JP2010500034A

JP2010500034A - インフルエンザ赤血球凝集素変異体およびノイラミニダーゼ変異体

Info

Publication number: JP2010500034A
Application number: JP2009523998A
Authority: JP
Inventors: ヤン，チン−フェン; ケンブル，ジョージ; サバラオ，カンタ; マーフィー，ブライアン
Original assignee: メッドイミューンバクシーンズ，インコーポレイティド; ザガバメントオブザユナイテッドステイツオブアメリカナショナルインスティテューツオブヘルス
Priority date: 2006-08-09
Filing date: 2007-08-09
Publication date: 2010-01-07
Also published as: EP2056872A4; AU2007286161A1; AU2007286161B2; US8039002B2; JP2013116109A; US20110182936A1; KR20140065487A; CN104140958A; JP2015172055A; KR20140139626A; CN101983069A; WO2008021959A3; CN104278014A; US8431137B2; US9028838B2; WO2008021959A2; US20080057081A1; KR101586968B1; US8580277B2; KR101586971B1

Abstract

（トリ汎発性）インフルエンザ赤血球凝集素変異体およびノイラミニダーゼ変異体を含むポリペプチド、ポリヌクレオチド、方法、組成物、およびワクチンを提供する。

Description

発明の背景
インフルエンザの種々の進化しつつある株に対するワクチンは、地域保健の観点から、ならびに商業的に、重要である。その理由は、毎年、多数の個体が、様々な株およびタイプのインフルエンザウイルスに感染しているからである。乳児、高齢者、適切な保健医療を受けていない人および免疫無防備状態の人は、そのような感染に起因する特有の死の危険にさらされている。インフルエンザ感染の問題をさらにひどくするのは、新規インフルエンザ株が容易に進化し、種々の種間に広がりうることであり、それによって新規ワクチンの継続的な作製を余儀なくされる。

そのような様々なインフルエンザウイルス／ウイルス株に特異的な防御免疫応答を生成可能な多数のワクチンが50年以上にわたって製造されてきた。それには、全ウイルスワクチン、スプリット・ウイルスワクチン、表面抗原ワクチンおよび弱毒化生ウイルスワクチンが含まれる。しかし、いずれの前記ワクチンタイプの適切な製剤も全身性免疫応答を生成可能であるが、弱毒化生ウイルスワクチンは、さらに、気道における局所粘膜免疫を刺激できる利点を有する。ワクチン製造用のインフルエンザウイルス、およびその断片、の製造に関する考慮すべき仕事は、本発明者らおよび共同研究者によって行われた；例えば2002年10月23日出願の米国出願第60/420,708号；2004年5月24日出願の第60/574,117号；2003年4月25日出願の第10/423,828号；2004年6月12日出願の第60/578,962号；および2004年6月16日出願の第10/870,690号（その開示内容は参照により本明細書中に組み入れられる）を参照のこと。

様々なインフルエンザ株の頻繁な出現（または再出現）のせいで、新規インフルエンザワクチンが絶えず望まれている。そのようなワクチンは、典型的に、新しく出現したウイルス株の抗原性成分を使用して作製される。ゆえに、新規の、新しく出現した、または新しく再出現したウイルス株のポリペプチドおよびポリヌクレオチド（特に抗原遺伝子の配列）が非常に望まれる。

本発明は、多数のタイプのワクチンの製造ならびに研究、診断等に使用可能な、新規のおよび／または新しく単離されたインフルエンザ赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ変異体を提供する。以下をレビューすれば多数の他の利益が明らかになる。

