HU215949B - Eljárás a humán gp39-nek megfelelő, tisztított nukleinsav-szekvencia, a megfelelő oldható gp39 és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására, valamint a B-sejtek proliferációjának gyorsítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás hűmán gp39-nek megfelelő, tisztítőttnűkleinsav-szekvencia előállítására, őly módőn, hőgy CD40–Igimműnglőbűlin dőménjében L234F, L235E és G237A műtációkat képezne , amódősűlt CD40–Ig-ket kiválasztják, a DNS-üket megfelelőenzimhasítóhelyeket tartalmazó szakaszőkkal ismert módőn, előnyösenpőlimeráz láncreakcióval kiegészítik, a fent nevezett szekvenciamegfel lő részeit tartalmazó őligőnűkleőtid vizsgáló primerekkelvégzett hibridizálás segítségével pőzitív klónőkat választanak ki, apőzitív klónők közül imműnprecipitációval a kívántnűkleőtidszekvenciát iválasztják. Kiterjed a találmány a megfelelőaminősav-szekvenciájú őldható gp39 prőtein és az ezt tartalmazógyógyászati készítmények előállítására, valamint a B-sejtekprőliferációjának in vitrő győrsítására az előállítőtt őldható gp39prőtein alkalmazásával. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás alapvetően a humán gp39nek megfelelő, lényegében tisztított és izolált nukleinsav-szekvencia, a megfelelő oldható gp39 protein és azt tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására, valamint a B-sejtek proliferációjának az előállított oldható gp39 proteinnel történő gyorsítására.

1. 1. A CD40 B-sejt antigén

A CD40 egy hozzávetőleg 50 kDa molekulatömegű glikoprotein, amely a B-sejtek, follicularis dentritikus sejtek, normál basalepithelium, valamint bizonyos carcinoma és melanóma eredetű sejtvonalak felületén expresszálódik (Paulie et al., 1985, Cancer Immunoi. Immunother., 20:23-28; Clark and Ledbetter, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci., 83:4494-4498; Ledbetter et al., 1987, „Leukocyte Typing III”, McMichael, ed., Oxford U. Press pp. 432-435; Paulie et al., 1989, J. Immunoi., 142.'590-595; Young et al., 1989, Int. J. Cancer, 43: 786-794; Galay et al., 1992, J. Immunoi., 149:115). Egy, a CD40-et kódoló humán cDNS izolálása azt mutatta, hogy ez a protein egy olyan I. típusú membránprotein, amely szignifikáns összefüggésben áll az idegnövekedési faktor receptorcsalád tagjaival (Stamenkovic etal., 1989, EMBO I, 8:1403-1410).

A CD40-nek a B-sejt aktivációjában játszott szerepe már tisztázott. A CD40-nek anti-CD40 monoklonális antitestekkel (mAb) végbemenő térhálósodása (vö.: Gordon et al., 1988, J. Immunoi., 740:1425-1430; Barrett et al., 1991, J. Immunoi., 146:1722-1729) kiváltja a B-sejtek aggregációját, fokozva nagyszámú intracelluláris szubsztrátum, így a szerin/treonin (Einfeld et al., 1988, EMBO I, 7:711-717)ésatirozin(Uckuneí al., 1991, J. Bioi. Vhem., 266:17478-17485) foszforilációját, és egy olyan „kompetencia’-szignált biztosít, amely — egy megfelelő második szignál stimuláló hatása esetén - lehetővé teszi a B-sejtek proliferációját és osztályváltását (eláss switching).

Például az anti-CD40 monoklonális antitest szinergizálhat: phorbol-mirisztil-acetáttal (PMA; Gordon et al., 1987, Eur. J. Immunoi., 17:1535-1538) vagy antiCD20 monoklonális antitesttel (Clark and Ledbetter, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci., 83 : 4494-4498), kiváltva a B-sejtek proliferációját; vagy IL-4-gyel, kiváltva a B-sejtek proliferációját (Gordon et al., 1987, Eur. J. Immunoi., 77:1535-1538; Rousset et al., 1991, J. Exp. Med., 773:705-710) és az IgE szekrécióját (Jabara et al., 1990, J. Exp. Med., 772: 1861-1864; Rousset et al., 1991, J. Exp. Med., 173 : 705 -710; Gascan et al., 1991, J. Immunoi., 747:8-13; Zhang et al., 1991, J. Immunoi., 746:1836-1842; Shapira et al., 1992, J. Exp. Med., 775:289- 292); valamint IL-10-zel és TGF-P-val, kiváltva az sIgD⁺ B-sejtek által az IgA szekrécióját (DeFrance et al., 1992, J. Exp. Med., 775:671-682).

Vagyis nyilvánvaló, hogy a CD40-től származó szignálok részt vesznek az aktivált B-sejtek által végzett citokintermelés szabályozásában (Caims et al., 1988, Eur. J. Immunoi., 18:349-353; valamint Clark and Shu, 1990, J. Immunoi., 745:1400-1406).

Az anti-CD40 monoklonális antitest térhálósodása önmagában nem elegendő a B-sejtek proliferációjának indukálásához. Ezt alátámasztja az a megfigyelés, hogy műanyag lemezen rögzített anti-CD40 monoklonális antitest IL-4-gyel együtt nem képes a B-sejtek erőteljes proliferációjának kiválasztására (Banchereau et al., 1991, Science,257:70-72).

Ugyanakkor a CDw32 Fc receptorral transzfektált murine (egér/patkány) L-sejteken immobilizált antiCD40 monoklonális antitest IL-4 jelenlétében képes kiváltani a B-sejtek proliferációját (Banchereau et al., 1991, Science, 251:70-72), ami arra utal, hogy egy, a fibroblasztok által biztosított szignálnak a CD40 szignállal és IL-4-gyel történő szinergizálása a B-sejtek proliferációjához vezet.

7. 2. A gp39 T-sejt antigén

A humán CD40 extracelluláris doménjének oldható formáit, amilyen például a CD40-Ig, már alkalmazták annak bemutatására, hogy a CD40 ligandja, a gp39 egy olyan, hozzávetőleg 39 kDa molekulatömegű glikoprotein, amely aktivált CD4+ murine T-sejteknek a felületén expresszálódik (Armitage et al., 1992, Natúré, 357: 80-82; Noelle etal., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:6550-6554). A gp39-cel történő kölcsönhatás kiváltja a nyugvó B-sejteknek a sejtciklusba történő belépését, illetve érzékennyé teszi a sejteket a limfokinek növekedési és differenciálódási hatásaira (Armitage et al., 1992, Natúré, 357:80-82; Noelle et a/., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 59:6550-6554).

A közelmúltban egy murine gp39-et kódoló cDNS-t izoláltak, amelyről kimutatták, hogy funkcionálisan aktív, amennyiben transzfektált sejtek membránproteinjeként expresszálódik (Armitage et al., 1992, Natúré, 357:80-82). Ez a cDNS egy olyan, 260 aminosavból álló polipeptidet kódol, amely egy II. típusú membránprotein tipikus jellemzőivel rendelkezik, és kimutatták azt is, hogy a murine gp39-et expresszáló CV1/EBNAsejtek - további kostimulus nélkül - kiváltják a murine és a humán B-sejtek proliferációját.

A találmány elsősorban a CD40 oldható ligandjainak, különösen a humán gp39 proteinnek és az ebből származtatható oldható ligandoknak az előállítására vonatkozik. Alapját - legalább részben - a humán T-sejt antigén gp39 felismerése, klónozása és expressziója képezi. A humán gp39 proteinnek a találmány szerint előállított oldható formája egy kostimuláló ágenssel együtt képes elősegíteni a B-sejtek proliferációját és differenciálódását.

A találmány kiterjed az 1. ábrán bemutatott szekvenciával rendelkező, lényegében megtisztított és izolált humán gp39 protein, továbbá az 1. ábrán bemutatott szekvenciával rendelkező és/vagy a humán gp39 proteint kódoló, lényegében megtisztított és izolált nukleinsav előállítására.

A találmány körébe tartozik a humán vagy nem humán gp39 oldható formáinak előállítása is. Ez előnyösen a CD8-gp39 expresszáló vektor alkalmazásával történhet.

A találmány szerint előállított oldható gp39 egy kostimuláló ágenssel együttesen a B-sejtek proliferációjának elősegítésére alkalmazható. Az ilyen proliferáció kívánatos lehet az olyan állapotok kezelésében, amelyek

HU 215 949 Β számára a fokozott immunválasz előnyökkel jár: példaként megemlíthető a szerzett immunhiányos szindróma (acquired zmmunoű'eficíency syndrome; AIDS). Ugyancsak előnyös az említett proliferáció továbbá egy, a Bsejtek tartós tenyésztésére szolgáló sejtkultúrarendszer generálására is.

Az ábrák ismertetése

1. ábra: A humán gp39-nek a nukleotid- és a valószínűsíthető aminosav-szekvenciája, valamint a murine gp39, a TNFa és a TNF[3 esetében meglévő homológiája.

A) A nukleotidszekvencia és a megfejtett, nyitott olvasatú szerkezet a bal szélen van számozva. A potenciális A-kötésű glikozilezés helyeit külön jelöljük (CHO), a valószínűsíthető transzmembrán domént (TM) aláhúztuk, valamint a valószínűsíthető transzmembrán és az extracelluláris domének találkozásánál elhelyezkedő két Arg csoportot kettős vonallal húztuk alá. A nukleotid- és aminosav-számozást a bal oldalon adjuk meg.

B) A humán gp39 (H-gp39), murine gp39 (M-gp39), humán TNFa és a humán TNFp valószínűsíthető aminosav-szekvenciájának megadása. A legalább három proteinben részt vevő aminosavakat bekeretezve ábrázoljuk; a legalább három proteinben részt vevő hasonló aminosavakat árnyékolva mutatjuk be.

2. ábra Oldható rekombináns humán gp39, valamint

CD72, sgp39 és sCD72.

A) A murine CD8 extracelluláris domént kódoló cDNS-fragmentumot mu-CD8 EC jelzéssel láttuk el. A murine CD8 aminoterminális szekréciós szignál szekvenciáját vonalkázva mutatjuk. A humán gp39 vagy CD72 extracelluláris domént kódoló cDNS-fragmentumot az előbbi sorrendnek megfelelően hu-gp39 EC és hu-CD72 EC jelöléssel láttuk el. A murine CD8 és a humán gp39 (dőlt betűs, italic) vagy CD72 (dőlt betűs, italic) extracelluláris dómén fúziójának helyén valószínűsíthető aminosavszekvenciát az egyes diagramok alatt tüntetjük fel. A két cDNS-fragmentum találkozásánál bevezetett csoportokat aláhúzással jelöljük. Az egyedi BamHI restrikciósenzim-felismerési helyet a két gén találkozásánál ábrázoljuk.

B) A CD8-gp39-cel (3. és 4. sáv) és metabolikusan jelölt megfelelőjével (utánzatával, mock) (1. és 2. sáv) transzfektált COS-sejtek felülúszóiból nyert izotópjelzett proteineket az antimurine CD8 mAb 53-6-tal (1. és 3. sáv) vagy a CD40-Ig-vel (2. és 4. sáv) történő kölcsönhatásuk alapján immunprecipitáltuk, majd a kitanításban ismertetett redukáló körülmények között SDS-PAGE módszerrel analizáltuk. A standard molekulatömegek elektroforetikus mobilitásához viszonyított elmozdulás alapján számított tömegértékeket kDa egységben a bal oldalon tüntetjük fel.

C) A CD8-CD72-vel (5-8. sáv) és metabolikusan jelölt megfelelőjével (utánzatával, mock) (1-4. sáv) transzfektált COS-sejtek felülúszóiból nyert izotópjelzett proteineket az antimurine mAb 53-6-tal (1. és 5. sáv), az anti-CD72 mAb J3I01-gyel (2. és 6. sáv), az antiCD72 mAb BU41-gyel (3. és 7. sáv) és a CD40-Ig-vel (4. és 8. sáv) történő kölcsönhatásuk alapján kinyertük, majd a későbbiekben ismertetett redukáló körülmények között SDS-PAGE módszerrel analizáltuk. A standard molekulatömegek elektroforetikus mobilitásához viszonyított elmozdulás alapján számított tömegértékeket kDa egységben a bal oldalon tüntetjük fel.

3. ábra Az spg39 vagy a CD40-Ig transzfektált COSsejtekhez történő kötése.

Gp39 (A és B) vagy CD40 (C-F) cDNS expressziós plazmiddal transzfektált COS-sejteket olyan szempontból vizsgáltunk, hogy milyen mértékben képesek megkötni az oldható rekombináns CD40-et (A és B), vagy az oldható rekombináns gp39-et (C és D), illetve az anti-CD40 mAb G28-5-öt (E és F). (A vizsgálatokat a kitanításban ismertetett módon végeztük). A reprezentatív területek fázisképeit (A, C és E), valamint fluoreszcens képeit (B, D és F) mutatjuk be az ábrán.

