BR112012018027B1

BR112012018027B1 - Vetores de vacina e métodos de aperfeiçoamento de respostas imunes

Info

Publication number: BR112012018027B1
Application number: BR112012018027-4A
Authority: BR
Inventors: Luc Berghman; Walter Bottje; Billy Hargis; Sherryll Layton
Original assignee: The Texas A&M University System; The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas
Priority date: 2010-01-21
Filing date: 2011-01-21
Publication date: 2022-02-22
Also published as: BR112012018027A2

Abstract

VETORES DE VACINA E MÉTODOS DE APERFEIÇOAMENTO DE RESPOSTAS IMUNES. O presente instrumento prevê vetores de vacina, incluindo um polipeptídeo antigênico e um polipeptídeo HMBG1 presentes na superfície do vetor e vacina. Composições que compreendem os vetores de vacina também são fornecidas e incluem um veículo farmaceuticamente aceito, adequadamente um veículo para administração oral ou nasal. Também são previstos métodos de aperfeiçoamento de respostas imunes, particularmente resposta imune de anticorpo e adequadamente uma resposta IgA, pela administração de vetores de vacina ou composições divulgadas no presente instrumento a um indivíduo.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA COM SOLICITAÇÕES RELACIONADAS

A presente solicitação de patente reivindica o benefício de prioridade da Solicitação de Patente Provisória dos Estados Unidos Número 61/297,098, arquivada em 21 de janeiro de 2010, incorporada ao presente por referência em sua totalidade.

INTRODUÇÃO

Vacinas são usadas para iniciar uma resposta imune adaptativa contra antígenos, em particular antígenos de patógenos, células de tumores ou afins, a fim de melhorar ou prevenir doenças. Peptídeos sintéticos ou vacinas de micro-organismos mortos ou atenuados são comumente eficazes no estímulo de uma resposta imune robusta, totalmente protetora. Em alguns desses casos, as vacinas não são protetoras ou são apenas parcialmente protetoras, devendo outras estratégias ser usadas para o desenvolvimentos de vacinas protetoras. Vacinas baseadas em micro-organismos atenuados também são associadas com riscos de transferência de gene ou reparo de mutação e podem representar riscos a indivíduos imunocomprometidos. O desenvolvimento de novas vacina que sejam seguras e eficazes na estimulação de respostas imunes protetoras duráveis é necessário.

Infecção do vírus de influenza, particularmente influenza aviária H5N1, apresenta uma grande preocupação de saúde e econômica. As evidências indicam claramente que H5N1 continua a circular entre aves e suínos suscetíveis em regiões cada vez maiores do mundo. Muitos cientistas acreditam que, se não verificada, a atual influenza aviária H5N1 sofrerá mutação para permitir a transmissão de humano para humano e causar uma pandemia mundial. Com uma taxa de mortalidade de mais de 50%, esse surto seria devastador. Independente da capacidade do vírus causar doença humana, a influenza aviária H5N1 já ameaça ter um grande impacto econômico devido à erradicação de criações de aves nas áreas afetadas. Portanto, o desenvolvimento de uma vacina para proteger humanos, aves, suínos e outros animais domesticados de influenza H5N1 é necessária. Uma vacina contra influenza capaz de proteger contra H5N1, bem como outros vírus de influenza, como H1N1, seria ideal.

RESUMO

Vetores de vacina e métodos de estímulo de uma resposta imune e métodos para reduzir a morbidez associada com a infecção de Influenza são fornecidos no presente instrumento. Em um aspecto, um vetor de vacina incluindo um polipeptídeo antigênico e um polipeptídeo HMGB1 ou um de seus fragmentos funcionais é fornecido. Pelo menos uma parte do polipeptídeo antigênico e o polipeptídeo HMGB1 estão presentes na superfície do vetor de vacina. O vetor de vacina pode incluir um primeiro polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo antigênico e um segundo polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo HMGB1. O polipeptídeo HMGB1 e o polipeptídeo antigênico pode ser ligado, como em uma proteína de fusão. O polipeptídeo HMGB1 e o polipeptídeo antigênico podem ser inseridos dentro de uma volta externa de uma proteína transmembrana.

Em outro aspecto, uma composição que compreende o vetor de vacina e um veículo farmaceuticamente aceitável. O veículo farmaceuticamente aceitável pode ser aceitável para uso oral ou nasal. O vetor de vacina pode ser incapaz de replicação.

Ainda em outro aspecto, um vetor de vacina de Bacillus spp. é fornecido. O vetor de vacina inclui uma primeira sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo antigênico expressa na superfície do vetor de vacina e uma segunda sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo imunoestimulante expresso na superfície do vetor de vacina. O polipeptídeo antigênico pode ser um polipeptídeo de Influenza M2e, um polipeptideo de Influenza HA, ou um polipeptideo de Influenza NP ou uma combinação. O polipeptideo imunoestimulante pode ser um polipeptideo CD154 ou um polipeptideo HMGB1 ou uma combinação. O polipeptideo imunoestimulante e o polipeptideo antigênico podem ser ligados, como em uma 5 proteína de fusão e podem ser inseridos dentro de uma volta externa de uma proteína transmembrana.

Ainda em outro aspecto, métodos para aperfeiçoar uma resposta imune em um indivíduo são fornecidos. No método, os vetores de vacina ou composições fornecidos no presente instrumento são administrados ao indivíduo em uma quantidade eficaz 10 * para garantir a resposta imune do indivíduo ao polipeptideo antigênico. Adequadamente, o vetor de vacina é administrado oral ou intranasalmente.

Em um aspecto posterior, métodos de aperfeiçoar a resposta imune em um indivíduo pela administração de um vetor de vacina de Bacillus spp. Conforme descrito no presente são fornecidos. O vetor de vacina inclui uma primeira sequência de 15 polinucleotídeo que codifica um polipeptideo antigênico expressa na superfície do vetor de vacina e uma segunda sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptideo imunoestimulante expresso na superfície do vetor de vacina. O polipeptideo antigênico pode ser um polipeptideo de Influenza M2e, um polipeptideo de Influenza HA, ou um polipeptideo de Influenza NP ou uma combinação. O polipeptideo imunoestimulante 20 pode ser um polipeptideo CD154, um polipeptideo HMGB1 ou uma combinação.

Em um aspecto posterior, métodos de redução de morbidez relacionada a influenza em um indivíduo são fornecidos. Nos métodos, a administração dos vetores da vacina ou composições divulgadas no presente instrumento reduz a morbidez associada com uma infecção de influenza subsequente.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 é um gráfico que demonstra as proporções S/P (amostra para controle positivo) de ELISA para a produção de anticorpo específico M2e por frangos após gavagem oral da dose indicada de vetor de vacina de Bacillus subtilis que expressa epítopos de Influenza A e HMGB1 ou CD154 em comparação com frangos vacinados com solução salina.

A Figura 2 é um gráfico que demonstra as proporções S/P de ELISA para a produção de anticorpo específico HÁ LB por frangos após gavagem oral da dose indicada de vetor de vacina de Bacillus subtilis que expressa epítopos de Influenza A e HMGB1 ou CD154 em comparação com frangos vacinados com solução salina.

A Figura 3 é um gráfico que demonstra as proporções S/P de ELISA para a produção de anticorpo específico HÁ UA por frangos após gavagem oral da dose indicada de vetor de vacina de Bacillus subtilis que expressa epítopos de Influenza A e HMGB1 ou CD154 em comparação com frangos vacinados com solução salina.