発明の要旨
本明細書中のある態様では、本発明は、以下から選択される、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドを含む：配列番号１〜配列番号１０または配列番号２１〜配列番号２６または配列番号３３〜配列番号３８によってコードされるポリペプチドのいずれか1つ；配列番号１１〜配列番号２０または配列番号２７〜配列番号３２または配列番号３９〜配列番号４４のポリペプチドのいずれか1つ；配列番号１１〜配列番号２０または配列番号２７〜配列番号３２または配列番号３９〜配列番号４４のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームのみ；配列番号１１〜２０または配列番号２７〜３２または配列番号３９〜４４のポリペプチドの別の任意の形態（例えば、シグナルペプチドを含まない成熟形態、またはオープンリーディングフレームの外側の5'および3'配列を含まない成熟形態、またはウイルス（例えばインフルエンザ）の表面で発現される配列）；配列番号１〜配列番号１０または配列番号２１〜配列番号２６、配列番号３３〜３８、または配列番号４５のポリヌクレオチド配列の実質的に全長にわたって、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされる任意のポリペプチド；配列番号１〜配列番号１０または配列番号２１〜配列番号２６または配列番号３３〜配列番号３８、または配列番号４５のポリヌクレオチド配列に、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされる任意のポリペプチド；および、上記のいずれかの断片（その配列は、赤血球凝集素もしくはノイラミニダーゼポリペプチド、または赤血球凝集素もしくはノイラミニダーゼポリペプチドの断片を含み、好ましくは該断片は、本発明の全長ポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生させる）。種々の実施形態では、本発明の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドは、上記ポリペプチドのいずれかの約300個連続したアミノ酸残基と実質的に同一である。さらに他の実施形態では、本発明は、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、上記ポリペプチドのいずれかの連続する少なくとも約350アミノ酸にわたって；少なくとも約400アミノ酸にわたって；少なくとも約450アミノ酸にわたって；少なくとも約500アミノ酸にわたって；少なくとも約520アミノ酸にわたって；少なくとも約550アミノ酸にわたって；少なくとも約559アミノ酸にわたって；少なくとも約565アミノ酸にわたって；または少なくとも約566アミノ酸にわたって実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。ある実施形態では、該ポリペプチド配列（例えば、本明細書中の「配列」欄に列挙した配列）は565個、559個等より少ないアミノ酸しか含まない。そのような実施形態では、その短い列挙したポリペプチドは、場合により、565個、559個等より少ないアミノ酸を含む。さらに他の実施形態では、本発明のポリペプチドは、場合により、融合タンパク質、リーダー配列を伴うタンパク質、前駆ポリペプチド、分泌シグナルもしくは局在化シグナルを伴うタンパク質、またはエピトープタグ、E-タグ、もしくはHisエピトープタグを伴うタンパク質を含む。さらに他の実施形態では、本発明は、上記の列挙される少なくとも1つのポリペプチドに対して、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも93％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも98.5％、少なくとも99％、少なくとも99.2％、少なくとも99.4％、少なくとも99.6％、少なくとも99.8％、または少なくとも99.9％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチドを含む。本発明の赤血球凝集素の配列は、無改変多塩基性切断部位および改変された多塩基性切断部位（それによって卵中のウイルスの増殖が可能になるもの）を有する両配列を含んでよい。配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２７、２９、３１、３９、４１、または４３の赤血球凝集素ポリペプチド配列は内因性アミノ末端シグナルペプチド配列を含むが、ただし、本発明の赤血球凝集素ポリペプチド配列には、成熟形態（アミノ末端シグナルペプチドが切断されているもの）の赤血球凝集素ポリペプチドも含まれる。いかなるインフルエンザ株のいかなる赤血球凝集素ポリペプチド配列の切断部位も、当技術分野の各種方法を使用して常套的に評価または予測することができる。

他の態様では、本発明は、上記の列挙される1種以上のポリペプチド、またはその断片、を含む組成物を含む。本発明にはまた、少なくとも1つの上記アミノ酸配列、またはその断片、を含む少なくとも1つの抗原に対して産生されたポリクローナル抗血清によって特異的に結合されるポリペプチドが含まれる。上記ポリペプチドに特異的なそのような抗体もまた、本発明の特徴である。本発明のポリペプチドは場合により免疫原性である。

本発明はまた、1種以上の任意の上記ポリペプチドの免疫学的有効量を含む免疫原性組成物を包含するだけでなく、生理学的に許容される担体中に含めた上記ポリペプチドのいずれかの免疫学的有効量を個体に投与することによって、個体の免疫系を刺激してインフルエンザウイルスに対する防御免疫応答を生じさせる方法をも包含する。

さらに、本発明には、1種以上の上記ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む組換えインフルエンザウイルスが含まれ、さらに、そのような組換えインフルエンザウイルスの免疫学的有効量を含む免疫原性組成物が含まれる。生理学的に許容される担体中に含めたそのような組換えインフルエンザウイルスの免疫学的有効量を投与することによって、個体の免疫系を刺激してインフルエンザウイルスに対する防御免疫応答を生じさせる方法もまた、本発明の一部である。