4. ábra Az spg39/CD40-Ig kölcsönhatás jellemzése.

A kitanításban ismertetetteknek megfelelően, ELISA módszerrel vizsgáltuk a (0,6 pg/mltől 20 gg/ml-ig) növekvő koncentrációjú CD40—Ig-nek és a (0,6 pg/ml-től 20 pg/ml-ig) növekvő koncentrációjú kontroll immunglobulin fúziós proteinnek, a Leu8-Ig-nek az immobilizált sgp39-hez való kötőképességét. Hasonló módon vizsgáltuk a növekvő koncentrációjú CD40-Ig-nek az immobilizált kontroll fúziós proteinnel, az sCD72-vel szembeni kötőképességét is. Mindkét esetben az sgp39-et és az sCD72-t olyan műanyag lemezen immobilizáltuk, amelyet előzőleg - a kitanításban leírtak szerint - bevontunk az anti-murine CD8 mAb 53-6-tal.

5. ábra A humán B-sejtek aktiválása felületileg kötött gp39-cel.

A gp39-expresszáló COS-sejteket (gp39-COS) vagy a megfelelő utánzattal transzfektált COSsejteket (mock-COS) olyan szempontból vizsgáltuk, hogy milyen mértékben képesek stimulálni a nyugalmi állapotban lévő humán perifériás vér B-sejtek proliferációját önmagukban vagy az anti-CD20 mAb IF5 (+IF5) vagy PMA (+PMA) jelenlétében, valamint CD40-Ig távollétében (fekete sáv, önmagában), vagy jelenlétében (vonalkázott sáv + CD40-Ig). A vizsgálatokat a kitanításban ismertetettek szerint végeztük, és a [³H]-timidin beépülése alapján értékeltük.

6. ábra A humán perifériás B-sejt aktiválása sgp39-cel.

Az oldható rekombináns gp39-et (sgp39, vonal3

HU 215 949 Β kázott sávok) vagy a kontroll oldható rekombináns fúziós proteint (sCD72, fekete sávok) olyan szempontból vizsgáltuk, hogy milyen mértékben képesek stimulálni a nyugalmi állapotban lévő humán perifériás vér B-sejtek proliferációját önmagukban, vagy az antiCD20 mAb IF5-tel ( + IF5) vagy PMA-val (+PMA) együttesen. A vizsgálatokat a kitanítás szerint végeztük, és a [³H]-timidin beépülése alapján értékeltük, majd összehasonlítást végeztünk az olyan, egyenlő időtartamig inkubált Bsejtekkel nyert értékekkel, amelyeket exogén stimuláns nélkül (sejtek önmagukban; üres sávok), illetve csak önmagában IF5, vagy csak önmagában PM A jelenlétében (üres sávok) kaptuk.

7. ábra A sűrű, humán tonzilláris B-sejtek aktiválása sgp39-cel.

Az oldható rekombináns gp39-et (sgp39, vonalkázott és fekete sávok) olyan szempontból vizsgáltuk, hogy milyen mértékben képesek stimulálni a sűrű, tonzilláris B-sejtek proliferációját önmagukban, vagy az anti-CD20 mAb IF5-tel (+IF5) vagy PMA-val (+PMA) együttesen. A vizsgálatokat a kitanítás szerint végeztük, és a [³Hj-timidin beépülése alapján értékeltük, majd összehasonlítást végeztünk az önmagukban, illetve csak önmagában IF5, vagy csak önmagában PMA (fekete sávok) jelenlétében inkubált B-sejtek esetében nyert értékekkel. A CD40-Ig-nek (fekete sávok) a B-sejt aktivációját irányító sgp39-et blokkoló képességét 20 mg/ml koncentrációnál vizsgáltuk (A), és összehasonlítottuk az így nyert értékeket egy irreleváns immunglobulin fúziós protein, a Leu-8-Ig (fekete sávok, B) azonos koncentrációjával kapott eredményekkel.

8. ábra A murine CD8-nak az aminosav- és nukleinsav-szekvenciája.

9. ábra A humán CD8-nak az aminosav- és nukleinsav-szekvenciája.

A leírás jobb megértésének szándékával - azonban korlátozó jelleg nélkül - a találmány részletes ismertetését a következő három részben tárgyaljuk:

2.1. A humán gp39 klónozása és expressziója (sgp39);

2. 2. Az oldható gp39 előállítása (sgp39); és

2. 3. A találmány alkalmazása.

2. 1. A humán gp39 klónozása és expressziója

A találmány a hgp39-et kódoló, lényegében tisztított és izolált nukleinsavakra, a lényegében tisztított és izolált hgp39 proteinre, valamint a hgp39 expresszálási eljárására vonatkozik. A hgp39-nek a (cDNS-hez hozzárendelt) teljes nukleinsav-szekvenciáját, valamint a hgp39 teljes aminosav-szekvenciáját az 1. ábrán mutatjuk be, és azokat a CDM-hgp39 plazmid tartalmazza. A plazmidot Escherichia coli, CDM MC1061/p3-hgp39 néven 1992. augusztus 14-én letétbe helyeztük az American Type Culture Collection-ben (ATCC) 69050 letéti szám alatt.

Az oldható hgp39 (shgp39) előállításához felhasználható egyik expresszáló vektor példájaként a

CDM7B -shgp39 plazmidot említjük, amelyet Escherichia coli, CDM7B MC1061/p3-shgp39 néven 1992. augusztus 14-én letétbe helyeztünk az American Type Culture Collection-ben (ATCC), ahol azt a 69049 letéti számmal látták el.

A találmány egyedi megvalósítása során egy lényegében tisztított és izolált, alapvetően az 1. ábrán megadott szekvenciával rendelkező nukleinsavat, valamint egy lényegében tisztított és izolált, egy alapvetően az 1. ábrán megadott szekvenciával rendelkező proteint kódoló nukleinsavat nyerünk. A találmány kiterjed továbbá egy lényegében tisztított és izolált, alapvetően az 1. ábrán megadott szekvenciával rendelkező proteinre is.

Az előbbiekben alkalmazott „alapvetően” megfogalmazás azt jelenti, hogy az 1. ábrán bemutatott szekvenciában mutációk, például helyettesítések, addíciók vagy törlések útján lehetségesek olyan változások, amelyek egy olyan molekulát eredményeznek, amely funkcionálisan ekvivalens az 1. ábrán megadott szekvenciával rendelkező proteinnel. Például a genetikai kód degenerációjának következtében az 1. ábrán bemutatott nukleinsavszekvencia megváltozhat úgy, hogy a végső szekvencia egy olyan proteint kódol, amely az 1. ábrán feltüntetett szekvenciával azonos, vagy egy funkcionálisan azonos szekvenciával rendelkezik; például egy olyan aminosavszekvencia, amelyben az aminosavakat funkcionálisan ekvivalens csoportba tartozó (például hidrofób, poláros, bázikus vagy savas) aminosavakkal cseréljük ki, behelyettesíthetők a proteinbe. A „lényegében tisztított és izolált” kifejezés azt jelenti, hogy a terméket a gyógyászati felhasználás szempontjából szükséges mértékben tisztítva izoláljuk.

Például a szekvenciában lévő egy vagy több aminosavcsoport kicserélhető egy olyan másik, hasonló polaritású aminosawal, amely funkcionális megfelelőként működik, s csak egy „silent” (csendes) változást eredményez. A szekvenciában lévő aminosav helyettesítésére alkalmas aminosavakat azon osztály további tagjai közül választhatjuk ki, amelyik osztályba maga a helyettesíteni szándékozott aminosav is tartozik. Például a nempoláros (hidrofób) aminosavak közé tartozik az alanin, leucin, izoleucin, valin, prolin, fenil-alanin, triptofán és a glutamin. A pozitív töltésű (bázikus) aminosavak magukban foglalják például a következőket: arginin, lizin és hisztidin. A negatív töltésű (savas) aminosavak közé tartozik az aszparaginsav és a glutaminsav.

A találmány szerinti proteinek a transzláció ideje alatt vagy azt követően ugyancsak módosulhatnak, például foszforiláció, glikozilezés, térhálósodás, acilezés, proteolitikus hasadás stb. útján.

A hgp39-et kódoló szekvenciákat tartalmazó genomiális vagy cDNS kiónokat például úgy azonosíthatjuk, hogy olyan oligonukleotid próbákat szintetizálunk, amelyek az 1. ábrán bemutatott hgp39 szekvenciának egy részét tartalmazzák, és az ilyen próbákat Benton és Davis (1977, Science, 196:180) vagy Grunstein és Hogness (1975, Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 72: 3961 -3965) módszere szerint hibridizációs reakciókban alkalmazzuk. Hasonlóképpen előállíthatunk olyan, az 1. ábrán bemutatott hgp39 szekvencia egy részletét tartalmazó

HU 215 949 Β oligonukleotidokat, amelyeket a polimeráz láncreakciók során alkalmazunk (Saiki et al., 1985, Science, 230:1350-1354). így például a hgp39 szekvencia fragmentumainak létrehozásához templátként felhasználhatunk aktivált T-lymphocytákból származó cDNS-t. Ezeket a fragmentumokat összeillesztve a hgp39-et kódoló szekvenciát teljes hosszában kialakíthatjuk, vagy más módon azonosíthatjuk.

A találmány szerint a hgp39-et kódoló cDNS-t a következőképpen izoláljuk és jellemezzük: CD40-Ig-t (amint az a következő helyen ismertetésre került: Noelle et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89: 6550-6554) úgy módosítunk, hogy az immunglobulin doménbe három olyan mutációt (nevezetesen L234F, L235E és G237A) hozunk létre, amelyek csökkentik az Fc receptorokhoz történő kötődést. A módosított CD40-Ig a COS-sejtek felülúszóiból tisztítható, annak megfelelően, ahogyan azt Aruffo (1990, Cell, 61: 1303-1313) korábban már ismertette. A humán gp39 cDNS egy phytohemagglutinin-aktivált humán perifériás vér T-sejtekből izolált mRNS-ből előállított gyűjteményből (Camerini et al., 1989, Natúré, 342: 78-82) polimeráz láncreakcióval (Polymerase Chain, Peaction, PCR) egészíthető ki (amplifikálható). Az oligonukleotid primereket a murine gp39 szekvenciája (Armitage et al., 1992, Natúré, 357:80-82) alapján vázolhatjuk fel, s az oligonukleotid primerek tervezése során beépítjük a polimeráz láncreakció termékének szubklónozása során alkalmazott Xbal és Hindlll restrikciós enzimek számára szolgáló hasítási helyeket. Például - korlátozó jelleg nélkül - a következő oligonukleotidokat alkalmazhatjuk:

5’-GCG AAG CTT TCA GTC AGC ATG ATA GAA

ACA-3’, valamint

5-CGC TCT AGA TGT TCA GAG TTT GAG TAA GCC-3’.

Az amplifikációt Taq polimerázzal és a gyártó (Perkin Elmer Cetus Corp., Norwalk, Connecticut, Amerikai Egyesült Államok) által előírt reakciópufferrel, a következő hőmérsékleti program 30 ciklusával végezhető: 2 perc, 95 °C; 2 perc, 55 °C; 3 perc, 72 °C. A polimeráz láncreakció termékének tartalmaznia kell egy belső Hindlll restrikciós helyet, s így a polimeráz láncreakció terméke HindlII-mal és Xbal-gyel feltárható. A kapott HindlII-Xbal-fragmentumot ezt követően egy megfelelő vektorba szubklónozhatjuk; ilyen vektor például a CDM8 vektor. A teljes génterméket a HindlII-HindlII-fragmentumnak a HindlII-Xbal fragmentumot tartalmazó vektorba történő szubklónozásával állíthatjuk össze.

A kapott szerkezetet ezt követően DEAE-dextrán alkalmazásával COS-sejtekbe transzfektálhatjuk, annak megfelelően, ahogy az a következő irodalmi helyen ismertetésre került: Aruffo et al., 1990, Cell, 61: 1303-1313. A transzfektánsokat megjelölhetjük CD40-Ig-vel (25 pg/ml DMEM médiumban), majd ezt követően FITC-konjugált kecske antihumán IgC Fc antitesttel (1:50 hígítás DMEM-ben, TAGO, Burlingame, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok), és a láthatóvá tételt immunfluoreszcens mikroszkópia segítségével végezzük. A teljes hgp39 szekvenciát tartalmazó kiónt kolóniahibridizációval nyeljük, annak megfelelően, ahogyan az a következő helyen ismertetésre került: Sambrook et al., 1989, „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, Amerikai Egyesült Államok.

A polimeráz láncreakció termékének szubklónozott HindlII-Hindni-ffagmentumát random (véletlenszerűen) bevezetett polimerizációval ³²p-jelölt próba előállítására is felhasználhatjuk.