A Figura 4 é um gráfico que mostra as proporções S/P de ELISA para a produção de anticorpo específico M2e por frangos após gavagem oral da dosagem indicada de vetores de vacina de Bacillus subtilis vivo ou variadamente inativado expressando os epítopos de Influenza A e HMGB1 ou CD154 em comparação com frangos vacinados com o vetor Bacillus isoladamente (BSBB).

A Figura 5 é um gráfico que mostra as proporções S/P de ELISA para a produção de anticorpo específico HA LB por frangos após gavagem oral da dosagem indicada de vetores de vacina de Bacillus subtilis vivo ou variadamente inativado expressando os epítopos de Influenza A e HMGB1 ou CD154 em comparação com frangos vacinados com o vetor Bacillus isoladamente (BSBB).

A Figura 6 é um gráfico que mostra as proporções S/P de ELISA para a produção de anticorpo específico HA UA por frangos após gavagem oral da dosagem indicada de vetores de vacina de Bacillus subtílis vivo ou variadamente inativado expressando os epítopos de Influenza A e HMGB1 ou CD 154 em comparação com frangos vacinados com o vetor Bacillus isoladamente (BSBB).

A Figura 7 é um gráfico que mostra as proporções S/P de ELISA para a produção de anticorpo específico IgG por frangos após gavagem oral de 106 vivo ou as diversas dosagens indicadas de vetores de vacina de Bacillus subtílis inativado por formalina que expressam os epítopos de Influenza A e HMGB1 em comparação com frangos vacinados com o vetor de Bacillus isoladamente (BSBB).

A Figura 8 é um gráfico que mostra as proporções S/P de ELISA para a produção de anticorpo IgA específico M2e por frangos vacinados, oral ou subcutaneamente, com vetores de vacina de Bacillus subtílis 106 vivo, ou inativado por formalina ou inativado por formalian e liofilizado que expressam epítopos de Influenza A e HMGB1 em comparação com frangos vacinados com o vetor de Bacillus isoladamente (BSBB).

A Figura 9 é um gráfico que mostra as proporções S/P de ELISA para a produção de anticorpo IgA específico M2e por frangos vacinados, oral ou subcutaneamente, com vetores de vacina de Bacillus subtílis 106 vivo, ou inativado por formalina ou inativado por formalian e liofilizado que expressam epítopos de Influenza A e HMGB1 em comparação com frangos vacinados cóm o vetor de Bacillus isoladamente (BSBB).

DESCRIÇÃO DETALHADA

Tecnologias de DNA recombinante possibilitam a manipulação relativamente fácil de muitas espécies bacterianas e virais. Algumas bactérias e vírus são naturalmente ou podem ser selecionados ou modificados para serem levemente patogênicos ou não patogênicos, mas permanecer capazes de gerar uma resposta imune robusta. Essas bactérias e vírus formam vetores atrativos para extrair uma resposta imune a antígenos heterólogos ou externos. Vetores de vacina bacterianos ou virais podem simular a infecção natural e produzir imunidade robusta e duradoura. Vetores de vacina são comumente relativamente baratos para produzir e administrar. Além disso, esses vetores podem comumente transportar mais de um antígeno, e podem oferecer proteção contra múltiplos agentes infecciosos.

Vetores de vacina bacterianos ou virais ainda podem representar riscos a indivíduos imunocomprometidos que exijam exame regulatório adicional. Assim, o uso de vetores que sejam mortos ou inativados ou qualificados como organismos Geralmente Considerados Seguros (GRAS) pela Administração de Alimentos e Medicamentos (FDA) dos EUA é desejado. O problema é gerar uma resposta imune robusta usando esses vetores. Conforme demonstrado nos Exemplos pela inclusão de polipeptídeos HMGB1 (caixa do grupo de alta morbidez 1) na superfície do vetor de vacina, podemos gerar uma resposta imune robusta contra polipeptídeos antigênicos usando vetor Bacillus spp. De fato, os Exemplos demonstram que esse vetor pode ser inativado de forma que não possa ser replicado com o uso de uma variedade de métodos e ainda extraia uma resposta imune robusta após a administração.

Vetores de vacina incluindo um polipeptideo antigênico e um polipeptideo HMGB1 ou um de seus fragmentos funcionais são fornecidos no presente instrumento. Pelo menos uma parte do polipeptideo antigênico e pelo menos uma parte do polipeptideo HMGB1 ou um fragmento funcional estão presentes na superfície do vetor de vacina. O vetor de vacina pode incluir um primeiro polinucleotídeo que codifica o polipeptideo antigênico e um segundo polinucleotídeo que codifica o polipeptideo HMGB1. O polipeptideo HMGB1 e o polipeptideo antigênico podem ser ligados, como em uma proteína de fusão, ou podem ser expressos separadamente. O polipeptideo HMGB1 e o polipeptideo antigênico podem ser inseridos dentro de uma volta externa de uma proteína transmembrana.

Os vetores de vacina podem ser bacterianos, virais ou vetores baseados em lipossomo. Possíveis vetores de vacina incluem, entre outros, Bacilos (Bacillus subtilis), Salmonella (Salmonella enteritidis), Shigella, Escherichia (E. coli), Yersinia, Bordetella, Lactococcus, Streptococcus, Vibrio (Vibrio cholerae), Listeria, adenovirus, poxvirus, herpesvirus, alphavirus e vírus associados a adeno. Adequadamente, o vetor de vacina é um organismo GRAS. O vetor de vacina pode ser inativado ou morto de forma que não seja mais capaz de replicar-se. Métodos de inativação ou morte de vetores de vacina virai ou bacteriana são conhecidos por pessoas habilidosas na arte e incluem, entre outros, métodos como os demonstrados nos Exemplos, a saber, inativação por formalina, inativação baseada em antibiótico, tratamento por calor e tratamento por etanol.

Um polipeptídeo antigênico é um polipeptídeo capaz de ser especificamente reconhecido pelo sistema imune adaptativo. Um polipeptídeo antigênico inclui qualquer polipeptídeo que seja imunogênico. Os polipeptídeos antigênicos incluem, entre outros, antígenos que sejam relacionados a patógeno, relacionados a alérgeno, relacionados a tumor ou relacionados a doença. Patógenos incluem patógenos virais, parasíticos, fúngicos e bacterianos, bem como patógenos de proteínas como príons. Os polipeptídeos antígenos podem ser proteínas de comprimento total ou suas partes. É bem estabelecido que o reconhecimento pelo sistema imune de muitas proteínas se baseia em um número relativamente pequeno de aminoácidos, comumente chamado de epítopo. Epítopos podem ser apenas 8-10 aminoácidos. Assim, os polipeptídeos antigênicos descritos no presente instrumento podem ser proteínas de comprimento total, epítopos de 8 aminoácidos ou qualquer parte entre esses extremos. De fato, o polipeptídeo antigênico pode incluir mais de um epítopo de um único patógeno ou proteína.

Múltiplas cópias do mesmo epítopo ou múltiplos epítopos de diferentes proteínas podem ser incluídas no vetor de vacina. Imagina-se que diversos epítopos ou antígenos dos mesmos patógenos ou doenças ou diferentes podem ser administrados em combinação em um único vetor de vacina único para gerar uma resposta imune aprimorada em comparação com múltiplos antígenos. Vetores de vacina recombjnantes podem codificar antígenos a partir de múltiplos micro-organismos patogênicos, vírus ou antígenos associados a tumor. A administração de vetores de vacina capazes de expressar múltiplos antígenos tem a vantagem de induzir imunidade contra duas ou mais doenças ao mesmo tempo.

