-플루오로우라실 (5-FU)와 같은 대사길항 물질 또는 4-히드록시시클로포스파미드 (4-HC)와 같은 알킬화제를 사용하여 더 계통화되기 쉬운 분열 세포 형태에서 세포 사멸을 유도하는 것이다. 비침묵 세포는 스템 세포 상에는 거의 영향을 미치지 않거나 전혀 영향을 미치지 않는 성장 인자를 첨가함으로써 자극하여 증식 및 분화시킴으로써 비스템 세포가 증식 및 분화되게 하고 이 세포가 5-FU 또는 4-HC의 세포파괴 효과에 대하여 더 취약성을 갖도록 한다 (본 명세서에 참고 문헌으로 채택된 베라르디 (Berardi) 등의 문헌 [Science, 267: 104 (1995)] 참조).
단리한 스템 세포를 조절된 등급의 냉동기에서 냉동시키고 (예를 들어 Cryo-Med, 미국 매사추세츠주 마운트 클레멘스 소재), 이어서 저온보호제로서 디메틸술폭시드를 사용하여 액체 질소의 증기 상에서 저장할 수 있다. 수상돌기 세포 (신선한 것 또는 냉동된 것)의 성장 및 배양을 위하여 혈청이 고갈된 배지 또는 혈청 기재 배지를 포함하는 다양한 성장 및 배양 배지를 사용할 수 있다. 유용한 성장 배지로는 RPMI, TC 199, 이스코베스 (Iscoves) 개질 둘베코 (Dulbecco) 배지 (이스코베 등의 문헌 [F.J. Exp. Med., 147: 923 (1978)] 참조), DMEM, 피셔 (Fischer) 배지, 알파 배지, NCTC, F-10, 레이보비츠 (Leibovitz) L-15, MEM 및 맥코이 (McCoy) 배지가 있다.
배지에 존재하는 특정 영양물은 혈청 알부민, 트랜스페린, 지질, 콜레스테롤, 환원제, 예를 들어 2-메르캅토에탄올 또는 모노티오글리세롤, 피루베이트, 부티레이트, 및 글루코코르티코이드, 예를 들어 히드로코르티손 2-헤미숙시네이트를 포함한다. 더 특별하게는, 표준 배지는 에너지원, 비타민 또는 다른 세포 지지 유기 화합물, 배지의 pH를 안정화시키는 작용을 하는 완충제, 예를 들어 HEPES, 또는 트리스 (Tris) 및 다양한 무기염을 포함한다. 다양한 무혈청 세포 성장 배지가 본 명세서에 참고 문헌으로 채택된 국제 특허 출원 공개 제WO 95/00632호에 기술되어 있다.
수집한 CD34＋세포를 예를 들어 본 명세서에 기술되어 있는 바와 같이, 그리고 미국 특허 제08/539,142호에 기술되어 있는 바와 같이 적당한 사이토카인과 함께 배양한다. 이어서 CD34＋세포는 분화되어 수상돌기 계통의 세포가 되게 한다. 이어서 상기 세포는 수상돌기 세포의 특징적인 마커, 예를 들어 CD1a, HLA DR, CD80 및(또는) CD86을 사용하여 유동 혈구 계산법 또는 유사한 방법으로 더 정제한다. 배양된 수상돌기 세포를 항원, 예를 들어 종양 항원 또는 병원성 또는 기회성 유기체로부터 유래된 항원에 노출시키고, 항원이 처리되게 하고, 이어서 수상돌기 세포를 활성화시키는 양의 CD40 결합 단백질과 함께 배양한다. 별법으로, 수상돌기 세포는 항원을 코딩하는 유전자로 트랜스펙션시키고, 이어서 항원 제시 수상돌기 세포를 활성화시키는 양의 CD40 결합 단백질과 함께 배양한다.
이어서 항원을 포함하는 활성화된 수상돌기 세포를 항원 특이 면역 응답을 자극하기 위하여 개인에게 투여한다. 수상돌기 세포는 항원 투여 전에, 항원 투여와 동시에, 또는 항원 투여 후에 투여될 수 있다. 별법으로, T 세포는 개인으로부터 수집되고 시험관 내에서 항원을 포함하는 활성화된 수상돌기 세포에 노출되어 항원 특이 T 세포를 자극할 수 있는데, 이들은 개인에게 투여된다.
유용한 사이토카인
다양한 사이토카인이 엑스 비보에서의 수상돌기 세포의 배양에 유용하다. Flt3-L은 본 명세서에 참고 문헌으로 모두 채택된, 유럽 특허 제0627487 A2호 및 국제 특허 출원 공개 제WO 94/28391호에 기술되어 있는 폴리펩티드류를 칭한다. 사람 flt3-L cDNA는 1993년 8월 6일에 미국 매릴랜드주 로크빌 소재의 American Type Culture Collection (ATCC)에 기탁되어 접근 번호 제ATCC 69382번을 부여받았다. IL-3은 본 명세서에 참고 문헌으로 채택되어 있는 미국 특허 제5,108,910호에 기술되어 있는 바와 같이 인터루킨-3 폴리펩티드류를 칭다. 본 발명에서 사용하기에 적당한 사람 IL-3 단백질을 코딩하는 DNA 서열은 접근 번호 제ATCC 67747번 하에 American Type Culture Collection (ATCC)로부터 공개적으로 입수가능하다. c-kit 리간드는 또한 마스트 세포 성장 인자 (MGF), 스틸 인자 또는 스템 세포 인자 (SCF)로 칭해지며, 본 명세서에 참고 문헌으로 채택된 유럽 특허 제423,980호에 기술되어 있다.
다른 유용한 사이토카인으로는 인터루킨-4 (각각 본 명세서에 참고 문헌으로 채택된, IL-4; 모슬리 (Mosley) 등의 문헌 [Cell 59: 335 (1989)], 이드제르다 (Idzerda) 등의 문헌 [J. Exp. Med. 171: 861 (1990)] 및 갈리지 (Galizzi) 등의 문헌 [Intl. Immunol. 2: 669 (1990)] 참조) 및 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF; 본 명세서에 각각 참고 문헌으로 채택된 미국 특허 제5,108,910호 및 동 제5,229,496호에 기술되어 있음)가 있다. 구매가능한 GM-CSF (사그라모스팀, 류카인(등록상표))는 미국 워싱톤주 시애틀 소재의 Immunex Corporation사로부터 입수가능하다. 또한 GM-CSF/IL-3 융합 단백질 (즉, GM-CSF 및 IL-3의 C-말단에서 N-말단으로의 융합물)이 또한 수상돌기 세포의 엑스 비보에서의 배양에 유용하다. 상기와 같은 융합 단백질은 공지되어 있으며, 본 명세서에 각각 참고 문헌으로 채택된 미국 특허 제5,199,942호, 동 제5,108,910호 및 동 제5,073,627호에 기술되어 있다. 바람직한 융합 단백질은 미국 특허 제5,199,942호에 기술되어 있는 PIXY321이다.
사이토카인은 수상돌기 세포의 엑스 비보에서의 배양에서의 그의 사용 외에도 항원 펄싱된 활성화된 수상돌기 세포와 함께 사이토카인 또는 사이토카인들의 별도 투여, 연속 투여 또는 동시 투여에 의해 본 발명에서 또한 유용하다. 바람직한 사이토카인은 면역 응답을 조정하는 사이토카인, 특히 인터루킨 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 12 및 15; 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자, 과립구 콜로니 자극인자; 인터루킨-3 및 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자를 포함하는 융합 단백질; 인터페론-γ; TNF; TGF-β; flt-3 리간드; 용해성 CD40 리간드; 상기 사이토카인들의 생물학적으로 활성인 유도체; 및 이들의 조합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 사이토카인이다. 용해성 CD83 (1996년 2월 15일에 출원된 미국 특허 제08/601,954호에 기술되어 있음) 및 용해성 CD40L (1995S년 6월 7일에 모두 출원된 미국 특허 제08/477,733호 및 동 제08/484,624호에 기술되어 있음)이 특히 바람직한 사이토카인이다.