Számos egyedi kiónból származó plazmid DNS-t transzfektálhatunk COS-sejtekbe, és a transzfektánsokat CD40-lg-vei jelölhetjük. Azokat a kiónokat, amelyek a pozitív jelölésű COS-sejt-transzfektánsokat eredményezik, restrikciós fragmentumtérképezéssel és szekvenciálással tovább jellemezhetjük.

A már előállított gén bármely, a szakterületen ismert módszerrel klónozható vagy szubklónozható. Igen nagyszámú, a szakterületen ismert vektorgazda rendszer alkalmazható. A lehetséges vektorok - korlátozó jelleg nélkül - magukban foglalják a cosmidokat, plazmidokat és a módosított vírusokat, azonban a vektorrendszemek kompatibilisnek kell lennie az alkalmazott gazdasejttel. Az ilyen vektorok - korlátozó jelleg nélkül - magukban foglalják az olyan bakteriofágokat, amilyenek például a lambda-származékok, vagy az olyan plazmidokat, amilyen például a pBR322, puC vagy a Bluescript™ (Stratagene) plazmidszármazékok. A gazdasejtekbe transzformáció, transzfekció, infekció, elektroporáció stb. útján vezethetjük be a rekombináns molekulákat.

A hgp39 vektor inzertálható (beszúrható) egy olyan klónozó vektorba, amely felhasználható adott gazdasejtek transzformálására, transzfektálására vagy infektálására, s így a génszekvencia számos másolatát állítjuk elő. Ez oly módon hajtható végre, hogy a DNS-fragmentumot bevisszük egy olyan klónozó vektorba, amely komplementer összetartozó végződésekkel rendelkezik. Ugyanakkor abban az esetben, ha a DNSfragmentumokhoz használt komplementer restrikciós helyek nincsenek jelen a klónozó vektorban, a DNS molekulák végeit enzimatikusan módosíthatjuk.

A rekombináns hgp39 expressziója céljából a hgp39 proteint vagy annak egy részletét kódoló nukleotidszekvenciát inzertálhatjuk egy megfelelő expresszáló vektorba, azaz egy olyan vektorba, amely tartalmazza az inzertált peptid/protein kódoló szekvencia transzkripciójához és transzlációjához szükséges elemeket. A szükséges transzkripciós és transzlációs szignálokat ugyancsak a natív hgp39 gén és/vagy ennek szomszédos régióinak segítségével biztosíthatjuk. A proteinkódoló szekvencia expressziójához különféle gazdavektor rendszereket alkalmazhatunk. Az ilyen rendszerek - korlátozó jelleg nélkül - magukban foglalják például a következőket: vírussal (így vakcinavírussal, adenovírussal stb.) infektált vagy plazmid expresszáló vektorral transzfektált emlős sejtrendszerek; vírussal (így baculovírussal) infektált rovar sejtrendszerek; mikroorganizmusok, amilyen például az élesztővektorokat tartalmazó élesztő, vagy a bakteriofág DNS-sel, plazmid DNS-sel, illetve cosmid

HU 215 949 Β

DNS-sel transzformált baktériumok. Ezeknek a vektoroknak az expressziós elemei erősségükben és specifitásukban különböznek.

A hgp39 proteint vagy ennek egy részletét kódoló nukleinsav-szekvencia egy második nukleinsav-szekvenciával regulálható, s így a hgp39 protein vagy peptid a rekombináns DNS molekulával transzformálva expresszálódik egy gazdában. Például a hgp39 expressziója bármely, a szakterületen ismert promoter/gátló elem segítségével kontrollálható. A hgp39 expressziójának kontrollálására alkalmazható promoterek - korlátozó jelleg nélkül - magukban foglalják a következőket: az SV40 korai promoter régió (Benoist and Chambon, 1981, Natúré, 290. 304—310); a cytomegalovírus promoter, amely promoter a Rous sarcoma vírus 3’ hosszú terminális ismétlődésében van jelen (Yamamoto et al., 1980, Cell, 22/787-797); a herpes thymidine kináz promoter (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78:1441 -1445); a metallothionine gén reguláló szekvenciái (Brinster et al., 1982, Natúré, 296:39-42); procaryota expresszáló vektorok, amilyen például a β-laktamáz promoter (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75: 3273-3731); élesztőből vagy más gombákból származó promoterelemek, amilyen például a Gal4 promoter vagy az alkoholdehidrogenáz promoter; valamint állati transzkripciós kontrollrégiók, amilyen például az immunglobulin génkontrollrégió, amely a lymphoid sejtekben aktív (Grosschedl et al., 1984, Cell, 38:647- 658); Adames et al., 1985, Natúré, 375/533-538; Alexanderéi al., 1987, Mól. Cell. Bioi., 7/1436-1444), a béta-globulin génkontrollrégió, amely a myeloid sejtekben aktív (Magram etal., 1985, Natúré, 375/338-340; Kollias et al., 1986, Cell, 46/89-94), valamint más, szövetspecifikus vagy szerkezeti promoter/gátló elemek.

Az ilyen rendszerekben expresszált rekombináns hgp39 proteint vagy pepiidet standard módszerekkel lehet kinyerni és tisztítani. Az ilyen standard eljárások közé tartozik - korlátozó jelleg nélkül - a kromatográfia [például az ioncserélő kromatográfia; az affinitáskromatográfia (például ligandként CD40-et alkalmazva); valamint a méret szerinti oszlopkromatográfia], a centrifugálás, az oldékonyságkülönbség, illetve bármely más, a proteinek tisztítására alkalmazott standard technika.

A jelen találmány értelmében a hgp39 protein vagy peptid standard proteinszintézis módszerek alkalmazásával kémiai úton is előállítható.

2. 2. Az oldható gp39 előállítása

A találmány körébe tartozik a gp39 humán és nemhumán oldható formáinak előállítása is. A gp39 ilyen oldható formáit a gp39-et kódoló nukleinsav - amilyen például a hgp39-et kódoló nukleinsav (lásd a 2. 1 „A humán gp39 klónozása és expressziója” című fejezetet és az 1. ábrát), vagy a murine gp39-et kódoló nukleinsav (Armitage et al., 1992, Natúré, 357/80-82) - biotechnológiai (genetic engineering) eljárásával lehet előállítani; így olyan gp39 fúziós proteineket nyerünk, amelyek a gp39 extracelluláris doménjét tartalmazzák; a dómén körülbelül a 48. aminosavcsoporttól a 261. aminosavcsoportig terjed ki. A gp39 aminosav-szekvencián túlmenően a találmány szerinti fúziós proteinek tartalmazhatnak egy olyan, molekuláris „toldalékot”, amely egy nagyobb protein részlete lehet, s amely helyettesíti a gp39 transzmembrán és cytoplazma doménjeit; ez a molekularészlet egy olyan „kart” biztosít, amely reakcióba lép a reagensekkel. Az oldható gp39 előállítható „toldalék” nélkül is, amelynek során a gp39 cytoplazma és transzmembrán doménjét egy I. típusú membránproteinből vagy szekretált proteinből származó aminoterminális szignálpeptiddel helyettesítjük.

Mivel a gp39 egy II. típusú membránprotein, s ezáltal a gp39 egy karboxiterminális extracelluláris doménnel orientált, a toldalék célszerűen az aminoterminális felől orientálódik a gp39 extracelluláris doménhez (gp39 ECD). A fúziós protein exportja érdekében a toldalék előnyösen egy aminoterminális szekréciós szignál szekvenciát foglal magában.

A megfelelő toldalékproteinek azokat az extracelluláris protein doméneket foglalják magukban, amelyek jól meghatározott tercier struktúrákkal rendelkeznek, s így csak minimális hatással vannak a gp39 ECD tercier struktúrájára, s ezzel egyidejűleg fokozzák a sikeres expresszió és transzport valószínűségét. Például egy olyan ECD protein, amelyről ismert, hogy beépült egy fúziós proteinbe, nagy valószínűséggel alkalmas toldalékprotein az oldható gp39 esetében is.

A toldalékprotein kiválasztásának további szempontját a toldalékproteinnel reagáló reagensek hozzáférhetősége képezi. Például egy olyan toldalékprotein, amelyhez már előállítottunk egy vagy több monoklonális antitestet, előnyösen egy olyan kart biztosít, amelynek esetében lehetőség nyílik monoklonális antitestekkel történő detektálásra vagy manipulációra.

Az alkalmas toldalékproteinek - korlátozó jelleg nélkül - magukban foglalják az I. típusú membránproteinek (például CD8) extracelluláris doménjeit, a szekretált proteineket (például IL-4), az immunglobulinok Fc doménjeit stb. A találmány egyik előnyös egyedi - azonban nem korlátozó jellegű - megoldásában a toldalékprotein egy murine CD8, amely tartalmazza az extracelluláris doménjét is (lásd: Nakauchi et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 52/5126-5130) vagy ennek humán megfelelője (Kavathas et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:7688).

A murine CD8 nukleotid- és aminosav-szekvenciáját a 8. ábrán mutatjuk be. Az extracelluláris dómén az

1. és 174. aminosavcsoport között található (a számozás a nukleinsav-szekvencia első ATG-jétől kezdődik); az extracelluláris domént a 121. és a 708. nukleotidcsoport közötti nukleinsavrészlet kódolja.

A megfelelő humán CD8 nukleotid- és aminosavszekvenciáját a 9. ábrán mutatjuk be. Az extracelluláris dómén az 1. és 161. aminosavcsoport között található; az extracelluláris domént a 129. és a 611. nukleotidcsoport közötti nukleinsavrészlet kódolja.

Például - korlátozó jelleg nélkül - a 2A) ábrán és a későbbiekben ismertetett összeállítás alkalmas az oldható gp39 (sgp39) előállítására. Ezt a konstrukciót a következőképpen állíthatjuk elő.

HU 215 949 Β

A hgp39 extracelluláris doménje phytohemagglutinin (PHA) által aktivált humán perifériás vér lymphocytákból származó mRNS-ből előállított cDNS állományból amplifikálható. Az oligonukleotid primerek az

1. ábrán bemutatott szekvencia alapján tervezhetők, figyelembe véve, hogy a gén 5’ végénél egy restrikciós enzimhasítási hely (például egy BamHI hasítási hely) van, s így az elképzelt gén összeállításakor megvédhetjük a leolvasási szerkezetet. Például a következő oligonukleotideket alkalmazhatjuk:

5’-CGA AGC TTG GAT CCG AGG AGG TTG GAC

AAG ATA GAA GAT-3’, valamint

5’-CGC TCT AGA TGT TCA GAG TTT GAG TAA GCC-3’.

A polimeráz láncreakciót Pfu polimerázzal és a gyártó (Stratagene, LaJolla, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok) által előírt reakciópufferrel, a következő hőmérsékleti programmal végezhetjük: 5 perc, 95 °C;

perc, 72 °C; 2 perc, 55 °C; az amplifikáció 40 ciklusa a következő részekből áll: 1 perc, 95 °C; 2 perc, 55 °C;

perc, 72 °C; 10 perc, 72 °C.

A polimeráz láncreakció terméke BamHI és Xbal segítségével feltárható, és egy olyan vektorba szubklónozható, amely vagy a murine CD8 (Lyt2a) extracelluláris domént vagy ennek humán ekvivalensét kódoló gént tartalmaz. A kapott szerkezetet ezt követően COS-sejtekbe transzfektálhatjuk, majd sgp39-et képezve expresszálhatjuk, amelyet azután egy affinitáskromatográfiás oszlopon abszorbeálva és onnan eluálva tisztíthatunk; a kromatográfiás oszlop szilárd hordozón, például sepharose gyöngyökön immobilizált CD40-Ig-t vagy antimurine CD8 mAb-t, így 53-6-ot tartalmaz.

Hangsúlyozni szeretnénk, hogy a gp39 extracelluláris doménből és különféle toldalékokból előállított sgp39 fúziós proteinek képesek a CD40-hez kötődni.

