ES2643646T3 - Vectores de vacuna y métodos para potenciar las respuestas inmunitarias - Google Patents

Vectores de vacuna y métodos para potenciar las respuestas inmunitarias Download PDF

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Description

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DESCRIPCION
Vectores de vacuna y metodos para potenciar las respuestas inmunitarias Referenda cruzada con solicitudes relacionadas
Esta solicitud de patente reivindica el beneficio de la prioridad de la Solicitud de patente provisional N.° 61/297.098, presentada el 21 de enero de 2010.
Introduccion
Las vacunas se usan para iniciar una respuesta inmunitaria adaptativa contra antlgenos, en particular antlgenos de patogenos, celulas tumorales o similares, con el objetivo de mejorar o de prevenir una enfermedad. Las vacunas de peptidos sinteticos o de microorganismos muertos o atenuados con frecuencia son eficaces para estimular una respuesta inmunitaria robusta que es totalmente protectora. En algunos casos estas vacunas no son protectoras o son solo parcialmente protectoras y se deben usar otras estrategias para desarrollar vacunas protectoras. Las vacunas a base de microorganismos atenuados estan asociadas con riesgos de transferencia genica y de reparacion de mutaciones y pueden poner en riesgo a individuos inmunocomprometidos. Es necesario desarrollar nuevas vacunas que sean seguras y eficaces para estimular respuestas inmunitarias protectoras duraderas.
La infeccion por el virus de la gripe, en particular el virus de la gripe aviar H5N1, supone una creciente importancia sanitaria y economica. Los datos indican claramente que el H5N1 continua circulando entre aves y cerdos susceptibles en regiones cada vez extensas del mundo. Muchos cientlficos creen que si no se controla, el virus de la gripe aviar H5N1 actual mutara y se podra producir la transmision de humano a humano y causara una pandemia mundial. Con una tasa de mortalidad de mas del 50 %, dicha epidemia serla devastadora. Independientemente de la habilidad del virus para causar la enfermedad en humanos, el virus de la gripe aviar H5N1 ya esta amenazando con tener un enorme impacto economico debido a la erradicacion de manadas de aves de corral en areas afectadas. Por lo tanto, se necesita el desarrollo de una vacuna para proteger a los seres humanos, aves de corral, cerdos y otros animales domesticos contra la el virus de la gripe H5N1. Una vacuna contra la gripe que sea capaz de proteger contra H5N1 as! como tambien contra otros virus de la gripe, tal como H1N1, serla optima. El documento US2008/0305120 divulga la actividad adyuvante del polipeptido HMGB1 y sugiere protelnas de fusion y antlgenos.
Sumario
En la presente memoria se proporcionan vectores de vacunas y metodos de estimulacion de una respuesta inmunitaria y metodos para reducir la morbilidad asociada con la infeccion por el virus de la gripe. En un aspecto, se proporciona un vector de vacuna que incluye un polipeptido antigenico y un polipeptido HMGB1 o un fragmento funcional de los mismos. Al menos una porcion del polipeptido antigenico y del polipeptido HMGB1 esta presente sobre la superficie del vector de vacuna. El vector de vacuna de esta divulgacion puede incluir un primer polinucleotido que codifica el polipeptido antigenico y un segundo polinucleotido que codifica el polipeptido HMGB1. El polipeptido HMGB1 y el polipeptido antigenico pueden estar unidos, tal como en una protelna de fusion. El polipeptido HMGB1 y el polipeptido antigenico se pueden insertar ambos dentro de un bucle extremo de una protelna transmembrana.
En un aspecto, esta invencion proporciona un vector de vacuna como se define en las reivindicaciones adjuntas.
En otro aspecto, se proporciona una composicion que comprende el vector de vacuna y un vehlculo farmaceuticamente aceptable. El vehlculo farmaceuticamente aceptable puede ser aceptable para uso oral o nasal.
El vector de vacuna puede ser incapaz de replicarse.
En otro aspecto mas, se proporciona un vector de vacuna contra Bacillus spp. El vector de vacuna incluye una primera secuencia de polinucleotidos que codifica un polipeptido antigenico que se expresa sobre la superficie del vector de vacuna y una segunda secuencia de polinucleotidos que codifica un polipeptido inmunoestimulador que se expresa sobre la superficie del vector de vacuna. El polipeptido antigenico puede ser un polipeptido M2e del virus de la gripe, un polipeptido HA del virus de la gripe o un polipeptido NP del virus de la gripe o una combinacion de los mismos. El polipeptido inmunoestimulador puede ser un polipeptido CD154 o un polipeptido HMGB1 o una combinacion de los mismos. El polipeptido inmunoestimulador y el polipeptido antigenico pueden estar unidos, tal como en una protelna de fusion y se pueden insertar en un bucle externo de una protelna transmembrana.
En otro aspecto mas de esta divulgacion, se proporcionan metodos para potenciar una respuesta inmunitaria en un sujeto. En el metodo, se administran al sujeto los vectores de vacuna o composiciones proporcionadas en la presente memoria en una cantidad eficaz para potenciar la respuesta inmunitaria del sujeto hacia el polipeptido antigenico. Convenientemente, el vector de vacuna se administra por via oral o por via intranasal.
En otro aspecto adicional de esta divulgacion, se proporcionan metodos para potenciar la respuesta inmunitaria en un sujeto mediante la administracion de un vector de vacuna contra Bacillus spp. como se proporciona en la
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presente memoria. El vector de vacuna incluye una primera secuencia de polinucleotidos que codifica un polipeptido antigenico que se expresa sobre la superficie del vector de vacuna y una segunda secuencia de polinucleotidos que codifica un polipeptido inmunoestimulador que se expresa sobre la superficie del vector de vacuna. El polipeptido antigenico puede ser un polipeptido M2e del virus de la gripe, un polipeptido HA del virus de la gripe, un polipeptido NP del virus de la gripe o una combinacion de los mismos. El polipeptido inmunoestimulador puede ser un polipeptido CD154, un polipeptido HMGB1 o una combinacion de los mismos.
En otro aspecto adicional mas de esta divulgacion, se proporcionan metodos para reducir la morbilidad relacionada con influenza en un sujeto. En los metodos, la administracion de los vectores de vacuna o composiciones divulgados en la presente memoria reduce la morbilidad asociada con una subsiguiente infeccion por el virus de la gripe.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 es un grafico que muestra las proporciones S/P (entre muestra y control positivo) del ELISA para la produccion de anticuerpos especlficos contra M2e en pollos despues de la administracion mediante sonda nasogastrica de la dosificacion indicada del vector de vacuna Bacillus subtilis que expresa los epltopos del virus de la gripe A y HMGB1 o CD154, en comparacion con pollos vacunados con solucion salina.