O polipeptídeo antigênico pode ser um polipeptídeo de Influenza, adequadamente é um polipeptídeo de Influenza H5N1 ou um polipeptídeo associado com múltiplas cepas do vírus de Influenza como um polipeptídeo da proteína de Influenza M2. O ectodomínio do vírus de Influenza A M2, conhecido como M2e, sobressai-se da superfície do vírus. A parte M2e da proteína M2 contêm aproximadamente 24 aminoácidos. Õ polipeptídeo M2e varia pouco de um isolado para o próximo dentro de Influenza. De fato, apenas algumas mutações de ocorrência natural em M2e foram isoladas dos humanos infectados desde a epidemia de influenza de 1918. Além disso, vírus de influenza isolados de hospedeiros aviários e suínos têm diferentes, ainda que bem conservadas, sequências de M2e. Quanto a revisões das sequências de polipeptídeo M2e isoladas de hospedeiros humanos, aviários e suínos, vide Liu et al., Microbes and Infection 7:171-177 (2005) e Reid et al., J. Virol. 76:10717-10723 (2002) cada um incorporado ao presente instrumento por referência em sua totalidade. Vide também SEQ ID NO: 1-4. Adequadamente, todo o polipeptídeo M2e pode ser inserido no vetor de vacina ou apenas uma parte pode ser usada. Nos Exemplos, um polipeptídeo de oito aminoácidos (LM2 com sequência de aminoácidos: EVETP1RN, SEQ ID NO:5 ou sua variante M2eA com sequência de aminoácidos EVETPTRN, SEQ ID NO:6) foi incorporado no vetor de vacina e demonstrou produzir uma resposta de anticorpos após a administração a frangos. Adequadamente, a parte do polipeptideo M2e inserida no vetor de vacina é imunogênica. Um fragmento imunogênico é um peptídeo ou polipeptideo capaz de extrair uma resposta imune celular ou humoral. Adequadamente, um fragmento imunogênico de M2e pode ser o polipeptideo de comprimento total M2e, ou adequadamente ter 20 ou mais aminoácidos, 15 ou mais aminoácidos, 10 ou mais aminoácidos ou 8 ou mais aminoácidos da sequência de comprimento total.

Outros epítopos adequados para inclusão em um vetor de vacina de Influenza A incluem, entre outros, polipeptídeos da hemaglutinina (HA) ou a proteína nuclear (NP) de Influenza A. Por exemplo, os peptídeos de SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, ou SEQ ID NO: 10 podem ser incluídos em um vetor de vacina. Nos Exemplos, SEQ ID NO: 7 (HAUA) e SEQ ID NO: 8 (HALB) foram incorporados no vetor de vacina e demonstraram produzir uma resposta de anticorpo após a administração a frangos. Vide as Figuras 2-3 e 5-6. Além disso, os epítopos NP de SEQ ID NO: 9 (NP54) e SEQ ID NO: 10 (NP147) foram incorporados ao vetor de vacina nos exemplos. Uma pessoa habilidosa na arte concluirá que qualquer uma dessas sequências pode ser usada em combinação com qualquer outro epítopo, incluindo epítopos derivados de outros patógenos ou antígenos.

A proteína HMGB1 (Caixa de Grupo de Alta Mobilidade-1) foi identificada pela primeira vez como uma proteína de ligação ao DNA crítica para a estrutura e estabilidade do DNA. Trata-se de uma proteína nuclear de expressão ubíqua que se liga a DNA sem especificidade de sequência. A proteína é altamente conservada e encontrada desde plantas até em mamíferos. As sequências de aminoácidos HMGB1 do peixe-zebra, frango e humano são fornecidas em SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 29, respectivamente. A sequência entre os mamíferos é altamente conservada com identidade de aminoácido de 98% e as alterações de aminoácidos são conservadoras.

Assim, uma proteína de HMGB1 de uma espécie pode provavelmente substituir a de outra espécie de forma funcional. A proteína de HMGB1 de comprimento total ou uma parte dela pode ser usada como o polipeptídeo HMGB1 nos vetores de vacina descritos no presente instrumento. HMGB1 tem duas regiões de ligação de DNA chamadas de caixa A, conforme demonstrado em SEQ ID NO: 23 e 24 e caixa B, 10 ■ conforme demonstrado em SEQ ID NO: 25 e 26. Vide Andersson and Tracey, Annu. Rev. Immunol. 2011, 29:139-162, incorporado ao presente instrumento por referência em sua totalidade. HMGB1 é um mediador de inflamação e serve como sinal de dano nuclear, como de células necróticas. HMGB1 também pode ser ativamente secretado por células da 15 linhagem de monócito/macrófago em um processo que exige acetilação da proteína, translocação do núcleo e secreção. HMGB1 extracelular atua como um potente mediador da inflamação sinalizando pelo Receptor para Produtos Finais Glicados Avançados (RAGE) e por meio de membros da família de Receptores do tipo Toll (TLR), em particular TLR4. A atividade de ligação de RAGE foi identificada e exige o 20 polipeptídeo de SEQ ID NO: 27. A ligação de TLR4 exige a cisteína na posição 106 de SEQ ID NO: 18, que é encontrada na região da caixa B de HMGB1.

As atividades inflamatórias de HMGB1 não exigem a proteína de comprimento total e fragmentos funcionais foram identificados. A caixa B demonstrou ser suficiente para mediar os efeitos pró-inflamatórios de HMGB1, e assim, SEQ ID NO: 25 e 26 são 25 polipeptídeos HMGB1 ou fragmentos funcionais dentro do contexto da presente invenção. Além disso, o local de ligação de RAGE e a atividade da citocina pró- inflamatória foram mapeados para SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 28, respectivamente. Assim, esses polipeptídeos são fragmentos funcionais de polipeptídeos HMGB1 dentro do contexto da presente invenção.

As pessoas habilidosas na arte são capazes de identificar polipeptídeos HMGB1 e seus fragmentos funcionais capazes de estimular a atividade de citocina pró-inflamatória, usando métodos como os da Publicação Internacional n- WO02 092004, incorporada ao presente instrumento por referência em sua totalidade. Adequadamente, o polipeptídeo HMGB1 inclui o domínio de ligação RAGE em aminoácidos 150-183 de SEQ ID NO:18 (SEQ ID NO: 27 ou um homólogo) e o domínio da atividade da citocina pró-inflamatória entre aminoácidos 89-109 de SEQ ID NO: 18 (SEQ ID NO: 28 ou um homólogo). Em particular, polipeptídeos HMGB1 e fragmentos funcionais ou homólogos incluem polipeptídeos idênticos a, ou pelo menos 99% idênticos, ou pelo menos 98% idênticos, pelo menos 95% idênticos, pelo menos 90% idênticos, pelo menos 85% idênticos, ou pelo menos 80% idênticos aos polipeptídeos HMGB1 de SEQ ID NOs: 18 ou 23-30.

Pelo menos uma parte do polipeptídeo antigênico e pelo menos uma parte do polipeptídeo HMGB1 estão presentes na superfície do vetor de vacina. A presença na superfície do vetor de vacina inclui polipeptídeos compostos dentro de uma proteína transmembrana que interage com, de forma covalente ou quimicamente com ligação cruzada a uma proteína transmembrana, um lipídio de membrana ou um carboidrato ancorado a membrana. Um polipeptídeo pode ser compreendido dentro de uma proteína transmembrana tendo os aminoácidos compondo o polipeptídeo ligados por meio de uma ligação de peptídeo ao término N, término C ou em qualquer lugar dentro da proteína transmembrana (ex.: inserido entre dois aminoácidos da proteína transmembrana ou em lugar de um ou mais aminoácidos da proteína transmembrana (ex.: deleção-inserção). Adequadamente, os polipeptídeos podem ser inseridos dentro de uma volta externa de uma proteína transmembrana. Proteínas transmembranas adequadas são cotB e lamB, mas as pessoas habilidosas na arte concluirão muitas 5 proteínas transmembrana adequadas encontram-se disponíveis.