Például - korlátozó jelleg nélkül - az sgp39-nek a CD40-hez történő kötődését igazolhatjuk egy ELISAvizsgálattal, amelynek során egy 96 lyukú lemez lyukait anti-toldalékantitesttel vonjuk be, 0,05 százalék Tween-20-at tartalmazó, foszfátpufferelt szalinnal (TPBS) mossuk, majd IX típusú Diluent Concentratetel (Genetic System, 225 μΐ/lyuk, 2 óra, szobahőmérséklet) blokkoljuk. A lyukakat ezt követően TPBS-sel mossuk. Az sgp39-et expresszáló COS-sejtekről vagy egy negatív kontrollról nyert felülúszókat felvisszük a lemezre (150 μΐ/lyuk), majd a lemezeket egy éjszakán keresztül 4 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezt követően a lyukakat TPBS-sel mossuk, majd hozzáadjuk a CD40-et (CD40-Ig fúziós protein formájában) vagy a negatív kontrollproteint; a hozzáadást előnyösen 1 mM kalcium-kloridot (CaCl₂) és 1 mM magnézium-kloridot (MgCI₂) tartalmazó PBS-ben készült sorozathígítás formájában végezzük: 20 pg/ml-től 0,6 pg/ml-ig, 100 μΐ/lyuk, 1 óra, szobahőmérséklet. A lyukakat ezt követően TPBS-sel mossuk, és a CD40-nek az spg39cel bevont lyukakhoz való kötődését detektáljuk; például a CD40-nek az sgp39-cel bevont lyukakhoz való kötődését úgy detektálhatjuk, hogy peroxidázkonjugált kecske F(ab’)₂ antihumán IgG-t, majd utána kromogén szubsztrátot [például EIA puffereit szubsztrátban (Genetic System) 1:100 arányban hígított Genetic Systems kromogént] adunk hozzá (100 μΐ/lyuk).

A kromogén reakciót 10 perc elteltével Stop Buffer (Genetic Systems, 100 μΐ/lyuk) hozzáadásával leállítjuk, és az abszorbanciát ELISA-leolvasóval, kettős hullámhosszon (450 nm, 630 nm) mérjük.

Egy másik megoldás szerint az ELISA-vizsgálat elvégezhető úgy is, hogy a CD40-et (például a CD40-Igt) rögzítjük antitesttel (például kecske antihumán Fcvel) bevont lemezeken, és az sgp39 kötődését a COSsejt felülúszó növekvő hígításaiból anti-toldalékantitesttel detektálhatjuk.

Ezen túlmenően az sgp39-nek a CD40-hez való kötőképessége a következők szerinti B-sejt proliferációs vizsgálat segítségével is megállapítható. Perifériás vér mononukleáris sejteket (Peripheral ólood wiononuclear cells; PBMC) Lymphocyte Separation Médiumon (Litton Bionetics, Kensington, Maryland, Amerikai Egyesült Államok) keresztül, centrifugálással izolálunk. A perifériás vér mononukleáris sejtekből feldúsítjuk a humán B-lymphocytákat oly módon, hogy a sejteket keresztüljuttatjuk egy nejlonoszlopon (Wako Chemicals USA, Inc., Richmond, Virginia, Amerikai Egyesült Államok), és az adherens (tapadó) sejteket összegyűjtjük. A monocyták és az NK (natural Áriller, természetes ölő) sejtek eltávolítása érdekében a sejteket ezt követően leuleu metil-észterével (Sigma, St. Louis, Missouri, Amerikai Egyesült Államok) kezeljük. A B-sejtek százalékos értékének meghatározásához a kapott sejtpopulációt egy EPICS C-n (Coulter Electronics, Hialeah, Florida, Amerikai Egyesült Államok) áramlásos citometriás módszerrel analizáljuk.

Tonsilláris (mandula) B-sejteket preparálunk intakt mandulákból oly módon, hogy egy tonsilláris sejtszuszpenzió előállításához a mandulákat ledaráljuk. A sejteket ezt követően Lymphocyte Separation Médiumon (Litton Bionetics, Kensington, Maryland, Amerikai Egyesült Államok) keresztülcentrifugáljuk, kétszer mossuk, majd egy szakaszos Percoll (Sigma, St. Louis, Missouri, Amerikai Egyesült Államok) gradiensen frakcionáljuk. Az 50 százaléknál nagyobb sűrűségű sejteket összegyűjtjük, kétszer mossuk, majd a sejteket proliferációs vizsgálatokban alkalmazzuk.

A proliferáció mérését úgy végezzük, hogy a B-sejteket lapos fenekű, 96 lyukú mikrotiter lemezeken, négy párhuzamos mintában, 5 χ 10⁴ sejt/lyuk koncentrációban, 10 százalék fetal calf szérumot (magzati borjúszérumot) tartalmazó teljes RPMI médiumban tenyésztjük. Az sgp39-et vagy a kontrollszerkezetet expresszáló COS-sejtek felülúszóit 1:4 arányban meghígítjuk, és a tenyészetekhez PMA-t (10 ng/ml, LC Services, Wobum, Massachusetts, Amerikai Egyesült Államok) vagy 1F5-Öt (anti-CD20, 1 μΐ/ml) adunk, és ezt követően ötnapos tenyésztés után és egy éjszakai [³H]timidinnel (6,7 Ci/mmol; New England Nuclear, Boston, Massachusetts, Amerikai Egyesült Államok) végzett jelzést követően, a timidinfelvétel alapján méljük a B-sejtek proliferációját (a sejteket üvegszálas szűrőkön

HU 215 949 Β gyűjthetjük be, és a radioaktivitást folyadékszcintillációs számlálóval mérhetjük).

A B-sejt proliferációjának során (az előnyösen legalább körülbelül 100 százalékkal) a kontrollszint fölötti kiugrás az sgp39 egy különleges formájával van kapcsolatban, s azt jelzi, hogy az sgp39 kapcsolatba lép a B-sejtek felületén lévő CD40-nel, és biológiailag aktív.

A találmány kiteljed egy olyan, lényegében megtisztított és izolált nukleinsavra, amely alapvetően az 1. ábrán bemutatott, 160-787 közötti nukleotidcsoportok szekvenciájával rendelkezik, s amely nukleinsav felhasználható a találmány szerinti íűziós proteinek következő előállítására. Ennek megfelelően a találmány magában foglal egy olyan, lényegében megtisztított és izolált nukleinsavat, amely alapvetően az 1. ábrán bemutatott, 160-787 közötti nukleotidcsoportok szekvenciájával rendelkezik, s ezen túlmenően egy olyan szekvenciát is tartalmaz, amely egy gp39 proteintől (humán vagy nemhumán gp39 proteintől) eltérő protein extracelluláris doménjét kódolja; az egyik előnyös megoldás során ez az egyéb protein murine vagy humán CD8 protein. Egy találmány szerinti, különösen előnyös - azonban nem korlátozó jellegű - megoldás értelmében ennek az egyéb proteinnek az extracelluláris doménje murine vagy humán CD8-nak - az előbbi sorrendnek megfelelően - az 1-174, illetve 1-161 közötti aminosavcsoportokat tartalmazó extracelluláris doménje, amelyeket - ugyancsak az előbbi sorrendnek megfelelően

- a 8. ábra szerinti 121-708 közötti nukleotidok, illetve a 9. ábra szerinti 129-611 közötti csoportok szekvenciája kódol. Egy találmány szerinti, előnyös, egyedi

- azonban nem korlátozó jellegű - megoldás értelmében ezt a lényegében tisztított és izolált nukleinsavat CDM7B MC1061/p3-shgp39 plazmid tartalmazza, amelyet az American Type Culture Collection-ben (ATCC) letétbe helyeztünk, s ahol azt a 69049 letéti számmal látták el. A jelen találmány kiterjed továbbá az ilyen nukleinsavak által kódolt proteinekre is.

Például a találmány magában foglalja egy olyan, lényegében megtisztított és izolált protein előállítását, amely alapvetően az 1. ábrán bemutatott, 47-261 közötti aminosavcsoportok szekvenciájával rendelkezik, s ezen túlmenően a lényegében megtisztított és izolált protein egy olyan protein extracelluláris doménjét is tartalmazza, amely protein nem egy gp39 protein. Az egyik előnyös megoldás során ez az egyéb protein murine vagy humán CD8 protein. Egy találmány szerinti, különösen előnyös - azonban nem korlátozó jellegű - megoldás értelmében ennek az egyéb proteinnek az extracelluláris doménje murine vagy humán CD8-nak - az előbbi sorrendnek megfelelően - az 1-174, illetve 1-161 közötti aminosavcsoportokat tartalmazó extracelluláris doménje. Egy találmány szerinti, előnyös, egyedi - azonban nem korlátozó jellegű megoldás értelmében a proteint a CDM7B MC1061/p3-shgp39 plazmid expressziójával állítjuk elő. A plazmidot az American Type Culture Collection-ben (ATCC) letétbe helyeztük, ahol azt a 69049 letéti számmal látták el.

2. 3. A találmány alkalmazása

A találmány kiterjed a CD40-et hordozó sejtek proliferációját és/vagy differenciálódását elősegítő eljárásra is, amelynek során a sejteket egy hatékony koncentrációban lévő oldható gp39 protein, például humán vagy nemhumán oldható gp39 protein hatásának teszünk ki, amint azt az előbbiekben már ismertettük.

Egy előnyös megoldás értelmében a találmány felhasználható az olyan B-sejtek proliferációjának és/vagy differenciálódásának in vitro gyorsítására, amelyeket az oldható gp39 protein hatása előtt már aktiváltunk, vagy amelyeket az oldható gp39 hatásával egyidejűleg aktiválunk, illetve amelyeket - kevéssé előnyösen - az oldható gp39 hatása után, de még az oldható gp39 jelenlétében aktiválunk. A B-sejtek aktiválását bármely, a szakterületen ismert módszerrel elvégezhetjük, többek között például kostimuláló ágensek segítségével, így például - korlátozó jelleg nélkül - anti-immunglobulin antitesttel, egy B-sejt felületi antigénhez (például CD20-hoz) kapcsolódó antitesttel, phorbol-mirisztilacetáttal (PMA), ionomycinnel, illetve oldható vagy felületileg kötött citokinekkel (amilyen például az IL-4).

Az oldható gp39 hatékony (effektív) koncentrációját e helyen úgy definiáljuk, mint egy olyan koncentrációt, amely - a gp39 vagy más, a B-sejtek proliferációját befolyásoló anyag hatásának ki nem tett, aktivált B-sejtek proliferációjához viszonyítva - legalább 100 százalékos növekedést eredményez a B-sejtek proliferációjában (lásd például a fentiekben a 2. 1. „A humán gp39 klónozása és expressziója” című fejezetet, valamint a későbbiekben a 4. 1. 3. „A B-sejt proliferációjának vizsgálata” című részt).

Például - korlátozó jelleg nélkül - körülbelül 0,005-2,5 pg/ml közötti koncentrációkat, és legelőnyösebben körülbelül 0,1-0,25 pg/ml közötti koncentrációkat alkalmazhatunk.

Amint az a 708075 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben összefoglalásra került, a találmány szerinti oldható gp39 proteinek számos célra felhasználhatók, magukban foglalva az in vitro és az in vivő alkalmazásokat is.

Az egyik találmány szerinti megoldás értelmében az oldható gp39 felhasználható B-sejtek tartós tenyésztésére szolgáló in vitro sejtkultúrarendszer előállítására. Ez különösen hasznos lehet az antigénspecifikus B-sejtvonalak előállítása során.

Egy másik, találmány szerinti in vitro megoldás szerint az oldható gp39 felhasználható CD40 antigént expresszáló sejtek azonosítására vagy elkülönítésére, és/vagy testfolyadékokban az esetleg előforduló CD40 antigén jelenlétének, illetve hiányának a megállapítására. Például az oldható gp39 és a CD40 antigén közötti kötést az oldható gp39 közvetlen vagy indirekt jelzésével detektálhatjuk, például egy radioizotópnak vagy egy kromogénnek az oldható gp39 proteinbe történő beépítésével (közvetlen jelzés) vagy anti-gp39 antitesttel (indirekt jelölés). Ily módon az oldható gp39 felhasználható a tumorokban, rosszindulatú sejtekben, testfolyadékokban stb. expresszált CD40 antigén in vitro diagnosztikai azonosítására.

HU 215 949 Β

Egy ehhez kapcsolódó megoldás értelmében a közvetlenül vagy indirekt úton megjelölt, oldható gp39 proteint a CD40 antigént expresszáló sejtek vagy tumorok in vivő ábrázolására (leképezésére) is alkalmazhatjuk.

Különféle más, a találmány körén kívüli in vivő megoldások során felhasználhatjuk az oldható gp39-et többek között az immunválasz fokozására, például hatásos mennyiségű „adjuváns”-ként alkalmas, egy vakcinával szembeni immunválasz jelentős növelésére.

Hasonlóképpen alkalmas az oldható gp39 egy immunszupresszált egyed immunválaszának fokozására, amilyen például egy szerzett immunhiányos szindrómában szenvedő (AIDS-es) vagy rosszindulatú daganatos beteg, illetve egy gyermek vagy egy idősebb korú személy.

Mivel valamennyi B-sejt CD40-et expresszál, ez a megoldás az immunválasz szupresszióját eredményezi. Például egy, az oldható gp39-hez kötődő citotoxikus hatóanyag in vivő alkalmazása immunszupressziót okoz. Transzplantált személyek esetében ez lehetőséget nyújt a hisztokompatibílitási gátak leküzdésére.

Alternatív módon ezek a módosított ligandok az autoimmun megbetegedések kontrolljára is jól felhasználhatók.