La Figura 2 representa un grafico que muestra las proporciones S/P del ELISA para la produccion de anticuerpos especlficos contra HA LB en pollos despues de la administracion mediante sonda nasogastrica de la dosificacion indicada del vector de vacuna Bacillus subtilis que expresa los epltopos del virus de la gripe A y HMGB1 o CD154 en comparacion con pollos vacunados con solucion salina.
La Figura 3 es un grafico que muestra las proporciones S/P del ELISA para la produccion de anticuerpos especlficos contra HA UA en pollos despues de la administracion mediante sonda nasogastrica de la dosificacion indicada del vector de vacuna Bacillus subtilis que expresa los epltopos del virus de la gripe A y HMGB1 o CD154 en comparacion con pollos vacunados con solucion salina.
La Figura 4 es un grafico que muestra las proporciones S/P del ELISA para la produccion de anticuerpos especlficos contra M2e en pollos despues de la administracion mediante sonda nasogastrica de la dosificacion indicada de vectores de vacuna Bacillus subtilis vivos o inactivados en diversos grados que expresan los epltopos del virus de la gripe A y HMGB1 o CD154 en comparacion con pollos vacunados con el vector contra Bacillus solo (BSBB).
La Figura 5 es un grafico que muestra las proporciones S/P del ELISA para la produccion de anticuerpos especlficos contra HA LB en pollos despues de la administracion mediante sonda nasogastrica de la dosificacion indicada de vectores de vacuna Bacillus subtilis vivos o inactivados en diversos grados que expresan los epltopos del virus de la gripe A y HMGB1 o CD154 en comparacion con pollos vacunados con el vector contra Bacillus solo (BSBB).
La Figura 6 es un grafico que muestra las proporciones S/P del ELISA para la produccion de anticuerpos especlficos contra HA UA en pollos despues de la administracion mediante sonda nasogastrica de la dosificacion indicada de vectores de vacuna Bacillus subtilis vivos o inactivados en diversos grados que expresan los epltopos del virus de la gripe A y HMGB1 o CD154 en comparacion con pollos vacunados con el vector de Bacillus solo (BSBB).
La Figura 7 es un grafico que muestra las proporciones S/P del ELISA para la produccion de anticuerpos IgG especlficos contra M2e en pollos despues de la administracion mediante sonda nasogastrica de 106 vectores de vacuna Bacillus subtilis, vivos o bien inactivados con las diferentes dosificaciones de formalina que se indican, que expresan los epltopos del virus de la gripe A y HMGB1 en comparacion con pollos vacunados con el vector contra Bacillus solo (BSBB).
La Figura 8 es un grafico que muestra las proporciones S/P del ELISA para produccion de anticuerpos IgA especlficos contra M2e en pollos vacunados, ya sea por via oral o por via subcutanea, con 106 vectores de vacuna Bacillus subtilis vivos, inactivados con formalina o inactivados con formalina y liofilizados que expresan los epltopos del virus de la gripe A y HMGB1 en comparacion con pollos vacunados con el vector contra Bacillus solo (BSBB).
La Figura 9 es un grafico que muestra las proporciones S/P del ELISA para la produccion de anticuerpos IgA especlficos contra M2e en pollos vacunados, ya sea por via oral o por via subcutanea, con 106 vectores de vacuna Bacillus subtilis vivos, inactivados con formalina o inactivados con formalina y liofilizados que expresan los epltopos del virus de la gripe A y HMGB1 en comparacion con pollos vacunados con el vector contra Bacillus solo (BSBB).
Descripcion detallada
Las tecnologlas del ADN recombinante permiten la manipulacion relativamente facil de muchas especies de bacterias y virus. Algunas bacterias y virus son, ya sea de forma natural o por seleccion o por manipulacion, levemente patogenas o no patogenas, pero retienen la capacidad de generar una respuesta inmunitaria robusta. Estas bacterias y virus hacen atractivos a los vectores de vacuna para producir una respuesta inmunitaria contra antlgenos heterologos o extranos. Los vectores de vacuna bacterianos o vlricos pueden imitar la infeccion natural y producir una inmunidad robusta y de larga duracion. Los vectores de vacuna con frecuencia no son relativamente caros para producir y administrar. Ademas, dichos vectores con frecuencia pueden llevar consigo mas de un antlgeno y pueden proporcionar proteccion contra multiples agentes infecciosos.
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Los vectores para vacuna de bacterias o virus vivos pueden suponer aun riegos para individuos inmunocomprometidos y pueden requerir observaciones reguladoras adicionales. Por lo tanto, es deseable el uso de vectores que esten muertos o inactivados o que califiquen como organismos generalmente considerados como seguros (GRAS) por la Administracion de Alimentos y Farmacos (FDA) de los Estados Unidos. El problema es generar una respuesta inmunitaria robusta usando dichos vectores. Como se muestra en los ejemplos, mediante la inclusion de polipeptidos HMGB1 (protelna de alta movilidad del grupo de caja 1) sobre la superficie del vector de vacuna se ha podido generar una respuesta inmunitaria robusta contra los polipeptidos antigenicos usando un vector contra Bacillus spp. De hecho, los ejemplos demuestran que este vector se puede inactivar, de modo que el mismo no se pueda replicar, usando varios metodos, y aun as! producir una respuesta inmunitaria robusta despues de su administracion.
En la presente memoria se proporcionan vectores de vacuna que incluyen un polipeptido antigenico y un polipeptido HMGB1 o un fragmento funcional de los mismos. Al menos una porcion del polipeptido antigenico y al menos una porcion del polipeptido HMGB1 o fragmentos funcionales de los mismos estan presentes sobre la superficie del vector de vacuna. El vector de vacuna puede incluir un primer polinucleotido que codifica el polipeptido antigenico y un segundo polinucleotido que codifica el polipeptido HMGB1. El polipeptido HMGB1 y el polipeptido antigenico pueden estar unidos, tal como en una protelna de fusion o se pueden expresar de forma separada. El polipeptido HMGB1 y el polipeptido antigenico se pueden insertar ambos dentro de un bucle externo de una protelna transmembrana.
Los vectores de vacuna pueden ser bacterianos, vlricos o a base de liposomas. Los posibles vectores de vacuna incluyen, pero no se limitan a, Bacillus (Bacillus subtilis), Salmonella (Salmonella enteritidis), Shigella, Escherichia (E. coli), Yersinia, Bordetella, Lactococcus, Streptococcus, Vibrio (Vibrio cholerae), Listeria, adenovirus, poxvirus, herpesvirus, alfavirus y virus adenoasociados. Convenientemente, el vector de vacuna es un organismo GRAS. El vector de vacuna puede estar inactivado o muerto de modo que no sea capaz de replicarse. Los metodos para inactivar o destruir vectores de vacuna bacterianos o vlricos son conocidos por los expertos en la materia e incluyen, sin limitarse a, metodos tales como los que se muestran en los ejemplos, concretamente inactivacion por formalina, inactivacion a base de antibioticos, tratamiento con calor y tratamiento con etanol.