유용한 사이토카인은 수상돌기 세포의 표면에 존재하는 수용체에 결합하여 신호를 변환전달함으로써 작용한다. 또한 적절한 사이토카인 수용체에 결합하여 수상돌기 세포로 신호를 변환전달하는 추가의 결합 단백질이 본 명세서에서 CD40 결합 단백질에 대하여 기술되어 있는 바와 같이 제조될 수 있다. 예를 들어 국제 특허 출원 공개 제WO 95/27062호에는 다양한 Flt-3 결합 단백질이 제조될 수 있는, Flt-3L의 수용체인 Flt-3에 대한 작용성 항체가 기술되어 있다. 추가의 유용한 사이토카인으로는 수상돌기 세포의 배양에 유용한 사이토카인의 생물학적으로 활성인 유사체가 있다. 유용한 사이토카인 유사체는 천연 사이토카인과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 가지며 그의 특이 수용체에 결합하여 생물학적 신호를 변환전달할 수 있는 생물학적 활성을 갖는다. 상기와 같은 유사체는 본 명세서에 기술되어 있는 바와 같이 당 업계에 공지된 방법에 의해 제조 및 시험될 수 있다.
CD40/CD40L
CD40은 세포외 영역에서 시스테인이 풍부한 모티프가 존재하는 것에 의해 정의되는, 종양 회저 인자 (TNF)/신경 성장 인자 (NGF) 수용체 패밀리의 일원이다 (스미쓰 (Smith) 등의 문헌 [Science 248: 1019, 1990]; 말레트 (Mallett) 및 바클레이 (Barclay)의 문헌 [Immunology Today 12: 220, 1991] 참조). 상기 패밀리는 림프구 항원인 CD27, CD30 (호지킨 림프종 및 리드-스턴버그 세포 상에서 발견되는 항원), TNF의 두 수용체, 4-1BB로 칭해지는 쥐과 단백질, 쥐 OX40 항원, NGF 수용체, 및 Fas 항원을 포함한다. 사람 CD40 항원 (CD40)은 분자량이 30,600인 277개의 아미노산의 펩티드이다 (스타멘코빅 (Stamenkovic) 등의 문헌 [EMBO J. 8: 1403, 1989] 참조).
활성화된 CD4＋T 세포는 고수준의 CD40에 대한 리간드 (CD40L)를 발현한다. 사람 CD40L은 스프리그스 (Spriggs) 등의 문헌 [J. Exp. Med. 176: 1543 (1992)]에 기술되어 있는 바와 같이 말초 혈액 T-세포로부터 클로닝되었다. 쥐과 CD40L의 클로닝은 아미타게 (Armitage) 등의 문헌 [Nature 357: 80 (1992)]에 기술되어 있다. CD40L은 C-말단의 세포외 영역, 트랜스멤브레인 (transmembrane) 부분 및 N-말단의 세포내 부분을 포함하는 제II형 막 폴리펩티드이다. CD40L의 생물학적 활성은 CD40L의 세포외 영역과 CD40의 결합에 의해 매개되고 B 세포 증식 및 항체 분비 (IgE 분비 포함)의 유도를 포함한다.
CD40L은 면역 응답의 피드백 (feedback) 조절에 중요한 것으로 생각된다. 예를 들어 CD40＋항원 제시 세포는 항원을 T 세포에 제시하고 이어서 이 T 세포가 활성화되어 CD40L을 발현한다. 다시 CD40L은 항원 제시 세포를 더 활성화시켜 항원 제시에 있어서의 상기 세포의 효율을 증가시키고, 클래스 I 및 클래스 II MHC, CD80 및 CD86 동시자극성 분자, 및 다양한 사이토카인의 발현을 증가조절 (upregulation)한다 (콕스 (Caux) 등의 문헌 [J. Exp. Med. 180: 1263 (1994)] 참조).
본 발명의 방법에 유용한 형태의 CD40L은 모두 1995년 6월 7일에 출원된 미국 특허 제08/477,733호 및 동 제08/484,624호에 공개되어 있고 이들 모두는 본 명세서에 참고 문헌으로 채택되어 있다. 상기와 같은 유용한 형태는 CD40 결합 펩티드 및 올리고머 형성 펩티드를 포함하는 용해성의 올리고머 CD40 리간드를 포함한다. CD40 결합 펩티드는
(a) 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 261, 35 내지 261, 34 내지 225, 113 내지 261, 113 내지 225, 120 내지 261, 또는 120 내지 225를 포함하는 펩티드;
(b) CD40에 결합하는 (a)에 따른 펩티드의 프래그먼트; 및
(c) 엄격한 조건 하에서 (63℃에서 밤새 6 X SSC에서 혼성화; 55℃에서 3 X SSC로 세척) (a) 또는 (b)의 펩티드를 코딩하는 DNA에 혼성화하는 DNA에 의해 코딩되는, CD40에 결합하는 펩티드
로 이루어진 군으로부터 선택된다. 유용한 올리고머 형성 펩티드는 또한 미국 특허 제08/477,733호 및 동 제08/484,624호에 공개되어 있고 본 명세서에서 서열 번호 3 및 4에 예시되어 있다.
상응하는 리간드 패밀리가 TNFR 패밀리의 분자에 대하여 존재하고, 상기 리간드 중 여러 리간드가 활성화된 T 세포 또는 면역 시스템의 다른 세포 상에서 또한 발현된다. 상기 패밀리는 종양 회저 인자 및 림포톡신 (각각 TNF 및 LT; 웨어 (Ware) 등의 문헌 [Curr. Top. Microbiol. Immunol. 198: 175, 1995] 에 개설되어 있음) 및 CD27L (1993년 8월 13일에 출원된 미국 특허 제08/106,507호), CD30L (1996년 1월 2일에 특허된 미국 특허 제5,480,981호), 4-1BBL (1994년 5월 6일에 출원된 미국 특허 제08/236,918호), OX40L (1995년 10월 10일에 특허된 미국 특허 제5,457,035호) 및 Fas L (1995년 12월 13일에 출원된 미국 특허 제08/571,579호)을 포함한다. 상기 리간드는 또한 면역 응답의 조절에 관계하는 것으로 공지되어 있고 항원 펄싱된 수상돌기 세포 또는 상응하는 수용체를 포함하는 다른 항원 제시 세포를 활성화시키는데 유용할 것 같다.
CD40 단일클론 항체 및 추가의 CD40 결합 단백질
유용한 CD40 결합 단백질은 용해성 CD40의 CD40L에 대한 결합의 약 90% 이상의 억제율이 관찰됨으로써 측정되는 바와 같이 CD40에 결합할 수 있고 CD40의 CD40L에 대한 결합을 억제시킬 수 있는 것이고 단일클론 항체, CD40 리간드, 및 그로부터 유래된 분자를 포함한다. CD40 표면 항원에 대하여 유도된 단일클론 항체 (CD40 mAB)는 사람 B 세포 상에서 다양한 생물학적 활성을 매개하는 것으로 나타났다 (예를 들어 Leukocyte Typing IV; 맥마이클 (A.J. McMichael) 편집, 영국 옥스퍼드 소재의 Oxford University Press사, 426페이지 참조). 참고 문헌으로 채택된 관련 문헌인 1993년 10월 1일에 출원된 미국 특허 제08/130,541호에는 CD40에 특이적으로 결합하는 2종의 단일클론 항체 (hCD40m2 및 hCD40m3로 칭해짐)가 공개되어 있다. 다른 CD40 mAB와는 달리, hCD40m2 (ATCC HB11459; 1993년 10월 6일에 미국 매릴랜드주 로크빌 소재의 American Type Culture Collection에 부다페스트 조약 하에 기탁됨) 및 hCD40m3은 CD40과 결합하고 CD40이 CD40L을 콘스티튜티브 (constitutive)하게 발현하는 세포에 결합하는 것을 억제하는데, 이는 hCD40m2 및 hCD40m3가 리간드 결합 도메인 내에서 또는 이 도메인 근처에서 CD40과 결합한다는 것을 나타낸다.
