JP2000351735A - カンピロバクターワクチン - Google Patents
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- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
- Y10S424/826—Bacterial vaccine for avian species, e.g. poultry or other birds
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 カンピロバクター転移増殖に対して有効なワ
クチン、当該ワクチンの調製に有効な新規な抗原性蛋白
質を提供する。 【解決手段】 鞭毛のないカンピロバクター（Ｃａｍｐ
ｙｌｏｂａｃｔｅｒ）株に対する抗血清を含む、動物へ
のカンピロバクター転移増殖を予防するためのワクチン
に関する。また、カンピロバクターイェヌニ蛋白質のウ
ェスタンブロットにおいて、鞭毛のないカンピロバクタ
ーイェヌニ変異株に対する抗体を用いた当該ウェスタン
ブロットのインキュベーションの後に視認できるが、野
生型カンピロバクターイェヌニに対する抗体を用いた当
該ブロットのインキュベーションの後には視認できない
こと抗原性蛋白質に関し、さらにそれらのワクチンへの
使用ならびにその製造に関する。
クチン、当該ワクチンの調製に有効な新規な抗原性蛋白
質を提供する。 【解決手段】 鞭毛のないカンピロバクター（Ｃａｍｐ
ｙｌｏｂａｃｔｅｒ）株に対する抗血清を含む、動物へ
のカンピロバクター転移増殖を予防するためのワクチン
に関する。また、カンピロバクターイェヌニ蛋白質のウ
ェスタンブロットにおいて、鞭毛のないカンピロバクタ
ーイェヌニ変異株に対する抗体を用いた当該ウェスタン
ブロットのインキュベーションの後に視認できるが、野
生型カンピロバクターイェヌニに対する抗体を用いた当
該ブロットのインキュベーションの後には視認できない
こと抗原性蛋白質に関し、さらにそれらのワクチンへの
使用ならびにその製造に関する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、カンピロバクター
（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）転移増殖に対するワク
チンに関し、さらにカンピロバクター蛋白質および抗カ
ンピロバクター抗体の当該ワクチン調製のための使用、
および当該ワクチンの調製方法に関する。
（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）転移増殖に対するワク
チンに関し、さらにカンピロバクター蛋白質および抗カ
ンピロバクター抗体の当該ワクチン調製のための使用、
および当該ワクチンの調製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】カンピロバクター属細菌は、運動能に富
んだ、細胞の一方もしくは双方の極に鞭毛を有している
グラム陰性の螺旋形病原性細菌である。これまでに幾つ
かのカンピロバクター種が発見されている。カンピロバ
クターイェヌニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊ
ｕｎｉ）は、家禽類において大変しばしば見出されてい
る。しばしば、カンピロバクターコリ（Ｃａｍｐｙｌｏ
ｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）そして（より低頻度に）最近
ではカンピロバクターヒョレイ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃ
ｔｅｒ ｈｙｏｉｌｅｉ）が豚から見出されている。
んだ、細胞の一方もしくは双方の極に鞭毛を有している
グラム陰性の螺旋形病原性細菌である。これまでに幾つ
かのカンピロバクター種が発見されている。カンピロバ
クターイェヌニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊ
ｕｎｉ）は、家禽類において大変しばしば見出されてい
る。しばしば、カンピロバクターコリ（Ｃａｍｐｙｌｏ
ｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）そして（より低頻度に）最近
ではカンピロバクターヒョレイ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃ
ｔｅｒ ｈｙｏｉｌｅｉ）が豚から見出されている。
【０００３】もちろん、カンピロバクターイェヌニは、
ヒトの下痢との関係において最もしばしば分離されるカ
ンピロバクター種である。ヒトに対するカンピロバクタ
ー感染件数はサルモネラのそれを上回っていることが、
次第に明らかとなってきている（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ
ら、Ｊｏｕｒｎ．ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ ６９；２８１−３０１、１９９０，Ｗａ
ｌｋｅｒら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｖ
ｉｅｗｓ ５０；８１−９４、１９８６，Ｂｕｔｚｌｅ
ｒ、Ｊ−Ｐ．，ＩＳＢＮ０−８４９３−５４４６−３、
ＲＩＶＭ報告番号２１６８５２００２号、ビルトホーベ
ン、オランダ）。とりわけカンピロバクターが、多くの
野生動物、家畜動物、その健康体、病気体のいずれも保
有宿主とする、食肉に発生する動物原性転移増殖細菌で
あることから、ヒトのカンピロバクター転移増殖を抑制
することは難しい。加えて、細菌は多くの異なった転移
増殖経路を有している。細菌は休眠型球菌として屠殺肉
の表面や水中で数週間生存することができる。それゆ
え、細菌は、動物への直接接触や、たとえば牛乳や肉な
どの汚染された水や食物によって、容易にヒトへと媒介
される。Ｃ．イェヌニは、七面鳥、鶏といった鳥類、
牛、羊、馬、齧歯動物などの多くの健康な動物に存在す
る。世界の多数の国で重要な栄養源である鶏肉は、カン
ピロバクターに大変頻繁に汚染されていることが知られ
ている（Ｓｈａｎｅ、（１９９２）Ｓ．Ｍ．，Ａｖｉａ
ｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２１；１８９−２１３）。こ
の状況は開発途上国のみならず、欧州においても同様で
ある。カンピロバクターは家禽の内臓に生育している。
食肉の汚染は、屠殺場において、しばしば重度にカンピ
ロバクターに汚染されている腸管を動物から取り除くと
きに発生する。この屠殺中の汚染を防ぐのは大変に困難
である。オランダでは、食肉工業に高度な衛生基準が適
用されているにもかかわらず、鶏肉の約５０％が汚染さ
れている。最近の鳥類におけるカンピロバクター疫学の
概説が、Ｃ．Ｍ．Ｋａｒｓｓｅｎによって報告されてい
る（ＩＳＢＮ９０−７１４６３−７２−９）。この高頻
度の汚染の結果、調理不充分の家禽肉を扱ったり食した
りすることにより、オランダ（総人口は１５００万人）
だけで毎年約３０万人がカンピロバクター転移増殖に苦
しんでいる。これらの事情は、他の欧州諸国においても
大きく変わるところはない。全世界では、毎年４億件を
超えて発生していると推察されている（Ｐａｃｅら、Ｖ
ａｃｃｉｎｅ、１９９８、１６；１５６３−１５７
４）。カンピロバクターはヒトの腸転移増殖症、そして
より重大な疾病、例えば流産、脳膜炎、虫垂炎、そして
尿管転移増殖などを引き起こす（Ｂｌａｓｅｒら、Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９８１、３０５；１４４
４−１４５２、Ｂｕｔｚｌｅｒら、Ｃｌｉｎｉｃｓｉｎ
Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１９７９，８；７３７
−７６５）。また、Ｇｕｉｌｌａｉｎ−Ｂａｒｒｉ症候
群やＭｉｌｌｅｒ−Ｆｉｓｈｅｒ症候群といった、重篤
な神経性合併症も時々認められる（Ｓｃｈｗｅｒｅｒ
ら、１９９５、Ｊ．Ｅｎｄｏｔｏｘ．Ｒｅｓ．２；３９
５−４０３、およびＳａｌｌｏｗａｙら、１９９６、Ｉ
ｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４；２９４５−２９４
９）。カンピロバクターイェニヌによる下痢は、普通は
自己制限的な転移増殖であり、約２−７日間続く。幼
児、老人および免疫力の低下した患者においては自己制
限的ではなく、抗生物質による処置が必要となる。
ヒトの下痢との関係において最もしばしば分離されるカ
ンピロバクター種である。ヒトに対するカンピロバクタ
ー感染件数はサルモネラのそれを上回っていることが、
次第に明らかとなってきている（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ
ら、Ｊｏｕｒｎ．ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ ６９；２８１−３０１、１９９０，Ｗａ
ｌｋｅｒら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｖ
ｉｅｗｓ ５０；８１−９４、１９８６，Ｂｕｔｚｌｅ
ｒ、Ｊ−Ｐ．，ＩＳＢＮ０−８４９３−５４４６−３、
ＲＩＶＭ報告番号２１６８５２００２号、ビルトホーベ
ン、オランダ）。とりわけカンピロバクターが、多くの
野生動物、家畜動物、その健康体、病気体のいずれも保
有宿主とする、食肉に発生する動物原性転移増殖細菌で
あることから、ヒトのカンピロバクター転移増殖を抑制
することは難しい。加えて、細菌は多くの異なった転移
増殖経路を有している。細菌は休眠型球菌として屠殺肉
の表面や水中で数週間生存することができる。それゆ
え、細菌は、動物への直接接触や、たとえば牛乳や肉な
どの汚染された水や食物によって、容易にヒトへと媒介
される。Ｃ．イェヌニは、七面鳥、鶏といった鳥類、
牛、羊、馬、齧歯動物などの多くの健康な動物に存在す
る。世界の多数の国で重要な栄養源である鶏肉は、カン
ピロバクターに大変頻繁に汚染されていることが知られ
ている（Ｓｈａｎｅ、（１９９２）Ｓ．Ｍ．，Ａｖｉａ
ｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２１；１８９−２１３）。こ
の状況は開発途上国のみならず、欧州においても同様で
ある。カンピロバクターは家禽の内臓に生育している。
食肉の汚染は、屠殺場において、しばしば重度にカンピ
ロバクターに汚染されている腸管を動物から取り除くと
きに発生する。この屠殺中の汚染を防ぐのは大変に困難
である。オランダでは、食肉工業に高度な衛生基準が適
用されているにもかかわらず、鶏肉の約５０％が汚染さ
れている。最近の鳥類におけるカンピロバクター疫学の
概説が、Ｃ．Ｍ．Ｋａｒｓｓｅｎによって報告されてい
る（ＩＳＢＮ９０−７１４６３−７２−９）。この高頻
度の汚染の結果、調理不充分の家禽肉を扱ったり食した
りすることにより、オランダ（総人口は１５００万人）
だけで毎年約３０万人がカンピロバクター転移増殖に苦
しんでいる。これらの事情は、他の欧州諸国においても
大きく変わるところはない。全世界では、毎年４億件を
超えて発生していると推察されている（Ｐａｃｅら、Ｖ
ａｃｃｉｎｅ、１９９８、１６；１５６３−１５７
４）。カンピロバクターはヒトの腸転移増殖症、そして
より重大な疾病、例えば流産、脳膜炎、虫垂炎、そして
尿管転移増殖などを引き起こす（Ｂｌａｓｅｒら、Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９８１、３０５；１４４
