NO311808B1 - Löselige ligander for CD40 - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører løselige

ligander for CD40 avledet fra humant gp39-protein, som kan anvendes i fremgangsmåter til iverksettelse av B-celle-proliferasjon.

2. BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

2.1. B-CELLE-ANTIGENET, CD40

CD4 0 er et omtrent 50 kDa glykoprotein som uttrykkes

på overflaten av B-celler, follikulære dendrittiske celler, normalt basalt epithelium, og noen carcinoma- og melanoma-avledede cellelinjer (Paulie et al., 1985, Cancer Immunol. Immunother., 20:23-28, Clark og Ledbetter, 1986, Proe. Nati. Acad. Sei. 83:4494-4498, Ledbetter et al.,

1987, J. Immunol. 138:788-794, Ledbetter et al., 1987, i "Leukocyte Typing III", McMichael, red., Oxford U. Press,

s. 432-435, Paulie et al., 1989, J. Immunol. 142:590-595, Young et al., 1989, Int. J. Cancer 43:786-794, Galay et

al., 1992, J. Immunol. 149-775). Isolasjon av en human cDNA som innkoder CD4 0 viste at dette protein er en type I membranprotein som er signifikant beslektet med medlemmene av reseptorfamilien for nervevekst (Stamenkovic et al.,

1989, EMBO J. 8:1403-1410).

Rollen av CD40 i B-celleaktivering er veletablert. Tverrbinding av CD40 med anti-CD40 monoklonale antistoffer (mAb) induserer B-celleaggregering via LFA-I (Gordon et

al., 1988, J. Immunol. 140:1425-1430, Barrett et al.,

1991, J. Immunol. 146:1722-1729), øker serin/threonin (Einfeld et al., 1988, EMBO J. 7:711-717) og tyrosin (Uckun et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:17478-17485) fosforylering av et antall intracellulære substrater, og frembringer et "kompetanse"-signal som tillater B-celler å proliferere og gjennomgå klasseskifting ved stimulanse med det egnede andre signal. Eksempelvis kan anti-CD40 mAb synergisere med phorbolmyristylacetat (PMA, Gordon et al., 1987, Eur. J. Immunol. 17:1535-1538) eller anti-CD20 Mab (Clark og Ledbetter, 1986, Proe. Nati. Acad. Sei. 83:4494-4498) til induksjon av B-celleproliferasjon, med IL-4 til induksjon av B-celleproliferasjon (Gordon et al., 1987, Eur. J. Immunol. 17:1535-1538, Rousset et al., 1991, J. Exp. Med. 173:705-710) og IgE-sekresjon (Jabara et al., 1990, J. Exp. Med. 172:1861-1864, Rousset et al., 1991, J. Exp. Med. 173:705-710, Gascan et al., 1991, J. Immunol. 147:8-13, Zhang et al., 1991, J. Immunol. 146:1836-1842, Shapira et al., 1992, J. Exp. Med. 175:289-292) og med IL-10 og TGF-fi til induksjon av IgA-sekresjon ved sIgD<+> B-celler (DeFrance et al., 1992, J. Exp. Med. 175:671-682). Dessuten foreligger det indikasjon for at CD4 0-avleverte signaler er involvert i modulering av cytokinproduksjonen ved aktiverte B-celler (Cairns et al., 1988, Eur. J. Immunol. 18:349-353, Clark og Shu, 1990, J. Immunol. 145:1400-1406) .

Tverrbinding av anti-CD40 mAb alene er ikke til-strekkelig til å indusere B-celleproliferasjon, hvilket demonstreres av den observasjon at anti-CD4 0 mAb som er immobilisert i plast i forening med IL-4 er ute av stand til å indusere kraftig B-celleproliferasjon (Banchereau et al., 1991, Science 251:70-72). Imidlertid er anti-CD40 mAb som er immobilisert på L-celler fra musefamilien som er transfektert med en Fc-reseptor, CDw32, i stand til å indusere B-celleproliferasjon i nærvær av IL-4 (Banchereau et al., 1991, Science 251:70-72), hvilket antyder at et signal som frembringes av fibroblastene synergiserer med CD40-signalet og IL-4 for å drive B-celleproliferasjon.

2.2. T-CELLEANTIGENET, GP39

Løselige former av det ekstracellulære domene av human CD40, slik som CD40-Ig, har vært benyttet til å vise at CD40-liganden, gp39, er et glykoprotein av omtrent 3 0 kDa som uttrykkes på overflaten av aktiverte CD4<+> T-celler fra musefamilien. (Armitage et al., 1992, Nature 357:80-82, Noelle et al., 1992, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:6550-6554). Interaksjon med gp39 induserer hvilende B-celler til å gå inn i cellecyklusen og bli reaktive ovenfor lymfokiners vekst- og differensieringseffekter (Armitage et al., 1992, Nature 357:80-82, Noelle et al., 1992, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:6550-6554).

Nylig har en cDNA som koder for gp39 fra musefamilien blitt isolert og vist å være funksjonelt aktiv når den uttrykkes som et membranprotein på transfekterte celler (Armitage et al., 1992, Nature 357:80-82). Denne cDNA koder for et 260 aminosyrers polypeptid med de typiske trekk for et type II membranprotein, og CVl/EBNA-celler som uttrykker gp3 9 fra musefamilien ble vist å indusere murin (musefamilien) og human B-celleproliferasjon uten ytterligere ko-stimulus.

3. OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Den foreliggende oppfinnelse vedrører løselige ligander for CD40 avledet fra humant gp39-protein. Den er, i det minste delvis, basert på iakttagelsen, kloningen og ekspresjonen av det humane T-celle-antigen gp39, en ligand for CD40-reseptoren. Den er også basert, til dels, på fremstilling av en løselig form av human gp3 9 som, sammen med et ko-stimulerende middel, er i stand til å iverksette B-celleproliferasjon og differensiering.

Den foreliggende oppfinnelse frembringer løselige former av humant gp39-protein med en sekvens i det vesentlige som fremstilt i fig. 1, så vel som essensielt renset og isolert nukleinsyre med en sekvens i det vesentlige som fremstilt i fig. 1 og/eller som innkoder det humane gp39-protein.

Den foreliggende oppfinnelse besørger dessuten løse-lige former av human, så vel som et ikke-human, gp39. I en foretrukken, ikke-begrensende utførelsesform ifølge oppfinnelsen, kan løselig gp3 9 produseres ved anvendelse av ekspresjonsvektoren CD8-gp3 9.

Den løselige gp39 ifølge oppfinnelsen kan, sammen med ko-stimulerende midler, anvendes til å iverksette proliferasjon av B-celler in vivo eller in vi tro. Slik proliferasjon kan være ønskelig i behandling av tilstander som vil ha nytte av en økt immunrespons, slik som ervervet immundefektsyndrom (aids) eller for dannelse av et celle-dyrkingssystem for langtids B-cellevekst.

4. FIGURBESKRIVELSE

Fig. 1. Nukleotid- og forutsagt aminosyre-sekvens for human gp3 9 og homologi overfor murin gp3 9, TNFa og TNFS.

(A) Nukleotidsekvensen og den translaterte åpne

leseramme [SEQ. ID NO: 2] er nummerert til venstre. Seter

for potensiell N-bundet glykosylering er merket (CHO), det forutsagte transmembrandomene (TM) er understreket og de to Arg-rester som er lokalisert ved knutepunktet mellom de forutsagte transmembran- og ekstracellulære domener er dobbelt understreket. Nukleotid- og aminosyrenummerering er oppgitt til venstre.

(B) Sammenligning mellom de forutsagte aminosyre-sekvenser for human gp3 9 (H-gp3 9) [SEQ. ID NO: 3], murin

(M-gp39) [SEQ. ID NO: 43], human TNFa (H-TNFof) [SEQ. ID NO: 5] og human TNF1S (H-TNF6) [SEQ. ID NO: 6] . Aminosyrer som var felles for i det minste tre proteiner er vist inn-rammet . Lignende aminosyrer som deles av i det minste tre av proteinene, er vist skyggelagt.

Fig. 2. Løselig rekombinant human gp39 og CD72, sgp39 og sCD72. (A) Det cDNA-fragment som koder for det ekstracellulære domene av murin CD8 er betegnet mu-CD8 EC. Den murine CD8-aminoterminale sekresjonssignalsekvens er vist stiplet. Det cDNA-fragment som koder for det ekstracellulære domene av gp39 eller CD72 er betegnet hhv. hu-gp39 EC og hu-CD72 EC. De forutsagte aminosyre-sekvenser på stedet for sammensmeltingen mellom det ekstracellulære domene på murint CD8 og humant gp39 [SEQ. ID NO: 7]

(kursiv) eller CD72 [SEQ. ID NO: 8] (kursiv) er vist under de enkelte diagrammer. Rester som er innført ved knutepunktet mellom de to cDNA-fragmenter er vist understreket. Det unike gjenkjennelsespunkt for BamHI-restriksjonsenzym ved skjøten mellom de to gener er vist. (B) Radioaktivt merkede proteiner fra supernatantene av metabolisk merket etterligning (banene 1 og 2) av CD8-gp3 9 (banene 3 og 4) - transfekterte COS-celler ble immunoutfelt basert på deres interaksjon med det anti-murine CD8 mAb 53-6 (banene 1 og 3) eller med CD40-Ig (banene 2 og 4) og analysert ved SDS-PAGE under reduserende betingelser som beskrevet i teksten. Den elektroforetiske mobilitet av molekylmasse-standarder for den indikerte masse i kDa er vist til venstre. (C) Radioaktivt merkede proteiner fra supernatantene av metabolisk merket etterligning (banene 1-4) og CD8-CD72 (banene 5-8) -transfekterte COS-celler ble utvunnet på basis av deres reaktivitet ovenfor det anti-murine mAb 53,6 (banene 1 og 5), det anti-CD72 mAb J3I01 (banene 2 og 6), det anti-CD72 mAb BU41 (banene 3 og 7) og CD40-Ig (banene 4 og 8) og analysert ved SDS-PAGE under reduserende betingelser som beskrevet i teksten. Den elektroforetiske mobilitet av molekylmasse-standarder av den indikerte masse i kDa er vist til venstre.

