EA023058B1

EA023058B1 - Вакцинные векторы и способы усиления иммунных ответов

Info

Publication number: EA023058B1
Application number: EA201290675A
Authority: EA
Inventors: Люк Бергман; Уолтер Боттдж; Билли Харджис; Шеррилл Лейтон
Original assignee: Дзе Борд Оф Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Арканзас; Дзе Тексас Эй Энд Эм Юниверсити Систем
Priority date: 2010-01-21
Filing date: 2011-01-21
Publication date: 2016-04-29
Also published as: EP2525817A1; EA201290675A1; PL2525817T3; CN102811734A; ES2643646T3; AU2011207331B2; ZA201205824B; JP2018039843A; NO2525817T3; UA110024C2; US9913893B2; CL2012002016A1; MX2012008506A; PT2525817T; WO2011091255A1; CA2787661A1; CO6561819A2; US20120282291A1; JP2016117757A; AU2011207331C1

Abstract

В изобретении представлены вакцинные векторы, включающие антигенный полипептид и полипептид HMGB1, которые присутствуют на поверхности вакцинного вектора. Композиции, включающие вакцинные векторы, также представляются и включают фармацевтически приемлемый носитель, соответственно носитель для орального или интраназального введения. Также представлены способы усиления иммунных ответов, в частности гуморального иммунного ответа и соответственно продукции IgA, посредством введения субъекту вакцинных векторов или композиций, раскрытых в изобретении.

Description

Эта заявка на патент притязает на приоритет предварительной заявки на патент США № 61/297098, поданной 21 января 2010 г., которая включена сюда посредством ссылки в ее полном объеме.

Введение

Вакцины используются для вызова адаптивного иммунного ответа против антигенов, в частности антигенов патогенов, опухолевых клеток или т.п., для уменьшения интенсивности или предотвращения заболевания. Синтетические пептиды или вакцины на основе убитых или аттенуированных микроорганизмов являются часто эффективными в стимулировании сильного иммунного ответа, который является полностью протективным. В некоторых случаях эти вакцины не являются протективными или являются лишь частично протективными, и другие стратегии должны применяться для разработки протективных вакцин. Вакцины на основе аттенуированных микроорганизмов также связаны с рисками переноса генов или исправления мутаций и могут представлять риск для индивидуумов с ослабленным иммунитетом. Необходима разработка новых вакцин, которые являются безопасными и эффективными в стимулировании длительных протективных иммунных ответов.

Инфицирование вирусом гриппа, в частности вирусом птичьего гриппа Η5Ν1, представляет собой растущую проблему в области здравоохранения и экономики. Факты явно указывают на то, что Η5Ν1 продолжает циркулировать между чувствительными птицами и свиньями в расширяющихся областях всего мира. Многие ученые полагают, что в случае оставления без сдерживания существующий сегодня вирус птичьего гриппа Η5Ν1 мутирует с созданием возможности для передачи от человека к человеку и вызовом всемирной пандемии. При коэффициенте смертности, превышающем 50%, такое появление эпидемии будет ужасающим. Независимо от способности вируса к вызову заболевания у человека вирус птичьего гриппа Η5Ν1 уже угрожает большим ударом по экономике вследствие уничтожения стай домашних птиц в пораженных областях. Поэтому необходима разработка вакцины для защиты людей, домашней птицы, свиней и других одомашненных животных от вируса гриппа Η5Ν1. Вакцина против гриппа, которая способна защитить от Η5Ν1, а также от других вирусов гриппа, таких как Η1Ν1, будет оптимальной.

Краткое изложение сущности изобретения

Здесь предоставляются вакцинные векторы, способы стимулирования иммунного ответа и способы снижения заболеваемости, связанной с инфицированием вирусом гриппа. В одном аспекте предоставляется вакцинный вектор, включающий антигенный полипептид и полипептид ΗΜΟΒ1 или его функциональный фрагмент. По крайней мере часть антигенного полипептида и по крайней мере полипептида ΗΜΟΒ1 присутствуют на поверхности вакцинного вектора. Вакцинный вектор может включать первый полинуклеотид, кодирующий антигенный полипептид, и второй полинуклеотид, кодирующий полипептид ΗΜΟΒ1. Полипептид ΗΜΟΒ1 и антигенный полипептид могут быть связаны, например, в гибридном белке. Как полипептид ΗΜΟΒ1, так и антигенный полипептид могут быть вставлены в поверхностный петлевой участок трансмембранного белка.

В другом аспекте предоставляется композиция, включающая вакцинный вектор и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемый носитель может быть приемлемым для орального или интраназального применения. Вакцинный вектор может быть не способен к репликации.

В еще одном аспекте предоставляется вакцинный вектор ΒααίΙΙιΐΒ врр. Вакцинный вектор включает первую полинуклеотидную последовательность, кодирующую антигенный полипептид, представляемый на поверхности вакцинного вектора, и вторую полинуклеотидную последовательность, кодирующую иммуностимулирующий полипептид, представляемый на поверхности вакцинного вектора. Антигенным полипептидом может быть полипептид М2е вируса гриппа, полипептид НА вируса гриппа или полипептид ΝΡ вируса гриппа или их комбинация. Иммуностимулирующим полипептидом может быть полипептид СП 154 или полипептид ΗΜΟΒ1 или их комбинация. Иммуностимулирующий полипептид и антигенный полипептид могут быть связаны, например, в гибридном белке, и могут быть включены в поверхностный петлевой участок трансмембранного белка.

Те не менее, в другом аспекте предоставляются способы усиления иммунного ответа у субъекта. В этом способе предоставляемые здесь вакцинные векторы или композиции вводят субъекту в количестве, эффективном для усиления иммунного ответа у субъекта против антигенного полипептида. Соответственно, когда вакцинный вектор вводят орально или интраназально.

В дальнейшем аспекте предоставляются способы усиления иммунного ответа у субъекта посредством введения вакцинного вектора ΒααίΙΙιΐΒ врр., описываемого здесь. Вакцинный вектор включает первую полинуклеотидную последовательность, кодирующую антигенный полипептид, представляемый на поверхности вакцинного вектора, и вторую полинуклеотидную последовательность, кодирующую иммуностимулирующий полипептид, представляемый на поверхности вакцинного вектора. Антигенным полипептидом может быть полипептид М2е вируса гриппа, полипептид НА вируса гриппа, полипептид ΝΡ вируса гриппа или их комбинация. Иммуностимулирующим полипептидом может быть полипептид СЭ154. полипептид ΗΜΟΒ1 или их комбинация.

Те не менее, в дальнейшем аспекте предоставляются способы снижения связанной с вирусом гриппа заболеваемости у субъекта. В этих способах введение раскрытых здесь вакцинных векторов или ком- 1 023058 позиций снижает заболеваемость, связанную с последующим инфицированием вирусом гриппа.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет собой диаграмму, на которой представлены отношения δ/Р (образца к положительному контролю), полученные в ЕЬ1§Л для продукции специфичных для М2е антител цыплятами после орального введения через зонд указанной дозы вакцинного вектора ВаеШик киЫШк, экспрессирующего эпитопы белков вируса гриппа А и либо НМОВ1, либо СЭ154, по сравнению с цыплятами, вакцинированными солевым раствором.

Фиг. 2 представляет собой диаграмму, на которой представлены отношения δ/Р, полученные в ЕЬ1δΛ для продукции специфичных для НАЕВ антител цыплятами после орального введения через зонд указанной дозы вакцинного вектора ВаеШик киЫШк, экспрессирующего эпитопы белков вируса гриппа А и либо НМОВ1, либо СЭ154, по сравнению с цыплятами, вакцинированными солевым раствором.

Фиг. 3 представляет собой диаграмму, на которой представлены отношения δ/Р, полученные в ЕЬ1δΑ для продукции специфичных для НАИА антител цыплятами после орального введения через зонд указанной дозы вакцинного вектора ВаеШик киЫШк, экспрессирующего эпитопы белков вируса гриппа А и либо НМОВ1, либо СЭ154, по сравнению с цыплятами, вакцинированными солевым раствором.

Фиг. 4 представляет собой диаграмму, на которой представлены отношения δ/Р, полученные в ЕЬ1δΑ для продукции специфичных для М2е антител цыплятами после орального введения через зонд указанной дозы живых или различных образом инактивированных вакцинных векторов ВаеШик киЬййк, экспрессирующих эпитопы белков вируса гриппа А и либо НМОВ1, либо СЭ154, по сравнению с цыплятами, вакцинированными лишь ВаеШик вектором (ВδВВ).

Фиг. 5 представляет собой диаграмму, на которой представлены отношения δ/Р, полученные в ЕЬ1δΑ для продукции специфичных для НАЬВ антител цыплятами после орального введения через зонд указанной дозы живых или различных образом инактивированных вакцинных векторов ВаеШик киЫШк, экспрессирующих эпитопы белков вируса гриппа А и либо НМОВ1, либо СЭ154, по сравнению с цыплятами, вакцинированными лишь ВаеШик вектором (ВδВВ).

Фиг. 6 представляет собой диаграмму, на которой представлены отношения δ/Р, полученные в ЕЬ1δΑ для продукции специфичных для НАИА антител цыплятами после орального введения через зонд указанной дозы живых или различных образом инактивированных вакцинных векторов ВаеШик киЫШк, экспрессирующих эпитопы белков вируса гриппа А и либо НМОВ1, либо СЭ154, по сравнению с цыплятами, вакцинированными лишь ВаеШик вектором (ВδВВ).

Фиг. 7 представляет собой диаграмму, на которой представлены отношения δ/Р, полученные в ЕЬ1δΑ для продукции специфичных для М2е антител класса 1§О цыплятами после орального введения через зонд либо 10⁶ живых, либо различных указанных доз инактивированных формалином вакцинных векторов ВаеШик киЫШк, экспрессирующих эпитопы белков вируса гриппа А и НМОВ1, по сравнению с цыплятами, вакцинированными лишь ВаеШик вектором (ВδВВ).

Фиг. 8 представляет собой диаграмму, на которой представлены отношения δ/Р, полученные в ЕЬ1δΑ для продукции специфичных для М2е антител класса 1дА цыплятами, вакцинированными либо орально, либо подкожно, 10⁶ живых, инактивированных формалином или инактивированных формалином и лиофилизированных вакцинных векторов ВаеШик киЬйНк, экспрессирующих эпитопы белков вируса гриппа А и НМОВ1, по сравнению с цыплятами, вакцинированными лишь ВаеШик вектором (ВδВВ).

Фиг. 9 представляет собой диаграмму, на которой представлены отношения δ/Р, полученные в ЕЬ1δΑ для продукции специфичных для М2е антител класса 1дА цыплятами, вакцинированными либо орально, либо подкожно, 10⁶ живых, инактивированных формалином или инактивированных формалином и лиофилизированных вакцинных векторов ВаеШик киЬйНк, экспрессирующих эпитопы белков вируса гриппа А и НМОВ1, по сравнению с цыплятами, вакцинированными лишь ВаеШик вектором (ВδВВ).

Подробное описание настоящего изобретения

Технологии рекомбинантных ДНК обеспечивают возможность для относительно легкой манипуляции многими бактериальными и вирусными видами. Некоторые бактерии и вирусы либо являются по своей природе малопатогенными или непатогенными, но остаются способными к вызову сильного иммунного ответа, либо их можно подвергнуть отбору на такое свойство или создать такими. Эти бактерии и вирусы порождают привлекательные вакцинные векторы для вызова иммунного ответа против гетерологичных или чужеродных антигенов. Бактериальные или вирусные вакцинные векторы могут имитировать природную инфекцию и вызывать сильный и длительно сохраняемый иммунитет. Часто производство и введение вакцинных векторов являются относительно недорогими. Кроме того, такие векторы могут часто содержать более одного антигена и могут обеспечить защиту от множества инфекционных агентов.

Вакцинные векторы в виде живых бактерий или вирусов могут, тем не менее, представлять риск для индивидуумов с ослабленным иммунитетом и в их случае требуется дополнительное регулятивное рассмотрение. Поэтому желательным является применение векторов, которые являются убитыми или инактивированными или квалифицируются как организмы, которые обычно считаются безопасными (ΟΚΛδ), Управлением по контролю за продуктами и лекарствами (ЕЭА). Проблемой является вызов сильного иммунного ответа, используя такие векторы. Как продемонстрировано в примерах, посредст- 2 023058 вом размещения полипептидов НМСВ1 (амфотеринов, белков В1 из группы белков с высокой подвижностью) на поверхности вакцинного вектора авторы настоящего изобретения могут вызвать сильный иммунный ответ против антигенных полипептидов, используя вектор ВасШик крр. На самом деле, в примерах демонстрируется, что этот вектор можно подвергнуть инактивации, так что он не может реплицироваться, используя множество способов, и, тем не менее, может вызывать сильный иммунный ответ после введения.

