KR102007132B1

KR102007132B1 - 캄필로박터 감염을 감소시키기 위한 백신 및 방법

Info

Publication number: KR102007132B1
Application number: KR1020187020489A
Authority: KR
Inventors: 빌리 하기스; 네일 알. 퓸포드; 영 민 권; 쉐릴 레이톤
Original assignee: 더 보드 오브 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 아칸소
Priority date: 2010-06-09
Filing date: 2011-06-09
Publication date: 2019-08-05
Also published as: WO2011156619A3; CL2012003458A1; US10960068B2; NZ604412A; AR081856A1; US8961990B2; AU2011264772A1; KR102008120B1; JP2013537401A; CN102971008B; PT2579901T; AU2015243062B2; CA2800830A1; JP5746333B2; NZ702839A; PL2579901T3; CO6670521A2; DK2579901T3; AU2011264772B2; AU2015243062A1

Abstract

본원에서는 캄필로박터 감염에 대한 저항성을 향상시키거나, 또는 캄필로박터에 대한 면역 반응을 향상시키기 위한 백신 벡터 및 방법을 제공한다. 백신 벡터는 서열 7-9로부터 선택된 항원성 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 벡터는 또한 면역자극성 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 방법은 대상체에게 백신 벡터를 투여하는 것을 포함한다.

Description

캄필로박터 감염을 감소시키기 위한 백신 및 방법{VACCINE AND METHODS TO REDUCE CAMPYLOBACTER INFECTION}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 특허 출원은 2010년 6월 9일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 61/353,039를 우선권 주장하며, 이 가특허 출원은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

연방 정부 지원 연구에 관한 진술

본 발명은 USDA/NRI가 수여하는 보조금 번호 208-35-201-04-683하에 미국 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 관하여 일정한 권리를 소유한다.

서열 목록

서열 목록이 본 출원에 첨부되며, 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 서열 목록은 2011년 6월 9일에 본 출원과 함께 텍스트 파일로 제출되었다.

다양한 병원체에 대한 점막성 면역 발생을 위한 것으로서, 안전하고 비용면에서 효과적인 백신 레퍼토리는 한정되어 있다. 전세계적으로 인간의 위장관 질환에 대한 주된 박테리아 원인은 캄필로박터(Campylobacter)이다. 박테리아성 위장염이 미국 국내 및 국외에서 예측 가능한 미래 동안 계속하여 일반 대중에 중대한 위협을 가할 것이다. 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)에 의한 감염이 살모넬라(Salmonella) 종 또는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O157:H7로부터의 것인 더 많이 알려져 있는 감염보다 더 빈번하게 발생한다. 미국 전역에서 캄필로박터 위장염의 실제 질병 부담은 연간 100,000명당 500-850건의 감염이다.

캄필로박터는 박테리아성 위장염의 주된 원인일 뿐만 아니라, 씨. 제주니(C. jejuni)는 신경병리학적 질환인 길랭-바레 증후군 (GBS)과도 관련이 있다. 생명을 위협하는 이 질환은 신경 세포에 대한 자가면역 반응이 일어나도록 유도하는, 특정 씨. 제주니 균주 상의 강글리오시드-유사 구조에 대한 면역 반응일 수 있다. GBS가 가장 중요한 만성 후유증이지만, 캄필로박터 감염은 또한 라이터 증후군으로 진행될 수 있는 반응성 관절염과도 관련이 있다.

사멸 전세포 또는 단백질 기반 백신을 사용함으로써 캄필로박터에 대한 백신 접종은 제한된 성공을 거두었다. 또한, 길랭-바레 증후군 또는 사균 전세포 백신 접종으로부터의 다른 후유증의 발생에 관한 우려가 제기되고 있다. 성공적인 백신은 비용면에서 효과적이고, 안전하고, 경구적으로 효과적이여야 하며, 매우 짧은 기간 동안 다량으로 생산되어야 한다. 현재 그러한 백신은 존재하지 않는다.

요약

본원에서는 캄필로박터 감염에 대한 저항성을 향상시키거나, 또는 캄필로박터에 대한 면역 반응을 향상시키기 위한 벡터 및 방법을 제공한다.

한 측면에서, 천연적으로는 본 벡터와 관련이 없는 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 항원성 폴리펩티드는 서열 7 (cjaD; cj0113;

), 서열 8 (ACE393; cj0420;

) 또는 서열 9 (cjaA; cj0982;

) 또는 그의 단편일 수 있다. 벡터는 또한 천연적으로는 본 벡터와 관련이 없는 면역자극성 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 백신 벡터는 백신 접종을 받은 대상체로부터, 캄필로박터에 대한 IgA 항체 반응을 비롯한, 면역 반응을 유도할 수 있다. 상기 반응은 캄필로박터에 의한 시험감염(challenge)에 대해 보호성일 수 있다.

또 다른 측면에서, 천연적으로는 본 벡터와 관련이 없는 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열 및 면역자극성 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 항원성 폴리펩티드는 서열 1 (cjaD), 서열 2 (cjaA) 또는 서열 3 (ACE393)의 단편일 수 있다. 백신 벡터는 백신 접종을 받은 대상체로부터, 캄필로박터에 대한 IgA 항체 반응을 비롯한, 면역 반응을 유도할 수 있다. 상기 반응은 캄필로박터에 의한 시험감염에 대해 보호성일 수 있다.

또 다른 측면에서, 제약상 허용되는 담체 중에 본원에서 제공하는 벡터를 포함하는 제약 조성물을 개시한다.

추가의 또 다른 측면에서, 대상체에서 캄필로박터에 대한 면역 반응을 향상시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 대상체에게 본원에서 제공하는 벡터를 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 향상된 면역 반응은 IgA 항체 반응을 포함하고, 반응은 보호 반응일 수 있다.

추가의 측면에서, 본원에서는 캄필로박터 감염에 대한 저항성을 향상시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 대상체에게 본원에서 개시하는 벡터를 유효량으로 투여하여 대상체가 캄필로박터에의 후속 노출 후, 감염에 대해 저항성이도록 하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 향상된 면역 반응은 IgA 항체 반응을 포함하고, 반응은 보호 반응일 수 있다.

도 1은 종래의 배양 및 콜로니 형성 단위 (CFU) 측정에 의해 측정된 바, x축 상의 배양가능한 캄필로박터 제주니의 개수를 보여주는 정량적 PCR에 대한 표준 곡선을 나타내는 그래프이다. 정량적 PCR에서 형광값과 역치의 교차점에서의 사이클 수를 y축에 제시하였다.
도 2는 씨. 제주니 (5 x 10⁷ cfu/ml)에 의한 시험감염 후 11일째의, 염수, 또는 캄필로박터 펩티드 cj0982 (서열 9), cj0113 (서열 7) 또는 cj0420 (서열 8)를 발현하는 살모넬라 벡터 (10⁸ cfu/병아리)로 백신 접종을 받은 병아리에서의 log cfu/g 회장 내용물을 보여주는 그래프이다. 종래 방법에 의해 회장의 점막 내층으로부터 추출된 총 DNA에 대해 정량적 PCR을 수행하였다. 결과는 평균 +/- SEM (n=10)으로 나타내었다. 다른 소문자를 가진 군은 유의적으로 상이한 것이다 (P<0.05).
도 3은 씨. 제주니 (1 x 10⁷ cfu/ml)에 의한 시험감염 후 11일째의, 염수, 항원성 폴리펩티드 삽입체를 포함하지 않는 살모넬라 벡터 또는 cj0113 삽입체 (서열 7)를 포함하는 살모넬라 벡터 (10⁸ cfu/병아리)로 백신 접종을 받은 병아리에서의 log cfu/g 회장 내용물을 보여주는 그래프이다. 종래 방법에 의해 회장의 점막 내층으로부터 추출된 총 DNA에 대해 정량적 PCR을 수행하였다. 결과는 평균 +/- SEM (n=10)으로 나타내었으며, * 표시는 유의차 (P<0.05)를 나타내는 것이다.
도 4는 명시된 벡터 (10⁸ cfu/병아리) 투여 후 21 및 32일째의, ELISA에 의해 측정된 항-캄필로박터 IgG의 상대적인 수준 (S/P 비)을 나타내는 그래프이다. 다른 소문자를 가진 군은 유의적으로 상이한 것이다 (P<0.05).
도 5는 명시된 벡터 (10⁸ cfu/병아리)로 백신 접종한 후 32일째의, 회장 점막 중의 항-캄필로박터 sIgA의 상대적인 수준 (S/P 비)을 나타내는 그래프이다. 다른 소문자를 가진 군은 유의적으로 상이한 것이다 (P<0.05).
도 6은 염수, 삽입체를 포함하지 않는 살모넬라 벡터 또는 항원성 폴리펩티드, cj0113 (서열 7)을 포함하는 상기 벡터 (10⁸ cfu/병아리)로 백신 접종 후 21 및 31일째의 혈청 IgG 수준 (S/P 비), 및 백신 접종한 후 32일째의 회장 점막 중의 sIgA 수준 (S/P 비)을 나타내는 그래프이다. * 표시는 대조군으로부터의 유의차 (P<0.05)를 나타내는 것이다.
도 7은 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 백본 균주 (BSBB), 또는 cj0113 (서열 7) 바실루스 서브틸리스 벡터화된 백신 후보물질을 10⁸ cfu/병아리로 경구 위관영양법을 통해 백신 접종한 후 10일째의 씨. 제주니 특이 혈청 IgG 항체 수준을 보여주는 그래프이다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었으며, * 표시는 두 대조군 모두로부터의 유의차 (P<0.05)를 나타내는 것이다.
도 8은 바실루스 서브틸리스 백본 균주 (BSBB), 또는 cj0113 (서열 7) 바실루스 서브틸리스 벡터화된 백신 후보물질을 10⁸ cfu/병아리로 경구 위관영양법을 통해 백신 접종한 후 10일째의 씨. 제주니 특이 분비성 IgA 항체 수준을 보여주는 그래프이다. 점막은 회장 부위에서 수집하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었으며, * 표시는 두 대조군 모두로부터의 유의차 (P<0.05)를 나타내는 것이다.
도 9는 정량적 PCR에 의해 계수된, 회장 내용물 1 g당 씨. 제주니의 log₁₀ CFU를 나타내는 그래프이다. 바실루스 서브틸리스 백본 균주 (BSBB) 또는 cj0113 (서열 7)을 발현하는 바실루스 서브틸리스 벡터로 백신 접종을 받은 병아리를 씨. 제주니 10⁸ cfu/병아리로 시험감염시킨 후, 10일 후 PCR에 의해 계수하였다. 종래 방법에 의해 회장의 점막 내층으로부터 추출된 총 DNA에 대해 qPCR을 수행하였다. 결과는 평균 log₁₀ cfu/g 회장 내용물 ± SEM (n=10)으로 나타내었으며, * 표시는 대조군으로부터의 유의차 (P<0.05)를 나타내는 것이다.
도 10은 정량적 PCR에 의해 계수된, 칠면조의 회장 내용물 1 g당의 씨. 제주니의 log₁₀ CFU를 나타내는 그래프이다. 백본 균주 또는 cj0113 (서열 7) 살모넬라 벡터화된 백신으로 백신 접종을 받은 칠면조를 씨. 콜라이(C. coli) 1 x 10⁸ cfu/닭으로 시험감염시킨 후, 12일 후 PCR에 의해 계수하였다. 종래 방법에 의해 회장의 점막 내층으로부터 추출된 총 DNA에 대해 qPCR을 수행하였다. 결과는 평균 log₁₀ cfu/g 회장 내용물 ± SEM (n=10)으로 나타내었으며, * 표시는 대조군으로부터의 유의차 (P<0.05)를 나타내는 것이다.