Fig. 3. Binding av sgp39 eller CD40-Ig til transfekterte COS-celler. COS-celler som var transfektert med enten en gp39 (A og B) eller et CD40 (C - F) cDNA-ekspresjonsplasmid ble undersøkt med hensyn på deres evne til å binde enten løselig rekombinant CD4 0 (A og B), eller løselig rekombinant gp3 9 (C og D), eller det anti-CD40 mAb G28-5 (E og F), som beskrevet i teksten. Fase (A, C og E og fluorescens (B, D og F) bilder av representative baner er vist. Fig. 4. Karakterisering av interaksjonen sgp3 9/CD4 0-Ig. Evnen av økende konsentrasjoner av CD4 0-Ig (0,6 /im/ml til 20 fim/ ml) og det kontrollimmunoglobulinfusjonsprotein, Leu8-Ig (0,6 Atg/ml til 20 /xm/ml) , til å binde immobilisert sgp3 9 ble undersøkt ved ELISA som beskrevet i teksten. Likeledes ble evnen av økende konsentrasjoner av CD40-Ig til å bindes til det immobiliserte kontrollfusjonsprotein sCD72 også undersøkt på samme måte. I begge tilfeller ble sgp3 9 og sCD72 immobilisert på plast som på forhånd var belagt med det anti-murine CD8 mAb 53-6 som beskrevet i teksten. Fig. 5. Aktivering av humane perifere B-blodceller ved sgp39. Evnen til rekombinant gp39 (sgp39, skraverte stolper) eller løselig rekombinant kontrollfusjonsprotein (sCD72, sorte stolper) til å stimulere proliferasjonen av hvilende humane perifere B-blodceller alene eller i forening med anti-CD20 mAb IF5 (+ IF5) eller PMA (+ PMA) ble undersøkt som beskrevet i teksten, evaluert ved [^H]-tymidin-inkorporering og sammenlignet med den for B-celler som var inkubert i et tilsvarende tidsrom i fravær av eksogene stimuli (celler alene, hvite stolper) eller i nærvær av enten IF5 alene eller PMA alene (hvite stolper). Fig. 6. Aktivering av tette humane tonsillare B-celler ved sgp39. Evnen til løselig rekombinant gp39 (sgp3 9, skraverte og sorte stolper) til å stimulere tette tonsillare B-cellers proliferasjon alene eller i forening med anti-CD20 mAb IF5 (+ IF5) eller PMA (+ PMA) ble undersøkt som beskrevet i teksten, evaluert ved [<3>H]-tymidin-inkorporering og sammenlignet med den for B-celler som var inkubert alene (celler alene, hvite stolper) eller i nærvær av enten IF5 alene eller PMA alene (hvite stolper). Evnen til CD40-Ig (sorte stolper) til å blokkere den sgp39-drevne B-celleaktivering ble undersøkt ved en konsentrasjon på 20 mg/ml (A) og sammenlignet med en lik konsentrasjon av et irrelevant immunoglobulin-fusjonsprotein, Leu-8-Ig (sorte stolper, B) . Fig. 7. Aminosyre [SEQ. ID NO: 9] og nukleinsyre [SEQ. ID NO: 10] sekvens for murin CD8. Fig. 8. Aminosyre [SEQ. ID NO: 11] og nukleinsyre [SEQ. ID NO: 12] sekvens for human CD8.

5. DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Av hensyn til beskrivelsens klarhet og ikke for å begrense, er den detaljerte beskrivelse av oppfinnelsen oppdelt i følgende underpunkter: (i) kloning og ekspresjon av human gp39 (hgp39)

(ii) preparering av løselig gp39 (sgp39)

(iii) utnyttelse av oppfinnelsen.

5.1. KLONING OG EKSPRESJON AV HUMAN GP39

Den foreliggende oppfinnelse besørger i det vesentlige rensede og isolerte nukleinsyrer som innkoder hgp3 9, i det vesentlige renset og isolert hgp39-protein, og fremgangsmåter til ekspresjon av hgp39. Den fullstendige nukleinsyre-sekvens for hgp39 (tilsvarende til cDNA) og den fullstendige aminosyre-sekvens for hgp3 9 er presentert i fig. 1 og finnes i plasmid CDM8-hgp39, som er deponert ved American Type Culture Collection (ATCC) som Escherichia coli, CDM8 MC1061/p3-hgp39 og tildelt aksesjonsnummer 69050. Et eksempel på en ekspresjonsvektor som kan anvendes til frembringelse av løselig hgp39 (shgp39) er plasmid CDM7B"-shgp39 som har blitt deponert ved ATCC som Escherichia coli CDM7B" MC1061/p3-shgp39 og tildelt aksesjonsnummer 69049.

I særskilte utførelsesformer besørger den foreliggende oppfinnelse en i det vesentlige renset og isolert nukleinsyre med en sekvens i det vesentlige som vist i fig. 1, og en i det vesentlige renset og isolert nukleinsyre som koder for et protein med en sekvens i det vesentlige som vist i fig. 1. Den foreliggende oppfinnelse frembringer dessuten et i det vesentlige renset og isolert protein med en sekvens i det vesentlige som vist i fig. 1.

Betegnelsen "i det vesentlige", viser, ved anvendelse heri, at de sekvenser som er vist i fig. 1 kan endres ved mutasjoner, slik som substitusjoner, addisjoner eller utelukkelser som resulterer i et molekyl som er funksjonelt ekvivalent med et protein som har en sekvens som vist i fig. 1. Eksempelvis, på grunn av degenerasjon av den genetiske kode, kan nukleinsyre-sekvensen som er vist i fig. 1 endres, forutsatt at den endelige sekvens koder for et protein med den samme sekvens som vist i fig. 1 eller en funksjonelt ekvivalent sekvens, dvs. en aminosyre-sekvens hvori funksjonelt ekvivalente aminosyrer, slik som aminosyrer fra den samme gruppe (eksempelvis hydrofobe, polare, basiske eller sure), i stedet settes inn i proteinet.

Eksempelvis kan én eller flere aminosyre-rester innen sekvensen erstattes med en annen aminosyre av en lignende polaritet som fungerer som en funksjonell ekvivalent, hvilket resulterer i en taus endring. Substitutter for aminosyren innen sekvensen kan utvelges fra andre medlemmer av den klasse som aminosyren tilhører. Eksempelvis inkluderer de ikke-polare (hydrofobe) aminosyrer alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, fenyl-alanin, tryptofan og glutamin. De positivt ladede (basiske) aminosyrer inkluderer arginin, lysin og histi-din. De negativt ladede (sure) aminosyrer inkluderer aspa-raginsyre og glutaminsyre. Proteinene ifølge oppfinnelsen kan også modifiseres differensielt i løpet av eller etter translasjon, eksempelvis ved fosforylering, glykosylering, tverrbinding, acylering, proteolytisk spalting, etc.

Genomiske eller cDNA-kloner som inneholder hgp39-innkodende sekvenser, kan identifiseres, eksempelvis ved syntetisering av oligonukleotid-prober som inneholder et parti av den hgp39-sekvens som er vist i fig. 1, og ved anvendelse av slike prober i hybridiseringsreaksjonen ved metoden til Benton og Davis (1977, Science 196:180) eller Grunstein og Hogness (1975, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 72:3961-3965). På samme måte kan oligonukletid-primere som inneholder et parti av den hgp39-sekvens som er illustrert i fig. 1, prepareres og benyttes i polymerasekjede-reaksjoner (Saiki et al., 1985, Science 230:1350-1354), eksempelvis ved anvendelse av cDNA fra aktiverte T-lymfo-cytter som mal, for å generere hgp39-sekvenser som kan sammensettes for å danne eller på annen måte identifisere en sekvens av full lengde som innkoder hgp3 9.

I en spesifikk, ikke-begrensende utførelsesform ifølge oppfinnelsen kan cDNA som innkoder hgp39 isoleres og karakteriseres som følger. CD40-Ig, som beskrevet i Noelle et al., 1992, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 89:6550-6554, kan modifiseres ved innføring av tre mutasjoner, nemlig L234F, L235E og G237A, i immunoglobulindomenet, noe som svekker bindingen til Fc-reseptorer. Den modifiserte CD40-Ig kan renses fra COS-cellesupernatanter, som beskrevet i Aruffo, 1990, Cell 61:1303-1313. Human gp39 cDNA kan oppformeres ved polymerasekjedereaksjonen (PCR) fra et bibliotek som er preparert fra fytohemagglutin-aktiverte humane perifere T-blodceller (Camerini et al., 1989, Nature 342:78-82). Oligonukleotid-primerne kan utformes på basis av sekvensen til murin gp3 9 (Armitage et al., 1992, Nature 357:80-82) og kan modifiseres til å inkludere spaltningspunkter for restriksjonsenzymene Xbal og Hindlll, som skal anvendes i subkloning av PCR-produktet. Eksempelvis, og uten å skulle begrense, kan de føl-gende oligonukleotider anvendes: 5'-GCG AAG CTT TCA GTC AGC ATG ATA GAA ACA-3' [SEQ. ID NO: 13] og 5-CGC TCT AGA

TGT TCA GAG TTT GAG TAA GCC-3'[SEQ. ID NO: 14].

