KR20120117886A - 백신 벡터 및 면역 반응을 강화시키는 방법 - Google Patents

백신 벡터 및 면역 반응을 강화시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본원에서는 백신 벡터의 표면 상에 존재하는 항원성 폴리펩티드 및 HMGB1 폴리펩티드를 포함하는 백신 벡터가 제공된다. 이러한 백신 벡터를 포함하는 조성물이 또한 제공되고, 이는 제약상 허용되는 담체, 적절하게는 경구 또는 비강 투여용 담체를 포함한다. 본원에 개시된 백신 벡터 또는 조성물을 대상체에게 투여함으로써 면역 반응, 특히 항체 면역 반응, 적절하게는 IgA 반응을 강화시키는 방법이 또한 제공된다.

Description

백신 벡터 및 면역 반응을 강화시키는 방법{VACCINE VECTORS AND METHODS OF ENHANCING IMMUNE RESPONSES}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2010년 1월 21일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/297,098을 우선권으로 청구하고, 이는 전문이 본원에 참고로 포함된다.
서론
백신은 질환을 경감시키거나 예방하기 위해 항원, 특히 병원체, 종양 세포 등으로부터의 항원에 대한 후천적(adaptive) 면역 반응을 개시시키는데 사용된다. 합성 펩티드 또는 사멸 또는 약화 미생물 백신이 충분히 보호적인 강건한 면역 반응을 자극하는데 종종 효과적이다. 일부 경우에, 이러한 백신들이 보호적이지 않거나 부분적으로만 보호적이고, 다른 전략을 사용하여 보호적인 백신을 개발하여야 한다. 약화 미생물을 기초로 하는 백신은 또한 유전자 전달 또는 돌연변이 복구의 위험과 관련되고, 면역손상 개체에 위험을 일으킬 수 있다. 지속적인 보호적 면역 반응을 자극하는데 효과적이고 안전한 신규 백신의 개발이 요구된다.
인플루엔자 바이러스 감염, 특히 조류 인플루엔자 H5N1 감염은 증가하는 건강 및 경제 우려를 제시한다. 세계의 확대되고 있는 영역에서 H5N1이 감수성 새와 돼지 사이에서 계속 순환하고 있다는 것을 증거가 명확하게 가리킨다. 많은 과학자들은 저지되지 않으면, 현재의 H5N1 조류 인플루엔자가 인간 대 인간 전파를 허용하고 세계적인 유행병을 야기하도록 돌연변이될 것이라고 생각한다. 사망률이 50％를 초과하여, 이같은 돌발은 파괴적일 것이다. 인간 질환을 야기하는 바이러스의 능력과 관계없이, 조류 인플루엔자 H5N1은 감염된 지역에서의 가금류 떼의 박멸로 인해 이미 위협적이어서 막대한 경제적 영향이 있다. 따라서, 인간, 가금류, 돼지 및 기타 가축을 H5N1 인플루엔자로부터 보호하기 위한 백신의 개발이 요구된다. H5N1, 뿐만 아니라 기타 인플루엔자 바이러스, 예컨대 H1N1에 대해 보호할 수 있는 인플루엔자 백신이 최적일 것이다.
개요
백신 벡터 및 면역 반응을 자극하는 방법 및 인플루엔자 감염과 관련된 이환율을 감소시키는 방법이 본원에서 제공된다. 한 측면에서, 항원성 폴리펩티드 및 HMGB1 폴리펩티드 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 백신 벡터가 제공된다. 항원성 폴리펩티드 및 HMGB1 폴리펩티드의 적어도 일부분이 백신 벡터의 표면 상에 존재한다. 백신 벡터는 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 HMGB1 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 융합 단백질에서와 같이, HMGB1 폴리펩티드 및 항원성 폴리펩티드가 연결될 수 있다. HMGB1 폴리펩티드 및 항원성 폴리펩티드 양쪽 모두가 막횡단 단백질의 외부 루프 내에 삽입될 수 있다.
또 다른 측면에서, 이러한 백신 벡터 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 제공된다. 제약상 허용되는 담체는 경구 또는 비강 용도를 위해 허용되는 것일 수 있다. 백신 벡터는 복제가 불가능할 수 있다.
또 다른 측면에서, 바실루스(Bacillus) 종 백신 벡터가 제공된다. 이러한 백신 벡터는 백신 벡터의 표면 상에서 발현되는 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열 및 백신 벡터의 표면 상에서 발현되는 면역자극성 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 항원성 폴리펩티드는 인플루엔자 M2e 폴리펩티드, 인플루엔자 HA 폴리펩티드, 또는 인플루엔자 NP 폴리펩티드 또는 이들의 조합물일 수 있다. 면역자극성 폴리펩티드는 CD154 폴리펩티드 또는 HMGB1 폴리펩티드 또는 이들의 조합물일 수 있다. 면역자극성 폴리펩티드 및 항원성 폴리펩티드가, 융합 단백질에서와 같이, 연결될 수 있고, 막횡단 단백질의 외부 루프 내에 삽입될 수 있다.
또 다른 측면에서, 대상체에서 면역 반응을 강화시키는 방법이 제공된다. 이러한 방법에서, 본원에서 제공되는 백신 벡터 또는 조성물이 항원성 폴리펩티드에 대한 대상체의 면역 반응을 강화시키는데 효과적인 양으로 대상체에게 투여된다. 적절하게는, 백신 벡터가 경구적으로 또는 비강내로 투여된다.
추가적인 측면에서, 본원에서 기술된 바와 같은 바실루스 종 백신 벡터를 투여함으로써 대상체에서 면역 반응을 강화시키는 방법이 제공된다. 이러한 백신 벡터는 백신 벡터의 표면 상에서 발현되는 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열 및 백신 벡터의 표면 상에서 발현되는 면역자극성 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 항원성 폴리펩티드는 인플루엔자 M2e 폴리펩티드, 인플루엔자 HA 폴리펩티드, 인플루엔자 NP 폴리펩티드 또는 이들의 조합물일 수 있다. 면역자극성 폴리펩티드는 CD154 폴리펩티드, HMGB1 폴리펩티드 또는 이들의 조합물일 수 있다.
추가적인 측면에서, 대상체에서의 인플루엔자와 관련된 이환율을 감소시키는 방법이 제공된다. 이러한 방법에서, 본원에 개시된 백신 벡터 또는 조성물의 투여가 추후 인플루엔자 감염과 관련된 이환율을 감소시킨다.
도면의 간단한 설명
도 1은 염수가 예방접종된 닭과 비교된 인플루엔자 A 에피토프 및 HMGB1 또는 CD154를 발현하는 지시된 투여량의 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 백신 벡터의 위관 영양 후의 닭에 의한 M2e 특이적 항체 생산에 대한 ELISA의 S/P (샘플 대 양성 대조군) 비율을 나타내는 그래프이다.
도 2는 염수가 예방접종된 닭과 비교된 인플루엔자 A 에피토프 및 HMGB1 또는 CD154를 발현하는 지시된 투여량의 바실루스 서브틸리스 백신 벡터의 위관 영양 후의 닭에 의한 HA LB 특이적 항체 생산에 대한 ELISA의 S/P 비율을 나타내는 그래프이다.
도 3은 염수가 예방접종된 닭과 비교된 인플루엔자 A 에피토프 및 HMGB1 또는 CD154를 발현하는 지시된 투여량의 바실루스 서브틸리스 백신 벡터의 위관 영양 후의 닭에 의한 HA UA 특이적 항체 생산에 대한 ELISA의 S/P 비율을 나타내는 그래프이다.
도 4는 바실루스 벡터 단독 (BSBB)이 예방접종된 닭과 비교된 인플루엔자 A 에피토프 및 HMGB1 또는 CD154를 발현하는 지시된 투여량의 생(live) 바실루스 서브틸리스 백신 벡터 또는 다양하게 불활성화된 바실루스 서브틸리스 백신 벡터의 위관 영양 후의 닭에 의한 M2e 특이적 항체 생산에 대한 ELISA의 S/P 비율을 나타내는 그래프이다.
도 5는 바실루스 벡터 단독 (BSBB)이 예방접종된 닭과 비교된 인플루엔자 A 에피토프 및 HMGB1 또는 CD154를 발현하는 지시된 투여량의 생 바실루스 서브틸리스 백신 벡터 또는 다양하게 불활성화된 바실루스 서브틸리스 백신 벡터의 위관 영양 후의 닭에 의한 HA LB 특이적 항체 생산에 대한 ELISA의 S/P 비율을 나타내는 그래프이다.
도 6은 바실루스 벡터 단독 (BSBB)이 예방접종된 닭과 비교된 인플루엔자 A 에피토프 및 HMGB1 또는 CD154를 발현하는 지시된 투여량의 생 바실루스 서브틸리스 백신 벡터 또는 다양하게 불활성화된 바실루스 서브틸리스 백신 벡터의 위관 영양 후의 닭에 의한 HA UA 특이적 항체 생산에 대한 ELISA의 S/P 비율을 나타내는 그래프이다.
도 7은 바실루스 벡터 단독 (BSBB)이 예방접종된 닭과 비교된 인플루엔자 A 에피토프 및 HMGB1을 발현하는 106개의 생 바실루스 서브틸리스 백신 벡터 또는 다양한 지시된 투여량의 포르말린으로 불활성화된 바실루스 서브틸리스 백신 벡터의 위관 영양 후의 닭에 의한 M2e 특이적 IgG 항체 생산에 대한 ELISA의 S/P 비율을 나타내는 그래프이다.
도 8은 바실루스 벡터 단독 (BSBB)이 예방접종된 닭과 비교된 인플루엔자 A 에피토프 및 HMGB1을 발현하는 106개의 생 바실루스 서브틸리스 백신 벡터, 포르말린으로 불활성화된 바실루스 서브틸리스 백신 벡터, 또는 포르말린으로 불활성화되고 동결건조된 바실루스 서브틸리스 백신 벡터가 경구 또는 피하 예방접종된 닭에 의한 M2e 특이적 IgA 항체 생산에 대한 ELISA의 S/P 비율을 나타내는 그래프이다.
도 9는 바실루스 벡터 단독 (BSBB)이 예방접종된 닭과 비교된 인플루엔자 A 에피토프 및 HMGB1을 발현하는 106개의 생 바실루스 서브틸리스 백신 벡터, 포르말린으로 불활성화된 바실루스 서브틸리스 백신 벡터, 또는 포르말린으로 불활성화되고 동결건조된 바실루스 서브틸리스 백신 벡터가 경구 또는 피하 예방접종된 닭에 의한 M2e 특이적 IgA 항체 생산에 대한 ELISA의 S/P 비율을 나타내는 그래프이다.