상세한 설명

다중 혈청형의 캄필로박터에 대한 점막성, 체액성, 및 세포 매개성 면역 반응을 유도하는 백신 벡터는 캄필로박터 위장염을 제한하는 유망한 접근법을 제공한다. 이 프로젝트는 비-천연 선형 에피토프 (항원성 폴리펩티드)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 삽입함으로써 백신 개발에서 신규한 접근법을 이용한다. 항원성 폴리펩티드는 백신 벡터 중에서 면역자극성 폴리펩티드, 예컨대, CD154 (CD40L) 또는 HMGB1 (고이동도 군 박스 1)과 함께 조합하여 사용될 수 있다. 항원성 폴리펩티드 및 면역자극성 폴리펩티드는 적합하게는 천연적으로는 본 벡터와 관련이 있는 것으로 밝혀진 폴리펩티드는 아니다. 에피토프 또는 항원성 폴리펩티드 및 면역자극성 폴리펩티드는 재조합 벡터의 표면 상에 발현될 수 있다. 벡터는 박테리아성, 바이러스성, 또는 심지어는 리포솜 벡터일 수 있다. 벡터는 생균, 생균의 약독화된 것이거나, 또는 투여 전에 사멸된 것일 수 있다. 예컨대, 본 실시예에 제시된 것과 같은 실질 예비 데이터를 통해 외래 에피토프를 발현하는 살모넬라 또는 바실루스 구축물이 생체내에서 고역가의 에피토프-특이 항체를 빠르게 유도할 수 있는 것으로 입증되었다. 추가로, 표면 상에 CD154 또는 HMGB1이 공동-발현되었을 때, 외래 에피토프에 대한 항체 반응은 효과적으로 향상되었다.

재조합 DNA 기술을 통해 많은 박테리아 및 바이러스 종을 상대적으로 쉽게 조작할 수 있다. 일부 박테리아 및 바이러스는 경미한 병원성을 지니고 있거나, 비-병원성이지만, 강건한 면역 반응을 발생시킬 수 있다. 이러한 박테리아 및 바이러스를 통해 이종성, 비-천연, 또는 외래 항원에 대한 면역 반응 유도용의 매력적인 백신 벡터를 만들 수 있다. 박테리아성 또는 바이러스성 백신 벡터는 천연 감염을 모방할 수 있고, 강건하고 장기간 지속되는 면역을 발생시킬 수 있다. 백신 벡터는 대개 생산 및 투여가 비교적 저렴하다. 추가로, 상기 벡터는 대개 1개 초과의 항원을 보유할 수 있고, 다수의 감염원에 대해 보호를 제공할 수 있다.

임의의 많은 병원성 유기체로부터의 폴리펩티드 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 백신 벡터 내로 삽입할 수 있고, 이를 발현시켜 항원성 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 항원성 폴리펩티드는 적응 면역계에 의해 특이적으로 인식될 수 있는 폴리펩티드이다. 항원성 폴리펩티드는 면역원성인 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 항원성 폴리펩티드는 병원체-관련, 알레르겐-관련, 종양-관련 또는 질환-관련 항원을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 병원체로는 바이러스, 기생충, 진균 및 박테리아 병원체 뿐만 아니라, 단백질 병원체, 예컨대, 프리온을 포함한다.

항원성 폴리펩티드는 전장 단백질, 또는 그의 일부일 수 있다. 많은 단백질의 면역계 인식은 대개는 에피토프로 지칭되는, 상대적으로 소수의 아미노산에 기초한다는 것이 잘 확립되어 있다. 에피토프는 단지 8-10개의 아미노산일 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 항원성 폴리펩티드는 전장 단백질인 8개의 아미노산 길이의 에피토프 또는 상기 양 극단 사이의 임의의 일부분일 수 있다. 사실상, 항원성 폴리펩티드는 단일 병원체 또는 단백질로부터의 1개 초과의 에피토프를 포함할 수 있다. 적합하게 항원성 폴리펩티드는 천연적으로는 본 벡터와 관련이 없는 폴리펩티드이다. 천연적으로 관련이 없는 것에는 또한 천연적으로 벡터 중에 존재할 수 있지만, 에피토프로서 재조합적으로 발현되고, 융합 단백질로서 다른 폴리펩티드와 함께 조합되어 발현됨으로써, 천연적으로 발현된 폴리펩티드와 비교하였을 때 면역 반응을 차별적으로 나타낼 수 있고, 차별적으로 향상시킬 수 있는 항원성 폴리펩티드를 포함한다.

동일한 에피토프 또는 상이한 단백질로부터의 다중 에피토프의 다중 카피가 백신 벡터 중에 포함되어 있을 수 있다. 동일한 또는 상이한 병원체 또는 질환으로부터의 수개의 에피토프 또는 항원을 단일 백신 벡터로 조합하여 투여함으로써 다중 항원에 대한 면역 반응을 향상시킬 수 있을 것으로 구상된다. 재조합 백신 벡터는 다중 병원성 미생물, 바이러스 또는 종양 관련 항원으로부터의 항원을 코딩할 수 있다. 다중 항원을 발현할 수 있는 백신 벡터를 투여하는 것은 2가지 이상의 질환에 대한 면역을 동시에 유도한다는 이점을 가지고 있다.

폴리뉴클레오티드는 백신 벡터의 염색체 내로 삽입될 수 있거나, 플라스미드 또는 다른 염색체외 DNA 상에 코딩될 수 있다. 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 독립적으로 발현될 수 있거나 (즉, 벡터 중에서 작용성인 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있거나), 벡터 중에서 발현되는 백신 벡터 폴리뉴클레오티드 (즉, 천연 폴리뉴클레오티드 또는 비-천연 폴리뉴클레오티드) 내로 삽입될 수 있다. 적합하게, 백신 벡터 폴리뉴클레오티드는 백신 벡터의 표면 상에서 발현되는 폴리펩티드, 예컨대, 막횡단 단백질을 코딩한다. 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 백신 벡터 폴리뉴클레오티드 서열 내로 해독틀 내로 (in frame) 삽입됨으로써 항원성 폴리펩티드가 벡터의 표면 상에 발현될 수 있도록 할 수 있다. 예를 들어, 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 벡터 폴리뉴클레오티드 서열이 해독틀 내로 계속 존재할 수 있도록 막횡단 단백질의 외부 루프 영역을 코딩하는 영역 중 박테리아 폴리뉴클레오티드 내로 해독틀 내로 삽입될 수 있다. 항원성 폴리펩티드를 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis) 벡터의 lamB 유전자의 외부 루프 내로 삽입시키는 하기 실시예를 참조한다.

별법으로, 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 분비된 폴리펩티드 내로 삽입될 수 있다. 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 매우 다양한 백신 벡터 폴리뉴클레오티드에 삽입됨으로써 항원성 폴리펩티드가 발현될 수 있고, 이는 백신 벡터로 치료받는 대상체의 면역 세포에 제시될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 실시예에서는 수개의 캄필로박터 폴리뉴클레오티드를 살모넬라 엔테리티디스의 lamB 코딩 서열 내로 삽입하였다. 생성된 재조합 박테리아는 박테리아의 표면 상에 상기 삽입된 항원성 폴리펩티드를 발현한다. 재조합 박테리아가 삽입된 항원성 폴리펩티드를 영양 박테리아에서의 표면 발현을 위한 slp 내로, 또는 포자로 발현하도록 상기 폴리뉴클레오티드를 바실루스 서브틸리스의 CotB에 삽입할 수 있다.

벡터는 cjaD (서열 1), cjaA (서열 2) 및 ACE393 (서열 3)을 비롯한 전장 캄필로박터 단백질, 또는 이들 단백질의 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 실시예에서는 하기와 같은 전장 단백질로부터 유래된 항원성 폴리펩티드가 사용되었다: 서열 7 (cjaD 폴리펩티드, 일명 cj0113); 서열 8 (ACE393 폴리펩티드, 일명 cj0420); 및 서열 9 (cjaA 폴리펩티드, 일명 cj0982). 상기 실시예에서 사용된 폴리뉴클레오티드는 각각 서열 4-6으로 제공된다. 상기 실시예에서 사용된 폴리뉴클레오티드는 세린 링커에 의해 이격되어 있고, CD154 아미노산 140-149에 연결되어 있는 서열 7-9의 항원성 폴리펩티드를 가졌다 (항원성 폴리펩티드 및 면역자극성 폴리펩티드의 전, 후, 및 그 사이 중간에 3개의 아미노산).

적합하게, 백신 벡터 내로 삽입되는 항원성 폴리펩티드의 일부는 면역원성이거나, 항원성이다. 면역원성 단편은 세포성 또는 체액성 면역 반응을 유도할 수 있는 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 적합하게, 항원성 폴리펩티드는 전장 단백질일 수 있거나, 적합하게, 전장 서열의 20개 이상의 아미노산, 15개 이상의 아미노산, 10개 이상의 아미노산 또는 8개 이상의 아미노산일 수 있다. 적합하게, 표적 병원체에 대해 발생된 면역 반응은 보호 면역 반응이다. 보호 면역 반응은 표적 병원체, 즉, 캄필로박터에 의한 후속 감염에 의해 유발되는 이환 또는 사망을 차단 또는 감소시킬 수 있는 반응이다.

예컨대, 국제 출원 번호 PCT US07/078785 및 PCT/US2011/022062 (상기 두 출원은 모두 그 전문이 본원에 참고로 포함된다)에 기술되어 있는 바와 같이, 이러한 폴리뉴클레오티드 서열 중 임의의 것이 다른 이종성 병원체 또는 유기체로부터의 폴리펩티드를 비롯한 임의의 다른 항원성 폴리펩티드와 조합하여 사용될 수 있고, 이는 또한 예컨대, CD154 또는 HMGB1 폴리펩티드와 같은 면역자극성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 함께 사용될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다.

대상체의 단백질과 동종성이고, 외래 에피토프에 대해 반응할 수 있도록 면역계를 자극시킬 수 있는 면역자극성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또한 벡터 내로 삽입될 수 있다. 하기에서 더욱 상세하게 기술되는 바와 같이, 벡터는, 대상체에서 CD40에 결합할 수 있고, 상기 벡터 및 그와 관련된 외래 항원성 폴리펩티드에 대해 반응하도록 대상체를 자극할 수 있는 CD154 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 추가로, 벡터는 HMGB1 폴리펩티드 또는 그의 기능적 단편을 포함할 수 있다. 항원성 폴리펩티드와 관련하여 상기 기술된 바와 같이, 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 벡터의 염색체 내로 삽입될 수 있거나, 염색체외에 유지될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 벡터의 다른 부분의 발현을 위해, 또는 폴리펩티드의 분비를 위해 다양한 벡터 폴리뉴클레오티드에 삽입될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다.

비-천연 항원성 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 향상시킬 수 있는 면역자극성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한 항원성 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 면역자극성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결될 수 있고, 이로써 면역자극성 폴리펩티드 및 외래 항원성 폴리펩티드는 백신 벡터 내에서 같은 폴리뉴클레오티드 상에 존재하게 된다. 예를 들어, 항원성 폴리펩티드 및 면역자극성 폴리펩티드는 융합 단백질의 일부일 수 있다. 실시예에서, CD40에 결합할 수 있는 CD154 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한 캄필로박터의 cjaD, cjaA 또는 ACE393으로부터의 항원성 폴리펩티드를 코딩한다. 첨부된 서열 목록 중 잠재적인 폴리펩티드 서열의 일부 예에 관해서는 서열 10-12 및 항원성 폴리펩티드, 면역자극성 폴리펩티드 및 숙주 폴리펩티드 사이의 임의적 세린 링커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해서는 서열 4-6을 참조한다.

실시예에서, 캄필로박터 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 면역자극성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 둘 모두 막횡단 lamB 유전자의 외부 루프에 삽입된다. 다른 막횡단 단백질을 코딩하는 벡터 폴리뉴클레오티드 또한 사용될 수 있다는 것도 당업자는 이해할 것이다. 추가로, 항원성 폴리뉴클레오티드는 염색체외에 존재할 수 있거나, 벡터에 의해 분비될 수 있다. 실시예에서, 캄필로박터 cj0113 항원 (서열 7) 및 면역자극성 펩티드 HMGB1 (서열 20)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바실루스 벡터가 보유하는 플라스미드로부터 발현되었고, 세포 표면 상에서 발현되었다.