추가의 CD40 단일클론 항체는 통상의 기술을 사용하여 제조할 수 있다 (본 명세서에 참고 문헌으로 채택된 미국 특허 제RE32,011호, 동 제4,902,614호, 동 제4,543,439호, 및 동 제4,411,993호를 참조하기 바람; 또한 본 명세서에 참고문헌으로 채택된 문헌 [Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press사, 케네트 (Kennett), 맥케이언 (McKearn), 및 베크톨 (Bechtol) 편집, 1980] 및 [Antibodies: A Laboratory Manual, 할로우 (Harlow) 및 레인 (Lane) 편집, Cold Spring Harbor Laboratory Press사, 1988]을 또한 참조하기 바람). 리간드 결합 도메인 내에서 또는 이 도메인 근처에서 CD40과 결합하는 단일클론 항체가 본 발명에 또한 유용하다.
추가의 CD40 결합 단백질은 또한 재조합 DNA 기술을 사용하여 작제될 수 있다. 예를 들어 리간드 결합 도메인 내에서 또는 이 도메인 근처에서 결합하는 CD40에 대한 항체를 코딩하는 유전자의 가변성 영역을 유용한 CD40 결합 단백질 내로 통합시킬 수 있다 (라릭 (Larrick) 등의 문헌 [Biotechnology 7: 934, 1989)]; 레이크만 (Reichmann) 등의 문헌 [Nature 332: 323, 1988]; 로버츠 (Roberts) 등의 문헌 [Nature 328: 731 (1987)]; 베뢰옌 (Verhoeyen) 등의 문헌 [Science 239: 1534, 1988]; 초드하리 (Chaudhary) 등의 문헌 [Nature 339: 394, 1989] 참조).
간단히 말해서, CD40 mAB의 항원 결합 부위 (또는 CD40 결합 도메인; 가변성 영역)를 코딩하는 DNA를 단리시키고, 증폭시키고 다른 단백질을 코딩하는 DNA, 예를 들어 사람 IgG에 결합시킨다 (베뢰옌 등의 상기 문헌 참조; 또한 레이크만의 상기 문헌 참조). 별법으로 항원 결합 부위 (가변성 영역)은 완전히 상이한 다른 단백질에 결합시키거나 또는 이 단백질 내로 삽입시켜 항체의 항원 결합 부위 및 완전히 상이한 단백질의 기능적 활성을 갖는 새로운 단백질을 생성시킬 수 있다 (초드하리 등의 상기 문헌 참조).
유사하게는 CD40 리간드의 CD40 결합 영역 (세포외 도메인)을 사용하여 다른 CD40 결합 단백질을 제조할 수 있다. CD40 리간드의 유용한 형태가 1995년 6월 7일에 모두 출원된 미국 특허 제08,477,733호 및 동 제08/484,624호에 공개되어 있다. CD40 리간드의 추가 형태는 당 업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 다른 유용한 CD40 결합 단백질에 있어서, CD40 리간드는 이 리간드의 결합 도메인 내에서 또는 그 근처에서 CD40과 결합하여 신호를 CD40을 발현하는 세포로 변환전달할 수 있다 (즉, 생물학적으로 활성).
올리고머를 형성하는 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 CD40 항체의 항원 결합 도메인 또는 CD40 리간드의 세포외 도메인을 포함하는 CD40 결합 단백질의 제조에 특히 유용하다. 특정의 상기와 같은 올리고머 형성 단백질이 미국 특허 제08/477,733호 및 동 제08/484,624호 (이들 모두는 1995년 6월 7일에 출원됨)에 공개되어 있고, 추가로 유용한 올리고머 형성 단백질이 1995년 5월 18일에 출원된 미국 특허 제08/446,922호에 또한 공개되어 있다. Fc 융합 단백질 (Fc 수용체에 대한 친화성이 감소된, Fc 뮤테인 (mutein)으로 형성된 것을 포함)도 또한 제조될 수 있다.
이전에 기술된 CD40 결합 단백질과 실질적으로 유사한 CD40 결합 단백질의 돌연변이체 형태 (즉, 천연 아미노산 서열과 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 것)가 본 발명에서 또한 유용하다. 퍼센트 동일성은 예를 들어 데버룩스 (Devereux)등에 의해 기술된 (문헌 [Nucl. Acids Res. 12: 387, 1984)] 참조) 버전 6.0의 GAP 컴퓨터 프로그램 (University of Wisconsin Genetics Computer Group, UWGCG으로부터 입수가능)을 사용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. GAP 프로그램은 스미쓰 (Smith) 및 워터맨 (Waterman) (문헌 [Adv. Appl. Math 2: 482, 1981] 참조)에 의해 개정된 바와 같은, 니들맨 (Needleman) 및 분슈 (Wunsch) (문헌 [J. Mol. Biol. 48: 443, 1970] 참조)의 정렬 방법을 사용한다. GAP 프로그램의 바람직한 디폴트 매개변수는 (1) 슈바르츠 (Schwartz) 및 데이호프 (Dayhoff) 편찬의 문헌 [Atlas of Portein Sequence and Structure, 국립 생물의학 연구 재단, 353 내지 358페이지, 1979]에 기술된 바와 같이 뉴클레오티를 위한 1진법 비교 매트릭스 (동일할 경우 1의 값, 그리고 동일하지 않을 경우 0의 값을 포함함) 및 그리브스코프 (Gribskov) 및 부르게스 (Burgess) (문헌 [Nucl. Acids Res. 14: 6745, 1986] 참조)의 가중 비교 매트릭스; (2) 각각의 갭에 대한 페널티 값 3.0 및 각각의 갭 내의 각각의 심볼에 대한 추가의 페널티 값 0.10; 및 (3) 말단 갭에 대한 무 페널티를 포함한다.
일반적으로 유용한 CD40 결합 단백질의 천연 형태와는 다른 아미노산이 보존적으로 치환되어야 한다 (즉, 가장 바람직한 치환 아미노산은 실질적으로 천연 CD40 리간드와 동일한 방식으로 본 발명의 단백질이 CD40에 결합하는 능력에 영향을 미치지 않는 것이어야 함). 보존적 치환의 예로는 결합 도메인(들)의 외부에서의 아미노산의 치환, 및 CD40 결합 단백질의 2차 및(또는) 3차 구조를 변경시키지 않는 아미노산의 치환이 있다. 추가의 예로는 한 지방족 잔기를 다른 것으로 치환하는 것, 예를 들어 Ile, Val, Leu, 또는 Ala를 서로에 대하여 치환시키는 것, 또는 한 극성 잔기를 다른 것으로 치환시키는 것, 예를 들어 Lys과 Arg 사이의 치환, Glu과 Asp 사이의 치환, 또는 Gln과 Asn 사이의 치환이 있다. 상기와 같은 다른 보존성 치환, 예를 들어 유사한 소수성 특성을 갖는 전체 영역의 치환이 잘 알려져 있다.
유사하게는 결실 또는 삽입 방법이 채용될 경우, 생물학적 활성에 대한 결실 또는 삽입의 잠재적인 효과가 고려되어야 한다. CD40 결합 단백질의 서브유닛은 말단 또는 내부 잔기 또는 서열이 결실되게 함으로써 작제할 수 있다. 생성될 수 있는 돌연변이의 형태에 대한 추가의 길잡이는 CD40 결합 단백질의 서열을 유사한 구조를 갖는 단백질과 비교함으로써 제공된다.
물론, 돌연변이에서는 코딩 서열의 판독 프레임 상태가 보존되어야 하고 바람직하게는 혼성화하여 CD40 결합 단백질의 mRNA의 번역에 악영향을 미치는 루프 또는 헤어핀과 같은 2차 mRNA의 구조를 생성시키는 상보성 영역이 만들어지지 않아야 한다. 돌연변이 부위를 예정할 수 있다 해도 돌연변이 그 자체의 성질이 예정될 필요는 없다. 예를 들어 주어진 부위에서 돌연변이체의 최적 특성에 대하여 선발하기 위하여 표적 코돈에서 랜덤 돌연변이 유발이 행해질 수 있고 발현된 돌연변이 단백질은 원하는 활성에 대하여 스크리닝될 수 있다.