상세한 설명
재조합 DNA 기술이 다수의 박테리아 및 바이러스 종의 비교적 용이한 조작을 가능하게 한다. 일부 박테리아 및 바이러스는 천연적으로 온건하게 병원성 또는 비-병원성이거나, 또는 그러하도록 선별 또는 조작될 수 있지만, 여전히 강건한 면역 반응을 생성시킬 수 있다. 이러한 박테리아 및 바이러스는 이종 또는 외래 항원에 대한 면역 반응을 유발하기 위한 매력적인 백신 벡터를 제조한다. 박테리아 및 바이러스 백신 벡터는 천연 감염을 모방할 수 있고, 강건하고 오래 지속되는 면역을 일으킬 수 있다. 백신 벡터는 생산 및 투여하기가 종종 비교적 저렴하다. 또한, 이같은 벡터는 종종 1개를 초과하는 항원을 보유할 수 있고, 다중 감염원에 대한 보호를 제공할 수 있다.
생 박테리아 또는 바이러스 백신 벡터는 여전히 면역손상 개체에 위험을 일으킬 수 있고, 추가적인 규제 감독을 필요로 한다. 따라서, 사멸 또는 불활성화되었거나 식품의약청 (FDA)의 일반적으로 안전하다고 볼 수 있는 (GRAS: Generally Regarded As Safe) 생물로서의 자격이 있는 벡터의 사용이 바람직하다. 문제는 이같은 벡터를 사용하여 강건한 면역 반응을 생성시키는 것이다. 실시예에서 나타난 바와 같이, 백신 벡터의 표면 상에 HMGB1 (고-이동성 그룹 박스(high mobility group box) 1) 폴리펩티드를 포함함으로써, 바실루스 종 벡터를 사용하여 항원성 폴리펩티드에 대한 강건한 면역 반응을 생성시킬 수 있다. 실제로, 이러한 벡터들이 다양한 방법을 사용하여 복제될 수 없도록 불활성화될 수 있고, 여전히 투여 후 강건한 면역 반응을 유발한다는 것이 실시예에서 실연된다.
항원성 폴리펩티드 및 HMGB1 폴리펩티드 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 백신 벡터가 본원에서 제공된다. 항원성 폴리펩티드의 적어도 일부분 및 HMGB1 폴리펩티드 또는 그의 기능적 단편의 적어도 일부분이 백신 벡터의 표면 상에 존재한다. 백신 벡터는 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 HMGB1 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. HMGB1 폴리펩티드 및 항원성 폴리펩티드는, 융합 단백질에서와 같이, 연결될 수 있거나, 또는 따로따로 발현될 수 있다. HMGB1 폴리펩티드 및 항원성 폴리펩티드 양쪽 모두가 막횡단 단백질의 외부 루프 내에 삽입될 수 있다.
백신 벡터는 박테리아, 바이러스 또는 리포솜-기반 벡터일 수 있다. 잠재적인 백신 벡터에는 바실루스 (바실루스 서브틸리스), 살모넬라(Salmonella) (살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis)), 시겔라(Shigella), 에쉐리키아(Escherichia) (대장균), 예르시니아(Yersinia), 보르데텔라(Bordetella), 락토코쿠스(Lactococcus), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 비브리오(Vibrio) (비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae)), 리스테리아(Listeria), 아데노바이러스, 폭스바이러스, 헤르페스바이러스, 알파바이러스, 및 아데노-관련 바이러스가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 적절하게는, 백신 벡터는 GRAS 생물이다. 백신 벡터는 복제할 수 없도록 불활성화 또는 사멸될 수 있다. 박테리아 또는 바이러스 백신 벡터를 불활성화 또는 사멸시키는 방법이 당업자에게 공지되어 있고, 실시예에서 제시된 것들과 같은 방법, 즉 포르말린 불활성화, 항생제-기반 불활성화, 열 처리 및 에탄올 처리를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
항원성 폴리펩티드는 후천적 면역계가 특이적으로 인식할 수 있는 폴리펩티드이다. 항원성 폴리펩티드는 면역원성인 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 항원성 폴리펩티드에는 병원체-관련, 알레르기원-관련, 종양-관련 또는 질환-관련 항원이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 병원체에는 바이러스, 기생충, 진균류 및 박테리아 병원체, 뿐만 아니라 단백질 병원체 예컨대 프라이온이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 항원성 폴리펩티드는 전장 단백질 또는 이의 일부분일 수 있다. 다수의 단백질의 면역계 인식이 에피토프로 종종 지칭되는 비교적 적은 개수의 아미노산을 기초로 한다는 것이 잘 확립되어 있다. 에피토프는 불과 8-10개의 아미노산일 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 항원성 폴리펩티드는 전장 단백질, 아미노산 8개 길이의 에피토프 또는 이러한 극값 사이의 임의의 일부분일 수 있다. 실제로, 항원성 폴리펩티드는 단일 병원체 또는 단백질로부터의 1개를 초과하는 에피토프를 포함할 수 있다.
동일한 에피토프의 다중 카피 또는 상이한 단백질들로부터의 다중 에피토프가 백신 벡터 내에 포함될 수 있다. 동일하거나 상이한 병원체 또는 질환으로부터의 여러 에피토프 또는 항원이 다중 항원에 대한 강화된 면역 반응을 생성시키도록 단일 백신 벡터 내에서 조합되어 투여될 수 있는 것으로 구상된다. 재조합 백신 벡터는 다중 병원체성 미생물, 바이러스 또는 종양 관련 항원으로부터의 항원을 코딩할 수 있다. 다중 항원을 발현할 수 있는 백신 벡터의 투여는 2가지 이상의 질환에 대한 면역을 동시에 유도하는 장점이 있다.
항원성 폴리펩티드는 인플루엔자 폴리펩티드일 수 있고, 적절하게는 인플루엔자 H5N1 폴리펩티드 또는 인플루엔자 바이러스의 다중 계통과 관련된 폴리펩티드 예컨대 인플루엔자 M2 단백질의 폴리펩티드이다. M2e로 공지된, 인플루엔자 A 바이러스 M2 단백질의 엑토도메인(ectodomain)은 바이러스 표면으로부터 돌출된다. M2 단백질의 M2e 부분은 약 24개의 아미노산을 함유한다. M2e 폴리펩티드는 인플루엔자 내에서 단리물마다 거의 변하지 않는다. 실제로, 1918년의 플루 유행 이후로 M2e에서의 소수의 천연 발생 돌연변이만이 감염된 인간으로부터 단리되었다. 또한, 조류 및 돼지 숙주로부터 단리된 인플루엔자 바이러스에 상이하지만 여전히 보존된 M2e 서열이 있다. 인간, 조류 및 돼지 숙주로부터 단리된 M2e 폴리펩티드 서열의 리뷰를 위해, 문헌 [Liu et al., Microbes and Infection 7:171-177 (2005)] 및 [Reid et al., J. Virol. 76:10717-10723 (2002)]를 참조하고, 이들 각각은 전문이 본원에 참고로 포함된다. 서열 1-4를 또한 참조한다.
적절하게는, 전체 M2e 폴리펩티드가 백신 벡터 내로 삽입될 수 있거나, 또는 일부분만 사용될 수 있다. 실시예에서, 아미노산 8개의 폴리펩티드 (아미노산 서열 EVETPIRN (서열 5)의 LM2 또는 이의 변이체인 아미노산 서열 EVETPTRN (서열 6)의 M2eA)가 백신 벡터 내로 혼입되었고, 닭에의 투여 후 항체 반응을 일으키는 것으로 실연되었다. 적절하게는, 백신 벡터 내로 삽입된 M2e 폴리펩티드의 일부분이 면역원성이다. 면역원성 단편은 세포성 또는 체액성 면역 반응을 유발할 수 있는 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 적절하게는, M2e의 면역원성 단편은 전장 M2e 폴리펩티드일 수 있거나, 또는 적절하게는 전장 서열의 20개 이상의 아미노산, 15개 이상의 아미노산, 10개 이상의 아미노산 또는 8개 이상의 아미노산일 수 있다.
인플루엔자 A 백신 벡터 내에 포함시키기 위한 기타 적절한 에피토프에는 인플루엔자 A의 혈구응집소 (HA) 또는 핵 단백질 (NP)의 폴리펩티드가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 예를 들어, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 또는 서열 10의 펩티드가 백신 벡터 내에 포함될 수 있다. 실시예에서, 서열 7 (HAUA) 및 서열 8 (HALB)이 백신 벡터 내로 혼입되었고, 닭에의 투여 후 항체 반응을 일으키는 것으로 실연되었다. 도 2-3 및 5-6을 참조한다. 또한, 서열 9 (NP54) 및 서열 10 (NP147)의 NP 에피토프가 실시예에서 백신 벡터 내로 혼입되었다. 당업자는 이러한 서열들 중 임의의 것이 다른 병원체 또는 항원으로부터 유래된 에피토프가 포함되는 임의의 다른 에피토프와 조합되어 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
HMGB1 (고-이동성 그룹 박스-1) 단백질은 DNA 구조 및 안정성에 중요한 DNA 결합 단백질로서 최초로 확인되었다. 이는 서열 특이성 없이 DNA에 결합하는 편재성으로 발현되는 핵 단백질이다. 이러한 단백질은 고도로 보존되고, 식물 내지 포유동물에서 발견된다. 지브라피시(zebrafish), 닭 및 인간 HMGB1 아미노산 서열이 서열 30, 서열 18 및 서열 29에서 각각 제공된다. 포유동물 전반에 걸친 서열이 98％ 아미노산 동일성으로 고도로 보존되고, 아미노산 변화가 보존적이다. 따라서, 한 종으로부터의 HMGB1 단백질이 기능적으로 또 다른 종으로부터의 것을 대체할 수 있을 것이다. 전장 HMGB1 단백질 또는 이의 일부분이 본원에 기술된 백신 벡터에서 HMGB1 폴리펩티드로서 사용될 수 있다. HMGB1에는 서열 23 및 24에서 제시된 바와 같은 A 박스 및 서열 25 및 26에 제시된 바와 같은 B 박스로 명명된 2개의 DNA 결합 영역이 있다. 본원에 참고로 전문이 포함된 문헌 [Andersson and Tracey, Annu. Rev. Immunol. 2011, 29:139-162] 참조.