Oppformering kan utføres med Taq-polymerase og den av produsenten (Perkin Eimer Cetus Corp., Norwalk, CT, USA) anbefalte reaksjonsbuffer ved anvendelse av 30 sykluser av følgende temperaturprogram: 95°C 2 minutter, 55°C 2 minutter, 72°C 3 minutter. PCR-produktet kan spaltes med HindiII og Xbal og bør finnes å inneholde et internt Hindlll-restriksjonspunkt. Det resulterende HindiII-Xbal-fragment kan deretter subklones til en egnet vektor, slik som eksempelvis CDM8-vektoren. Det komplette genprodukt kan konstrueres ved å subklone Hindlll-Hindlll-fragmentet inn i den vektor som inneholder HindiII-Xbal-fragmentet. Den resulterende konstruksjon kan deretter transfekteres inn i COS-celler ved anvendelse av DEAE-dekstran, som beskrevet i Aruffo, 1990, Cell 61:1303-1313. Trans-fektanter kan farges med CD40-Ig (25 fig/ val i DMEM-media) fulgt av FITC-konjugert geits anti-humant IgG Fc antistoff (1:50 fortynning i DMEM, TAGO, Burlingame, CA, USA) og gjøres synlig ved immunofluorescens-mikroskopering. En klon som inneholder den fullstendige hgp39-sekvens kan fås ved kolonihybridisering, som beskrevet i Sambrook et al., 1989, i "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, USA. PCR-produktets subklonede Hindlll-Hindlll-fragment kan anvendes til å generere en <32>P-merket probe ved tilfeldig primet polymerisering. Plasmid DNA fra flere individuelle kloner kan transfekteres inn i COS-celler, og transfektantene kan farges med CD4 0-Ig. Kloner som gir oppgav til positivt fargende COS-celletransfektanter kan deretter ytterligere karakteriseres ved restriksjonsfragment-kartlegging og -sekvensering.

Når det foreligger, kan hgp39-genet klones eller subklones ved anvendelse av enhver i faget kjent metode. Et stort antall vektor-vertssystemer som er kjent innen faget, kan anvendes. Mulige vektorer inkluderer, men er ikke begrenset til kosmider, plasmider eller modifiserte viruser, men vektorsystemet må være kompatibelt med den vertscelle som benyttes. Slike vektorer inkluderer, men er ikke begrenset til, bakteriofager, slik som lambda-deriva-ter, eller plasmider, slik som pBR322, puC, eller Blue-script<®> (Stratagene) -plasmidderivater. Rekombinant-mole-kyler kan introduseres inn i vertscellene via transforma-sjon, transfeksjon, infeksjon, elektroforering, etc.

hgp3 9-genet kan innsettes i en kloningsvektor som kan anvendes til å transformere, transfektere eller infektere egnede vertsceller slik at eventuelle kopier av gen-sekvensen genereres. Dette kan oppnås ved å ligere DNA-fragmentet inn i en kloningsvektor som har komplementa-riske kohesive termini. Dersom imidlertid de komplementa-riske restriksjonspunkter som anvendes til å fragmentere

DNA ikke foreligger i kloningsvektoren, kan DNA-mole-kylenes ender modifiseres enzymatisk.

For å uttrykke rekombinant hgp3 9, kan den nukleotid-sekvens som koder for hgp39-protein, eller et parti derav, settes inn i en egnet ekspresjonsvektor, dvs. en vektor som inneholder de nødvendige elementer for transkripsjon og translasjon av den innsatte peptid/protein-kodende sekvens. De nødvendige transkripsjons- og translasjons-signaler kan også tilføres av det naturlige hgp39-gen og/eller dets flankerende regioner. Et utvalg verts/vektor-systemer kan benyttes til å uttrykke den proteinkodende sekvens. Disse inkluderer, men er ikke begrenset til, pattedyrcelle-systemer som er infektert med virus (eksempelvis vacciniavirus, adenovirus, etc.) eller transfektert med plasmid-ekspresjonsvektor; insektscelle-systemer som er infektert med virus (eksempelvis baculovirus); mikroorganismer, slik som gjær, som inneholder gjærvektorer, eller bakterier som er transformert med bakteriofag DNA, plasmid DNA, eller kosmid DNA. Disse vektorers ekspre-sjonselementer varierer i styrke og spesifisitet.

Ekspresjon av nukleinsyre-sekvenser kodende hgp39

eller en del derav kan reguleres ved en andre nukleinsyre-sekvens slik at hgp39-protein eller -peptid uttrykkes i en vert som er transformert med det rekombinante DNA-molekyl. Eksempelvis kan ekspresjon av hgp3 9 styres ved ethvert

promoter-/forsterkerelement som er kjent innen faget. Promotere som kan anvendes til styring av hgp39-ekspresjon inkluderer, men er ikke begrenset til, den tidligere SV40-promoterregion (Benoist og Chambon, 1981, Nature 290:304-310), cytomegalovirus-promoteren, den promoter som rommes i Rous sarcoma-virusets 3' lange gjentagelse (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797), herpes-tymidin-kinase-promoteren (Wagner et al., 1981, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 78:1441-1445), metallotioningenets regulerende sekvenser (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42), prokaryotiske ekspresjonsvektorer, slik som JS-laktamase-promotoren (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proe. Nati. Acad.

Sei. USA 75:3727-3731), promoterelementer fra gjær eller andre fungi slik, som Gal 4-promoteren eller alkohol-dehydrogenase-promoteren; og animalske transkripsjonale styringsregioner, slik som den immunoglobulingen-styringsregion som er aktiv i lymfoidceller (Grosschedl et al. 1984, Cell 38:647-658, Adames et al., 1985, Nature 318:533-538, Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), den beta-globingens styringsregion som er aktiv i myeloidceller (Magram et al., 1985, Nature 315:338-340, Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94), og andre vevsspesifikke eller konstitutive promoter/for-sterkerelementer.

Rekombinant hgp39-protein eller -peptid som uttrykkes i slike systemer kan oppsamles og renses ved vanlige fremgangsmåter, inklusive kromatografi [eksempelvis ione-bytter-; affinitets- (eksempelvis ved anvendelse av CD40 som ligand) og størrelsessorterende kolonnekromatografi] sentrifugering, differensiell løselighet, eller ved en annen vanlig teknikk for rensing av proteiner.

Ifølge den foreliggende oppfinnelse kan hgp39-protein eller -peptid også syntetiseres kjemisk ved anvendelse av vanlige proteinsynteseteknikker.

5.2. PREPARERING AV LØSELIG GP3 9

Den foreliggende oppfinnelse besørger løselige former av human gp39. Slike løselige former av gp39 frembringes ved genetisk modifisering av gp39-kodende nukleinsyre, slik som hgp39-kodende nukleinsyre (se avsnitt 5.1, over, samt fig. 1), til frembringelse av gp39-fusjonsproteiner som omfatter det ekstracellulære domene av gp39, som strekker seg fra aminosyre-rest 47 til aminosyre-rest 261. I tillegg til gp39-aminosyre-sekvens kan fusjonsproteinene ifølge oppfinnelsen dessuten omfatte en molekylær "merkelapp", som kan være et parti av et større protein og som erstatter det transmembrane og cytoplasmiske domener av gp3 9 og frembringer et "håndtak" som reagerer med reagenser og transmembrane domene av gp3 9 med et aminoterminalt signalpeptid som avledes fra et type I membranprotein.

Fordi gp39 er et type II membranprotein og derfor er orientert med et karboksyterminalt ekstracellulært domene, er det å ønske at merkelappen er orientert aminoterminalt i forhold til det gp39-ekstracellulære domene (gp39 ECD). Fortrinnsvis inneholder merkelapp-peptidet en aminoterminal sekretorisk signalsekvens for å tillate eksport av fusj onsproteinet.

Egnede merkelapp-proteiner inkluderer ekstracellulære proteindomener med veldefinerte tertiære strukturer, slik at muligheten for å påvirke den tertiære struktur til gp3 9 ECD minimaliseres, mens sannsynligheten for vellykket ekspresjon og transport økes. Eksempelvis er det sannsyn-lig at et ECD-protein som er kjent for å ha vært inkorpo-rert i et fusjonsprotein som ble syntetisert og eksportert i høyt utbytte fra et ekspresjonssystem, kan være et egnet merkelapp-protein for løselig gp39.

Et annet kriterium for utvelgelse av et merkelapp-protein er tilgjengeligheten av reagenser som reagerer med merkelapp-proteinet. Eksempelvis innebærer et merkelapp-protein til hvilket ett eller flere monoklonale antistoffer er blittt produsert, fordelen med å frembringe et "håndtak" som kan påvises eller manipuleres med monoklo-nalt antistoff.

Egnede merkelapp-proteiner inkluderer, men begrenses ikke til, ekstracellulære domener av type I membranproteiner, slik som CD8, utskilte proteiner, slik som IL-4, Fc-domener av immunglobeliner, etc. I foretrukne, spesi-fiserte, ikke-begrensende utførelsesformer ifølge oppfinnelsen, er merkelapp-proteinet det murine CD8 som omfatter det ekstracellulære domene (ECD) (beskrevet av Nakauchi et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82:5126-5130) eller dets humane ekvivalent (Kavathas et al., 1984, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:7688). Nukleotid- og aminosyre-sekvensene for murin CD8 er presentert i fig. 7. ECD finnes mellom aminosyre-restene 1 og 174 (nummerering fra nukleinsyre- sekvensens første ATG), slik den koder av nukleinsyre-partiet mellom nukleotid-restene 121 og 708. Nukleotid- og aminosyre-sekvensene for tilsvarende human CD8 er presentert i fig. 8. ECD finnes mellom aminosyre-restene 1 og 161, slik det er innkodet av nukleinsyre-partiet mellom nukleotid-restene 129 og 611.