４−１４５２、Ｂｕｔｚｌｅｒら、Ｃｌｉｎｉｃｓｉｎ
Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１９７９，８；７３７
−７６５）。また、Ｇｕｉｌｌａｉｎ−Ｂａｒｒｉ症候
群やＭｉｌｌｅｒ−Ｆｉｓｈｅｒ症候群といった、重篤
な神経性合併症も時々認められる（Ｓｃｈｗｅｒｅｒ
ら、１９９５、Ｊ．Ｅｎｄｏｔｏｘ．Ｒｅｓ．２；３９
５−４０３、およびＳａｌｌｏｗａｙら、１９９６、Ｉ
ｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４；２９４５−２９４
９）。カンピロバクターイェニヌによる下痢は、普通は
自己制限的な転移増殖であり、約２−７日間続く。幼
児、老人および免疫力の低下した患者においては自己制
限的ではなく、抗生物質による処置が必要となる。
【０００４】もしヒト用の有効な抗カンピロバクターワ
クチンが利用可能であれば、ヒトへの転移増殖を予防で
きるであろうことは明らかである。しかし、このために
は、例えば耳下腺炎やはしかに見られるような標準的な
ワクチン接種が必要である。これは明らかに実践的では
ない。より論理的な試みは動物からヒトへの、特に家禽
からヒトへの伝播を防ぐことである。これを行うための
もっとも簡便な方法は、カンピロバクター転移増殖に対
して家禽を予防接種することである。しかし、家禽の予
防接種（ヒトの予防接種も同様に）当初予想したよりも
はるかに難しいものである事が判った。それは、カンピ
ロバクターが家禽の消化管に転移増殖するにもかかわら
ず、家禽自身に対しては病原的ではないからである。試
されたワクチンのほとんどは不活化された全細胞調製物
であり、全身的にまたは経口的に、時にはアジュバント
とともに投与された。いくつかの例では、ある程度、消
化管内での転移増殖を減少させることができたが、転移
増殖を回避するワクチンの例は存在しない。また、これ
らいずれのワクチンもカンピロバクターの脱皮（sheddi
ng）を停止させることはできなかった。殺全細胞ワクチ
ンは、サブユニットワクチンと比較したときに、原則と
してそれらはまだすべての有効な免疫原性決定因子を有
しているという理由から、ワクチンの最適候補と考えら
れてきた。全細胞ワクチンの開発の次には、鞭毛由来の
サブユニットワクチンの開発に多くの努力がなされてき
た。鞭毛は、転移増殖過程において認められた免疫優性
抗原と認識されており、さまざまな研究が生体防御にお
けるこの蛋白質の役割を提唱している（Ｍａｒｔｉｎ
ら、Ｉｎｆ．Ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ．１９８９，５７；２
５４２−２５４６、Ｗｅｎｍａｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９８５，２１；１０８−１１
２）。野生株は転移増殖した動物の消化管に残存する一
方で、鞭毛を失った変異株は１，２週間で消失し、消化
管に転移増殖することができないことが知られている。
とりわけ、鞭毛が消化管での転移増殖に重要な役割を、
唯一でないとしても、果たしていると思われる事から、
鞭毛はワクチン調製のための傑出した最も好適な候補で
ある。転移増殖が予防できれば、それは家禽の汚染絶滅
の第一歩となろう。にもかかわらず、カンピロバクター
鞭毛に基づいた有効なワクチンは、生体防御に対して許
容できるレベルには達していない。
クチンが利用可能であれば、ヒトへの転移増殖を予防で
きるであろうことは明らかである。しかし、このために
は、例えば耳下腺炎やはしかに見られるような標準的な
ワクチン接種が必要である。これは明らかに実践的では
ない。より論理的な試みは動物からヒトへの、特に家禽
からヒトへの伝播を防ぐことである。これを行うための
もっとも簡便な方法は、カンピロバクター転移増殖に対
して家禽を予防接種することである。しかし、家禽の予
防接種（ヒトの予防接種も同様に）当初予想したよりも
はるかに難しいものである事が判った。それは、カンピ
ロバクターが家禽の消化管に転移増殖するにもかかわら
ず、家禽自身に対しては病原的ではないからである。試
されたワクチンのほとんどは不活化された全細胞調製物
であり、全身的にまたは経口的に、時にはアジュバント
とともに投与された。いくつかの例では、ある程度、消
化管内での転移増殖を減少させることができたが、転移
増殖を回避するワクチンの例は存在しない。また、これ
らいずれのワクチンもカンピロバクターの脱皮（sheddi
ng）を停止させることはできなかった。殺全細胞ワクチ
ンは、サブユニットワクチンと比較したときに、原則と
してそれらはまだすべての有効な免疫原性決定因子を有
しているという理由から、ワクチンの最適候補と考えら
れてきた。全細胞ワクチンの開発の次には、鞭毛由来の
サブユニットワクチンの開発に多くの努力がなされてき
た。鞭毛は、転移増殖過程において認められた免疫優性
抗原と認識されており、さまざまな研究が生体防御にお
けるこの蛋白質の役割を提唱している（Ｍａｒｔｉｎ
ら、Ｉｎｆ．Ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ．１９８９，５７；２
５４２−２５４６、Ｗｅｎｍａｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９８５，２１；１０８−１１
２）。野生株は転移増殖した動物の消化管に残存する一
方で、鞭毛を失った変異株は１，２週間で消失し、消化
管に転移増殖することができないことが知られている。
とりわけ、鞭毛が消化管での転移増殖に重要な役割を、
唯一でないとしても、果たしていると思われる事から、
鞭毛はワクチン調製のための傑出した最も好適な候補で
ある。転移増殖が予防できれば、それは家禽の汚染絶滅
の第一歩となろう。にもかかわらず、カンピロバクター
鞭毛に基づいた有効なワクチンは、生体防御に対して許
容できるレベルには達していない。
【０００５】上記に述べたような能動的予防接種の次
に、カンピロバクター転移増殖の低減手段として受動的
予防接種が試みられている。Ｔｓｕｂｏｋｕｒａら（１
９９７、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０８；
４５１−４５５）は、カンピロバクターイェヌニ全細胞
に対する抗体を経口的に投与し、続いてカンピロバクタ
ーイェヌニを抗原投与した。彼らは、このようなワクチ
ン処理した鶏の糞中で見られる細菌数が、１−２対数減
少したと主張している。これまでのすべての努力によっ
ても、転移増殖レベルや糞中での細菌脱皮量を顕著に減
ずることのできるような生ワクチン、不活化ワクチン、
サブユニットを基としたワクチンのいずれも、完成まで
には至っていない。今でも、信頼性ある安全なワクチン
またはそれに代わる処置に対するニーズが今もあること
は明らかである。
に、カンピロバクター転移増殖の低減手段として受動的
予防接種が試みられている。Ｔｓｕｂｏｋｕｒａら（１
９９７、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０８；
４５１−４５５）は、カンピロバクターイェヌニ全細胞
に対する抗体を経口的に投与し、続いてカンピロバクタ
ーイェヌニを抗原投与した。彼らは、このようなワクチ
ン処理した鶏の糞中で見られる細菌数が、１−２対数減
少したと主張している。これまでのすべての努力によっ
ても、転移増殖レベルや糞中での細菌脱皮量を顕著に減
ずることのできるような生ワクチン、不活化ワクチン、
サブユニットを基としたワクチンのいずれも、完成まで
には至っていない。今でも、信頼性ある安全なワクチン
またはそれに代わる処置に対するニーズが今もあること
は明らかである。
【０００６】原理的には、家禽を一生涯カンピロバクタ
ー転移増殖から保護する必要はない。上述の通り、彼等
は転移増殖によって苦しむことはない。それゆえ、屠殺
のわずかな前に細菌数や感染圧力を低減できるような処
置が、屠殺の過程に引き続いて起こる汚染を抑制する効
果的な処置となるであろう。そして、結局それが食肉を
経由したカンピロバクターのヒトへの感染を予防できる
ことになるであろう。
ー転移増殖から保護する必要はない。上述の通り、彼等
は転移増殖によって苦しむことはない。それゆえ、屠殺
のわずかな前に細菌数や感染圧力を低減できるような処
置が、屠殺の過程に引き続いて起こる汚染を抑制する効
果的な処置となるであろう。そして、結局それが食肉を
経由したカンピロバクターのヒトへの感染を予防できる
ことになるであろう。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、カン
ピロバクターの転移増殖や脱皮のレベルを減じたり、家
禽の盲腸からカンピロバクターを排除したりすることの
できるワクチンを提供することである。これにより、屠
殺中でのカンピロバクター汚染とそれに引き続くヒトへ
の伝播を回避することができる。
ピロバクターの転移増殖や脱皮のレベルを減じたり、家
禽の盲腸からカンピロバクターを排除したりすることの
できるワクチンを提供することである。これにより、屠
殺中でのカンピロバクター汚染とそれに引き続くヒトへ
の伝播を回避することができる。
【０００８】
【発明の実施の形態】上記のような特徴を有するワクチ
ンが、鞭毛を持たないカンピロバクター変異株に対する
抗体に依拠し得るということは驚くべき知見であった。
このことは、これまでに述べたように、鞭毛が定着と転
移増殖に関係した大切な蛋白質であると認識されてきた
ことからすると、まったく予見できないものであった。
さらに驚くべきことは、このようなワクチンが実際に鞭
毛を持つ野生型カンピロバクターの転移増殖や脱皮を減
じ得ることである。今回は、盲腸から検出レベル以下に
までカンピロバクターを排除することのできるワクチン
が報告された最初の例である。
ンが、鞭毛を持たないカンピロバクター変異株に対する
抗体に依拠し得るということは驚くべき知見であった。
このことは、これまでに述べたように、鞭毛が定着と転
移増殖に関係した大切な蛋白質であると認識されてきた
ことからすると、まったく予見できないものであった。
さらに驚くべきことは、このようなワクチンが実際に鞭
毛を持つ野生型カンピロバクターの転移増殖や脱皮を減
じ得ることである。今回は、盲腸から検出レベル以下に
までカンピロバクターを排除することのできるワクチン
が報告された最初の例である。
【０００９】このように、本発明の一実施態様は、動物
におけるカンピロバクター転移増殖を予防するためのワ
クチンに関し、当該ワクチンは鞭毛のないカンピロバク
ター株に対する抗血清を含むものである。
におけるカンピロバクター転移増殖を予防するためのワ
クチンに関し、当該ワクチンは鞭毛のないカンピロバク
ター株に対する抗血清を含むものである。
【００１０】そのようなワクチンは、分離された抗カン
ピロバクター血清と許容される一種類の稀釈剤とを含む
だけの大変単純な構成とすることもできる。そのような
稀釈剤は、抗体価が高すぎるときに、抗血清を稀釈する
ために加えることができる。稀釈剤は蒸留水または生理
学的塩溶液などの単純なものであり得る。実際には、薬
学的に許容し得る稀釈剤であればいずれも使用すること
ができる。
ピロバクター血清と許容される一種類の稀釈剤とを含む
だけの大変単純な構成とすることもできる。そのような
稀釈剤は、抗体価が高すぎるときに、抗血清を稀釈する
ために加えることができる。稀釈剤は蒸留水または生理
学的塩溶液などの単純なものであり得る。実際には、薬
学的に許容し得る稀釈剤であればいずれも使用すること
ができる。
【００１１】本発明は、家禽、豚、その他の動物におけ
るカンピロバクター汚染に対して等しく適用することが
できる。