HMGB1은 염증 매개물이고, 예컨대 괴사성 세포로부터, 핵 손상의 신호로서의 역할을 한다. 또한 HMGB1은 단백질의 아세틸화, 핵을 가로지르는 전위 및 분비를 필요로 하는 프로세스에서 단핵구/대식세포 계통의 세포에 의해 활발하게 분비될 수 있다. 세포외 HMGB1은 최종 당화 생성물에 대한 수용체 (RAGE: Receptor for Advanced Glycated End-products), 및 톨(Toll)-유사 수용체 패밀리 (TLR)의 구성원, 특히 TLR4를 통한 신호전달에 의해 강력한 염증 매개물로서 작용한다. RAGE 결합 활성이 확인되었고, 이는 서열 27의 폴리펩티드를 필요로 한다. TLR4 결합은 서열 18의 위치 106에서의 시스테인을 필요로 하고, 이는 HMGB1의 B 박스 영역에서 발견된다.
HMGB1의 염증성 활성은 전장 단백질을 필요로 하지 않고, 기능적 단편이 확인되었다. B 박스가 HMGB1의 염증유발성(pro-inflammatory) 효과를 매개하는데 충분한 것으로 나타났고, 따라서 서열 25 및 26이 본 발명의 맥락에서 HMGB1 폴리펩티드 또는 그의 기능적 단편이다. 또한, RAGE 결합 부위 및 염증유발성 사이토카인 활성이 각각 서열 27 및 서열 28로 지도로 작성되었다. 따라서, 이러한 폴리펩티드들이 본 발명의 맥락에서 HMGB1 폴리펩티드의 기능적 단편이다.
당업자는 전문이 본원에 참고로 포함된 국제 공보 번호 WO02 092004에서의 것과 같은 방법을 사용하여 염증유발성 사이토카인 활성을 자극할 수 있는 HMGB1 폴리펩티드 및 이의 단편을 확인할 수 있다. 적절하게는, HMGB1 폴리펩티드는 서열 18의 아미노산 150-183의 RAGE 결합 도메인 (서열 27 또는 이의 상동체(homolog)) 및 서열 18의 아미노산 89-109의 염증유발성 사이토카인 활성 도메인 (서열 28 또는 이의 상동체)을 포함한다. 특히, HMGB1 폴리펩티드 및 그의 기능적 단편 또는 상동체는 서열 18 또는 23-30의 HMGB1 폴리펩티드와 동일하거나, 99％ 이상 동일하거나, 98％ 이상 동일하거나, 95％ 이상 동일하거나, 90％ 이상 동일하거나, 85％ 이상 동일하거나, 80％ 이상 동일한 폴리펩티드를 포함한다.
항원성 폴리펩티드의 적어도 일부분 및 HMGB1 폴리펩티드의 적어도 일부분이 백신 벡터의 표면 상에 존재한다. 백신 벡터의 표면 상에 존재하는 것은 막횡단 단백질 내에 포함되거나, 막횡단 단백질, 막 지질 또는 막-고정(anchored) 탄수화물과 상호작용하거나, 이에 공유결합으로 또는 화학적으로 가교된 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드를 이루는 아미노산들을 펩티드 결합을 통해 N-말단, C-말단 또는 막횡단 단백질 내의 임의의 장소 (즉, 막횡단 단백질의 2개의 아미노산 사이에 삽입됨)에 또는 막횡단 단백질의 하나 이상의 아미노산 대신 (즉, 결실-삽입)에 연결시킴으로써 폴리펩티드가 막횡단 단백질 내에 포함될 수 있다. 적절하게는, 폴리펩티드가 막횡단 단백질의 외부 루프 내로 삽입될 수 있다. 적절한 막횡단 단백질은 cotB 및 lamB이지만, 당업자는 다수의 적절한 막횡단 단백질이 이용가능하다는 것을 이해할 것이다.
별법적으로, 당업자가 이용가능한 방법들을 통해 막 또는 바이러스 벡터가 사용되는 경우의 캡시드 내의 단백질, 지질 또는 탄수화물에 폴리펩티드가 공유결합으로 또는 화학적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 디-술피드 결합 또는 비오틴-아비딘 가교를 사용하여 항원성 폴리펩티드 및 HMGB1 폴리펩티드를 백신 벡터의 표면 상에 제시시킬 수 있다. 적절하게는, 항원성 폴리펩티드 및 HMGB1 폴리펩티드가 융합 단백질의 일부분이다. 2개의 폴리펩티드는 펩티드 결합을 통해 직접적으로 연결될 수 있거나, 또는 링커, 또는 이들이 내부로 삽입되는 제3 단백질의 절편에 의해 분리될 수 있다.
항원성 폴리펩티드 또는 HMGB1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 백신 벡터 내로 삽입되고 발현되어, 항원성 폴리펩티드 및 HMGB1 폴리펩티드가 생성될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드들은 백신 벡터의 염색체 내로 삽입될 수 있거나, 또는 플라스미드 또는 기타 염색체외 DNA 상에 코딩될 수 있다. 적절하게는, 항원성 폴리펩티드 및/또는 HMGB1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 독립적으로 발현될 수 있거나, 또는 백신 벡터 폴리뉴클레오티드 내로 삽입되고 이것이 발현된다. 적절하게는, 이러한 백신 벡터 폴리뉴클레오티드는 백신 벡터의 표면 상에서 발현되는 폴리펩티드 예컨대 막횡단 단백질을 코딩한다. 항원성 폴리펩티드 및/또는 HMGB1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 벡터 표면 상에서의 항원성 폴리펩티드 및/또는 HMGB1 폴리펩티드의 발현을 허용하도록 백신 벡터 폴리뉴클레오티드 서열 내로 삽입될 수 있다. 예를 들어, 항원성 폴리펩티드 및 HMGB1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 박테리아 폴리뉴클레오티드 서열이 인-프레임(in-frame)으로 유지되도록 막횡단 단백질의 외부 루프 영역을 코딩하는 영역 내에서 박테리아 폴리뉴클레오티드 내로 인-프레임으로 삽입될 수 있다. 실시예 1 참조.
별법적으로, 항원성 폴리펩티드 및/또는 HMGB1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 백신 벡터의 표면 상의 단백질, 지질 또는 탄수화물과의 회합을 통해 백신 벡터의 표면 상에 디스플레이되거나 제시되는 분비형 폴리펩티드 내로 삽입될 수 있다. 당업자는 항원성 폴리펩티드 및/또는 HMGB1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 항원성 폴리펩티드 및/또는 HMGB1 폴리펩티드의 발현 및 백신 벡터로 처치되는 대상의 면역 세포에 대한 항원성 폴리펩티드 및/또는 HMGB1 폴리펩티드의 제시를 제공하도록 광범위한 백신 벡터 폴리뉴클레오티드 내로 삽입될 수 있음을 이해할 것이다. 실시예에서, M2e 에피토프, HA 에피토프 및 NP 에피토프를 포함하는 여러 인플루엔자 에피토프가 바실루스 서브틸리스에서의 증식형(vegetative) 발현을 위한 플라스미드로부터 발현되었다. 생성된 재조합 박테리아는 도 1-6에서 제시된 면역 반응에 의해 실연되는 바와 같이 삽입된 에피토프를 발현한다.
실시예에서, 백신 벡터는 동일한 폴리뉴클레오티드 상에서 서로 인-프레임으로 코딩된 항원성 폴리펩티드 (M2e, HA 및 NP 폴리펩티드) 및 면역자극성 폴리펩티드 (CD154 또는 HMGB1)를 갖는다. 별법적인 실시양태에서, 면역자극성 폴리펩티드 및 항원성 폴리펩티드가 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다. 당업자는 다양한 방법을 사용하여 백신 벡터의 표면 상에서의 항원성 폴리펩티드 및 HMGB1 폴리펩티드의 발현을 수득할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이같은 방법들이 당업자에게 공지되어 있다.
백신 벡터 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 제약상 허용되는 담체는 생체내 투여에 적절한 임의의 담체이다. 적절하게는, 제약상 허용되는 담체가 경구, 비강, 또는 점막 전달용으로 허용된다. 제약상 허용되는 담체에는 물, 완충 용액, 글루코스 용액 또는 박테리아 배양액이 포함될 수 있다. 조성물의 추가적인 성분에는 부형제 예컨대 안정화제, 방부제, 희석제, 유화제 및 윤활제가 적절하게 포함될 수 있다. 제약상 허용되는 담체 또는 희석제의 예로는 안정화제 예컨대 탄수화물 (예를 들어, 소르비톨, 만니톨, 전분, 수크로스, 글루코스, 덱스트란), 단백질 예컨대 알부민 또는 카세인, 단백질을 함유하는 작용제 예컨대 소 혈청 또는 탈지유, 및 완충제 (예를 들어, 포스페이트 완충제)가 포함된다. 특히 이같은 안정화제가 조성물에 첨가되는 경우, 조성물은 동결 건조 또는 분무 건조에 적절하다. 조성물 내의 백신 벡터는 복제가 가능하지 않을 수 있고, 적절하게는 백신 벡터가 조성물에의 첨가 전에 불활성화 또는 사멸된다.
본원에 기술된 조성물은 항원성 폴리펩티드에 대한 항체 반응과 같은 면역 반응을 강화시키는데 사용될 수 있다. 인플루엔자 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 추후 인플루엔자 감염과 관련된 이환율을 감소시키는데 또한 사용될 수 있다. 조성물은 본원에 기술된 조성물 또는 백신 벡터가 투여된 대상에서 질환 또는 임의의 관련된 이환율을 야기하는 것으로부터 인플루엔자를 예방할 수 있다. 본원에 기술된 조성물 및 백신 벡터는 질환 기간을 감소시킴으로써, 질환과 관련된 이환율 또는 사망률을 감소시킴으로써, 또는 질환에 걸릴 가능성을 감소시킴으로써 추후 질환의 중증도를 감소시킬 수 있다. 본원에 기술된 백신 벡터의 투여 후의 질환과 관련된 이환율 또는 사망률이 백신 벡터가 제공되지 않은 유사한 대상과 비교하여 25％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 심지어 100％만큼 감소될 수 있다.