Som eksempel, og ikke for å begrense, kan den konstruksjon som er illustrert i fig. 2A og beskrevet neden-for i avsnitt 7 anvendes til å frembringe løselige gp3 9 (sgp3 9). Denne konstruksjon kan prepareres som følger: Det ECD av hgp39 kan amplifiseres fra et cDNA-bibliotek som prepareres fra mRNA fra fytohemagglutinin-(PHA)-aktiverte humane perifere blodlymfocytter. De oligo-nukleotide primere kan utformes basert på den sekvens som er vist i fig. 1, og kan modifiseres slik at det plasseres et restriksjonsenzyms spaltingspunkt (eksempelvis et BamHI-spaltingspunkt) i genets 5'-ende, slik at strukturavlesningen kan bevares når fantasigenet konstrueres. De oligonukleotider som kan anvendes er eksempelvis 5'-CGA AGC TTG GAT CCG AGG AGG TTG GAC AAG ATA GAA GAT-3' og 5'-CGC TCT AGA TGT TCA GAG TTT GAG TAA GCC-3'. Polymerase-kjedereaksjon kan utformes ved anvendelse av Pfu-polymerase med buffer som levert av produsenten (Stratagene, LaJolla, CA, USA) med det følgende temperaturprogram: 95°C 5 minutter, 72°C 2 minutter, 55°C 2 minutter, 40 amplifi-kasjonssykluser bestående av 95°C 1 minutt, 55°C 2 minutter, 72°C 3 minutter, 72°C 10 minutter. PCR-produktet kan spaltes med BamHI og Xbal og subklones inn i en vektor som inneholder det gen som koder for enten det murine CD8 (Lyt2a) ECD eller den humane ekvivalent derav. Den resulterende konstruksjon kan deretter transfekteres inn i COS-celler og deretter uttrykkes til dannelse av sgp39, som deretter kan renses ved adsorpsjon og eluering fra en affinitetskolonne som inneholder enten CD4 0-Ig eller en anti-murin CD8 mAb, slik som 53-6, som er immobilisert på en fast bærer, slik som sepharose-perler.

Det kan være ønskelig å bekrefte at sgp39-fusjonsproteiner som er preparert fra gp3 9 ECD og forskjellige merkelapper er i stand til å bindes til CD40. For eksempel kan bindingen av sgp3 9 til CD40 bekreftes i en ELISA-analyse hvori fordypninger på en 96-fordypningers plate kan belegges med anti-merkelapp-antistoff, vasket med fosfatbufret saltvann (PBS) som inneholder 0,05% Tween-20 (TPBS) og deretter blokkeres med IX Specimen Diluent Concentrate (Genetic Systems, 225 ( il/fordypning, 2 timer, romtemperatur). Fordypningene kan deretter vaskes med TPBS. Supernatanter fra COS-celler som uttrykker sgp39 eller en negativ kontrollprøve kan tilsettes (150 fil/fordypning) , og platene kan inkuberes ved 4°C over natten. Fordypningene kan så vaskes med TPBS og deretter med CD40 (eksempelvis i form av CD40-Ig fusjonsprotein) eller negativt kontrollprotein, som med fordel kan tilsettes i form av serielle fortynninger i PBS som inneholder 1 mmol CaCl2 og 1 mmol MgCl2, 20 //g/ml til 0,6 jug/ml, 100 /il/fordypning, 1 time, romtemperatur) . Fordypningene kan deretter vaskes med TPBS og binding av CD40 til de sgp39-belagte fordypninger påvises. Eksempelvis kan binding av CD40-Ig til sgp39-belagte fordypninger påvises ved tilsats av peroksidase-konjugert geits F(ab')2 anti-human IgG, fulgt av kromogent substrat (eksempelvis Genetic Systems kromogen fortynnet 1:100 i EIA Buffered Substrate, Genetic Systems, 100 /xl/fordypning) . Den kromogene reaksjon kan stoppes etter 10 minutter med tilsats av Stop Buffer (Genetic Systems, 100 ( il/ fordypning) og absorbansen kan måles på en ELISA-avleser ved to forskjellige bølge-lengder (450 nm, 630 nm). Alternativt kan ELISA utføres ved immobilisering av CD40 (eksempelvis CD40-Ig) på plater som er belagt med antistoff (eksempelvis gjeit anti-human Fc), og binding av sgp39 fra økede fortynninger av COS-cellesupernatant kan påvises ved anvendelse av anti-merke-lapps antistoff.

Dessuten kan evnen til sgp3 9 til å bindes til CD40 bekreftes ved proliferasjonsanalyse av B-celler på følgende måte: Perifert blods mononukleære celler kan isoleres ved sentrifugering gjennom Lymphocyte Separation Medium (Litton Bionetics, Kensington, MD, USA). Humane B-lymfocytter kan anrikes fra PBMC ved at celler føres gjennom nylonkolonner (Wako Chemicals USA, Inc., Richmond, VA, USA) og innhøsting av adherende celler. Cellene kan deretter behandles med leu-leu-metylester (Sigma, St. Louis, MO, USA) for å uttynne monocytter og NK-celler. Den resulterende cellepopulasjon kan analyseres ved strøm-ningscytometri på en EPICS C (Coulter Electronics, Hialeah, FLA, USA) for å bestemme prosentandelen B-celler.

Tonsillare B-celler kan prepareres fra intakte tonsiler ved finhakking til frembringelse av en tonsillar cellesuspensjon. Cellene kan deretter sentrifugeres gjennom Lymphocyte Separation Medium, vaskes to ganger, og deretter fraksjoneres på en diskontinuerlig Percoll-gradient. Celler med en tetthet over 50% kan samles opp, vaskes to ganger og anvendes i proliferasjonsanalyser.

Måling av proliferasjon kan utføres ved dyrking av B-celler i firedoble prøver i flatbunnede 96-fordypningers mikrotiter-plater med 5 x 10<4> celler pr. fordypning i fullstendig RPMI-medium som inneholder 10% føtalt kalve-serum. Supernatanter av COS-celler som uttrykker sgp3 9 eller sammenlignende konstruksjon, fortynnet 1:4, pluss PMA (10 ng/ml, LC Services, Woburn, MA, USA) eller 1F5 (anti-CD20, 1 /il/ml), kan tilsettes til kulturene, og deretter kan B-celleproliferasjon måles ved opptak av [<3->H]-tymidin (6,7 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, MA, USA) etter 5 dagers dyrking og en puls over natten (cellene kan innhøstes på glassfiberfiltre og radioaktiviteten kan måles i en væskescintilasjonsteller). En oppgang i B-celleproliferasjon (fortrinnsvis med i det minste ca. 100%) over sammenlignende prøvers nivåer assosiert med en særskilt form av sgp3 9 indikerer at sgp3 9 samvirker med CD40 på B-cellers overflate og er biologisk aktiv.

Den foreliggende oppfinnelse besørger en i det vesentlige renset og isolert nukleinsyre som omfatter en sekvens i det vesentlige som vist i fig. 1 fra nukleotid-restene 160 - 787, som kan anvendes til produksjon av fusjonsproteinene ifølge oppfinnelsen. Altså besørger den foreliggende oppfinnelse også en i det vesentlige renset og isolert nukleinsyre som omfatter en sekvens i det vesentlige som vist i fig. 1 fra nukleotid-restene 160 - 787, og som dessuten omfatter en sekvens som innkoder et ekstracellulært domene av et et membranprotein av Type I. I foretrukne utførelsesformer er dette membranprotein murint eller humant CD8-protein. I en spesifikk, ikke-begrensende utførelsesform av oppfinnelsen er dette membranproteins ekstracellulære domene det ekstracellulære domene fra murin eller human CD8 fra henholdsvis aminosyre-restene 1 - 174 og 1 - 161, som kodet for ved sekvensen mellom nukleotidene 121 - 708, som illustrert i fig. 7, og restene 129 - 611 i fig. 8. I en foretrukket spesifikk utførelsesform ifølge oppfinnelsen, rommes denne i det vesentlige rensede og isolerte nukleinsyre i plasmid CDM7B" MC1061/p3-shgp39, slik det er deponert ved ATCC og tildelt aksesjonsnummer 69049. Den foreliggende oppfinnelse besørger videre proteiner som slike nukleinsyrer koder for.

Eksempelvis frembringer den foreliggende oppfinnelse et i det vesentlige renset og isolert protein som omfatter en sekvens i det vesentlige som vist i fig. 1 fra aminosyre-restene 47 - 261, og dette i det vesentlige rensede og isolerte protein av omfatter videre et ekstracellulært domene av et membranprotein av Type I. I foretrukne utførelsesformer er membranproteinet murint eller humant CD8-protein, og i en spesifikk, ikke-begrensende utførelsesform ifølge oppfinnelsen er det ekstracellulære domene av dette membranprotein det ekstracellulære domene fra henholdsvis murin eller human CD8, fra henholdsvis aminosyre-restene 1 - 174 og 1 - 161. I en foretrukket, spesifikk, ikke-begrensende utførelsesform av oppfinnelsen er det i det vesentlige rensede og isolerte protein frembrakt ved ekspresjon av plasmid CDM7B- MC1061/p3-

shgp3 9, som deponert ved ATCC og tildelt aksesjonsnummer 69049.

5.3. UTNYTTELSE AV OPPFINNELSEN

Den foreliggende oppfinnelse frembringer en fremgangsmåte til iverksettelse av proliferasjon og/eller differensiering av CD40-bærende celler, idet fremgangsmåten omfatter at cellene eksponeres for en effektiv konsentrasjon av et løselig gp39-protein, som beskrevet i avsnitt 5.2, ovenfor.