るカンピロバクター汚染に対して等しく適用することが
できる。
【００１２】鶏肉が高度に汚染され得る環境にあること
から、好ましい実施態様の形態は、カンピロバクターイ
ェヌニ種の鞭毛を持たないカンピロバクター株、そして
家禽に関する。
から、好ましい実施態様の形態は、カンピロバクターイ
ェヌニ種の鞭毛を持たないカンピロバクター株、そして
家禽に関する。
【００１３】鞭毛を持たないカンピロバクター株であれ
ば、いずれも抗血清を惹起させるために使用することが
できる。特に、生育速度が野生株に匹敵する、鞭毛のな
いカンピロバクター株が好ましい。抗体を惹起させるの
に大変好適である鞭毛のないカンピロバクター株は、Ｅ
ＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １９９１、１０；２０５５−
２０６１において、Ｗａｓｓｅｎａａｒ、Ｔ．Ｍ．，Ｂ
ｌｅｕｍｉｎｋ−Ｐｌｕｙｍ，Ｎ．Ｍ．Ｃ．、ｖａｎ
ｄｅｒ Ｚｅｉｊｓｔ、Ｂ．Ａ．Ｍ．が示している。
ば、いずれも抗血清を惹起させるために使用することが
できる。特に、生育速度が野生株に匹敵する、鞭毛のな
いカンピロバクター株が好ましい。抗体を惹起させるの
に大変好適である鞭毛のないカンピロバクター株は、Ｅ
ＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １９９１、１０；２０５５−
２０６１において、Ｗａｓｓｅｎａａｒ、Ｔ．Ｍ．，Ｂ
ｌｅｕｍｉｎｋ−Ｐｌｕｙｍ，Ｎ．Ｍ．Ｃ．、ｖａｎ
ｄｅｒ Ｚｅｉｊｓｔ、Ｂ．Ａ．Ｍ．が示している。
【００１４】このように、好ましい態様において、抗体
を惹起するための鞭毛のないカンピロバクターイェヌニ
はＲ２株である。
を惹起するための鞭毛のないカンピロバクターイェヌニ
はＲ２株である。
【００１５】本発明に従ったワクチンに使用するのに適
した抗体は、ポリクローナル血清、単一特異性血清、モ
ノクローナル抗体培養液から得ることができる。ポリク
ローナル血清は、標準的な方法によって容易に調製し得
るという利点を有する。ポリクローナル血清の製造およ
び処理手段は、当業者により詳しく知られている（例え
ば、Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｔｅｒ著、 Ｉｍｍｕ
ｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ
ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８
７）。抗体を惹起させるのに好適な動物は、例えば乳
牛、ウサギ、マウスおよび鶏である。カンピロバクター
に対する牛抗体を効果的に得る方法は、Ｈｉｌｐｅｒｔ
ら、１９８７、Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓｅａｓｅｓ １５
６；１５８−１６６に示されている。他に大量の抗体を
生産する魅力的な方法としては、例えば卵黄を用いた製
造法がＨａｔｔａら、１９９３、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏ
ｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７；４５０−４５４に示
されている。
した抗体は、ポリクローナル血清、単一特異性血清、モ
ノクローナル抗体培養液から得ることができる。ポリク
ローナル血清は、標準的な方法によって容易に調製し得
るという利点を有する。ポリクローナル血清の製造およ
び処理手段は、当業者により詳しく知られている（例え
ば、Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｔｅｒ著、 Ｉｍｍｕ
ｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ
ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８
７）。抗体を惹起させるのに好適な動物は、例えば乳
牛、ウサギ、マウスおよび鶏である。カンピロバクター
に対する牛抗体を効果的に得る方法は、Ｈｉｌｐｅｒｔ
ら、１９８７、Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓｅａｓｅｓ １５
６；１５８−１６６に示されている。他に大量の抗体を
生産する魅力的な方法としては、例えば卵黄を用いた製
造法がＨａｔｔａら、１９９３、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏ
ｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７；４５０−４５４に示
されている。
【００１６】本発明の別の実施態様は、カンピロバクタ
ーイェヌニの転移増殖に対するワクチン調製のための、
鞭毛のないカンピロバクターイェヌニ株に対する抗体の
使用に関する。
ーイェヌニの転移増殖に対するワクチン調製のための、
鞭毛のないカンピロバクターイェヌニ株に対する抗体の
使用に関する。
【００１７】驚くべきことに、以下のことが明らかとな
った；鞭毛のないカンピロバクターイェヌニ変異体に対
して惹起された抗血清は、全カンピロバクターイェヌニ
蛋白質のウェスタンブロットにおいて、野生型カンピロ
バクターイェヌニに対する抗血清では視認できない３つ
の主要蛋白質のバンド、９７ｋＤ（＋／−５ｋＤ）、６
０ｋＤ（＋／−５ｋＤ）、１３ｋＤ（＋／−３ｋＤ）を
認識する。この現象は、野生型カンピロバクターおよび
鞭毛のないカンピロバクターを用いたウェスタンブロッ
トの場合でも、同様に認められる。この様に、これら３
種の蛋白質は、野生型および鞭毛のないカンピロバクタ
ー株のいずれにも存在している。それゆえ、免疫機構に
おけるこれら特異的な蛋白質の認識は、鞭毛が存在しな
いときのみに生じると結論付けられる。
った；鞭毛のないカンピロバクターイェヌニ変異体に対
して惹起された抗血清は、全カンピロバクターイェヌニ
蛋白質のウェスタンブロットにおいて、野生型カンピロ
バクターイェヌニに対する抗血清では視認できない３つ
の主要蛋白質のバンド、９７ｋＤ（＋／−５ｋＤ）、６
０ｋＤ（＋／−５ｋＤ）、１３ｋＤ（＋／−３ｋＤ）を
認識する。この現象は、野生型カンピロバクターおよび
鞭毛のないカンピロバクターを用いたウェスタンブロッ
トの場合でも、同様に認められる。この様に、これら３
種の蛋白質は、野生型および鞭毛のないカンピロバクタ
ー株のいずれにも存在している。それゆえ、免疫機構に
おけるこれら特異的な蛋白質の認識は、鞭毛が存在しな
いときのみに生じると結論付けられる。
【００１８】上述のように、鞭毛のないカンピロバクタ
ー変異体に対する抗血清は、カンピロバクターを盲腸か
ら検出レベル以下にまで除去することができる。この抗
血清は、付加的に９７ｋＤ、６０ｋＤ、１３ｋＤの蛋白
質に対する抗体を含んでいるという点において、野生型
カンピロバクターに対する抗血清（カンピロバクターを
除去できない）とは異なるものである。これら３つの蛋
白質は、明らかに鞭毛がないときに限り抗体を誘導する
ことから、これら３つの蛋白質は盲腸からのカンピロバ
クターの除去に本質的な役割を果たしている抗体を誘導
することができるものであると結論付けることができ
る。それゆえ、９７ｋＤ、６０ｋＤ、１３ｋＤの蛋白質
のいずれかもしくはこれらの結合に対して惹起される抗
体は、同様に盲腸からカンピロバクター株を除去するこ
とができる。
ー変異体に対する抗血清は、カンピロバクターを盲腸か
ら検出レベル以下にまで除去することができる。この抗
血清は、付加的に９７ｋＤ、６０ｋＤ、１３ｋＤの蛋白
質に対する抗体を含んでいるという点において、野生型
カンピロバクターに対する抗血清（カンピロバクターを
除去できない）とは異なるものである。これら３つの蛋
白質は、明らかに鞭毛がないときに限り抗体を誘導する
ことから、これら３つの蛋白質は盲腸からのカンピロバ
クターの除去に本質的な役割を果たしている抗体を誘導
することができるものであると結論付けることができ
る。それゆえ、９７ｋＤ、６０ｋＤ、１３ｋＤの蛋白質
のいずれかもしくはこれらの結合に対して惹起される抗
体は、同様に盲腸からカンピロバクター株を除去するこ
とができる。
【００１９】本発明の別の実施態様は、カンピロバクタ
ーイェヌニの全蛋白質のウェスタンブロットにおいて鞭
毛のないカンピロバクターイェヌニ変異体に対する抗体
を用いたウェスタンブロットで視認できるが、野生型カ
ンピロバクターイェヌニに対する抗体を用いたウェスタ
ンブロットでは視認できない、分子量９７ｋＤ、６０ｋ
Ｄ、１３ｋＤの抗原蛋白質に関する。
ーイェヌニの全蛋白質のウェスタンブロットにおいて鞭
毛のないカンピロバクターイェヌニ変異体に対する抗体
を用いたウェスタンブロットで視認できるが、野生型カ
ンピロバクターイェヌニに対する抗体を用いたウェスタ
ンブロットでは視認できない、分子量９７ｋＤ、６０ｋ
Ｄ、１３ｋＤの抗原蛋白質に関する。
【００２０】６０ｋＤ蛋白質と１３ｋＤ蛋白質はさらに
分析され、それらのアミノ酸配列が決定された。
分析され、それらのアミノ酸配列が決定された。
【００２１】６０ｋＤ蛋白質のアミノ酸配列は下記に示
され、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１に表される。
され、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１に表される。
【００２２】６０ｋＤ蛋白質のアミノ酸配列は；
【００２３】
【化１】 １３ｋＤ蛋白質のアミノ酸配列は下記に示され、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２に表される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２に表される。
【００２４】１３ｋＤ蛋白質のアミノ酸配列は；
【００２５】
【化２】 ６０ｋＤ蛋白質と１３ｋＤ蛋白質のアミノ酸配列にはわ
ずかに変異があり得る。アミノ酸配列における変異は、
アミノ酸の一またはそれ以上の機能的等価物への置換の
結果である場合がある。機能的等価物への置換はしばし
ば見られる。Ｎｅｕｒａｔｈら（Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉ
ｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ
（１９７９）、１４頁、図６）に示された例示は、例え
ばアミノ酸であるアラニンがセリンに置換された；Ａｌ
ａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、またはＡｓｐ／Ｇｌｕ等
がある。上に挙げた機能的等価物の置換という変異に加
え、機能的等価物でない別のアミノ酸に置換されたよう
な変異も見られ得る。この種の変異は、それが空間的な
折りたたみ構造においてわずかな変化を有する蛋白質を
生じ得るという点で、機能的等価物への置換と異なるの
みである。いずれの変異の種類も蛋白質にはよく見られ
ることであり、これらは生物学的変異として知られてい
る。
ずかに変異があり得る。アミノ酸配列における変異は、
アミノ酸の一またはそれ以上の機能的等価物への置換の
結果である場合がある。機能的等価物への置換はしばし
ば見られる。Ｎｅｕｒａｔｈら（Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉ
ｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ
（１９７９）、１４頁、図６）に示された例示は、例え