Здесь предоставляются вакцинные векторы, включающие антигенный полипептид и полипептид НМСВ1 или его функциональный фрагмент. По крайней мере часть антигенного полипептида и по крайней мере часть полипептида НМСВ 1 или его функционального фрагмента присутствуют на поверхности вакцинного вектора. Вакцинный вектор может включать первый полинуклеотид, кодирующий антигенный полипептид, и второй полинуклеотид, кодирующий полипептид НМСВ1. Полипептид НМСВ1 и антигенный полипептид могут быть связаны, например, в гибридном белке, или могут экспрессироваться по отдельности. Как полипептид НМСВ1, так и антигенный полипептид могут быть включены в поверхностный петлевой участок трансмембранного белка.

Вакцинные векторы могут быть бактериальными, вирусными векторами или векторами на основе липосом. Потенциальные вакцинные векторы включают, но без ограничения, ВасШик (ВасШик киЪййк), 8а1тоие11а (8а1тоие11а ейегШШк), 8Шде11а, ЕксйейсЫа (Е. сой), Усгкийа. ВогНс1с11а. йасЮсоссик. 8йерЮсоссик, УШйо (УШйо сйо1егае), ЫЧейа, аденовирус, поксвирус, вирус герпеса, альфавирус и аденоассоциированный вирус. Соответственно, когда вакцинным вектором является СКЛ8 организм, вакцинный вектор может быть инактивированным или убитым, так что он не способен к репликации. Способы инактивации или убивания бактериальных или вирусных вакцинных векторов известны квалифицированным в данной области техники специалистам и включают, но без ограничения, такие способы, как те, которые приведены в примерах, т.е. инактивацию формалином, основанную на антибиотиках инактивацию, термическую обработку и обработку этанолом.

Антигенным полипептидом является полипептид, который может специфически распознать адаптивная иммунная система. Антигенный полипептид включает любой полипептид, который является иммуногенным. Антигенные полипептиды включают, но без ограничения, антигены, которые относятся к патогенам, относятся к аллергенам, опухолям или связаны с заболеванием. Патогены включают вирусные, паразитические, грибковые и бактериальные патогены, а также белки-патогены, такие как прионы. Антигенными полипептидами могут быть полноразмерные белки или их части. Хорошо известно, что распознавание иммунной системой многих белков основано на относительно небольшом числе аминокислот, часто называемом эпитопом. Эпитопы могут представлять собой лишь 8-10 аминокислот. Таким образом, описываемые здесь антигенные полипептиды могут представлять собой полноразмерные белки, эпитопы длиной 8 аминокислот или любой участок между этими пределами. В действительности, антигенные полипептиды могут включать более одного эпитопа одиночного патогена или белка.

В вакцинный вектор могут быть включено множество копий одного и того же эпитопа или множество эпитопов различных белков. Предусматривается, что несколько эпитопов или антигенов, связанных с одним и тем же патогеном или заболеванием или различными патогенами или заболеваниями, могут вводиться вместе в одном вакцинном векторе для вызова усиленного иммунного ответа против множества антигенов. Рекомбинантные вакцинные векторы могут кодировать антигены множества патогенных микроорганизмов, вирусов или опухолевоспецифических антигенов. Введение вакцинных векторов, способных экспрессировать множество антигенов, способствует вызову иммунитета к двум или более заболеваниям в одно и то же время.

Антигенным полипептидом может быть полипептид вируса гриппа соответственно, когда им является полипептид вируса гриппа штамма Н5Ы1 или полипептид, ассоциируемый с множеством штаммов вируса гриппа, такой как полипептид белка М2 вируса гриппа. Эктодомен белка М2 вируса гриппа А, известный как М2е, выпячивается с поверхности вируса. М2е - часть белка М2 содержит приблизительно 24 аминокислоты. Полипептид М2е незначительно варьируют от одного изолята к другому изоляту вируса гриппа. На самом деле, лишь несколько встречающихся в природе мутаций в М2е было обнаружено в изолятах от инфицированных людей с момента эпидемии гриппа в 1918. Кроме того, вирусы гриппы, выделенные из организмов-носителей, являющихся птицами и свиньями, имеют различные, однако консервативные, последовательности М2е. Для просмотра последовательностей полипептидов М2е, выделенных из организмов-носителей, являющихся людьми, птицами и свиньями, см. Ьш е1 а1., МюгоЪек апй 1и£есйоп 7: 171-177 (2005) и РеШ е! а1., I. Уйо1. 76: 10717-10723 (2002), каждый из которых включен сюда посредством ссылки в его полном объеме (см. также 8ЕЦ ГО N0: 1-4.

Соответственно, когда весь полипептид М2е включают в вакцинный вектор или может использоваться лишь часть, в примерах полипептид из восьми аминокислот (ЬМ2, имеющий аминокислотную последовательность ЕУЕТРГОН 8ЕЦ ГО N0:5, или его вариант М2еА, имеющий аминокислотную последовательность ЕУЕТРТВИ 8ЕЦ ГО N0:6) был включен в вакцинный вектор и, как показано, вызывал гуморальный иммунный ответ после введения цыплятам. Соответственно, когда часть полипептида М2е, включенная в вакцинный вектор, является иммуногенной, иммуногенным фрагментом является пептид или полипептид, способный к вызову клеточных или гуморальных иммунных ответов. Соответственно

- 3 023058 иммуногенным фрагментом М2е может быть полноразмерный полипептид М2е или соответственно он может представлять собой 20 или более аминокислот, 15 или более аминокислот, 10 или более аминокислот или 8 или более аминокислот полной последовательности.

Другие эпитопы, подходящие для включения в вакцинный вектор против вируса гриппа А, включают, но без ограничения, полипептиды гемагглютинина (НА) или ядерного белка (ΝΡ) вируса гриппа А. Например, пептиды 5>ЕО ГО N0:7, 5>Е0 ГО N0:8, 5>Е0 ГО N0:9 или 5>Е0 ГО N0:10 могут быть включены в вакцинный вектор. В примерах 5>Е0 ГО N0:7 (НАИА) и 5>Е0 ГО N0:8 (НАЬВ) были включены в вакцинный вектор и, как показано, вызывали гуморальный иммунный ответ после введения цыплятам (см. фиг. 2, 3 и 5, 6. Кроме того, эпитопы № - 5>Е0 ГО N0:9 (№54) и 5>Е0 ГО N0:10 (N0147) были включены в вакцинный вектор в примерах. Квалифицированному в данной области техники специалисту будет понятно, что любая из этих последовательностей может использоваться в комбинации с любым другим эпитопом, в том числе с эпитопами, происходящими из других патогенов или антигенов.

Белок НМ0В1 (амфотерин, белок В1 из группы белков с высокой подвижностью) был сначала идентифицирован как ДНК-связывающий белок, важный для структуры и стабильности ДНК. Он является повсеместно экспрессируемым ядерным белком, который связывается с ДНК без специфичности в отношении ее последовательности. Этот белок является высококонсервативным и обнаруживается в растениях вплоть до млекопитающих. Аминокислотные последовательности НМОВ1 данио, цыпленка и человека представлены в 5>Е0 ГО N0:30, 5>Е0 ГО N0:18 и 5>Е0 ГО N0:29 соответственно. Последовательность для всех млекопитающих является высококонсервативной, при этом идентичность последовательностей составляет 98%, и аминокислотные замены являются консервативными. Поэтому белок НМОВ1 одного вида может, вероятно, функционально замещать белок другого вида. Полноразмерный белок НМОВ1 или его часть могут использоваться в качестве полипептида НМОВ1 в описываемых здесь вакцинных векторах. НМОВ1 имеет два ДНК-связывающий района, называемых блоком А, представленным в 5>Е0 ГО N0:23 и 24, и блоком В, представленным в 5>Е0 ГО N0:25 и 26 (см. Апйеткюп апй Тгасеу, Аппи. Кеу. 1ттипо1. 2011, 29: 139-162, который включен сюда посредством ссылки в его полном объеме.

НМОВ1 является медиатором воспаления и выполняет функцию сигнала ядерного повреждения, например, от некротических клеток. НМОВ1 может также активно секретироваться клетками моноцитарной/макрофагальной линии дифференцировки в ходе процесса, для которого необходимы ацетилирование белка, передвижение через ядро и секреция. Экстраклеточный НМОВ1 функционирует в качестве сильного медиатора воспаления посредством передачи сигналов через рецептор для конечных продуктов усиленного гликозилирования (КАОЕ) и через члены семейства То11-подобных рецепторов (ТЬК), в частности ТЬК4. Активность связывания с КАОЕ была идентифицирована, и для нее требуется полипептид 5>Е0 ГО N0: 27. Для связывания с ТЬК4 требуется цистеин в положении 106 5>Е0 ГО N0:18, который обнаруживается в районе блока В НМОВ1.

Для воспалительных активностей НМОВ1 не требуется полноразмерный белок, и были идентифицированы функциональные фрагменты. Установлено, что блок В достаточен, чтобы опосредовать провоспалительные эффекты НМОВ1, и поэтому 5>Е0 ГО N0:25 и 26 являются полипептидами НМОВ1 или его функциональными фрагментами в контексте настоящего изобретения. Кроме того, сайт связывания с КАОЕ и провоспалительная цитокиновая активность были картированы в 5>Е0 ГО N0:27 и 5>Е0 ГО N0:28 соответственно. Таким образом, эти полипептиды являются функциональными фрагментами полипептидов НМОВ1 в контексте настоящего изобретения.

Квалифицированные в данной области техники специалисты могут идентифицировать полипептиды НМОВ1 и их фрагменты, способные к стимулированию провоспалительной цитокиновой активности, используя такие способы, как те, которые описаны в публикации международной заявки с № ^002/092004. которая включена сюда посредством ссылки в ее полном объеме. Соответственно, когда полипептид НМОВ1 включает КАОЕ-связывающий домен в положениях 150-183 аминокислот 5>Е0 ГО N0:18 (5>Е0 ГО N0:27 или его гомолог) и домен провоспалительной цитокиновой активности между аминокислотами 89-109 5>Е0 ГО N0:18 (5>Е0 ГО N0:28 или его гомолог). В частности, полипептиды НМОВ1 и их функциональные фрагменты или гомологи включают полипептиды, идентичные или идентичные на по крайней мере 99%, по крайней мере 98%, по крайней мере 95%, по крайней мере 90%, по крайней мере 85% или по крайней мере 80% полипептидам НМОВ1 с 5>Е0 ГО N0:18 или 23-30.

По крайней мере часть антигенного полипептида и по крайней мере часть полипептида НМОВ1 присутствуют на поверхности вакцинного вектора. Присутствующие на поверхности вакцинного вектора полипептиды включают полипептиды, которые включены в трансмембранный белок, взаимодействуют, ковалентно или химически сшиты, с трансмембранным белком, мембранным липидом или прикрепленным к мембране углеводом. Полипептид можно включить в трансмембранный белок, связав аминокислоты, включающие полипептид, через пептидную связь с ^концом, С-концом трансмембранного белка или где-нибудь в нем (т.е. включив между двумя аминокислотами трансмембранного белка или вместо одной или более аминокислот трансмембранного белка (т.е. посредством делеции-вставки). Соответственно полипептиды можно включить в поверхностный петлевой участок трансмембранного белка. Подходящими трансмембранными белками являются со!В и 1атВ, но квалифицированным в данной области техники специалистам будет понятно, что в наличие имеется множество подходящих трансмембранных

- 4 023058 белков.

Альтернативно, полипептиды можно ковалентно или химически связать с белками, липидами или углеводами в мембране, или капсидом в случае использования вирусного вектора, посредством способов, имеющихся в распоряжении квалифицированных в данной области техники специалистов. Например, дисульфидные связи или перекрестное сшивание биотина с авидином можно было бы использовать для представления антигенного полипептида и полипептида НМСВ1 на поверхности вакцинного вектора. Соответственно, когда антигенный полипептид и полипептид НМСВ1 являются частью гибридного белка. Два полипептида можно непосредственно соединить через пептидную связь, или они могут быть разделены линкером или районом третьего белка, в который их включают.