적합하게, CD154 폴리펩티드의 길이는 50개 미만의 아미노산이거나, 더욱 적합하게는 40개 미만, 30개 미만 또는 20개 미만의 아미노산이다. 폴리펩티드의 길이는 10 내지 15개의 아미노산, 10 내지 20개의 아미노산 또는 10 내지 25개의 아미노산일 수 있다. CD154 서열 및 CD40 결합 영역은 다양한 종들간에 고도로 보존되어 있는 것은 아니다. 닭 및 인간의 CD154 서열은 각각 서열 13 및 서열 14로 제공된다.

CD154의 CD40 결합 영역은 인간, 닭, 오리, 마우스, 및 소를 비롯한 많은 종에 대해 결정되었고, 이는 각각 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 및 서열 19로 제시되어 있다. CD40 결합 영역의 서열에 있어서 종들 사이에는 가변성이 존재하지만, CD154의 CD40에의 종간 결합이 보고된 바 있다. 예를 들어, 인간 CD154 폴리펩티드가 닭에서 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 따라서, 종 특이 CD154 폴리펩티드 또는 이종성 CD154 폴리펩티드를 사용하여 본 발명을 수행할 수 있다.

HMGB1 (고이동도 군 박스 1) 단백질은 최초로 DNA 구조 및 안정성에 중요한 DNA 결합 단백질로서 확인되었다. 이는 어떤 서열 특이성없이 DNA에 결합하는, 편재하여 발현되는 핵 단백질이다. 상기 단백질은 고도로 보존적이며, 식물에서부터 포유동물에까지 발견된다. 제브라피쉬, 닭 및 인간 HMGB1 아미노산 서열은 각각 서열 28, 서열 20 및 서열 27로 제공된다. 포유동물 전체에 걸쳐 상기 서열의 아미노산 동일성은 98%로서 고도로 보존되어 있으며, 아미노산 변경은 보존적이다. 따라서, 한 종으로부터의 HMGB1 단백질은 또 다른 종으로부터의 것으로 기능적으로 치환될 가능성을 가지고 있을 수 있다. 전장 HMGB1 단백질 또는 그의 일부가 본원에 기술된 백신 벡터에서 HMGB1 폴리펩티드로서 사용될 수 있다. HMGB1은 서열 21 및 22에 제시된 A 박스라고 지칭되는 것, 및 서열 23 및 24에 제시된 B 박스라고 지칭되는 것인 2개의 DNA 결합 영역을 가지고 있다. 문헌 [Andersson and Tracey, Annu. Rev. Immunol. 2011, 29: 139-162] (상기 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다)을 참조한다.

HMGB1은 염증의 매개자이고, 예컨대, 괴사 세포로부터의 핵 손상의 신호로서의 역할을 한다. HMGB1은 또한 단백질의 아세틸화, 핵을 가로지르는 전위 및 분비를 필요로 하는 프로세스에서 단핵구/대식세포 계통의 세포에 의해 능동적으로 분비될 수 있다. 세포외 HMGB1은 진행성 당화 최종 생성물에 대한 수용체 (RAGE)를 통한 및 톨-유사 수용체 패밀리 (TLR)의 구성원, 특히, TLR4를 통한 신호전달에 의해 염증의 강력한 매개자로서의 역할을 한다. RAGE 결합 활성이 확인되었고, 이는 서열 25의 폴리펩티드를 필요로 한다. TLR4 결합은 HMGB1의 B 박스에서 발견되는 것인, 서열 20의 106번 위치의 시스테인을 필요로 한다.

HMGB1의 염증성 활성은 전장 단백질을 필요로 하지 않으며, 기능적 단편이 확인되었다. B 박스는 HMGB1의 염증유발 효과를 매개하는 데 충분한 것으로 나타났고, 따라서, 서열 23 및 24는 본 발명의 맥락에서 HMGB1 폴리펩티드 또는 그의 기능적 단편이다. 추가로, RAGE 결합 부위 및 염증유발 시토카인 활성이 각각 서열 25 및 서열 26으로 맵핑되었다. 따라서, 이러한 폴리펩티드는 본 발명의 맥락에서 HMGB1 폴리펩티드의 기능적 단편이다.

당업자는 예컨대, 국제 공개 번호 WO02092004 (이는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다)의 방법과 같은 방법을 사용하여 염증유발 시토카인 활성을 자극시킬 수 있는 HMGB1 폴리펩티드 및 그의 단편을 확인할 수 있다. 적합하게, HMGB1 폴리펩티드는 서열 20의 아미노산 150-183의 RAGE 결합 도메인 (서열 25 또는 그의 상동체), 및 서열 20의 아미노산 89-109 사이의 염증유발 시토카인 활성 도메인 (서열 26 또는 그의 상동체)을 포함한다. 특히, HMGB1 폴리펩티드 및 그의 기능적 단편 또는 상동체는 서열 20-28의 HMGB1 폴리펩티드와 동일하거나, 또는 99% 이상 동일, 98% 이상 동일, 95% 이상 동일, 90% 이상 동일, 85% 이상 동일, 또는 80% 이상 동일한 폴리펩티드를 포함한다.

HMGB1 폴리펩티드는 벡터 중에 존재하는 1개 초과의 항원성 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 향상시키기 위해 사용될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. HMGB1로부터의 폴리펩티드는 적어도 부분적으로는 수지상 세포를 활성화시켜 IL-1, IL-6, IFN-γ 및 TNF-α의 생산을 자극시킴으로써 면역 반응을 자극시킨다. 적합하게, HMGB1은 벡터 표면 상에 발현될 수 있다.

항원성 폴리펩티드의 적어도 일부 및 HMGB1 폴리펩티드 또는 또 다른 면역자극성 폴리펩티드의 적어도 일부는 백신 벡터의 표면 상에 존재할 수 있다. 백신 벡터의 표면 상에 존재하는 것으로는 막횡단 단백질 내에 포함되어 있거나, 막횡단 단백질과 상호작용하거나, 막횡단 단백질, 막 지질 또는 막 부착 탄수화물에 공유적으로 또는 화학적으로 교차 결합된 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드는 막횡단 단백질 내의 N-말단, C-말단 또는 그 내부의 어느 곳에 (즉, 막횡단 단백질의 두 아미노산 사이에 삽입), 또는 막횡단 단백질의 하나 이상의 아미노산을 대신하여 (즉, 결실-삽입) 펩티드 결합을 통해 연결된 폴리펩티드를 포함하는 아미노산을 가짐으로써 막횡단 단백질 내에 포함되어 있을 수 있다. 적합하게, 폴리펩티드는 막횡단 단백질의 외부 루프 내로 삽입될 수 있다. 적합한 막횡단 단백질은 cotB 및 lamB이지만, 다수의 적합한 막횡단 단백질이 이용가능하다는 것을 당업자는 이해할 것이다.

별법으로, 폴리펩티드는 막 중의 단백질, 지질, 또는 탄수화물에, 또는 바이러스 벡터가 사용되는 경우에는 캡시드에 당업자가 이용가능한 방법을 통해 공유적으로 또는 화학적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 디술피드 결합 또는 비오틴-아비딘 교차 결합은 백신 벡터의 표면 상에 항원성 및 HMGB1 폴리펩티드를 제시하는 데 사용될 수 있다. 적합하게, 항원성 폴리펩티드 및 HMGB1 폴리펩티드는 융합 단백질의 일부이다. 두 폴리펩티드는 펩티드 결합을 통해 직접적으로 연결될 수 있거나, 그 둘 내로 삽입된 링커 또는 제3 단백질의 섹션에 의해 이격되어 있을 수 있다.

실시예에서, 벡터 중 일부는 서열이 서로 함께, 그리고 그가 삽입되어 있는 살모넬라 폴리뉴클레오티드와 함께 해독틀 내로 존재할 수 있도록 캄필로박터 항원성 폴리펩티드 (cj0113, cj0420 및 cj0982) 및 면역자극성 폴리펩티드 (CD154 아미노산 140-149 또는 HMGB1 또는 그의 기능적 단편)가 동일한 폴리뉴클레오티드 (lamB) 상에서 코딩되도록 한다. 일부 실시양태에서, 링커는 발현된 폴리펩티드 중에서 수개의 아미노산이 2개의 폴리펩티드를 분리할 수 있도록 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과 면역자극성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 사이에 부가될 수 있다. 링커는 단일 아미노산을 코딩하는 3개의 뉴클레오티드일 수 있거나, 그보다 훨씬 더 장쇄인, 예를 들어, 10개 이상의 아미노산을 코딩하는 30개의 뉴클레오티드일 수 있다. 실시예에서는, 9개의 뉴클레오티드로 된 링커가 사용되었으며, 이는 3개의 세린 잔기를 코딩하였다. 당업자는 사용될 수 있는 많은 다른 유형의 링커들을 쉽게 구상할 수 있을 것이다.

또한, 폴리뉴클레오티드는 단일 카피로, 또는 다중 카피로 존재할 수 있다. 예를 들어, 3개의 항원성 폴리펩티드 카피 및 3개의 면역자극성 폴리펩티드 카피가 막횡단 단백질의 동일한 외부 루프에서 발견될 수 있거나, 수개의 다른 벡터 단백질내에서 발현될 수 있다. 대체 실시양태에서, 면역자극성 폴리펩티드 및 항원성 폴리펩티드는 상이한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다.

본 방법에서 사용하기 위한 잠재적인 백신 벡터로는 바실루스, 살모넬라 (살모넬라 엔테리티디스), 시겔라(Shigella), 에스케리키아 (이. 콜라이(E. coli)), 예르시니아(Yersinia), 보르데텔라(Bordetella), 락토코쿠스(Lactococcus), 락토바실루스(Lactobacillus), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 비브리오(Vibrio) (비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae)), 리스테리아(Listeria), 아데노바이러스, 폭스바이러스, 헤르페스바이러스, 알파바이러스, 및 아데노-관련 바이러스를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 적합하게, 백신 벡터는 GRAS 유기체이다. 백신 벡터는 복제할 수 없도록 불활성되거나 사멸된 상태일 수 있다. 박테리아성 또는 바이러스성 백신 벡터를 불활성화시키거나 사멸시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 예컨대, 포르말린 불활성화, 항생제 기반 불활성화, 열처리 및 에탄올 처리를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 백신 벡터는 리포솜 기반 벡터일 수 있다.

벡터 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물 또한 제공한다. 제약상 허용되는 담체는 생체내 투여에 적합한 임의의 담체이다. 제약상 허용되는 담체는 물, 완충 용액, 글루코스 용액 또는 박테리아 배양액을 포함할 수 있다. 조성물의 추가 성분으로는 적합하게는 부형제, 예컨대, 안정화제, 보존제, 희석제, 유화제 및 활택제를 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 담체 또는 희석제의 예로는 안정화제, 예컨대, 탄수화물 (예컨대, 소르비톨, 만니톨, 전분, 수크로스, 글루코스, 덱스트란), 단백질, 예컨대, 알부민 또는 카제인, 단백질 함유 작용제, 예컨대, 소 혈청 또는 탈지유 및 완충제 (예컨대, 포스페이트 완충제)를 포함한다. 특히, 상기 안정화제가 조성물에 첨가되는 경우, 조성물은 냉동 건조 또는 분무 건조에 적합하다.

본원에 기술된 벡터를 투여함으로써 대상체에서 캄필로박터에 대한 면역 반응을 향상시키는 방법 또한 제공한다. 벡터는 벡터에 대한 면역 반응을 자극시킬 수 있는 HMGB1 폴리펩티드 또는 CD154 폴리펩티드 및 항원성 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 벡터는 대상체의 비-천연 항원성 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 향상시키는 데 유효한 양으로 대상체에게 투여된다. 적합하게, 캄필로박터에 의한 시험감염에 대한 면역 반응은 향상된다.