Alternativamente, os polipeptídeos podem ter ligação covalente ou química a proteínas, lipídios ou carboidratos na membrana, ou capsídeo caso um vetor virai seja usado através de métodos disponíveis a pessoas habilidosas na arte. Por exemplo, ligações de dissulfeto ou ligação cruzada biotina - avidina podem ser usadas para apresentar os 10 ■ polipeptídeos antigênico e HMGB1 sobre a superfície de um vetor de vacina.

Adequadamente, o polipeptideo antigênico e o polipeptideo HMGB1 fazem parte dé uma proteína de fusão. Os dois polipeptídeos podem ser diretamente ligados por meio de uma ligação de peptídeo ou podem ser separados por uma ligação ou uma seção de uma terceira proteína na qual estiverem inseridos. Polinucleotídeos que codifiquem o polipeptideo antigênico ou o polipeptideo HMGB1 podem ser inseridos no vetor de vacina e expressos para gerar o polipeptideo antigênico e o polipeptideo HMGB1. Os polinucleotídeo podem ser inseridos no cromossomo do vetor de vacina ou codificados em plasmídeos ou outro DNA extracromossômico. Adequadamente, polinucleotídeo que codificam o polipeptideo antigênico e/ou o polipeptideo HMGB1 podem ser expressos independentemente ou são inseridos em um polinucleotídeo de vetor de vacina expresso. Adequadamente, o polinucleotídeo do vetor de vacina codifica um polipeptideo expresso na superfície do vetor de vacina como uma proteína transmembrana. O polinucleotídeo que codifica o polipeptideo antigênico e/ou o polipeptideo HMGB1 pode ser inserido na sequência de polinucleotídeo do vetor de vacina para permitir a expressão do polipeptideo antigênico e/ou polipeptídeo HMGB1 na superfície do vetor. Por exemplo, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo antigênico e o polipeptídeo HMGB1 podem ser inseridos em uma estrutura dentro de um polinucleotídeo em uma região que codifique uma região de volta externa de uma proteína transmembrana de forma que a sequência de polinucleotídeo bacteriana permaneça na estrutura. Vide o Exempío 1.

Alternativamente, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo antigênico e/ou o polipeptídeo HMGB1 pode ser inserido em um polipeptídeo secretado que é exibido ou apresentado na superfície do vetor de vacina através de associação com uma proteína, lipídeo ou carboidrato na superfície do vetor de vacina. As pessoas habilidosas na arte concluirão que o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo antigênico e/ou o polipeptídeo HMGB1 podem ser inseridos em uma grande variedade de polinucleotídeo de vetor de vacina para providenciar a expressão e apresentação do polipeptídeo antigênico e/ou o polipeptídeo HMGB1 às células imunes de um indivíduo tratado com o vetor de vacina. Nos Exemplos, diversos epítopos de influenza, incluindo um epítopo M2e, um epítopo HA e um epítopo NP foram expressos a partir de um plasmídeo para expressão vegetativa em Bacillus subtilis. As bactérias recombinantes resultantes expressam os epítopos inseridos conforme demonstrado pela resposta imune demonstrada nas Figuras 1-6. Nos Exemplos, os vetores de vacina têm os polipeptídeos antigênicos (polipeptídeos M2e, HA e NP) e o polipeptídeo imunoestimulante (CD154 ou HMGB1) codificados no mesmo polinucleotídeo e na estrutura entre si. Em configurações alternativas, o polipeptídeo imunoestimulante e o polipeptídeo antigênico podem ser codificados por polinucleotídeos distintos. As pessoas habilidosas na arte apreciarão que uma variedade de métodos pode ser usada para obter a expressão do polipeptídeo antigênico e o polipeptídeo HMGB1 na superfície do vetor de vacina. Esses métodos são conhecidos dos habilidosos na arte.

Composições que compreendem o vetor de vacina e um veículo farmaceuticamente aceitável também são fornecidas. Um veículo farmaceuticamente aceitável é qualquer veículo adequado para administração in vivo. Adequadamente, o veículo farmaceuticamente aceitável é aceitável para administração oral, nasal ou mucosal. O veículo farmaceuticamente aceitável pode incluir água, soluções tampão, soluções de glicose ou fluidos de cultura bacteriana. Componentes adicionais das composições podem adequadamente incluir excipientes como estabilizadores, preservativos, diluentes, emulsificantes e lubrificantes. Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis ou diluentes incluem estabilizantes como carboidratos (ex.: sorbitol, manitol, amido, sacarose, glicose, dextrano), proteínas como albumina ou caseína, agentes que contenham proteínas como soro bovino ou leite desnatado e tampões (ex.: tampão fosfatado). Especialmente quando esses estabilizantes são adicionados às composições, a composição é adequada para secagem por congelamento ou secagem por borrifo. O vetor de vacina nas composições pode não ser capaz de replicação, adequadamente o vetor de vacina é inativado ou morto antes da adição à composição. As composições descritas no presente instrumento podem ser usadas para aprimorar uma resposta imune como uma resposta de anticorpo ao polipeptídeo antigênico. As composições que contêm polipeptídeos de influenza também podem ser usadas para reduzir a morbidez associada com a infecção subsequente por influenza. As composições podem prevenir que influenza cause doença ou qualquer morbidez associada em um indivíduo a quem as composições ou os vetores de vacina aqui descritos tenham sido administrados. As composições e vetores de vacina descritos no presente instrumento podem reduzir a gravidade de doença subsequente reduzindo o comprimento da doença, reduzindo a morbidez ou mortalidade associada com a doença ou reduzindo a probabilidade de contrair a doença. A morbidez ou mortalidade associada com a doença após a administração dos vetores de vacina aqui descritos podem ser reduzidas em 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou até 100% em comparação com indivíduos semelhantes que não tenham recebido o vetor de vacina.

Métodos para aprimorar respostas imunes em um indivíduo através da administração de um vetor de vacina também são fornecidos. O vetor de vacina pode conter um polipeptideo HMGB1 capaz de estimular a resposta imune ao vetor de vacina e seu polipeptideo antigênico associado. O vetor de vacina que compreende um polipeptideo de HMGB1 é administrado a um indivíduo em uma quantidade eficaz para aperfeiçoar a resposta imune do indivíduo à vacina, e em particular, ao polipeptideo antigênico. Adequadamente, o vetor de vacina contém um polinucleotídeo que codifica um polipeptideo que inclui aminoácidos 150-183 e 89-109 do polipeptideo HMGB1 (SEQ ID NO: 18) ou um homólogo. Nos Exemplos, foi usado um polipeptideo de aminoácido 190 de HMGB1. Adequadamente, o polinucleotídeo codifica um polipeptideo HMGB1 da mesma espécie do indivíduo. Combinações heterólogas de polipeptídeos HMGB1 e indivíduos (ex.: um polipeptideo HMGB1 humano para uso em uma vacina de frango) pode ser usado nos métodos da invenção, visto que HMGB1 é altamente conservado através de uma grande variedade de espécies. O polipeptideo HMGB1 pode ser usado para aperfeiçoar a resposta imune no indivíduo em quem haja a presença de antígenos externos ou polipeptideo antigênico ou no vetor de vacina. Uma pessoa habilidosa na arte concluirá que o polipeptideo HMGB1 pode ser usado para aprimorar a resposta imune a mais de um polipeptideo antigênico presente em um vetor de vacina. O polipeptideo de HMGB1 estimula uma resposta imune pelo menos em parte ativando células dendríticas e macrófagos e, assim, estimulando a produção de citocinas como 1L-1, IL-6, IFN-Y θ TNF-α. Nos Exemplos, um polipeptideo de HMGB1 foi expresso na superfície do vetor de vacina.