Полинуклеотиды, кодирующие антигенный полипептид или полипептид НМСВ1, можно ввести в вакцинный вектор и экспрессировать с созданием антигенного полипептида и полипептида НМСВ1. Полинуклеотиды можно встроить в хромосому вакцинного вектора, или они могут кодироваться на плазмидах или другой экстрахромосомной ДНК. Соответственно полинуклеотиды, кодирующие антигенный полипептид и/или полипептид НМСВ1, могут экспрессироваться независимо или они встроены в полинуклеотид вакцинного вектора, который экспрессируется. Соответственно, когда полинуклеотид вакцинного вектора кодирует полипептид, представляемый на поверхности вакцинного вектора, такой как трансмембранный белок, полинуклеотид, кодирующий антигенный полипептид и/или полипептид НМСВ1, можно встроить в полинуклеотидную последовательность вакцинного вектора, чтобы сделать возможным представление антигенного полипептида и/или полипептида НМСВ 1 на поверхности вектора. Например, полинуклеотид, кодирующий антигенный полипептид и полипептид НМСВ1, можно встроить в рамке считывания в бактериальный полинуклеотид в районе, кодирующем поверхностный петлевой участок трансмембранного белка, из условия, чтобы бактериальная полинуклеотидная последовательность оставалась в рамке считывания (см. пример 1).

Альтернативно, полинуклеотид, кодирующий антигенный полипептид и/или полипептид НМСВ1, можно встроить в полинуклеотид секретируемого полипептида, который представляется на поверхности вакцинного вектора благодаря связи с белком, липидом или углеводом на поверхности вакцинного вектора. Квалифицированным в данной области техники специалистам будет понятно, что полинуклеотид, кодирующий антигенный полипептид и/или полипептид НМСВ1, можно было бы встроить в широкий ряд полинуклеотидов вакцинного вектора для обеспечения экспрессии и представления антигенного полипептида и/или полипептида НМСВ1 на иммуноцитах субъекта, подвергаемого вакцинотерапии. В примерах несколько эпитопов белков вируса гриппа, включающих эпитоп М2е, эпитоп НА и эпитоп ΝΡ, были экспрессированы с плазмиды для экспрессии в вегетативных клетках в ВасШик киМШк. Результирующие рекомбинантные бактерии экспрессируют включенные эпитопы, что показано с помощью иммунного ответа, представленного на фиг. 1-6.

В примерах вакцинные векторы содержат антигенные полипептиды (полипептиды М2е, НА и ΝΡ) и иммуностимулирующий полипептид (либо СЭ154. либо НМСВ1), кодируемые одним и тем полинуклеотидом и в рамке считывания друг с другом. В альтернативных вариантах осуществления иммуностимулирующий полипептид и антигенный полипептид могут кодироваться отдельными полинуклеотидами. Квалифицированным в данной области техники специалистам будет понятно, что множество способов может использоваться для достижения представленности антигенного полипептида и полипептида НМСВ1 на поверхности вакцинного вектора. Такие способы известны квалифицированным в данной области техники специалистам.

Также предоставляются композиции, включающие вакцинный вектор и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемым носителем является любой носитель, подходящий для ίη νίνο введения. Соответственно, когда фармацевтически приемлемый носитель является приемлемым для оральной, интраназальной доставки или доставки через слизистую оболочку, фармацевтически приемлемый носитель может включать воду, забуференные растворы, растворы глюкозы или жидкие среды для культивирования бактерий.

Дополнительные компоненты композиций могут соответственно включать наполнители, такие как стабилизаторы, консерванты, разбавители, эмульгаторы и смазки. Примеры фармацевтически приемлемых носителей или разбавителей включают стабилизаторы, такие как углеводы (например, сорбит, маннит, крахмал, сахароза, глюкоза, декстран), белки, такие как альбумин или казеин, белоксодержащие агенты, такие как бычья сыворотка или снятое молоко, и буферы (например, фосфатный буфер). Особенно в случае добавления таких стабилизаторов к композициям композиция подходит для сушки сублимацией или сушки распылением. Вакцинный вектор в композициях может быть неспособен к репликации соответственно, когда вакцинный вектор инактивируют или убивают до добавления в композицию.

Описываемые здесь композиции могут использоваться для усиления иммунного ответа, такого как продукция антител против антигенного полипептида. Композиции, содержащие полипептиды вируса гриппа, могут также использоваться для снижения заболеваемости, связанной с последующим инфицированием вирусом гриппа. Композиции могут предотвращать вызов вирусом гриппа заболевания или любой связанной заболеваемости у субъекта, которому введены композиции или вакцинные векторы, описываемые здесь. Описываемые здесь композиции и вакцинные векторы могут уменьшать тяжесть

- 5 023058 последующего заболевания в результате уменьшения продолжительности заболевания, снижения коэффициента заболеваемости или смертности, связанной с заболеванием, или уменьшения вероятности заражения. Заболеваемость и смертность, связанная с заболеванием, после введения описываемых здесь вакцинных векторов могут снизиться на 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или даже 100% по сравнению с подобными субъектами, которым не предоставлен вакцинный вектор.

Также предоставляются способы усиления иммунных ответов у субъекта посредством введения вакцинного вектора. Вакцинный вектор может содержать полипептид НМСВ1, способный к стимулированию иммунного ответа против вакцинного вектора и связанного с ним антигенного полипептида. Вакцинный вектор, включающий полипептид НМСВ1, вводят субъекту в количестве, эффективном для усиления иммунного ответа у субъекта против вакцины, в частности антигенного полипептида. Соответственно, когда вакцинный вектор содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, включающий аминокислоты 150-183 и 89-109 полипептида НМСВ1 (ЗЕО ГО N0:18), или его гомолог, в примерах используется полипептид из 190 аминокислот НМОВ1. Соответственно, когда полинуклеотид кодирует полипептид НМОВ1 вида, одинакового с видом субъекта, гетерологичные комбинации полипептидов НМОВ1 и субъектов (т.е. полипептид НМОВ1 человека для применения в вакцине для цыплят) могут применяться в способах настоящего изобретения, поскольку НМОВ1 является высококонсервативным для широкого ряда видов. Полипептид НМОВ 1 может использоваться для усиления иммунного ответа у субъекта, направленного на любой чужеродный антиген или антигенный полипептид, присутствующий в вакцинном векторе или на нем. Квалифицированному в данной области техники специалисту будет понятно, что полипептид НМОВ1 мог бы использоваться для усиления иммунного ответа против более одного антигенного полипептида, присутствующего в вакцинном векторе. Полипептид из НМОВ1 стимулирует иммунный ответ, по крайней мере, частично в результате активации дендритных клеток и макрофагов и, следовательно, стимулирования продукции цитокинов, таких как ГО-1, ГО-6, ΙΡΝ- γ и ΤΝΡ-α. В примерах полипептид НМОВ1 представлен на поверхности вакцинного вектора.

Кроме того, раскрываются способы усиления иммунного ответа против вируса гриппа А и способы снижения заболеваемости, связанной с последующим инфицированием вирусом гриппа А. Вкратце, способы включают введение субъекту вакцинного вектора, включающего эпитоп белка вируса гриппа А (антигенный полипептид вируса гриппа), способный к вызову иммунного ответа, в количестве, эффективном для вызова иммунного ответа. Эпитопом белка вируса гриппа А может быть полипептид М2е, полипептид НА, или полипептид ΝΡ, или другой полипептид вируса гриппа, обсуждавшийся выше. Включение антигенных полипептидов в вакцинный вектор можно выполнить множеством способов, известных квалифицированным в данной области техники специалистам, включающих, но без ограничения, систему сайт-направленного мутагенеза, не оставляющего глубоких следов, описанную в публикации международной заявки на патент с № \70 2008/036675. Можно также создать бактерию, которая экспрессирует полипептиды вируса гриппа, в сочетании с полинуклеотидами, способными к усилению иммунного ответа, обсуждавшимися выше. В частности, полипептид СГО154 или НМОВ1 может экспрессироваться вакцинным вектором для усиления иммунного ответа у субъекта против полипептидов вируса гриппа. В примерах демонстрируется вызов обильной продукции 1дА и 1дО на вакцинацию у цыплят. Авторы настоящего изобретения предполагают, что такой сильный ответ будет предохранять от заболеваемости, связанной с последующим инфицированием или заражением источником антигенного полипептида (вирусом гриппа в примерах), или по крайней мере снижать ее.

Композиции можно вводить множеством способов, в том числе, но без ограничения, орально, интраназально или через слизистую оболочку. Например, доставку композиций или вакцинных векторов можно осуществить с использованием аэрозоля посредством распыления, посредством добавления в пищевые продукты или воду, посредством орального введения через зонд или через глазные капли. В некоторых вариантах осуществления композиции вводят посредством инъекции, например, внутрикожно, парентерально, подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно, интракраниально или внутримышечно. В случае цыплят или другой домашней птицы композиции можно вводить в яйцо.

Субъекты включают, но без ограничения, позвоночных, соответственно млекопитающих, соответственно человека, коров, кошек, собак, свиней, или птиц, соответственно домашнюю птицу, такую как цыплята. Могут также использоваться другие модели инфекционного заболевания на животных. Усиление иммунного ответа включает, но без ограничения, вызов терапевтического или профилактического эффекта, опосредуемого иммунной системой субъекта. В частности, усиление иммунного ответа может включать увеличенную продукцию антител, например, продемонстрированную на фиг. 1-3, увеличенное переключение класса - переключение синтеза тяжелых цепей антител, например, продукцию 1дА, продемонстрированную на фиг. 8, созревание антигенпрезентирующих клеток, стимуляцию Т-клетокхелперов, стимуляцию цитолитических Т-клеток или индукцию Т- и В-клеточной иммунологической памяти.

Дозы, применимые для ведения, будут варьировать в зависимости от возраста, веса и вида субъекта, способа и пути введения и типа патогена или заболевания, против которого требуется иммунный ответ. Композицию можно вводить в любой дозе вакцинного вектора, достаточной для вызова иммунного ответа. Предусматривается, что подходящими являются дозы в диапазоне от 10³ до 10¹⁰ копий вектора (т.е.

- 6 023058 бляшкообразующих или колониеобразующих единиц), от 10⁴ до 10⁹ копий вектора или от 10⁵ до 10⁷ копий вектора.

Композицию можно вводить только один раз или ее можно вводить два или более раз для увеличения иммунного ответа. Например, композицию можно вводить два или более раз с интервалами, составляющими одну неделю, две недели или три недели, один месяц, два месяца, три месяца, шесть месяцев или более. Бактерии могут быть жизнеспособными перед введением, но в некоторых вариантах осуществления бактерии могут быть убитыми или инактивированными перед введением. В некоторых вариантах осуществления бактерии могут быть способными к репликации в организме субъекта, в то время как в других вариантах осуществления бактерии могут быть неспособными к репликации в организме субъекта. Как продемонстрировано в примерах, бактериальные вакцинные векторы можно инактивировать до введения, используя формалин, этанол, нагревание или антибиотики. Квалифицированному в данной области техники специалисту будет понятно, что другие способы инактивации вакцинных векторов могли бы также использоваться.

Здесь также предоставляется вакцинный вектор ВасШик крр. ВасШик вакцинный вектор включает первую полинуклеотидную последовательность, кодирующую антигенный полипептид, и вторую полинуклеотидную последовательность, кодирующую иммуностимулирующий полипептид. Антигенный полипептид и иммуностимулирующий полипептид присутствуют на поверхности ВасШик вакцинного вектора, описанного выше. Антигенным полипептидом является полипептид вируса гриппа, описанный выше, а иммуностимулирующим полипептидом является полипептид НМСВ1, описанный выше, или полипептид ΟΌ154.

Полинуклеотиды, кодирующие иммуностимулирующие полипептиды, которые гомологичны белкам субъекта и способны к стимулированию ответа иммунной системы на антигенный полипептид, могут быть также введены в вакцинный вектор. Как описано подробнее в примерах, вакцинный вектор может включать полипептид СЭ154. который способен к связыванию СЭ40 у субъекта и стимулированию ответа субъекта на вакцинный вектор и связанный с ним антигенный полипептид, подобно НМСВ1, описанному выше. ВасШик вакцинный вектор может включать полипептид НМСВ1, полипептид СЭ154 или их комбинацию. Как описано выше, полинуклеотиды, кодирующие эти полипептиды, могут быть встроены в хромосому вакцинного вектора или сохраняться вне хромосомы. Квалифицированному в данной области техники специалисту будет понятно, что эти полипептиды могут быть включены в ряд полипептидов вакцинного вектора и представлены в различных частях вакцинного вектора или могут секретироваться.