A találmány lehetőséget biztosít továbbá - standard laboratóriumi módszerek segítségével - poliklonális vagy monoklonális anti-hgp39 antitestek egyszerű és kényelmes előállítására.

A találmány kiterjed olyan gyógyszerkészítmények előállítására is, amelyek egy gyógyszerészeti szempontból elfogadható hordozóban egy oldható gp39 (lásd a 2.

2. „Az oldható gp39 előállítása” című fejezetet) gyógyászati szempontból hatásos mennyiségét tartalmazzák.

Ezeket a gyógyszerkészítményeket bármely megfelelő módon beadhatjuk az ilyen kezelésre szoruló betegeknek; a lehetőségek - korlátozó jelleg nélkül - magukban foglalják az intravénás vagy lokális injekciókat, így a szubkután és az intramuszkuláris befecskendezést, valamint az orális, intranazális, rektális, vaginális, intrathecalis stb. alkalmazást.

Példa (3)

A tumor necrosis géncsalád egy tagja, a humán

T-sejt antigén gp39

A B-sejtekben lévő CD40 receptorhoz alkalmas ligand

3. 1. Anyagok és módszerek

CD40-Ig-t (amint az a következő szakirodalmi helyen ismertetésre került: Noelle et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., Amerikai Egyesült Államok, 89: 6550-6554) három mutációnak, nevezetesen az L234F-nek, az L235E-nek és a G237A-nak az immunglobulin doménbe történő bevezetésével módosítottunk abból a célból, hogy csökkentsük a CD40-Ig-nek az Fc receptorokhoz való kötődését. A módosított CD40-Ig-t a korábbiakban már ismertetettek szerint (Aruffo et al. 1990, Cell, 67; 1303-1313) COS-sejtek felülúszóiból tisztítottuk.

A humán gp39 cDNS-t egy phytohemagglutinin-aktivált humán perifériás vér T-sejtekből izolált mRNSből előállított gyűjteményből (Camerini et al., 1989, Natúré, 342;78-82), polimeráz láncreakcióval (7’olymerase Chain 7?eaction, PCR) egészítettük ki (amplifikáltuk).

Az oligonukleotid primereket a murine gp39 szekvenciája (Armitage et al., 1992, Natúré, 357:80-82) alapján terveztük meg, s az oligonukleotid primerek tervezése során beépítettük a polimeráz láncreakció termékének szubklónozása során alkalmazott Xbal és HindlII restrikciós enzimek számára szolgáló hasítási helyeket. A következő oligonukleotidok kerültek alkalmazásra:

5’-GCG AAG CTT TCA GTC AGC ATG ATA GAA

ACA-3’, valamint

5-CGC TCT AGA TGT TCA GAG TTT GAG TAA GCC-3’.

Az amplifikációt Taq polimerázzal és a gyártó (Perkin Elmer Cetus Corp., Norwalk, Connecticut, Amerikai Egyesült Államok) által előírt reakciópufferrel, a következő hőmérsékleti program 30 ciklusával végeztük: 2 perc, 95 °C; 2 perc, 55 °C; 3 perc, 72 °C. A polimeráz láncreakció terméke tartalmazott egy belső HindlII restrikciós helyet, s így a polimeráz láncreakció terméke HindlII-mal és Xbal-gyel feltárható volt.

A kapott HindlII -Xbal-ffagmentumot ezt követően a CDM8 vektorba szubklónoztuk. A teljes génterméket a HindlII-HindlII-fragmentumnak a HindlII-Xbalffagmentumot tartalmazó vektorba történő szubklónozásával állítottuk össze. A kapott szerkezetet ezt követően DEAE-dextrán alkalmazásával COS-sejtekbe transzfektáltuk, annak megfelelően, ahogy az a következő irodalmi helyen ismertetésre került: Aruffo et al., 1990, Cell, 67; 1303-1313.

A transzfektánsokat megjelöltük CD40-Ig-vel (25 pg/ml DMEM médiumban), majd ezt követően FITC-konjugált kecske antihumán IgC Fc antitesttel (1:50 hígítás DMEM-ben, TAGO, Burlingame, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok), és a láthatóvá tételt immunfluoreszcens mikroszkópia segítségével végeztük.

A teljes hgp39 szekvenciát tartalmazó kiónt kolóniahibridizációval nyertük, annak megfelelően, ahogyan az a következő helyen ismertetésre került: Sambrook et al., 1989, „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New

York, Amerikai Egyesült Államok.

A polimeráz láncreakció termékének szubklónozott HindlII-HindlII-fragmentumát random (véletlenszerűen) bevezetett polimerizációval ³²p-jelölt próba előállítására használtuk fel.

A három egyedi klónból származó plazmid DNS-t COS-sejtekbe transzfektáltuk, és a sejteket CD40-Igvel jelöltük meg. Egyetlen klón, a 19-es klón pozitív jelölésű COS-sejt-transzfektánsokat eredményezett, s ezt a kiónt alkalmaztuk a vizsgálatok további részében. A szekvenciát Sequenase™ (United States Biochemical Co., Cleveland, Ohio, Amerikai Egyesült Államok) segítségével, didezoxi-szekventálással határoztuk meg.

HU 215 949 Β

3. 2. Eredmények

A humán gp39-et kódoló cDNS-t egy phytohemagglutinin-aktivált humán perifériás vér T-sejtekből izolált mRNS-ből előállított gyűjteményből, polimeráz láncreakcióval (PCR) egészítettük ki (amplifikáltuk), amelynek során a murine gp39 szekvenciáján (Armitage et al., 1992, Natúré, 357/80-82) alapuló szintetikus oligonukleotideket alkalmaztunk. A polimeráz láncreakció termékét a CDM8 (Seed, 1987, Natúré, 329: 840-842) expresszáló vektorba szubklónoztuk. A CDM8-gp39 plazmiddal transzfektált COS-sejtek olyan proteint eredményeztek, amely kötődött a CD40-Ig-hez (Noelle et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 59/6550-6554).

Egy teljes humán gp39 gént kolóniahibridizációval ugyanabból a cDNS állományból izoláltunk, mint amelyet a polimeráz láncreakció szubklónozott termékének próbaként történő alkalmazásával a gp39-nek a polimeráz láncreakciós amplifikációjához használtunk.

Számos pozitív kiónt izoláltunk, amelyeket restrikciós enzimmel végzett feltárással elemeztünk. Az azokhoz a kiónokhoz tartozó DNS-eket, amelyek a legnagyobb inzerteket (1,8-1,5 kb) tartalmazták, COS-sejtekbe transzfektáltuk, majd megvizsgáltuk, hogy képesek-e ezek egy CD40-Ig-t megkötő protein expreszsziójára. Ennek a kritériumnak a szempontjából egyetlen klón, a 19. számú klón bizonyult pozitívnak, amelyet tovább analizáltunk, s mint humán gp39-re, a későbbiekben TO jelöléssel hivatkozunk. A transzfektált COS-sejtekből nyert, cDNS által kódolt humán gp39 proteinnek CD40-Ig alkalmazásával végzett immunprecipitációja egyetlen sávot mutatott, amely egy körülbelül 32-33 kDa értékű molekulatömegnek felelt meg. A COS-sejt eredetű protein kisebb, mint azt a murine gp39 esetében végzett korábbi vizsgálataink alapján vártuk, még annak tükrében is, hogy számos esetben megfigyeltük, miszerint a COS-sejt-transzfektánsokból nyert nagyszámú, különféle T-sejt felületi protein látszólagos molekulatömege kisebb, mint azoké, amelyeket T-sejtekből kaptunk (Aruffo and Seed, 1987, EMBO I, 77/3313-3316; Aruffo et al., 1991, J. Exp. Med., 774/949-952). Ezek a méretbeli eltérések feltehetően a COS-sejtek által nyert proteinek inkomplett glikozilezéséből származnak.

A humán gp39 cDNS körülbelül 1,8 kb hosszúságú, és egy olyan, 261 aminosavból (aa) álló és körülbelül 29 kDa várható molekulatömegű polipeptidet kódol, amely a következő részeket tartalmazza: egy 22 aminosavból álló, aminoterminális, citoplazmatíkus dómén; egy 24 aminosavból álló, hidrofób transzmembrán dómén; és egy 215 aminosavból álló, karboxiterminális, extracelluláris (EC) dómén. A polipeptid egyetlen A-kötésű glikozilezési helyet (Asn-X-Ser/Thr) tartalmaz az extracelluláris doménben, és ugyancsak egyet a citoplazmatíkus doménben (a kódoló szekvenciának megfelelő nukleotidszekvenciát és a várható aminosavszekvenciát az 1A ábrán mutatjuk be). A proteinnek a várt, extracelluláris karboxi végződésű orientációja a proteint a II. típusú membránproteinek osztályába sorolja be, és a várt, valamint a megfigyelt molekulatömegek közötti eltérés arra utal, hogy a protein a transzlációt követő (poszttranszlációs) változásokon megy keresztül, valószínűleg szénhidráté söpörtök addíciója útján.

A humán gp39 várt aminosav-szekvenciáját a FASTP algoritmus segítségével összehasonlítottuk a National Biomedical Research Foundation (NBRF) adatbázisában található aminosav-szekvenciákkal.

Azt találtuk, hogy a humán gp39 várt aminosavszekvenciája szignifikáns homológiát mutat a tumor necrosis faktor (TNF) a (Gray et al., 1984, Natúré, 312 /721-724) aminosav-szekvenciájával és a tumor necrosis faktor (TNF) β (Pennica et al., 1984, Natúré, 372/724-729; Wang et al., 1985, Science, 228: 149-154) aminosav-szekvenciájával (IB ábra).

A gp39 exracelluláris doménje igen közeli rokonságot mutat a TNF a és β szerkezetével: a dómén mindkét esetben körülbelül 30%-os homológiával rendelkezik; ez csaknem tökéletesen megfelel a TNFa és a ΤΝΡβ közötti értéknek, ahol a két tumor necrosis faktor körülbelül 30%-os homológiát mutat.

3. 3. Értékelés

A CD40 felületi receptoroknak a B-sejtekhez történő szignáladó képességét monoklonális antitestek (Clark and Ledbetter, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci., 83: 4494-4498; Gordon et al., 1987, Eur. J. Immunoi., 77/ 1535-1538) alkalmazásával határoztuk meg. A CD40 szerepének további tanulmányozása céljából elvégeztük egy humán forrásból származó, a CD40 ligandot kódoló cDNS izolálását és megfelelő jellemzését is.

Egy, a humán gp39-et kódoló cDNS klón izolációja azt mutatta, hogy ez a II. típusú membránprotein közeli rokonságban van a tumor necrosis faktor α-val (Gray et al., 1984, Natúré, 372/ 721-724) és a tumor necrosis faktor β-val (Pennica et al. 1984, Natúré, 372/ 724-729; Wang et al., 1985, Science, 228:149-154). A tumor necrosis faktor a és a tumor necrosis faktor β pleiotropicus citokinek, amelyek elsődlegesen mint szekretált proteinek fordulnak elő.

Példa (4)

A B-sejt-kostimuláló aktivitással rendelkező gp39 egy oldható formájának expressziója

4. 1. Anyagok és módszerek

4. 1. 1. Egy oldható gp39 kiméra szerkezete, jellemzése és előállítása

A hgp39 extracelluláris doménjét phytohemagglutinin (PHA) által aktivált humán perifériás vér lymphocytákból származó mRNS-ből előállított cDNS állományból amplifikáltuk. Az oligonukleotid primereket a fentiekben ismertetett polimeráz láncreakciós termékből nyert szekvenciainformációk alapján terveztük, és a gén 5’ végénél egy BamHI hasítási helyet alakítottunk ki úgy, hogy az elképzelt gén összeállításakor megvédjük a leolvasási szerkezetet. A következő oligonukleotideket alkalmaztuk:

5’-CGA AGC TTG GAT CCG AGG AGG TTG GAC

AAG ATA GAA GAT-3’, valamint

HU 215 949 Β

5’-CGC TCT AGA TGT TCA GAG TTT GAG TAA GCC-3’.

A polimeráz láncreakciót Pfu polimerázzal és a gyártó (Stratagene, LaJolla, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok) által előírt reakciópufferrel, a következő hőmérsékleti programmal végeztük: 5 perc, 95 °C; 2 perc, 72 °C; 2 perc, 55 °C; az amplifikáció 40 ciklusa a következő részekből állt: 1 perc, 95 °C; 2 perc, 55 °C; 3 perc, 72 °C; 10 perc, 72 °C.

A polimeráz láncreakció termékét BamHl és Xbal segítségével feltártuk, és egy olyan vektorba szubklónoztuk, amely a polimeráz láncreakció által létrehozott, BamHl restrikciós hellyel rendelkező, murine CD8 (Lyt2a) extracelluláris domént kódoló gént tartalmazta.