Un polipeptido antigenico es un polipeptido capaz de ser reconocido especlficamente por el sistema inmunitario adaptativo. Un polipeptido antigenico incluye cualquier polipeptido inmunogenico. Los polipeptidos antigenicos incluyen, pero no se limitan a, antlgenos relacionados con patogenos, con alergenos, con tumores o con enfermedades. Los patogenos incluyen patogenos vlricos, parasitos, fungicos y bacterianos, as! como tambien patogenos proteicos tales como los priones. Los polipeptidos antigenicos pueden ser protelnas de longitud completa o porciones de las mismas. Esta bien establecido que el reconocimiento por el sistema inmunitario de muchas protelnas se basa en un numero relativamente pequeno de aminoacidos, con frecuencia denominados epltopo. Los epltopos pueden ser de entre solo 8 y 10 aminoacidos. Por lo tanto, los polipeptidos antigenicos que se describen en la presente memoria pueden ser protelnas de longitud completa, epltopos de 8 aminoacidos de longitud o cualquier porcion entre estos extremos. De hecho, el polipeptido antigenico puede incluir mas de un epltopo de un unico patogeno o protelna.
Se pueden incluir en el vector de vacuna multiples copias del mismo epltopo o multiples epltopos de diferentes protelnas. Se cree que se pueden administrar varios epltopos o antlgenos del mismo o diferentes patogenos o enfermedades en combinacion con un vector de vacuna individual para generar una respuesta inmunitaria mas intensa contra multiples antlgenos. Los vectores de vacuna recombinantes pueden codificar antlgenos de multiples antlgenos asociados a microorganismos patogenos, virus o tumores. La administracion de vectores de vacuna capaces de expresar multiples antlgenos tiene la ventaja de inducir inmunidad contra dos o mas enfermedades al mismo tiempo.
El polipeptido antigenico puede ser un polipeptido del virus de la gripe, convenientemente es un polipeptido del virus de la gripe H5N1 o un polipeptido asociado con multiples cepas del virus de la gripe tal como un polipeptido de la protelna M2 del virus de la gripe. El ectodominio de la protelna M2 del virus de la gripe A, 25 conocido como M2e, protruye desde la superficie del virus. La porcion M2e de la protelna M2 contiene aproximadamente 24 aminoacidos. El polipeptido M2e varla poco entre un aislamiento del virus de la gripe y otro. De hecho, se han aislado solo unas pocas mutaciones de origen natural en M2e a partir de humanos infectados desde la epidemia de gripe de 1918. Ademas, los virus de la gripe aislados a partir de hospedadores aviares y porcinos tienen diferentes, aunque conservadas, secuencias de M2e. Para revisiones de las secuencias del polipeptido M2e aislado de hospedadores humanos, aviares y porcinos vease Liu et al., Microbes and Infection 7:171-177 (2005) y Reid et al., J. Viral. 76:10717-10723 (2002). Vease tambien la SEQ ID NO: 1-4.
Convenientemente se puede insertar el polipeptido M2e completo en el vector de vacuna o se puede usar solamente una porcion. En los ejemplos, se incorporo un polipeptido de ocho aminoacidos (LM2 que tiene la secuencia de aminoacidos: EVETPIRN, SEQ ID NO:5 o su variante M2eA que tiene la secuencia de aminoacidos EVETPTRN, SEQ ID NO:6) en el vector de vacuna y se demostro que produce una respuesta con anticuerpos despues de su administracion a pollos. Convenientemente, la porcion del polipeptido M2e insertada en el vector de vacuna es inmunogenica. Un fragmento inmunogenico es un peptido o polipeptido que es capaz de producir una respuesta
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inmunitaria celular o humoral. Convenientemente, un fragmento inmunogenico de M2e puede ser el polipeptido M2e de longitud completa, o convenientemente puede ser de 20 o mas aminoacidos, 15 o mas aminoacidos, 10 o mas aminoacidos u 8 o mas aminoacidos de la secuencia de longitud completa.
Otros epltopos apropiados para su inclusion en un vector de vacuna del virus de la gripe A incluyen, pero no se limitan a, polipeptidos de la hemaglutinina (HA) o de la protelna nuclear (NP) del virus de la gripe A. Por ejemplo, se pueden incluir los peptidos de SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO: 10 en un vector de vacuna. En los ejemplos, se incorporaron la SEQ ID NO: 7 (HAUA) y la SEQ ID NO: 8 (HALB) en el vector de vacuna y se demostro que produclan una respuesta con anticuerpos despues de su administracion a pollos. Veanse las figuras 2-3 y 5-6. Ademas, en los ejemplos, se incorporaron en el vector de vacuna los epltopos NP de SEQ ID NO: 9 (NP54) y SEQ ID NO: 10 (NP147). Un experto en la materia apreciara que cualquiera de estas secuencias se puede usar en combinacion con cualquier otro epltopo, incluyendo epltopos que derivan de otros patogenos o antlgenos.
La protelna HMGB1 (protelna de alta movilidad del grupo caja 1) se identifico primero como una protelna de union a ADN que es crltica para la estructura y estabilidad del ADN. Es una protelna nuclear que se expresa en forma ubicua que se une al ADN sin especificidad de secuencia. La protelna esta muy conservada y se encuentra en plantas hasta en mamlferos. Las secuencias de aminoacidos de HMGB1 del pez cebra, el pollo y seres humanos se proporcionan en la SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 29, respectivamente. La secuencia esta muy conservada en mamlferos, con un 98 % de identidad de aminoacidos y los cambios de aminoacidos son conservativos. Por lo tanto, una protelna HMGB1 de una especie probablemente puede sustituir funcionalmente a la de otras especies. La protelna HMGB1 de longitud completa o una porcion de la misma, se puede usar como polipeptido HMGB1 en el vector de vacuna como se describe en la presente memoria. HMGB1 tiene dos regiones de union a ADN denominadas caja A, como se muestra en la SEQ ID NO: 23 y 24 y caja B como se muestra en la SEQ ID NO: 25 y 26. Vease Andersson and Tracey, Annu. Rev. Immunol. 2011, 29:139-162.
HMGB1 es un mediador de la inflamacion y sirve como una senal de dano nuclear, tal como en celulas necroticas. HMGB1 tambien se puede secretar activamente en celulas del linaje de los monocitos/macrofagos en un proceso que requiere acetilacion de la protelna, translocacion a traves del nucleo y secrecion. La HMGB1 extracelular actua como un potente mediador de la inflamacion mediante la serialization de la via de los receptores para productos finales de glicosilacion avanzada (RAGE) y a traves de miembros de la familia de receptores tipo Toll (TLR), en particular TLR4. Se ha identificado la actividad de union a RAGE y la misma requiere del polipeptido de SEQ ID NO: 27. La union a TLR4 requiere de la cistelna de la position 106 de la SEQ ID NO: 18, que se encuentra en la region de la caja B de HMGB1.