돌연변이는 천연 서열의 프래그먼트에 라이게이션시킬 수 있는 제한효소 부위에 의해 플랭킹된, 돌연변이 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 합성함으로써 특정 위치에 도입시킬 수 있다. 라이게이션 후에 생성된 재작제된 서열은 원하는 아미노산 삽입, 치환, 또는 결실을 갖는 유사체를 코딩한다. 별법으로 올리고뉴클레오티드 유도 특정 부위 (site specific) 돌연변이 유발 방법을 사용하여 필요한 치환, 결실, 또는 삽입에 의해 변경된 특정 코돈을 갖는 변경된 유전자가 제공될 수 있다. 상기 변경 방법의 예는 월더 (Walder) 등의 문헌 [Gene 42: 133 (1986)]; 바우어 (Bauer) 등의 문헌 [Gene 37: 73, 1985]; 크레이크 (Craik)의 문헌 [BioTechniques, 1985년 1월, 12-19]; 스미쓰 등의 문헌 [Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press사, 1981]에 공개되어 있으며; 본 명세서에 참고 문헌으로 채택된 미국 특허 제4,518,584호 및 동 제4,737,462호에 적당한 기술이 공개되어 있다.
당 업계에 잘 알려진 것과 같이 일부의 돌연변이만이 아미노산 서열의 변화를 야기한다. 재조합 단백질의 제조에 있어서 유익한 특성을 부여하는 돌연변이는 또한 유용한 CD40 결합 단백질을 제조하는데 유용하다. 천연 변이체가 또한 본 발명에 포함된다. 상기와 같은 변이체의 예로는 천연의 생물학적 특성은 유지되는, mRNA의 대체 (alternate) 스플라이싱 결과에 의해 또는 단백질 분해성 절단에 의해 생성되는 단백질이 있다.
적당한 항체 또는 결합 단백질은 일단 수득되면 당 업계의 숙련자들에게 잘 알려진 많은 기술을 사용하여 단리 또는 정제시킬 수 있다 (문헌 [Antibodies: A Laboratory Manual, 할로우 (Harlow) 및 레인 (Lane) 편집, Cold Spring Harbor Laboratory Press사, 1988] 참조). 적당한 기술로는 펩티드 또는 단백질 친화 칼럼, HPLC 또는 RP-HPLC, 단백질 A 또는 단백질 G 칼럼 상에서의 정제, 또는 상기 기술을 임의로 조합시키는 방법이 있다. 재조합 CD40 결합 단백질은 표준 방법에 따라 제조할 수 있으며 예를 들어 ELISA, ABC 또는 도트 블롯 분석법 및 생물활성 분석법을 포함하는 당 업계에 공지된 분석법을 사용하여 CD40에 대한 결합 특이성에 대하여 시험한다. 생물활성 분석법은 또한 CD40 결합 단백질의 생물학적 활성을 평가하는데 유용하다.
항원의 제조
면역법은 질병을 예방하거나 또는 개선시키기 위하여 병원균에 대한 보호성 면역 응답을 유도하는 수세기된, 매우 효과적인 방법이다. 상기와 같은 유도에 사용된 백신은 일반적으로 약화된 생미생물, 또는 사멸 유기체 제제 또는 그의 분획물이다. 약화된 생백신은 일반적으로 사멸 미생물 또는 병원균으로부터 유래된 비감염성 제제 (즉, 톡소이드, 재조합 단백질 백신)로부터 제조된 것보다 천연 감염으로 발생하는 면역 응답을 더 밀접하게 모방할 것으로 생각된다. 그러나 약화된 백신은 또한 병원성으로 복귀될 위험성을 가지며 특히 면역손상 개인에 있어서 병을 야기할 수 있다.
개선된 공중 위생과 함께 면역화는 사람 및 다른 동물에 있어서의 다수의 감염성 질병으로부터의 사망 또는 장애를 예방하는 가장 유효한 방법이었다. 감염되기 쉬운 집단의 백신 접종은 세계적인 천연두의 제거 및 개발국에서의 디프테리아, 백일해, 및 소아마비와 같은 질병 발생의 과감한 감소를 초래하였다. 특정 아데노바이러스, 홍역, 유행성 이하선염 및 풍진 바이러스, 및 폴리오바이러스에 대한 생바이러스 백신, 디프테리아 및 파상풍 톡소이드 백신, 및 헤모필루스 (Haemophilus) b 및 메닝고코칼 (meningococcal) 폴리사카라이드 백신을 포함하는 다수의 백신은 사람에게 투여하는 것이 허용된다 (힌만 (Hinman) 등의 문헌 [Principles and Practice of Infectious Diseases, 제3판; 맨델 (G.L. Mandell), 더글라스 (R.G. Douglas) 및 베네트 (J.E. Bennett) 편집, 미국 뉴욕주 뉴욕 소재의 Churchill Livingstone Inc.사; 2320-2333; 표 2] 참조).
감염성 질병 분야에서의 용도 외에도, 백신 접종은 암의 유망한 치료법으로 또한 여겨진다. 상기와 같은 용도에 있어서, 종양 관련 항원은 예를 들어 코헨 (Cohen) 등의 문헌 [Cancer Res. 54: 1055 (1994)] 및 코헨 등의 문헌 [Eur. J. Immunol. 24: 315 (1994)]에 기술되어 있는 바와 같이 종양 세포의 조 용해물 (lysate)을 제조하거나 또는 항원을 부분적으로 정제함으로써 (예를 들어 이또 (Itoh) 등의 문헌 [J. Immunol. 153: 1202 (1994)]에 기술되어 있는 바와 같음) 종양 세포로부터 제조할 수 있다. 또한 유용한 종양 항원은 더 정제하거나 또는 심지어 재조합적으로 발현시켜 적당한 항원 제조물을 제공할 수 있다. 암에서 면역 응답을 유익하게 하는 항원을 동정하고 단리하는 다른 임의의 방법은 본 발명의 방법에서 또한 유용하다.
이어서 정제된 수상돌기 세포를 항원으로 펄싱하여 (항원에 노출시켜) 면역 시스템의 다른 세포에 제시하기에 적당한 방식으로 상기 세포가 항원을 흡수하게 한다. 항원은 두 가지 경로를 통하여 고전적으로 처리되고 제시된다. 시토졸 구획의 단백질로부터 유래된 펩티드는 클래스 I MHC 분자 환경에서 제시되는 반면 세포내이입 경로에서 발견되는 단백질로부터 유래된 펩티드는 클래스 II MHC의 환경에서 제시된다. 그러나 당 업계의 숙련자는 예외가 있다는 것을 알 것이다 (예를 들어 MHC 클래스 I 상에서 발현되는 외인성 종양 항원을 인지하는 CD8＋종양 특이 T 세포의 응답). MHC-의존성 항원 처리 및 펩티드 제시는 게르마인 (Germain, R.N.)의 문헌 [Cell 76: 287 (1994)]에 개설되어 있다.
수상돌기 세포를 항원으로 펄싱하는 다수의 방법이 공지되어 있으며 당 업계의 숙련자는 선택된 항원에 적당한 방법의 개발을 일상의 실험으로서 생각할 것이다. 일반적으로 항원은 세포의 생존능력을 촉진시키는 조건 하에서 배양된 수상돌기 세포에 첨가하고 이어서 이 세포에 약 24시간 (약 18 내지 약 30시간, 바람직하게는 24시간)의 충분한 시간을 주어 이 세포가 항원을 흡수 및 처리하고 클래스 I 또는 클래스 II MHC와 관련하여 세포 표면 상에서 항원 펩티드를 발현하게 한다. 수상돌기 세포는 또한 항원을 코딩하는 DNA로 트랜스펙션시킴으로써 항원에 노출시킬 수 있다. DNA가 발현되고 항원은 시토졸/클래스 I 경로를 통하여 아마도 처리될 것이다.