Hasonlóképpen, a humán CD72 extracelluláris doménjét kódoló gént is polimeráz láncreakcióval hoztuk létre, annak érdekében, hogy az tartalmazzon egy BamHl restrikciós helyet, majd a gént ugyanolyan módon a CD8-at tartalmazó vektorba szubklónoztuk.

A COS-sejteknek az shgp39-et és az sCD72-t expresszáló és exportáló képességét vizsgáltuk. Először DEAE-dextrán alkalmazásával a COS-sejteket transzfektáltuk. A transzfekció után egy nappal a sejteket tripszinizáltuk és leszedtük. Egy nappal később a sejteket 2% formaldehidet tartalmazó PBS-ben fixáltuk (20 perc, szobahőmérséklet) és 2% formaldehidet, valamint 0,1% Triton Χ-100-at tartalmazó PBS-ben permeabilizáltuk (20 perc, szobahőmérséklet). Az spg39cel transzfektált sejteket megjelöltük CD40-Ig-vel (25 pg/ml DMEM-ben, 30 perc, szobahőmérséklet), majd ezt követően DMEM-ben 1:500 arányban meghígított FITC-konjugált kecske antihumán Fc antitesttel (TAGO, Burlingame, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok). Az sCD72-vel transzfektált sejteket az antiCD72 antitest BU40-nel (The Binding Site, Birmingham, Nagy-Britannia), majd ezt követően DMEM-ben 1:500 arányban meghígított FITC-konjugált kecske antiegér Fc antitesttel (TAGO, Burlingame, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok) jelöltük meg.

Az shgp39 vagy sCD72 szerkezettel transzfektált COS-sejteket vagy a vektort önmagában (az utánzatot, mock) egy éjszakán keresztül olyan, Cys-től és Met-tól mentes DMEM-ben tenyésztettük, amelyhez előzetesen [³⁵S]-L-metionint és [³⁵S]-L-ciszteint (Tran[³⁵S]-label, ICN, Costa Mesa, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok) adtunk. A felülúszókat leszedtük, majd 1000 fordulat/perc értéken 10 percen keresztül centrifugáltuk. A fúziós proteineket a felülúszókból CD40-Ig, 53-6 (antimurine CD8) plusz kecske antipatkány Fc, BU40, BU41 (The Binding Site, Birmingham, Nagy-Britannia) plusz kecske antiegér IgM Fc, vagy J3.101 (AMAC Inc., Westbrook, Maine, Amerikai Egyesült Államok) alkalmazásával nyertük ki.

A kecske antitesteket az Organon Teknika Co. (West Chester, Pennsylvania, Amerikai Egyesült Államok) cégtől szereztük be. Az 1 ml felülúszót, 75 μΐ Protein A-sepharose-t (Repligen, Cambridge, Massachusetts, Amerikai Egyesült Államok) és a precipitáló ágens(eke)t tartalmazó minták mindegyikét összekevertük, majd °C hőmérsékleten 2 órán keresztül inkubáltuk. A sepharose-t 0,01% ΝΡ-40-et tartalmazó PBS-sel intenzíven mostuk, majd 5% β-merkapto-etanolt tartalmazó töltőpufferben felszuszpendáltuk. A proteineket 8%-os poliakrilamid gélen SDS-PAGE módszerrel kezeltük. A gélt rögzítettük (fixáltuk), szárítottuk, és filmmé alakítottuk. Az shgp39-et vagy sCD72-t tartalmazó COSsejt-felülúszókat COS-sejtek transzfektálásával hoztuk létre. Egy nappal a transzfekciót követően a sejtmédiumot 2% FBS-t tartalmazó DMEM-re cseréltük. A felülúszókat nyolc nappal a transzfekció után gyűjtöttük be.

4. 1.2. Kötési vizsgálatok

Transzfektált COS-sejtek jelölésének segítségével vizsgáltuk a hgp39-nek és a CD40-nek a megfelelő ligandjaik oldható formáihoz történő kötődését. A COSsejteket DEAE-dextrán alkalmazása mellett CD40-nel, hgp39-cel vagy a vektorral önmagában (utánzat, mock) transzfektáltuk. A transzfekció után egy nappal a sejteket tripszinizáltuk és leszedtük. A sejtek megjelölését a következő napon végeztük el. A gp39-et expresszáló sejteket vagy a vektorral önmagában transzfektált (utánzóit) sejteket CD40-Ig-vel (25 pg/ml), majd ezt követően FOTC-konjugált kecske antihumán Fc-vel jelöltük meg.

A CD40-et expresszáló sejteket úgy jelöltük meg, hogy a sejteket shgp39-et tartalmazó COS-sejt-felülúszókkal, majd ezt követően mAb 53-6-tal (antimurine CD8,2,5 pg/ml), végül FITC-konjugált kecske antipatkány Fc-vel (1,5 pg/ml; Organon Teknika Co., West Chester, Pennsylvania, Amerikai Egyesült Államok) inkubáltuk. Kontrollként a CD40-et expresszáló COSsejteket FITC-konjugált G28-5-tel (anti-CD40) vagy sCD72-t tartalmazó COS-sejt-felülúszók alkalmazásával jelöltük meg. Valamennyi inkubációt szobahőmérsékleten, 1 mM kalcium-kloridot (CaCl₂), 1 mM magnézium-kloridot (MgCl₂) és 2% FBS-t tartalmazó PBSben végeztük; valamennyi mosás alkalmával ugyanezt a puffért alkalmaztuk. A megjelölést követően a sejteket 1% paraformaldehidet tartalmazó PBS-sel fixáltuk (rögzítettük).

Az shgp39-nek a CD40-Ig-hez történő kötődését ELISA módszerrel vizsgáltuk. Egy 96 lyukú lemez (Immunolon-2, Dynatech) lyukait 53-6 antitesttel [antimurine CD8, 10 pg/ml, 100 pl/lyuk, 50 mM nátrium-hidrogén-karbonát (NaHCO₃), pH-9,6, 1 óra, szobahőmérséklet] vontuk be. A lyukakat 0,05% Tween-20-t tartalmazó, foszfátpufferelt szalinnal (TPBS) mostuk, majd IX Specimen Diluent Concentrate (Genetic Systems, 225 pl/lyuk, 2 óra, szobahőmérséklet) segítségével blokkoltuk. A lyukakat mostuk (TPBS). Vagy sgp39-et vagy sCD72-t expresszáló COS-sejtekről származó felülúszókat adtunk a lyukakba (150 pl/lyuk), majd a lemezeket 4 °C hőmérsékleten egy éjszakán keresztül inkubáltuk. A lyukakat mostuk (TPBS), és CD40-Ig vagy Leu8-Ig fúziós proteineket adtunk hozzá [olyan PBS-ben lévő sorozathígításban, amely 1 mM kalcium-kloridot (CaCl₂) és 1 mM magnézium-kloridot (MgCl₂) tartalmazott; 20 pg/ml-től 0,6 pg/ml-ig, 100 pl/lyuk, 1 óra, szobahőmérséklet]. A lyukakat mostuk, majd minden lyukhoz peroxidázkonjugált kecske

HU 215 949 Β

F(ab’)2 antihumán IgG-t (TAGO, Burlingame, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok; 1:5000 hígítás IX Specimen Diluent-ben; 100 μΐ/lyuk, 1 óra, szobahőmérséklet). A lyukakat mostuk, majd kromogén szubsztrátot adtunk hozzá (Genetic Systems kromogén 1:100 hígításban EIA Buffered Substrate-ben, Genetic Systems, ΙΟΟμΙ/lyuk). A reakciót 10 perc után Stop Buffer (Genetic Systems, 100 μΐ/lyuk) hozzáadásával leállítottuk, és egy ELISA-leolvasóval kettős hullámhosszon, nevezetesen 450 és 630 nm hullámhosszon mértük az abszorbanciát.

Ezenkívül az ELISA-vizsgálatot CD40-Ig-nek a kecske antihumán Fc-vel bevont lemezeken történő rögzítésével is végrehajtottuk. A COS-sejt-felülúszók növekvő hígításaiból származó shgp39 kötődést 53-6 mAb, majd ezt követően FITC-konjugált kecske antipatkány Fc alkalmazásával detektáltuk. A fluoreszcencia értékét egy mikrolemezleolvasó segítségével mértük.

4. 1. 3. A B-sejt proliferációjának vizsgálata

Perifériás vér mononukleáris sejteket (Peripheral ólood wononuclear cells; PBMC) Lymphocyte Separation Médiumon (Litton Bionetics, Kensington, Maryland, Amerikai Egyesült Államok) keresztülcentrifúgálással izoláltunk. A perifériás vér mononukleáris sejtekből feldúsítottuk a humán B-lymphocytákat oly módon, hogy a sejteket keresztüljuttattuk egy nejlonoszlopon (Wako Chemicals USA, Inc., Richmond, Virginia, Amerikai Egyesült Államok), és az adherens (tapadó) sejteket összegyűjtöttük. A monocyták és az NK (természetes ölő, «atural Miller) sejtek eltávolítása érdekében a sejteket ezt követően leu-leu metil-észterével (Sigma, St. Louis, Missouri, Amerikai Egyesült Államok) kezeltük. A B-sejtek százalékos értékének meghatározásához a kapott sejtpopulációt egy EPICS C-n (Coulter Electronics, Hialeah, Florida, Amerikai Egyesült Államok) áramlásos citometriás módszerrel analizáltuk, s megállapítottuk, hogy a sejtpopuláció 50% humán perifériás Bsejtből áll.

Tonsilláris (mandula) B-sejteket preparáltunk intakt mandulákból oly módon, hogy egy tonsilláris sejtszuszpenzió előállításához a mandulákat ledaráltuk. A sejteket ezt követően Lymphocyte Separation Médiumon (Litton Bionetics, Kensington, Maryland, Amerikai Egyesült Államok) keresztülcentrifugáltuk, kétszer mostuk, majd egy szakaszos Percoll (Sigma, St. Louis, Missouri, Amerikai Egyesült Államok) gradiensen ffakcionáltuk. Az 50 százaléknál nagyobb sűrűségű sejteket összegyűjtöttük, kétszer mostuk, majd a sejteket proliferációs vizsgálatokban alkalmaztuk.

A gp39 szerkezettel vagy a vektorral önmagában (utánzat; mock-COS) transzfektált COS-sejteket EDTAval leszedtük a szövettenyésztő lemezekről, kétszer mostuk PBS-sel, óxlO⁶ koncentrációban felszuszpendáltuk és egy ^,37Cs forrásból 5000 rad-dal besugároztuk. A proliferációs vizsgálatokban a COS-sejteket 1:4 arányban (1 χ 10⁴ COS-sejt és 4χ 10⁴ B-sejt mennyiségben) alkalmaztuk.

A proliferáció mérését úgy végeztük, hogy a B-sejteket lapos fenekű, 96 lyukú mikrotiter lemezeken, négy párhuzamos mintában, 5 x1ο⁴ sejt/lyuk koncentrációban, 10 százalék fetal calf szérumot (FCS-t, magzati borjúszérumot) tartalmazó teljes RPMI médiumban tenyésztettük. Az alkalmazott reagensek a következők voltak: 1F5 (anti-CD20, 1 pg/ml); PMA (10 ng/ml, LC Services, Wobum, Massachusetts, Amerikai Egyesült Államok); G28-5 (anti-CD40, lpg/ml); CD40-Ig (5 pg/ml a perifériás vér B-sejtek vizsgálatában; 20 pg/ml a tonzilláris B-sejtek vizsgálatában); shgp39-et vagy sCD72-t expresszáló COS-sejtek felülúszói (1:4 arányban meghígítva).

Ötnapos tenyésztés után és egy éjszakai [³H]timidinnel (6,7 Ci/mmol; New England Nuclear, Boston, Massachusetts, Amerikai Egyesült Államok) végzett jelzést követően a timidinfelvétel alapján mértük a B-sejtek proliferációját. A sejteket üvegszálas szűrőkön gyűjtöttük be, és a radioaktivitást egy folyadékszcintillációs számlálóval mértük.