Las actividades inflamatorias de HMGB1 no requieren de la protelna de longitud completa y se han identificado fragmentos funcionales. La caja B se ha demostrado como suficiente para mediar los efectos proinflamatorios de HMGB1 y por lo tanto las SEQ ID NO: 25 y 26 son polipeptidos HMGB1 o fragmentos funcionales de los mismos dentro del contexto de la presente divulgation. Ademas, el sitio de union a RAGE y la actividad de citocina proinflamatoria se han cartografiado en la SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28, respectivamente. Por lo tanto, estos polipeptidos son fragmentos funcionales del polipeptido HMGB1.
Los expertos en la materia son capaces de identificar polipeptidos HMGB1 y fragmentos de los mismos que son capaces de estimular actividad de citocina pro-inflamatoria, usando metodos tales como los de la Publication internacional N.° W002 092004. Convenientemente, el polipeptido HMGB1 incluye el dominio de union a RAGE en los aminoacidos 150 a 183 de SEQ ID NO:18 (SEQ ID NO: 27 o un homologo de la misma) y el domino de actividad citocina proinflamatoria entre los aminoacidos 89 y 109 de la SEQ ID NO: 18 (SEQ ID NO: 28 o un homologo de la misma). En particular, los polipeptidos HMGB1 y fragmentos funcionales u homologos de los mismos incluyen a polipeptidos identicos, o al menos 99 % identicos, al menos 98 % identicos, al menos 95 % identicos, al menos 90 % identicos, al menos 85 % identicos, o al menos 80 % identicos a los polipeptidos HMGB1 de las SEQ ID NOs: 18 o 23-30.
Al menos una porcion del polipeptido antigenico y al menos una porcion del polipeptido HMGB1 estan presentes sobre la superficie del vector de vacuna. Presente sobre la superficie del vector de vacuna incluye a polipeptidos que estan comprendidos dentro de una protelna transmembrana, que interaccionan covalentemente o qulmicamente entrecruzados con una protelna transmembrana, un llpido de membrana o un carbohidrato anclado a la membrana. Un polipeptido puede estar comprendido en una protelna transmembrana teniendo los aminoacidos que comprenden el polipeptido unidos a traves de un enlace peptldico al extremo N-terminal, C-terminal o a cualquier parte dentro de la protelna transmembrana (es decir, insertados entre dos aminoacidos de la protelna transmembrana o en el lugar de uno o mas aminoacidos de la protelna transmembrana (es decir, deletion-insertion). Convenientemente, los polipeptidos se pueden insertar en un bucle externo de una protelna transmembrana. Las protelnas transmembrana adecuadas son cotB y lamB, pero los expertos en la materia apreciaran que existen muchas protelnas transmembrana apropiadas.
Como alternativa, los polipeptidos pueden unirse covalente o qulmicamente a protelnas, llpidos o carbohidratos en la membrana, o capside si se usa un vector viral mediante los metodos disponibles para los expertos en la materia. Por ejemplo, se pueden usar enlaces disulfuro o entrecruzamientos de biotina - avidina para presentar los polipeptidos
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antigenicos y HMGB1 sobre la superficie de un vector de vacuna. Convenientemente, el polipeptido antigenico y el polipeptido HMGB1 son parte de una protelna de fusion. Los dos polipeptidos se pueden unir directamente a traves de un enlace peptldico o puede estar separados por un adaptador o por una seccion de una tercera protelna en la cual estan insertados.
Los polinucleotidos que codifican el polipeptido antigenico o el polipeptido HMGB1 se pueden insertar en el vector de vacuna y expresar para generar el polipeptido antigenico y el polipeptido HMGB1. Los polinucleotidos se pueden insertar en el cromosoma del vector de vacuna o pueden estar codificados en plasmidos u otro ADN extracromosomico. Convenientemente, los polinucleotidos que codifican el polipeptido antigenico y/o el polipeptido HMGB1 se pueden expresar en forma independiente o se insertan en un polinucleotido del vector de vacuna que se expresa. Convenientemente, el polinucleotido del vector de vacuna codifica un polipeptido que se expresa sobre la superficie del vector de vacuna tal como una protelna transmembrana. El polinucleotido que codifica el polipeptido antigenico y/o el polipeptido HMGB1 se puede insertar en la secuencia de polinucleotidos del vector de vacuna para permitir la expresion del polipeptido antigenico y/o el polipeptido HMGB1 sobre la superficie del vector. Por ejemplo, el polinucleotido que codifica el polipeptido antigenico y el polipeptido HMGB1 se pueden insertar en fase dentro de un polinucleotido bacteriano en una region que codifica una region externa en bucle de una protelna transmembrana, de modo que la secuencia de polinucleotidos bacteriana permanezca en fase. Vease el Ejemplo 1.
De forma alternativa, el polinucleotido que codifica el polipeptido antigenico y/o el polipeptido HMGB1 se puede insertar en un polipeptido' secretado que se expone o presenta sobre la superficie del vector de vacuna a traves de la asociacion con una protelna, llpido o carbohidrato sobre la superficie del vector de vacuna. Los expertos en la materia apreciaran que el polinucleotido que codifica el polipeptido antigenico y/o el polipeptido HMGB1 se puede insertar en una amplia variedad de polinucleotidos del vector de vacuna para proporcionar la expresion y presentacion del polipeptido antigenico y/o el polipeptido HMGB1 a las celulas inmunitarias del sujeto que se trata con el vector de vacuna. En los ejemplos, se expresaron varios epltopos del virus de la gripe, que incluyen un epltopo M2e, un epltopo HA y un epltopo NP, a partir de un plasmido para expresion vegetativa en Bacillus subtilis. La bacteria recombinante resultante expresa los epltopos insertados segun se demuestra mediante la respuesta inmunitaria que se muestra en las Figuras 1-6.
En los ejemplos, los vectores de vacuna tienen los polipeptidos antigenicos (polipeptidos M2e, HA y NP) y el polipeptido inmunoestimulador (CD154 o HMGB1) codificados por el mismo polinucleotido y en fase entre si. En realizaciones alternativas, el polipeptido inmunoestimulador y el polipeptido antigenico pueden estar codificados por polinucleotidos diferentes. Los expertos en la materia apreciaran que se puede usar varios metodos para obtener la expresion del polipeptido antigenico y el polipeptido HMGB1 sobre la superficie del vector de vacuna. Dichos metodos son conocidos por los expertos en la materia.