활성화된, 항원 펄싱된 수상돌기 세포의 투여
본 발명은 활성화된, 항원 펄싱된 수상돌기 세포를 포함하는 치료 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 상기 세포를 용해성 사이토카인 수용체 또는 사이토카인, 또는 다른 면역조절 분자와 함께 사용하는 것도 또한 고려된다. 본 발명의 조성물은 투여되어 면역 응답을 자극하고 볼루스 주입법, 연속 주입법, 이식물로부터의 지속적인 방출법, 또는 다른 적당한 기술에 의해 주어질 수 있다. 일반적으로 본 발명의 방법에서의 세포는 항원 펄싱된, 활성화된 수상돌기 세포를 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 함께 포함하는 조성물의 형태로 투여된다. 상기와 같은 담체는 사용되는 투약량 및 농도에서 수용자에게 비독성이다. 중성의 완충 염수 또는 같은 종류의 혈청 알부민과 혼합된 완충 염수가 적절한 희석제의 전형이다.
특정 형태의 면역 응답을 자극하는데 사용하기 위하여 다른 사이토카인을 활성화된, 항원 펄싱된 수상돌기 세포와 함께 투여하는 것도 또한 고려된다. 유용한 여러 사이토카인 (또는 펩티드 조절 인자)가 슈라더 (Schrader, J.W.)의 문헌 [Mol Immunol 28: 295; 1991]에 논의되어 있다. 상기와 같은 인자로는 (단독 또는 조합 형태의) 인터루킨 1, 2, 4, 5, 6, 7, 10, 12 및 15; 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자, 과립구 콜로니 자극 인자; 인터루킨-3 및 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자를 포함하는 융합 단백질; 인터페론-γ; TNF, TGF-β, flt-3 리간드 및 그의 생물학적으로 활성인 유도체가 있다. 특히 바람직한 사이토카인은 CD40 리간드 (CD40L)이다. 용해성 형태의 CD40L은 1995년 6월 7일에 출원된 미국 특허 제08/484,624호에 기술되어 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같이 다른 사이토카인도 또한 유용하다. 상기와 같은 사이토카인을 코딩하는 DNA도 예를 들어 수상돌기 세포를 트랜스펙션시켜 사이토카인을 발현하게 함으로써 본 발명의 방법에서 또한 유용하다. 상기 면역조절 분자의 투여는 본 발명의 세포의 투여와 동시에, 세포의 투여와 별개로 또는 세포의 투여에 이어서 투여하는 것을 포함한다.
본 명세서에 인용된 모든 출판물의 관련 공개물이 참고 문헌으로 구체적으로 채택되어 있다. 하기 실시예는 특정 실시 형태를 예시하기 위하여 제공되며 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예 1
본 실시예에서는 엑스 비보에서 정제 수상돌기 세포를 생성시키기 위한 방법이 기술되어 있다. 사람 골수를 수득하여 CD34＋표현형을 갖는 세포를 CD34 항체 칼럼 (CellPro사, 미국 워싱톤주 보텔 소재)을 사용하여 단리시킨다. CD34＋세포는 수상돌기 세포의 성장을 촉진하는 사이토카인 (즉, 20 ng/ml의 각각의 GM-CSF, IL-4, TNF-α, 또는 100 ng/ml의 flt3-L 또는 c-kit 리간드, 또는 그의 조합물)을 함유하는 적당한 배지, 예를 들어 맥코이 증강 배지 (McCoy's enhanced medium)에서 배양한다. 배양은 습한 공기에서 10%의 CO2에서 37℃에서 약 2주 동안 계속한다. 이어서 세포는 CD1a＋, HLA-DR＋및 CD86＋에 대한 항체를 사용하여 유동 혈구계산법으로 분류한다. GM-CSF, IL-4 및 TNF-α의 조합물은 2주 동안의 배양 후에 얻어지는 세포의 수를 6 내지 7배 증가시킬 수 있는데, 세포의 50 내지 80%는 CD1a＋HLA-DR＋CD86＋이다. flt3-L 및(또는) c-kit 리간드를 첨가하면 전체 세포의 확장이 더 증강되고, 따라서 수상돌기 세포의 확장도 증강된다. 상기 조건 하에서 단리 및 배양된 세포의 표현형 분석에 의하면 세포의 60 내지 70%가 HLA-DR＋, CD86＋이고, 40 내지 50%의 세포가 조사된 모든 인자의 조합에서 CD1a를 발현하는 것으로 나타났다.
실시예 2
본 실시예에서는 수상돌기 세포를 수집 및 확장시키는 방법이 기술되어 있다. 세포 수집 전에, flt3-L 또는 사그라모스팀 (류카인 (등록상표), 미국 워싱톤주 시애틀 소재의 Immunex Corporation사 제품)을 개인에게 투여하여 순환 PBPC 및 PBSC의 수를 동원 또는 증가시킬 수 있다. 다른 성장 인자, 예를 들어 CSF-1, GM-CSF, c-kit 리간드, G-CSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, GM-CSF/IL-3 융합 단백질, LIF, FGF 및 이들의 조합물도 또한 flt3-L에 이어서, 또는 그와 동시에 투여될 수 있다.
동원 또는 비동원 PBPC 및 PBSC는 당 업계에 공지된 분리반출법을 사용하여 수집한다 (예를 들어 비숍 등의 문헌 [Blood, 제83권, 제2호, 610 내지 616페이지 (1994)] 참조). 간단히 말해서 PBPC 및 PBSC는 통상의 장치, 예를 들어 헤모네틱스 모델 V50 분리반출 장치 (미국 매사추세츠주 브레인트리 소재의 Haemonetics사 제품)를 사용하여 수집한다. 4시간 동안의 수집을 일반적으로 단지 주 당 5회 수행하여 개인의 kg당 약 6.5 x 108개의 단핵 세포 (MNC)를 수집한다.
수집된 PBPC 및 PBSC의 분액은 과립구 마크로파지 콜로니 형성 단위 (CFU-GM) 함량에 대하여 분석한다. 간단히 말해서 MNC (대략 300,000개)를 단리하고, 개질된 맥코이 5A 배지, 0.3%의 아가, 200 U/ml의 재조합 사람 GM-CSF, 200 u/ml의 재조합 사람 IL-3, 및 200 u/ml의 재조합 사람 G-CSF에서 약 2주 동안 완전히 습윤화된 공기에서 5%의 CO2에서 37℃에서 배양한다. flt3-L 또는 GM-CSF/IL-3 융합 분자 (PIXY 321)을 포함하는 다른 사이토카인을 배양물에 첨가할 수 있다. 상기 배양물을 라이트 (Wright) 염료로 염색시키고, CFU/GM 콜로니는 해부 현미경을 사용하여 스코어링한다 (워드 (Ward) 등의 문헌 [Exp. Hematol., 16: 358 (1988)] 참조). 별법으로, CFU-GM 콜로니는 시에나 (Siena) 등의 문헌 [Blood, 제77권, 제2호, 400 내지 409페이지 (1991)]의 CD34/CD33 유동 혈구계산법 또는 당 업계에 공지된 임의의 다른 방법을 사용하여 분석할 수 있다.
CFU-GM 포함 배양물은 조정된 등급의 냉동기 (예를 들어 CryoMed사, 미국 매사추세츠주 마운트 클레멘스 소재)에서 냉동시키고, 이어서 액체 질소의 기상에서 저장한다. 10 퍼센트의 디메틸술폭시드를 저온보호제로서 사용할 수 있다. 개인으로부터 모두 수집한 후 CFU-GM 포함 배양물은 해동시키고 모으고, 이어서 flt3-L과 단독으로 접촉시키거나, 상기 다른 사이토카인에 이어서 접촉시키거나 또는 다른 사이토카인과 조합시켜 동시에 접촉시켜 CFU-GM이 수상돌기 세포 계통으로 되게 한다. 수상돌기 세포를 배양하고 상기에 기술된 바와 같이 선택된 마커를 나타내는 세포의 퍼센트에 대하여 분석한다.