4. 2. Eredmények

4. 2. I. A rekombináns gp39-nek mint kiméra fúziós proteinnek az előállítása és jellemzése

Tekintettel arra, hogy a gp39 egy II. típusú membránprotein, és a II. típusú membránproteinek egy karboxiterminális extracelluláris doménnel rendelkeznek, egy olyan fúziós szerkezetet terveztünk, amelyben a felületi protein transzmembrán és citoplazmatikus doménjének helyére a protein extracelluláris részletéhez aminoterminális elhelyezkedéssel egy toldalék polipeptidet helyeztünk. A fúziós protein exportjának lehetővé tétele érdekében a toldalék polipeptidnek egy aminoterminális szekréciós szignál szekvenciát kell tartalmaznia. A következő négy okból kifolyólag a II. típusú membránproteinek közé tartozó fúziós proteinjeink összeállításához toldalék polipeptidünkként a murine CD8 extracelluláris domént (lásd: Nakauchi et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. Amerikai Egyesült Államok, 82:5126- 5130) választottuk:

(i) egy jól definiált tercier struktúrával rendelkező intakt extracelluláris doménnek a toldalék polipeptidként történő alkalmazása egyrészt minimalizálja annak az esélyét, hogy a toldalék polipeptid hatással legyen annak a felületi proteinnek a tercier struktúrájára, amelyhez a toldalék polipeptid hozzáépül, másrészt ugyanakkor maximálisan megnöveli annak a valószínűségét, hogy a fúziós protein expresszálódni és exportálódni fog;

(ii) a CD8-Ig kiméra egy korábbi vizsgálata azt bizonyította, hogy COS-sejtek segítségével a CD8 fúziós proteinek magas hozammal képződnek és exportálódnak;

(iii) nagyszámú olyan, a CD8-hoz irányuló monoklonális antitest (mAb) áll rendelkezésre, amelyek felhasználhatók a rekombináns CD8 fúziós protein befolyásolására (manipulálására); és (iv) a murine CD8 és a humán MHC I közötti kölcsönhatás nem detektálható.

A CD8-gp39 fúziós gén előállításához egy, a murine

CD8 extracelluláris doménjét kódoló cDNS-fragmentumot fuzionáltunk egy, a gp39 extracelluláris doménjét kódoló cDNS-fragmentummal (lásd a 3. 1. „Anyagok és módszerek” című fejezetet, valamint a 2A ábrát).

HU 215 949 Β

Az shgp39 proteint COS-sejtekben történő tranziens expresszióval állítottuk elő, és a proteint a COS-sejtek felülúszóiból olyan anti-CD8 monoklonális antitesttel, vagy olyan oldható rekombináns CD40-Ig kimérával nyertük ki, amelyeket a korábbi, murine gp39-re vonatkozó vizsgálataink során már alkalmaztunk (lásd a 2B ábrát). Az shgp39 protein - redukáló körülmények között SDS-PAGE módszerrel analizálva - körülbelül 50 kDa értékű molekulatömeggel rendelkezik (lásd a 2B ábrát). A kísérleti eredmények azt jelzik, hogy az shgp39 oldatban dimereket és trimereket képez.

Kontrollként egy olyan kiméra gént állítottunk össze, amely egy másik II. típusú membránprotein, a B-sejt antigén CD72 (Von Hoegen et al., 1990, J. Immunoi., 744:4870-4877) egy oldható rekombináns formáját kódolja. Az sCD72 proteint ugyancsak a COS-sejtekben történő tranziens expresszióval állítottuk elő, s ezt követően a COS-sejt-felülúszókból anti-CD8 monoklonális antitesttel vagy a három tesztelt anti-CD72 monoklonális antitesttel, nem pedig a CD40-Ig fúziós proteinnel nyertük ki a proteint (lásd a 2C ábrát).

A CD40 és az oldható rekombináns hgp39 közötti kölcsönhatás további jellemzéséhez a COS-sejteket egy a teljes hosszúságú CD40 proteint (Stamenkovic et al., 1989, EMBO J., 8:1403-1410) kódoló cDNS-sel transzfektáltuk, majd fluoreszcens mikroszkópia segítségével megvizsgáltuk az shgp39-hez, az sCD72-höz és az anti-CD40 monoklonális antitesthez történő kötőképességüket.

Az shgp39 és az anti-CD40 monoklonális antitest kötődött a transzfektánsokhoz, míg az sCD72 esetében nem történt kötődés (lásd a 3. ábrát).

Ezen túlmenően a COS-sejteket egy olyan cDNSsel is transzfektáltuk, amely a felületileg kötött gp39-et kódolja, s megvizsgáltuk a CD40-Ig-vel (Noelle et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. Amerikai Egyesült Államok, 89:6550-6554), vagy egy irreleváns lg fúziós proteinnel, a Leu8-Ig-vel (Aruffo et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., Amerikai Egyesült Államok, 89: 2292-2296) szembeni kötőképességüket.

A CD40-Ig kötődött a COS-sejtek által expresszált gp39-hez, azonban a Leu8-Ig esetében nem történt kötődés (lásd a 3. ábrát).

Párhuzamos kísérletekben az shgp39-et és a CD72-t anti-CD8 monoklonális antitesttel egy 96 lyukú mikrotiter lemez lyukaiban rögzítettük, s megvizsgáltuk ezek kötődését a CD40-Ig vagy egy kontroll immunglobulin íüziós protein, a Leu8-Ig növekvő koncentrációihoz. A CD40-Ig-nek az immobilizált shgp39-hez történő kötődése teljessé vált, míg az sCD72-höz nem kötődött a CD40-Ig, illetve az shgp39-hez nem kötődött a Leu8-Ig (lásd a 4. ábrát).

4. 2. 2. A humán gp39-nek szüksége van egy kostimulusra a B-sejtekproliferáriájának kiváltásához

A gp39-CD40 kölcsönhatásoknak a B-sejtek aktivációjában játszott szerepének vizsgálatához COS-sejteket transzfektáltunk vagy a hgp39-et kódoló cDNSsel, vagy a vektorral (utánzattal) önmagában, majd a transzfektált COS-sejteket arra nézve teszteltük, hogy milyen mértékben képesek stimulálni a B-sejtek proliferációját. A nyugvó, perifériás vér B-sejtek csak gyengén proliferálódtak, amikor a sejteket a hgp39expresszáló COS-sejtekkel önmagukban inkubáltuk (lásd az 5. ábrát). Ugyanakkor ha a B-sejteket a hgp39expresszáló COS-sejtek és (i) a CD20 B-sejt felületi protein ellen irányuló 1F5 monoklonális antitest (Clark et al., 1985, Proc. Natl. Acad., Sci., Amerikai Egyesült Államok, 52:1766-1770), vagy (ii) phorbol-mirisztilacetát (PMA) együttes hatásának tettük ki, a B-sejtek erőteljes proliferációját figyeltük meg. A B-sejteknek a hgp39 által vezetett proliferációját az oldható CD40-Ig fúziós proteinnel mindkét esetben az alapértékekre csökkenthettük (lásd az 5. ábrát).

Amennyiben a B-sejteket az utánzattal (mock) transzfektált COS-sejtekkel, és vagy az anti-CD20 monoklonális antitest, vagy a phorbol-mirisztil-acetát (PMA) jelenlétében inkubáltuk, a B-sejtek csak gyengén proliferálódtak; a CD40-Ig jelenléte nem volt hatással erre a proliferációra (lásd az 5. ábrát).

Gyenge B-sejt-proliferációt figyeltünk meg, amikor a hgp39-expresszáló COS-sejteket egy kostimuláló szignál nélkül alkalmaztuk, ami arra utal, hogy ebben az esetben a COS-sejtek olyan kostimuláló szignálokat is biztosítanak, amelyek a B-sejtek proliferációjának vezetéséhez a CD40 szignálokkal szinergizálnak.

Nyugvó, humán perifériás vér B-sejteket az oldható rekombináns hgp39-cel, shgp39-cel vagy egy kontroll fúziós proteinnel, az sCD72-vel, és anti-CD20 monoklonális antitest vagy phorbol-mirisztil-acetát (PMA) jelenlétében, vagy az utóbbiak nélkül inkubáltunk. Jóllehet csak nagyon gyenge proliferációt figyeltünk meg abban az esetben, ha az shgp39-et önmagában alkalmaztuk, az shgp39 igen erőteljes B-sejt-proliferációt indukált, ha vagy az anti-CD20 monoklonális antitest, vagy phorbol-mirisztil-acetát is jelen volt az inkubáció során (lásd a 6. ábrát). Nem figyeltünk meg B-sejt-proliferációt az sCD72-vel, az anti-CD20 monoklonális antitesttel vagy a phorbol-mirisztil-acetáttal önmagában, illetve az sCD72. és az anti-CD20 monoklonális antitest vagy a phorbol-mirisztil-acetát (PMA) együttes alkalmazásával (lásd az 5. ábrát).

Párhuzamos kísérletekben nyugvó, sűrű, humán tonsilláris B-sejteket preparáltunk, annak megfelelően, ahogyan azt a 4. 1. „Anyagok és módszerek” című fejezetben ismertettük. A B-sejteket arra nézve vizsgáltuk, hogy az shgp39 és az sCD72 hatására milyen a sejtek proliferációs képessége (lásd a 7. ábrát). Amint azt már a perifériás vér B-sejtek esetében is megfigyeltük, a tonsilláris B-sejtek az shgp39 hatására gyengén proliferálódtak, azonban erős proliferációt mutattak, ha az shgp39-cel történő inkubációt az anti-CD20 monoklonális antitest vagy a phorbol-mirisztil-acetát (PMA) jelenlétében végeztük. Semmilyen - az alapszintet meghaladó - proliferációt nem tapasztaltunk, ha a sejteket sCD72-vel önmagában, vagy az 1F5 monoklonális antitest, illetve a phorbol-mirisztil-acetát (PMA) jelenlétében végeztük. Az aktivációs válaszhoz vezető shgp39 specifitásának megállapítása céljából megvizsgáltuk, hogy a CD40-Ig milyen mértékben képes blok13

HU 215 949 Β kölni a B-sejt proliferációjához vezető shgp39/lF5 vagy shgp39/PMA rendszert. A CD40-Ig le tudta csökkenteni az shgp39 B-sejt-aktiváló hatását (kb 20 pg/ml körülbelül 50%-os gátlást eredményezett; lásd a 7A ábrát), míg egy kontroll fúziós protein, a Leu8-Ig nem rendelkezett ilyen hatással (lásd a 7B ábrát).

Értékelés

Korábban már beszámoltak arról, hogy a tisztított, murin lép (splen) B-sejtek és a humán tonzilláris B-sejtek proliferálódnak, ha a sejteket a murine gp39-et expresszáló CVl/EBNA-sejtekkel, kostimulus nélkül inkubálják (Armitage et al., 1992, Natúré, 357: 80-82). Ezeknek az adatoknak az alapján úgy véltük, hogy a gp39 közvetlenül mitogén a B-sejtek számára. Annak meghatározásához, hogy a CD40-hez kötődő gp39 képes-e a nyugvó B-sejteket más kostimuláló szignálok nélkül is proliferációra késztetni, valamint a fibroblaszt sejteknek a stimulációban kifejtett hatásának megállapítására megvizsgáltuk a teljes hosszúságú hgp39-et vagy shgp39-et expresszáló COS-sejtekre adott B-sejt-proliferációs választ. Ellentétben Armitage-nek a fentiekben hivatkozott helyen adott kitanításával - miszerint a gp39-nek egy membránhoz kell kapcsolódnia ahhoz, hogy aktívvá váljon a mi eredményeink azt mutatták, hogy a hgp39 membránhoz kapcsolt állapotban és oldható formákban egyaránt aktív.

Ugyanakkor a hgp39⁺ COS-sejtek és az shgp39 között érdekes különbségeket láttunk. A hgp39-et expreszszáló COS-sejtek kostimulusok nélkül csak gyenge Bsejt-proliferációt indukáltak, azonban kostimuláló anyagokkal, például anti-CD20 monoklonális antitesttel vagy phorbol-mirisztil-acetáttal (PMA) szinergizálhatnak, s így erőteljes B-sejt-proliferációt indukálnak. Az oldható rekombináns hgp39 receptorral, a CD40-Ig-vel az előbbi esetek mindegyikében az alapszintre lehetett csökkenteni a B-sejteknek a proliferációját.

A perifériás vérből vagy a mandulából izolált nyugvó B-sejteket a kostimuláló anyagokkal, így az antiCD20 monoklonális antitesttel vagy phorbol-mirisztilacetáttal együttesen alkalmazva, csak az shgp39 volt képes proliferációra késztetni. Amint azt a hgp39expresszáló COS-sejtekkel már megfigyeltük, az shgp39 által irányított B-sejt-aktiváció a CD40-Ig-vel gátolható, azonban egy irreleváns lg fúziós proteinnel nincs lehetőség a B-sejt-aktiváció gátlására.

Ezek az adatok azt jelzik, hogy a B-sejtek proliferációjának leghatékonyabb irányításához a hgp3 9-nek szüksége van egy kostimuláló szignálra, továbbá arra is utalnak az adatok, hogy nincs semmiféle szigorú követelmény az aktiváláshoz szükséges hgp39 sejtfelületi expressziójával kapcsolatban.

Ezen túlmenően, a COS-sejtek felületén expreszszálódó hgp39-nek a B-sejtek proliferációját gyengén stimuláló képessége alátámasztja azt az elképzelést, hogy a COS-sejtek alacsony szintű kostimuláló szignálokat is biztosítanak, ugyanakkor jelenleg még bizonytalan, hogy ezek szinergizálnak-e a hgp39 által biztosítottakkal.