ばアミノ酸であるアラニンがセリンに置換された；Ａｌ
ａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、またはＡｓｐ／Ｇｌｕ等
がある。上に挙げた機能的等価物の置換という変異に加
え、機能的等価物でない別のアミノ酸に置換されたよう
な変異も見られ得る。この種の変異は、それが空間的な
折りたたみ構造においてわずかな変化を有する蛋白質を
生じ得るという点で、機能的等価物への置換と異なるの
みである。いずれの変異の種類も蛋白質にはよく見られ
ることであり、これらは生物学的変異として知られてい
る。
【００２６】６０ｋＤ蛋白質や１３ｋＤ蛋白質のアミノ
酸配列における変異体であって、ポリペプチドの抗原活
性が保持される様な変化もまた、本発明の範囲内である
ことは、言うまでもないことである。
酸配列における変異体であって、ポリペプチドの抗原活
性が保持される様な変化もまた、本発明の範囲内である
ことは、言うまでもないことである。
【００２７】９７ｋＤ、６０ｋＤ、１３ｋＤの各蛋白質
は、ポリクローナル、単一特異性またはモノクローナル
（もしくはこれらの誘導体）などの様な抗体の生産に使
用できる。９７ｋＤ、６０ｋＤ、１３ｋＤの各蛋白質
は、当業者にとって周知の多くの標準的な分離方法に従
って分離することができる。ひとつの大変簡単な方法
は、調製用ゲルからこれらの蛋白質を切り出すことであ
る。ポリクローナル抗体が必要とされるときは、ポリク
ローナル血清の製造方法および処理方法は当業者に知ら
れている（例えば、ＭａｙｅｒおよびＷａｌｔｅｒ著、
上述）。本発明における９７ｋＤ、６０ｋＤ、１３ｋＤ
の各蛋白質（または各断片の誘導体）に対して反応する
モノクローナル抗体は、当業者により知られた手法（Ｋ
ｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ，２
５６，４９５−４９７，１９７５）によって近親繁殖型
マウスを免疫することによって調製することができる。
は、ポリクローナル、単一特異性またはモノクローナル
（もしくはこれらの誘導体）などの様な抗体の生産に使
用できる。９７ｋＤ、６０ｋＤ、１３ｋＤの各蛋白質
は、当業者にとって周知の多くの標準的な分離方法に従
って分離することができる。ひとつの大変簡単な方法
は、調製用ゲルからこれらの蛋白質を切り出すことであ
る。ポリクローナル抗体が必要とされるときは、ポリク
ローナル血清の製造方法および処理方法は当業者に知ら
れている（例えば、ＭａｙｅｒおよびＷａｌｔｅｒ著、
上述）。本発明における９７ｋＤ、６０ｋＤ、１３ｋＤ
の各蛋白質（または各断片の誘導体）に対して反応する
モノクローナル抗体は、当業者により知られた手法（Ｋ
ｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ，２
５６，４９５−４９７，１９７５）によって近親繁殖型
マウスを免疫することによって調製することができる。
【００２８】鞭毛のないカンピロバクター全体に対する
抗血清の代わりにこれら３種の蛋白質のいずれかに対す
る抗体を用いることの優位性のひとつは、これら３種の
蛋白質に対する特異的なモノクローナル抗体が培養器の
中で大量に生育させたハイブリドーマから容易に得られ
ることである。これにより、動物を用いずに少ない費用
／労力で大量の抗体を生産することが可能となる。
抗血清の代わりにこれら３種の蛋白質のいずれかに対す
る抗体を用いることの優位性のひとつは、これら３種の
蛋白質に対する特異的なモノクローナル抗体が培養器の
中で大量に生育させたハイブリドーマから容易に得られ
ることである。これにより、動物を用いずに少ない費用
／労力で大量の抗体を生産することが可能となる。
【００２９】この様に、本発明の別の実施態様は、カン
ピロバクターの９７ｋＤ、６０ｋＤ、１３ｋＤの蛋白質
に対する抗体を含むワクチンに関する。
ピロバクターの９７ｋＤ、６０ｋＤ、１３ｋＤの蛋白質
に対する抗体を含むワクチンに関する。
【００３０】さらに別の本発明の実施態様は、カンピロ
バクターイェヌニ転移増殖に対するワクチンの調製のた
めに、本発明である９７ｋＤおよび／または６０ｋＤお
よび／または１３ｋＤの蛋白質に対する抗体を使用する
ことである。
バクターイェヌニ転移増殖に対するワクチンの調製のた
めに、本発明である９７ｋＤおよび／または６０ｋＤお
よび／または１３ｋＤの蛋白質に対する抗体を使用する
ことである。
【００３１】本発明においてワクチンを調製する方法
は、複雑化を要しない。原則として、例えば動物を用い
て、鞭毛のない変異体に対するまたは本発明である９７
ｋＤおよび／または６０ｋＤおよび／または１３ｋＤの
蛋白質に対する抗体を惹起させることで十分であり、次
いで標準的方法に従って採血し抗血清を調製する。抗体
を惹起させるのに好適な動物としては、例えばウサギお
よび鶏である。鶏を用いた場合には、選択的に全身的に
免疫された鶏の卵黄からでも抗体を得ることができる。
原則として、抗体を稀釈する必要はない。それらはその
様に、もし必要であれば濃縮された形態でも与えられ
る。あるいは、抗体濃度が大変高いときには、例えば投
与前に稀釈してもよい。
は、複雑化を要しない。原則として、例えば動物を用い
て、鞭毛のない変異体に対するまたは本発明である９７
ｋＤおよび／または６０ｋＤおよび／または１３ｋＤの
蛋白質に対する抗体を惹起させることで十分であり、次
いで標準的方法に従って採血し抗血清を調製する。抗体
を惹起させるのに好適な動物としては、例えばウサギお
よび鶏である。鶏を用いた場合には、選択的に全身的に
免疫された鶏の卵黄からでも抗体を得ることができる。
原則として、抗体を稀釈する必要はない。それらはその
様に、もし必要であれば濃縮された形態でも与えられ
る。あるいは、抗体濃度が大変高いときには、例えば投
与前に稀釈してもよい。
【００３２】この様に、本発明の別の実施態様は、本発
明によるワクチンの調製のための方法に関する。その様
な方法は、宿主動物において鞭毛のないカンピロバクタ
ーイェニヌ株の抗原性材料に対する抗体を惹起させ、次
いで抗体を分離することからなる。原則として、通常こ
の方法は、宿主動物から血液を採取し、次いで例えば遠
心分離やろ過により抗血清を精製することを含むことと
なろう。
明によるワクチンの調製のための方法に関する。その様
な方法は、宿主動物において鞭毛のないカンピロバクタ
ーイェニヌ株の抗原性材料に対する抗体を惹起させ、次
いで抗体を分離することからなる。原則として、通常こ
の方法は、宿主動物から血液を採取し、次いで例えば遠
心分離やろ過により抗血清を精製することを含むことと
なろう。
【００３３】９７ｋＤ、６０ｋＤ、１３ｋＤの蛋白質に
対して指向的な望ましい抗体を生産する細胞を得るこ
と、およびこれらを例えば培養器内で生育させることも
また可能である。抗体は最終的に回収され、必要であれ
ば薬学的に許容される担体と混合され得る。その様な方
法の優位点は、抗体の調製に動物を必要としないことで
ある。
対して指向的な望ましい抗体を生産する細胞を得るこ
と、およびこれらを例えば培養器内で生育させることも
また可能である。抗体は最終的に回収され、必要であれ
ば薬学的に許容される担体と混合され得る。その様な方
法の優位点は、抗体の調製に動物を必要としないことで
ある。
【００３４】この発明は、屠殺前での食肉用鶏の処理に
大変好適である。食肉用鶏は通常６週齢で屠殺される。
それゆえ、屠殺の約一週間前に本発明であるワクチンで
動物を処理することにより、カンピロバクター汚染の顕
著な現象が生じる。投与されるワクチンの量がワクチン
中の抗体量に高度に依存することは明らかである。大変
好適な抗体量が粗抗血清の０．１から１ｍＬの間である
ことがひとつの指針として役に立つであろう。
大変好適である。食肉用鶏は通常６週齢で屠殺される。
それゆえ、屠殺の約一週間前に本発明であるワクチンで
動物を処理することにより、カンピロバクター汚染の顕
著な現象が生じる。投与されるワクチンの量がワクチン
中の抗体量に高度に依存することは明らかである。大変
好適な抗体量が粗抗血清の０．１から１ｍＬの間である
ことがひとつの指針として役に立つであろう。
【００３５】例えば卵黄調製物の抗体力価は、ＥＬＩＳ
Ａ法のような当業者により周知な標準的方法によって容
易に決定することができる。
Ａ法のような当業者により周知な標準的方法によって容
易に決定することができる。
【００３６】抗体は多少、粗な調製物として容易に与え
られる。可能な投与方法は、例えば粗抗血清を鶏に給餌
することである。他の投与方法は、例えば飲み水に抗血
清を混ぜ込むことである。また、抗体は直接鶏の餌に混
ぜることもできる。その様な目的のために、他の方法は
抗体の凍結乾燥であり、こうして餌や水に混ぜる前の長
期安定性が増強される。また、抗体を鶏の餌に加えられ
る前にカプセル化することもできる。
られる。可能な投与方法は、例えば粗抗血清を鶏に給餌
することである。他の投与方法は、例えば飲み水に抗血
清を混ぜ込むことである。また、抗体は直接鶏の餌に混
ぜることもできる。その様な目的のために、他の方法は
抗体の凍結乾燥であり、こうして餌や水に混ぜる前の長
期安定性が増強される。また、抗体を鶏の餌に加えられ
る前にカプセル化することもできる。
【００３７】なお別の本発明の実施態様は、予防（ワク
チン）接種の目的のために本発明である抗血清や抗体の
使用の選択を提供することである。選択的に、直接的な
予防接種を目的ととして、本発明である９７ｋＤ、６０
ｋＤ、または１３ｋＤの蛋白質を用いることが可能であ
る。９７ｋＤ、６０ｋＤ、または１３ｋＤの蛋白質が家
禽に直接投与されると、それらは直接的に９７ｋＤ、６
０ｋＤ、または１３ｋＤの各蛋白質に対する抗体を誘導
する。動物はその後カンピロバクターに対する自身の防
御的な抗体を生産する。ここで再び驚くべきことは、野
生型のカンピロバクター株全体の投与は盲腸からカンピ
ロバクターを排除しないことであるが、それは、野生型
のカンピロバクター株が９７ｋＤ、６０ｋＤ、および１
３ｋＤの蛋白質に対する抗体の誘導を抑制するからであ
る。この様に９７ｋＤ、６０ｋＤ、および１３ｋＤの蛋
白質は、分離された状態ではなく野生型のカンピロバク
ター細胞の一部分として与えられるときは、それらは効
果を奏しないのである。
チン）接種の目的のために本発明である抗血清や抗体の
使用の選択を提供することである。選択的に、直接的な
予防接種を目的ととして、本発明である９７ｋＤ、６０
ｋＤ、または１３ｋＤの蛋白質を用いることが可能であ
る。９７ｋＤ、６０ｋＤ、または１３ｋＤの蛋白質が家
禽に直接投与されると、それらは直接的に９７ｋＤ、６
０ｋＤ、または１３ｋＤの各蛋白質に対する抗体を誘導
する。動物はその後カンピロバクターに対する自身の防
御的な抗体を生産する。ここで再び驚くべきことは、野
生型のカンピロバクター株全体の投与は盲腸からカンピ
ロバクターを排除しないことであるが、それは、野生型
のカンピロバクター株が９７ｋＤ、６０ｋＤ、および１
３ｋＤの蛋白質に対する抗体の誘導を抑制するからであ
る。この様に９７ｋＤ、６０ｋＤ、および１３ｋＤの蛋
白質は、分離された状態ではなく野生型のカンピロバク
ター細胞の一部分として与えられるときは、それらは効
果を奏しないのである。
【００３８】このように、本発明の別の実施態様は、特
異的な抗原性を有する９７ｋＤ、６０ｋＤ、または１３
ｋＤの蛋白質であり、これらは、カンピロバクターイェ
ヌニ蛋白質のウェスタンブロットにおいて、鞭毛のない
変異体に対する抗体を用いたウェスタンブロットのイン
キュベーション後に視認でき、野生型のカンピロバクタ
ーイェヌニに対する抗体を用いたブロットのインキュベ
ーション後では視認できないものである。その様なワク
チンは、蛋白質と薬学的に許容される担体とを混ぜ合わ