Além disso, métodos de aperfeiçoamento de uma resposta imune contra influenza A e métodos de redução de morbidez associada com a subsequente infecção por Influenza A são divulgados. Resumidamente, os métodos compreendem a administração a um indivíduo de um vetor de vacina que compreende um epítopo de Influenza A (um polipeptídeo antigênico de Influenza) capaz de extrair uma resposta imune em uma quantidade eficiente para extrair a resposta imune. O epítopo de Influenza A pode ser um polipeptídeo M2e, um polipeptídeo HA ou um polipeptídeo NP ou outro polipeptídeo de influenza conforme discutido acima. A inserção dos polipeptídeos antigênicos no vetor de vacina pode ser realizada em uma variedade de formas conhecidas pelas pessoas habilidosas na arte, incluindo, entre outras, o sistema de mutação direcionado a local sem cicatriz descrito na Publicação de Patente Internacional Ns WO 2008/036675. A bactéria também pode ser modificada para expressar polipeptídeos de Influenza em conjunto com polinucleotídeo capazes de aperfeiçoar a resposta imune, conforme discutido acima. Em particular, um polipeptídeo de CD154 ou HMGB1 pode ser expresso pelo vetor de vacina para aperfeiçoar a resposta imune do indivíduo aos polipeptídeos de influenza. Os Exemplos demonstram a produção de uma resposta IgA e IgG robusta a vacinação em frangos. Esperamos que essa resposta robusta seja protetora contra ou pelo menos reduza a morbidez associada com a subsequente infecção ou desafie com a fonte do polipeptídeo antigênico (vírus de Influenza nos Exemplos).

As composições podem ser administradas por uma variedade de meios, incluindo, entre outros, oral, intranasal e mucosal. Por exemplo, as composições ou vetores de vacina podem ser administrados por aerossol, por borrifo, além de alimentos ou água, por gavagem oral ou por gotas nos olhos. Em algumas configurações, as composições são administradas por injeção como intradermal, parenteral, subcutânea, intraperitoneal, intravenosa, intracranial ou intramuscular. Para frangos ou outras aves, as composições podem ser administradas in ovo.

Os indivíduos incluem, entre outros, um vertebrado, adequadamente um mamífero, 5 adequadamente um humano, vacas, gatos, cães, porcos ou aves, adequadamente aves de corte como frangos. Outros modelos animais de infecção também podem ser usados. O aperfeiçoamento de uma resposta imune inclui, entre outros, a indução a um efeito terapêutico ou profilático mediado pelo sistema imune do indivíduo. Especificamente, o aperfeiçoamento de uma resposta imune pode incluir um aumento 10 ■ na produção de anticorpos, como demonstrado nas Figuras 1-3, aperfeiçoamento na troca de classes de anticorpos de cadeia pesada como a produção de IgA conforme demonstrado na Figura 8, maturação de células que apresentam antígenos, estímulo de células ajudantes T, estímulos de células citolíticas T ou indução de memória celular TeB.

A dose útil a ser administrada variará dependendo da idade, peso e espécie do indivíduo, modo e via de administração e tipo de patógeno ou doença contra a qual se busca uma resposta imune. A composição pode ser administrada em qualquer dose de vetor de vacina suficiente para invocar uma resposta imune. Imagina-se que doses variando de 103 a 1010 cópias de vetor (ex.: unidades formadoras de placa ou colônia), 20 de 104 a 109 cópias de vetor, ou de 105 a 107 cópias de vetor sejam adequadas.

A composição pode ser administrada apenas uma vez ou pode ser administrada duas ou mais vezes para aumentar a resposta imune. Por exemplo, a composição pode ser administrada duas ou mais vezes separadamente por uma semana, duas semanas ou três semanas, um mês, dois meses, três meses, seis meses ou mais. As bactérias 25 serão viáveis antes da administração, mas em algumas configurações, as bactérias podem ser mortas ou inativadas antes da administração. Em algumas configurações, as bactérias serão capazes de replícar-se no indivíduo, enquanto em outras configurações as bactérias podem não ser capazes de replicar-se no indivíduo conforme demonstrado nos Exemplos, vetores de vacina bacterianos podem ser inativados antes da administração usando formalina, etanol, calor ou antibióticos. Uma pessoa habilidosa na arte concluirá que outros meios de inativar vetores de vacina também podem ser usados.

Um vetor de vacina de Bacillus spp. também é fornecido no presente instrumento. O vetor de vacina Bacillus inclui uma primeira sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo antigênico e uma segunda sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo imunoestimulante. O polipeptídeo antigênico e o polipeptídeo imunoestimulante estão presentes na superfície do vetor de vacina Bacillus conforme descrito acima. O polipeptídeo antigênico é um polipeptídeo de influenza conforme descrito acima, e o polipeptídeo imunoestimulante é um polipeptídeo HMGB1 conforme descrito acima ou um polipeptídeo CD154.

Polinucleotídeos que codificam polipeptídeos imunoestimulantes homólogos a proteínas do indivíduo e capazes de estimular o sistema imune a responder aó polipeptídeo antigênico também podem ser inseridos em um vetor de vacina. Conforme descrito mais detalhadamente nos Exemplos, um vetor de vacina pode incluir um polipeptídeo CD154 capaz de ligar-se a CD40 no indivíduo e estimular o indivíduo a responder ao vetor de vacina e seu polipeptídeo antigênico associado, semelhante a HMGB1 descrito acima. O vetor de vacina Bacillus pode incluir um polipeptídeo HMGB1, um polipeptídeo CD154 ou uma combinação. Como descrito acima, polinucleotídeo que codificam esses polipeptídeos podem ser inseridos no cromossomo do vetor da vacina ou mantidos extracromossomicamente. Uma pessoa habilidosa na arte concluiria que esses polipeptídeos podem ser inseridos em uma variedade de polipeptídeos do vetor de vacina e expressos em partes diferentes do vetor da vacina, ou podem ser secretados.

O polinucleotídeo que codifica um polipeptideo imunoestimulante capaz de aprimorar a 5 resposta imune a um polipeptideo antigênico também pode codificar o polipeptideo antigênico. O polipeptideo que codifica um polipeptideo imunoestimulante pode ligar- se ao polinucleotídeo que codifica o polipeptideo antigênico, de forma que, no vetor de vacina, o polipeptideo imunoestimulante e o polipeptideo antigênico sejam codificados pelo mesmo polinucleotídeo. Nos Exemplos, um polinucleotídeo que codifica um 10 - polipeptideo de CD154, capaz de ligar-se a CD40, ou HMGB1 também codifica um epítopo de M2e, um epítopo de HÁ, um epítopo de NP e um epítopo de Influenza A.

Vide SEQ ID NOs: 19-22. Nos Exemplos, o polinucleotídeo que codifica os epítopos de Influenza e o polinucleotídeo codifica o polipeptideo imunoestimulante são expressos de um plasmídeo para expressão de célula vegetativa. Em algumas configurações, os 15 polinucleotídeo estão inseridos no gene cotB ou outro gene que codifica uma proteína expressa na superfície de esporos. As pessoas habilidosas na arte concluirão que polinucleotídeos bacterianos que codificam outras proteínas transmembrana também podem ser usados.