A faktorfíiggő, hosszú távú B-sejtkultúrák kifejlesztése igen lényeges alkalmazást nyer a B-sejtek növekedésének és differenciálódásának tanulmányozása, valamint az antigénspecifikus B-sejtvonalak kifejlesztése területén (Tisch et al., 1988, Immunoi. Today, 9: 145-150). Az anti-CD40 monoklonális antitestekkel végzett kísérletek azt mutatták, hogy a CD40 szignálok szinergizálhatnak a B-sejtek proliferációjához vezető, más kostimuláló szignálokkal, például azokkal, amelyek anti-CD20 monoklonális antitestektől származnak, továbbá azt is alátámasztották a kísérletek, hogy a B-sejteknek anti-CD40 monoklonális antitesttel végzett kezelése a B-sejteknek egy olyan „készenléti” („alertness”) állapotát váltja ki (indukálja), amely lehetővé teszi, hogy a későbbi aktivációs szignálokra készségesebben reagáljanak a sejtek. Az shgp39-nek anti-CD20 monoklonális antitesttel vagy phorbol-mirisztil-acetáttal együttes, a B-sejtek proliferációját stimuláló képessége arra utal, hogy az shgp39 felhasználható tartós B-sejt-tenyésztés számára szolgáló in vitro rendszerek létrehozására.

Érdeklődésre tarthat számot, hogy az itt ismertetett CD40-Ig fúziós protein és az shgp39 felhasználható a B-sejtekben a CD40 válasz - az előbbi sorrendnek megfelelően - gátlására vagy stimulálására, s így értékes eszközként szerepelhetnek a B-sejt/T-sejt kölcsönhatások tanulmányozása során, illetve jól felhasználhatók a klinikai alkalmazások területén is.

A mikroorganizmusok letétbe helyezése

A következőket helyeztük letétbe az American Type Culture Collection-ben (ATCC; 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, Amerikai Egyesült Államok):

Mikroorganizmus ncv	ATCC leteti szám
Escherichia coli CDM7B MC1061/p3-shgp39	69049
Escherichia coli CDM8 MC1061/p3-hgp39	69050

A fenti, letétbe helyezett mikroorganizmusok nem korlátozzák a találmány oltalmi körének teijedelmét, mivel a letétbe helyezett formák csak a találmány egyedi aspektusainak illusztrációját hivatottak szolgálni; valamennyi olyan mikroorganizmust, amely funkcionálisan ekvivalens az előbbiekkel, a jelen találmány oltalmi körébe esőnek tekintünk.

A találmány oltalmi körét nem korlátozzák a bemutatott példák sem, amelyek ugyancsak a találmány egyedi aspektusainak illusztrációját szolgálják. Az összes olyan klón, DNS vagy aminosav-szekvencia, amely funkcionálisan ekvivalens a példákban, illetve a leírásban szereplőkkel, ugyancsak a találmány oltalmi körébe tartoznak.

Az előzőekben ismertetett kitanítás, valamint a mellékelt ábrák alapján a területen jártas szakember számára számos további módosításra nyílik lehetőség. Ezek a változtatások ugyancsak a mellékelt szabadalmi igénypontok által meghatározott oltalmi körbe esnek.

Meg kell jegyeznünk azt is, hogy a nukleotid esetén megadott bázispárméretek csak hozzávetőlegesek, s azokat csak a találmány bemutatásának céljaira használtuk fel.

Claims (41)

1. Eljárás alapvetően az 1. ábra szerinti nukleotidszekvenciájú, lényegében tisztított és izolált nukleinsavszekvencia előállítására, azzal jellemezve, hogy CD40-Ig immunglobulin doménjében L234F, L235E és G237A mutációkat képzünk, a módosult CD40-Igket kiválasztjuk, a DNS-üket megfelelő enzimhasítóhelyeket tartalmazó szakaszokkal ismert módon, előnyösen polimeráz láncreakcióval kiegészítjük, a fent nevezett szekvencia megfelelő részeit tartalmazó oligonukleotid vizsgáló primerekkel végzett hibridizálás segítségével pozitív kiónokat választunk ki, a pozitív kiónok közül immunprecipitációval a kívánt nukleotidszekvenciát kiválasztjuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olígonukleotid vizsgáló primerként murine gp39 megfelelő részeit alkalmazzuk.

3. Eljárás az alapvetően az 1. ábra szerinti nukleotidszekvenciájú, lényegében tisztított és izolált nukleinsav előállítására, azzal jellemezve, hogy az ATCC 69050 letéti számú Escherichia coli CDM8 MC1061/p3-hgp39 mikroorganizmustörzsben található CDM8 MC1061/p3-hpg39 plazmidból a nevezett nukleinsavat kihasítjuk.

4. Eljárás az alapvetően az 1. ábra szerinti 160-787 helyek közötti nukleotidszekvenciájának megfelelő, lényegében tisztított és izolált nukleinsav előállítására, azzal jellemezve, hogy CD40-Ig immunglobulin doménjében mutációkat végzünk, a módosult CD40-Igket kiválasztjuk, a DNS-üket megfelelő restrikciós hasítóhelyeket tartalmazó szakaszokkal ismert módon, előnyösen polimerizációs láncreakcióval kiegészítjük, a fent nevezett szekvencia megfelelő részeit tartalmazó olígonukleotid vizsgáló primerekkel végzett hibridizálás segítségével pozitív kiónokat választunk ki, a pozitív kiónok közül a kívánt nukleotidszekvenciát immunprecipitációval kiválasztjuk.

5. Eljárás az alapvetően az 1. ábra szerinti 160-787 helyek közötti nukleotidszekvenciát és egy I. típusú membránproteinekhez tartozó, aminoterminális szignál szekvenciát tartalmazó toldalékprotein extracelluláris doménjét kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó, lényegében tisztított és izolált nukleinsav előállítására, azzal jellemezve, hogy a 4. igénypont szerinti nukleotidszekvenciával bíró nukleinsavat valamely, az I. típusú membránproteinhez tartozó, aminoterminális szekréciós szignál szekvenciát tartalmazó toldalékprotein extracelluláris doménjét kódoló nukleinsav-szekvenciát tartalmazó vektorba szubklónozzuk, és a vektorból a nevezett nukleinsavat kinyerjük.

6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 4. igénypont szerinti nukleotidszekvenciát tartalmazó nukleinsavat valamely CD8 toldalékprotein extracelluláris doménjét kódoló, nukleotidszekvenciát is tartalmazó vektorba klónozzuk.

7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy CD8 toldalékproteinnek megfelelő nukleotidszekvenciaként murine CD8 szekvenciát alkalmazunk.

8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy murine CD8 proteinnek megfelelő nukleotidszekvenciaként a 8. ábrán megadott nukleotidszekvenciát alkalmazunk.

9. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy CD8 toldalékproteinnek megfelelő nukleotidszekvenciaként humán CD8 toldalékprotein extracelluláris doménjét kódoló nukleotidszekvenciát alkalmazunk.

10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy humán CD8 proteinnek megfelelő nukleotidszekvenciaként a 9. ábrán megadott nukleotidszekvenciát alkalmazunk.

11. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kívánt nukleinsavat az ATCC 69049 letéti számú Escherichia coli CDM7B MC1061/p3-shgp39 mikroorganizmustörzsben található MC1061/p3-shgp39 plazmidból hasítjuk ki.

12. Eljárás az 1. ábra szerinti aminosav-szekvenciájú, tisztított és izolált protein előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely 1. igénypont szerinti nukleinsavszekvenciát megfelelő vektorba viszünk, a vektorral megfelelő gazdasejtet transzformálunk, és az expreszsziós terméket a gazdasejtből kinyerjük.

13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vektorként az ATCC 69050 letéti számú Escherichia coli CDM8 MC1061/p3-hgp39 mikroorganizmustörzsben található CDM8 MC1061/p3-hgp39 plazmidot alkalmazunk.

14. Eljárás az 1. ábra 41-261. aminosavak közötti szekvenciájú, lényegében tisztított és izolált oldható gp39 protein előállítására, azzal jellemezve, hogy a 4. igénypont szerinti valamely nukleotidszekvenciát megfelelő vektorba viszünk, a vektorral egy megfelelő gazdasejtet transzformálunk, és az expressziós terméket a gazdasejtből kinyerjük.

15. Eljárás alapvetően az 1. ábra szerinti 47-261. aminosavak közötti szekvenciát lényegileg tisztítva is izolálva, valamint egy I. típusú membránproteinekhez tartozó, aminoterminális szekréciós szignál szekvenciát tartalmazó toldalékprotein extracelluláris doménjét magába foglaló protein előállítására, azzal jellemezve, hogy az 5. igénypont szerinti valamely nukleinsav-szekvenciát megfelelő vektorba viszünk, a vektorral megfelelő gazdasejtet transzformálunk, és az expressziós terméket a gazdasejtből kinyerjük.

16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vektorként az ATCC 69049 letéti számú Escherichia coli CDM7B MC1061/p3-shgp39 mikroorganizmustörzsben található CDM7B MC1061/p3-shgp39 plazmidot alkalmazunk.

17. A 14. vagy 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 6. igénypont szerinti valamely nukleotidszekvenciának a megfelelő vektorba vitelénél toldalékproteinként valamely CD8 toldalékprotein extracelluláris doménjét tartalmazó proteint állítunk elő.

18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 7. igénypont szerinti eljárással előállított nukleinsav-szekvenciának a megfelelő vektorba vitelénél CD8 toldalékproteinként murine CDS toldalékpro15

HU 215 949 Β tein extracelluláris doménjét tartalmazó proteint állítunk elő.

19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 8. igénypont szerinti eljárással előállított nukleinsav-szekvenciának a megfelelő vektorba vitelénél murine CD8 toldalékproteinként a 8. ábra aminosav-szekvenciájával bíró protein extracelluláris doménjét tartalmazó proteint állítunk elő.

20. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 9. igénypont szerinti eljárással előállított nukleinsav-szekvenciának a megfelelő vektorba vitelénél CD8 toldalékproteinként humán CD8 toldalékprotein extracelluláris doménjét tartalmazó proteint állítunk elő.

21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 10. igénypont szerinti eljárással előállított nukleinsav-szekvenciának a megfelelő vektorba vitelénél humán CD8 toldalékproteinként a 9. ábra szerinti aminosav-szekvenciával bíró protein extracelluláris doménjét tartalmazó proteint állítunk elő.

22. Eljárás B-sejtek in vitro proliferációjának gyorsítására, azzal jellemezve, hogy aktivált B-sejtekhez a 14-21. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított, oldható gp39 protein hatékony - előnyösen 0,005 és 2,5 pm/ml közötti - koncentrációjú oldatát adjuk.

23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy aktivált B-sejtekhez a 14. igénypont szerinti eljárással előállított proteint adunk.

24. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy aktivált B-sejtekhez a 15. vagy 16. igénypont szerinti eljárással előállított proteint adunk.

25. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy aktivált B-sejtekhez a 17. igénypont szerinti eljárással előállított proteint adunk.

26. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy aktivált B-sejtekhez a 18. igénypont szerinti eljárással előállított proteint adunk.

27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy aktivált B-sejtekhez a 19. igénypont szerinti eljárással előállított proteint adunk.

28. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy aktivált B-sejtekhez a 20. igénypont szerinti eljárással előállított proteint adunk.

29. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy aktivált B-sejtekhez a 21. igénypont szerinti eljárással előállított proteint adunk.

30. A 22. igénypont szerinti eljárás B-sejtek proliferációjának in vitro gyorsítására, azzal jellemezve, hogy B-sejtekhez (i) valamely a 14-21. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított oldható gp39 proteint és (ii) egy kostimuláló anyagot adunk.

31. A 30. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kostimuláló anyagként antiimmunglobulin antitestet alkalmazunk.

32. A 30. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kostimuláló anyagként B-sejt antigén ellen irányuló antitestet alkalmazunk.

33. A 30. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy B-sejt antigénként CD20 antigént alkalmazunk.

34. Eljárás immunválaszt fokozó gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a 14-21. igénypontok bármelyike szerint előállított, oldható gp39 protein hatásos mennyiségét gyógyászatilag elfogadható hordozóval összekeverjük.

35. A 34. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 15. igénypont szerinti eljárással előállított proteint keveijük össze a hordozóval.

36. A 34. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 16. igénypont szerinti eljárással előállított proteint keveijük össze a hordozóval.

37. A 34. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 17. igénypont szerinti eljárással előállított proteint keveijük össze a hordozóval.

38. A 34. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 18. igénypont szerinti eljárással előállított proteint keveijük össze a hordozóval.

39. A 34. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 19. igénypont szerinti eljárással előállított proteint keveijük össze a hordozóval.

40. A 34. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 20. igénypont szerinti eljárással előállított proteint keveijük össze a hordozóval.

41. A 34. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 21. igénypont szerinti eljárással előállított proteint keveijük össze a hordozóval.