せることで容易に調製できる。薬学的に許容される担体
は、予防接種されるべき動物の健康状態に反対の影響
を、これは少なくとも動物が予防接種されないときに見
られる効果よりもより悪い効果という意味で、与えない
化合物として理解される。薬学的に許容される担体とし
ては、例えば、滅菌水や滅菌された生理学的塩溶液であ
る。より複雑には、担体は例えば緩衝剤である。
異的な抗原性を有する９７ｋＤ、６０ｋＤ、または１３
ｋＤの蛋白質であり、これらは、カンピロバクターイェ
ヌニ蛋白質のウェスタンブロットにおいて、鞭毛のない
変異体に対する抗体を用いたウェスタンブロットのイン
キュベーション後に視認でき、野生型のカンピロバクタ
ーイェヌニに対する抗体を用いたブロットのインキュベ
ーション後では視認できないものである。その様なワク
チンは、蛋白質と薬学的に許容される担体とを混ぜ合わ
せることで容易に調製できる。薬学的に許容される担体
は、予防接種されるべき動物の健康状態に反対の影響
を、これは少なくとも動物が予防接種されないときに見
られる効果よりもより悪い効果という意味で、与えない
化合物として理解される。薬学的に許容される担体とし
ては、例えば、滅菌水や滅菌された生理学的塩溶液であ
る。より複雑には、担体は例えば緩衝剤である。
【００３９】さらに本発明の別の実施態様は、ワクチン
において使用される抗原性の９７ｋＤ、６０ｋＤ、また
は１３ｋＤの蛋白質である。この実施態様の好ましい形
態は、カンピロバクターイェヌニの転移増殖に対抗する
ための薬学的組成物の調製に、本発明である９７ｋＤ、
６０ｋＤ、または１３ｋＤの抗原性蛋白質を使用するこ
とに関する。
において使用される抗原性の９７ｋＤ、６０ｋＤ、また
は１３ｋＤの蛋白質である。この実施態様の好ましい形
態は、カンピロバクターイェヌニの転移増殖に対抗する
ための薬学的組成物の調製に、本発明である９７ｋＤ、
６０ｋＤ、または１３ｋＤの抗原性蛋白質を使用するこ
とに関する。
【００４０】ワクチン調製のための好適な蛋白質の量
は、投与方法によって変化する。全身適用には１から１
０００μｇが大変好ましい。経口用のワクチンにおいて
も、この容量が好ましいであろう。しかしながら、飲み
水を介した経口予防接種を計画するときは、水をこぼす
こともあるためにおそらくより多量の蛋白質が与えられ
ねばならない。
は、投与方法によって変化する。全身適用には１から１
０００μｇが大変好ましい。経口用のワクチンにおいて
も、この容量が好ましいであろう。しかしながら、飲み
水を介した経口予防接種を計画するときは、水をこぼす
こともあるためにおそらくより多量の蛋白質が与えられ
ねばならない。
【００４１】本発明におけるワクチンは、好ましい提示
として、アジュバントを含む。一般に、アジュバントは
宿主の免疫応答を非特異的な方法で後押しする物質を含
む。多くの異なったアジュバントが当業者に知られてい
る。アジュバントの例としては、フロイント完全または
不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性ブロック
ポリマー、デキストラン硫酸、カーボポールやピランの
ようなプロアミンなどがある。また大変好ましいもの
に、スパン、ツイーン、ヘキサデシルアミン、リゾレシ
チン、メトキシヘキサデシルグリセロールやサポニン
（ＱｕｉｌＡ（登録商標））といった界面活性化剤があ
る。さらに、ムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、
タフトシンといったペプチドがしばしば用いられる。こ
れらのアジュバントの次に、免疫刺激性コンプレックス
（Ｉｍｍｕｎｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｃｏｍｐｌ
ｅｘ、ＩＳＣＯＭＳ）、例えばＢａｙｏｌ（登録商標）
またはＭａｒｋｏｌ（登録商標）のような鉱物油、植物
油またはそのエマルジョンおよびＤｉｌｕｖａｃ（登録
商標）Ｆｏｒｔｅが優位に使用される。ワクチンはいわ
ゆるベヒクルもまた含んでなる。ベヒクルはポリペプチ
ドが共有結合的に結合することなく付着する化合物であ
る。しばしば用いられるベヒクル化合物は、例えば水酸
化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウ
ム、酸化アルミニウム、シリカ、カオリン、およびベン
トナイトである。その様なベヒクルの特別な形態、そこ
では抗原が部分的にベヒクル中に内包される、はいわゆ
るＩＳＣＯＭ（欧州特許ＥＰ１０９．９４２，ＥＰ１８
０．５６４，ＥＰ２４２．３８０）である。
として、アジュバントを含む。一般に、アジュバントは
宿主の免疫応答を非特異的な方法で後押しする物質を含
む。多くの異なったアジュバントが当業者に知られてい
る。アジュバントの例としては、フロイント完全または
不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性ブロック
ポリマー、デキストラン硫酸、カーボポールやピランの
ようなプロアミンなどがある。また大変好ましいもの
に、スパン、ツイーン、ヘキサデシルアミン、リゾレシ
チン、メトキシヘキサデシルグリセロールやサポニン
（ＱｕｉｌＡ（登録商標））といった界面活性化剤があ
る。さらに、ムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、
タフトシンといったペプチドがしばしば用いられる。こ
れらのアジュバントの次に、免疫刺激性コンプレックス
（Ｉｍｍｕｎｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｃｏｍｐｌ
ｅｘ、ＩＳＣＯＭＳ）、例えばＢａｙｏｌ（登録商標）
またはＭａｒｋｏｌ（登録商標）のような鉱物油、植物
油またはそのエマルジョンおよびＤｉｌｕｖａｃ（登録
商標）Ｆｏｒｔｅが優位に使用される。ワクチンはいわ
ゆるベヒクルもまた含んでなる。ベヒクルはポリペプチ
ドが共有結合的に結合することなく付着する化合物であ
る。しばしば用いられるベヒクル化合物は、例えば水酸
化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウ
ム、酸化アルミニウム、シリカ、カオリン、およびベン
トナイトである。その様なベヒクルの特別な形態、そこ
では抗原が部分的にベヒクル中に内包される、はいわゆ
るＩＳＣＯＭ（欧州特許ＥＰ１０９．９４２，ＥＰ１８
０．５６４，ＥＰ２４２．３８０）である。
【００４２】しばしば、ワクチンは安定化剤、例えば分
解しがちなポリペプチドを分解から保護するため、ワク
チンの保存期間を延長するため、または凍結乾燥効率を
高めるために、安定化剤と混合される。有用な安定化剤
は、ＳＰＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉｋら；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ，５９；５０９（１９５０）），脱脂粉
乳、ゼラチン、牛血清アルブミン、例えばソルビトール
やマンニトール、トレハロース、澱粉、蔗糖、デキスト
ラン、またはグルコースなどの炭水化物、アルブミンや
カゼインのような蛋白質またそれらの分解物、およびア
ルカリ金属リン酸塩のような緩衝剤などがある。凍結乾
燥は保存のための効果的な方法である。凍結乾燥された
材料は、何年でも安定に保存できる。凍結乾燥された材
料の保存温度は０℃以上であってもよく、材料にとって
不都合なことはない。凍結乾燥はよく知られた標準的な
凍結乾燥方法によって行うことができる。
解しがちなポリペプチドを分解から保護するため、ワク
チンの保存期間を延長するため、または凍結乾燥効率を
高めるために、安定化剤と混合される。有用な安定化剤
は、ＳＰＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉｋら；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ，５９；５０９（１９５０）），脱脂粉
乳、ゼラチン、牛血清アルブミン、例えばソルビトール
やマンニトール、トレハロース、澱粉、蔗糖、デキスト
ラン、またはグルコースなどの炭水化物、アルブミンや
カゼインのような蛋白質またそれらの分解物、およびア
ルカリ金属リン酸塩のような緩衝剤などがある。凍結乾
燥は保存のための効果的な方法である。凍結乾燥された
材料は、何年でも安定に保存できる。凍結乾燥された材
料の保存温度は０℃以上であってもよく、材料にとって
不都合なことはない。凍結乾燥はよく知られた標準的な
凍結乾燥方法によって行うことができる。
【００４３】９７ｋＤ、６０ｋＤ、または１３ｋＤの蛋
白質を含むワクチンは、好ましくは経粘膜的に投与され
る。これは、例えば飲み水にワクチンを混ぜることで経
口投与によって達成することができる。家禽においては
特に、付加的な眼内予防接種や経鼻予防接種が経粘膜予
防接種方法として、大変好ましい方法である。
白質を含むワクチンは、好ましくは経粘膜的に投与され
る。これは、例えば飲み水にワクチンを混ぜることで経
口投与によって達成することができる。家禽においては
特に、付加的な眼内予防接種や経鼻予防接種が経粘膜予
防接種方法として、大変好ましい方法である。
【００４４】
【実施例】実施例１；９７ｋＤ、６０ｋＤ、および１３
ｋＤ蛋白質の検出細菌株 野生型８１１１６：カンピロバクターイェヌニ、野生
型、ヒト由来、鞭毛表現型Ａ＋Ｂ＋、試験管内で運動性
および侵入性（Ｗａｓｓｅｎａａｒ，Ｔ．Ｍ．，Ｂｌｅ
ｕｍｉｎｋ−Ｐｌｕｙｍ，Ｎ．Ｍ．Ｃ．ａｎｄ ｖａｎ
ｄｅｒ Ｚｅｉｊｓｔ、Ｂ．Ａ．Ｍ．１９９１、ＥＭ
ＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １０；２０５５−２０６１）。
変異体８１１１６−Ｒ２：ＦｌａＡおよびＦｌａＢ欠損
変異体（カナマイシン挿入）、鞭毛表現型Ａ−Ｂ−、試
験管内で非運動性および非侵入性（Ｗａｓｓｅｎａａ
ｒ，Ｔ．Ｍ．，Ｂｌｅｕｍｉｎｋ−Ｐｌｕｙｍ，Ｎ．
Ｍ．Ｃ．ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｉｊｓｔ、Ｂ．
Ａ．Ｍ．１９９１、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ１０；２
０５５−２０６１）。細胞増殖 カンピロバクターイェヌニ８１１１６株をＢｌａｓｅｒ
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ寒天に、カンピロバクター
イェヌニ８１１１６−Ｒ２株を４０μｇ／ｍＬカナマイ
シンを含むＢｌａｓｅｒＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ寒
天にそれぞれ接種した。プレートを微好気条件下、４１
℃で４８時間培養した。寒天平板培地からの少数のコロ
ニーを、８１１１６株は１％イーストエキストラクトを
含むＢｒｕｃｅｌｌａブロスに、８１１１６−Ｒ２株は
１％イーストエキストラクトおよび４０μｇ／ｍＬカナ
マイシンを含むＢｒｕｃｅｌｌａブロスにそれぞれ接種
した。微好気条件下、４１℃で２４時間培養した後、総
菌数を確認し、０．２％のホルマリンを加えて不活化し
た（室温で２４時間）。不活化した菌体を遠心分離で集
めた。菌体を０．０１Ｍトリス緩衝液ｐＨ７．４に蛋白
濃度が１．０ｍｇ／ｍＬとなるよう懸濁した。
ｋＤ蛋白質の検出細菌株 野生型８１１１６：カンピロバクターイェヌニ、野生
型、ヒト由来、鞭毛表現型Ａ＋Ｂ＋、試験管内で運動性
および侵入性（Ｗａｓｓｅｎａａｒ，Ｔ．Ｍ．，Ｂｌｅ
ｕｍｉｎｋ−Ｐｌｕｙｍ，Ｎ．Ｍ．Ｃ．ａｎｄ ｖａｎ
ｄｅｒ Ｚｅｉｊｓｔ、Ｂ．Ａ．Ｍ．１９９１、ＥＭ
ＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １０；２０５５−２０６１）。
変異体８１１１６−Ｒ２：ＦｌａＡおよびＦｌａＢ欠損
変異体（カナマイシン挿入）、鞭毛表現型Ａ−Ｂ−、試
験管内で非運動性および非侵入性（Ｗａｓｓｅｎａａ
ｒ，Ｔ．Ｍ．，Ｂｌｅｕｍｉｎｋ−Ｐｌｕｙｍ，Ｎ．
Ｍ．Ｃ．ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｉｊｓｔ、Ｂ．
Ａ．Ｍ．１９９１、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ１０；２
０５５−２０６１）。細胞増殖 カンピロバクターイェヌニ８１１１６株をＢｌａｓｅｒ
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ寒天に、カンピロバクター
イェヌニ８１１１６−Ｒ２株を４０μｇ／ｍＬカナマイ
シンを含むＢｌａｓｅｒＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ寒
天にそれぞれ接種した。プレートを微好気条件下、４１
℃で４８時間培養した。寒天平板培地からの少数のコロ
ニーを、８１１１６株は１％イーストエキストラクトを
含むＢｒｕｃｅｌｌａブロスに、８１１１６−Ｒ２株は
１％イーストエキストラクトおよび４０μｇ／ｍＬカナ
マイシンを含むＢｒｕｃｅｌｌａブロスにそれぞれ接種
した。微好気条件下、４１℃で２４時間培養した後、総
菌数を確認し、０．２％のホルマリンを加えて不活化し
た（室温で２４時間）。不活化した菌体を遠心分離で集
めた。菌体を０．０１Ｍトリス緩衝液ｐＨ７．４に蛋白
濃度が１．０ｍｇ／ｍＬとなるよう懸濁した。
【００４５】その後、標準ＰＡＡＧＥ用として、一スロ
ット当たり２０μｌの懸濁液を加え、４−１２％のＮｕ
Ｐａｇｅゲル、ビス−トリス緩衝液で泳動した。ウェス
タンブロットはＮｕＰａｇｅトランスファー緩衝液／１
０％メタノールで行った。２次元電気泳動は、Ａｄｅｓ
ｓｉ，Ｃ（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １９９
７、１８ １２７−１３５）およびＧｏｒｇ，Ａ．，
（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １９９５、１６，
１０７９−１０８６）およびファルマシア社の取扱説明
書１８−１０３８−６３に記載されている標準方法を用
いて行った。鶏抗血清の調製 ４週齢の鶏に、８１１１６株または８１１１６−Ｒ２株
の全細胞ワクチン（下記参照）１ｍＬを筋注接種した。
一群の鶏は非接種のままとした。接種後４週間に全鶏を
失血死させた。血清はグループごとに分けて保存し、４
日齢の鶏への免疫に用いた。
ット当たり２０μｌの懸濁液を加え、４−１２％のＮｕ
Ｐａｇｅゲル、ビス−トリス緩衝液で泳動した。ウェス
タンブロットはＮｕＰａｇｅトランスファー緩衝液／１
０％メタノールで行った。２次元電気泳動は、Ａｄｅｓ
ｓｉ，Ｃ（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １９９
７、１８ １２７−１３５）およびＧｏｒｇ，Ａ．，
（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １９９５、１６，
１０７９−１０８６）およびファルマシア社の取扱説明
書１８−１０３８−６３に記載されている標準方法を用
いて行った。鶏抗血清の調製 ４週齢の鶏に、８１１１６株または８１１１６−Ｒ２株
の全細胞ワクチン（下記参照）１ｍＬを筋注接種した。
一群の鶏は非接種のままとした。接種後４週間に全鶏を
失血死させた。血清はグループごとに分けて保存し、４
日齢の鶏への免疫に用いた。
【００４６】こうして得た血清は２０倍、２００倍、４
００倍に稀釈し、標準方法に従ってウェスタンブロット
に用いた。結果 図１の左のウェスタンブロットは、野生型カンピロバク
ター８１１１６株の全抗原を含み、右のウェスタンブロ
ットは鞭毛のないカンピロバクター８１１１６−Ｒ２株
の全抗原を含む。レーン１と７、レーン２と８、レーン
３と９は、２０倍、２００倍、４００倍に希釈された野
生型カンピロバクター８１１１６に対する抗体を用い
て、それぞれインキュベートした。レーン４と１０、レ
ーン５と１１、レーン６と１２は、２０倍、２００倍、
４００倍に希釈された鞭毛のないカンピロバクター８１
１１６−Ｒ２に対する抗体を用いて、それぞれインキュ
ベートした。
００倍に稀釈し、標準方法に従ってウェスタンブロット
に用いた。結果 図１の左のウェスタンブロットは、野生型カンピロバク
ター８１１１６株の全抗原を含み、右のウェスタンブロ
ットは鞭毛のないカンピロバクター８１１１６−Ｒ２株
の全抗原を含む。レーン１と７、レーン２と８、レーン
３と９は、２０倍、２００倍、４００倍に希釈された野
生型カンピロバクター８１１１６に対する抗体を用い
て、それぞれインキュベートした。レーン４と１０、レ
ーン５と１１、レーン６と１２は、２０倍、２００倍、
４００倍に希釈された鞭毛のないカンピロバクター８１
１１６−Ｒ２に対する抗体を用いて、それぞれインキュ
ベートした。
【００４７】レーン４から６およびレーン１０から１２
に明瞭に見られるように、分子量がそれぞれ９７ｋＤお
よび６０ｋＤである２本のバンドが視認できるが、これ
らはレーン１から３およびレーン７−９では視認できな
い（これらのレーンで見られる幾分かすかなそしてより
分散したバンドは分子量マーカーである）。
に明瞭に見られるように、分子量がそれぞれ９７ｋＤお
よび６０ｋＤである２本のバンドが視認できるが、これ
らはレーン１から３およびレーン７−９では視認できな
い（これらのレーンで見られる幾分かすかなそしてより
分散したバンドは分子量マーカーである）。
【００４８】図２は、野生型カンピロバクター８１１１
６株の全抗原を含んだ２次元ゲル電気泳動である。２次
元ゲルは比較的小さな蛋白質の検出に好適であり、それ
ゆえ標準的な１次元ＰＡＡＧＥよりも１３ｋＤ蛋白質
（これに対する抗体）の存在の検出により好適である。
図３は、このゲルのウェスタンブロットを示す。ブロッ
ティング／インキュベーション操作は、図１における方
法に準じた標準方法である。図３ａは、鞭毛のないカン
ピロバクター８１１１６−Ｒ２株に対する抗血清でイン
キュベートした２次元ゲルのウェスタンブロットを示
す。図３ｂは、同じウェスタンブロットであるが、野生
型カンピロバクター８１１１６株に対する抗血清を用い
たものを示す。図３ａのウェスタンブロットは、鞭毛の
ないカンピロバクターに対して惹起された血清中に、６
０ｋＤ（矢１）および１３ｋＤ（矢２）蛋白質に対する
抗体が存在することを明瞭に示している、そしてこれは
野生型カンピロバクターに対して惹起された抗血清には
見られない（図３ｂ）。
６株の全抗原を含んだ２次元ゲル電気泳動である。２次
元ゲルは比較的小さな蛋白質の検出に好適であり、それ
ゆえ標準的な１次元ＰＡＡＧＥよりも１３ｋＤ蛋白質
（これに対する抗体）の存在の検出により好適である。
図３は、このゲルのウェスタンブロットを示す。ブロッ
ティング／インキュベーション操作は、図１における方
法に準じた標準方法である。図３ａは、鞭毛のないカン
ピロバクター８１１１６−Ｒ２株に対する抗血清でイン
キュベートした２次元ゲルのウェスタンブロットを示
す。図３ｂは、同じウェスタンブロットであるが、野生
型カンピロバクター８１１１６株に対する抗血清を用い
たものを示す。図３ａのウェスタンブロットは、鞭毛の
ないカンピロバクターに対して惹起された血清中に、６
０ｋＤ（矢１）および１３ｋＤ（矢２）蛋白質に対する
抗体が存在することを明瞭に示している、そしてこれは
野生型カンピロバクターに対して惹起された抗血清には
見られない（図３ｂ）。
【００４９】これらのウェスタンブロットは、鞭毛のな
いカンピロバクター株は９７ｋＤ，６０ｋＤ，および１
３ｋＤ蛋白質に対する免疫応答を誘導し得るが、一方で
野生型カンピロバクター株はこの現象を示さないことを
明瞭に示している。
いカンピロバクター株は９７ｋＤ，６０ｋＤ，および１
３ｋＤ蛋白質に対する免疫応答を誘導し得るが、一方で
野生型カンピロバクター株はこの現象を示さないことを
明瞭に示している。
【００５０】実施例２：ワクチンの調製 菌株 ： 野生型８１１１６：上述に同じ。 変異型８１１１６−Ｒ２：上述に同じ。
【００５１】受動的免疫用鶏血清の調製 ４週齢の鶏に、８１１１６株または８１１１６−Ｒ２株
の全細胞ワクチン（下記参照）１ｍＬを筋注接種した。
一群の鶏は非接種のままとした。接種後４週間に全鶏を
失血死させた。血清はグループごとに分けて保存し、４
日齢の鶏への免疫に用いた。
の全細胞ワクチン（下記参照）１ｍＬを筋注接種した。
一群の鶏は非接種のままとした。接種後４週間に全鶏を
失血死させた。血清はグループごとに分けて保存し、４
日齢の鶏への免疫に用いた。
【００５２】不活化全細胞ワクチンの調製 カンピロバクターイェヌニ８１１１６株をＢｌａｓｅｒ
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ寒天に、カンピロバクター
イェヌニ８１１１６−Ｒ２株を４０μｇ／ｍＬカナマイ
シンを含むＢｌａｓｅｒＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ寒
天にそれぞれ接種した。プレートを微好気条件下、４１
℃で４８時間培養した。寒天平板培地からの少数のコロ
ニーを、８１１１６株は１％イーストエキストラクトを
含むＢｒｕｃｅｌｌａブロスに、８１１１６−Ｒ２株は
１％イーストエキストラクトおよび４０μｇ／ｍＬカナ
マイシンを含むＢｒｕｃｅｌｌａブロスにそれぞれ接種
した。微好気条件下、４１℃で２４時間培養した後、総
菌数を確認し、０．２％のホルマリンを加えて不活化し
た（室温で２４時間）。不活化した菌体を遠心分離で集
め、ＰＢＳに懸濁し、油中水エマルジョンのフロイント
不完全型と細胞との混合によるワクチンの調製に用い
た。ワクチンエマルジョンは約１ｍＬ当たり１０９の菌
体を含んでいる。
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ寒天に、カンピロバクター
イェヌニ８１１１６−Ｒ２株を４０μｇ／ｍＬカナマイ
シンを含むＢｌａｓｅｒＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ寒
天にそれぞれ接種した。プレートを微好気条件下、４１
℃で４８時間培養した。寒天平板培地からの少数のコロ
ニーを、８１１１６株は１％イーストエキストラクトを
含むＢｒｕｃｅｌｌａブロスに、８１１１６−Ｒ２株は
１％イーストエキストラクトおよび４０μｇ／ｍＬカナ
マイシンを含むＢｒｕｃｅｌｌａブロスにそれぞれ接種
した。微好気条件下、４１℃で２４時間培養した後、総
菌数を確認し、０．２％のホルマリンを加えて不活化し
た（室温で２４時間）。不活化した菌体を遠心分離で集
め、ＰＢＳに懸濁し、油中水エマルジョンのフロイント
不完全型と細胞との混合によるワクチンの調製に用い
た。ワクチンエマルジョンは約１ｍＬ当たり１０９の菌
体を含んでいる。
【００５３】カンピロバクター抗原投与株の調製 カンピロバクターイェヌニ８１１１６株を、Ｂｌａｓｅ
ｒＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ寒天プレート上で、微好
気条件下４１℃で４８時間培養した。一寒天プレート上
の生育菌体を１％イーストエキストラクトを含むＢｒｕ
ｃｅｌｌａブロスに懸濁し、密封した培養瓶中で４１℃
で４８時間培養した。鶏を０．２ｍＬの培養液で経口的
に抗原投与した。抗原投与用培養液中の生菌数は、プレ