실시예 3
본 실시예는 알로-항원을 제시함으로써 T 세포의 증식을 야기하는 CD40L-자극 수상돌기 세포의 능력을 예시한다. CD34＋세포는 사람 제공자의 골수로부터 얻어지고, 선택된 사이토카인의 존재 하에 2주 동안 배양되고, 실질적으로 실시예 1에 기술된 바와 같이 유동 혈구계산법으로 단리시킨다. 수상돌기 세포는 혼합 림프구 반응 (mixed lymphocyte reaction, MLR)에 사용하기 전에 수상돌기 세포의 성장을 지지하는 사이토카인을 함유하는 맥코이 증강 배지에서 용해성의 삼량체 형태의 CD40L (1 μg/ml)의 존재 하에 또는 부재 하에 추가로 24시간 동안 배양한다.
T 세포는 2-아미노에틸이소티오우로늄 브로마이드 하이드로브로마이드 처리 양 적혈구 세포로 로제팅 (rosetting)함으로써 비HLA 매치 제공자의 혈액으로부터 정제한다. CD4＋및 CD8＋집단은 MACS (Milenyi Biotec사 제품, 미국 캘리포니아주 서니베일 소재)를 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 면역자성 선발법을 사용하여 더 정제한다. 세포 증식 분석은 37℃에서 10%의 CO2분위기에서 RPMI (10%의 가열 불활성화 소 태아 혈청 (FBS))에서 적정된 수의 수상돌기 세포의 존재 하에 정제된 T 세포를 사용하여 수행한다. 웰 당 약 1 x 105개의 T 세포를 다양한 수의 비매치 수상돌기 세포의 존재 하에 둥근 바닥 96웰 마이크로타이터 플레이트 (Corning사 제품)에서 7일 동안 삼중으로 배양한다. 세포는 마지막 8시간의 배양 동안 1 μCi/웰의 삼중수소화 티미딘 (25 Ci/nmole, Amersham사, 미국 일리노이주 알링턴 하이츠 소재)으로 펄싱한다.
세포는 자동화 세포 수확기를 사용하여 유리 섬유 디스크 상에 수확하고 혼입된 cpm은 액체 신틸레이션 분광계로 측정한다. 도 1에 나타낸 결과는 MLR에서 사용 전에 CD40L에 노출시키지 않은 수상돌기 세포와 비교하여 3배 더 적은 수의 CD40L 활성화 수상돌기 세포가 T 세포의 동일한 증식을 자극하는데 필요하다는 것을 증명한다. 상기 증가는 알로 반응성 T 세포를 자극하는 세포 표면 분자의 발현의 증가에 가장 많이 기인하는 것 같다.
실시예 4
본 실시예는 T 세포의 항원 특이 증식을 자극하는 수상돌기 세포의 능력을 예시한다. CD34＋세포를 파상풍 톡소이드에 대하여 반응성을 갖는 것으로 생각되는 사람 제공자의 골수로부터 얻어 선택된 사이토카인의 존재 하에 2주 동안 배양하고, 실질적으로 실시예 1에 기술된 바와 같이 유동 혈구계산법으로 단리시킨다. 수상돌기 세포는 파상풍 톡소이드 (TTX) 항원 제시 분석에 사용하기 전에 수상돌기 세포의 성장을 지지하는 사이토카인을 함유하는 맥코이 증강 배지에서 용해성의 삼량체 형태의 CD40L (1 μg/ml)의 존재 하에 또는 부재 하에 추가로 24시간 동안 배양하고 이어서 정제된 TTX (Connaught Laboratory Inc.사, 미국 펜실바니아주 스위프트워터 소재)를 사용하여 37℃에서 10%의 CO2분위기 하에서 24시간 동안 펄싱시킨다.
자가유래성의 파상풍 톡소이드 반응성 T 세포는 CD34 항체 칼럼으로부터 용출시킨 CD34-세포를 정제된 TTX 및 저농도의 IL-2 및 IL-7 (각각 2 ng/ml 및 5 ng/ml)의 존재 하에 2주 동안 배양함으로써 유래된다. CD34-집단은 파상풍 톡소이드에 대하여 반응성인 약 5% 비율의 T 세포 및 항원 제시 세포로서 작용하는 다른 세포 형태를 포함한다. 2주까지는 상기 세포의 분석에서 이들 세포가 약 90%가 T 세포이고 그 중 대부분은 저수준의 T 세포 활성화 마커를 갖는 파상풍 톡소이드 특이성인 것이다.
항원 특이 T 세포 증식 분석은 상기와 같이 CD34-골수 세포로부터의 TTX 특이 T 세포를 사용하여 37℃에서 10%의 CO2분위기에서 파상풍 톡소이드 펄싱된 수상돌기 세포의 존재 하에 10%의 가열 불활성화 소태아 혈청 (FBS)이 첨가된 RPMI에서 수행한다. 웰 당 약 1 x 105개의 T 세포를 적정된 수의 수상돌기 세포의 존재 하에 둥근 바닥 96웰 마이크로타이터 플레이트 (Corning사 제품)에서 5일 동안 삼중으로 배양한다. 세포는 마지막 4 내지 8시간의 배양 동안 1 μCi/웰의 삼중수소화 티미딘 (25 Ci/nmole, Amersham사, 미국 일리노이주 알링턴 하이츠 소재)으로 펄싱한다. 세포는 자동화 세포 수확기를 사용하여 유리 섬유 디스크 상에 수확하고 혼입된 cpm은 액체 신틸레이션 분광계로 측정한다. 도 2에 나타낸 결과에서 CD40L과 함께 배양한 수상돌기 세포가 CD40L에 노출하지 않은 수상돌기 세포보다 TTX 특이 T 세포에 항원을 제시함에 있어서 약 10배 덜 유효하다는 것이 나타났다.
실시예 5
본 실시예는 항원 특이 T 세포의 자극에 있어서 항원 펄싱된 수상돌기 세포를 활성화시키는 CD40L의 능력을 예시한다. CD34＋세포를 수득하여 이 세포를 CD40L과 함께 배양하기 전에 24시간 동안 파상풍 톡소이드로 펄싱하는 것을 제외하고는 실시예 4와 동일하게 처리한다. 자가유래성 파상풍 톡소이드 반응성 T 세포가 유래되었고 실시예 4에 기술한 바와 같이 항원 특이 T 세포 증식 분석을 수행한다. 도 3에 나타낸 결과에서 항원으로 펄싱하였지만 CD40L에 노출시키지 않은 수상돌기 세포보다 항원으로 먼저 펄싱한 후 CD40L과 함께 배양한 수상돌기 세포가 TTX를 TTX 특이 T 세포에 제시할 경우 동일 수준의 증식을 자극하는데 3배가 덜 필요하다는 것이 나타났다.
〈서열표〉
(1) 일반적 정보 :
(i) 출원인: 임뮤넥스 코포레이션
(ii) 발명의 명칭: 수상돌기 세포의 활성화 방법
(iii) 서열수: 4
(iv) 통신 주소:
(A) 수신인: 임뮤넥스 코포레이션
(B) 거리: 유니버시티 스트리트 51
(C) 도시: 시애틀
(D) 주: 워싱톤주
(E) 국가: 미국
(F) 우편번호: 98101
(v) 컴퓨터 판독 형태
(A) 매체 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: 파워 매킨토시 7200/90
(C) 작동 시스템: 애플 작동 시스템 7.6
(D) 소프트웨어: 매킨토시를 위한 마이크로소프트 워드, 버전 #6.0.1
(vi) 현 출원 데이타:
(A) 출원 번호: 할당될 것임
(B) 출원일: 1997년 7월 9일
(C) 분류:
(vii) 우선권 출원 데이타:
(A) 출원 번호: 미국 특허 제08/677,762호
(B) 출원일: 1996년 7월 10일
(C) 분류:
(vii) 우선권 출원 데이타:
(A) 출원 번호: 미국 특허 제08/763,995호
(B) 출원일: 1996년 12월 12일
(C) 분류:
(vii) 대리인/대행자 정보:
(A) 이름: 퍼킨스, 패트리샤 에이.