Conforme discutido acima, um polinucleotídeo que codifica um polipeptideo 20 imunoestimulante homólogo a uma proteína do indivíduo capaz de aperfeiçoar a resposta imune ao epítopo pode ser incluído no vetor de vacina. Nos Exemplos, um vetor de vacina de Bacillus que inclui um polinucleotídeo que codifica um polipeptideo D154 capaz de ligar-se a CD40 ou um polipeptideo que codifica HMGB1 demonstrou aperfeiçoar a resposta imune ao epítopo M2e e a dois epítopos HA distintos conforme 25 medido pelo aumento na produção de anticorpos em resposta à vacinação.

Adequadamente, o polipeptídeo CD154 tem menos do que 50 aminoácidos de comprimento, mais adequadamente menos do que 40, menos do que 30 ou menos do que 20 aminoácidos de comprimento. O polipeptídeo pode ter entre 10 e 15 aminoácidos, entre 10 e 20 aminoácidos ou entre 10 e 25 aminoácidos de comprimento. A sequência de CD154 e a região de ligação de CD40 não são altamente conservadas dentre as diversas espécies. As sequências de aminoácidos CD154 do frango e humano são fornecidas em SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12, respectivamente.

As regiões de ligação de CD40 de CD154 foram determinadas para uma quantidade de espécie, incluindo humanos, frango, pato, camundongo e gado e são demonstradas em SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, respectivamente. Embora haja variabilidade nas sequências na região de ligação de CD40 entre espécies, os Exemplos abaixo indicam que o polipeptídeo humano CD154 foi capaz de aprimorar a resposta imune em frangos. Portanto, pode-se praticar a invenção usando polipeptídeos CD154 específicos de espécie ou um polipeptídeo CD 154 heterólogo. Em particular, polipeptídeos CD154 e fragmentos funcionais ou homólogos incluem polipeptídeos idênticos a, ou pelo menos 99% idênticos, ou pelo menos 98% idênticos, pelo menos 95% idênticos, pelo menos 90% idênticos, pelo menos 85% idênticos, ou pelo menos 80% idênticos aos polipeptídeos CD 154 de SEQ IDNOs: 11-17.

O vetor de vacina de Bacillus descrito no presente instrumento pode ser usado nos métodos de aprimorar uma resposta imune e os métodos para reduzir a morbidez de Influenza em um indivíduo conforme descrito acima. O vetor de vacina de Bacillus pode ser usado para fazer composições para administração a indivíduos como os descritos acima.

Polinucleotídeos heterólogos que codificam polipeptídeos antigênicos podem ser inseridos no genoma bacteriano em qualquer local não essencial ou podem alternativamente ser transportados em um plasmídeo usando métodos bem conhecidos na arte. Um local adequado para a inserção de polinucleotídeo está dentro das partes externas de proteínas transmembrana ou acopladas a sequências que têm como alvo o polinucleotídeo heterólogo para vias secretórias. Exemplos de uma proteína transmembrana adequada para inserção de polinucleotídeo são o gene cotB de Bacillus e o gene lamB de Salmonella.

Polinucleotídeos heterólogos incluem, entre outros, polinucleotídeo que codificam antígenos selecionados de micro-organismos patogênicos ou vírus que não sejam o vetor de vacina. Esses polinucleotídeo podem ser derivados de vírus patogênicos como influenza (ex.: M2e, hemaglutinina ou neuraminidase), vírus de herpes (ex.: os genes que codificam as proteínas estruturais de vírus da herpes), retrovirus (ex.: a proteína de envelope gp160), adenovirus, paramixovirus, coronavirus e afins. Polinucleotídeos heterólogos também podem ser obtidos de bactérias patogênicas, como genes que codificam proteínas bacterianas como toxinas e proteínas de membrana externa. Além disso, polinucleotídeo heterólogos de parasitas, como Eimeria são candidatos atrativos para uso em uma vacina de vetor.

Além disso, polipeptídeos imunoestimulantes envolvidos no desencadeamento do sistema imune também podem ser incluídos nos vetores de vacina descritos no presente instrumento. Os polinucleotídeo podem codificar moléculas do sistema imune conhecidas por seus efeitos estimulantes como interleucina, Fator de Necrose de Tumor ou um interferon, ou outro polinucleotídeo envolvido na regulação imune.

Os exemplos a seguir servem apenas para ser ilustrativos e não devem ser considerados limitações sobre o escopo da invenção das reivindicações anexas.

EXEMPLOS

Exemplo 1. A Construção de HA/NP/M2e/cCD154 e HA/NP/M2e/HMGB1 Vetores Bacillus Condições de Cepa e Cultura Todos os plasmídeos foram mantidos pela primeira vez em células TOP10 de E. coli (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a menos que tenha sido descrito de outra forma. Bacillus spp. foi usado para a introdução de mutações (Bacillus subtilis, cepa do Poultry Health Laboratory designada como NP122). Bactérias que transportam plasmídeo pDGIEF e pHT10 foram cultivadas a 37°C.

Meio de Luria-Bertani (LB) foi usado para o crescimento rotineiro de células, e meio SOC (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) foi usado para expressão fenotípica após a eletroporação. Quando apropriado, o seguinte foi adicionado ao meio: Isopropyl-β-D-tiogalactopiranosida (IPTG) a 1mM, ampicilina (Amp) a 100μg/ml, espectinomicina (SP) a 100μg/ml e cloramfenicol (Cm) a 5μg/ml.

Plasmídeos

Plasmídeos pDGIEF (Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, OH) e pHT10 usados para o presente estudo foram descritos anteriormente (Zhang et al., Nuc. Acids Research 2006, 34 (9): 1-8 e Nguyen et al., Curr. Micro. 2007, 55:89-93). Plasmídeo pDGIEF serviu como modelo para amplificação do gene mazF que foi usado como marcador contra-selecionável durante a manipulação cromossômica de Bacillus. Plasmídeo pHT10 foi usado para codificar e produzir as sequências de epítopo heterólogo para Influenza Aviária em Bacillus spp. Esse plasmídeo contêm um gene de resistência de CM, é induzido pela adição de 1mM IPTG, e é mantido em Bacillus a 37°C.

Produção de Proteínas Heterólogas para Expressão Celular Vegetatíva:

Plasmídeo pHT10 comprado de MoBioTec/Boca Scientific, Boca Raton, FL (Nguyen et al., 2007) foram transformados no local de clonagem múltipla pela adição de uma sequência de inserção otimizada códon de Bacillus subtílis. O sequenciamento de DNA foi feito para confirmar a inserção da sequência correta. O plasmídeo recém modificado foi, então, transformado em Bacillus. Resumidamente, culturas de Bacillus foram cultivadas de um dia para o outro a 37°C em meio HS (meio de Spizizen suplementado com 0,5% de glicose, 50μg/ml de DL-triptofano, 50μg/ml de uracilo, 0,02% de hidrolisado de caseína, 0,1% de extrato de levedura, 8μg/ml de arginina, 0,4μg/ml de histidina, 1mM de MgSO4). A cultura de um dia para o outro (1 ml) foi usada para inocular 20ml do meio LS (meio de Spizizen suplementado com 0,5% de glicose, 5μg/ml de DL-triptofano, 5μg/ml de uracilo, 0.01% de hidrolisado de caseína, 0.1% de extrato de levedura, 1mM de MgSO4| 2,5mM de MgCI2, 0,5mM de CaCI2) e incubada com agitação por 3-4 horas a 30 °C. Para 1 ml da cultura LS resultante, 10μl de 0,1M EGTA foram adicionados e incubados em temperatura ambiente por 5 minutos. Então, 1-2 μg de DNA de plasmídeo foram adicionados, agitados por 2 horas a 37°C e colocados em lâminas LB com antibióticos seletivos. Esses Bacillus spp. transformados produzem agora sequências de epítopo heterólogas de Al quando induzidos com 1mM IPTG. PCR