ート計測法にて決定した。
ｒＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ寒天プレート上で、微好
気条件下４１℃で４８時間培養した。一寒天プレート上
の生育菌体を１％イーストエキストラクトを含むＢｒｕ
ｃｅｌｌａブロスに懸濁し、密封した培養瓶中で４１℃
で４８時間培養した。鶏を０．２ｍＬの培養液で経口的
に抗原投与した。抗原投与用培養液中の生菌数は、プレ
ート計測法にて決定した。
【００５４】実施例３：ワクチン接種実験 本実験では、野生型カンピロバクターに対する抗血清お
よび鞭毛のないカンピロバクターに対する抗血清を用い
た場合の受動接種と、不活化された野生型カンピロバク
ター全細胞調製物を用いた能動型接種との間で比較を行
った。
よび鞭毛のないカンピロバクターに対する抗血清を用い
た場合の受動接種と、不活化された野生型カンピロバク
ター全細胞調製物を用いた能動型接種との間で比較を行
った。
【００５５】鶏 ４日齢または２週齢のＳＰＦ鶏を用いた。
【００５６】実験１の手法 １０羽の４日齢鶏を一単位とする集団を４つ用意し、野
生型カンピロバクター８１１１６株に対する抗血清０．
８ｍＬを毎日一回、鞭毛のない８１１１６−Ｒ２変異株
に対する抗血清０．８ｍＬを毎日一回、未接種のニワト
リ血清０．８ｍＬを毎日一回、それぞれ経口的に処理し
た集団と、何も処理しない対照集団とに分けた。初日
（すなわち４日齢）の鶏には、３．２×１０７ＣＦＵ／
ｍＬを用いた抗原投与の直前および抗原投与６時間後に
抗血清を与えておいた。処理は剖検まで続けた。抗原投
与後５日または１０日で各集団の５羽を殺し、盲腸内容
物グラム当たりのＣＦＵを測定した（下記参照、殺処理
後および微生物計測）。
生型カンピロバクター８１１１６株に対する抗血清０．
８ｍＬを毎日一回、鞭毛のない８１１１６−Ｒ２変異株
に対する抗血清０．８ｍＬを毎日一回、未接種のニワト
リ血清０．８ｍＬを毎日一回、それぞれ経口的に処理し
た集団と、何も処理しない対照集団とに分けた。初日
（すなわち４日齢）の鶏には、３．２×１０７ＣＦＵ／
ｍＬを用いた抗原投与の直前および抗原投与６時間後に
抗血清を与えておいた。処理は剖検まで続けた。抗原投
与後５日または１０日で各集団の５羽を殺し、盲腸内容
物グラム当たりのＣＦＵを測定した（下記参照、殺処理
後および微生物計測）。
【００５７】実験２の手法 １０羽の４日齢鶏を一単位とする集団を４つ用意し、野
生型カンピロバクター８１１１６株に対する鶏抗血清
０．８ｍＬを毎日一回、鞭毛のない８１１１６−Ｒ２変
異株に対する抗血清０．８ｍＬを毎日一回、未接種のニ
ワトリ血清を毎日一回、それぞれ経口的に処理した集団
と、何も処理しない対照集団とに分けた。初日（すなわ
ち４日齢）の鶏に、１．４×１０８ＣＦＵ／ｍＬを用い
た抗原投与の直前および抗原投与６時間後に抗血清を与
えた。処理は剖検まで続けた。抗原投与後５日で鶏を殺
し、盲腸内容物グラム当たりのＣＦＵを測定した。
生型カンピロバクター８１１１６株に対する鶏抗血清
０．８ｍＬを毎日一回、鞭毛のない８１１１６−Ｒ２変
異株に対する抗血清０．８ｍＬを毎日一回、未接種のニ
ワトリ血清を毎日一回、それぞれ経口的に処理した集団
と、何も処理しない対照集団とに分けた。初日（すなわ
ち４日齢）の鶏に、１．４×１０８ＣＦＵ／ｍＬを用い
た抗原投与の直前および抗原投与６時間後に抗血清を与
えた。処理は剖検まで続けた。抗原投与後５日で鶏を殺
し、盲腸内容物グラム当たりのＣＦＵを測定した。
【００５８】実験３の設計 １０羽の２週齢鶏を一単位とする集団を３つ用意し、野
生型カンピロバクター８１１１６株の不活化菌体を含む
油中水エマルジョンのフロイント不完全型アジュバント
中の全菌体１ｍＬを筋注接種した集団と、鞭毛のない８
１１１６−Ｒ２変異株の不活化菌体を含む油中水エマル
ジョンのフロイント不完全型アジュバント中の全菌体１
ｍＬを用いて筋注接種した集団と、何も処理しない対照
集団とに分けた。５週齢時に全鶏に、１．４×１０８Ｃ
ＦＵ／ｍＬの野生型カンピロバクター８１１１６株を用
いて経口的に抗原投与した。抗原投与後１週間で鶏を殺
し、盲腸内容物グラム当たりのＣＦＵを測定した。
生型カンピロバクター８１１１６株の不活化菌体を含む
油中水エマルジョンのフロイント不完全型アジュバント
中の全菌体１ｍＬを筋注接種した集団と、鞭毛のない８
１１１６−Ｒ２変異株の不活化菌体を含む油中水エマル
ジョンのフロイント不完全型アジュバント中の全菌体１
ｍＬを用いて筋注接種した集団と、何も処理しない対照
集団とに分けた。５週齢時に全鶏に、１．４×１０８Ｃ
ＦＵ／ｍＬの野生型カンピロバクター８１１１６株を用
いて経口的に抗原投与した。抗原投与後１週間で鶏を殺
し、盲腸内容物グラム当たりのＣＦＵを測定した。
【００５９】殺処理後および微生物計測 鶏を殺し、それぞれの盲腸内容物を静かに取り出し、重
量を測定後０．０４ＭのＰＢＳで０．１ｇ／ｍＬとなる
よう稀釈した。続いて１０倍稀釈液を選択的Ｂｌａｓｅ
ｒカンピロバクター寒天プレートに捲いた。微好気条件
下４１℃で４８時間培養後、盲腸内容物グラム当たりの
ＣＦＵを決定した。
量を測定後０．０４ＭのＰＢＳで０．１ｇ／ｍＬとなる
よう稀釈した。続いて１０倍稀釈液を選択的Ｂｌａｓｅ
ｒカンピロバクター寒天プレートに捲いた。微好気条件
下４１℃で４８時間培養後、盲腸内容物グラム当たりの
ＣＦＵを決定した。
【００６０】結果実験１ 表１ａおよび表１ｂから、野生型カンピロバクターに対
する血清または接種していない鶏の対照血清を用いて受
動型免疫を毎日繰り返しても、未処理の対照鶏（抗原投
与後５日後ならびに１０日も同様）と比較すると、野生
型カンピロバクターの盲腸への転移増殖に対しては効果
は認められなかったと結論できる。これら３集団のすべ
ては盲腸でカンピロバクター転移増殖が高度に（盲腸内
容物グラム当たり１０８ＣＦＵ以上）認められた。これ
とは明らかに対照的に、本発明の（例えば鞭毛のない変
異体に対して惹起された）抗血清を用いた受動型免疫
は、盲腸から野生型カンピロバクターを排除（または転
移増殖を予防）していた。３未満のレベルとは、盲腸内
容物グラム当たりＣＦＵ／グラムの数値が検出レベル以
下である事を意味する。
する血清または接種していない鶏の対照血清を用いて受
動型免疫を毎日繰り返しても、未処理の対照鶏（抗原投
与後５日後ならびに１０日も同様）と比較すると、野生
型カンピロバクターの盲腸への転移増殖に対しては効果
は認められなかったと結論できる。これら３集団のすべ
ては盲腸でカンピロバクター転移増殖が高度に（盲腸内
容物グラム当たり１０８ＣＦＵ以上）認められた。これ
とは明らかに対照的に、本発明の（例えば鞭毛のない変
異体に対して惹起された）抗血清を用いた受動型免疫
は、盲腸から野生型カンピロバクターを排除（または転
移増殖を予防）していた。３未満のレベルとは、盲腸内
容物グラム当たりＣＦＵ／グラムの数値が検出レベル以
下である事を意味する。
【００６１】
【表１】
【００６２】
【表２】 実験２ この実験は繰り返し行った（表２参照）。本発明の（す
なわち鞭毛のない変異体に対して惹起された）抗血清を
用いた能動的な接種においても、盲腸内での転移増殖が
強く減少していることが認められた：１０羽中６羽の鶏
が完全にネガティブであり、３対数以上の平均値減少が
認められた。
なわち鞭毛のない変異体に対して惹起された）抗血清を
用いた能動的な接種においても、盲腸内での転移増殖が
強く減少していることが認められた：１０羽中６羽の鶏
が完全にネガティブであり、３対数以上の平均値減少が
認められた。
【００６３】
【表３】 実験３ 野生型カンピロバクターを用いた能動型免疫がカンピロ
バクター転移増殖を最大２対数減少させるという文献報
告がある（Ｗｉｄｄｅｒｓ，Ｐ．Ｒ．，Ｐｅｒｒｙ，
Ｒ．，Ｍｕｉｒ，Ｗ．Ｉ．，Ｈｕｓｂａｎｄ，Ａ．Ｊ
ａｎｄ Ｌｏｎｇ，Ｋ．Ａ．，１９９６，Ｂｒ．Ｐｏｕ
ｌｔｒｙ Ｓｃｉ．３７：７６５−７７８）ことから、
能動的保護モデルにおける野生型およびＲ２に基づいた
ワクチンをを試験、比較した。
バクター転移増殖を最大２対数減少させるという文献報
告がある（Ｗｉｄｄｅｒｓ，Ｐ．Ｒ．，Ｐｅｒｒｙ，
Ｒ．，Ｍｕｉｒ，Ｗ．Ｉ．，Ｈｕｓｂａｎｄ，Ａ．Ｊ
ａｎｄ Ｌｏｎｇ，Ｋ．Ａ．，１９９６，Ｂｒ．Ｐｏｕ
ｌｔｒｙ Ｓｃｉ．３７：７６５−７７８）ことから、
能動的保護モデルにおける野生型およびＲ２に基づいた
ワクチンをを試験、比較した。
【００６４】結果（表３）から、いずれのワクチンも盲
腸内での転移増殖には影響を示さなかったのは明らかで
ある。
腸内での転移増殖には影響を示さなかったのは明らかで
ある。
【００６５】
【表４】 結論 鞭毛のないカンピロバクターに対して惹起された抗体に
基づくワクチンは、盲腸から野生型カンピロバクターを
排除することができる。これは、野生型カンピロバクタ
ーに対して惹起された抗体に基づくワクチンとは、極め
て対照的である。また、野生型カンピロバクター細胞を
含むワクチンとも極めて対照的である。
基づくワクチンは、盲腸から野生型カンピロバクターを
排除することができる。これは、野生型カンピロバクタ
ーに対して惹起された抗体に基づくワクチンとは、極め
て対照的である。また、野生型カンピロバクター細胞を
含むワクチンとも極めて対照的である。
【図１】図１左は野生型カンピロバクター８１１１６株
の全抗原を含むウェスタンブロット、および鞭毛のない
カンピロバクター８１１１６−Ｒ２株の抗原を含むウェ
スタンブロットの結果を示す。レーン１と７、レーン２
と８、レーン３と９は、２０倍、２００倍、４００倍に
稀釈された野生型カンピロバクター８１１１６株に対す
る抗血清を用いてそれぞれインキュベートされたもので
ある。レーン４と１０、レーン５と１１、レーン６と１
２は、２０倍、２００倍、４００倍に稀釈された鞭毛の
ないカンピロバクター８１１１６−Ｒ２株に対する抗血
清を用いてそれぞれインキュベートされたものである。
の全抗原を含むウェスタンブロット、および鞭毛のない
カンピロバクター８１１１６−Ｒ２株の抗原を含むウェ
スタンブロットの結果を示す。レーン１と７、レーン２
と８、レーン３と９は、２０倍、２００倍、４００倍に
稀釈された野生型カンピロバクター８１１１６株に対す
る抗血清を用いてそれぞれインキュベートされたもので
ある。レーン４と１０、レーン５と１１、レーン６と１
２は、２０倍、２００倍、４００倍に稀釈された鞭毛の
ないカンピロバクター８１１１６−Ｒ２株に対する抗血
清を用いてそれぞれインキュベートされたものである。
【図２】図２は、野生型カンピロバクター８１１１６株
の全抗原の２次元ゲルを示す。
の全抗原の２次元ゲルを示す。
【図３ａ】図３ａは、鞭毛のないカンピロバクター８１
１１６−Ｒ２に対する抗血清でインキュベートした２次
元ゲルのウェスタンブロットを示す。６０ｋＤ蛋白質は
矢印１で、１３ｋＤ蛋白質は矢印２で示す。
１１６−Ｒ２に対する抗血清でインキュベートした２次
元ゲルのウェスタンブロットを示す。６０ｋＤ蛋白質は
矢印１で、１３ｋＤ蛋白質は矢印２で示す。
【図３ｂ】図３ｂは、野生型カンピロバクター８１１１
６株に対する抗血清でインキュベートしたウェスタンブ
ロットを示す。
６株に対する抗血清でインキュベートしたウェスタンブ
ロットを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/04 Ｃ０７Ｋ 14/205 ＺＮＡ Ｃ０７Ｋ 14/205 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 ヨハネス・フランシスカス・フアン・デ ン・ボス オランダ国、5831・セー・ハー・ボツクス ミール、スポールストラート・９ (72)発明者 ペトラス・ヨハネス・マリア・ナイテン オランダ国、5831・エル・デー・ボツクス ミール、デ・リンデ・10