백신 벡터를 투여함으로써 대상체에서 면역 반응을 강화시키는 방법이 또한 제공된다. 이러한 백신 벡터는 백신 벡터 및 이의 회합된 항원성 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 자극할 수 있는 HMGB1 폴리펩티드를 함유할 수 있다. HMGB1의 폴리펩티드를 함유하는 백신 벡터가 백신, 특히 항원성 폴리펩티드에 대한 대상체의 면역 반응을 강화시키는데 효과적인 양으로 대상체에게 투여된다. 적절하게는, 백신 벡터가 HMGB1 폴리펩티드 (서열 18)의 아미노산 150-183 및 89-109 또는 이의 상동체를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 실시예에서, HMGB1의 아미노산 190개의 폴리펩티드가 사용되었다. 적절하게는, 이러한 폴리뉴클레오티드는 대상과 동일한 종으로부터의 HMGB1 폴리펩티드를 코딩한다. HMGB1 폴리펩티드와 대상의 이종성 조합 (즉, 닭 백신에서 사용하기 위한 인간 HMGB1 폴리펩티드)이 본 발명의 방법에서 유용할 수 있는데, 이는 HMGB1이 광범위한 종에 걸쳐 고도로 보존되기 때문이다. HMGB1 폴리펩티드는 백신 벡터 내에 또는 백신 벡터 상에 존재하는 임의의 외래 항원 또는 항원성 폴리펩티드에 대한 대상체에서의 면역 반응을 강화시키는데 사용될 수 있다. 당업자는 HMGB1 폴리펩티드가 백신 벡터 내에 존재하는 1가지를 초과하는 항원성 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 강화시키는데 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. HMGB1로부터의 폴리펩티드는, 적어도 부분적으로, 수지상 세포 및 대식세포를 활성화시켜 사이토카인 예컨대 IL-1, IL-6, IFN-γ 및 TNF-α의 생산을 자극함으로써 면역 반응을 자극한다. 실시예에서, HMGB1의 폴리펩티드가 백신 벡터의 표면 상에서 발현되었다.
또한, 인플루엔자 A에 대한 면역 반응을 강화시키는 방법, 및 추후 인플루엔자 A 감염과 관련된 이환율을 감소시키는 방법이 개시된다. 간략하게, 이러한 방법들은 면역 반응을 유발하는데 효과적인 양으로 면역 반응을 유발할 수 있는 인플루엔자 A 에피토프 (인플루엔자의 항원성 폴리펩티드)를 포함하는 백신 벡터를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 인플루엔자 A 에피토프는 M2e 폴리펩티드, HA 폴리펩티드 또는 NP 폴리펩티드, 또는 상기 논의된 바와 같은 또 다른 인플루엔자 폴리펩티드일 수 있다. 백신 벡터 내로의 항원성 폴리펩티드의 삽입은 국제 특허 공개 번호 WO 2008/036675에 기술된 무자국(scarless) 부위-지정 돌연변이 시스템을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 당업자에게 공지된 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 또한 박테리아를 상기 논의된 바와 같이 면역 반응을 강화시킬 수 있는 폴리뉴클레오티드와 함께 인플루엔자 폴리펩티드를 발현하도록 조작할 수 있다. 특히, CD154 또는 HMGB1의 폴리펩티드가 인플루엔자 폴리펩티드에 대한 대상체의 면역 반응을 강화시키도록 백신 벡터에 의해 발현될 수 있다. 실시예에서 닭에서의 예방접종에 대한 강건한 IgA 및 IgG 반응의 생산이 실연된다. 본 발명가들은 이같은 강건한 반응이 항원성 폴리펩티드의 원천 (실시예에서는 인플루엔자 바이러스)으로의 추후 감염 또는 챌린지(challenge)와 관련된 이환율에 대해 보호적이거나 또는 적어도 이를 감소시킬 것으로 예상한다.
조성물은 경구, 비강내, 및 점막 투여를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 수단에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 조성물 또는 백신 벡터가 에어로졸에 의해, 분무에 의해, 식품 또는 물에의 첨가에 의해, 위관 영양에 의해, 또는 점안물을 통해 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물이 피내, 비경구, 피하, 복강내, 정맥내, 두개내 또는 근육내 투여와 같은 주사에 의해 투여된다. 닭 또는 기타 가금류에 대해서는, 조성물이 알에 투여될 수 있다.
대상에는 척추동물, 적절하게는 포유동물, 적절하게는 인간, 소, 고양이, 개, 돼지, 또는 새, 적절하게는 가금류 예컨대 닭이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 감염에 대한 기타 동물 모델이 또한 사용될 수 있다. 면역 반응을 강화시키는 것은 대상의 면역계에 의해 매개되는 치료 또는 예방 효과를 유도하는 것을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 구체적으로, 면역 반응을 강화시키는 것은 도 1-3에 실연된 것과 같은 강화된 항체 생산, 도 8에 제시된 바와 같은 IgA 생산과 같은 강화된 항체 중쇄 전환, 항원 제시 세포의 성숙, 헬퍼 T 세포의 자극, 세포용해성 T 세포의 자극, 또는 T 및 B 세포 메모리의 유도를 포함할 수 있다.
투여될 유용한 투여량은 대상의 연령, 체중 및 종, 투여 방식 및 경로, 및 면역 반응이 추구되는 병원체 또는 질환의 유형에 따라 변할 것이다. 조성물은 면역 반응을 유발하는데 충분한 백신 벡터의 임의의 용량으로 투여될 수 있다. 103개 내지 1010개의 벡터 카피 (즉, 플라크 형성 또는 콜로니 형성 단위), 104개 내지 109개의 벡터 카피, 또는 105개 내지 107개의 벡터 카피 범위의 용량이 적절한 것으로 구상된다.
조성물은 1회만 투여될 수 있거나, 또는 면역 반응을 증가시키도록 2회 이상 투여될 수 있다. 예를 들어, 조성물이 1주일, 2주일, 또는 3주일, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월 또는 이를 초과하는 기간만큼 분리되어 2회 이상 투여될 수 있다. 투여 전에 박테리아가 생육성일 수 있지만, 일부 실시양태에서는 박테리아가 투여 전에 사멸 또는 불활성화될 수 있다. 일부 실시양태에서는 박테리아가 대상체 내에서 복제가 가능할 수 있는 한편, 다른 실시양태에서는 박테리아가 대상체 내에서 복제가 가능하지 않을 수 있다. 실시예에 나타난 바와 같이, 투여 전에 포르말린, 에탄올, 열 또는 항생제를 사용하여 박테리아 백신 벡터를 불활성화시킬 수 있다. 당업자는 백신 벡터를 불활성화시키는 적합한 다른 수단을 또한 사용할 수 있음을 이해할 것이다.
바실루스 종 백신 벡터가 또한 본원에서 제공된다. 이러한 바실루스 백신 벡터는 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열 및 면역자극성 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 항원성 폴리펩티드 및 면역자극성 폴리펩티드가 상기 기술된 바와 같이 바실루스 백신 벡터의 표면 상에 존재한다. 항원성 폴리펩티드는 상기 기술된 바와 같은 인플루엔자 폴리펩티드 이고, 면역자극성 폴리펩티드는 상기 기술된 바와 같은 HMGB1 폴리펩티드 또는 CD154 폴리펩티드이다.
대상의 단백질에 대해 상동성이고 항원성 폴리펩티드에 대해 반응하도록 면역계를 자극할 수 있는 면역자극성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 또한 백신 벡터 내로 삽입될 수 있다. 실시예에서 더욱 상세하게 기술된 바와 같이, 상기 기술된 HMGB1과 유사하게, 대상 내의 CD40에 결합할 수 있고 백신 벡터 및 이의 회합된 항원성 폴리펩티드에 대해 반응하도록 대상을 자극할 수 있는 CD154 폴리펩티드를 백신 벡터가 포함할 수 있다. 바실루스 백신 벡터는 HMGB1 폴리펩티드, CD154 폴리펩티드 또는 이의 조합물을 포함할 수 있다. 상기 기술된 바와 같이, 이러한 폴리펩티드들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드들이 백신 벡터의 염색체 내로 삽입될 수 있거나, 또는 염색체 외부에서 유지될 수 있다. 당업자는 이러한 폴리펩티드들이 백신 벡터의 다양한 폴리펩티드 내에 삽입되어 백신 벡터의 여러 부분에서 발현되거나 분비될 수 있음을 이해할 것이다.
항원성 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 강화시킬 수 있는 면역자극성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 항원성 폴리펩티드를 또한 코딩할 수 있다. 백신 벡터 내에서 면역자극성 폴리펩티드 및 항원성 폴리펩티드가 동일한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되도록, 면역자극성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결될 수 있다. 실시예에서, CD40에 결합할 수 있는 CD154 또는 HMGB1의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 인플루엔자 A의 M2e 에피토프, HA 에피토프 및 NP 에피토프를 또한 코딩한다. 서열 19-22 참조. 실시예에서, 인플루엔자 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 면역자극성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 양쪽 모두 증식형 세포 발현을 위한 플라스미드로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드들이 cotB 유전자 또는 포자의 표면에서 발현되는 단백질을 코딩하는 또 다른 유전자에 삽입된다. 당업자는 다른 막횡단 단백질을 코딩하는 박테리아 폴리뉴클레오티드가 또한 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
상기 논의된 바와 같이, 에피토프에 대한 면역 반응을 강화시킬 수 있는 대상의 단백질에 대해 상동성인 면역자극성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 백신 벡터 내에 포함될 수 있다. 실시예에서, CD40에 결합할 수 있는 CD154 폴리펩티드 또는 HMGB1을 코딩하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바실루스 백신 벡터가 예방접종에 반응한 증가된 항체 생산에 의해 측정되는 바와 같이 M2e 에피토프 및 2개의 별개의 HA 에피토프에 대한 면역 반응을 강화시키는 것으로 실연되었다.
적절하게는, CD154 폴리펩티드는 아미노산 50개 미만의 길이이고, 더욱 적절하게는 길이가 아미노산 40개 미만, 30개 미만 또는 20개 미만이다. 이러한 폴리펩티드는 길이가 아미노산 10개 내지 15개, 아미노산 10개 내지 20개, 또는 아미노산 10개 내지 25개일 수 있다. CD154 서열 및 CD40 결합 영역은 다양한 종들 사이에서 고도로 보존되지 않는다. 닭 및 인간의 CD154 서열이 서열 11 및 서열 12에서 각각 제공된다.