면역 반응을 향상시키는 것은 항체 반응을 향상시키는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 벡터 투여 후 대조군과 비교하여 적합하게는, IgA 반응이 향상되고, 더욱 적합하게는, 분비성 IgA 반응이 향상된다. 대조군은 벡터 투여 이전의 동일한 대상체, 벡터 단독, 또는 비관련 또는 비-캄필로박터 항원성 폴리펩티드를 발현하는 벡터를 투여받은 유사한 대상체일 수 있다. 항체 반응, 적합하게, IgA 반응은 대조군 대상체의 반응과 비교하여 2배, 3배, 4배, 5배 또는 그 초과만큼 증가될 수 있다. 향상된 면역 반응은 또한 본원에 기술된 벡터의 투여 이후 대상체에서 성장 또는 복제하고, 집락형성할 수 있는 캄필로박터의 능력을 감소시킬 수 있다. 상기와 같은 감소는 벡터를 투여받은 대상체를 캄필로박터 감염으로 시험감염시키고, 대조군 대상체와 비교하여 대상체에서 집락형성 및 복제할 수 있는, 즉, 대상체를 감염시킬 수 있는 박테리아의 능력을 모니터링함으로써 시험될 수 있다. 대상체에서 캄필로박터의 성장은 1 로그, 2 로그, 3 로그, 4 로그, 5 로그 또는 그 초과만큼 감소될 수 있다. 벡터를 투여받은 대상체에서의 캄필로박터의 성장은 검출 수준 미만일 수 있다.

추가로, 캄필로박터 감염에 대한 저항성을 향상시키는 방법을 개시한다. 간략하면, 본 방법은 면역 반응을 유도시키는 데 유효한 양으로 캄필로박터 항원성 폴리펩티드를 포함하는, 상기 기술된 벡터를 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 캄필로박터 감염에 대한 저항성을 향상시키는 것은 캄필로박터 감염의 발병률을 감소시키는 것, 한 숙주로부터 또 다른 숙주로의 캄필로박터 감염 확산 제한, 대상체에서의 캄필로박터 복제, 단일 숙주 내에서의 침입 또는 확산을 감소시키는 것, 캄필로박터 감염과 관련된 이환의 감소, 및 캄필로박터 감염의 지속 기간 단축을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

벡터 투여는 대상체가 캄필로박터에 의해 이환되지 못하도록, 또는 예컨대, 위장염 또는 GBS와 같은 질환의 임의의 징후가 겉으로 나타나지 못하게 할 수 있다. 캄필로박터에 대한 저항성 증가는 또한 항체 생산, 적합하게는, IgA 생산 증가를 포함할 수 있다. 항체 반응, 적합하게는, IgA 반응은 대조군 대상체의 반응과 비교하여 2배, 3배, 4배, 5배 또는 그 초과만큼 증가될 수 있다. 향상된 면역 반응은 또한 본원에 기술된 벡터의 투여 이후 대상체에서 성장 또는 복제하고, 집락형성할 수 있는 캄필로박터의 능력을 감소시킬 수 있다. 상기와 같은 감소는 벡터를 투여받은 대상체를 캄필로박터 감염으로 시험감염시키고, 대조군 대상체와의 비교로서 대상체에서 집락형성 및 복제할 수 있는, 즉, 대상체를 감염시킬 수 있는 박테리아의 능력을 모니터링함으로써 시험될 수 있다. 대상체에서 캄필로박터의 성장은 1 로그, 2 로그, 3 로그, 4 로그, 5 로그 또는 그 초과만큼 감소될 수 있다. 벡터를 투여받은 대상체에서의 캄필로박터의 성장은 검출 수준 미만일 수 있다.

본원에 기술된 모든 방법에서 사용하기 위한 항원성 폴리펩티드는 하기 논의된 바와 같이 cjaD, cjaA 또는 ACE393으로부터의 것일 수 있다. 국제 특허 공개 번호 WO2008/036675 (상기 특허는 그의 전문이 본원에 참고로 포함된다)에 기술된 스카리스(scarless) 부위-지정 돌연변이 시스템을 포함하나 이로 제한되는 것은 아닌, 당업계에 공지된 다양한 방법으로 벡터 내로 항원성 폴리펩티드를 삽입할 수 있다. 벡터는 상기 논의된 바와 같이 면역 반응을 향상시킬 수 있는 폴리뉴클레오티드와 함께, 캄필로박터 항원성 폴리펩티드를 발현하도록 조작된 박테리아일 수 있다. 특히, CD154 또는 HMGB1 폴리펩티드는 항원성 폴리펩티드에 대한 대상체의 면역 반응을 향상시키기 위해 벡터에 의해 발현될 수 있다. 상기 방법에서 사용되는 벡터는 본 방법에서 투여 또는 사용되기 이전에 약독화되거나 사멸될 수 있다.

유용한 투여량은 대상체의 연령, 체중, 및 종, 투여 방식 및 경로, 및 면역 반응이 그에 대해서 추구되는 것인 병원체의 유형에 따라서 달라질 것이다. 조성물은 면역 반응을 일으키는 데 충분한 임의의 용량의 벡터로 투여될 수 있다. 박테리아 벡터의 경우, 10³ 내지 10¹⁰개의 박테리아, 10⁴ 내지 10⁹개의 박테리아, 또는 10⁵ 내지 10⁷개의 박테리아 범위인 용량이 적합한 것으로 구상된다. 조성물은 단 1회 투여될 수 있거나, 또는 면역 반응을 증가시키기 위하여 2회 이상 투여될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 1주, 2주, 또는 3주 또는 그 초과의 간격을 두고 2회 이상 투여될 수 있다. 박테리아 벡터는 적합하게는 투여 이전에 생존력 있는 것이지만, 일부 실시양태에서, 박테리아 벡터는 투여 이전에 사멸될 수 있다. 일부 실시양태에서, 박테리아 벡터는 대상체에서 복제가 가능할 수 있는 반면, 다른 실시양태에서, 박테리아 벡터는 약독화될 수 있고/거나, 대상체에서 복제가 불가능할 수 있다.

동물 또는 인간에게로의 투여를 위해, 조성물은 비내로, 점막으로, 분무에 의해 진피내로, 비경구적으로, 피하로, 경구적으로, 에어로졸에 의해 또는 근육내로인 것을 비롯한, 다양한 수단에 의해 투여될 수 있다. 점안 투여 또는 음용수 또는 음식물에의 첨가가 추가적으로 적합한 투여 수단이다. 닭의 경우, 조성물은 난내 (in ovo) 투여될 수 있다.

본 방법과 관련하여, 대상체로는 척추동물, 적합하게는, 포유동물, 적합하게는, 인간, 또는 조류, 적합하게는 가금류, 예컨대, 닭 또는 칠면조를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 감염의 다른 동물 모델 또한 사용될 수 있다. 면역 반응을 향상시키는 것은 대상체의 면역계에 의해 매개되는 치료적 또는 예방적 효과를 유도하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 캄필로박터에 의한 후속 감염으로부터 대상체가 보호되는 경우에, 면역 반응은 향상된 것이다. 구체적으로, 면역 반응을 향상시키는 것은 예컨대, 도 4-8에서 입증된 바와 같이, 항체 생산의 향상, 항체 중쇄의 클래스 스위칭 향상, 항원 제시 세포의 성숙, 헬퍼 T 세포의 자극, 세포용해 T 세포의 자극, 또는 T 및 B 세포 기억 유도를 포함할 수 있다. 실시예에서는 벡터 투여 이후 분비성 IgA 양의 증가가 관찰되었고, 이는 후속 캄필로박터 감염으로부터의 보호와 상관관계가 있었다.

동일하거나 상이한 병원체로부터의 수개의 에피토프 또는 항원을 단일 벡터 중에 조합하여 투여함으로써 다중 항원 및 그의 관련된 병원체에 대한 면역 반응을 향상시킬 수 있을 것으로 구상된다. 재조합 백신 벡터는 다중 병원성 미생물, 바이러스 또는 종양 관련 항원으로부터의 항원을 코딩할 수 있다. 다중 항원을 발현할 수 있는 백신 벡터를 투여하는 것은 2가지 이상의 질환에 대한 면역을 동시에 유도한다는 이점을 가지고 있다.

항원을 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드는 백신 벡터 게놈 중 임의의 비-필수 부위에 삽입될 수 있거나, 별법으로, 당업계에 주지된 방법을 사용하여 플라스미드 상에 보유될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 삽입을 위해 적합한 한 부위는 막횡단 단백질의 외부 부분 내에 위치하거나, 분비 경로를 위한 이종성 폴리뉴클레오티드를 표적화하는 서열에 커플링된다. 폴리뉴클레오티드의 삽입을 위해 적합한 막횡단 단백질의 일례로 살모넬라의 lamB 유전자가 있다. 이종성 폴리뉴클레오티드로는 백신 벡터 이외의 병원성 미생물 또는 바이러스로부터 선택된 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 즉, 비-천연 폴리펩티드를 코딩하는 비-천연 폴리뉴클레오티드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

하기 실시예는 오직 예시적인 목적만을 위한 것이며, 본 발명의 범주, 또는첨부된 특허청구범위의 범주를 제한하는 의미는 없다. 본원에서 인용된 모든 참고 문헌은 그 전문이 본원에서 참고로 포함한다.

실시예

살모넬라 백신 후보물질 균주의 약독화

(ATCC 기탁 번호 PTA-7871, PTA-7872 및 PTA-7873으로서 이용가능한) 앞서 기술된 바와 같은 에스. 엔테리티디스 게놈의 aroA 및/또는 htrA 유전자에 정의된 비가역적 결실 돌연변이를 도입함으로써 살모넬라 엔테리티디스 파지 유형 13A (에스. 엔테리티디스)를 약독화시켰다. 간략하면, 에스. 엔테리티디스의 박테리아 게놈 중 표적 유전자 서열을 카나마이신-저항성 (Km^R) 유전자 서열로 대체하였다. 이는 3S-PCR, 및 3S-PCR 산물을 pKD46 플라스미드를 함유하는 전기적격 살모넬라 세포 내로 전기천공시키는 것을 사용함으로써 수행되었다. 생성된 세포 혼합물을 Km으로 보충된 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅시켜 Km^R 유전자를 함유하는 양성 클론에 대해 선택하였다. Km^R 유전자를 관심의 대상이 되는 유전자 (aroA 또는 htrA)와 상동성인 서열 측면에 위치하도록 배치함으로써 Km^R 유전자를 관심의 대상이 되는 유전자를 함유하는 게놈 영역 내로 삽입하였다. 일단 Km^R 돌연변이체를 수득하고 나면, PCR 및 DNA 서열 분석에 의해 결실 돌연변이를 확인하였다. 에피토프 삽입을 시작하기 전에 모든 Km^R 유전자를 제거하였다.

재조합 백신 후보물질의 구축

3가지 잠재적인 후보물질 항원성 폴리펩티드를 선택하였다: Omp18/cjaD (cj0113), cjaA (cj0982) 및 ACE393 (cj0420). 선택된 폴리펩티드는 하기와 같았고:

모든 삽입체는 추가로 CD154의 아미노산 140-149에 대한 서열을 함유하였다.