Claims (14)
- 【請求項１】 鞭毛のないカンピロバクター（Ｃａｍｐ
ｙｌｏｂａｃｔｅｒ）株に対して惹起された抗血清を含
むことを特徴とする、動物におけるカンピロバクターの
転移増殖を予防するためのワクチン。 - 【請求項２】 鞭毛のないカンピロバクター株がカンピ
ロバクターイェヌニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊ
ｅｊｕｎｉ）である、請求項１に記載のワクチン。 - 【請求項３】 鞭毛のないカンピロバクターイェヌニ株
がＲ２株である、請求項２に記載のワクチン。 - 【請求項４】 カンピロバクターイェヌニ蛋白質のウェ
スタンブロットにおいて、鞭毛のないカンピロバクター
イェヌニ変異体に対する抗体を用いた当該ウェスタンブ
ロットのインキュベーションの後に視認できるが、野生
型カンピロバクターイェヌニに対する抗体を用いた当該
ブロットのインキュベーションの後には視認できないこ
とを特徴とする、分子量が９７キロダルトン（ｋＤ）
（＋／−５ｋＤ）であるカンピロバクターの抗原性蛋白
質。 - 【請求項５】 カンピロバクターイェヌニ蛋白質のウェ
スタンブロットにおいて、鞭毛のないカンピロバクター
イェヌニ変異体に対する抗体を用いた当該ウェスタンブ
ロットのインキュベーションの後に視認できるが、野生
型カンピロバクターイェヌニに対する抗体を用いた当該
ブロットのインキュベーションの後には視認できないこ
とを特徴とする、分子量が６０キロダルトン（ｋＤ）
（＋／−５ｋＤ）であるカンピロバクターの抗原性蛋白
質。 - 【請求項６】 カンピロバクターイェヌニ蛋白質のウェ
スタンブロットにおいて、鞭毛のないカンピロバクター
イェヌニ変異体に対する抗体を用いた当該ウェスタンブ
ロットのインキュベーションの後に視認できるが、野生
型カンピロバクターイェヌニに対する抗体を用いた当該
ブロットのインキュベーションの後には視認できないこ
とを特徴とする、分子量が１３キロダルトン（ｋＤ）
（＋／−３ｋＤ）であるカンピロバクターの抗原性蛋白
質。 - 【請求項７】 ワクチンに使用するための、請求項４、
請求項５または請求項６に記載の抗原性蛋白質。 - 【請求項８】 カンピロバクターイェヌニの転移増殖を
阻止するための医薬組成物を製造するための、請求項
４、請求項５または請求項６に定義された抗原性蛋白質
の使用。 - 【請求項９】 請求項４、請求項５または請求項６に記
載の抗原性蛋白質に対する抗体を含むことを特徴とす
る、家禽におけるカンピロバクターイェヌニの転移増殖
を予防するためのワクチン。 - 【請求項１０】 請求項４、請求項５、または請求項６
に記載の抗原性蛋白質を含むことを特徴とする、家禽に
おけるカンピロバクターイェヌニの転移増殖を予防する
ためのワクチン。 - 【請求項１１】 鞭毛のないカンピロバクター株に対す
る抗体、または請求項４、請求項５もしくは請求項６に
記載の抗原性蛋白質に対する抗体の、動物へのカンピロ
バクターの転移増殖に対するワクチンを調製するための
使用。 - 【請求項１２】 宿主動物において鞭毛のないカンピロ
バクター株の抗原材料に対する抗血清を惹起し、ついで
宿主動物からその抗血清を分離する工程を含んでなるこ
とを特徴とする、請求項１ないし請求項３または請求項
９のいずれかに記載のワクチンを調製するための方法。 - 【請求項１３】 抗体産生細胞の増殖および抗体の回収
工程を含んでなることを特徴とする、請求項９に記載の
ワクチンの調製方法。 - 【請求項１４】 請求項４ないし請求項６のいずれかに
記載の蛋白質と薬学的に許容される担体とを混和させる
工程を含むことを特徴とする、請求項１０に記載のワク
チンの調製方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP99201086 | 1999-04-09 | ||
| EP99201086.8 | 1999-04-09 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000351735A true JP2000351735A (ja) | 2000-12-19 |
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ID=8240072
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000088054A Withdrawn JP2000351735A (ja) | 1999-04-09 | 2000-03-28 | カンピロバクターワクチン |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6787137B1 (ja) |
| JP (1) | JP2000351735A (ja) |
| KR (1) | KR20010014710A (ja) |
| CN (1) | CN1170594C (ja) |
| AU (1) | AU775752B2 (ja) |
| BR (1) | BR0001559A (ja) |
| CA (1) | CA2303722A1 (ja) |
| HU (1) | HUP0001423A3 (ja) |
| MX (1) | MXPA00003427A (ja) |
| PL (1) | PL339513A1 (ja) |
| TW (1) | TW200418874A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008146830A1 (ja) * | 2007-05-28 | 2008-12-04 | The Kitasato Institute | パラ百日咳菌全菌体ワクチン組成物 |
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|---|---|---|---|---|
| BRPI0414267A (pt) | 2003-09-19 | 2006-11-21 | Epitopix Llc | polipeptìdeos de campilobacter e métodos de uso |
| JP2008501625A (ja) * | 2003-11-21 | 2008-01-24 | エース バイオサイエンシズ エー／エス | 表在Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉポリペプチド |
| KR101881611B1 (ko) * | 2010-06-09 | 2018-07-25 | 더 보드 오브 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 아칸소 | 캄필로박터 감염을 감소시키기 위한 백신 및 방법 |
| US11130800B2 (en) | 2016-05-20 | 2021-09-28 | Novobind Livestock Therapeutics Inc. | Antibodies against microorganisms and uses thereof |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4748018A (en) * | 1984-02-07 | 1988-05-31 | Stolle Research & Development Corp. | Method of passive immunization of mammals using avian antibody |
| US5200344A (en) * | 1990-11-13 | 1993-04-06 | Blaser Martin J | Diagnostic testing for campylobacter jejuni or campylobacter coli infections using novel antigens |
| EP0719155A1 (en) * | 1993-08-27 | 1996-07-03 | Enteric Research Laboratories, Inc. | $i(CAMPYLOBACTER JEJUNI) ANTIGENS, AND METHODS FOR THEIR PRODUCTION AND USE |
| US5681736A (en) * | 1994-10-05 | 1997-10-28 | Antex Biologics, Inc. | Methods for producing enhanced antigenic shigella bacteria and vaccines comprising same |
| US5827654A (en) * | 1995-05-08 | 1998-10-27 | University Of Toronto | Basal body rod protein genes of campylobacter |
| DE19548221C1 (de) * | 1995-12-22 | 1997-05-15 | Biotest Pharma Gmbh | Orale Anwendung von Immunglobulin-Präparationen zur Behandlung und Prophylaxe chronischer Schmerzzustände |
| CA2227932A1 (en) * | 1997-04-08 | 1998-10-08 | Voon Loong Chan | Gene encoding invasion protein of campylobacter jejuni |
| US6156546A (en) * | 1997-05-16 | 2000-12-05 | Washington State University Research Foundation | Identification and molecular cloning of a gene encoding a fibronectin binding protein (CadF) from Campylobacter coli and Campylobacter jejuni |
| EP1043029A1 (en) * | 1999-04-09 | 2000-10-11 | Akzo Nobel N.V. | Campylobacter vaccine |
-
2000
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- 2000-04-07 US US09/544,683 patent/US6787137B1/en not_active Expired - Fee Related
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-
2002
- 2002-07-10 US US10/192,419 patent/US6790446B2/en not_active Expired - Fee Related
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|---|---|---|---|---|
| WO2008146830A1 (ja) * | 2007-05-28 | 2008-12-04 | The Kitasato Institute | パラ百日咳菌全菌体ワクチン組成物 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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