CD154의 CD40 결합 영역이 인간, 닭, 오리, 마우스 및 소가 포함되는 다수의 종에 대해 결정되었고, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17에서 각각 제시된다. 종들 사이에서 CD40 결합 영역에서의 서열이 가변적이지만, 하기의 실시예는 인간 CD154 폴리펩티드가 닭에서 면역 반응을 강화시킬 수 있었음을 가리킨다. 따라서, 종 특이적 CD154 폴리펩티드 또는 이종성 CD154 폴리펩티드를 사용하여 본 발명을 실행할 수 있다. 특히, CD154 폴리펩티드 및 그의 기능적 단편 또는 상동체는 서열 11-17의 CD154 폴리펩티드와 동일하거나, 99％ 이상 동일하거나, 98％ 이상 동일하거나, 95％ 이상 동일하거나, 90％ 이상 동일하거나, 85％ 이상 동일하거나, 80％ 이상 동일한 폴리펩티드를 포함한다.
본원에 기술된 바실루스 백신 벡터는 상기 기술된 바와 같은 대상에서 면역 반응을 강화시키는 방법 및 인플루엔자 이환율을 감소시키는 방법에서 사용될 수 있다. 바실루스 백신 벡터는 또한 상기 기술된 것들과 같은 대상체에게 투여하기 위한 조성물을 제조하는데 사용될 수 있다.
항원성 폴리펩티드를 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드는 당업계에 주지된 방법을 사용하여 임의의 비-필수 부위에서 박테리아 게놈에 삽입될 수 있거나 또는 별법적으로 플라스미드 상에서 보유될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 삽입을 위한 한 적절한 부위가 막횡단 단백질의 외부 부분 내에 있거나 또는 이종성 폴리뉴클레오티드를 분비 경로에 표적화하는 서열에 커플링된다. 폴리뉴클레오티드 삽입을 위한 적절한 막횡단 단백질의 예는 바실루스의 cotB 유전자 및 살모넬라의 lamB 유전자이다.
이종성 폴리뉴클레오티드에는 백신 벡터 이외의 병원체성 미생물 또는 바이러스로부터 선택된 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 이같은 폴리뉴클레오티드는 병원체성 바이러스 예컨대 인플루엔자 (예를 들어, M2e, 혈구응집소, 또는 뉴라미니다제(neuraminidase)), 헤르페스바이러스 (예를 들어, 헤르페스바이러스의 구조 단백질을 코딩하는 유전자), 레트로바이러스 (예를 들어, gp160 외피 단백질), 아데노바이러스, 파라믹소바이러스, 코로나바이러스 등으로부터 유래될 수 있다. 병원체성 박테리아, 예를 들어, 박테리아 단백질 예컨대 독소 및 외막 단백질을 코딩하는 유전자로부터 이종성 폴리뉴클레오티드가 또한 수득될 수 있다. 추가로, 기생충, 예컨대 아이메리아(Eimeria)로부터의 이종성 폴리뉴클레오티드가 벡터 백신에서 사용하기 위한 매력적인 후보물이다.
면역계를 촉발시키는데 수반되는 추가적인 면역자극성 폴리펩티드가 본원에 기술된 백신 벡터 내에 또한 포함될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 자신의 자극 효과에 대해 공지된 면역계 분자, 예컨대 인터루킨, 종양 괴사 인자 또는 인터페론, 또는 면역-조절에서 수반되는 또 다른 폴리뉴클레오티드를 코딩할 수 있다.
하기의 실시예는 오직 설명적인 것으로 의도되고, 본 발명 또는 첨부된 청구항의 범주에 대한 제한으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1. HA / NP / M2e / cCD154 및 HA / NP / M2e / HMGB1 바실루스 벡터의 구축.
균주 및 배양 조건
달리 기술되지 않는 한, 모든 플라스미드가 처음에 TOP10 대장균 세포 (인비트로젠(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스배드)에서 유지되었다. 바실루스 종을 돌연변이 도입에 사용하였다 (바실루스 서브틸리스, NP122로 지정된 가금류 보건 실험 균주). 플라스미드 pDGIEF 및 pHT10를 보유하는 박테리아를 37℃에서 성장시켰다.
루리아-베르타니(Luria-Bertani) (LB) 배지를 세포의 일상적인 성장에 사용하였고, SOC 배지 (인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스배드)를 전기천공 후의 표현형 발현에 사용하였다. 적합한 경우, 하기를 배지에 첨가하였다:
1 mM의 이소프로필-ß-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG), 100 ㎍/㎖의 앰피실린 (Amp), 100 ㎍/㎖의 스펙티노마이신 (SP), 및 5 ㎍/㎖의 클로람페니콜 (Cm).
플라스미드
본 연구에 사용된 플라스미드 pDGIEF (바실루스 제네틱 스톡 센터(Bacillus Genetic Stock Center), 오하이오주 콜럼버스) 및 pHT10이 이전에 기술되었다 (문헌 [Zhang et al., Nuc. Acids Research 2006, 34 (9):1-8] 및 [Nguyen et al., Curr. Micro. 2007, 55:89-93]). 플라스미드 pDGIEF은 바실루스 염색체 조작 동안 카운터(counter)-선별성 마커로서 사용된 mazF 유전자의 증폭을 위한 주형으로서의 역할을 하였다. 플라스미드 pHT10은 바실루스 종 내에서 조류 인플루엔자에 대한 이종성 에피토프 서열을 코딩하고 생산하기 위해 사용되었다. 이러한 플라스미드는 CM 저항성 유전자를 함유하고, 1 mM IPTG 첨가에 의해 유도되며, 37℃에서 바실루스 내에서 유지된다.
증식형 세포 발현을 위한 이종성 단백질의 생산:
플로리다주 보카 레이턴의 모바이오텍/보카 사이언티픽(MoBioTec/Boca Scientific)으로부터 구입한 플라스미드 pHT10 (문헌 [Nguyen et al., 2007])을 바실루스 서브틸리스 코돈에 대해 최적화된 삽입 서열의 첨가에 의해 다중 클로닝 부위에서 형질전환시켰다. DNA 서열분석을 수행하여 정확한 서열 삽입을 확인하였다. 그 후, 새롭게 변형된 플라스미드를 바실루스 내로 형질전환시켰다. 간략하게, 바실루스 배양물을 HS 배지 (0.5％ 글루코스, 50 ㎍/㎖ DL-트립토판, 50 ㎍/㎖ 우라실, 0.02％ 카세인 가수분해물, 0.1％ 효모 추출물, 8 ㎍/㎖ 아르기닌, 0.4 ㎍/㎖ 히스티딘, 1 mM MgSO4가 보충된 스피지젠(Spizizen) 배지)에서 하룻밤 동안 37℃에서 성장시켰다. 철야 배양물 (1 ㎖)을 사용하여 20 ㎖ LS 배지 (0.5％ 글루코스, 5 ㎍/㎖ DL-트립토판, 5 ㎍/㎖ 우라실, 0.01％ 카세인 가수분해물, 0.1％ 효모 추출물, 1 mM MgSO4, 2.5 mM MgCl2, 0.5 mM CaCl2가 보충된 스피지젠 배지)에 접종하고, 진탕하면서 3-4시간 동안 30℃에서 인큐베이션하였다. 생성된 LS 배양물 1 ㎖에, 10 ㎕의 0.1M EGTA를 첨가하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 1-2 ㎍ 플라스미드 DNA를 첨가하고, 2시간 동안 37℃에서 진탕시키고, 선별 항생제가 있는 LB 플레이트 상에 플레이팅하였다. 이제 이러한 형질전환된 바실루스 종은 1 mM IPTG로 유도되었을 때 AI로부터의 이종성 에피토프를 발현한다..
PCR
PCR에 사용된 모든 프라이머가 표 1에서 열거된다. 전형적인 PCR 조건은 총 부피 50 ㎕ 내의 약 0.1 ㎍의 정제된 게놈 DNA, 플라스미드 DNA 또는 PCR-생성 DNA (퀴아젠(Qiagen), 미국 캘리포니아주 발렌시아), 1× Pfu 중합효소 완충제, 5U Pfu 중합효소 (스트라타진(Stratagene), 미국 캘리포니아주 라 호야), 1 mM dNTP (지이 헬스케어 바이오-사이언시즈 코포레이션(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.), 뉴저지주 피스카타웨이), 1.2 μM의 각각의 프라이머로 구성되었다. DNA 엔진 열 사이클러(thermal cycler) (바이오-래드(Bio-Rad), 미국 캘리포니아주 에르쿨레스)를 하기의 증폭 조건으로 사용하였다: 2분 동안 94℃; 1 kb 당 30초 동안 94℃, 60초 동안 58℃, 90초 동안 72℃의 사이클 30회; 및 최종 확장을 위한 10분 동안 72℃. 각각의 PCR 생성물을 젤로 정제하고 (퀴아젠, 미국 캘리포니아주 발렌시아), 중첩 확장 PCR에서 사용되는 주형의 제조를 위해 25 ㎕ EB 완충제에서 용출시키거나, 또는 바실루스 종 내로의 전기천공을 위해 50 ㎕ EB 완충제에서 용출시키고, 에탄올로 침전시키고, 5 ㎕의 ddH2O에 현탁시켰다.
Figure pct00001
전기천공
간략하게, 세포를 10 ㎖의 LB 브로스(broth) 내로 접종하고, 37℃에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 그 후, 100 ㎕의 철야 배양물을 37℃에서 3-4시간 동안 10 ㎖의 신선한 LB 브로스 내로 다시 접종하였다. 세포를 ddH2O 물에서 5회 세정하고, 60 ㎕의 10％ 글리세롤에 재현탁시켰다. 그 후, 2.4-2.45 kV에서 1-6 ms 동안 세포를 펄스화시키고, 0.5 ㎖ SOC에서 2-3 시간 동안 37℃에서 인큐베이션하고, 적합한 항생제가 있는 LB 배지 상에 플레이팅하였다.
포자 코트 발현을 위한 이종성 DNA 의 염색체 통합:
최근에 공개된 방법을 변형시켜 사용하여, 선택된 M2e, HA 및 NP 에피토프의 안정적으로 통합된 카피를 함유하는 재조합 바실루스 균주를 구축하였다. 간략하게, 바실루스 균주를 MazF 카세트 (문헌 [Zhang et al., 2006])로 형질전환시켰고, 이는 IPTG 민감성 및 스펙티노마이신 저항성인 균주를 생성시켰다. 약 300 bp의 상동성 DNA가 각각의 측면 상에 플랭킹(flanking)된 MazF 카세트를 전기천공에 의해 바실루스 벡터의 CotB 유전자 (문헌 [Isticato et al., 2001]) 내로 도입한 후, 이제 스펙티노마이신 저항성인 MazF 카세트를 함유하는 양성 클론에 대해 스펙티노마이신을 함유하는 배지에서 성장시켰다.