Полинуклеотид, кодирующий иммуностимулирующий полипептид, способный к усилению иммунного ответа против антигенного полипептида, может также кодировать антигенный полипептид. Полинуклеотид, кодирующий иммуностимулирующий полипептид, может быть связан с полинуклеотидом, кодирующим антигенный полипептид, например, в вакцинном векторе иммуностимулирующий полипептид и антигенный полипептид кодируются одним и тем же полинуклеотидом. В примерах полинуклеотид, кодирующий полипептид СЭ154, который способен к связыванию СЭ40, или НМСВ1, также кодирует эпитоп М2е, эпитоп НА и эпитоп ΝΡ вируса гриппа А (см. ЗЕО ГО N0:19-22). В примерах как полинуклеотид, кодирующий эпитопы белков вируса гриппа, так и полинуклеотид, кодирующий иммуностимулирующий полипептид, экспрессируются с плазмиды для экспрессии в вегетативных клетках. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды встроены в ген со1В или другой ген, кодирующий белок, представляемый на поверхности спор. Квалифицированным в данной области техники специалистам будет понятно, что бактериальные полинуклеотиды, кодирующие другие трансмембранные белки, могут также использоваться.

Как обсуждалось выше, полинуклеотид, кодирующий иммуностимулирующий полипептид, гомологичный белку у субъекта, который способен к усилению иммунного ответа против эпитопа, может быть включен в вакцинный вектор. В примерах ВасШик вакцинный вектор, включающий полинуклеотид, кодирующий либо полипептид СО154, способный к связыванию с СЭ40, либо полипептид НМОВ1, как показано, усиливал иммунный ответ против эпитопа М2е и два отличных эпитопа НА, что определено по увеличению продукции антител в ответ на вакцинацию.

Соответственно, когда длина полипептида СГО154 составляет менее 50 аминокислот, еще более соответственно менее 40, менее 30 или менее 20 аминокислот, длина полипептида может составлять от 10 до 15 аминокислот, от 10 до 20 аминокислот или от 10 до 25 аминокислот. Среди различных видов последовательность СГО154 и СЭ40-связывающий район не являются в высокой степени консервативными. Последовательности СГО154 курицы и человека представлены в ЗЕО ГО N0:11 и ЗЕО ГО N0:12 соответственно.

СЭ40-связывающие районы СГО154 были определены для ряда видов, в том числе человека, курицы, утки, мыши и крупного рогатого скота, и представлены в ЗЕО ГО N0:13, ЗЕО ГО N0:14, ЗЕО ГО N0:15, ЗЕО ГО N0:16, ЗЕО ГО N0:17 соответственно. Хотя существуют вариабельность последовательностей в СЭ40-связывающем районе между видами, в представленных ниже примерах показано, что полипептид СГО154 человека способен к усилению иммунного ответа у цыплят. Следовательно, настоящее изобретение можно осуществить на практике, используя видоспецифичные полипептиды СГО154 или гетероло- 7 023058 гичный полипептид СЭ154. В частности, полипептиды СЭ154 и их функциональные фрагменты или гомологи включают полипептиды, идентичные или идентичные на по крайней мере 99%, по крайней мере 98%, по крайней мере 95%, по крайней мере 90%, по крайней мере 85% или по крайней мере 80% полипептидам СЭ154 с 8ЕО ГО N0:11-17.

ВасШик вакцинный вектор, описываемый здесь, может использоваться в способах усиления иммунного ответа и способах снижения заболеваемости гриппом у субъекта, описанных выше. ВасШик вакцинный вектор может использоваться для изготовления композиций для введения субъектам, таким как те, которые также описаны выше.

Гетерологичные полинуклеотиды, кодирующие антигенные полипептиды, могут быть встроены в бактериальный геном в любом несущественном месте, или альтернативно, их можно переместить на плазмиду, используя хорошо известные в данной области техники способы. Одно место, подходящее для встраивания полинуклеотидов, находится внутри поверхностных частей трансмембранных белков или связано с последовательностями, которые ориентируют гетерологичный полинуклеотид на пути секреции. Примерами гена трансмембранного белка, подходящего для вставки полинуклеотидов, являются ген со!В ВасШик и ген 1атЬ 8а1топе11а.

Гетерологичные полинуклеотиды включают, но без ограничения, полинуклеотиды, кодирующие антигены, отбираемые из патогенных микроорганизмов или вирусов, отличных от вакцинного вектора. Такие полинуклеотиды могут происходить от патогенных вирусов, таких как вирус гриппа (например, М2е, гемагглютинин или нейраминидаза), вирусы герпеса (например, гены, колирующие структурные белки вирусов герпеса), ретровирусы (например, оболочечный белок др160), аденовирусы, парамиксовирусы, коронавирусы и т.п. Можно также получить гетерологичные полинуклеотиды из патогенных бактерий, например гены, кодирующие бактериальные белки, такие как токсины или белки наружной мембраны. Кроме того, гетерологичные полинуклеотиды из паразитов, таких как Еипепа. являются привлекательными кандидатами на применение в векторной вакцине.

Дополнительные иммуностимулирующие полипептиды, вовлеченные в приведение в действие иммунной системы, могут быть также включены в вакцинные векторы, описываемые здесь.

Полинуклеотиды могут кодировать молекулы иммунной системы, известные в отношении их стимулирующих эффектов, такие как интерлейкин, фактор некроза опухолей или интерферон, или другой полипептид, вовлеченных в иммунорегуляцию.

Следующие примеры, как подразумевается, являются исключительно иллюстративными и не подразумеваются как ограничения объема настоящего изобретения или прилагаемой формулы изобретения.

Примеры

Пример 1. Конструирование НА/Ж/М2е/сСГО154 и НА/№/М2е/НМОВ1 ВасШик векторов.

Штаммы и условия культивирования.

Все плазмиды сначала сохраняли в клетках Е. сой Т0Р10 (1пуйгодеи, Сат1кЬаб, СА, США), кроме особо оговоренных случаев. ВасШик крр. использовали для введения мутаций (штамм ВасШик киЫШк, РоиШу НеаИй ЬаЬотаЮгу, названный ΝΡ122). Бактерии, содержащие плазмиду ρΌΟΙΕΡ и рНТ10, наращивали при 37°С.

Среду Лурия-Бертани (ЬВ) использовали для обычного наращивания клеток, а среду 80С (ΙπνίΙΐΌдеп, Сат1кЬаб, СА, США) использовали для фенотипического выражения после электропорации. По мере уместности в среду добавляли следующее: изопропил-вГО-тиогалактопиранозид (ΙΡΤΟ) в концентрации 1 мМ, ампициллин (Атр) в концентрации 100 мкг/мл, спектиномицин (8Р) в концентрации 100 мкг/мл и хлорамфеникол (Ст) в концентрации 5 мкг/мл.

Плазмиды.

Плазмиды рЭО1ЕЕ (ВасШик ОепеНс 8Юск Сеп!ег, Со1итЬик, ОН) и рНТ10, использованные в настоящем исследовании, были описаны ранее (2Ьапд е! а1., Шс. АсШк Кекеатсй 2006, 34 (9): 1-8 и Nдиуеη е! а1., Сигг. Мюто. 2007, 55: 89-93). Плазмида рЭО1ЕЕ выполняла функцию матрицы для амплификации гена та/Е, который использовался в качестве промежуточного селектируемого маркера во время манипулирования хромосомой ВасШик. Плазмиду рНТ10 использовали для кодирования и продуцирования гетерологичных последовательностей эпитопов белков вируса птичьего гриппа в ВасШик крр. Эта плазмида содержит ген устойчивости к СМ, ее индукцию осуществляют, добавляя 1 мМ ΙΡΤΟ, и ее сохраняют в ВасШик при 37°С.

Продукция гетерологичных белков для экспрессии в вегетативных клетках:

Плазмиду рНТ10, купленную у МоВюТес/Воса 8с1епШтс, Воса КаЮп, ЕЬ ^диуеп е! а1., 2007), преобразовывали в сайт множественного клонирования при добавлении вставочной последовательности с оптимизацией частоты использования кодонов для ВасШик киЬййк. Проводили секвенирование ДНК для подтверждения правильной вставки последовательности. По-новому модифицированную плазмиду затем трансформировали в ВасШик. Вкратце, культуры ВасШик наращивали в течение ночи при 37°С в среде Н8 (среде Спицайзена, дополненной 0,5% глюкозы, 50 мкг/мл ОЬ-триптофана, 50 мкг/мл урацила, 0,02% гидролизата казеина, 0,1% дрожжевого экстракта, 8 мкг/мл аргинина, 0,1 мкг/мл гистидина, 1 мМ Мд80₄). Ночную культуру (1 мл) использовали для засева в 20 мл среды (среды Спицайзена, дополненной 0,5% глюкозы, 5 мкг/мл ΌΕ-триптофана, 5 мкг/мл урацила, 0,01% гидролизата казеина, 0,1% дрож- 8 023058 жевого экстракта, 1 мМ Мд80₄, 2,5 мМ МдС1₂, 0,5 мМ СаС1₂), и инкубацию проводили при встряхивании в течение 3-4 ч 30°С. К 1 мл результирующей культуры Ь8 добавляли 10 мкл 0,1М БОТА, и инкубацию проводили при комнатной температуре в течение 5 мин. Затем добавляли 1-2 мкг плазмидной ДНК, осуществляли встряхивание в течение 2 ч при 37°С, и осуществляли засев на чашки с ЬВ с селективными антибиотиками. Эти трансформированные ВасШик крр теперь продуцируют гетерологичные последовательности эпитопов из А1 после индукции 1 мМ 1РТО.

ПЦР.

Все праймеры, использованные для ПЦР, перечислены в табл. 1. Типичные условия для ПЦР состояли из приблизительно 0,1 мкг очищенной геномной, плазмидной или образованной в ходе ПЦР ДНК (ф1адеи, Уа1еис1а, СА, США), 1х буфера для полимеразы РГи, 5 Е полимеразы РГи (81га1адеие Ьа Ло11а. СА, США), 1 мМ 6ΝΤΡ (ОЕ Неа1Шсаге Вю-Заеисек Согр., Р|5са1а^ау, N1), 1,2 мкМ каждого праймера в общем объеме, равном 50 мкл. Термоциклер - прибор для амплификации ДНК (Вю-Каб, Негси1ек, СА, США) применяли со следующими условиями амплификации: 94°С в течение 2 мин; 30 циклов, каждый из которых состоял из 94°С в течение 30 с, 58°С в течение 60 с, 72°С в течение 90 с для каждой 1 т.о.; и 72°С в течение 10 мин для коечного удлинения. Каждый продукт ПЦР подвергали очистке из геля (φίадеи, Уа1еиаа, СА, США) и элюированию либо в 25 мкл буфера ЕВ для приготовления матриц, используемых в ПЦР с использованием перекрывания и удлинения, либо в 50 мкл буфера ЕВ, осаждали этанолом и суспендировали в 5 мкл ббН₂0 для электропорации в ВасШик крр.