Tambien se proporcionan composiciones que comprenden el vector de vacuna y un vehlculo farmaceuticamente aceptable. Un vehlculo farmaceuticamente aceptable es cualquier vehlculo apropiado para su administracion in vivo. Convenientemente, el vehlculo farmaceuticamente aceptable es aceptable para administracion oral, nasal o a traves de la mucosa. El vehlculo farmaceuticamente aceptable puede incluir agua, soluciones tamponadas, soluciones de glucosa o fluidos de cultivo bacteriano. Otros componentes de las composiciones convenientemente pueden incluir excipientes tales como estabilizantes, conservantes, diluyentes, emulsionantes y lubricantes. Entre los ejemplos de vehlculos o diluyentes farmaceuticamente aceptables se incluyen estabilizantes tales como carbohidratos (por ejemplo, sorbitol, manitol, almidon, sacarosa, glucosa, dextrano), protelnas tales como albumina o caselna, agentes que contienen protelnas tales como suero bovino o leche desnatada y tampones (p. ej., tampon fosfato). En especial cuando se agregan dichos estabilizantes a las composiciones, la composicion es apropiada para secado por congelacion o secado por pulverizacion. El vector de vacuna en las composiciones puede no ser capaz de replicarse, convenientemente el vector de vacuna se inactiva o destruye antes de agregarse a la composicion.
Las composiciones descritas en la presente memoria se pueden usar para potenciar una respuesta inmunitaria tal como una respuesta con anticuerpos frente al polipeptido antigenico. Las composiciones que contienen polipeptidos del virus de la gripe tambien se pueden usar para disminuir la morbilidad asociada con la consiguiente infeccion por el virus de la gripe. Las composiciones pueden prevenir que el virus de la gripe cause enfermedad o cualquier morbilidad asociada en un sujeto al cual se administraron las composiciones o los vectores de vacuna descritos en la presente memoria. Las composiciones y los vectores de vacuna descritos en la presente memoria pueden reducir la gravedad de la consiguiente enfermedad mediante la disminucion de la duracion de la enfermedad, disminuyendo la morbilidad o mortalidad asociadas con la enfermedad o reduciendo la posibilidad de contraer la enfermedad. La morbilidad o mortalidad asociadas con la enfermedad despues de la administracion del vector de vacuna como se describe en la presente memoria se pueden reducir en 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o incluso 100 % en comparacion con sujetos similares que no recibieron el vector de vacuna.
Tambien se proporcionan metodos para potenciar las respuestas inmunitarias en un sujeto mediante la administracion de un vector de vacuna. El vector de vacuna puede contener un polipeptido HMGB1 capaz de estimular la respuesta inmunitaria contra el vector de vacuna y su polipeptido antigenico asociado. El vector de vacuna que comprende un polipeptido de HMGB1 se administra a un sujeto en una cantidad eficaz para potenciar la respuesta inmunitaria del sujeto contra la vacuna y en particular contra el polipeptido antigenico. Convenientemente,
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el vector de vacuna contiene un polinucleotido que codifica un polipeptido que incluye los aminoacidos 150-183 y 89109 del polipeptido HMGB1 (SEQ ID NO: 18) o un homologo del mismo. En los ejemplos, se uso un polipeptido de 190 aminoacidos de HMGB1. Convenientemente, el polinucleotido codifica un polipeptido HMGB1 de la misma especie que el sujeto. Las combinaciones heterologas de polipeptidos HMGB1 y sujetos (es decir, un polipeptido HMGB1 humano para usar en una vacuna para pollos) pueden ser utiles en los metodos de la invencion debido a que HMGB1 esta muy conservado a traves de un amplio numero de especies. El polipeptido HMGB1 se puede usar para potenciar la respuesta inmunitaria en el sujeto frente a cualquier antlgeno o polipeptido antigenico extrano que este presente en, o sobre el vector de vacuna. El experto en la materia apreciara que el polipeptido HMGB1 se puede usar para potenciar la respuesta inmunitaria frente a mas de un polipeptido antigenico presente en un vector de vacuna. El polipeptido de HMGB1 estimula una respuesta inmunitaria al menos en parte mediante la activacion de celulas dendrlticas y macrofagos y por lo tanto estimulando la produccion de citocinas tales como IL-1, IL-6, IFN-y y TNF-a. En los ejemplos, se expreso un polipeptido de HMGB1 sobre la superficie del vector de vacuna.
Ademas, se divulgan metodos para potenciar una respuesta inmunitaria contra el virus de la gripe A y metodos para reducir la morbilidad asociada con la subsiguiente infeccion por el virus de la gripe A. Brevemente, los metodos comprenden administrar a un sujeto un vector de vacuna que comprende un epltopo del virus de la gripe A (un polipeptido antigenico del virus de la gripe) capaz de producir una respuesta inmunitaria en una cantidad eficaz para producir la respuesta inmunitaria. El epltopo del virus de la gripe A puede ser un polipeptido M2e, un HA polipeptido o un polipeptido NP u otro polipeptido del virus de la gripe como se expuso previamente. La insercion de los polipeptidos antigenicos en el vector de vacuna se puede llevar a cabo en varias formas que son conocidas para los expertos en la materia, que incluyen, pero no se limitan a, el sistema de mutagenesis sin cicatrices dirigida al sitio, que se describe en la Publicacion de patente internacional N.° WO 2008/036675. Las bacterias tambien se pueden manipular para que expresen polipeptidos del virus de la gripe junto con polinucleotidos capaces de potenciar la respuesta inmunitaria como se expuso previamente. En particular, se puede expresar un polipeptido de CD154 o HMGB1 mediante el vector de vacuna para potenciar la respuesta inmunitaria del sujeto contra los polipeptidos del virus de la gripe. Los ejemplos demuestran la produccion de una respuesta robusta a IgA e IgG ante la vacunacion en pollos. Se espera que dicha respuesta robusta sea protectora, o que al menos reduzca la morbilidad asociada con la subsiguiente infeccion o estimulacion con la fuente de polipeptido antigenico (virus de la gripe en los ejemplos).
Las composiciones se pueden administrar mediante varios medios que incluyen, pero no se limitan a, por via oral, por via intranasal y a traves de mucosa. Por ejemplo, las composiciones o vectores de vacuna se pueden administrar mediante aerosol, mediante pulverization, mediante la adicion a la comida o al agua, mediante sonda nasogastrica o a traves de gotas oftalmicas. En algunas realizaciones, las composiciones se administran mediante inyeccion tal como intradermica, parenteral, subcutanea, intraperitoneal, intravenosa, intracraneal, o intramuscular. Para los pollos u otras aves de corral, las composiciones se pueden administrar in ovo.