他の態様では、本発明は、以下から選択される、単離された核酸または組換え核酸を含む：配列番号１〜配列番号１０または配列番号２１〜配列番号２６または配列番号３３〜配列番号３８、または配列番号４５のポリヌクレオチド配列（またはその相補配列）のいずれか1つ；配列番号１１〜配列番号２０または配列番号２７〜配列番号３２または配列番号３９〜配列番号４４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列（またはその相補ポリヌクレオチド配列）のいずれか1つ；上記ポリヌクレオチド配列のいずれかの実質的に全長にわたって、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列；およびそのようなポリヌクレオチド配列のいずれかの全体または断片を含むポリヌクレオチド配列であって、好ましくは赤血球凝集素またはノイラミニダーゼポリペプチド、または赤血球凝集素もしくはノイラミニダーゼポリペプチドの断片をコードする配列。本発明にはまた、上記核酸によってコードされる任意のポリペプチドの少なくとも約300アミノ酸にわたって、または上記核酸によってコードされる任意のポリペプチドの少なくとも約350アミノ酸にわたって；少なくとも約400アミノ酸にわたって；少なくとも約450アミノ酸にわたって；少なくとも約500アミノ酸にわたって；少なくとも約502アミノ酸にわたって；少なくとも約550アミノ酸にわたって；少なくとも約559アミノ酸にわたって；少なくとも約565アミノ酸にわたって；または少なくとも約566アミノ酸にわたって、実質的に同一のアミノ酸配列をコードする、単離された核酸または組換え核酸が含まれる。また、アミノ酸の長さが例えば、566個、565個、559個等より少ない状況（例えば「配列」欄を参照のこと）では、その長さは、場合により、566個、565個、559個等より少ないと理解されるべきであろう。本発明にはまた、赤血球凝集素もしくはノイラミニダーゼポリペプチド、または1種以上の赤血球凝集素もしくはノイラミニダーゼポリペプチドの1種以上の断片、をコードするポリヌクレオチドを含む任意の上記核酸が含まれる。本発明の他の態様には、ポリペプチド（場合により赤血球凝集素またはノイラミニダーゼポリペプチド）をコードする単離された核酸または組換え核酸であって、その配列が、上記ポリヌクレオチドの少なくとも1つに対して、少なくとも98％の同一性、少なくとも98.5％の同一性、少なくとも99％の同一性、少なくとも99.2％の同一性、少なくとも99.4％の同一性、少なくとも99.6％の同一性、少なくとも99.8％の同一性、または少なくとも99.9％の同一性を有する核酸が含まれる。本発明にはまた、1種以上の上記ポリヌクレオチド配列を突然変異させるかまたは遺伝子組換えすることによって得られる赤血球凝集素またはノイラミニダーゼのポリペプチドをコードする単離された核酸または組換え核酸が含まれる。本発明のポリヌクレオチド配列は、場合により、1種以上の、例えば、リーダー配列、前駆配列、またはエピトープタグ配列等を含んでもよく、場合により融合タンパク質（例えば、1種以上の追加の核酸配列との融合タンパク質）をコードしてもよい。

さらに他の実施形態では、本発明は、2種以上の上記核酸を有する組成物（例えば、少なくとも約2、5、10、50またはそれ以上の核酸を含むライブラリー）を含む。そのような組成物は、場合により、1種以上の上記核酸を切断（例えば、機械的、化学的、制限酵素／RNA分解酵素／DNA分解酵素を用いた酵素的等の手法で）することによって得られる。本発明の他の組成物には、例えば、デオキシリボヌクレオチド三リン酸および熱安定核酸ポリメラーゼの存在下で1種以上の上記核酸をインキュベートすることによって得られる組成物が含まれる。

本発明はまた、上記核酸の少なくとも1つ、またはその切断断片または増幅断片またはその産物を含む細胞を包含する。そのような細胞は、場合により、そのような核酸によってコードされるポリペプチドを発現しうる。本発明の他の実施形態には、上記核酸のいずれかを含むベクター（例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、ウイルス断片、等）が含まれる。そのようなベクターは、場合により、発現ベクターを含みうる。本発明の好ましい発現ベクターには、非限定的に、pol Iプロモーターおよびターミネーター配列を含むベクターまたはpol Iおよびpol IIプロモーターの両者を使用するベクター「polI/polIIプロモーター系」が含まれる（例えば、Zobel et al., Nucl. Acids Res. 1993, 21:3607; US20020164770; Neumann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:9345; Fodor et al., J. Virol. 1999, 73:9679; およびUS20030035814）。そのようなベクターによって形質導入された細胞もまた本発明の範囲内である。