I de foretrukne utførelsesformer anvendes oppfinnelsen til å fremme proliferasjonen og/eller differensie-ringen av B-celler som kan ha blitt aktivert forut for eksponering for det løselige gp39-protein, samtidig med eksponering for løselig gp39-protein eller, mindre å foretrekke, etter eksponering for løselig gp39-protein, hvori det løselige gp39-protein fremdeles er til stede. Aktivering av B-celler kan utføres ved enhver innen faget kjent fremgangsmåte, inklusive eksponering ovenfor ko-st imulerende midler inklusive, men ikke begrenset til, anti-immunoglobulin-antistoff, antistoff rettet mot en B-celles overflate-antigen (eksempelvis CD20), forbylmyri-stylacetat (PMA), ionomycin, eller løselige eller over-flatebundne cytokiner (eksempelvis IL-4).

En effektiv konsentrasjon av løselig gp39 defineres heri som en konsentrasjon som resulterer i en økning i aktivert B-celle-proliferasjon på minst 100% i forhold til proliferasjon av aktiverte B-celler som ikke eksponeres for gp3 9 eller andre mediatorer for B-celle-proliferasjon (se eksempelvis avsnitt 5.1 over og avsnitt 7.1.3 neden-for) . For eksempel, kan en konsentrasjon på ca. 0,005 - 2,5 /ig/ml og aller helst ca. 0,1 - 0,25 /xg/ml anvendes.

Som vist i US-patentsøknad 708.075, som i sin helhet under henvisning medtas heri, har de løselige gp39-proteiner ifølge oppfinnelsen et antall anvendelser, inklusive in vi tro- og in vivo-anvendelser.

Ifølge én utførelsesform ifølge oppfinnelsen kan løselig gp3 9 anvendes til å frembringe et in vitro celle-dyrknings-system for langtids B-cellevekst. Dette kan særskilt være nyttig ved preparasjon av antigen-spesifikke B-cellelinjer.

I en annen in vitro-utførelsesform kan løselig gp3 9 anvendes til å identifisere eller separere celler som uttrykker CD40-antigen og/eller til å analysere kropps-væske med hensyn på nærvær av det CD40-antigen som avgis eller ikke. Eksempelvis kan bindingen av løselig gp39 til CD4 0-antigen påvises ved direkte eller indirekte merking av det løselige gp3 9, eksempelvis ved inkorporering av radioaktiv merking eller kromogen i det løselige gp39-protein (direkte merking) eller via anti-gp39-antistoff (indirekte merking). På denne måte kan løselig gp39 anvendes diagnostisk in vitro til identifikasjon av CD40-antigen, slik det uttrykkes i tumorer, ondartede celler, kropps-væsker, etc.

I relaterte utførelsesformer kan direkte eller indirekte merket løselig gp3 9 anvendes i in vivo for å avbilde celler eller tumorer som uttrykker CD40-antigenet.

I forskjellige andre in vivo utførelsesformer kan løselig gp3 9 anvendes til å øke en immunrespons, eksempelvis ved effektivt å fungere som en type "tilsatsstoff" for å øke en immunrespons overfor en vaksine. Alternativt kan løselig gp3 9 anvendes til å øke immunresponsen for et immunosuprimert individ, slik som en person som lider av ervervet immundefekt syndrom, av ondartethet, eller et lite barn, eller en eldre person.

I diverse øvrige utførelsesformer ifølge oppfinnelsen kan løselig gp3 9 modifiseres kjemisk slik at cellene som den forbindes til, drepes. Siden alle B-celler uttrykker CD4 0, ville denne tilnærmelsesform resultere i under-trykkelse av immunresponsen. Eksempelvis kan et cytotok-sisk medikament som er sammenkjedet med løselig gp39 anvendes in vivo for å forårsake immunsuppresjon med sikte på å krysse histokompabilitetsbarrierer i transplanta-sjonspasienter. Alternativt kan disse modifiserte ligander anvendes til å kontrollere autoimmunsykdommer.

I ytterligere utførelsesformer kan løselig gp3 9 anvendes til å iverksette proliferasjon og/eller differensiering av CD40-bærende celler som ikke er B-celler, eksempelvis sarkom-celler, som et middel til direkte behandling av ondartethet eller som et tillegg til kjemo-terapi .

Den foreliggende oppfinnelse besørger videre produksjon av anti-hgp39-antistoffer, polyklonale eller monoklonale, ved anvendelse av vanlige laboratorieteknikker.

Den foreliggende oppfinnelse besørger også farmasøy-tiske preparater som omfatter en terapeutisk effektiv konsentrasjon av en løselig gp39, slik det er beskrevet i avsnitt 5.2, over, i en egnet farmakologisk bærer.

Slike farmasøytiske preparater kan, til et individ med behov for slik behandling, administreres ved enhver egnet administrasjonsmodus, inklusive, men ikke begrenset til, intravenøs, lokal injeksjon, subkutan, intramuskulær, oral, intranasal, rektal, vaginal, intratehcal, etc.

6. EKSEMPEL: DET HUMANE T-CELLEANTIGEN GP3 9, ET MEDLEM AV FAMILIEN TUMOR-NEKROSEGEN ER EN LIGAND FOR CD40-RESEPTOREN PÅ B-CELLER

6.1. MATERIALER OG METODER

CD40-Ig, slik den er beskrevet i Noelle et al., 1992, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:6550-6554, ble modifisert ved introduksjon av tre mutasjoner, nemlig L234F, L235E og G23 7A, i immunglobulindomenet for å svekke bindingen til Fc-reseptorer. Den modifiserte CD40-Ig ble renset fra COS-cellesupernatanter som tidligere beskrevet (Aruffo et al., 1990, Cell 61:1303-1313). Human gp39 CDNA ble amplifisert ved polmerasekjedereaksjon (PCR) fra et bibliotek som var preparert fra mRNA som var isolert fra PHA-aktiverte humane, perifere T-blodceller (Camerini et al., 1989, Nature 342:78-82). Oligonukleotidprimerne ble utformet på basis av sekvensen for den murine gp39 (Armitage et al., 1992, Nature, 357:80-82) og inkluderte punkter for restriksjonsenzymene Xbal og Hindlll til å bli anvendt i subkloning av PCR-produktet. De anvendte oligonukleotider var: 5'-GCG AAG CTT TCA GTC AGC ATG ATA GAA ACA-3' og 5' - CGC TCT AGA TGT TCA GAG TTT GAG TAA GCC-3'. Amplifisering ble utført med Taq-polymerase og den reaksjonscyklus som var anbefalt av produsenten (Perkin Eimer Cetus Corp., Norwalk, CT) ved anvendelse av 3 0 sykluser av det følgende temperaturprogram: 95°C 2 minutter, 55°C 3 minutter, 72°C 3 minutter. PCR-produktet ble spaltet med Hindlll og Xbal, og ble funnet å inneholde et internt Hindlll-restriksjonspunkt. HindiII-Xbal-fragmentet ble subklonet inn i CDM8-vektoren. Det fullstendige genprodukt ble konstruert ved at Hindlll-Hindlll-fragmentet ble subklonet inn i den vektor som inneholdt HindiII-Xbal-fragmentet. Den resulterende konstruksjon ble transfektert inn i COS-celler ved anvendelse av DEAE-tekstran, som beskrevet i Aruffo et al., 1990, Cell 61:1303-1313). Transfektantene ble farget med CD40-Ig (25 /xg/ml i DMEM-media) fulgt av FITC-konjugert geits antihumant IgG Fc-antistoff (1:50 fortynning i DMEM, TAGO, Burlingame, CA, USA) og gjort synlig ved immunoflurescens-mikroskopiering. Den fullstendige humane gp39 fremkom ved kolonihybridisering som beskrevet (Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA). Det subklonede Hindlll-Hindlll-fragment fra PCR-produktet ble anvendt til å generere en <32>P-merket probe ved tilfeldig primet polymerisering. Plasmid-DNA fra tre individuelle kloner ble transfektert inn i COS-celler og cellene ble farget med CD40-Ig. Én klon, klon 19, var positiv med dette kriterium og ble anvendt i resten av studiet. Sekvensen ble bestemt ved dideoksy-sekvensering ved anvendelse av Sequenase<®>

(United States Biochemical Co., Cleveland, OH, USA).

6.2. RESULTATER

En cDNA som innkoder det humane gp3 9 ble mangfoldig-gjort fra et cDNA-bibliotek som var preparert fra mRNA som var isolert fra PHA-aktiverte humane periferie T-blodceller ved polymerasekjedereaksjonen (PCR) ved anvendelse av syntetiske oligonukleotider basert på den murine gp39-sekvens (Armitage et al., 1992, Nature 357:80-82). PCR-produktet ble subklonet inn i ekspresjonsvektoren CDM8 (Seed, 1987, Nature 329:840-842). COS-celler som var transfektert med CDM8-gp39-plasmidet frembrakte protein som forbandt seg med CD40-Ig (Noelle et al., 1992, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:6550-6554). Et fullstendig humant gp3 9-gen ble isolert ved kolonihybridisering fra det samme cDNA-bibliotek som ble anvendt til PCR-amplifiseringen av gp3 9 ved anvendelse av det subklonede PCR-produkt som en probe. Et antall positive kloner ble isolert og analysert ved restriksjonsenzymdigerering. DNA som svarte til de kloner som inneholdt de største innsettinger, 1,8 - 1,5 kb, ble transfektert inn i COS-celler og deres evne til å styre ekspresjonen av et CD40-Ig-bindingsprotein ble undersøkt. Én slik klon var positiv ifølge dette kriterium og ble analysert videre og henvises heretter til som human gp39. Immunoutfelling av cDNA-innkodet humant CD40-Ig-protein fra transfekterte COS-celler ved anvendelse av CD40-Ig viste et enkelt bånd som svarer til en molekylær masse på ca. 32 - 33 kDa. Det COS-celleavledede protein er mindre enn hva som var forventet på grunnlag av tidligere studier av murin gp39, imidlertid er det i mange tilfeller observert at den tilsynelatende molekylære masse av et antall forskjellige T-cellers overflateproteiner som fås fra COS-celletransfektanter er mindre enn de som fås fra T-celler (Aruffo og Seed, 1987, EMBO J. 11:3313-3316, Aruffo et al., 1991, J. Exp. Med. 174:949-952). Disse forskjeller i størrelse kan være resultatet av COS-cellers ufullstendige glykosylering av proteinene.