Todos os primers usados para PCR são listados na Tabela 1. Condições típicas de PCR consistiram de aproximadamente 0,1 μg de DNA genômico, gerado por PCR ou plasmídeo (Qiagen, Valencia, CA, EUA), 1x Pfu de tampão de polimerase, 5U Pfu de polimerase (Stratagene La Jolla, CA, EUA), 1mM dNTPs (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ), 1,2μM de cada primer em urn volume total de 50 μL. O ciclador térmico de DNA (Bo-Rad, Hercules, CA, EUA) foi usado com as seguintes condições de amplificação: 94°C por 2 minutos; 30 ciclos de 94°C seg por 30 seg, 58 °C por 60 seg, 72 °C por 90 seg por 1 kb; e 72 °C por 10 minutos para a extensão final. Cada produto de PCR foi purificada por gel (Qiagen, Valencia, CA, EUA) e éter eluído em 25μL de tampão EB para o preparo de modelos usados em PCR de extensão de sobreposição ou em 50pL de tampão EB, etanol precipitado e suspenso em 5μL de ddH2O para eletroporação em Bacillus spp. Tabela 1: Sequências de primer usadas para gerar o vetor de vacina

Na Tabela 1, os nucleotídeos em itálico são os complementares a qualquer lado do local de inserção de gene CotB de Bacillus subtilis.

Eletroporaçâo

Em resumo, células foram inoculadas em 10 mL de caldo LB e cultivadas a 37 °C durante a noite. Então, 100μL de cultura de um dia para o outro foram re-inoculados em 10mL de caldo LB fresco a 37 °C por 3-4 horas. Células foram lavadas cinco vezes em água ddH2O e re-suspensas em 60μL de 10% glicerol. As células foram, então, . pulsadas a 2,4-2,45kV por 1-6ms, incubadas em 0,5ml SOC por 2-3 horas a 37°C e colocadas em lâminas em meio LB com antibióticos apropriados.

Integração Cromossômica de DNA Heterólogo para Expressão de Revestimento de Esporos:

Cepas de Bacillus recombinantes que continham cópias integradas estáveis de epítopos selecionados de M2e, HA e NP foram construídas com o uso de métodos recém-publicados com modificação. Em resumo, cepas de Bacillus foram transformadas com o cassete MazF (Zhang et al., 2006) que gerou uma cepa sensível a IPTG e resistente a espectinomicina. O cassete MazF flanqueado por aproximadamente 300bp de DNA homólogo de cada lado foi introduzido no gene CotB (Isticato et al., 2001) do vetor de Bacillus por eletroporaçâo seguida de crescimento em meio que continha espectinomicina para clones positivos, que agora contêm o cassete MazF resistente a espectinomicina.

Após a confirmação da mutação de MazF em CotB, essa região foi substituída por uma sequência de DNA otimizada para códon que codificava para os epítopos antigênicos de Al novamente flanqueado por 300 bp de DNA homólogo. Isso foi feito através da criação de um produto de PCR usando sobreposição e extensão de PCR para produzir sequências antigênicas flanqueadas por aproximadamente 300bp de cada lado homólogo ao cromossomo de Bacillus (Cox et al., 2007). O produto de PCR foi introduzido novamente no Bacillus por eletroporação e substituição do cassete MazF. Transformantes foram selecionados em lâminas que continham IPTG, e clones positivos agora não devem ser responsivos a IPTG e devem ser sensíveis a espectinomicina. A inserção da sequência cromossômica correta foi confirmada por sequenciamento de DNA.

Exemplo 2. Estudo de Vacinação 1 e 2. - Pintos no dia de eclosão (dia 0) foram obtidos de um viveiro comercial local e foram aleatoriamente distribuídos em grupos de tratamento (n=15/grupo de tratamento, Exp 1 e n=20/ grupo de tratamento, Exp 2). Todos os pintos em cada grupo de tratamento foram marcados e numerados. Os pintos foram infectados oralmente por gavagem com 0,25 ml de solução salina ou 106-108 cfu/ml dos diversos tratamentos de Bacillus conforme indicado na Tabela 2 para o estudo 1 e na Tabela 3 para o estudo 2. Tabela 2. Dose de Desafio para cada grupo de tratamento no Estudo de 15 Vacinação 1.

Tabela 3. Dose de Desafio para cada grupo de tratamento no Estudo de

No estudo 2, as bactérias foram inativadas de diversas formas diferentes para avaliar se a replicação era necessária para a produção de uma resposta de anticorpo direcionada aos peptídeos de influenza antigênicos. Diversos meios de inativação foram usados porque os meios de inativação poderiam resultar na destruição do epítopo e resultar em interpretação errônea dos dados e suportar uma necessidade de replicação ou viabilidade do vetor de Bacillus. As bactérias foram inativadas por incubação por 10 minutos em formalina 0,022% (inativadas por formalina); incubação k por 10 minutos a 70°C (inativadas por calor); incubação em δμg/ml de gentamicina (inativadas por antibiótico); ou incubação por 10 minutos em etanol70% (inativadas por etanol).

Cada grupo de tratamento foi alojado em um curral de piso ou liteira de pinho fresco e recebeu água e comida ad libitum. Nos dias 11 e 21 pós-eclosão, as aves receberam uma vacina de reforço do mesmo tratamento que receberam no Dia 0. Além disso, nos dias 21 e 31/32, sangue foi colhido de cada uma das aves marcadas e o soro foi removido. O soro colhido das aves marcadas em cada grupo de tratamento foi, então, usado em ELISA de captura de anticorpo para determinar a resposta de anticorpo específico M2e, HAUA e HALB. Em resumo, fontes individuais de uma lâmina 96-well foram revestidas com 10 μg/ml do epítopo de M2e, epítopo de HAUA ou epítopo de HALB conjugado a BSA. A adesão de antígeno foi deixada durante a noite a 4°C. As lâminas foram lavadas com PBS + 0,05% Tween 20, bloqueadas com PBS Superblock (Pierce Chemical Co.) por, no mínimo, 2 horas e incubadas por 2 horas com o soro anteriormente colhido das aves em cada um dos grupos de tratamento descritos acima. As lâminas foram lavadas com PBS + 0,05% Tween 20 seguidas de incubação com anticorpo secundário Bode-anti-Frango IgY conjugado com peroxidase (diluição de 1:7,500) obtido de Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA) por uma hora adicional. Após a lavagem subsequente, as lâminas foram reveladas com o uso de um kit de substrato de peroxidase obtido da Fisher Scientific e as absorbâncias foram lidas em um espèctrofotômetro a 450nm e 405nm.