Таблица 1

Последовательности праймеров, использованные для создания вакцинного вектора

Граймер	Амппифицируемый район	Последовательность праймера (ЗЕО 10 ΝΟ:)
гоахР прямой	Μαζί ген	Б' сРддад СсГ-ГогздаРдаРсдлРсаРссТ.сасТ.дс-.с.дс.И'.Р.с.сядЕсддздАаЗ' (5ЕО ГО N0:31)
щадР обратный	Μαζί ген	5'{2аас^!^ас^аас^асса^а1ПС(хосш.^саз^^Л!2.С)' (8ЕЦ ГО ΝΟ: 32)
ъ ио«ь прямой	5’ СО! В	5' еааа1£С1сяа1е«еацга 3’ (5ЕО ГО ΝΟ: 33)
5* Со© обратный	5' Су/В	б’квОДдидесаодаахаОПаяЗ’ (5ΕΟΙΠΝΟ: 34)
3’Со® прямой	3· Со! В	5’аааад1еяхс£Исг!сас£НсаЗ’ (δΕΟΙϋΝΟ: 35)
3‘Сс1В обратный	3 Со! В	5’ 1.1ясяШссая1яа1ая1с1а1схЗ’ (5ЕО ΙΠΝΟ: 36)
В8»'А1/НМОВ1 Прямой	Βδ/ΑΙ,ΉΜΟΒΙ 5' Со®	5‘аясоаПоП1С0аП51ааП5ааППйаа«са81с»8СС18а(ваГ8аса8«еиса1оа1сапаааа<с 8ссс8§а(а8саса8а1сат8се88а(пест8ат&агдаагсса<8ссс8пс1аасса818стси8пс Шда1аск1ее^-д('г^гт»р15гса/с/в'ддгд/«'йд3’ (8Е0 ΙϋΝΟ: 37)
Β8/ΑΙ/ΗΜΟΒΙ обратный	Β8/ΑΙ/ΗΜΟΒ1 3' Со©	5'(Щ1:ааПдааи2'1а1в^¹-4д1са<са(са1сас(дс1д1саадааиш11сий1/даг111Щ1лЩ:аа1си( са(садаа5((8оаасассдоНадааоПса1са1са(дда(дасаооассайЙ8?ОСС8аса(са(са1са 1сайаадбвааасассяаПадааа1гигаГ1:гд1;гс)гг/се(сасд?//саЗ’ (8ΕΟΙΟΝΟ: 38)
В5/АРСО154 Прямой	В2/А1/СШ54 5’ Со®	5’1Ссаааа1£аОгаПсП£аса£са&(£аТ£а1§а(§асаЕ!аасоаМстсаа1(£ГааК§аа1М§ааГ са81с,§сс18а18а1§аса§Пс[1са1аа(саИапааСс8ссс^8а(о8саса§а1са1Н8СС88а1118 (8Εζ>ΙΟΝΟ: 39)
В5/АЕСР154 обратный	В5/А1/СО154 3' Со©	5‘саадаа,1аз1со1ОС8аааааа4<саа1са»са(саваав(С8ааасассдаПадааа11са1са(сас1§ааа а§садааааа1сааааааа1зца/с/д5-(сдц^,сд/сас^//с'л3 ’ (8Е0 ΙΕ> ΝΟ: 40)

В табл. 1 выделенные курсивом нуклеотиды являются нуклеотидами, которые комплементарны той или другой стороне сайта вставки в ген Со® ВасШик киЫШк.

Электропорация.

Вкратце, клетки засевали в 10 мл среды ЬВ и наращивали при 37°С в течение ночи. Затем 100 мкл ночной культуры вновь засевали в 10 мл новой среды ЬВ с инкубацией при 37°С в течение 3-4 ч. Клетки промывали пять раз водой ббН₂0 и ресуспендировали в 60 мкл 10% глицерина. Затем на клетки посылали импульсы при 2,4-2,45 кВ в течение 1-6 мс, их инкубировали в 0,5 мл 30С в течение 2-3 ч при 37°С и засевали на среду ЬВ с соответствующими антибиотиками.

Интеграция в хромосому гетерологичной ДНК для представления в оболочке споры.

Рекомбинантные штаммы ВасШик, содержащие устойчиво интегрированные копии отобранных эпитопов М2е, НА и ΝΡ, конструировали, используя недавно опубликованные способы с модификацией. Вкратце, штаммы ВасШик трансформировали кассетой Ма/Р (2Ьаид е1 а1., 2006), которая порождала штамм, который был чувствительным к 1РТО и устойчивым к спектомицину. Кассету Ма/Р, фланкированную гомологичной ДНК размером приблизительно 300 п.о. с каждой стороны, вводили в ген С.'о1В (1кОса1о е1 а1., 2001) ВасШик вектора с помощью электропорации с последующим выращиванием в среде, содержащей спектомицин, для отбора положительных клонов, которые теперь содержат кассету Ма/Р, которая является устойчивой к спектомицину.

После подтверждения мутации Ма/Р в Со1В этот район замещали оптимизированной в отношении частоты использования кодонов последовательностью ДНК, кодирующей антигенные детерминанты А1, снова фланкированной гомологичной ДНК размером приблизительно 300 п.о. Это выполняли посредством создания продукта ПЦП, используя ПЦР с использованием перекрывания и удлинения, чтобы создать антигенные последовательности, фланкированные последовательностями размером приблизительно 300 п.о. с каждой стороны, гомологичными хромосоме ВасШик (Сох е1 а1., 2007). Продукт ПЦР вводили в ВасШик снова посредством электропорации и замещения кассеты Ма/Р. Отбор трансформантов осуществляли на чашках, содержащих 1РТО, положительные клоны должны теперь быть нереагирующими на 1РТО и чувствительными к спектомицину. Правильную вставку последовательности в хромосому подтверждали посредством секвенирования ДНК.

- 9 023058

Пример 2. Исследование 1 и 2 вакцинации.

Цыплят в день вылупления (день 0) получали с местной коммерческой инкубаторной станции и случайным образом разделяли на группы терапии (п=15/группу терапии в эксперименте 1 и п=20/группу терапии в эксперименте 2). Всех цыплят в каждой группе терапии снабжали ярлычками и занумеровывали. Цыплят орально инфицировали посредством введения через зонд 0,25 мл солевого раствора или 10⁶10⁸ КОЕ/мл различных ВасШик терапий, указанных в табл.2 для исследования 1 и в табл.3 для исследования 2.

Таблица 2

Заражающая доза для каждой группы терапии в исследовании 1 вакцинации

Группа терапии	Заражающая доза
Только солевой раствор
В5/А1/НМСВ1	10^ь КОЕ/мл
ВЗ/А1/НМСВ1	10“ КОЕ/мл
В5/А1/СО154	10’ КОЕ/мл
В5/А1/СШ54	10 КОЕ/мл

Таблица 3

Заражающая доза для каждой группы терапии в исследовании 2 вакцинации

Группа терапии	Заражающая доза
ВЗВВ (ВасШиз)	10^е КОЕ/мл
В5/А1/НМСВ1	10^ь КОЕ/мл
ВЗ/А1/СЦ154	10’ КОЕ/мл
В5/А1/НМСВ1 инактивированные нагреванием	10’ КОЕ/мл
ВЗ/А1/НМСВ1 инактивированные формалином	10^ъ КОЕ/мл
В5/А1/НМСВ1 подвергнутые основанной на антибиотиках инактивации	10 КОЕ/мл
В5/А1/НМСВ1 инактивированные этанолом	10’ КОЕ/мл

В исследовании 2 бактерии инактивировали несколькими различными способами для оценки, необходима ли репликация для вызова продукции антител, направленных против антигенных пептидов вируса гриппа. Использовали несколько способов инактивации, поскольку способы инактивации могли привести к разрушению эпитопа и привести к неверной интерпретации данных и подтверждению необходимости репликации или жизнеспособности ВаеШик вектора. Бактерии инактивировали посредством инкубации в течение 10 мин в 0,022% формалине (инактивированные формалином); инкубации в течение 10 мин при 70°С (инактивированные нагреванием); инкубации в 5 мкг/мл гентамицина (подвергнутые основанной на антибиотиках инактивации) или инкубации в течение 10 мин в 70% этаноле (инактивированные этанолом).

Каждую группу терапии размещали в отдельном напольном загоне на свежей сосновой подстилке и неограниченно предоставляли воду и пищу. В дни 11 и 21 после вылупления птицы получали бустервакцину той же терапии, которую они получали в день 0. Также в дни 21 и 31/32 от каждой снабженной ярлычком птицы получали кровь, и снимали сыворотку.

Сыворотку, полученную от снабженных ярлычками птиц в каждой группе терапии, затем использовали в ЕЬ1§А с захватом антител для определения продукции антител, специфичных для М2е, НАИЛ и НАЕВ. Вкратце, индивидуальные лунки 96-луночного планшета покрывали 10 мкг/мл эпитопа М2е, эпитопа НАИЛ или эпитопа НАЬВ, конъюгированного с В8А. Допускали прохождение адгезии антигенов в течение ночи при 4°С. Планшеты промывали РВ§+0,05% Т\уееп 20, блокировали РВ§ ЗирегЫоск (Р1егсе Скеш1са1 Со.) в течение как минимум 2 ч и инкубировали в течение 2 ч с сывороткой, предварительно полученной от птиц в каждой из групп терапий, описанных выше, Планшеты промывали РВ§+0,05% Т\уееп 20 с последующей инкубацией с конъюгированным с пероксидазой козьим вторым антителом против 1дУ кур (в разведении 1:7500), полученным из 1асккои ПптипоРекеагск ЬаБогаШпек (\Уек1 Сгоуе, РА), в течение еще часа. После последующей промывки планшеты проявляли, используя набор с субстратом для пероксидазы, полученный от Иккег Заеиййс, и оптические плотности считывали на спектрофотометре при 450 и 405 нм.

Образцы объединенных сывороток от групп, получающих векторные вакцины, использовали в качестве положительных контролей, а образцы объединенных сывороток от невакцинированных групп использовали в качестве отрицательных контролей в каждом планшете для замены сыворотки от групп терапий. Оптические плотности, полученные для положительного контроля, отрицательного контроля и экспериментальных образцов, использовали для расчета отношений образца к положительному контролю (отношений δ/Р), используя следующий расчет:

- 10 023058 среднее значение для образца среднее значение для отрицательного контроля

Расчет отношения 3/Р: _ среднее значение для положительного контроля - среднее значение для отрицательного контроля

Рассчитанные отношения 8/Р для каждого исследования представлены на фиг. 1-6. На фиг. 1-3 представлены суммарные титры антител против М2е, НАЬБ и ΗΛϋΆ для исследования 1, соответственно в дни 21 и 31 после вылупления. Результаты доказывают, что сильные иммунные ответы против каждого из этих антигенов были вызваны после орального введения ВасШиз, экспрессирующей каждый из этих эпитопов вместе либо с СЭ154, либо НМОВ1 в качестве иммуностимулирующего пептида. На фиг. 4-6 представлены суммарные титры антител против М2е, НАБВ и ΗΛϋΆ для исследования 2, соответственно в дни 21 и 32 после вылупления. Результаты доказывают, что сильные иммунные ответы против каждого из этих эпитопов были вызваны после орального введения живой ВасШиз, экспрессирующей эпитоп и иммуностимулирующий пептид. На фиг. 4-6 также показано, что сходные уровни специфических антител были также порождены, когда вектор (ВасШиз) был инактивирован до введения.

Пример 3. Исследование 3 вакцинации.

Цыплят в день вылупления (день 0) получали с местной коммерческой инкубаторной станции и случайным образом разделяли на группы терапии (п=20/группу терапии). Всех цыплят в каждой группе терапии снабжали ярлычками и занумеровывали. Цыплят орально инфицировали посредством введения через зонд 0,25 мл солевого раствора или 10⁵-10⁸ КОЕ/мл ВасШиз вектора (В8ВВ), ВасШиз вектора, экспрессирующего эпитопы белков птичьего гриппа и НМОВ1 (В8/А1/НМОВ1), или различных количеств В8/А1/НМОВ1 вектора после инактивации формалином (как описано выше). В день 10 после вылупления птицы получали бустер-вакцину той же терапии, которую они получали в день 0. Также в дни 21 и 32 от каждой снабженной ярлычком птицы получали кровь, и снимали сыворотку. Уровни специфичных для М2е антител класса 1дО в сыворотке определяли, используя описанный выше способ с использованием меченного пероксидазой второго антитела, специфичного для 1дО кур Цаскзоп 1шшипоКезеагсй БаЪогаШпез, ^ез1 Огоуе, РА). Представленные на фиг. 7 результаты доказывают, что так же как живые бактерии инактивированные формалином бактерии были способны к стимулированию продукции специфичных для М2е антител класса 1дО. Этот результат был неожиданным, поскольку обычно полагают, что только живые бактерии могут стимулировать сильный иммунный ответ после орального введения.

Пример 4. Исследование 4 вакцинации.