MazF 돌연변이가 CotB에서 확인된 후, 이러한 영역을 300 bp의 상동성 DNA가 또다시 플랭킹된 AI의 항원성 에피토프를 코딩하는 코돈-최적화 DNA 서열로 교체하였다. 이는 바실루스 염색체에 대해 상동성인 각각의 측면 상의 약 300 bp가 플랭킹된 항원성 펩티드를 생산하도록 중첩 및 확장 PCR을 사용하여 PCR 생성물을 생성시킴으로써 수행되었다 (문헌 [Cox et al., 2007]). PCR 생성물을 전기천공 및 MazF 카세트의 교체에 의해 다시 바실루스 내로 도입하였다. 형질전환체를 IPTG를 함유하는 플레이트 상에서 선별하였고, 양성 클론은 이제 IPTG에 대해 비반응성이고 스펙티노마이신에 대해 감수성이어야 한다. 정확한 염색체 서열 삽입을 DNA 서열 분석에 의해 확인하였다.
실시예 2. 예방접종 연구 1 및 2.
부화일 (제0일)의 병아리를 지역의 상업적 부화장에서 수득하였고, 무작위로 처리 군에 배분하였다 (실험 1에 대해 n = 15마리/처리 군, 실험 2에 대해 n = 20마리/처리 군). 각각의 처리 군 내의 모든 병아리에 태그를 붙이고, 번호를 매겼다. 연구 1에 대해 표 2에, 연구 2에 대해 표 3에 지시된 바와 같이, 0.25 ㎖의 염수 또는 106-108 cfu/㎖의 다양한 바실루스 처리로 위관 영양에 의해 병아리를 경구 감염시켰다.
Figure pct00002
Figure pct00003
연구 2에서, 항원성 인플루엔자 펩티드에 대해 지시된 항체 반응의 생산에 복제가 필요하였는지 여부를 평가하기 위해 박테리아를 여러 상이한 방식으로 불활성화시켰다. 불활성화 수단이 에피토프의 파괴를 초래하여 데이터의 잘못된 해석 및 바실루스 벡터의 복제 또는 생육력에 대한 필요를 지지하는 것을 초래할 수 있기 때문에 여러 불활성화 수단이 사용되었다. 박테리아를 10분 동안 0.022％ 포르말린에서의 인큐베이션 (포르말린 불활성화); 10분 동안 70℃에서의 인큐베이션 (열 불활성화); 5 ㎍/㎖ 젠타마이신에서의 인큐베이션 (항생제 불활성화); 또는 10분 동안 70％ 에탄올에서의 인큐베이션 (에탄올 불활성화)에 의해 불활성화시켰다.
각각의 처리 군을 개별적인 층 우리에서 신선한 소나무 리터(litter) 상에 거주시켰고, 물 및 사료를 자유롭게 먹게 하였다. 부화 후 제11일 및 제21일에, 제0일에 제공된 것과 동일한 처리의 추가접종(booster) 백신을 새들에게 제공하였다. 또한 제21일 및 제31/32일에, 태그가 부착된 새 각각으로부터 혈액을 수집하고, 혈청을 제거하였다.
그 후, 각각의 처리 군 내의 태그가 부착된 새로부터 수집된 혈청을 항체 포착 ELISA에서 사용하여 특이적 M2e, HAUA 및 HALB 항체 반응을 결정하였다. 간략하게, 96웰 플레이트의 각각의 웰에 BSA에 접합된 M2e 에피토프, HAUA 에피토프 또는 HALB 에피토프를 10 ㎍/㎖으로 코팅하였다. 4℃에서 하룻밤 동안 항원 부착이 진행되도록 하였다. 플레이트를 PBS + 0.05％ 트윈(Tween) 20으로 헹구고, PBS 수퍼블록(Superblock) (피어스 케미컬 컴패니(Pierce Chemical Co.))로 최소 2시간 동안 차단하고, 상기 기술된 각각의 처리 군 내의 새로부터 앞서 수집된 혈청과 함께 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS + 0.05％ 트윈 20으로 헹군 후, 잭슨 이뮤노리서치 래버러토리즈(Jackson ImmunoResearch Laboratories) (펜실베니아주 웨스트 그로브)로부터 수득된 과산화효소(peroxidase)가 접합된 염소-항-닭 IgY 2차 항체 (1:7,500 희석)와 함께 추가 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 헹군 후, 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)으로부터 수득된 과산화효소 기질 키트를 사용하여 플레이트를 발색시키고, 450 nm 및 405 nm에서 분광광도계에서 흡광도를 판독하였다.
처리 군으로부터의 혈청을 교체하도록 각각의 플레이트 상에서 벡터화 백신이 제공된 군으로부터의 풀링(pooling)된 혈청 샘플을 양성 대조군으로 사용하고 예방접종되지 않은 군으로부터의 풀링된 혈청 샘플을 음성 대조군으로 사용하였다. 양성 대조군, 음성 대조군 및 실험 샘플에 대해 수득된 흡광도를 하기의 계산을 사용하여 샘플 대 양성 대조군 비율 (S/P 비율)을 계산하는데 사용하였다:
Figure pct00004
각각의 연구에 대한 계산된 S/P 비율이 도 1-6에서 제시된다. 도 1-3은 부화 후 제21일 및 제31일의 연구 1에 대한 M2e, HALB 및 HAUA에 대한 전체 항체 역가를 각각 나타낸다. 이러한 결과는 각각의 이러한 항원에 대한 강건한 면역 반응이 면역자극성 펩티드로서의 CD154 또는 HMGB1과 함께 각각의 에피토프를 발현하는 바실루스의 경구 투여 후에 생성되었음을 실연한다. 도 4-6은 부화 후 제21일 및 제32일의 연구 2에 대한 M2e, HALB 및 HAUA에 대한 전체 항체 역가를 각각 나타낸다. 이러한 결과는 각각의 에피토프에 대한 강건한 면역 반응이 에피토프 및 면역자극성 펩티드를 발현하는 생 바실루스의 경구 투여 후에 생성되었음을 실연한다. 도 4-6은 벡터 (바실루스)가 투여 전에 불활성화되었을 때 유사한 수준의 특이적 항체들이 생성되었음을 또한 실연한다.
실시예 3. 예방접종 연구 3
부화일 (제0일)의 병아리를 지역의 상업적 부화장에서 수득하였고, 무작위로 처리 군에 배분하였다 (n = 20마리/처리 군). 각각의 처리 군 내의 모든 병아리에 태그를 붙이고, 번호를 매겼다. 0.25 ㎖의 염수 또는 105-108 cfu/㎖의 바실루스 벡터 (BSBB), 조류 인플루엔자 에피토프 및 HMGB1을 발현하는 바실루스 벡터 (BS/AI/HMGB1), 또는 포르말린 불활성화 (상기 기술된 바와 같음) 후의 다양한 양의 BS/AI/HMGB1 벡터로 위관 영양에 의해 병아리를 경구 감염시켰다. 부화 후 제10일에, 제0일에 제공된 것과 동일한 처리의 추가접종 백신을 새들에게 제공하였다. 또한 제21일 및 제32일에, 태그가 부착된 새 각각으로부터 혈액을 수집하고, 혈청을 제거하였다. 혈청 IgG M2e 특이적 항체 수준을 과산화효소로 표지된 항-닭 IgG 특이적 2차 항체 (잭슨 이뮤노리서치 래버러토리즈, 펜실베니아주 웨스트 그로브)로 상기 기술된 방법을 사용하여 결정하였다. 도 7의 결과는 생 박테리아뿐만 아니라 포르말린으로 불활성화된 박테리아가 M2e 특이적 IgG 항체의 생산을 자극할 수 있었음을 나타낸다. 생 박테리아만이 경구 투여 후 강건한 면역 반응을 자극할 수 있는 것으로 일반적으로 생각되었기 때문에 이러한 결과는 놀라웠다.