Amostras de soro tríadas dos grupos que receberam a vacina vetorada foram usadas como controles positivos e amostras de soro triadas dos grupos que não receberam as vacinas foram usadas como controles negativos erh cada lâmina para substituir o soro - dos grupos de tratamento. As absorbâncias obtidas para o controle positivo, controle negativo e amostras experimentais foram usadas para calcular as proporções de Amostra para Controle positivo (proporções S/P) usando-se o cálculo a seguir: Cálculo da proporção S/P: média da amostra - média do controle negativo média do controle positivo - média do controle negativo

As proporções S/P calculadas para cada estudo são exibidas nas Figuras 1-6. As Figuras 1-3 mostram o total de titulações de anticorpo para M2e, HALB e HAUA para o estudo 1, respectivamente, nos dias 21 e 31 pós-eclosão. Os resultados demonstram que respostas imunes robustas a cada um desses antígenos foram geradas após a administração oral com um Bacillus que expressa cada um dos epítopos com CD154 de HMGB1 como o peptídeo imunoestimulante. As Figuras 4-6 mostram o total de titulações de anticorpos para M2e, HALB e HAUA para o estudo 2, respectivamente, nos dias 21 e 32 pós-eclosão. Os resultados demonstram que respostas imunes robustas a cada um dos epítopos foram geradas após a administração oral de um Bacillus vivo que expressa o epítopo e um peptídeo imunoestimulante. As Figuras 4-6 também demonstram que níveis semelhantes de anticorpos específicos foram gerados quando o vetor (o Bacillus) estava inativado antes da administração.

Exemplo 3. Estudo de Vacinação 3

Pintos do dia de eclosão (dia 0) foram obtidos de um viveiro comercial local e foram aleatoriamente distribuídos em grupos de tratamento (n=20/grupo de tratamento). Todos os pintos em cada grupo de tratamento foram marcados e numerados. Os pintos foram infectados oralmente por gavagem, com 0,25 ml de solução salina ou 105- 5 108cfu/ml do vetor de Bacillus (BSBB), o vetor de Bacillus que expressava os epítopos de influenza aviária e HMGB1 (BS/AI/HMGB1), ou diversas quantidades do vetor de BS/AI/HMGB1 após a inativação por formalina (como descrito acima). No dia 10 pós- - eclosão, as aves receberam uma vacina de reforço do mesmo tratamento que receberam no Dia 0. Além disso, nos dias 21 e 32, sangue foi colhido de cada uma das 10 aves marcadas e o soro foi removido. Os níveis de anticorpos específicos IgG M2e de soro foram determinados durante o método descrito acima, com um anticorpo secundário específico de IgG anti-frango rotulado por peroxidase (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Os resultados na Figura 7 demonstram que as bactérias inativadas por formalina foram capazes de estimular a 15 produção de anticorpos IgG específicos M2e bem como bactérias vivas. Esse resultado foi surpreendente porque geralmente acreditava-se que apenas bactérias vivas pudessem estimular uma resposta imune robusta após administração oral.

Exemplo 4. Estudo de Vacinação 4

Pintos do dia de eclosão (dia 0) foram obtidos de um viveiro comercial local e foram 20 aleatoriamente distribuídos em grupos de tratamento (n=20-35/grupo de tratamento).

Todos os pintos em cada grupo de tratamento foram marcados e numerados. Os pintos foram oralmente infectados por gavagem ou receberam injeção subcutânea de 0,25 ml de 106 cfu/ml do vetor de Bacillus (BSBB), o vetor de Bacillus que expressava os epítopos de influenza aviária e HMGB1 (BSAI), ou o vetor de BSAI após a inativação 25 por formalina (conforme descrito acima) ou após a inativação por formalina seguida de liofilização (reconstituída com solução salina imediatamente antes da administração). No dia 10 pós-eclosão, algumas aves receberam uma vacina de reforço do mesmo tratamento que receberam no Dia 0. Nos dias 11, 14 e 21, sangue foi colhido de cada uma das aves marcadas e o soro foi removido. Os níveis de anticorpos específicos IgA e IgG M2e de soro foram determinados durante o método descrito acima, com um anticorpo secundário específico de IgA (GenTex) anti-frango rotulado por peroxidase ou de IgG anti-frango rotulado por peroxidase (Jackson ImmunoResearch Laboratories, . West Grove, PA). Os resultados na Figura 8 demonstram que as bactérias inativadas por formalina foram capazes de estimular a produção de anticorpos IgA específicos de * M2e bem como bactérias vivas quando administradas oralmente. Em contraste com a administração subcutânea, o vetor BSAI inativado não foi tão eficiente no estímulo da resposta do anticorpo IgA e as bactérias liofilizadas não estimularam uma resposta IgA. Os resultados na Figura 9 demonstram que cada um dos protocolos de administração BSAI suportaram a formação de IgG robusta.

Claims

1. Um vetor de vacina caracterizado por compreender um polipeptídeo antigênico e um polipeptídeo HMGB1, em que o polipeptídeo HMGB1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada da SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 30, em que o polipeptídeo antigênico e o polipeptídeo HMGB1 são presentes em uma superfície externa do vetor de vacina como uma proteína de fusão a uma proteína transmembrana, e em que o polipeptídeo HMGB1 tem uma atividade imunoestimulante.

2. Vetor de vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo polipeptídeo antigênico ser um polipeptídeo específico Influenza.

3. Vetor de vacina, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo polipeptídeo antigênico ser um polipeptídeo M2e, HA ou NP Influenza.

4. Vetor de vacina, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo polipeptídeo antigênico ser selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, um fragmento imunogênico de SEQ ID NO: 1, um fragmento imunogênico de SEQ ID NO: 2, um fragmento imunogênico de SEQ ID NO: 3, um fragmento imunogênico de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 e um fragmento imunogênico de pelo menos uma das SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10.

5. Vetor de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo vetor de vacina ser uma bactéria.

6. Vetor de vacina, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela bactéria ser Bacillus spp.

7. Vetor de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo polipeptídeo antigênico e/ou o polipeptídeo HMGB1 estar dentro de uma alça externa de uma proteína transmembrana.

8. Vetor de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pela proteína transmembrana ser cotB.

9. Uma composição, caracterizada por comprender um vetor de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo veículo farmaceuticamente aceitável ser aceitável para administração oral ou nasal.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizada pelo vetor da vacina não ser capaz de se replicar, ser inativado ou ser morto.

12. Uso do vetor de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado por ser para fabricação de um medicamento para aumentar a resposta imune de um indivíduo ao polipeptídeo antigênico.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo vetor de vacina ser formulado para administração via oral ou intranasal.

14. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 e 13, caracterizado pelo vetor de vacina não ser capaz de se replicar no indivíduo ou ser inativado ou morto antes da administração ao indivíduo.

15. Vetor de vacina Bacillus spp. caracterizado por ter um polipeptídeo imunoestimulador, em que o polipeptídeo antigênico e o polipeptídeo imunoestimulador estão cada um compreendido em uma proteína transmembrana e estão presentes na superfície do vetor de vacina, em que o polipeptídeo antigênico é um polipeptídeo da gripe, em que o polipeptídeo imunoestimulador é um polipeptídeo HMGB1, e em que o polipeptídeo HMGB1 é selecionado a partir de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 30.

16. Vetor de vacina, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo polipeptídeo antigênico e o polipeptídeo imunoestimulador serem inseridos em uma porção externa da proteína transmembrana.

17. Vetor de vacina, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pela proteína transmembrana ser cotB.

18. Vetor de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo polipeptídeo antigênico ser um polipeptídeo Influenza M2e, Influenza HA ou Influenza NP.

19. Vetor de vacina, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo polipeptídeo antigênico ser selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, um fragmento imunogênico de SEQ ID NO: 1, um fragmento imunogênico de SEQ ID NO: 2, um fragmento imunogênico de SEQ ID NO: 3, um fragmento imunogênico de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10.

20. Vetor de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 19, caracterizado pelo polipeptídeo HMGB1 ser selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 30.

21. Vetor de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 20, caracterizado pelo vetor de vacina ser formulado para ser administrado por via oral ou intranasal.

22. Vetor de vacina, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo vetor de vacina não ser capaz de se replicar no indivíduo ou ser inativado ou morto antes da administração ao indivíduo.