Det humane gp39-cDNA er av 1,8 kb lengde og innkoder et polypeptid av 261 aminosyrer (aa) med en forutsagt molekylær masse på ca. 29 kDa bestående av et 22 aminosyrers aminoterminalt cytoplastisk domene, et 24 aminosyrers hydrofobt transmembran-domene og et 215 aminosyrers karboksyterminalt ekstracellulært (EC) domene med et N-kjedet glykosyleringspunkt (Asn-X-Ser/Thr) i EC og ett i det cytoplasmiske domene (nukleotidsekvenser som svarer til kodingssekvens og den forutsagte aminosyre-sekvens er vist i fig. la). Proteinets forventede orientering, med en ekstracellulær karboksyterminus, klassifiserer det som et type II membranprotein og forskjellen mellom den forutsagte og observerte molekylære masse antyder at det gjen-nomgår posttranslasjonsmodifikasjoner, sannsynligvis med tillegg av karbohydratgrupper.

Den forutsagte aminosyre-sekvens for human gp39 ble sammenlignet med de i databasen til National Biomedical Research Foundation (NBRF) ved anvendelsen av FASTP-algo-ritmen og ble funnet å ha signifikant homologi med tumor-nekrosefaktor (TNF) cx (Gray et al., 1984, Nature 312:721-724) og IS (Pennica et al., 1984, Nature 312:724-729), Wang et al., 1985, Science 228:149-154) (fig. lb). Det ekstracellulære domene av gp39 er nært beslektet med TNF o; og S, med ca. 25% homologi med hver av dem, på samme måte som TNF ot og TNF S seg imellom har ca. 3 0% homologi (Pennica et al., 1984, Nature 312:724-729).

6.3. DISKUSJON

Overflatereseptorens CD40 evne til å avlevere signaler til B-cellen har blitt etablert ved anvendelse av monoklonale antistoffer (Clark og Ledbetter, 1986, Proe. Nati., Acad. Sei. 83:4494-4498, Gordon et al., 1987, Eur. J. Immunol. 17:1535-1538). For ytterligere å studere rollen til CD40, har en cDNA som innkoder CD40-liganden fra en human kilde blitt isolert og karakterisert.

Isolering av en cDNA-klon som innkoder human gp3 9 viste at denne type II membranprotein er nært beslektet med TNF cx (Gray et al., 1984, Nature 312:721-724) og S (Pennica et al., 1984, Nature 312:724-729), Wang et al., 1985, Science 228:149-154). TNF a og £ er pleiotropisk cytokiner som hovedsakelig eksisterer som utskilte proteiner.

7. EKSEMPEL: EKSPRESJON AV EN LØSELIG FORM AV GP3 9 MED

B-CELLES KO-STIMULERINGSAKTIVITET

7.1. MATERIALER OG METODER

7.1.1. KONSTRUKSJON, KARAKTERISERING OG PREPARERING AV EN

LØSELIG GP3 9-KIMÆRE

Det ekstracellulære domene av det humane gp39 ble amplifisert fra det cDNA-bibliotek som var preparert fra mRNA fra PHA-aktiverte humane perifere blodlymfocytter. Oligonukleotid-primerne ble utformet på basis av sekvens-informasjonen som kom fra det PCR-produkt som er beskrevet i det foregående og ble utformet til å plassere et BamHI-punkt ved genets 5' ende, slik at strukturavlesningen kunne bevares når det kimære gen ble konstruert. De anvendte oligonukleotider var 5'-CGA AGC TTG GAT CCG AGG

TTG GAC AAG ATA GAA GAT-3' og 5'-CGC TCT AGA TGT TCA GAG

TTT GAG TAA GCC-3'. PCR ble utført ved anvendelse av Pfu-polymerase med den buffer som produsenten leverer (Stratagene, La Jolla, CA, USA) med det følgende temperaturprogram: 95°C 5 minutter, 72°C 2 minutter, 55°C 2 minutter, 40 amplifiseringscykler bestående av 95°C 1 minutt, 55°C 2 minutter, 72°C 3 minutter, 72°C 10 minutter. PCR-produktet ble digerert med BamHI og Xbal og subklonet i en vektor som inneholdt det gen som innkoder det murine CD8 (Lyt2a) ekstracellulære domene med et BamHi-restriksjonspunkt som var generert ved PCR. På lignende måte ble det gen som innkoder det ekstracellulære domene av human CD72 generert ved PCR for å inneholde et BamHI-restriksjonspunkt og subklonet i den CD8-holdige vektor på samme måte.

COS-cellers evne til å uttrykke og eksportere shgp39 og sCD72 ble testet. Først ble COS-celler transfektert ved anvendelse av DEAE-dekstran. Én dag etter transfeksjon ble cellene trypsinert og gjensådd (replated). Én dag senere ble cellene fiksert med 2% formaldehyd i PBS (20 min., romtemp.) og permeabilisert med 2% formaldehyd i PBS som inneholdt 0,1% Triton X-100 (20 min., romtemp.). Celler som var transfektert med sgp3 9 ble farget med CD40-Ig (25 fig/ ml i DMEM, 30 min., romtemp.) fulgt av Fl TC-konjugert geits anti-humane Fc antistoff (TAGO, Burlingame, CA, USA) som var fortynnet 1:500 DMEM. Celler som var transfektert med sCD72 ble farget med anti-CD72 antistoff BU40 (The Binding Site, Birmingham, UK), fulgt av FITC-konjugert geits anti-mus Fc antistoff (TAGO, Burlingame, CA, USA) som var fortynnet 1:500 i DMEM.

COS-celler som var transfektert med shgp39- eller sCD72-konstruksjoner eller vektor alene (etterligning) ble dyrket over natten i Cys- og Met-fri DMEM hvortil [<35>S]-L-metionin og [<35>S]-L-cystein var tilsatt (Tran[35S]-merke, ICN, Costa Mesa, CA, 27 /zCi/ml) . Supe mat ant ene ble inn-høstet og sentrifugert ved 1 krpm i 10 minutter. Det ble utvunnet fusjonsproteiner fra supernatanten ved anvendelse av CD40-Ig, 53-6 (anti-murin CD8) pluss geits anti-rotte Fc, BU40, BU41 (The Binding Site, Birmingham, UK) pluss geits anti-mus IgM Fc, eller J3.101 (AMAC Inc., Westbrook, ME, USA). Geite-antistoffer ble anskaffet fra Organon Teknika Co., West Chester, PA, USA. For hver prøve ble 1 ml supernatant, 75 fil protein A-sefarose (Repligen, Cam-bridge, MA, USA) og utfellingsmidlet/utfellingsmidlene blandet og inkubert ved 40°C i 2 timer. Sefarosen ble grundig vasket med PBS som inneholdt 0,01% NP-40 og resus-pendert i belastningsbuffer som inneholdt 5% 6-merkapto-etanol. Proteinene ble underlagt SDS-PAGE i en 8% poly-akrylamidgel. Gelen ble fiksert, tørket og eksponert ovenfor film. COS-cellesupernatanter som inneholdt shgp39 eller sCD72 ble generert ved transfeksjon av COS-celler. Én dag etter transfeksjon ble cellemedia endret til DMEM som inneholdt 2% FBS. Supernatantene ble innhøstet 8 dager etter transfeksjon.

7.1.2. BINDINGSANALYSER

Bindingen av hgp39 og CD40 til deres respektive liganders løselige former ble testet ved farging av transfekterte COS-celler. COS-cellene ble transfektert med CD4 0, hgp3 9 eller vektor alene (etterligning) ved anvendelse av DEAE-dekstran. Én dag etter transfeksjon ble cellene trypsinisert og gjenutsådd. Cellene ble farget den følgende dag. Celler som uttrykte gp3 9 eller etterlig-nings-transfekterte celler ble farget med CD40-Ig (25 /zg/ml) , fulgt av FI TC-konjugert geits- og human Fc. Celler som uttrykte CD40 ble farget ved inkubering med COS-cellesupernatanter som inneholdt shgp39, fulgt av mAb 53-6 (anti-murin CD8, 2,5 /zg/ml) , deretter av FITC-konjugert geits anti-rotte Fc (Organon Teknika Co., West Chester, PA, USA, 1,5 /zg/ml) . Som kontroller, ble COS-celler som uttrykte CD40 farget med FITC-konjugert G28-5 (anti-CD40) eller ved anvendelse av COS-cellesupernatanter som inneholdt sCD72. Alle inkubasjoner ble utført ved romtemperatur i PBS som inneholdt 1 mmol CaCl2, 1 mmol MgCl2 og 2% FBS og den samme buffer ble anvendt til alle vaskinger. Etter farging ble cellene fiksert med 1% paraformaldehyd i

PBS.