문헌 [Cox et al. Scarless and site-directed mutagenesis in Salmonella enteritidis chromosome. BMC Biotechnol 2007;7:59]의 방법을 사용하여 cj0113-CD154 (cj0113), cj0420-CD154 (cj0420) 또는 cj0982c-CD154 (cj0982)의 안정적인 통합된 카피를 함유하는 재조합 에스. 엔테리티디스 균주를 구축하였다. 간략하면, 루프 9의 상류 및 하류 영역에 상동성인, 대략 200-300 염기쌍의 DNA가 양측에서 측면에 위치하는 I-SceI 효소 부위 및 Km^R 유전자를 포함하는 PCR 산물의 설계에 의해 lamB 유전자의 루프 9 내로 Km^R 유전자와 함께 I-SceI 효소 부위를 도입하였다. 사용된 프라이머는 하기 표 I에 제시되어 있다. PCR 산물을 pKD46 플라스미드를 함유하는 전기적격 약독화된 살모넬라 세포 내로 전기천공시키고, 생성된 세포 혼합물을, Km으로 보충된 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅시켜 이제 Km^R 유전자를 함유하는 양성 클론에 대해 선택하였다. 루프 9에서 Sce-I/Km 돌연변이를 유발한 후, 상기 영역을 코돈-최적화된 외래 에피토프 DNA 서열에 의해 대체하였다 (문헌 [Burns DM, Beacham IR. Rare codons in E. coli and S. typhimurium signal sequences. FEBS Lett 1985;189(2):318-24.]). 상기 제2의 3S-PCR 반응을 수행함으로써 루프 9 상류 및 하류 영역 측면에 위치하는 외래 에피토프 삽입체를 생산하고, 생성된 PCR 산물을, 상기 기술된 Sce-I/Km 돌연변이를 함유하는 전기적격 SE13A 내로 전기천공시켰다. 또한, 플라스미드 pBC-I-SceI가, 외래 에피토프 서열이 SE13A 게놈 내로 삽입되어 있는 LamB 유전자의 루프 9 영역 중 I-SceI 효소 부위에 갭을 형성하는 서열을 인식하고 절단하는 I-SceI 효소를 생산함에 따라, 상기 플라스미드를 삽입체와 함께 세포 내로 전기천공시켰다. 플라스미드는 또한 그와 함께 이전의 I-SceI/Km 돌연변이에 대해 역-선택하기 위해 돌연변이가 새로운 선택 마커를 가져야 하는, Km^R 유전자를 대체하는 삽입체로서 클로람페니콜 (Cm) 저항성 유전자 (Cm^R)를 보유한다. 전기천공 후, 양성 돌연변이체 선택을 위해 25 ㎍/mL Cm을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 세포를 플레이팅시켰다.

<표 I>

일단 양성 돌연변이/삽입체로 의심되면, PCR 및 DNA 서열 분석을 수행하여 삽입 서열이 존재하는지 및 올바른지를 확인하였다.

캄필로박터 제주니에 의한 시험감염

육계로부터의 씨. 제주니의 3가지 야생형 단리물을 대수증식기 성장까지 개별적으로 성장시키고, 조합하고, 연속으로 희석시키고, 앞서 기술된 바와 같이 (문헌 [Cole et al. Effect of aeration and storage temperature on Campylobacter concentrations in poultry semen. Poult Sci 2004;83:1734-8.]) 종래의 배양 계수를 위해 확산 플레이팅시켰다. 분광광도적 밀도 및 기작성된 표준 곡선과의 비교를 사용하여 경구 위관영양법에 의한 시험감염을 위해 이들을 대략 10⁷ 내지 10⁸ cfu/ml로 희석시켰다. 시험감염을 수반하는 각 실험에 대하여 실험적으로 측정된 투여된 cfu를 기록하였다 (하기 참조).

백신 접종 연구 1

제1 면역화 연구에서, 부화일의 육계 210마리를 지방 상업적 부화장으로부터 입수하고, 이를 4가지 처리군 중 하나로 무작위적으로 배정하였다: 염수 단독 (음성 대조군), 또는 3가지 백신 후보물질 군, 즉 cj0113, cj0420 또는 cj0982 중 하나; 한 우리당 n=50마리. 각 처리군을 신선한 소나무 깔개가 있는 개별 계사에서 하우징하고, 물과 사료를 자유로이 공급하였다. 부화당일, 각 처리군의 병아리 모두에 대략 10⁸ cfu/mL의 적절한 처리물을 함유하는 용액 0.25 mL를 경구 위관영양법을 통해 접종하였다. 부화 후 21일째, 각 처리군의 병아리 모두에 1 x 10⁷ cfu/ml를 함유하는 용액 0.25 mL를 경구 위관영양법을 통해 씨. 제주니로 시험감염시켰다. 부화 후 3, 11, 21 (추가 접종 이전) 및 32일째, 각 처리군으로부터의 10-15마리를 인도적으로 치사시키고, 살모넬라 백신 벡터 균주의 기관 침입, 집락형성 및 클리어런스를 측정하기 위해 간, 비장, 및 맹장 편도를 무균적으로 절제하였다. 또한, 부화 후 21 및 32일째, 회장 절편을 절제하고, qRT-PCR에서 사용하기 위해 프로세싱하고, 32일째 별도의 회장 샘플을 절제하여, 염수 중에서 1:5로 희석시키고, 이를 사용하여 분비성 이뮤노글로불린 A (sIgA)에 대해 시험하였다. 추가로, 백신 접종 후 21 및 32일째 한 처리군당 10마리의 병아리로부터 혈액 샘플을 수집하고, 혈청을 사용하여 항체 반응에 대해 측정하였다.

백신 접종 연구 2

실험 2에서, 부화일의 육계 110마리를 지방 상업적 부화장으로부터 입수하고, 이를 2가지 처리군 중 하나로 무작위적으로 배정하였다: 염수 단독 (비히클 대조군) 또는 살모넬라 백신 후보물질, cj0113 (우리당 n=55마리). 각 처리군을 신선한 소나무 깔개가 있는 개별 계사에서 하우징하고, 물과 사료를 자유로이 공급하였다. 부화당일, 각 처리군의 병아리 모두에 대략 10⁸ cfu/mL의 적절한 처리물을 함유하는 용액 0.25 mL를 경구 위관영양법을 통해 접종하였다. 부화 후 21일째, 각 처리군의 병아리 모두에 1 x 10⁷ cfu/ml를 함유하는 용액 0.25 mL를 경구 위관영양법을 통해 씨. 제주니로 시험감염시켰다. 부화 후 3, 11, 21 (추가 접종 이전) 및 32일째, 각 처리군으로부터의 10-15마리를 인도적으로 치사시키고, 살모넬라 백신 벡터 균주의 기관 침입, 집락형성 및 클리어런스를 측정하기 위해 간, 비장, 및 맹장 편도를 무균적으로 절제하였다. 또한, 부화 후 21 및 32일째, 회장 절편을 절제하고, qRT-PCR에서 사용하기 위해 프로세싱하였다. 추가로, 부화 후 21 및 32일째 한 처리군당 10마리의 병아리로부터 혈액 샘플을 수집하고, 혈청을 사용하여 항체 반응에 대해 측정하였다.

백신 접종 연구 3

제3 실험은 (상기 기술된) 백신 접종 실험 2와 유사하였으나, 단, 벡터 그 자체의 경구 백신 접종을 위한 대조군으로서 캄필로박터 에피토프를 포함하지 않는 에스. 엔테리티디스 13A aroA/htrA (SE13A)로 이루어진 제3 군을 추가하였다. 샘플 수집에 관한 모든 것은 백신 접종 연구 2와 동일하였으나, 단, 부화 후 32일째 추가의 회장 절편을 사용하여 실험 1에서와 같이 sIgA 조사를 위해 점막층을 수거하였다.

캄필로박터 항체 반응 측정

두 면역화 연구 모두에서 병아리로부터 수집된 혈청을 ELISA에 사용하여 상대적인 항체 반응을 측정하였다. 간략하면, 96-웰 플레이트의 개별 웰을 씨. 제주니로 코팅하였다. 4℃에서 밤새 항원 부착을 진행시킨 후, 플레이트를 세척하고, 실온에서 1시간 동안 슈퍼블럭(Superblock) (피어스(Pierce))으로 차단시켰다. 이어서, 플레이트를 앞서 수집된 혈청의 1:50 희석액과 함께 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 다시 세정한 후, 추가로 1시간 동안 퍼옥시다제-표지된 항-닭 IgG 2차 항체 (잭슨 이뮤노라보라토리즈(Jackson Immunolaboratories))와 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 세정한 후, 퍼옥시다제 기질 키트 (BD OptEIA, 피셔 사이언픽(Fisher Scienfic))를 사용하여 플레이트를 발색시키고, 450 nm에서 분광광도계로 흡광도를 판독하였다. 각 플레이트는 양성 대조군 및 음성 대조군을 함유하였는데, 여기서, 백신 접종을 받은 병아리 및 면역전 닭 혈청으로부터의 풀링된 샘플이 각각 처리군으로부터의 혈청을 대체하였다. 양성 대조군, 음성 대조군 및 실험 샘플에 대하여 얻은 흡광도를 사용함으로써 하기 계산식을 이용하여 샘플 대 양성 대조군 비 (S/P 비)를 계산하였다: (샘플 평균 -음성 대조군 평균)/(양성 대조군 평균 - 음성 대조군 평균) (문헌 ([Brown et al. Detection of antibodies to Mycoplasma gallisepticum in egg yolk versus serum samples. J Clin Microbiol 1991;29(12):2901-3] 및 [Davies et al. Evaluation of the use of pooled serum, pooled muscle tissue fluid (meat juice) and pooled faeces for monitoring pig herds for Salmonella. J Appl Microbiol 2003;95(5): 1016-25.])). sIgA 검출을 위해 사용된 ELISA 방법은 혈청 이뮤노글로불린의 경우에 대한 상기 기술된 검정법과 유사하였으나, 단, 본 발명자들은 항-닭 IgG 항체 접합체 대신 양고추냉이 퍼옥시다제 (겐텍스(GenTex))와 접합된 염소 항-닭 IgA를 사용하였다.

씨. 제주니에 대한 DNA 단리 및 정량적 PCR

QIAmp DNA 스툴 미니 키트(QIAmp DNA Stool Mini Kit) (퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 회장 샘플로부터 총 DNA를 추출하였다. 제조사가 포함시킨 프로토콜을 하기 방식으로 약간 변형시켰다: 점막층을 포함하도록 회장 내용물을 취하고, 빙냉 PBS + 0.05% 트윈 (Tween) 20을 사용하여 1:5 (w/v)로 희석시키고; 2.0 ml 미량원심분리용 튜브 중 포함된 ASL 완충제 1 ml에 1 ml의 슬러리를 첨가하고, 와동시키고, 5분 동안 70℃로 가열하였다. 이어서, DNA가 최종 부피 50 ul로 용리되었을 때, 제조사의 권고에 따라 마지막 단계로 진행하였다.

앞서 공개된 방법을 약간 변형시켜 사용함으로써 씨. 제주니를 정량적으로 측정하였다 (문헌 [Skanseng et al. Comparison of chicken gut colonisation by the pathogens Campylobacter jejuni and Clostridium perfringens by realtime quantitative PCR. Mol Cell Probes 2006;20(5):269-7)9]). MX3005P (애질러트 테크놀러지(Agilent Technology))에서 사용하기 위해 검정법을 최적화시키고, 브릴리언트(Brilliant) II QPCR 마스터 믹스 (애질러트 테크놀러지스), 모든 다른 혼합물 성분, 프라이머, 프로브 및 사이클링 주기는 공개된 바와 같이 그대로 하였다.

연속으로 10배 희석되고, 회장 내용물의 일정한 배경에 첨가된 씨. 제주니의 순수한 배양물을 사용하여 표준 곡선 (도 1)을 작성하고; 앞서 기술된 바와 같이 총 DNA 단리를 수행하였다.

통계학적 분석

JMP™ 통계 소프트웨어를 사용하여 각 군과 대조군 사이의 차이를 비교하기 위해 불균등 분산이라는 가정하에 스튜던츠 양측 t-검정(Student's two-tailed t-test)을 사용하여 데이터를 분석하였다. P<0.05인 값을 유의적인 것으로 간주하였다.

결과

종래 미생물 계수 기법을 사용한 씨. 제주니 정량화 대 qPCR 사이에는 탁월한 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌으며 (도 1), 두 방법 간에는 99% 초과의 상관관계가 있었다. 실험 1에서, 본 발명자들은, 백신 접종 후 3일째까지 맹장 편도 내에서 3가지 벡터화된 백신 후보물질에 의한 유의적인 집락형성 수준 뿐만 아니라; 동시점에 cj0113 발현 벡터에 의한 내부 기관의 유의적인 침입을 관찰하게 되었다 (표 II). 그러나, 백신 접종 후 11일째까지 3가지 벡터 모두의 집락형성의 양은 감소하였고, 백신 접종 후 21일째까지는 맹장 편도 뿐만 아니라, 내부 기관으로부터 벡터가 완전하게 제거되었다 (표 II). 본 발명자들은, 표 II에 제시된 데이터에 의해 밝혀진 바와 같이, 본 발명자들의 백신 후보물질로서 cj0113을 발현하는 벡터를 사용한 본 발명자들의 후속 백신 접종 연구 (실험 2)에서도 같은 경향이 있는 것을 관찰하게 되었다.