Цыплят в день вылупления (день 0) получали с местной коммерческой инкубаторной станции и случайным образом разделяли на группы терапии (п=20-35/группу терапии). Всех цыплят в каждой группе терапии снабжали ярлычками и занумеровывали. Цыплят инфицировали посредством орального введения через зонд или подкожной инъекции 0,25 мл солевого раствора или 10⁶ КОЕ/мл ВасШиз вектора (В8ВВ), ВасШиз вектора, экспрессирующего эпитопы белков птичьего гриппа и НМОВ1 (В8А1), или В8А1 вектора после инактивации формалином (как описано выше) или после инактивации формалином с последующей лиофилизацией (воссоздаваемого с использованием солевого раствора непосредственно перед введением). В день 10 после вылупления некоторые птицы получали бустер-вакцину той же терапии, которую они получали в день 0. В дни 11, 14 и 21 от каждой снабженной ярлычком птицы получали кровь, и снимали сыворотку. Уровни специфичных для М2е антител классов 1дА и 1дО в сыворотке определяли, используя описанный выше способ с использованием меченного пероксидазой антитела против 1дА кур (ОепТех) или меченного пероксидазой второго антитела против 1дО кур Цаскзоп 1шшипоКезеагсй ТаЪогаЮпез, \Уез1 Огоуе, РА). Представленные на фиг. 8 результаты доказывают, что приблизительно так же как живые бактерий инактивированные формалином бактерии были способны к стимулированию продукции специфичных для М2е антител класса 1дА после орального введения. Напротив, в случае подкожного введения инактивированный В8А1 вектор не был настолько же эффективен в стимулировании продукции антител класса 1дА, и лиофилизированные бактерии не стимулировали продукцию 1дА. Представленные на фиг. 9 результаты доказывают, что каждый из протоколов введения В8А1 поддерживал обильное образование 1дО.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Вакцинный вектор, включающий антигенный полипептид и полипептид НМОВ1, в котором по крайней мере часть антигенного полипептида и по крайней мере часть полипептида НМОВ1 присутствуют на поверхности вакцинного вектора.
2. Вакцинный вектор по п.1, в котором антигенным полипептидом является специфичный для вируса гриппа полипептид.
3. Вакцинный вектор по п.2, в котором антигенным полипептидом является полипептид М2е, НА или ΝΡ вируса гриппа.
4. Вакцинный вектор по п.3, в котором антигенный полипептид выбирают из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0:1, 8ЕЦ ГО N0:2, 8ЕЦ ГО N0:3, 8ЕЦ ГО N0:4, 8ЕЦ ГО N0:5, 8ЕЦ ГО N0:6, 8ЕЦ ГО N0:7, 8ЕЦ ГО N0:8, 8ЕЦ ГО N0:9 и 8ЕЦ ГО N0:10.

- 11 023058
5. Вакцинный вектор по любому из пп.1-4, в котором полипептид НМОВ1 выбирают из 8ЕО ГО N0:18, 8ЕО ГО N0:29, 8ЕО ГО N0:30.
6. Вакцинный вектор по любому из пп.1-5, который является бактерией.
7. Вакцинный вектор по п.6, в случае которого бактерией является ВасШик крр.
8. Вакцинный вектор по любому из пп.1-7, в котором антигенный полипептид и/или полипептид НМОВ1 включен в трансмембранный белок.
9. Вакцинный вектор по п.8, в котором антигенный полипептид и/или полипептид НМОВ1 находятся в поверхностном петлевом участке трансмембранного белка.
10. Вакцинный вектор по п.8 или 9, в случае которого трансмембранным белком является со®.
11. Вакцинный вектор по любому из пп.1-10, в котором антигенный полипептид и полипептид НМОВ 1 формируют часть гибридного белка.
12. Композиция, включающая вакцинный вектор по любому из пп.1-11 и фармацевтически приемлемый носитель.
13. Композиция по п.12, в которой фармацевтически приемлемый носитель является приемлемым для орального или интраназального введения.
14. Композиция по п.12 или 13, в которой вакцинный вектор не способен к репликации, является инактивированным или убитым.
15. Способ усиления иммунного ответа у субъекта, включающий введение субъекту вакцинного вектора по любому из пп.1-11 или композиции по любому из пп.12-14 в количестве, эффективном для усиления иммунного ответа у субъекта против антигенного полипептида.
16. Способ по п.15, в котором вакцинный вектор вводят орально или интраназально.
17. Способ по п.16, в котором иммунным ответом является продукция антител класса 1дА против антигенного полипептида.
18. Способ по любому из пп.15-17, в котором вакцинный вектор не способен к репликации в организме субъекта или является инактивированным или убитым перед введением субъекту.
19. Вакцинный вектор ВасШик крр., включающий первую полинуклеотидную последовательность, кодирующую антигенный полипептид, присутствующий на поверхности вакцинного вектора, и вторую полинуклеотидную последовательность, кодирующую иммуностимулирующий полипептид, в котором антигенный полипептид и иммуностимулирующий полипептид присутствуют на поверхности вакцинного вектора, причем антигенным полипептидом является полипептид вируса гриппа, а иммуностимулирующим полипептидом является полипептид НМОВ1.
20. Вакцинный вектор по п.19, в котором первый полинуклеотид и второй полинуклеотид встроены в третью полинуклеотидную последовательность, кодирующую поверхностную часть трансмембранного белка.
21. Вакцинный вектор по п.20, в случае которого трансмембранным белком является со1В.
22. Вакцинный вектор по любому из пп.19-21, в котором антигенным полипептидом является полипептид М2е вируса гриппа, полипептид НА вируса гриппа или полипептид ΝΡ вируса гриппа.
23. Вакцинный вектор по п.22, в котором антигенный полипептид выбирают из группы, состоящей из 8ЕО ГО N0:1, 8ЕО ГО N0:2, 8ЕО ГО N0:3, 8ЕО ГО N0:4, 8ЕО ГО N0:5, 8ЕО ГО N0:6, 8ЕО ГО N0:7, 8ЕО ГО N0:8, 8ЕО ГО N0:9 и 8ЕО ГО N0:10.
24. Вакцинный вектор по любому из пп.19-23, в котором полипептид НМОВ1 выбирают из 8Е0 ГО N0:18, 8ЕО ГО N0:29, 8ЕО ГО N0:30.
25. Способ усиления иммунного ответа у субъекта, включающий введение субъекту вакцинного вектора ВасШик крр. по любому из пп.19-24 в количестве, эффективном для усиления иммунного ответа у субъекта против антигенного полипептида.
26. Способ по п.25, в котором вакцинный вектор вводят орально или интраназально.
27. Способ по п.26, в котором иммунным ответом является продукция антител класса 1дА против антигенного полипептида.
28. Способ по любому из пп.25-27, в котором вакцинный вектор не способен к репликации в организме субъекта или является инактивированным или убитым перед введением субъекту.

29. Способы снижения связанной с вирусом гриппа А заболеваемости у субъекта, включающий введение субъекту вакцинного вектора по любому из пп.2-11 или 19-24 или композиции по любому из пп.12-14 в количестве, эффективном для снижения связанной с вирусом гриппа А заболеваемости у субъекта.

- 12 023058

Фиг. 1

Продукция антител против НАЬВ 1.5 п 0. 55 1 ф 5 |₀.5 о 5 0 1 | Я . л 1 1 | □ День 21 День 31 ΊΊΊγΙ Солевой раствор Β5/ΑΙ Β5/ΑΙ Β5/ΑΙ Β5/ΑΙ НМСЗВ1 НМСВ1 С0154 С0154 Ю'б 10^Л8 Ю'б 10*8

Фиг. 2

Продукция антител против НАид

10*6 10^Л8 106 10^л8

Фиг. 3 □ День 21 День 31

Продукция антител против М2е

Фиг. 4

Фиг. 5

13 023058

Фиг. 6

Фиг. 7

Фиг. 8

Фиг. 9

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> υΝΐνΕΚ3ΙΤΥ ОГ ΑΚΚΑΝ5Α3 ТНЕ ТЕХАЗ А6М 1Ш1УЕН51ТУ 5Υ3ΤΕΜ <120> ВАКЦИННЫЕ ВЕКТОРЫ И СПОСОБЫ УСИЛЕНИЯ ИММУННЫХ ОТВЕТОВ <130> 5658-00099 <150> <151> из 61/297,098 2010-01-21 <160> 40 <170> Рабепб1п уегзЬоп 3.5 <210> <2Ы> <212> <213> 1 24 БЕЛОК Вирус птичьего гриппа

<220> <221> <223> тЬзс Ьеабиге М2е <400> 1

Меб Зех Ьеи Ьеи ТЬг СЬи УаЬ СЬи ТЬг Рго ТЬг Агд Азп СЬу Тгр СЬи 15 10 15

Суз Ьуз Суз Зег Азр Зег Зег Азр 20

<210> <211> <212> <213> 2 24 БЕЛОК Вирус птичьего гриппа

<220> <221> <223> тЬзс £еабиге М2е <400> 2

Меб Зег Ьеи Ьеи ТЬх СЬи УаЬ СЬи ТЬг Рхо ТЬг Агд Азп СЬи Тгр СЬу 15 10 15

Суз Ахд Суз Азп Азр Зег Зег Азр 20

<210> <211> <212> <213> 3 24 БЕЛОК Вирус птичьего гриппа

<220> <221> пи.зс_£еабиге <223> М2е <400> 3 Меб Зе 1 г Ьеи Ьеи ТЬг СЬи УаЬ СЬи ТЬг Рго Не Агд Азп СЬи Тгр СЬу 5 10 15

Суз Ахд Суз Азп Азр Зех Зех Азр 20

<210> <211> <212> <213> 4 24 БЕЛОК Вирус птичьего гриппа

<220> <221> <223> низе £еабиге М2е

<220> <221> <223> низе £еабиге М2е <400> 4

Меб Зег Ьеи Ьеи ТЬх СЬи УаЬ СЬи ТЬх Рхо ТЬг Агд Азп СЬу Гхр 01ι 15 10 15

Суз Агд Суз Азп Азр Зех Зег Азр 20

<210> <211> <212> <213> 5 8 БЕЛОК Вирус птичьего гриппа

<220> <221> <223> тЬзс £еабихе М2е <4 00> 5

СЬи УаЬ СЬи ТЬг Рго

1 □. ихи хАхх гхи ххе лху 5 <210> <211> <212> <213> 6 8 БЕЛОК Вирус птичьего гриппа

<220> <221> <223> тЬзс £еабиге М2е <400> 6

61и УаЬ 61и ТЬг Рго ТЬг Агд Азп 1 5

- 15 023058 <210> Ί <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Вирус птичьего гриппа <220>

<221> тЬзс_£еаСиге <223> НА5 иА <400> 7

Ьеи Ьеи Зег Агд Не Азп НЬз РЬе СЬи Ьуз 11е С1п 15 10 <210> 8 <211> 19 <212> БЕЛОК <213> Вирус птичьего гриппа <220>

<221> гщдс_£еаСихе <223> НА5 ЪВ <400> 8

А1а Азп Рго А1а Азп Азр Ьеи Суд Туг Рго <31у Азр РЬе Азп Азр Туг 15 10 15

С1и СЬи Ьеи <210> 9 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Вирус птичьего гриппа <220>

<221> тЬзс_£еаСиге <223> ΝΡ 54-69 <400> 9

С1у Агд Ьеи Не С1п Азп Зег Не ТЬг Не С1и Агд МеС УаЬ Ьеи Зег 15 Ю 15 <210> 10 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Вирус птичьего гриппа <220>

<221> гдЬзс_£еаСиге <223> ΝΡ 147-160 <400> 10

ТЬг Туг С1п Агд ТЬг Агд А1а Ьеи Уа1 Агд ТЬг С1у МеС Азр 1 5 10 <210> 11 <211> 272 <212> БЕЛОК <213> Са11и5 даПиз <220>