Bindingen av shgp39 til CD40-Ig ble undersøkt i en ELISA-analyse. Fordypningene i en 96-fordypningers plate (Immunolon-2, Dynatech) ble belagt med 53-6 antistoff (anti-murin CD8, 10 //g/ml, 100 /ti/fordypning, 50 mmol nat-riumbikarbonat, pH 9,6, 1 time, romtemperatur). Fordypningene ble vasket med fosfatbufret saltvann som inneholdt 0,05% Tween-20 (TPBS) og blokkert med IX Specimen Diluent Concentrate (Genetic Systems, 225 fil/fordypning, 2 timer, romtemperatur). Fordypningene ble vasket (TPBS). Supernatanter fra COS-celler som uttrykte enten sgp39 eller sCD72 ble tilsatt (150 /zl/fordypning) og platene ble inkubert ved 4°C over natten. Fordypningene ble vasket (TPBS) og fusjonsproteinene CD40-Ig eller Leu8-Ig ble tilsatt (serielt fortynnet i PBS som inneholdt 1 mmol CaCl2 og 1 mmol MgCl2, 20 /xg/ml til 0,6 /ig/ml, 100 fil/fordypning, 1 time, romtemperatur. Fordypningene ble vasket (TPBS) og peroksidase-konjugert geits F(ab')2 anti-humane IgG ble tilsatt til hver fordypning (TAGO, Burlingame, CA, USA, 1:5000 fortynning i IX Spee imen Diluent, 100 /il/fordypning, 1 time, romtemperatur). Fordypningene ble vasket (TPBS) og kromogent substrat ble tilsatt (Genetic Systems chromogen fortynnet 1:100 i EIA Buffered Substrate, Genetic Systems, 100 /xl/fordypning. Reaksjonen ble stoppet etter 10 minutter med tilsats av Stop Buffer (Genetic Systems, 100 /il/fordypning) og absorbansen ble målt på en ELI SA-avleser ved to bølgelengder, nemlig 450 eller 630 nm. Dessuten ble ELISA utført ved immobilisering av CD40-Ig på plater som var belagt med geits anti-human Fc. Binding av shgp3 9 fra økende fortynninger av COS-cellersuper-natanter ble påvist ved anvendelse av 53-6 Mab fulgt av FITC-konjugert geits anti-rotte Fc. Fluorescens ble målt på en mikroplateavleser.

7.1.3. ANALYSER AV B-CELLEPROLIFERASJON

Perifere mononukleære blodceller (PBMC) ble isolert ved sentrifugering gjennom Lymhocyte Separation Medium (Litton Bionetics, Kensington, MD, USA). Humane B-lymfo-cytter ble anriket fra PBMC ved at cellene ble ført gjennom nylonkolonner (Wako Chemicals USA, Inc., Richmond, VA, USA) og høsting av adherende celler. Disse celler ble deretter behandlet med leu-leu-metylester (Sigma, St. Louis, MO, USA) for å uttynne monocytter og NK-celler. Den resulterende cellepopulasjon ble analysert ved strømnings-cytometri på en EPICS C (Coulter Electonics, Hileah, FLA, USA), og bestod av 50% humane perifere B-celler.

Tonsillare B-celler ble preparert fra intakte tonsiler ved finoppkutting for å gi en tonsillar cellesuspensjon. Cellene ble deretter sentrifugert gjennom Lymphocyte Separation Medium, vasket to ganger og fraksjonert på en diskontinuerlig Percoll (Sigma, St. Louis, MO, USA) - gradient. Celler med en tetthet over 50% ble oppsamlet, vasket to ganger og anvendt i proliferasjonsanalyser.

COS-celler som var transfektert med gp39-konstruk-sjonen eller vektor alene (COS-etterligning) ble innhøstet fra vevskulturplater med EDTA, vasket to ganger med PBS, suspendert ved 5 x IO<6> celler/ml og bestrålet med 5000 rad fra en 137 Cs kilde. COS-cellene ble anvendt i et forhold på 1:4 (lx IO<4> COS-celler versus 4 x IO<4> B-celler) i pro-lif erasj onsanalyse .

Måling av proliferasjon ble utført ved dyrking av celler i firedoble prøver i flatbunnede 96-fordypningers mikrotiterplater ved 5 x IO<4->celler pr. fordypning i fullstendig RPMI-medium som inneholdt 10% FCS. De anvendte reagenser var 1F5 (anti-CD20, 1 /xg/ml) , PMA (10 ng/ml, LC Services Woburn, MA), G28-5 (anti-CD40, 1 /xg/ml) , CD40-Ig (5 //g/ml analyser av perifere B-blodceller, 20 /ig/ml i analyser av tonsillare B-celler), supernatanter fra COS-celler som uttrykte shgp39 eller sCD72 (fortynnet 1:4). Celleproliferasjon ble målt ved opptak av [<3>H]tymidin (6,7 Ci/mmol, New England, Nuclear, Boston, MA, USA) etter 5 dagers dyrking og en puls over natten. Cellene ble inn-høstet på glassfiberfiltere og radioaktivitet ble målt i en væske-scintillasjonsteller.

7.2. RESULTATER

7.2.1. PREPARERING OG KARAKTERISERING AV DEN REKOMBINATE

GP3 9 SOM ET KIMÆRT FUSJONSPROTEIN

Fordi gp3 9 er en type II membranprotein, og type II membranproteiner er orientert med et karboksyterminal EC-domene, ble det utformet en fusjonskonstruksjon slik at et merkelapp-polypeptid ble plassert aminoterminalt til proteinets EC-parti, idet det erstattet overflate-proteinets transmembran- og cytoplasmiske domene. Merkelapp-polypeptidet skulle inneholde en aminoterminal sekretorisk signalsekvens for å tillate eksport av fusjonsproteinet. Vi valgte det murine CD8 EC-domene (Nakauchi et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei., USA 82:5126-5130) som vårt merkelapp-polypeptid til konstruksjon av være fusjonsproteiner av type II membranproteiner - og da av fire grunner: (i) anvendelsen av et intakt ekstracellulært proteindomene med en veldefinert tertiær struktur som merkelapp-polypeptidet minimaliserer sjansene for at merkelapp-polypeptidet vil påvirke den tertiære struktur av det overflate-protein til hvilket det er sammensmeltet mens det maksimaliserer sannsynligheten for at fusjonsproteinet vil uttrykkes og eksporteres, (ii) en tidligere studert kimær CD8 lg viste at CD8-fusjonsproteiner frembringes og eksporteres av COS-celler med høyt utbytte, (iii) en stort antall mAb rettet mot CD8 er tilgjengelige og kan anvendes til å manipulere de rekombinante CD8-fusjonsproteiner, og (iv) interaksjonen mellom murin CD8 og human MHC I er ikke påvisbar. For å generere CD8-gp39-fusjonsgenet, ble shgp39 et cDNA-fragment som innkoder EC-domenet til murin CD8 sammensmeltet med et cDNA-fragment som innkoder EC-domenet til gp39 som beskrevet i Materialer og metoder (fig. 2a). shgp39-proteinet ble preparert ved transient ekspresjon i COS-celler og utvunnet fra COS-cellesupernatanter med anti-CD8 mAb eller med en løselig rekombinant kimær CD4-Ig som ble anvendt i tidligere murin gp39-studier (fig. 2b). shgp39-proteinet har en molekylær masse på ca. 50 kDa (fig. 2b) ved analysering med SDS-PAGE under reduserende betingelser. Eksperimentelle resultater viser at shgp3 9 danner dimerer og trimerer i løsning.

Som en kontroll ble et kimært gen som koder for en løselig rekombinant form av B-celleantigenet CD72 (Von Hoegen et al., 1990, J. Immunol. 144:4870-4877), en annen type II membranprotein konstruert (fig. 2a). sCD72-proteinet ble også produsert ved transient ekspresjon i COS-celler og utvunnet fra COS-cellesupernatanter med anti-CD8 mAb eller med tre anti-CD72 mAb som var testet, men ikke med CD40-Ig fusjonsproteinet (fig. 2c).

For videre å karakterisere interaksjonen mellom CD4 0 og den løselige rekombinante hgp39, ble COS-celler transfektert med en cDNA som innkoder CD40-proteinet av full lengde (Stamenkovic et al., 1989, EMBO J. 8:1403-1410) og deres evne til å binde seg til shgp39, sCD72 og anti-CD40 mAb ble undersøkt ved fluorescens-mikroskopering. Både shgp39 og anti-CD40 mAb ble bundet til transfektantene, mens sCD72 ikke ble bundet (fig. 3). Dessuten ble COS-celler transfektert med en cDNA som innkoder den over-flatebundne gp39 og deres evne til å bindes til CD40-Ig (Noelle et al., 1992, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 89:6550-6554) eller et irrelevant lg-fusjonsprotein, Leu8-Ig (Aruffo et al., 1992, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:2292-22 96, ble undersøkt. CD40-Ig, men ikke Leu8-Ig, ble bundet til gp39-uttrykkende COS-celler (fig. 3). I parallelle eksperimenter ble shgp3 9 og CD72 immobilisert i fordypningene på en 96-fordypningers mikrotiterskål via en anti-CD8 mAb og deres binding til økende konsentrasjoner av CD40-Ig eller et sammenlignende immunoglobulin-fusjonsprotein, Leu8-Ig, ble undersøkt. Bindingen av CD40-Ig til immobilisert shgp39 var mettbar, mens CD40-Ig ikke ble bundet til SCD72 og Leu8-Ig ikke ble bundet til shgp39 (fig. 4).

Hvilende, humane, perifere B-blodceller ble inkubert med den løselige rekombinante hgp3 9, shgp3 9 eller et sammenlignende løselig fusjonsprotein, sCD72, i fravær eller nærvær av anti-CD20 mAb eller PMA. Selv om meget svak proliferasjon ble observert med shgp39 alene, induserte shgp39 kraftig B-celleproliferasjon når enten anti-CD20 mAb eller PMA var til stede (fig. 5). B-celleproliferasjon ble ikke observert med sCD72, anti-CD20 mAb eller PMA alene eller med sCD72 i forening med anti-CD20 mAb eller PMA (fig. 5).