<표 II>

백신 접종 후 21일째 닭을 씨. 제주니로 시험감염시켰다. 백신 접종 후 21 및 32일째 (시험감염 후 0 및 11일째)에 회장 점막 샘플을 수득하고, 상기 기술된 바와 같이, 장내 씨. 제주니를 계수하기 위한 DNA 샘플 시료로 사용하였다. 벡터 후보물질 cj0420 및 cj0982로 백신 접종한 결과, 회장 샘플 중에 존재하는 씨. 제주니의 수준은 각각 대략 1 로그 및 2 로그만큼 감소하였다 (P<0.05). cj0113 백신 후보물질을 사용한 경우에는 대조군 닭과 비교하였을 때, 회장 중 씨. 제주니가 4.8 로그만큼 현저하게 감소한 것으로 나타났다 (P<0.05) (도 2).

실험 2에서는 cj0113을 발현하는 백신 후보물질만을 사용하여 1차 면역화 연구를 반복 수행하였다. 본 연구에서, qPCR 데이터 결과, 염수만을 받은 닭과 비교하였을 때, cj0113 SE-벡터화된 백신을 투여받은 닭에서는 씨. 제주니가 대략 5 로그만큼 감소한 것으로 나타났다 (표 III). 추가로, 실험 3에서, cj0113 벡터로 백신 접종한 결과, 씨. 제주니는 염수, 또는 에피토프 삽입체를 함유하지 않는 살모넬라 모 균주와 비교하였을 때, 대략 4 로그만큼 감소하여, 검출가능한 수준 미만으로 되었다 (도 3).

<표 III>

백신 접종 후 21 및 32일째 각 실험에서 수집된 혈청 샘플을 사용하여 씨. 제주니-특이 IgG 항체를 측정하였다. 제1 실험에서, 오직 염수만을 받은 군과 비교하였을 때 3가지 백신 후보물질 (cj0420, cj0113, cj0982) 모두 양 시점 모두에서 유의적으로 더 높은 항체 수준을 산출하였다 (도 4). 또한, 제1 실험에서, cj0420 및 cj0982와 비교하였을 때, cj0113을 백신 접종을 받은 군에서는 항체 역가가 유의적으로 더 높았다 (도 4). 또한, ELISA를 사용하여 캄필로박터에 대해 특이적인 점막 sIgA 항체 수준을 측정하였다. 이러한 데이터는 염수군 및 cj0420 또는 cj0982를 받은 2개의 군과 비교하였을 때, 백신 벡터 cj0113이 sIgA의 수준을 유의적으로 증가시켰다는 것을 시사한다 (도 5). 백신 후보물질로서 오직 cj0113만을 사용한 제2 및 제3 연구로부터 얻은 결과는 실험 1과 유사한 결과를 나타내었는데, 여기서 백신 접종을 받은 닭은 오직 염수만을 받은 닭과 비교하였을 때 씨. 제주니에 대한 항원-특이 IgG 및 sIgA 항체를 유의적으로 더 높은 수준으로 가졌다 (실험 3에 대한 데이터는 도 6에 제시되어 있다). 또한, 제3 실험에서, 백본 균주 (SE13)에 대한 항체 수준은 염수 대조군과 유사하였다 (도 6).

바실루스 벡터화된 백신 접종 연구

영양 세포 발현을 위한 이종성 단백질의 생산

cj0113 및 HMGB1에 대한 바실루스 서브틸리스 코돈 최적화된 삽입 서열 (각각 서열 4 및 20)을 부가함으로써 다중 클로닝 부위에서 모바이오테크/보카 사이언티픽(MoBioTec/Boca Scientific: 미국 플로리다주 보카레이턴)으로부터 구입한 플라스미드 pHT10 (문헌 [Nguyen et al., 2007])을 형질전환시켰다. 올바른 서열 삽입을 확인하기 위해 DNA 서열을 분석하였다. 이어서, 새로 변형된 플라스미드를 바실루스 내로 형질전환시켰다. 간략하면, 바실루스 배양물을 HS 배지 (0.5% 글루코스, 50 ㎍/ml DL-트립토판, 50 ㎍/ml 우라실, 0.02% 카세인 가수분해물, 0.1% 효모 추출물, 8 ㎍/ml 아르기닌, 0.4 ㎍/ml 히스티딘, 1 mM MgSO₄로 보충된 스피지젠(Spizizen) 배지) 중 37℃에서 밤새 성장시켰다. 밤새 배양된 배양물 1 ml를 20 ml LS 배지 (0.5% 글루코스, 5 ㎍/ml DL-트립토판, 5 ㎍/ml 우라실, 0.01% 카세인 가수분해물, 0.1% 효모 추출물, 1 mM MgSO₄, 2.5 mM MgCl₂, 0.5 mM CaCl₂로 보충된 스피지젠 배지)에 접종하고, 30℃에서 3-4시간 동안 진탕시키면서 인큐베이션시켰다. LS 배양물 1 ml를 인출하고, 10 ㎕의 0.1 M EGTA를 첨가하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 1-2 ㎍의 플라스미드 DNA를 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 진탕시키고, 선택 항생제를 포함하는 LB 플레이트 상에 플레이팅시켰다. 상기 형질전환된 바실루스 종은 이에 1 mM IPTG로 유도되었을 때에 HMGB1 및 캄필로박터로부터 이종성 에피토프 서열(cj0113)을 생산하였다.

백신 접종 연구

백신 접종 시험감염에서, 부화일의 육계 100마리를 지방 상업적 부화장으로부터 입수하고, 이를 4가지 처리군 중 하나로 무작위적으로 배정하였다: 염수 단독, 바실루스 벡터 단독 (BSBB), 또는 10⁶ 또는 10⁸의 바실루스 백신 후보물질, cj0113 (우리당 n=25마리). 각 처리군을 신선한 소나무 깔개가 있는 개별 계사에서 하우징하고, 물과 사료를 자유로이 공급하였다. 부화당일, 각 처리군의 병아리 모두에 대략 10⁶ cfu/mL의 백본 벡터 균주 또는 cj0113 바실루스 벡터를 함유하는 용액 0.25 mL를 경구 위관영양법을 통해 접종하였다. 10일째, 병아리들은 부화당일날 받은 것과 같은 처리의 추가 백신 접종을 받았다. 부화 후 21일째, 각 처리군의 병아리들 모두에 상기 기술된 바와 같이 제조된 1 x 10⁷ cfu/ml를 함유하는 용액 0.25 mL를 경구 위관영양법을 통해 씨. 제주니로 시험감염시켰다. 부화 후 3, 11, 21 (추가 접종 이전) 및 32일째, 각 처리군으로부터의 10-15마리를 인도적으로 치사시키고, 백신 벡터 균주의 기관 침입, 집락형성 및 클리어런스를 측정하기 위해 간, 비장, 및 맹장 편도를 무균적으로 절제하였다. 또한, 부화 후 21 및 36일째, 회장 절편을 절제하고, qRT-PCR에서 사용하기 위해 프로세싱하였다. 추가로, 백신 접종 후 21 및 36일째 한 처리군당 15마리의 병아리로부터 혈액 샘플을 수집하고, 혈청을 사용하여 항체 반응에 대해 측정하였다.

결과

백신 접종 후 36일째 수집된 혈청 샘플을 사용하여 씨. 제주니-특이 IgG 항체를 측정하였다. cj0113 폴리펩티드를 발현하는 바실루스 벡터로 백신 접종을 한 결과 염수 단독을 또는 공 벡터를 받은 군과 비교하였을 때, 항체 수준이 유의적으로 더 높게 증가하였다 (도 7). 또한, 백신 접종 후 36일째에 ELISA를 사용하여 캄필로박터에 대해 특이적인 점막 sIgA 항체 수준을 측정하였다. 이러한 데이터는 cj0113을 발현하는 백신 벡터가 공 벡터와 비교하였을 때 sIgA의 수준을 유의적으로 증가시켰다는 것을 시사한다 (도 8).

백신 접종 후 24일째 씨. 제주니로 닭을 시험감염시켰다. 백신 접종 후 24 및 36일째 (시험감염 후 0 및 11일째)에 회장 점막 샘플을 수득하고, 상기 기술된 바와 같이, 장내 씨. 제주니를 계수하기 위한 DNA 샘플 시료로 사용하였다. 바실루스 cj0113 벡터로 백신 접종한 결과, 회장 샘플 중에 존재하는 씨. 제주니의 수준이 대략 3 로그만큼 감소하였다 (P<0.05) (도 9).

칠면조 병아리에서의 백신 접종 연구

살모넬라-벡터화된 cj0113 백신이 닭에서 시험감염 후 캄필로박터 회수를 감소시키는 데 효과적이었기 때문에, 본 발명자들은 백신이 칠면조 병아리에서도 또한 효과가 있다고 가정하였다. 따라서, 상기 에피토프 전달 시스템의 용도를 추가로 평가하기 위해, 칠면조 병아리에서의 씨. 콜라이 시험감염에 대한 백신의 유효성을 시험하는 실험을 설계하였다.

ΔSE-cj0113 백신을 상기와 같이 구축하였다. 살모넬라 엔테리티디스 파지 유형 13A (SE13A)를 상기 백신 후보물질에 대한 백본 균주로서 사용하였다. 상기 단리물을 앞서 기술된 바와 같이 aroA 및 htrA 유전자에서의 비가역적 유전자 결실에 의해 이중으로 약독화시켰다. 이어서, cj0113 삽입체 및 면역자극성 분자인 CD-154를 혼입시켜 상기 결실을 함유하는 재조합 균주를 추가로 변형시켰다 (ΔSE-cj0113). 상기 서열을 앞서 기술된 바와 같이 통합하였다.

본 실험에서는 70마리의 칠면조 병아리를 지방 부화장으로부터 입수하였다. 이를 2가지 처리군 중 하나로 무작위적으로 배정하고, 태깅하였다. 30마리의 칠면조 병아리에는 10⁸ cfu/병아리 ΔSE-cj0113을 경구 위관영양법을 통해 공급하고, 남은 병아리는 염수를 이용하여 모의 처리하였다. 21일째, 칠면조 병아리를 경구 위관영양법을 통해 1.5 x 10⁸ cfu/병아리의 씨. 콜라이로 시험감염시켰다. 테트라티오네이트 브로쓰 중에서 농축시키고, 브릴리언트 그린(Brilliant Green) 아가 상에 플레이팅시킴으로써 벡터 회수에 대해 검출하기 위해 3일째 (N=10), 21일째 (N=10) 및 35일째 (N=10) 간, 비장, 및 맹장 편도를 무균적으로 절제하였다. 21 및 35일째, 추가 분석을 위해 섭취물 (N=10) 및 조직 (N=5) 샘플을 수집하였다. 씨. 콜라이의 계수를 위해 qPCR을 사용하여 사육된 칠면조 병아리의 회장으로부터 얻은 섭취물을 분석하였다. 같은 부위로부터 조직 샘플을 수집하고, 총 RNA를 추출하였다. 인터페론-감마 및 TNF-알파 유사 백신 반응을 평가하였다.

결과

앞서 닭에서 밝혀진 바와 같이, 살모넬라-벡터화된 cj0113 백신에 의한 백신 접종 후, 칠면조 병아리에서는 유의적인 면역 반응이 발달하였다. 시험감염 후, 회장내 캄필로박터 콜라이는 단지 벡터만이 있는 대조군과 비교하였을 때 약 5 로그만큼 감소되어 있었다 (도 10). 살모넬라-벡터화된 cj0113 백신에 의한 백신 접종은 닭과 유사한 칠면조에서도 효과가 있는 것으로 보인다.