<221> тЬзс_£еаСиге <223> СО154 курицы <400> 11

МеС. Азп С1и А1а Туг Зег Рго А1а А1а Рго Агд Рго МеС С1у Зег ТЬг 15 10 15

Зег Рго Зег ТЬг МеС Ьуз МеС РЬе МеС Суз РЬе Ьеи Зег Уа1 РЬе МеС 20 25 30

Уа1 Уа1 С1п ТЬг 11е С1у ТЬг Уа1 Ьеи РЬе Суз Ьеи Туг Ьеи НЬз МеС 35 40 45

Ьуз МеС Азр Ьуз МеС С1и С1и Уа1 Ьеи Зег Ьеи Азп С1и Азр Туг Не 50 55 60

РЬе Ьеи Агд Ьуз Уа1 СЬп Ьуз Суз С1п ТЬг С1у С1и Азр 61п Ьуз Зег 65 70 75 80

ТЬг Ьеи Ьеи Азр Суз С1и Ьуз Уа1 Ьеи Ьуз С1у РЬе СЬп Азр Ьеи С1п 85 90 95

Суз Ьуз Азр Агд ТЬг А1а Зег С1и С1и Ьеи Рго Ьуз РЬе СЬи МеС Нхз 100 105 110

Агд С1у НЬз СЬи НЬз Рго НЬз Ьеи Ьуз Зег Агд Азп С1и ТЬг Зег Уа1 115 120 125

АЬа СЬи СЬи Ьуз Агд С1п Рго Не АЬа ТЬг НЬз Ьеи АЬа С1у Уа1 Ьуз 130 135 140

Зег Азп ТЬг ТЬг Уа1 Агд Уа1 Ьеи Ьуз Тгр МеС ТЬг ТЬг Зег Туг А1а 145 150 155 160

Рго ТЬг Зег Зег Ьеи Не Зег Туе НЬз СЬи С1у Ьуз Ьеи Ьуз Уа1 С1и 165 170 175

Ьуз АЬа С1у Ьеи Туг Туг Не Туг Зег СЬп \/а1 Зег РЬе Суз ТЬг Ьуз 180 185 190

А1а А1а А1а 5ег А1а Рго РЬе ТЬг Ьеи Туг Не Туг Ьеи Туг Ьеи Рго 195 200 205 МеЬ 01и С1и Азр Агд Ьеи Ьеи МеЬ Ьуз С1у Ьеи Азр ТЬг Нхз Зег ТЬг 210 215 220 Зег ТЬг А1а Ьеи Суз 01 и Ьеи С1п Зег Не Ахд С1и 01у 01у Уа1 РЬе 225 230 235 240 01и Ьеи Агд ΟΙ η С1у Азр МеЬ Уа1 РЬе Уа1 Азп Уа1 ТЬг Азр Зег ТЬг 245 250 255 А1а Уа1 Азп Уа1 Азп Рго 01 у Азп ТЬг Туг РЬе 01 у МеЬ РЬе Ьуз Ьеи 260 265 270 <210> 12 <211> 261 <212> ' БЕЛОК <213> ' Ното зархепз <220> <221> ι тхзс СеаЬиге <223> ' СЫ54 человека <4 00> 12 МеЬ Не С1и ТЬг Туг Азп С1п ТЬг Зег Рго Агд Зег А1а А1а ТЬг С1у 1 5 10 15 Ьеи Рго Не Зег МеЬ Ьуз 11е РЬе МеЬ Туг Ьеи Ьеи ТЬг Уа1 РЬе Ьеи 20 25 30 Не ТЬг О1п МеЬ 11е О1у Зег А1а Ьеи РЬе А1а Уа1 Туг Ьеи Нхз Агд 35 40 45 Агд Ьеи Азр Ьуз 11е 01и Азр С1и Агд Азп Ьеи Нхз С1и Азр РЬе Уа1 50 55 60 РЬе МеЬ Ьуз ТЬг Не С1п Агд Суз Азп ТЬг С1 у С1и Агд Зег Ьеи Зег 65 70 75 80 Ьеи Ьеи Азп Суз С1и <31и Не Ьуз Зег С1п РЬе С1и 01 у РЬе Уа1 Ьуз 85 90 95 Агр Не МеЬ Ьеи Азп Ьуз 01 и С1и ТЬг Ьув Ьуз С1и Азп Зег РЬе С1и 100 105 110 МеЬ 01п Ьуз С1у Азр С1п Азп Рго С1п Не А1а А1а Нхз Уа1 Не Зег 115 120 125 С1и А1а Зег Зег Ьуз ТЬг ТЬг Зег Уа1 Ьеи О1п Тгр А1а 01 и Ьуз 01 у 130 135 140 Туг Туг ТЬг МеЬ Зег Азп Азп Ьеи Уа1 ТЬг Ьеи 01 и Азп О1у Ьуз С1п 145 150 155 160 Ьеи ТЬг Уа1 Ьуз Агд 01 п О1у Ьеи Туг Туг Не Туг А1а С1п Уа1 ТЬг 165 170 175 РЬе Суз Зег Азп Агд С1и А1а Зег Зег С1п А1а Рго РЬе Не А1а Зег 180 185 190 Ьеи Суз Ьеи Ьуз Зег Рго О1у Агд РЬе С1и Агд Не Ьеи Ьеи Агд А1а 195 200 205 А1а Азп ТЬг ΗΪ3 Зег Зег А1а Ьуз Рго Суз 01у 01п 01п Зег Не Нхз 210 215 220 Ьеи О1у 01 у Уа1 РЬе С1и Ьеи С1п Рго С1у А1а Зег Уа1 РЬе Уа1 Азп 225 230 235 240 Уа1 ТЬг Азр Рго Зег С1п Уа1 Зег Нхз С1 у ТЬг С1у РЬе ТЬг Зег РЬе 245 250 255 С1у Ьеи Ьеи Ьуз Ьеи 260 <210> 13 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <220> <221> : тхзс £еаЬиге <223> пептид СР154 человека <400> 13 Тгр А1а О1и Ьуз С1у Туг Туг ТЬг МеЬ Зег Суз 1 5 10

<210> 14 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> СаПиз даНиз <220>

<221> тхзс_£еа£иге <223> пептид СБ154 курицы <400> 14

МеС СЬу Ьу5 СЬу Азр Рго Ьуз Ьуз Рго Агд СЬу Ьуз МеС Зег Зег Туг

АЬа РЬе РЬе УаЬ СЬп ТЬг Суа Агд СЬи СЬи Шз Ьуз Ьуз Ьуз Шз Рго

Азр АЬа Зег УаЬ Азп РЬе Зег СЬи РЬе Зег Ьуз Ьуз Суз Зег СЬи Агд

Тгр Ьуз ТЬг МеС. Зег Зег Ьуз С1и Ьуз С1у Ьуз РЬе СЬи Азр МеС А1а

Ьуз АЬа Азр Ьуз Ьеи Агд Туг СЬи Ьуз СЬи МеС Ьуз Азп Туг УаЬ Рго

Рго Ьуз СЬу СЬи ТЬг Ьуз Ьуз Ьуз РЬе Ьуз Азр Рго Азп АЬа Рго Ьуз

Ьеи СЬу СЬи Мес тхр Азп Азп ТЬг АЬа АЬа Азр Азр Ьуз СЬп Рго Туг 130 135 140

АЬа Туе Асд АЬа Ьуз СЬу Ьуз УаЬ Азр АЬа СЬу Ьуз Ьуз УаЬ УаЬ АЬа 165 170 175

Ьуз АЬа СЬи Ьуз Зег Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз СЬи С1и СЬи СЬи Азр 180 185 190 <2Ю> 19 <2Ы> 111 <212> БЕЛОК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический пептид: ВЗ/А1/С0154 = НА/ЫР/м2е/сСОЬ54: 555 сериновый Спейсер <400> 19

Зег Зег Зег ТЬг Туг С1п Агд ТЬг Агд АЬа Ьеи УаЬ Агд ТЬг СЬу МеС

Азр Зег Зег Зег А1а Азп Рго АЬа Азп Аэр Ьеи Суз Туг Рго 61у Азр

- 18 023058

РЬе Азп Аэр Туг С1и СЬи Ьеи Бег Бег Бег СЬу Агд Ьеи Не СЬп Азп

Бег Не ТЬг 11е СЬи Агд МеЬ УаЬ Ьеи Бег Бег Бег Бег Ьеи Ьеи Бег

Агд Не Азп Ηίδ РЬе СЬи Ьуз Не С1п Бег Бег Бег О1и Уа1 СЬи ТЬг

Рго Не Агд Азп Бег Бег Бег С1и Уа1 С1и ТЬг Рго ТЬг Агд Азп Бег

Бег Бег Тгр МеЬ ТЬг ТЬг Бег Туг А1а Рго ТЬг Бег Бег Бег Бе 100 105 110 <210> 20 <211> 302 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический пептид: В5/А1/НМСВ1 = НА/ЫР/М2е/НМСВ1 <400> 20

Бег Бег Бег ТЬг Туг С1п Агд ТЬг Агд АЬа Ьеи Уа1 Агд ТЬг С1у МеЬ

Азр Бег Бег Бег А1а Азп Рго А1а Азп Азр Ьеи Суз Туг Рго С1у Азр

РЬе Азп Азр Туг С1и СЬи Ьеи Бег Бег Бег С1у Агд Ьеи Не С1п Азп

Бег Не ТЬг Не О1и Агд МеЬ Уа1 Ьеи Бег Бег Бег Бег Ьеи Ьеи Бег

Агд Не Азп Н±з РЬе СЬи Ьуз Не С1п Бег Бег Бег С1и Уа1 С1и ТЬг

Рго Не Агд Азп Бег Бег Бег СЬи УаЬ СЬи ТЬг Рго ТЬг Агд Азп Бег

Бег Бег Тгр МеЬ ТЬг ТЬг Бег Туг А1а Рго ТЬг Бег Бег Бег Бег Бег 100 105 НО

МеЬ СЬу Ьуз С1у Азр Рго Ьуз Ьуз Рго Агд СЬу Ьуз МеЬ Бег Бег Туг 115 120 125

АЬа РЬе РЬе УаЬ СЬп ТЬг Суз Агд СЬи С1и НЬз Ьуз Ьуз Ьуз Шз Рго 130 135 140

Азр А1а Бег УаЬ Азп РЬе Бег СЬи РЬе Бег Ьуз Ьуз Суз Бес СЬи Агд 145 150 155 160

Тгр Ьуз ТЬг МеЬ Бег Бег Ьуз СЬи Ьуэ 61у Ьуз РЬе СЬи Азр МеЬ АЬа 165 170 175

Ьуз А1а Азр Ьуз Ьеи Агд Туг С1и Ьуз СЬи МеЬ Ьуз Азп Туг УаЬ Рго 180 185 190

Рго Ьуз С1у СЬи ТЬг Ьуз Ьуз Ьуз РЬе Ьуз Азр Рго Азп АЬа Рго Ьуз 195 200 205

Агд Рго Рго Бег АЬа РЬе РЬе Ьеи РЬе Суз Бег СЬи РЬе Агд Рго Ьуз 210 215 220

11е Ьуз С1у 61и Ηίδ Рго СЬу Ьеи Бег 11е СЬу Азр УаЬ АЬа Ьуз Ьуз 225 230 235 240

Ьеи С1у 61и МеЬ Тгр Азп Азп ТЬг АЬа АЬа Азр Азр Ьуз СЬп Рго Туг 245 250 255

С1и Ьуз Ьуз А1а А1а Ьуз Ьеи Ьуз СЬи Ьуз Тух СЬи Ьуз Азр Не АЬа 260 265 270

АЬа Туг Агд АЬа Ьуз С1у Ьуз УаЬ Азр АЬа С1у Ьуз Ьуз УаЬ УаЬ АЬа 275 280 285

Ьуз АЬа СЬи Ьуз Бег Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз СЬи СЬи СЬи СЬи Азр 290 295 300 <210> 21 <2Ы> 111 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический пептид: ВЗ/А1/СО154

Зег Бег Бег ТЬг Туг 61п Агд ТЬг Агд АЬа Ьеи Уа1 Агд ТЬг С1у МеЬ 15 10 15

Азр Зег Бег Бег АЬа Азп Рго АЬа Азп Азр Ьеи Суз Туг Рго СЬу Азр

РЬе Азп Азр Туг СЬи СЬи Ьеи Бег Бег Бег С1у Агд Ьеи 11е СЬп Азп

- 19 023058

Зег Не ТЪг Не СЬи Агд МеЪ УаЬ Ьеи 5ег Зег Зег Зег Ьеи Ьеи Зег

Агд Не Азп НЬз РЪе СЬи Ьуз Не СЬп Зег 5ех Зег СЬи УаЬ СЬи ТЪг

Рго Пе Агд Азп Зег Зег Зег СЬи УаЬ СЬи ТЪг Рго ТЪг Агд Азп Зег <210> 22 <211> 290 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический пептид: В5/А1/НМСВЬ <400> 22

Зег Зег Зег ТЪг Туг СЬп Агд ТЪг Агд АЬа Ьеи УаЬ Агд ТЪг СЬу МеС

Азр Зег Зег Зег АЬа Азп Рго АЬа Азп Азр Ьеи Суз Туг Рго СЬу Азр

РЪе Азп Азр Туг СЬи СЬи Ьеи Зег Зег Зег СЬу Агд Ьеи ЬЬе СЬп Азп

Зег ЬЬе ТЪг ЬЬе СЬи Агд МеС УаЬ Ьеи Зег Зег Зег Зег Ьеи Ьеи Зег 50 55 60

Агд ЬЬе Азп НЬз РЪе СЬи Ьуз ЬЬе СЬп Зег Зег Зег СЬи УаЬ СЬи ТЪг

Рго ЬЬе Агд Азп Зег Зег Зег СЬи УаЬ СЬи ТЪг Рго ТЪг Агд Азп Зег

Зег Зег Зег Зег МеС СЬу Ьуз СЬу Азр Рго Ьуз Ьуз Рго Агд СЬу Ьуз ЬОО 105 ЬЬО

МеС Зег Зег Туг АЬа РЪе РЬе УаЬ СЬп ТЪг Суз Агд СЬи СЬи Нтз Ьуз 115 120 125

Ьуз Ьуз НЬз Рго Азр АЬа Зег УаЬ Азп РЪе Зег СЬи РЪе Зег Ьуз Ьуз 130 135 140

Суз Зег СЬи Агд Тгр Ьуз ТЪг МеС Зег Зег Ьуз СЬи Ьуз СЬу Ьуз РЪе 145 150 155 160

Азп АЬа Рго Ьуз Агд Рго Рго Зег АЬа РЬе РЪе Ьеи РЪе Суз Зег СЬи 195 200 205

РЪе Агд Рго Ьуз Не Ьуз СЬу СЬи НЬз Рго СЬу Ьеи Зег Не СЬу Азр 210 215 220

Ьуз СЬп Рго Туг СЬи Ьуз Ьуз АЬа АЬа Ьуз Ьеи Ьуз СЬи Ьуз Туг СЬи 245 250 255

Ьуз Азр Пе АЬа АЬа Туг Агд АЬа Ьуз СЬу Ьуз УаЬ Азр АЬа СЬу Ьуз 260 265 270

СЬи Азр 290 <210> 23 <211> 85 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический пептид: НМСВ1 блок а!