I parallelle forsøk ble hvilende, tette humane tonsillare B-celler preparert som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder og deres evne til å proliferere som respons til shgp39 og SCD72 ble undersøkt (fig. 7). Slik det har vært sett med perifere B-blodceller, prolifererte tonsillare B-celler svakt som respons til shgp39, men viste sterk proliferasjon ved inkubasjon med shgp3 9 i nærvær av anti-CD20 mAb IF5 eller PMA. Ingen signifikant pro-lif erasj on i forhold til bakgrunnsnivåer ble observert når cellene ble inkubert med SCD72 alene eller i nærvær av IF5 mAb eller PMA. For å undersøke spesifisiteten av den shgp39-drevne aktiveringsrespons ble evnen til CD40-Ig til å blokkere shgp39/lF5- eller shgp39/PMA-dreven B-cellepro-lif erasjon undersøkt. CD40-Ig var i stand til å redusere den shgp39-drevne B-celleaktivering (+20 //g/ml gav +50% inhibering, fig. 6A), mens et sammenlignende fusjonsprotein Leu8-Ig ikke hadde noen virkning (fig. 6B).

7.3. DISKUSJON

Det har vært meldt at rensede murine B-miltceller og humane tonsillare B-celler prolifererer ved inkubering med CV1/EBNA-celler som uttrykker murin gp39 i fravær av ko-stimulus (Armitage et al., 1992, Nature 357:80-82). Basert på disse data har det vært antatt at gp39 er direkte mito-gen for B-celler. For å fastslå hvorvidt gp39-binding til CD40 er i stand til å stimulere hvilende B-celler til pro-lif erasj on i fravær av andre ko-stimulerende signaler, og effekten av fibroblast-celler i stimuleringen, ble proliferasjonen av B-celler i respons til COS-celler som uttrykte shgp39 testet.

sHgp3 9 var utelukkende i stand til å indusere hvilende B-celler, som var isolert fra enten perifert blod eller tonsiler, til å proliferere i forening med ko-stimuli, slik som anti-CD20 mAb eller PMA. Slik det hadde vært observert med hgp39-utrykkende COS-celler, kunne shgp39-dreven celleaktivering inhiberes med CD40-Ig, men ikke med et irrelevant lg-fusjonsprotein.

Utviklingen av faktoravhengige, langstids B-celle-kulturer har viktige anvendelser for studiet av B-cellevekst og differensiering og utviklingen av antigen-spesifikke B-cellelinjer (Tisch et al., 1988, Immunol. Today 9:145-150). Eksperimenter med anti-CD40 mAb viste at CD40-signaler kan synergisere med andre ko-stimulerende signaler, lik de som leveres av anti-CD20 mAb for å drive B-celleproliferasjon og at behandling av B-celler med anti-CD4 0 mAb i B-celler induserer en tilstand av "våkenhet" som tillater dem å lettere besvare påfølgende aktiverings-signaler. Evnen til shgp39 til å stimulere B-celleproliferasjon i forening med anti-CD20 mAb antyder at den kan benyttes til å skape in vi tro-systemer for langtids B-cellevekst.

Det er interessant å merke seg at CD40-Ig-fusjonsproteinet og den shgp39-fusjon som er beskrevet her, kan anvendes til henholdvis å inhibere eller stimulere CD40-respons i B-celler og dermed er anvendelige verktøyer i studiet av B-celle-/T-celleinteraksjoner og i kliniske applikasj oner.

8. DEPONERING AV MIKROORGANISMER

Det følgende ble deponert ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852

USA:

ATCC- betegnelse

Den foreliggende oppfinnelse skal, ved de deponerte mikroorganismer, ikke begrenses i rekkevidde siden de deponerte utførelsesformer er ment som illustrasjoner av enkeltstående aspekter ifølge oppfinnelsen og siden alle mikroorganismer som er funksjonelt ekvivalente befinner seg innen rekkevidden ifølge oppfinnelsen.

Det skal også oppfattes slik at alle oppgitte base-parstørrelser for nukleotider er omtrentlige og anvendes med det formål å beskrive.

Forskjellige litteraturhenvisninger har vært oppgitt heri, og disses samlede innhold medtas heri under henvisning .

Claims (33)

1. I det vesentlige renset og isolert nukleinsyre, karakterisert ved at den omfatter en sekvens hovedsakelig som vist i fig. 1 fra nukleotid-rester 160 til 787, eller en sekvens som koder for et protein med en aminosyresekvens hovedsakelig som vist i fig. 1 fra aminosyrerester 47 til 2 61, og at den dessuten omfatter en sekvens som koder for et ekstracellulært domene av et membranprotein av type I.

2. I det vesentlige renset og isolert nukleinsyre i samsvar med krav 1, karakterisert ved at den omfatter et ekstracellulært domene av et membranprotein av type I som er en sekvens som koder for et CD8-proteins ekstracellulære domene.

3. I det vesentlige renset og isolert nukleinsyre i samsvar med krav 2, karakterisert ved at den rommes i plasmid CDM7B" MC106l/p3-shgp39, slik det er deponert ved American Type Culture Collection og tildelt aksejonsnummer 69049.

4. I det vesentlige renset og isolert protein, karakterisert ved at det omfatter en sekvens i det vesentlige som vist i fig. 1 fra aminosyre-rester 47 til 261, og at det også omfatter et ekstracellulært domene av et membranprotein av type I.

5. I det vesentlige renset og isolert protein i samsvar med krav 4, karakterisert ved at det omfatter et CD8-proteins ekstracellulære domene.

6. I det vesentlige renset og isolert protein i samsvar med krav 5, karakterisert ved at det fremstilt ved ekspresjon av plasmid CDM7B" MC1061/p3- shgp39, slik det er deponert ved American Type Culture Collection og tildelt aksejonsnummer 69049.

7. In vitro fremgangsmåte til iverksettelse av B-celleproliferasjon, karakterisert ved at den omfatter eksponering av aktiverte B-celler for en effektiv konsentrasjon av minst ett protein ifølge kravene 4-6.

8. In vitro fremgangsmåte til iverksettelse av B-celleproliferasjon, karakterisert ved at den omfatter eksponering av B-celler for (i) en effektiv konsentrasjon av et protein ifølge kravene 4-6 og (ii) en ko-stimulerende substans.

9. Fremgangsmåte i samsvar med krav 8, karakterisert ved at den ko-stimulerende substans er et anti-immunglobulin-antistoff.

10. Fremgangsmåte i samsvar med krav 9, karakterisert ved at den ko-stimulerende substans er et antistoff som er rettet mot et B-celle-antigen.

11. Fremgangsmåte i samsvar med krav 10, karakterisert ved at B-celle-antigenet er CD20.

12. Anvendelse av minst ett protein ifølge kravene 4-6 for fremstilling av et farmasøytisk preparat til økning av et individs immunrespons.

13. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter en terapeutisk effektiv konsentrasjon av minst ett protein ifølge kravene 4-6 i en egnet farmakologisk bærer.

14. In vitro fremgangsmåte til iverksettelse av B-celle-differensiering, karakterisert ved at den omfatter eksponering av aktiverte B-celler for en effektiv konsentrasjon av minst ett protein ifølge kravene 4-6.

15. In vitro fremgangsmåte til iverksettelse av B-celle-differensiering, karakterisert ved at den omfatter eksponering av B-celler for en (i) en effektiv konsentrasjon av et protein ifølge kravene 4-6 og (ii) en ko-stimulerende substans.

16. Fremgangsmåte i samsvar med krav 15, karakterisert ved at den ko-stimulerende substans er et anti-immunglobulin-antistoff.

17. Fremgangsmåte i samsvar med krav 15, karakterisert ved at den ko-stimulerende substans er et antistoff som er rettet mot et B-celleantigen.

18. Fremgangsmåte i samsvar med krav 15, karakterisert ved at B-celleantigenet er CD20.

19. In vitro fremgangsmåte til iverksettelse av proliferasjon av celler som bærer CD40, karakteri sert ved at den omfatter eksponering av cellene ovenfor en effektiv konsentrasjon av et protein ifølge kravene 4-6.

20. In vitro fremgangsmåte til iverksettelse av differensiering av celler som bærer CD40, karakterisert ved at den omfatter eksponering av cellene for en effektiv konsentrasjon av et protein ifølge kravene 4 -6.

21. Fremgangsmåte i samsvar med krav 19 eller 20, karakterisert ved at cellene er sarkom-celler.

22. Anvendelse av minst ett protein ifølge kravene 4-6 til fremstilling av et farmasøytisk preparat som er egnet til iverksettelse av B-celle-proliferasjon.

23. Anvendelse i samsvar med krav 22, hvor det også anvendes en ko-stimulerende substans.

24. Anvendelse i samsvar med krav 22, hvor den ko-stimulerende substans er et anti-immunglobulin-antistoff.

25. Anvendelse i samsvar med krav 24, hvor den ko-stimulerende substans er et antistoff som er rettet mot et B-celleantigen.

26. Anvendelse i samsvar med krav 25, hvor B-celle-antigenet er CD20.

27. Anvendelse av minst ett protein ifølge kravene 4-6 til fremstilling av et farmasøytisk preparat egnet til iverksettelse av B-celle-differensiering.

28. Anvendelse i samsvar med krav 27, hvor det også anvendes en ko-stimulerende substans.

29. Anvendelse i samsvar med krav 28, hvor den ko-st imulerende substans er et anti-immunglobulin-antistoff.

30. Anvendelse i samsvar med krav 28, hvor den ko-stimulerende substans er et antistoff som er rettet mot et B-celleantigen.

31. Anvendelse i samsvar med krav 28, hvor B-celle-antigenet er CD20.

32. Anvendelse av et protein ifølge kravene 4-6 til fremstilling av et farmasøytisk preparat som er egnet til iverksettelse av proliferasjon eller differensiering av celler som bærer CD40.

33. Anvendelse i samsvar med krav 32, karakterisert ved at cellene er sarkom-celler.