ある実施形態では、本発明は、1種以上の上記核酸（例えば、赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼをコードする核酸）、または1種以上のその断片、を含むウイルス（例えばインフルエンザウイルス）を包含する。そのようなウイルスを含む免疫原性組成物もまた、本発明の一部である。そのようなウイルスは、再集合（reassortment）ウイルス、例えば6:2再集合ウイルス（例えば、1種以上のドナーウイルス由来の領域をコードする6つの遺伝子および1種以上の上記ヌクレオチド配列（または1種以上のその断片）（場合により赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼを含んでもよい）由来の領域をコードする2つの遺伝子を含むもの）を含みうる。本発明の再集合ウイルス（場合により生ウイルス）には、例えば、低温感受性、低温適応、または弱毒化のうち1つ以上に該当するドナーウイルスが含まれうる。例えば、再集合ウイルスは、例えば、A/Ann Arbor/6/60、PR8等を含みうる。あるいは、本発明の再集合ウイルスからA/Ann Arbor/6/60が除外される。本発明の好ましい一実施形態は、再集合（reassortant）インフルエンザウイルスであって、かつ6:2再集合インフルエンザウイルスであり、これはA/Ann Arbor/6/60由来の6つの遺伝子コード領域、および配列番号１１〜２０、配列番号２７〜３２、および配列番号３９〜４４のポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードする2つの遺伝子コード領域を含む。代替の実施形態では、本発明の再集合インフルエンザウイルスには、6:2再集合インフルエンザウイルスが含まれ、該ウイルスは、A/Ann Arbor/6/60以外の1種以上のドナーウイルス由来の6つの遺伝子コード領域、および配列番号１１〜２０、配列番号２７〜３２、および配列番号３９〜４４のポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードする2つの遺伝子コード領域を含む。別の代替の実施形態では、本発明の再集合インフルエンザウイルスには、6:2再集合インフルエンザウイルスが含まれ、該ウイルスは、A/Ann Arbor/6/60以外の1種以上のドナーウイルス由来の6つの遺伝子コード領域、および任意の汎発性（pandemic）インフルエンザ株由来のHAまたはNAポリペプチドである、2つの遺伝子コード領域を含む。好適な培養培地で、核酸の発現を可能にする条件下で、インフルエンザウイルスを保持する宿主細胞を培養し、かつ1種以上のその宿主細胞または培地から組換えインフルエンザウイルスを単離することによる組換えインフルエンザウイルスの製造方法もまた、本発明の一部である。

本明細書中の他の実施形態では、本発明は、任意の上記組換えインフルエンザウイルスの免疫学的有効量を有する免疫原性組成物を含む。他の実施形態には、（場合により生理学的に有効な担体中に含めた）任意の上記組換えインフルエンザウイルスの免疫学的有効量を個体に投与することによって、個体の免疫系を刺激してインフルエンザウイルスに対する防御免疫応答を生じさせる方法が含まれる。

本発明の他の態様には、核酸の発現を可能にする条件下で、好適な培養培地中で、任意の上記宿主細胞を培養し、そしてその宿主細胞の1つ以上または該細胞を培養させる培地からポリペプチドを単離することによる、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドの製造方法が含まれる。

免疫原性組成物もまた、本発明の特徴である。例えば、1種以上の任意の上記ポリペプチドおよび／または核酸および、場合により、賦形剤、例えば製薬的に許容される賦形剤または1種以上の製薬的に許容される投与成分を含む免疫原性組成物である。本発明の免疫原性組成物は、任意の1種以上の上記ウイルスを同様に（例えば、1種以上の製薬的に許容される投与成分とともに）含んでもよい。

任意の上記ウイルス（または免疫原性組成物）の有効量を被験体に投与することによって被験体の免疫原性応答を生じさせる方法もまた、本発明の範囲内である。さらに、任意の1種以上の上記ウイルス（または免疫原性組成物）を、ウイルス感染に対する免疫原性応答を生じさせるために有効な量で投与することによって被験体のウイルス感染（例えばウイルス性インフルエンザ）を予防的または治療的に処置する方法もまた、本発明の部分である。そのような処置の被験体には、哺乳類（例えばヒト）が含まれうる。そのような方法は、被験体へのin vivo投与ならびに被験体の1個以上の細胞へのin vitroまたはex vivo投与を含んでもよい。さらに、そのような方法は、ウイルス感染を予防的または治療的に処置するために有効な量で被験体に投与される、ウイルスおよび製薬的に許容される賦形剤からなる組成物の投与を含んでもよい。