<400> 23

МеС СЬу Ьуз СЬу Азр Рго Ьуз Ьуз Рго Агд СЬу Ьуз МеС Зег Зег Туг

АЬа РЪе РЪе \Га1 СЬп ТЪг Суз Агд СЬи СЬи НЬз Ьуз Ьуз Ьуз Нтз Рго 20 25 30

Азр АЬа Зег УаЬ Азп РЬе Зег СЬи РЪе Зег Ьуз Ьуз Суз Зег СЬи Агд

Тгр Ьуз ТЪг МеС Зег Зег Ьуз СЬи Ьуз СЬу Ьуз РЪе СЬи Азр МеС АЬа

- 20 023058

Ьуз А1а Азр Ьуз Ьеи Агд Туг С1и Ьуз С1и МеС Ьуз Азп Туг Уа1 Рго

Рго Ьуз С1у С1и ТЪг <210> 24 <211> 54 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <400> 24

Рго Азр АЬа Зег Уа1 Азп РЬе Зег СЬи РЬе Зег Ьуз Ьуз Суз Зег СЬи

Агд Тгр Ьуз ТЪг МеЬ. Зег Зег Ьуз СЬи Ьуз СЬу Ьуз РЪе СЬи Азр МеЬ

АЬа Ьуз АЬа Азр Ьуз Ьеи Агд Туг СЬи Ьуз СЬи МеЬ Ьуз Азп Туг УаЬ

Рго Рго Ьуз СЬу СЬи ТЪг <210> 25 <211> 73 <212> БЕЛОК <2ЬЗ> Искусственная последовательность <400> 25

Ьуз Азр Рго Азп АЬа Рго Ьуз Агд Рго Рго Зег АЬа РЪе РЪе Ьеи РЪе

Суз Зег СЬи РЪе Агд Рго Ьуз ЬЬе Ьуз СЬу СЬи НЬз Рго СЬу Ьеи Зег

ЬЬе СЬу Азр УаЬ АЬа Ьуз Ьуз Ьеи СЬу СЬи МеС Тгр Азп Азп ТЪг АЬа

АЬа Азр Азр Ьуз С1п Рго Туг СЬи Ьуз Ьуз АЬа АЬа Ьуз Ьеи Ьуз СЬи

Ьуз Туг СЬи Ьуз Азр ЬЬе АЬа АЬа Туг <2Ь0> 26 <2ЬЬ> 69 <212> БЕЛОК <2ЬЗ> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический пептид: НМОВ1 блок Ъ2 <400> 26

Азп АЬа Рго Ьуз Агд Рго Рго Зег АЬа РЪе РЪе Ьеи РЪе Суа Зег СЬи

РЪе Агд Рго Ьуз Не Ьуз О1у СЬи НЬз Рго О1у Ьеи Зег Не СЬу Азр

УаЬ АЬа Ьуз Ьуз Ьеи С1у СЬи МеТ Тгр Азп Азп ТЪг АЬа АЬа Азр Азр

Ьуз ЗЬп Рго Туг СЬи Ьуз Ьуз АЬа АЬа Ьуз Ьеи Ьуз СЬи Ьуз Туг СЬи

Ьуз Азр Не АЬа АЬа <210> 27 <211> 21 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический пептид: НМСВ1 ВАСЕ-связывакиций домен <400> 27

Суз Зег <31и РЪе Агд <210> 28 <211> 33 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <22й>

<223> Синтетический пептид: домен провоспалительной кинетической активности НМСВ1 <400> 28

Ьеи Ьуз СЬи Ьуз Туг СЬи Ьуз Азр 11е АЬа АЬа Туг Агд АЬа Ьуз СЬу

- 21 023058

Ьуз Ьуз Уа1 Азр А1а С1у 20 Ьуз Ьуз УаЬ УаЬ АЬа Ьуз АЬа СЬи Ьуз Бег Ьуз 25 30 <210> 29 <211> 215 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз <220> <221> тЬзс СеаСиге <223> НМСВ1 <400> 29 МеС С1у Ьуз С1у Азр Рго Ьуз Ьуз Рго Агд С1у Ьуз МеС Бег Бег Туг 1 5 10 15 АЬа РЬе РЬе УаЬ СЬп ТЬг Суз Агд СЬи СЬи НЬз Ьуз Ьуз Ьуз НЬз Рго 20 25 30 Азр АЬа 5ег УаЬ Азп РЬе Бег СЬи РЬе Бег Ьуз Ьуз Суз Бег СЬи Агд 35 40 45 Тгр Ьуз ТЬг МеС Бег АЬа Ьуз СЬи Ьуз С1у Ьуз РЬе СЬи Азр МеС АЬа 50 55 60 Ьуз АЬа Азр Ьуз АЬа Агд Туг СЬи Агд СЬи МеС Ьуз ТЬг Туг Пе Рго 65 70 75 80 Рго Ьуз С1у СЬи ТЬг Ьуз Ьуз Ьуз РЬе Ьуз Азр Рго Авп АЬа Рго Ьуз 85 90 95 Агд Рго Рго Бег АЬа РЬе РЬе Ьеи РЬе Суз Бег СЬи Туг Агд Рго Ьуз 100 105 110 11е Ьуз С1у СЬи НЬз Рго С1у Ьеи Бег 11е СЬу Азр УаЬ АЬа Ьуз Ьуз 115 120 125 Ьеи С1у СЬи МеС Тгр Азп Азп ТЬг АЬа АЬа Азр Азр Ьуз СЬп Рго Туг 130 135 140 СЬи Ьуз Ьуз АЬа АЬа Ьуз Ьеи Ьуз СЬи Ьуз Туг СЬи Ьуз Азр 11е АЬа 145 150 155 160 А1а Туг Агд АЬа Ьуз СЬу Ьуз Рго Азр АЬа АЬа Ьуз Ьуз СЬу УаЬ УаЬ 165 170 175 Ьуз . А1а СЬи Ьуз Бег Ьуз Ьуз Ьу5 Ьуз СЬи СЬи С1и С1и Аэр СЬи СЬи 180 185 190 Азр СЬи С1и Азр СЬи СЬи СЬи СЬи СЬи Азр СЬи СЬи Азр СЬи Азр СЬи 195 200 205 СЬи С1и Азр Азр Авр Азр СЬи

210 215 <210> 30 <2Ы> 205 <212> БЕЛОК <213> ОапЬо гегЬо <220>

<22Ь> т1зс_£еаСиге <223> НМСВ1 полосатого данио <400> 30

МеС С1у Ьуз Азр Рго ТЬг Ьуз Рго Агд С1у Ьуз Мек Бег Бег Туг А1а 15 10 15

Туг РЬе УаЬ СЬп ТЬг Суз Агд СЬи СЬи Ηίδ Ьуз Ьуз Ьуз ΗΪ5 Рго СЬи 20 25 30

АЬа ТЬг УаЬ Азп РЬе 5ег СЬи РЬе Зег Ьуз Ьуз Суз Бег СЬи Агд Тгр 35 40 45

Ьуз ТЬг МеС Зег А1а Ьуз СЬи Ьуз СЬу Ьуз РЬе СЬи Азр МеС А1а Ьуз 50 55 60

Ьеи Азр Ьуз А1а Агд Туг СЬи Агд СЬи МеС Ьуз Азп Туг Не Рго Рго 65 70 75 80

Ьуз С1у С1и Ьуз Ьуз Ьуз Агд РЬе Ьуз Азр Рго Азп АЬа Рго Ьуз Агд 85 90 95

Рго Рго Бег А1а РЬе РЬе Не РЬе Суз Зег СЬи РЬе Агд Рго Ьуз Уа1 100 105 110

Ьуз СЬи 01и ТЬг Рго С1у Ьеи Зег 11е С1у Азр Уа1 АЬа Ьуз Агд Ьеи 115 120 125

С1у С1и МеС Тгр Азп Ьуз Не Бег Бег С1и С1и Ьуз С1п Рго Туг С1и 130 135 140

Ьуз Ьуз А1а АЬа Ьуз Ьеи Ьуз С1и Ьуз Туг СЬи Ьуз Азр Не А1а А1а 145 150 155 160

Туг Агд Зег Ьуз С1у Ьуз Уа1 С1у С1у С1у А1а А1а Ьуз А1а Рго Зег 165 170 175

Ьуз Рго Азр Ьуз А1а Азп Азр 61и Азр С1и Азр Азр Азр <31и С1и С1и 180 185 190

Азр Θΐυ Азр Азр Азр Азр С1и б!и С1и б1и Азр Азр С1и 195 200 205 <210> 31 <211> 53 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический праймер: таг? прямой - Маг? ген <400> 31 сбааааЪсбС. садаСдаЕса абсабссбса сбдсссдсбб ЕссадЬсддд ааа 53 <210> 32 <211> 44 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический праймер: шаг? обратный - Маг? ген <400> 32 рдаасдбдас даасдассад аЕССсссссЪ аСдсаадддЬ РЬак 44 <210> 33 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический праймер: 5' СоСВ прямой - 5^х СоЪВ <400> 33 дааабдсбсд абдсСдаСда 20 <210> 34 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический праймер: 5' СоЪВ обратный - 5' СоЪВ <400> 34 ддабдаЪЪда СсаЬсСдаад аЪЪСЪад 27 <210> 35 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический праймер: 3' СоЪВ прямой - 3' СобВ <400> 35 аааСсСддбс дСЪсдксасд ЪЪса 24 <210> 36 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический праймер: 3' СобВ обратный - 3' СоЬВ <400> 36

СЕасдСССсс адСда£ад£с ЪаЪсд 25 <210> 37 <211> 186 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический праймер: ВЗ/А1/НМСВ1 прямой - ВЗ/А1/НМСВ1 5' СоТВ <400> 37 аассаббсЪк СсааСЪдЕаа ЬЕдаакСС^д ааСсадОсЬд ссЬда^даСд асадЕксСЬс 60 абааЬсаЕка аааксдсссд даСадсасад аСсаЪЕкдсс ддаССкдсСд акдаЬдааЬс 120 саЪдсстдСС сСаассадСд сСсССдЪЕсб ССдаЪаЪдСд даСдаЪСдаЪ саСс£даада 180

ССЪЪад 186 <210> 38 <211> 200 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический праймер: В5/А1/НМСВ1 обратный - Β5/ΑΙ/ΗΜ6Β1 3’ <400> 38

СЪасааССда аадаагддТБ скдСсабсаб сабсасбдсъ дбсаадааСС ааСсаРСССд ааааааССса аЪсаСсаСса даадСИдааа сассдаббад аааббсабса бсабддабда саасаЪса£а Сдсассдаса ксаСсабсаЕ садаадСЪда аасассдаСЬ адаааЬаааЕ сбддгсдСбс дбсасдССса