SEQUENCE LISTING <110> THE BOARD OF TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF ARKANSAS <120> VACCINE AND METHODS TO REDUCE CAMPYLOBACTER INFECTION <130> 5658-00102 <150> US 61/353,039 <151> 2010-06-09 <160> 44 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 165 <212> PRT <213> Campylobacter jejuni cjaD <400> 1 Met Lys Lys Ile Leu Phe Thr Ser Ile Ala Ala Leu Ala Val Val Ile 1 5 10 15 Ser Gly Cys Ser Thr Lys Ser Thr Ser Val Ser Gly Asp Ser Ser Val 20 25 30 Asp Ser Asn Arg Gly Ser Gly Gly Ser Asp Gly Trp Asp Ile Asp Ser 35 40 45 Lys Ile Ser Gln Leu Asn Asp Thr Leu Asn Lys Val Tyr Phe Asp Phe 50 55 60 Asp Lys Phe Asn Ile Arg Pro Asp Met Gln Asn Val Val Ser Thr Asn 65 70 75 80 Ala Asn Ile Phe Asn Thr Glu Val Ser Gly Val Ser Ile Thr Val Glu 85 90 95 Gly Asn Cys Asp Glu Trp Gly Thr Asp Glu Tyr Asn Gln Ala Leu Gly 100 105 110 Leu Lys Arg Ala Lys Ala Val Lys Glu Ala Leu Ile Ala Lys Gly Val 115 120 125 Asn Ala Asp Arg Ile Ala Val Lys Ser Tyr Gly Glu Thr Asn Pro Val 130 135 140 Cys Thr Glu Lys Thr Lys Ala Cys Asp Ala Gln Asn Arg Arg Ala Glu 145 150 155 160 Phe Lys Leu Ser Arg 165 <210> 2 <211> 279 <212> PRT <213> Campylobacter jejuni cjaA <400> 2 Met Lys Lys Ile Leu Leu Ser Val Leu Thr Ala Phe Val Ala Val Val 1 5 10 15 Leu Ala Ala Cys Gly Gly Asn Ser Asp Ser Lys Thr Leu Asn Ser Leu 20 25 30 Asp Lys Ile Lys Gln Asn Gly Val Val Arg Ile Gly Val Phe Gly Asp 35 40 45 Lys Pro Pro Phe Gly Tyr Val Asp Glu Lys Gly Asn Asn Gln Gly Tyr 50 55 60 Asp Ile Ala Leu Ala Lys Arg Ile Ala Lys Glu Leu Phe Gly Asp Glu 65 70 75 80 Asn Lys Val Gln Phe Val Leu Val Glu Ala Ala Asn Arg Val Glu Phe 85 90 95 Leu Lys Ser Asn Lys Val Asp Ile Ile Leu Ala Asn Phe Thr Gln Thr 100 105 110 Pro Gln Arg Ala Glu Gln Val Asp Phe Cys Ser Pro Tyr Met Lys Val 115 120 125 Ala Leu Gly Val Ala Val Pro Lys Asp Ser Asn Ile Thr Ser Val Glu 130 135 140 Asp Leu Lys Asp Lys Thr Leu Leu Leu Asn Lys Gly Thr Thr Ala Asp 145 150 155 160 Ala Tyr Phe Thr Gln Asn Tyr Pro Asn Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Asp 165 170 175 Gln Asn Thr Glu Thr Phe Ala Ala Leu Met Asp Lys Arg Gly Asp Ala 180 185 190 Leu Ser His Asp Asn Thr Leu Leu Phe Ala Trp Val Lys Asp His Pro 195 200 205 Asp Phe Lys Met Gly Ile Lys Glu Leu Gly Asn Lys Asp Val Ile Ala 210 215 220 Pro Ala Val Lys Lys Gly Asp Lys Glu Leu Lys Glu Phe Ile Asp Asn 225 230 235 240 Leu Ile Ile Lys Leu Gly Gln Glu Gln Phe Phe His Lys Ala Tyr Asp 245 250 255 Glu Thr Leu Lys Ala His Phe Gly Asp Asp Val Lys Ala Asp Asp Val 260 265 270 Val Ile Glu Gly Gly Lys Ile 275 <210> 3 <211> 190 <212> PRT <213> Campylobacter jejuni ACE 393 <400> 3 Met Lys Lys Val Leu Leu Ser Ser Leu Val Ala Val Ser Leu Leu Ser 1 5 10 15 Thr Gly Leu Phe Ala Lys Glu Tyr Thr Leu Asp Lys Ala His Thr Asp 20 25 30 Val Gly Phe Lys Ile Lys His Leu Gln Ile Ser Asn Val Lys Gly Asn 35 40 45 Phe Lys Asp Tyr Ser Ala Val Ile Asp Phe Asp Pro Ala Ser Ala Glu 50 55 60 Phe Lys Lys Leu Asp Val Thr Ile Lys Ile Ala Ser Val Asn Thr Glu 65 70 75 80 Asn Gln Thr Arg Asp Asn His Leu Gln Gln Asp Asp Phe Phe Lys Ala 85 90 95 Lys Lys Tyr Pro Asp Met Thr Phe Thr Met Lys Lys Tyr Glu Lys Ile 100 105 110 Asp Asn Glu Lys Gly Lys Met Thr Gly Thr Leu Thr Ile Ala Gly Val 115 120 125 Ser Lys Asp Ile Val Leu Asp Ala Glu Ile Gly Gly Val Ala Lys Gly 130 135 140 Lys Asp Gly Lys Glu Lys Ile Gly Phe Ser Leu Asn Gly Lys Ile Lys 145 150 155 160 Arg Ser Asp Phe Lys Phe Ala Thr Ser Thr Ser Thr Ile Thr Leu Ser 165 170 175 Asp Asp Ile Asn Leu Asn Ile Glu Val Glu Ala Asn Glu Lys 180 185 190 <210> 4 <211> 120 <212> DNA <213> Campylobacter jejuni cjaD <400> 4 tcctcctccg gtgttagcat caccgttgaa ggtaactgtg atgaatgggg taccgatgaa 60 tataaccagg cgtcctcctc ctggatgacc acctcctatg cgccgacctc ctcctcctcc 120 <210> 5 <211> 162 <212> DNA <213> Campylobacter jejuni cjaA <400> 5 tcctcctcca aagttgcgct gggtgttgcg gttccgaaag atagcaacat caccagcgtt 60 gaagatctga aagataaaac cctgctgctg aacaaaggta ccaccgcgga tgcgtcctcc 120 tcctggatga ccacctccta tgcgccgacc tcctcctcct cc 162 <210> 6 <211> 120 <212> DNA <213> Campylobacter jejuni ACE 393 <400> 6 tcctcctcca aagatatcgt tctggatgcg gaaatcggtg gtgttgcgaa aggtaaagat 60 ggtaaagaaa aatcctcctc ctggatgacc acctcctatg cgccgacctc ctcctcctcc 120 <210> 7 <211> 21 <212> PRT <213> Campylobacter jejuni Cj0113 <400> 7 Gly Val Ser Ile Thr Val Glu Gly Asn Cys Asp Glu Trp Gly Thr Asp 1 5 10 15 Glu Tyr Asn Gln Ala 20 <210> 8 <211> 21 <212> PRT <213> Campylobacter jejuni Cj0420 <400> 8 Lys Asp Ile Val Leu Asp Ala Glu Ile Gly Gly Val Ala Lys Gly Lys 1 5 10 15 Asp Gly Lys Glu Lys 20 <210> 9 <211> 35 <212> PRT <213> Campylobacter jejuni Cj0982 <400> 9 Lys Val Ala Leu Gly Val Ala Val Pro Lys Asp Ser Asn Ile Thr Ser 1 5 10 15 Val Glu Asp Leu Lys Asp Lys Thr Leu Leu Leu Asn Lys Gly Thr Thr 20 25 30 Ala Asp Ala 35 <210> 10 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide: Cj0113-CD154 <400> 10 Gly Val Ser Ile Thr Val Glu Gly Asn Cys Asp Glu Trp Gly Thr Asp 1 5 10 15 Glu Tyr Asn Gln Ala Trp Met Thr Thr Ser Tyr Ala Pro Thr Ser 20 25 30 <210> 11 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide: Cj0420-CD154 <400> 11 Lys Asp Ile Val Leu Asp Ala Glu Ile Gly Gly Val Ala Lys Gly Lys 1 5 10 15 Asp Gly Lys Glu Lys Trp Met Thr Thr Ser Tyr Ala Pro Thr Ser 20 25 30 <210> 12 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide: Cj0982-CD154 <400> 12 Lys Val Ala Leu Gly Val Ala Val Pro Lys Asp Ser Asn Ile Thr Ser 1 5 10 15 Val Glu Asp Leu Lys Asp Lys Thr Leu Leu Leu Asn Lys Gly Thr Thr 20 25 30 Ala Asp Ala Trp Met Thr Thr Ser Tyr Ala Pro Thr Ser 35 40 45 <210> 13 <211> 272 <212> PRT <213> Gallus gallus <220> <221> misc_feature <223> CD154 chicken <400> 13 Met Asn Glu Ala Tyr Ser Pro Ala Ala Pro Arg Pro Met Gly Ser Thr 1 5 10 15 Ser Pro Ser Thr Met Lys Met Phe Met Cys Phe Leu Ser Val Phe Met 20 25 30 Val Val Gln Thr Ile Gly Thr Val Leu Phe Cys Leu Tyr Leu His Met 35 40 45 Lys Met Asp Lys Met Glu Glu Val Leu Ser Leu Asn Glu Asp Tyr Ile 50 55 60 Phe Leu Arg Lys Val Gln Lys Cys Gln Thr Gly Glu Asp Gln Lys Ser 65 70 75 80 Thr Leu Leu Asp Cys Glu Lys Val Leu Lys Gly Phe Gln Asp Leu Gln 85 90 95 Cys Lys Asp Arg Thr Ala Ser Glu Glu Leu Pro Lys Phe Glu Met His 100 105 110 Arg Gly His Glu His Pro His Leu Lys Ser Arg Asn Glu Thr Ser Val 115 120 125 Ala Glu Glu Lys Arg Gln Pro Ile Ala Thr His Leu Ala Gly Val Lys 130 135 140 Ser Asn Thr Thr Val Arg Val Leu Lys Trp Met Thr Thr Ser Tyr Ala 145 150 155 160 Pro Thr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr His Glu Gly Lys Leu Lys Val Glu 165 170 175 Lys Ala Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Val Ser Phe Cys Thr Lys 180 185 190 Ala Ala Ala Ser Ala Pro Phe Thr Leu Tyr Ile Tyr Leu Tyr Leu Pro 195 200 205 Met Glu Glu Asp Arg Leu Leu Met Lys Gly Leu Asp Thr His Ser Thr 210 215 220 Ser Thr Ala Leu Cys Glu Leu Gln Ser Ile Arg Glu Gly Gly Val Phe 225 230 235 240 Glu Leu Arg Gln Gly Asp Met Val Phe Val Asn Val Thr Asp Ser Thr 245 250 255 Ala Val Asn Val Asn Pro Gly Asn Thr Tyr Phe Gly Met Phe Lys Leu 260 265 270 <210> 14 <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> CD154 human <400> 14 Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu 20 25 30 Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg 35 40 45 Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val 50 55 60 Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser 65 70 75 80 Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys 85 90 95 Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu 100 105 110 Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser 115 120 125 Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly 130 135 140 Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln 145 150 155 160 Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr 165 170 175 Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser 180 185 190 Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala 195 200 205 Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His 210 215 220 Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn 225 230 235 240 Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe 245 250 255 Gly Leu Leu Lys Leu 260 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> CD154 partial human <400> 15 Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Cys 1 5 10 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Gallus gallus <220> <221> misc_feature <223> Chicken CD154 peptide <400> 16 Trp Met Thr Thr Ser Tyr Ala Pro Thr Ser Ser 1 5 10 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Anas sp. <220> <221> misc_feature <223> Duck CD154 peptide <400> 17 Trp Asn Lys Thr Ser Tyr Ala Pro Met Asn 1 5 10 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Mus sp. <220> <221> misc_feature <223> Mouse CD154 peptide <400> 18 Trp Ala Lys Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Lys 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Bos taurus <220> <221> misc_feature <223> Cow CD154 peptide <400> 19 Trp Ala Pro Lys Gly Tyr Tyr Thr Leu Ser 1 5 10 <210> 20 <211> 190 <212> PRT <213> Gallus gallus <220> <221> misc_feature <223> Chicken HMGB1 amino acid <400> 20 Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ser Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60 Lys Ala Asp Lys Leu Arg Tyr Glu Lys Glu Met Lys Asn Tyr Val Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 85 90 95 Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Phe Arg Pro Lys 100 105 110 Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys 115 120 125 Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr 130 135 140 Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala 145 150 155 160 Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Val Asp Ala Gly Lys Lys Val Val Ala 165 170 175 Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Glu Asp 180 185 190 <210> 21 <211> 85 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide: HMGB1 box a1 <400> 21 Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ser Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60 Lys Ala Asp Lys Leu Arg Tyr Glu Lys Glu Met Lys Asn Tyr Val Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Glu Thr 85 <210> 22 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide: HMGB1 box a2 <400> 22 Pro Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu 1 5 10 15 Arg Trp Lys Thr Met Ser Ser Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met 20 25 30 Ala Lys Ala Asp Lys Leu Arg Tyr Glu Lys Glu Met Lys Asn Tyr Val 35 40 45 Pro Pro Lys Gly Glu Thr 50 <210> 23 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide: HMGB1 box b1 <400> 23 Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe 1 5 10 15 Cys Ser Glu Phe Arg Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser 20 25 30 Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala 35 40 45 Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu 50 55 60 Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr 65 70 <210> 24 <211> 69 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide: HMGB1 box b2 <400> 24 Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu 1 5 10 15 Phe Arg Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp 20 25 30 Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp 35 40 45 Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu 50 55 60 Lys Asp Ile Ala Ala 65 <210> 25 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide: HMGB1 RAGE Binding domain <400> 25 Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe 1 5 10 15 Cys Ser Glu Phe Arg 20 <210> 26 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide: HMGB1 proinflammatory cytokine activity <400> 26 Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr Arg Ala Lys Gly 1 5 10 15 Lys Val Asp Ala Gly Lys Lys Val Val Ala Lys Ala Glu Lys Ser Lys 20 25 30 Lys <210> 27 <211> 215 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> HMGB1 <400> 27 Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60 Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 85 90 95 Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys 100 105 110 Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys 115 120 125 Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr 130 135 140 Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala 145 150 155 160 Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val 165 170 175 Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu 180 185 190 Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Asp Glu 195 200 205 Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu 210 215 <210> 28 <211> 205 <212> PRT <213> Danio rerio <220> <221> misc_feature <223> Zebra fish HMGB1 <400> 28 Met Gly Lys Asp Pro Thr Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr Ala 1 5 10 15 Tyr Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro Glu 20 25 30 Ala Thr Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg Trp 35 40 45 Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala Lys 50 55 60 Leu Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Asn Tyr Ile Pro Pro 65 70 75 80 Lys Gly Glu Lys Lys Lys Arg Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg 85 90 95 Pro Pro Ser Ala Phe Phe Ile Phe Cys Ser Glu Phe Arg Pro Lys Val 100 105 110 Lys Glu Glu Thr Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Arg Leu 115 120 125 Gly Glu Met Trp Asn Lys Ile Ser Ser Glu Glu Lys Gln Pro Tyr Glu 130 135 140 Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala 145 150 155 160 Tyr Arg Ser Lys Gly Lys Val Gly Gly Gly Ala Ala Lys Ala Pro Ser 165 170 175 Lys Pro Asp Lys Ala Asn Asp Glu Asp Glu Asp Asp Asp Glu Glu Glu 180 185 190 Asp Glu Asp Asp Asp Asp Glu Glu Glu Glu Asp Asp Glu 195 200 205 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: lam-up-f; Loop 9 up <400> 29 tgtacaagtg gacgccaatc 20 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: lam-up-r; Loop 9 up <400> 30 gttatcgccg tctttgatat agcc 24 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: lam-dn-f; Loop 9 dn <400> 31 atttcccgtt atgccgcagc 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: lam-dn-r; Loop 9 dn <400> 32 gttaaacaga gggcgacgag 20 <210> 33 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: Km-f; I-SceI/Kmr gene <400> 33 gctatatcaa agacggcgat aactaactat aacggtccta aggtagcgaa tttccgggga 60 tccgtcga 68 <210> 34 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: Km-r; I-SceI/Kmr gene <400> 34 gctgcggcat aacgggaaat gtaggctgga gctgcttcg 39 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: Kan4f; Inside Kmr gene <400> 35 caaaagcgct ctgaagttcc 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: Kan4r; Inside Kmr gene <400> 36 gcgtgagggg atcttgaagt 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: lam 3f; Outer regions of loop 9 <400> 37 gccatctcgc ttggtgataa 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: lam 3r; Outer regions of loop 9 <400> 38 cgctggtatt ttgcggtaca 20 <210> 39 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: Cj0113f; Insert with loop 9 up <400> 39 ttcatcggta ccccattcat cacagttacc ttcaacggtg atgctaacac cggaggagga 60 gttatcgccg tctttgatat agcc 84 <210> 40 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: Cj0113r; Insert with loop 9 down <400> 40 atgaatgggg taccgatgaa tataaccagg cgtcctcctc ctggatgacc acctcctatg 60 cgccgacctc ctcctcctcc atttcccgtt atgccgcagc 100 <210> 41 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: Cj0420f; Insert with loop 9 up <400> 41 atctttacct ttcgcaacac caccgatttc cgcatccaga acgatatctt tggaggagga 60 gttatcgccg tctttgatat agcc 84 <210> 42 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: Cj0420r; Insert with loop 9 down <400> 42 gtgttgcgaa aggtaaagat ggtaaagaaa aatcctcctc ctggatgacc acctcctatg 60 cgccgacctc ctcctcctcc atttcccgtt atgccgcagc 100 <210> 43 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: Cj0982c-f; Insert with loop 9 up <400> 43 ggttttatct ttcagatctt caacgctggt gatgttgcta tctttcggaa ccgcaacacc 60 cagcgcaact ttggaggagg agttatcgcc gtctttgata tagcc 105 <210> 44 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer: Cj0982c-r; Insert with loop 9 down <400> 44 aagatctgaa agataaaacc ctgctgctga acaaaggtac caccgcggat gcgtcctcct 60 cctggatgac cacctcctat gcgccgacct cctcctcctc catttcccgt tatgccgcag 120 c 121