(B) 등록번호: 34,693
(C) 참조/허가 번호: 2845-WO
(vii) 통신 정보:
(A) 전화번호: (206) 587-0430
(B) 텔레팩스: (206) 233-0644
(2) 서열 1에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 840 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(vi) 원천:
(A) 유기체: 호모 사피엔스
(vii) 직접적 원천:
(B) 클론: CD40-L
(ix) 특징:
(A) 이름/키: CDS
(B) 위치: 46..831
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 2에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 261개의 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 3에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 740 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(vi) 원천:
(A) 유기체: 사람
(vii) 직접적 원천:
(B) 클론: IgG1 Fc
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 4에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 33개의 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 펩티드
(xi) 서열 설명:

Claims (20)

  1. (a) 수상돌기 세포를 수득하는 단계;
    (b) (i) 항원의 흡수 및 처리를 촉진하는 조건 하에서 배양물에서 수상돌기 세포를 항원에 노출시키거나, 또는 (ii) 수상돌기 세포를 항원을 코딩하는 유전자로 트랜스펙션시킴으로써 수상돌기 세포가 항원을 발현하게 하는 단계; 및
    (c) CD40L에 대한 용해성 CD40의 결합의 약 90% 이상의 억제율을 관찰함으로써 측정되는 바와 같이 CD40에 결합할 수 있고 CD40L에 대한 CD40의 결합을 억제시킬 수 있는 CD40 결합 단백질에 항원 발현 수상돌기 세포를 노출시킴으로써 상기 수상돌기 세포를 활성화시키는 단계에 의해 제조되는, 항원을 발현하는 활성화된 수상돌기 세포 집단.
  2. 제1항에 있어서, 조혈 스템 세포 또는 프로제니터 세포를 GM-CSF, flt-3L, IL-4, TNF-α, IL-3, c-kit 리간드, GM-CSF와 IL-3의 융합물, 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 분자와 접촉시킴으로써 수득되는 수상돌기 세포 집단.
  3. 제1항에 있어서, CD40 결합 단백질이
    (a) 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 261, 35 내지 261, 34 내지 225, 113 내지 261, 113 내지 225, 120 내지 261, 또는 120 내지 225를 포함하는 펩티드;
    (b) CD40에 결합하는 (a)에 따른 펩티드의 프래그먼트; 및
    (c) 엄격한 조건 하에서 (63℃에서 밤새 6 X SSC에서 혼성화; 55℃에서 3 X SSC로 세척) (a) 또는 (b)의 펩티드를 코딩하는 DNA에 혼성화하는 DNA에 의해 코딩되는, CD40에 결합하는 펩티드,
    및 올리고머 형성 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 용해성의 올리고머 CD40 리간드인 집단.
  4. 제3항에 있어서, 용해성의 올리고머 CD40 리간드가
    (a) 아미노산 194에서 시스테인이 다른 아미노산으로 치환된 서열 번호 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드; 및
    (b) CD40에 결합하는 뮤테인 (a)의 프래그먼트인 폴리펩티드;
    (여기서, 아미노산 194에서 시스테인에 대하여 치환되는 아미노산은 트립토판, 세린, 아스파르트산, 및 리신으로 이루어진 군으로부터 선택됨)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 집단.
  5. (a) 수상돌기 세포를 개인으로부터 수득하는 단계;
    (b) (i) 항원의 흡수 및 처리를 촉진하는 조건 하에서 배양물에서 수상돌기 세포를 항원에 노출시키거나, 또는 (ii) 수상돌기 세포를 항원을 코딩하는 유전자로 트랜스펙션시킴으로써 수상돌기 세포가 항원을 발현하게 하는 단계;
    (c) CD40L에 대한 용해성 CD40의 결합의 약 90% 이상의 억제율을 관찰함으로써 측정되는 바와 같이 CD40에 결합할 수 있고 CD40L에 대한 CD40의 결합을 억제시킬 수 있는 CD40 결합 단백질에 항원 발현 수상돌기 세포를 노출시킴으로써 상기 수상돌기 세포를 활성화시키는 단계; 및
    (d) 활성화된 항원 발현 수상돌기 세포를 개인에게 투여하는 단계를 포함하는, 개인에 있어서 항원에 대한 특이적 면역 응답의 자극 방법.
  6. 제5항에 있어서, 수상돌기 세포가 개인으로부터 조혈 스템 세포 또는 프로제니터 세포를 수득하고, 조혈 스템 세포 또는 프로제니터 세포를 flt-3 리간드, GM-CSF, IL-4, TNF-α, IL-3, c-kit 리간드, GM-CSF와 IL-3의 융합물, 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 분자와 접촉시킴으로써 수득되는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, CD40 결합 단백질이
    (a) 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 261, 35 내지 261, 34 내지 225, 113 내지 261, 113 내지 225, 120 내지 261, 또는 120 내지 225를 포함하는 펩티드;
    (b) CD40에 결합하는 (a)에 따른 펩티드의 프래그먼트; 및
    (c) 엄격한 조건 하에서 (63℃에서 밤새 6 X SSC에서 혼성화; 55℃에서 3 X SSC로 세척) (a) 또는 (b)의 펩티드를 코딩하는 DNA에 혼성화하는 DNA에 의해 코딩되는, CD40에 결합하는 펩티드,
    및 올리고머 형성 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 용해성의 올리고머 CD40 리간드인 방법.
  8. 용해성의 올리고머 CD40 리간드가
    (a) 아미노산 194에서 시스테인이 다른 아미노산으로 치환된 서열 번호 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드; 및
    (b) CD40에 결합하는 폴리펩티드 (a)의 프래그먼트인 폴리펩티드;
    (여기서, 아미노산 194에서 시스테인에 대하여 치환되는 아미노산은 트립토판, 세린, 아스파르트산, 및 리신으로 이루어진 군으로부터 선택됨)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제7항에 따른 집단.
  9. 제5항에 있어서, flt-3 리간드를 수상돌기 세포를 수득하기 전에 개인에게 투여하여 개인의 순환계의 프로제니터 세포의 수를 확장시키는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 수상돌기 세포가 개인으로부터 조혈 스템 세포 또는 프로제니터 세포를 수득하고, 조혈 스템 세포 또는 프로제니터 세포를 flt-3 리간드, GM-CSF, IL-4, TNF-α, IL-3, c-kit 리간드, GM-CSF와 IL-3의 융합물, 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 분자와 접촉시킴으로써 수득되는 것인 방법.
  11. 제5항에 있어서, 활성화된 항원 발현 수상돌기 세포를 인터루킨 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 12 및 15; 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자, 과립구 콜로니 자극 인자; 인터루킨-3과 과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자를 포함하는 융합 단백질; 인터페론-γ, TNF; TGF-β, flt-3 리간드; 용해성 CD40 리간드; 용해성 CD83; 상기 사이토카인의 생물학적으로 활성인 유도체; 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 분자와 동시에, 이 분자에 이어서 또는 이 분자와 별개로 투여하는 것인 방법.
  12. 제9항에 있어서, CD40 결합 단백질이
    (a) 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 261, 35 내지 261, 34 내지 225, 113 내지 261, 113 내지 225, 120 내지 261, 또는 120 내지 225를 포함하는 펩티드;
    (b) CD40에 결합하는 (a)에 따른 펩티드의 프래그먼트;
    (c) 엄격한 조건 하에서 (63℃에서 밤새 6 X SSC에서 혼성화; 55℃에서 3 X SSC로 세척) (a) 또는 (b)의 펩티드를 코딩하는 DNA에 혼성화하는 DNA에 의해 코딩되는, CD40에 결합하는 펩티드;
    (d) 아미노산 194에서 시스테인이 트립토판, 세린, 아스파르트산, 및 리신으로 이루어진 군으로부터 선택된 다른 아미노산으로 대체된 (a)에 따른 폴리펩티드; 및
    (e) CD40에 결합하는 (d)의 폴리펩티드의 프래그먼트;
    및 올리고머 형성 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 용해성의 올리고머 CD40 리간드인 방법.