Los sujetos incluyen, pero no se limitan a, un vertebrado, convenientemente un mamlfero, convenientemente un ser humano, vacas, gatos, perros, cerdos, o aves, convenientemente aves de corral tal como pollos. Tambien se pueden usar otros modelos de infeccion en animales. La potenciacion de la respuesta inmunitaria incluye, pero no se limita a, inducir un efecto terapeutico o profilactico que esta mediado por el sistema inmunitario del sujeto. Especlficamente, la potenciacion de una respuesta inmunitaria puede incluir la produccion aumentada de anticuerpos, tal como se demuestra en las Figuras 1 a 3, un aumento en el cambio de clase de las cadenas pesadas de anticuerpo tal como la produccion de IgA como se muestra en la Figura 8, la maduracion de celulas presentadoras de antlgeno, la estimulacion de los linfocitos cooperadores y la estimulacion de linfocitos T citotoxicos o la induction de memoria de linfocitosT y B.
La dosificacion util a administrar variara dependiendo de la edad, peso y especie del sujeto, el modo y la via de administration y el tipo de patogeno o enfermedad contra la que se busca una respuesta inmunitaria. La composition se puede administrar en cualquier dosis de vector de vacuna que sea suficiente para producir una respuesta inmunitaria. Se cree que las dosis que estan en el intervalo de 103 a 1010 copias de vector (es decir unidades formadoras de placas o unidades formadoras de colonias), de 104 a 109 copias de vector, o de 105 a 107 copias de vector son apropiadas.
La composicion se puede administrar solo una vez o se pueden administrar dos o mas veces para incrementar la respuesta inmunitaria. Por ejemplo, la composicion se puede administrar dos o mas veces, separadas por una semana, dos semanas, o por tres semanas, un mes, dos meses, tres meses, seis meses o mas. La bacteria puede ser viable antes de la administracion, pero en algunas realizaciones la bacteria se puede destruir o inactivar antes de la administracion. En algunas realizaciones, la bacteria puede ser capaz de replicarse en el sujeto, mientras que en otras realizaciones la bacteria puede no ser capaz de replicarse en el sujeto. Como se muestra en los ejemplos, los vectores de vacuna bacterianos se pueden inactivar antes de la administracion usando formalina, etanol, calor o antibioticos. Un experto en la materia apreciara que tambien se pueden usar otros metodos para inactivar vectores de vacuna.
En la presente memoria tambien se proporciona un vector de vacuna Bacillus spp. El vector de vacuna Bacillus incluye una primera secuencia de polinucleotidos que codifica un polipeptido antigenico y una segunda secuencia de
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polinucleotidos que codifica un polipeptido inmunoestimulador. El polipeptido antigenico y el polipeptido inmunoestimulador estan presentes sobre la superfine del vector de vacuna Bacillus como se describio previamente. El polipeptido antigenico es un polipeptido del virus de la gripe como se describio previamente y el polipeptido inmunoestimulador es un polipeptido HMGB1 como se describio previamente o un polipeptido CD154.
Tambien se pueden insertar dentro del vector de vacuna polinucleotidos que codifican polipeptidos inmunoestimuladores homologos a protelnas del sujeto y que son capaces de estimular al sistema inmune para responder al polipeptido antigenico. Como se describe en mas detalle en los ejemplos, un vector de vacuna puede incluir un polipeptido CD154 capaz de unirse a CD40 en el sujeto y estimular al sujeto para responder contra el vector de vacuna y su polipeptido antigenico asociado, similar a HMGB1 descrito previamente. El vector de vacuna Bacillus puede incluir un polipeptido HMGB1, un polipeptido CD154 o una combinacion de los mismos. Como se describio previamente, los polinucleotidos que codifican estos polipeptidos se pueden insertar en el cromosoma del vector de vacuna o se pueden mantener extracromosomicamente. Un experto en la materia apreciara que estos polipeptidos se pueden insertar en varios polipeptidos del vector de vacuna y expresarse en diferentes partes del vector de vacuna, o que se pueden secretar.
El polinucleotido que codifica un polipeptido inmunoestimulador capaz de potenciar la respuesta inmunitaria contra un polipeptido antigenico puede tambien codificar el polipeptido antigenico. El polinucleotido que codifica un polipeptido inmunoestimulador puede estar unido al polinucleotido que codifica el polipeptido antigenico, de forma que en el vector de vacuna, el polipeptido inmunoestimulador y el polipeptido antigenico estan codificados por el mismo polinucleotido. En los ejemplos, un polinucleotido que codifica un polipeptido de CD154, que es capaz de unirse a CD40, o HMGB1, tambien codifica un epltopo M2e, un epltopo HA y un epltopo NP del virus de la gripe A. Veanse las SEQ ID NOs: 19-22. En los ejemplos, el polinucleotido que codifica los epltopos del virus de la gripe y el polinucleotido que codifica el polipeptido inmunoestimulador se expresan ambos a partir de un plasmido para expresion en celulas vegetativas. En algunas realizaciones, los polinucleotidos se insertan en el gen cotB u otro gen que codifique una protelna que se expresa sobre la superficie de las esporas. Los expertos en la materia apreciaran que tambien se pueden usar polinucleotidos bacterianos que codifican otras protelnas transmembrana.
Como se expuso previamente, se puede incluir un polinucleotido que codifica un polipeptido inmunoestimulador homologo a una protelna del sujeto que es capaz de potenciar la respuesta inmunitaria contra el epltopo en el vector de vacuna. En los ejemplos se demostro que un vector de vacuna Bacillus que incluye un polinucleotido que codifica un polipeptido CD154 capaz de unirse a CD40 o un polipeptido que codifica HMGB1, potencia la respuesta inmunitaria contra el epltopo M2e y contra los dos diferentes epltopos HA, medida por el incremento de la produccion de anticuerpos en respuesta a la vacunacion.
Convenientemente, el polipeptido CD154 tiene menos de 50 aminoacidos de longitud, mas convenientemente menos de 40, menos de 30 o menos de 20 aminoacidos de longitud. El polipeptido puede ser de entre 10 y 15 aminoacidos, entre 10 y 20 aminoacidos o entre 10 y 25 aminoacidos de longitud. La secuencia de CD154 y la region de union de CD40 no estan muy conservadas entre las diferentes especies. Las secuencias de CD154 de pollo y de ser humano se proporcionan en la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 12, respectivamente.