Claims

서열 9 (cjaA; cj0982), 또는 서열 9의 8개 이상의 아미노산의 단편으로 이루어진 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 천연적으로는 백신 벡터와 관련이 없는 것인, 백신 벡터.
제1항에 있어서, 천연적으로는 벡터와 관련이 없는 면역자극성 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 백신 벡터.
천연적으로는 백신 벡터와 관련이 없는 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열 및 면역자극성 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 항원성 폴리펩티드는 서열 9를 포함하는 서열 2 (cjaA)의 단편인, 백신 벡터.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아인 백신 벡터.
제4항에 있어서, 박테리아가 살모넬라(Salmonella), 에스케리키아(Escherichia), 바실루스(Bacillus) 또는 락토바실루스(Lactobacillus)로부터 선택된 속으로부터의 것인 백신 벡터.
제2항 또는 제3항에 있어서, 박테리아이고, 제1 폴리뉴클레오티드 서열 및 제2 폴리뉴클레오티드 서열이 박테리아의 게놈 내로 통합되어 있는 것인 백신 벡터.
제2항 또는 제3항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 서열의 1개 초과의 카피, 제2 폴리뉴클레오티드 서열의 1개 초과의 카피, 또는 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 서열의 1개 초과의 카피를 포함하는 백신 벡터.
제2항 또는 제3항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 서열이 제2 폴리뉴클레오티드 서열에 해독틀 내로(in frame) 연결되어 있는 것인 백신 벡터.
제2항 또는 제3항에 있어서, 항원성 폴리펩티드 및 면역자극성 폴리펩티드가 백신 벡터의 표면 상에서 발현되는 것인 백신 벡터.
제9항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 서열 및 제2 폴리뉴클레오티드 서열이, 막횡단 단백질의 외부 부분을 코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드 서열 내로 삽입되어 있는 것인 백신 벡터.
제2항 또는 제3항에 있어서, 면역자극성 폴리펩티드가 CD154 폴리펩티드 또는 HMGB1 폴리펩티드인 백신 벡터.
제11항에 있어서, CD154 폴리펩티드가 CD40에 결합할 수 있고 50개 미만의 아미노산을 가지며 서열 13의 아미노산 154-163을 포함하는 것이거나, 서열 15-19로부터 선택된 폴리펩티드를 포함하는 것인 백신 벡터.
제11항에 있어서, HMGB1 폴리펩티드가 서열 20-28로부터 선택된 폴리펩티드를 포함하는 것인 백신 벡터.
제2항 또는 제3항에 있어서, 항원성 폴리펩티드 서열이 서열 9이고, 면역자극성 폴리펩티드가 서열 13-28로부터 선택되거나, 또는 항원성 폴리펩티드 서열 및 면역자극성 폴리펩티드 서열이 서열 12인 백신 벡터.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 투여함에 의해 항체 반응을 유도할 수 있는 백신 벡터.
제15항에 있어서, 항체 반응이 IgA 반응인 백신 벡터.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 백신 접종을 받은 대상체를 캄필로박터(Campylobacter) 종에 의한 후속 감염으로부터 보호할 수 있는 백신 벡터.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 제4 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 백신 벡터.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 백신 벡터 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 캄필로박터 종에 의한 감염으로부터 대상체를 보호하기 위한 제약 조성물.
비-인간 대상체에게 항원성 폴리펩티드에 대한 대상체의 면역 반응을 향상시키는 데 유효한 양의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 백신 벡터를 투여하는 것을 포함하는, 비-인간 대상체에서 면역 반응을 향상시키는 방법.
제20항에 있어서, 면역 반응이 향상된 항체 반응을 포함하는 것인 방법.
제21항에 있어서, 가용성 IgA 항체 반응이 향상되는 것인 방법.
제22항에 있어서, 백신 벡터 투여 후의 IgA 반응이 대조군 벡터를 투여받은 대상체의 IgA 반응에 비하여 3배 이상 증가되는 것인 방법.
제20항에 있어서, 대상체를 캄필로박터 종으로 시험감염(challenge)시키는 것을 추가로 포함하고, 여기서 시험감염 후 대상체에서의 캄필로박터의 성장이 대조군 벡터를 투여받은 대상체와 비교하여 백신 벡터를 투여받은 대상체에서 적어도 2 로그만큼 감소되는 것인 방법.
비-인간 대상체에게 캄필로박터 종에의 후속 노출 후 캄필로박터 감염에 대한 저항성을 향상시키는 데 유효한 양의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 백신 벡터를 투여하는 것을 포함하는, 비-인간 대상체에서 캄필로박터 감염에 대한 저항성을 향상시키는 방법.
제25항에 있어서, 백신 벡터가 약독화되거나, 또는 투여 이전에 사멸된 것인 방법.
제25항에 있어서, 저항성이 항체 생산 증가에 의해 향상된 것인 방법.
제27항에 있어서, 항체 생산 증가가 IgA 반응 증가를 포함하는 것인 방법.
제25항에 있어서, 저항성 증가가, 캄필로박터 종에 의한 후속 감염시에 캄필로박터 성장이 대조군에 비하여 감소되는 것을 특징으로 하는 것인 방법.
제25항에 있어서, 캄필로박터 성장이 대조군 벡터 투여 후의 캄필로박터 성장과 비교하여 적어도 2 로그만큼 감소되는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 백신 벡터를 포함하는, 캄필로박터 종에 의한 감염으로부터 대상체를 보호하기 위한 제약 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 백신 벡터를 포함하는, 캄필로박터 종에의 후속 노출 후 캄필로박터 감염에 대한 저항성을 향상시키기 위한 제약 조성물.