  13. 제10항에 있어서, CD40 결합 단백질이
    (a) 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 261, 35 내지 261, 34 내지 225, 113 내지 261, 113 내지 225, 120 내지 261, 또는 120 내지 225를 포함하는 펩티드;
    (b) CD40에 결합하는 (a)에 따른 펩티드의 프래그먼트;
    (c) 엄격한 조건 하에서 (63℃에서 밤새 6 X SSC에서 혼성화; 55℃에서 3 X SSC로 세척) (a) 또는 (b)의 펩티드를 코딩하는 DNA에 혼성화하는 DNA에 의해 코딩되는, CD40에 결합하는 펩티드;
    (d) 아미노산 194에서 시스테인이 트립토판, 세린, 아스파르트산, 및 리신으로 이루어진 군으로부터 선택된 다른 아미노산으로 대체된 (a)에 따른 폴리펩티드; 및
    (e) CD40에 결합하는 (d)의 폴리펩티드의 프래그먼트;
    및 올리고머 형성 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 용해성의 올리고머 CD40 리간드인 방법.
  14. 제11항에 있어서, CD40 결합 단백질이
    (a) 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 261, 35 내지 261, 34 내지 225, 113 내지 261, 113 내지 225, 120 내지 261, 또는 120 내지 225를 포함하는 펩티드;
    (b) CD40에 결합하는 (a)에 따른 펩티드의 프래그먼트;
    (c) 엄격한 조건 하에서 (63℃에서 밤새 6 X SSC에서 혼성화; 55℃에서 3 X SSC로 세척) (a) 또는 (b)의 펩티드를 코딩하는 DNA에 혼성화하는 DNA에 의해 코딩되는, CD40에 결합하는 펩티드;
    (d) 아미노산 194에서 시스테인이 트립토판, 세린, 아스파르트산, 및 리신으로 이루어진 군으로부터 선택된 다른 아미노산으로 대체된 (a)에 따른 폴리펩티드; 및
    (e) CD40에 결합하는 (d)의 폴리펩티드의 프래그먼트;
    및 올리고머 형성 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 용해성의 올리고머 CD40 리간드인 방법.
  15. (a) 수상돌기 세포를 개인으로부터 수득하는 단계;
    (b) (i) 항원의 흡수 및 처리를 촉진하는 조건 하에서 배양물에서 수상돌기 세포를 항원에 노출시키거나, 또는 (ii) 수상돌기 세포를 항원을 코딩하는 유전자로 트랜스펙션시킴으로써 수상돌기 세포가 항원을 발현하게 하는 단계;
    (c) CD40L에 대한 용해성 CD40의 결합의 약 90% 이상의 억제율을 관찰함으로써 측정되는 바와 같이 CD40에 결합할 수 있고 CD40L에 대한 CD40의 결합을 억제시킬 수 있는 CD40 결합 단백질에 항원 발현 수상돌기 세포를 노출시킴으로써 상기 수상돌기 세포를 활성화시키는 단계; 및
    (d) 수상돌기 세포가 항원을 T 세포에 제시하게 하는 단계를 포함하는, 개인으로부터의 항원 특이 T 세포의 제조 방법.
  16. 제15항에 있어서, 항원 특이 T 세포를 개인으로부터 수득하고, 엑스 비보에서 항원 제시 수상돌기 세포에 노출시키고, 개인에게 재투여하는 방법.
  17. 제15항에 있어서, CD40 결합 단백질이
    (a) 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 261, 35 내지 261, 34 내지 225, 113 내지 261, 113 내지 225, 120 내지 261, 또는 120 내지 225를 포함하는 펩티드;
    (b) CD40에 결합하는 (a)에 따른 펩티드의 프래그먼트;
    (c) 엄격한 조건 하에서 (63℃에서 밤새 6 X SSC에서 혼성화; 55℃에서 3 X SSC로 세척) (a) 또는 (b)의 펩티드를 코딩하는 DNA에 혼성화하는 DNA에 의해 코딩되는, CD40에 결합하는 펩티드;
    (d) 아미노산 194에서 시스테인이 트립토판, 세린, 아스파르트산, 및 리신으로 이루어진 군으로부터 선택된 다른 아미노산으로 대체된 (a)에 따른 폴리펩티드; 및
    (e) CD40에 결합하는 (d)의 폴리펩티드의 프래그먼트;
    및 올리고머 형성 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 용해성의 올리고머 CD40 리간드인 방법.
  18. 제16항에 있어서, CD40 결합 단백질이
    (a) 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 261, 35 내지 261, 34 내지 225, 113 내지 261, 113 내지 225, 120 내지 261, 또는 120 내지 225를 포함하는 펩티드;
    (b) CD40에 결합하는 (a)에 따른 펩티드의 프래그먼트;
    (c) 엄격한 조건 하에서 (63℃에서 밤새 6 X SSC에서 혼성화; 55℃에서 3 X SSC로 세척) (a) 또는 (b)의 펩티드를 코딩하는 DNA에 혼성화하는 DNA에 의해 코딩되는, CD40에 결합하는 펩티드;
    (d) 아미노산 194에서 시스테인이 트립토판, 세린, 아스파르트산, 및 리신으로 이루어진 군으로부터 선택된 다른 아미노산으로 대체된 (a)에 따른 폴리펩티드; 및
    (e) CD40에 결합하는 (d)의 폴리펩티드의 프래그먼트;
    및 올리고머 형성 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 용해성의 올리고머 CD40 리간드인 방법.
  19. (a) 수상돌기 세포를 개인으로부터 수득하는 단계;
    (b) (i) 항원의 흡수 및 처리를 촉진하는 조건 하에서 배양물에서 수상돌기 세포를 항원에 노출시키거나, 또는 (ii) 수상돌기 세포를 항원을 코딩하는 유전자로 트랜스펙션시킴으로써 수상돌기 세포가 항원을 발현하게 하는 단계;
    (c) CD40L에 대한 용해성 CD40의 결합의 약 90% 이상의 억제율을 관찰함으로써 측정되는 바와 같이 CD40에 결합할 수 있고 CD40L에 대한 CD40의 결합을 억제시킬 수 있는 CD40 결합 단백질에 항원 발현 수상돌기 세포를 노출시킴으로써 상기 수상돌기 세포를 활성화시키는 단계; 및
    (d) 수상돌기 세포가 항원을 T 세포에 제시하게 하는 단계에 의해 제조된 항원 특이 T 세포 집단.
  20. 제19항에 있어서, CD40 결합 단백질이
    (a) 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 261, 35 내지 261, 34 내지 225, 113 내지 261, 113 내지 225, 120 내지 261, 또는 120 내지 225를 포함하는 펩티드;
    (b) CD40에 결합하는 (a)에 따른 펩티드의 프래그먼트;
    (c) 엄격한 조건 하에서 (63℃에서 밤새 6 X SSC에서 혼성화; 55℃에서 3 X SSC로 세척) (a) 또는 (b)의 펩티드를 코딩하는 DNA에 혼성화하는 DNA에 의해 코딩되는, CD40에 결합하는 펩티드;
    (d) 아미노산 194에서 시스테인이 트립토판, 세린, 아스파르트산, 및 리신으로 이루어진 군으로부터 선택된 다른 아미노산으로 대체된 (a)에 따른 폴리펩티드; 및
    (e) CD40에 결합하는 (d)의 폴리펩티드의 프래그먼트;
    및 올리고머 형성 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 용해성의 올리고머 CD40 리간드인 집단.
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