Se han determinado las regiones de union a CD40 de CD154 para varias especies, incluyendo ser humano, pollo, pato, raton y bovino, y se las muestra en SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, respectivamente. A pesar de que hay una variabilidad en las secuencias de la region de union a CD40 entre las especies, los ejemplos siguientes indican que el polipeptido CD154 humano fue capaz de potenciar la respuesta inmunitaria en pollos. Por lo tanto, se puede poner en practica la invencion usando polipeptidos CD154 especlficos de la especie o un polipeptido CD154 heterologo. En particular, los polipeptidos CD154 y fragmentos funcionales u homologos de los mismos incluyen polipeptidos identicos, o al menos 99 % identicos, al menos 98 % identicos, al menos 95 % identicos, al menos 90 % identicos, al menos 85 % identicos, o al menos 80 % identicos a los polipeptidos CD154 de SEQ las ID NOs: 11-17.
El vector de vacuna Bacillus que se describe en la presente memoria se puede usar en los metodos para potenciar una respuesta inmunitaria y los metodos para reducir la morbilidad por el virus de la gripe en un sujeto como se describio previamente. El vector de vacuna Bacillus se puede usar para preparar composiciones para administracion a sujetos tales como los que tambien se describen previamente.
Se pueden insertar polinucleotidos heterologos que codifican polipeptidos antigenicos en el genoma bacteriano en cualquier sitio no esencial o, de forma alternativa, se pueden transportar sobre un plasmido usando metodos bien conocidos en la tecnica. Un sitio apropiado para la insertion de los polinucleotidos es dentro de las porciones externas de las protelnas transmembrana o acoplados a las secuencias que dirigen al polinucleotido heterologo hacia vlas secretorias. Entre los ejemplos de una protelna transmembrana apropiada para insertar los polinucleotidos se encuentra el gen cotB de Bacillus y el gen lamB de Salmonella.
Los polinucleotidos heterologos incluyen, pero no se limitan a, polinucleotidos que codifican antlgenos seleccionados de microorganismos o virus patogenos distintos al vector de vacuna. Dichos polinucleotidos pueden derivar de virus patogenos tales como el virus de la gripe (p. ej., M2e, hemaglutinina, o neuraminidasa), herpesvirus (por ejemplo, los
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genes que codifican las protelnas estructurales de herpesvirus), retrovirus (por ejemplo, la protelna de cubierta gp160), adenovirus, paramixovirus, coronavirus y similares. Los polinucleotidos heterologos tambien se pueden obtener a partir de bacterias patogenas, por ejemplo, genes que codifican protelnas bacterianas tales como toxinas, y protelnas de la membrana externa. Ademas, los polinucleotidos heterologos de parasitos, tales como Eimeria son candidatos atractivos para su uso en una vacuna a base de vector.
Tambien se pueden incluir en el vector de vacuna polipeptidos inmunoestimuladores adicionales involucrados en la estimulacion del sistema inmunitario como se describe en la presente memoria. Los polinucleotidos pueden codificar moleculas del sistema inmunitario que son conocidas por sus efectos estimulatorios, tales como una interleucina, factor de necrosis tumoral o un interferon, u otro polinucleotido involucrado en la regulacion del sistema inmunitario.
Los siguientes ejemplos tienen solamente un proposito ilustrativo y no representan limitaciones al alcance de la invencion o a las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplos
Ejemplo 1. Construccion de HA/NP/M2e/cCD154 y HA/NP/M2e/HMGB1 Vectores de Bacillus.
Cepas y condiciones de cultivo
Todos los plasmidos se mantuvieron primero en celulas E. coli TOP1O (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) a menos que se describa de otra manera. Se uso Bacillus spp. para la introduccion de mutaciones (Bacillus subtilis, cepa Poultry Health Laboratory designada como NP122). Las bacterias que portan los plasmidos pDGlEF y pHT10 se cultivaron a 37 °C.
Se uso el medio de Luria-Bertani (LB) para el crecimiento celular de rutina, y se uso medio SOC (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) para la expresion fenotlpica despues de la electroporacion. En los casos apropiados, al medio se anadio lo siguiente:
Isopropil-p-D-tiogalactopiranosido (IPTG) a 1 mM, ampicilina (Amp) a 100 pg/ml, espectinomicina (SP) a 100 pg/ml, y cloramfenicol (Cm) a 5 pg/ml.
Plasmidos
Los plasmidos pDGlEF (Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, OH) y pHT10 que se usaron para el presente estudio se describieron previamente (Zhang et al., Nuc. Acids Research 2006, 34 (9). 1 -8 y Nguyen et al., Curr. Micro. 2007, 55:89-93). El plasmido pDGlEF sirvio como molde para la amplificacion del gen mazF que se uso como contra-marcador de selection durante la manipulation del cromosoma de Bacillus. El plasmido pHT10 se uso para codificar y producir las secuencias de epltopos heterologos del virus de la gripe aviar dentro de Bacillus spp. Este plasmido contiene un gen de resistencia a Cm, se induce mediante la adicion de IPTG 1 mM y se mantiene dentro de Bacillus a 37 °C.
Production de protelnas heterologas para la expresion en celulas vegetativas:
Se transformo el plasmido pHT10 adquirido de MoBioTec/Boca Scientific, Boca Raton, FL (Nguyen et al., 2007) en el sitio de clonado multiple mediante la adicion de una secuencia de insertion optimizada por codon de Bacillus subtilis. Se hizo la secuenciacion de ADN para confirmar la insercion correcta de la secuencia. El plasmido recien modificado se transformo entonces en Bacillus. Brevemente, se desarrollaron cultivos de Bacillus durante la noche a 37 °C en medio HS (medio de Spizizen suplementado con glucosa al 0,5 %, DL-triptofano 50 pg/ml, uracilo 50 pg/ml, hidrolizado de caselna al 0,02 %, extracto de levadura al 0,1 %, arginina 8 (pg/ml, histidina 0,4 pg/ml, MgSO4 1 mM). Se uso el cultivo de la noche (1 ml) para inocular 20 ml de medio LS (Medio de Spizizen suplementado con glucosa al 0,5 %, DL-triptofano 5 pg/ml, uracilo 5 pg/ml, hidrolizado de caselna al 0,01 %, extracto de levadura al 0,1 %, MgSO4 1 mM, MgCH 2,5 mM, CaCH 0,5 mM) y se incubo con agitation durante 3-4 horas a 30 °C. A 1 ml del cultivo de LS resultante se anadio 10 pl de EGTA 0,1 M y se incubo a temperatura ambiente durante 5 minutos. A continuation se anadio 1-2 pg de ADN plasmldico, se agito durante 2 horas a 37 °C y se sembro en placas de LB con antibioticos de seleccion. Estos Bacillus spp. transformados producen ahora secuencias de epltopos heterologos a partir de Al cuando se los induce con IPTG 1 mM.