실시예 4. 예방접종 연구 4
부화일 (제0일)의 병아리를 지역의 상업적 부화장에서 수득하였고, 무작위로 처리 군에 배분하였다 (n = 20-35마리/처리 군). 각각의 처리 군 내의 모든 병아리에 태그를 붙이고, 번호를 매겼다. 0.25 ㎖의 106 cfu/㎖의 바실루스 벡터 (BSBB), 조류 인플루엔자 에피토프 및 HMGB1을 발현하는 바실루스 벡터 (BSAI), 포르말린 불활성화 (상기 기술된 바와 같음) 후의 BSAI 벡터, 또는 포르말린 불활성화에 이은 동결건조 후의 BSAI 벡터 (투여 직전에 염수로 재구성됨)로 위관 영양에 의해 병아리를 경구 감염시키거나 이를 병아리에게 피하 주사하였다. 부화 후 제10일에, 제0일에 제공된 것과 동일한 처리의 추가접종 백신을 일부 새에게 제공하였다. 제11일, 제14일 및 제21일에, 태그가 부착된 새 각각으로부터 혈액을 수집하고, 혈청을 제거하였다. 혈청 IgA 및 IgG M2e 특이적 항체 수준을 과산화효소로 표지된 항-닭 IgA (젠텍스(GenTex)) 또는 과산화효소로 표지된 항-닭 IgG 특이적 2차 항체 (잭슨 이뮤노리서치 래버러토리즈, 펜실베니아주 웨스트 그로브)로 상기 기술된 방법을 사용하여 결정하였다. 도 8의 결과는 포르말린으로 불활성화된 박테리아가 경구 투여로 제공되었을 때 생 박테리아뿐만 아니라 포르말린으로 불활성화된 박테리아가 M2e 특이적 IgA 항체의 생산을 자극할 수 있었음을 나타낸다. 대조적으로, 피하 주사로 제공되었을 때, 불활성화된 BSAI 벡터가 IgA 항체 반응을 자극하는 것에서 그만큼 효율적이지 않았다. 도 9의 결과는 각각의 BSAI 투여 프로토콜이 강건한 IgG 형성을 지지하였음을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> UNIVERSITY OF ARKANSAS THE TEXAS A&M UNIVERSITY SYSTEM <120> VACCINE VECTORS AND METHODS OF ENHANCING IMMUNE RESPONSES <130> 5658-00099 <150> US 61/297,098 <151> 2010-01-21 <160> 40 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 24 <212> PRT <213> Avian influenza virus <220> <221> misc_feature <223> M2e <400> 1 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Gly Trp Glu 1 5 10 15 Cys Lys Cys Ser Asp Ser Ser Asp 20 <210> 2 <211> 24 <212> PRT <213> Avian Influenza virus <220> <221> misc_feature <223> M2e <400> 2 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 3 <211> 24 <212> PRT <213> Avian Influenza virus <220> <221> misc_feature <223> M2e <400> 3 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 4 <211> 24 <212> PRT <213> Avian Influenza virus <220> <221> misc_feature <223> M2e <400> 4 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Gly Trp Glu 1 5 10 15 Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Avian Influenza virus <220> <221> misc_feature <223> M2e <400> 5 Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Avian Influenza virus <220> <221> misc_feature <223> M2e <400> 6 Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn 1 5 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Avian Influenza virus <220> <221> misc_feature <223> HA5 UA <400> 7 Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu Lys Ile Gln 1 5 10 <210> 8 <211> 19 <212> PRT <213> Avian Influenza virus <220> <221> misc_feature <223> HA5 LB <400> 8 Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn Asp Tyr 1 5 10 15 Glu Glu Leu <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Avian Influenza virus <220> <221> misc_feature <223> NP 54-69 <400> 9 Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Ile Thr Ile Glu Arg Met Val Leu Ser 1 5 10 15 <210> 10 <211> 14 <212> PRT <213> Avian Influenza virus <220> <221> misc_feature <223> NP 147-160 <400> 10 Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp 1 5 10 <210> 11 <211> 272 <212> PRT <213> Gallus gallus <220> <221> misc_feature <223> CD154 chicken <400> 11 Met Asn Glu Ala Tyr Ser Pro Ala Ala Pro Arg Pro Met Gly Ser Thr 1 5 10 15 Ser Pro Ser Thr Met Lys Met Phe Met Cys Phe Leu Ser Val Phe Met 20 25 30 Val Val Gln Thr Ile Gly Thr Val Leu Phe Cys Leu Tyr Leu His Met 35 40 45 Lys Met Asp Lys Met Glu Glu Val Leu Ser Leu Asn Glu Asp Tyr Ile 50 55 60 Phe Leu Arg Lys Val Gln Lys Cys Gln Thr Gly Glu Asp Gln Lys Ser 65 70 75 80 Thr Leu Leu Asp Cys Glu Lys Val Leu Lys Gly Phe Gln Asp Leu Gln 85 90 95 Cys Lys Asp Arg Thr Ala Ser Glu Glu Leu Pro Lys Phe Glu Met His 100 105 110 Arg Gly His Glu His Pro His Leu Lys Ser Arg Asn Glu Thr Ser Val 115 120 125 Ala Glu Glu Lys Arg Gln Pro Ile Ala Thr His Leu Ala Gly Val Lys 130 135 140 Ser Asn Thr Thr Val Arg Val Leu Lys Trp Met Thr Thr Ser Tyr Ala 145 150 155 160 Pro Thr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr His Glu Gly Lys Leu Lys Val Glu 165 170 175 Lys Ala Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Val Ser Phe Cys Thr Lys 180 185 190 Ala Ala Ala Ser Ala Pro Phe Thr Leu Tyr Ile Tyr Leu Tyr Leu Pro 195 200 205 Met Glu Glu Asp Arg Leu Leu Met Lys Gly Leu Asp Thr His Ser Thr 210 215 220 Ser Thr Ala Leu Cys Glu Leu Gln Ser Ile Arg Glu Gly Gly Val Phe 225 230 235 240 Glu Leu Arg Gln Gly Asp Met Val Phe Val Asn Val Thr Asp Ser Thr 245 250 255 Ala Val Asn Val Asn Pro Gly Asn Thr Tyr Phe Gly Met Phe Lys Leu 260 265 270 <210> 12 <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Human CD154 <400> 12 Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu 20 25 30 Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg 35 40 45 Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val 50 55 60 Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser 65 70 75 80 Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys 85 90 95 Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu 100 105 110 Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser 115 120 125 Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly 130 135 140 Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln 145 150 155 160 Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr 165 170 175 Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser 180 185 190 Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala 195 200 205 Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His 210 215 220 Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn 225 230 235 240 Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe 245 250 255 Gly Leu Leu Lys Leu 260 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Human CD154 peptide <400> 13 Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Cys 1 5 10 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Gallus gallus <220> <221> misc_feature <223> Chicken CD154 peptide <400> 14 Trp Met Thr Thr Ser Tyr Ala Pro Thr Ser Ser 1 5 10 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Anas sp. <220> <221> misc_feature <223> Duck CD154 peptide <400> 15 Trp Asn Lys Thr Ser Tyr Ala Pro Met Asn 1 5 10 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Mus sp. <220> <221> misc_feature <223> Mouse CD154 peptide <400> 16 Trp Ala Lys Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Lys 1 5 10 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Bos taurus <220> <221> misc_feature <223> Cow CD154 peptide <400> 17 Trp Ala Pro Lys Gly Tyr Tyr Thr Leu Ser 1 5 10 <210> 18 <211> 190 <212> PRT <213> Gallus gallus <220> <221> misc_feature <223> Chicken HMGB1 amino acid <400> 18 Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ser Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60 Lys Ala Asp Lys Leu Arg Tyr Glu Lys Glu Met Lys Asn Tyr Val Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 85 90 95 Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Phe Arg Pro Lys 100 105 110 Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys 115 120 125 Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr 130 135 140 Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala 145 150 155 160 Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Val Asp Ala Gly Lys Lys Val Val Ala 165 170 175 Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Glu Asp 180 185 190 <210> 19 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide: BS/AI/CD154 = HA/NP/M2e/cCD154: SSS serine spacer <400> 19 Ser Ser Ser Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met 1 5 10 15 Asp Ser Ser Ser Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp 20 25 30 Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Ser Ser Ser Gly Arg Leu Ile Gln Asn 35 40 45 Ser Ile Thr Ile Glu Arg Met Val Leu Ser Ser Ser Ser Leu Leu Ser 50 55 60 Arg Ile Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ser Ser Ser Glu Val Glu Thr 65 70 75 80 Pro Ile Arg Asn Ser Ser Ser Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Ser 85 90 95 Ser Ser Trp Met Thr Thr Ser Tyr Ala Pro Thr Ser Ser Ser Ser 100 105 110 <210> 20 <211> 302 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide: BS/AI/HMGB1 = HA/NP/M2e/HMGB1 <400> 20 Ser Ser Ser Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met 1 5 10 15 Asp Ser Ser Ser Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp 20 25 30 Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Ser Ser Ser Gly Arg Leu Ile Gln Asn 35 40 45 Ser Ile Thr Ile Glu Arg Met Val Leu Ser Ser Ser Ser Leu Leu Ser 50 55 60 Arg Ile Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ser Ser Ser Glu Val Glu Thr 65 70 75 80 Pro Ile Arg Asn Ser Ser Ser Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Ser 85 90 95 Ser Ser Trp Met Thr Thr Ser Tyr Ala Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser 100 105 110 Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 115 120 125 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 130 135 140 Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 145 150 155 160 Trp Lys Thr Met Ser Ser Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala 165 170 175 Lys Ala Asp Lys Leu Arg Tyr Glu Lys Glu Met Lys Asn Tyr Val Pro 180 185 190 Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 195 200 205 Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Phe Arg Pro Lys 210 215 220 Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys 225 230 235 240 Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr 245 250 255 Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala 260 265 270 Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Val Asp Ala Gly Lys Lys Val Val Ala 275 280 285 Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Glu Asp 290 295 300 <210> 21 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide: BS/AI/CD154 <400> 21 Ser Ser Ser Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met 1 5 10 15 Asp Ser Ser Ser Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp 20 25 30 Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Ser Ser Ser Gly Arg Leu Ile Gln Asn 35 40 45 Ser Ile Thr Ile Glu Arg Met Val Leu Ser Ser Ser Ser Leu Leu Ser 50 55 60 Arg Ile Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ser Ser Ser Glu Val Glu Thr 65 70 75 80 Pro Ile Arg Asn Ser Ser Ser Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Ser 85 90 95 Ser Ser Trp Met Thr Thr Ser Tyr Ala Pro Thr Ser Ser Ser Ser 100 105 110 <210> 22 <211> 290 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide: BS/AI/HMGB1 <400> 22 Ser Ser Ser Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met 1 5 10 15 Asp Ser Ser Ser Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp 20 25 30 Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Ser Ser Ser Gly Arg Leu Ile Gln Asn 35 40 45 Ser Ile Thr Ile Glu Arg Met Val Leu Ser Ser Ser Ser Leu Leu Ser 50 55 60 Arg Ile Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ser Ser Ser Glu Val Glu Thr 65 70 75 80 Pro Ile Arg Asn Ser Ser Ser Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Ser 85 90 95 Ser Ser Ser Ser Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys 100 105 110 Met Ser Ser Tyr Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys 115 120 125 Lys Lys His Pro Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys 130 135 140 Cys Ser Glu Arg Trp Lys Thr Met Ser Ser Lys Glu Lys Gly Lys Phe 145 150 155 160 Glu Asp Met Ala Lys Ala Asp Lys Leu Arg Tyr Glu Lys Glu Met Lys 165 170 175 Asn Tyr Val Pro Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro 180 185 190 Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu 195 200 205 Phe Arg Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp 210 215 220 Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp 225 230 235 240 Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu 245 250 255 Lys Asp Ile Ala Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Val Asp Ala Gly Lys 260 265 270 Lys Val Val Ala Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu 275 280 285 Glu Asp 290 <210> 23 <211> 85 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide: HMGB1 box a1 <400> 23 Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ser Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60 Lys Ala Asp Lys Leu Arg Tyr Glu Lys Glu Met Lys Asn Tyr Val Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Glu Thr 85 <210> 24 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide: HMGB1 box a2 <400> 24 Pro Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu 1 5 10 15 Arg Trp Lys Thr Met Ser Ser Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met 20 25 30 Ala Lys Ala Asp Lys Leu Arg Tyr Glu Lys Glu Met Lys Asn Tyr Val 35 40 45 Pro Pro Lys Gly Glu Thr 50 <210> 25 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide: HMGB1 box b1 <400> 25 Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe 1 5 10 15 Cys Ser Glu Phe Arg Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser 20 25 30 Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala 35 40 45 Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu 50 55 60 Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr 65 70 <210> 26 <211> 69 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide: HMGB1 box b2 <400> 26 Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu 1 5 10 15 Phe Arg Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp 20 25 30 Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp 35 40 45 Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu 50 55 60 Lys Asp Ile Ala Ala 65 <210> 27 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide: HMGB1 RAGE Binding domain <400> 27 Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe 1 5 10 15 Cys Ser Glu Phe Arg 20 <210> 28 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide: HMGB1 proinflammatory cytokine activity <400> 28 Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr Arg Ala Lys Gly 1 5 10 15 Lys Val Asp Ala Gly Lys Lys Val Val Ala Lys Ala Glu Lys Ser Lys 20 25 30 Lys <210> 29 <211> 215 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> HMGB1 <400> 29 Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60 Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 85 90 95 Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys 100 105 110 Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys 115 120 125 Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr 130 135 140 Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala 145 150 155 160 Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val 165 170 175 Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu 180 185 190 Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Asp Glu 195 200 205 Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu 210 215 <210> 30 <211> 205 <212> PRT <213> Danio rerio <220> <221> misc_feature <223> Zebra fish HMGB1 <400> 30 Met Gly Lys Asp Pro Thr Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr Ala 1 5 10 15 Tyr Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro Glu 20 25 30 Ala Thr Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg Trp 35 40 45 Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala Lys 50 55 60 Leu Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Asn Tyr Ile Pro Pro 65 70 75 80 Lys Gly Glu Lys Lys Lys Arg Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg 85 90 95 Pro Pro Ser Ala Phe Phe Ile Phe Cys Ser Glu Phe Arg Pro Lys Val 100 105 110 Lys Glu Glu Thr Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Arg Leu 115 120 125 Gly Glu Met Trp Asn Lys Ile Ser Ser Glu Glu Lys Gln Pro Tyr Glu 130 135 140 Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala 145 150 155 160 Tyr Arg Ser Lys Gly Lys Val Gly Gly Gly Ala Ala Lys Ala Pro Ser 165 170 175 Lys Pro Asp Lys Ala Asn Asp Glu Asp Glu Asp Asp Asp Glu Glu Glu 180 185 190 Asp Glu Asp Asp Asp Asp Glu Glu Glu Glu Asp Asp Glu 195 200 205 <210> 31 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer: mazF for - MazF gene <400> 31 ctaaaatctt cagatgatca atcatcctca ctgcccgctt tccagtcggg aaa 53 <210> 32 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer: mazF rev - MazF gene <400> 32 tgaacgtgac gaacgaccag atttccccct atgcaagggt ttat 44 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer: CotB up for - Cot B up <400> 33 gaaatgctcg atgctgatga 20 <210> 34 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer: Cot B up rev - Cot B up <400> 34 ggatgattga tcatctgaag attttag 27 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer: Cot B dn for - Cot B down <400> 35 aaatctggtc gttcgtcacg ttca 24 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer: Cot B dn rev - Cot B down <400> 36 ttacgtttcc agtgatagtc tatcg 25 <210> 37 <211> 186 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer: BS/AI/HMGB1 for - BS/AI/HMGB1 CotB up <400> 37 aaccattctt tcaattgtaa ttgaattttg aatcagtctg cctgatgatg acagttcttc 60 ataatcatta aaatcgcccg gatagcacag atcatttgcc ggatttgctg atgatgaatc 120 catgcctgtt ctaaccagtg ctcttgttct ttgatatgtg gatgattgat catctgaaga 180 ttttag 186 <210> 38 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer: BS/AI/HMGB1 rev - BS/AI/HMGB1 CotB down <400> 38 ttacaattga aagaatggtt ctgtcatcat catcactgct gtcaagaatt aatcattttg 60 aaaaaattca atcatcatca gaagttgaaa caccgattag aaattcatca tcatggatga 120 caacatcata tgcaccgaca tcatcatcat cagaagttga aacaccgatt agaaataaat 180 ctggtcgttc gtcacgttca 200 <210> 39 <211> 177 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer: BS/AI/CD154 for - BS/AI/CD154 CotB up <400> 39 ttcaaaatga ttaattcttg acagcagtga tgatgatgac agaaccattc tttcaattgt 60 aattgaattt tgaatcagtc tgcctgatga tgacagttct tcataatcat taaaatcgcc 120 cggatagcac agatcatttg ccggatttgc ggatgattga tcatctgaag attttag 177 <210> 40 <211> 194 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer: BS/AI/CD154 rev - BS/AI/CD154 CotB down <400> 40 caagaattaa tcattttgaa aaaattcaat catcatcaga agttgaaaca ccgattagaa 60 attcatcatc actgaaagaa aaatatgaaa aagatattgc agcatataga gcaaaaggca 120 aagttgatgc aggcaaaaaa gttgttgcaa aagcagaaaa atcaaaaaaa aaatctggtc 180 gttcgtcacg ttca 194

Claims (43)

  1. 항원성 폴리펩티드 및 HMGB1 폴리펩티드 또는 그의 기능적 단편을 포함하고, 여기서 항원성 폴리펩티드의 적어도 일부분 및 HMGB1 폴리펩티드의 적어도 일부분이 백신 벡터의 표면 상에 존재하는 것인 백신 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 항원성 폴리펩티드가 인플루엔자 특이적 폴리펩티드인 백신 벡터.
  3. 제2항에 있어서, 항원성 폴리펩티드가 M2e, HA 또는 NP 인플루엔자 폴리펩티드인 백신 벡터.
  4. 제3항에 있어서, 인플루엔자 M2e 폴리펩티드가 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 1의 면역원성 단편, 서열 2의 면역원성 단편, 서열 3의 면역원성 단편 및 서열 4의 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 백신 벡터.
  5. 제3항에 있어서, 항원성 폴리펩티드가 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 및 서열 7, 서열 8, 서열 9 또는 서열 10의 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 백신 벡터.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, HMGB1 폴리펩티드가 서열 18, 서열 29, 서열 30, 서열 18, 서열 29 또는 서열 30의 기능적 단편, 및 이들의 상동체로부터 선택된 것인 백신 벡터.
  7. 제6항에 있어서, HMGB1의 기능적 단편이 서열 25, 서열 26, 서열 27 및 서열 28로부터 선택된 것인 백신 벡터.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아인 백신 벡터.
  9. 제8항에 있어서, 박테리아가 바실루스(Bacillus) 종인 백신 벡터.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 폴리펩티드가 막횡단 단백질 내에 포함되는 것인 백신 벡터.
  11. 제10항에 있어서, 항원성 폴리펩티드가 막횡단 단백질의 외부 루프 내에 있는 것인 백신 벡터.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, HMGB1 폴리펩티드가 막횡단 단백질 내에 포함되는 것인 백신 벡터.
  13. 제12항에 있어서, HMGB1 폴리펩티드가 막횡단 단백질의 외부 루프 내에 있는 것인 백신 벡터.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 막횡단 단백질이 cotB인 백신 벡터.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 폴리펩티드 및 HMGB1 폴리펩티드가 융합 단백질의 일부인 백신 벡터.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 백신 벡터 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 제약상 허용되는 담체가 경구 또는 비강 투여용으로 허용되는 것인 조성물.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 백신 벡터가 복제될 수 없는 것인 조성물.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 백신 벡터가 불활성화 또는 사멸된 것인 조성물.
  20. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 백신 벡터 또는 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항의 조성물을 항원성 폴리펩티드에 대한 대상체의 면역 반응을 강화시키는데 효과적인 양으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 강화시키는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 백신 벡터가 경구적으로 또는 비강내로 투여되는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 면역 반응이 항원성 폴리펩티드에 대한 IgA 항체 반응인 방법.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 백신 벡터가 대상체 내에서 복제될 수 없는 것인 방법.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 백신 벡터가 대상체에게 투여되기 전에 불활성화 또는 사멸되는 것인 방법.
  25. 백신 벡터의 표면 상에 존재하는 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열 및 면역자극성 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 항원성 폴리펩티드 및 면역자극성 폴리펩티드가 백신 벡터의 표면 상에 존재하고, 항원성 폴리펩티드가 인플루엔자 폴리펩티드이며, 면역자극성 폴리펩티드가 CD154 폴리펩티드 또는 HMGB1 폴리펩티드인 바실루스 종 백신 벡터.
  26. 제25항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드가 막횡단 단백질의 외부 부분을 코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드 서열 내에 삽입된 것인 백신 벡터.
  27. 제26항에 있어서, 막횡단 단백질이 cotB인 백신 벡터.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 폴리펩티드가 인플루엔자 M2e 폴리펩티드, 인플루엔자 HA 폴리펩티드, 또는 인플루엔자 NP 폴리펩티드인 백신 벡터.
  29. 제28항에 있어서, 인플루엔자 M2e 폴리펩티드가 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 1의 면역원성 단편, 서열 2의 면역원성 단편, 서열 3의 면역원성 단편 및 서열 4의 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 백신 벡터.
  30. 제28항에 있어서, 인플루엔자 폴리펩티드가 서열 7, 서열 8, 서열 9 또는 서열 10을 포함하는 것인 백신 벡터.
  31. 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, HMGB1 폴리펩티드가 서열 18, 서열 29, 서열 30, 서열 18, 서열 29 또는 서열 30의 기능적 단편, 및 이들의 상동체로부터 선택된 것인 백신 벡터.
  32. 제31항에 있어서, HMGB1의 기능적 단편이 서열 25, 서열 26, 서열 27 및 서열 28로부터 선택된 것인 백신 벡터.
  33. 제25항 내지 제32항 중 어느 한 항의 바실루스 종 백신 벡터를 대상체의 면역 반응을 강화시키는데 효과적인 양으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 강화시키는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 백신 벡터가 경구적으로 또는 비강내로 투여되는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 면역 반응이 항원성 폴리펩티드에 대한 IgA 항체 반응인 방법.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 백신 벡터가 대상체 내에서 복제될 수 없는 것인 방법.
  37. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 백신 벡터가 대상체에게 투여되기 전에 불활성화 또는 사멸되는 것인 방법.
  38. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 백신 벡터 또는 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항의 조성물을 인플루엔자 A-관련 이환율을 감소시키는데 효과적인 양으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 인플루엔자 A-관련 이환율을 감소시키는 방법.
  39. 제25항 내지 제32항 중 어느 한 항의 바실루스 종 백신 벡터를 인플루엔자 A-관련 이환율을 감소시키는데 효과적인 양으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 인플루엔자 A-관련 이환율을 감소시키는 방법.
  40. 제1항의 백신 벡터를 항원성 폴리펩티드에 대한 대상체의 면역 반응을 강화시키는데 효과적인 양으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 강화시키는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 백신 벡터가 경구적으로 또는 비강내로 투여되는 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 면역 반응이 항원성 폴리펩티드에 대한 IgA 항체 반응인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 백신 벡터가 대상체 내에서 복제될 수 없는 것인 방법.
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