PCR
Todos los cebadores usados para la PCR se enumeran en la Tabla 1. Las condiciones tlpicas de PCR consisten en aproximadamente 0,1 pg de ADN genomico purificado, plasmldico o generado por PCR (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.), 1x tampon Pfu polimerasa, 5U de Pfu polimerasa (Stratagene La Jolla, CA, EE.Uu.), dNTP 1 mM (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ), 1,2 pM de cada cebador en un volumen total de 50 pl. Se uso el
DNA engine thermal cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) con las siguientes condiciones de amplificacion: 94 °C durante 2 minutos; 30 ciclos de 94 °C durante 30 se gundos, 58 °C durante 60 segundos, 72 °C durante 90 segundos por cada 1 kb y 72 °C durante 10 minutos para la extension final. Cada producto de PCR se purifico por mediante gel (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.) y se eluyo o bien con 25 gl de solucion tampon EB para la preparacion de los 5 moldes que se usan en la PCR de extension solapada o con 50 gl de tampon EB, se precipito con etanol y se resuspendio en 5 gl de ddH2O para electroporacion en Bacillus spp.

Claims (16)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un vector de vacuna que es un vector bacteriano, vlrico o a base de liposomas, comprendiendo el vector un polipeptido antigenico y un polipeptido HMGB1 comprendidos cada uno dentro de una protelna transmembrana, en donde el polipeptido antigenico y el polipeptido HMGB1 estan presentes en la superficie del vector de vacuna, en donde el polipeptido antigenico es opcionalmente un polipeptido del virus de la gripe y el polipeptido del virus de la gripe se selecciona opcionalmente de un polipeptido del virus de la gripe M2e, HA o NP
    en donde el polipeptido HMGB1 se selecciona de las SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 y un homologo del mismo que tiene al menos el 95 % de identidad de secuencia con al menos una de las SEQ ID NO: 18, 29 o 30.
  2. 2. El vector de vacuna de la reivindicacion 1, en el que el polipeptido antigenico se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, un fragmento inmunogenico de SEQ ID NO: 1, un fragmento inmunogenico de SEQ ID NO: 2, un fragmento inmunogenico de SEQ ID NO: 3, un fragmento inmunogenico de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y un fragmento inmunogenico de SEQ ID NO: 7, un fragmento inmunogenico de SEQ ID NO: 8, un fragmento inmunogenico de SEQ ID NO: 9 o un fragmento inmunogenico de SEQ ID NO: 10.
  3. 3. El vector de vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el polipeptido HMGB1 se selecciona de las SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30.
  4. 4. El vector de vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el vector de vacuna es una bacteria, opcionalmente un Bacillus spp.
  5. 5. El vector de vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el polipeptido antigenico y/o el polipeptido HMGB1 estan dentro de un bucle externo de una protelna transmembrana.
  6. 6. Una composicion que comprende el vector de vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y un vehlculo farmaceuticamente aceptable, opcionalmente formulado para administracion oral o nasal.
  7. 7. La composicion de la reivindicacion 6, en la que el vector de vacuna no es capaz de replicarse, esta inactivado o muerto.
  8. 8. Uso del vector de vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o de las reivindicaciones 12-14 o la composicion de cualquiera de las reivindicaciones 6-7 en la fabricacion de un medicamento para potenciar la respuesta inmunitaria de un sujeto al polipeptido antigenico.
  9. 9. El uso de la reivindicacion 8, en el que el vector de vacuna esta formulado para ser administrado por via oral o intranasal.
  10. 10. El uso de la reivindicacion 9, en el que la respuesta inmunitaria es una respuesta de anticuerpo IgA al polipeptido antigenico.
  11. 11. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en el que el vector de vacuna no es capaz de replicacion en el sujeto o esta inactivado o muerto antes de la administracion al sujeto.
  12. 12. Un vector de vacuna Bacillus spp. que comprende una primera secuencia de polinucleotidos que codifica un polipeptido antigenico presente sobre la superficie del vector de vacuna y una segunda secuencia de polinucleotidos que codifica un polipeptido inmunoestimulador, en donde el polipeptido antigenico y el polipeptido inmunoestimulador estan comprendidos cada uno dentro de una protelna transmembrana y estan presentes sobre la superficie del vector de vacuna, en donde
    (i) el polipeptido antigenico es un polipeptido del virus de la gripe y en donde
    (ii) el polipeptido inmunoestimulador es un polipeptido HMGB1, en donde el polipeptido HMGB1 se selecciona entre SeQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 y un homologo del mismo que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con al menos una de las SEQ ID NO: 18, 29 o 30.
  13. 13. El vector de vacuna de la reivindicacion 12, en el que el polipeptido inmunoestimulador comprende ademas un polipeptido CD154 capaz de unirse a CD40 y tiene menos de 50 aminoacidos y comprende los aminoacidos 140-149 de la SEQ ID NO: 11.
  14. 14. El vector de vacuna de la reivindicacion 12 o de la reivindicacion 13, en el que el primer polinucleotido y el segundo polinucleotido estan insertados dentro de una tercera secuencia de polinucleotidos que codifica una porcion externa de una protelna transmembrana.
  15. 15. El vector de vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en el que el polipeptido antigenico es un
    polipeptido del virus de la gripe M2e, un polipeptido del virus de la gripe HA o un polipeptido NP del virus de la gripe, opcionalmente seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, un fragmento inmunogenico de SEQ ID NO: 1, un fragmento inmunogenico de SEQ ID NO: 2, un fragmento inmunogenico de SEQ ID NO: 3, un fragmento inmunogenico de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 5 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10.
  16. 16. El vector de vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 12-15, en el que el polipeptido HMGB1 se selecciona de las SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30.
    imagen1
    imagen2
    imagen3
    imagen4
    imagen5
    Respuesta de anticuerpos a HA/UA
    imagen6
    BSBB BSiM BSIAV BS/AI/ BS/A.' BS/A1/ BS/A1/
    HMGB1 CD154 HVIGB1 HMGB1 HMGB1 HMGB1 10^6 10A8 10AG 10A6 1(^6 10^
    Inactivado Inactivado Inactivado Inactivado con calor con formalina con antibioticos con ETOH
    Fig. 6
    Relacion S/P
    1 n
    M Dia 21
    imagen7
    ESEB BS/AI/HMGB1 ES/AI/HMGB1
    lO'-G 10" 5
    Inactivado con formalina
    imagen8
    BS/A / HMGB1
    BS/A / HMGB1
    BS/A HMGB1
    10A6
    10 8
    Inactivado
    nactivado
    Inactivado
    con forma ina
    con forma ina
    con forma ina
    Fig. 7
    Relacion S/P
    imagen9
    Fig. 8
    Relacion S/P
    imagen10
    BSBB BSAI Inact, SubQ BSAI Inact, oral +
    (Dia 0) (Dia 0) SubQ (Dia 0)
    BSAI vivo (Dia 0)
    BSAI Refuerzo vivo (Dia 0. 10)
    BSAI Inact, Refuerzo liofilizado (Dfa 0, 10)
    Fig. 9
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