他の態様では、本発明には、1種以上の汎発性インフルエンザ株の赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼポリペプチドをコードする核酸配列およびA/Ann Arbor/6/60の1種以上のポリペプチドをコードする核酸配列を含む組成物が含まれる。さらに、本発明には、1種以上の汎発性インフルエンザ株の赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼポリペプチドをコードする核酸配列およびPR8またはA/Ann Arbor/6/60の1種以上のポリペプチドをコードする核酸配列を含む組成物が含まれる。そのような配列には、本明細書中の「配列」欄に列挙される配列が含まれうる。さらに、本発明の好ましい実施形態には、1種以上の汎発性インフルエンザ株の赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼをコードする配列および選択されたバックボーン株をコードする核酸配列を6:2再集合体として含む組成物が含まれる。そのような組成物には、好ましくは、本明細書中の「配列」欄から選択される赤血球凝集素およびノイラミニダーゼをコードする配列およびバックボーン株が含まれ、該バックボーン株はPR8またはA/Ann Arbor/6/60である。本発明にはまた、赤血球凝集素が改変された多塩基性切断部位を含んでいるそのような上記組成物が含まれる。本発明にはまた、そのような上記組成物を含む弱毒化生インフルエンザワクチンが含まれる。

本発明の前記および他の目的および特徴は、以下の詳細な説明を添付の図面および添付書類と組み合わせて読むことにより、さらに完全に明らかになる。

図１は、多塩基性切断部位を除去するためにVN/1203/2004のHA遺伝子内に遺伝子操作で導入された改変を示す。図２は、鼻腔内投与されたH5N1 ca再集合ウイルスがニワトリにおいて複製しないことを示す結果を表示する。図３は、H5N1/AA caワクチン候補がマウスに対して致死的でないことを説明する。図４は、1997および2004 H5N1 ca再集合ウイルスの複製がマウスにおいて制限されることを示す。図５は、再集合H5N1/AA caインフルエンザウイルスの複製がマウスの肺において制限されることを示す。図６は、ワクチンの1回量のi.n.投与後にマウスにおいて誘導された血清HAI Ab力価を示す。図７は、ワクチンの1回量のi.n.投与後にマウスにおいて誘導された血清中和Ab力価を示す。図８は、H5N1 ca再集合ウイルスが、50、500または5000 LD₅₀の野生型H5N1ウイルスを用いた致死的チャレンジに対してマウスを防御することを示す。図９は、マウスにおける同種および異種H5N1チャレンジウイルスの肺複製に対する防御の効力を示す。図１０は、マウスの上気道における同種および異種H5N1チャレンジウイルスの複製に対する防御の効力を示す。図１１は、マウスにおける同種または異種H5N1 wtウイルスを用いた高用量（10₅TCID₅₀）チャレンジに対する、2004 H5N1 caワクチンによって付与される防御の効力を示す。図１２は、マウスにおける同種または異種H5N1野生型ウイルスを用いた高用量（10₅TCID₅₀）チャレンジに対する、1997および2003 H5N1 caワクチンによって付与される防御の効力を示す。図１３は、マウスにおける低または高用量の同種H5N1野生型ウイルスチャレンジに対する、2004 H5N1 caワクチンによって付与される防御の効力を示す。図１４は、多塩基性切断部位を除去するためにA/Netherland/219/03 HAのHA遺伝子内へ遺伝子操作で導入されうる改変を示す。図１５は、H5N1 caワクチンがマウスにおいて血清中和抗体力価を誘導することを示す。ワクチン投与前（事前採血）および各ワクチン投与の28日後に血清を収集した。検出不能な力価には値10を割り当てる。図１６は、フェレットにおいてH6 caウイルスが弱毒化されることを示す。＊肺ではEID₅₀/g；鼻甲介ではPFU/g。10⁷ TCID₅₀を鼻腔内に接種し、感染後3日目に組織を回収した。図１７は、フェレットにおけるH6 caワクチンの免疫原性を示す。図１８（ａ）および１８（ｂ）は、フェレットにおけるH6 caワクチンの効力を示す。（ａ）肺および（ｂ）鼻甲介においてウイルス力価を測定した。ワクチン：7 log₁₀ PFUの単回投与。チャレンジ：7 log₁₀ PFU；チャレンジ後の3日間。図１９は、フェレットにおいてH7N3 BC 04 caが弱毒化されることを示す。接種物：鼻腔内に10⁷ TCID₅₀を含む0.5 mL。感染後3日目に組織を回収した。図２０は、H7N3 BC 2004 caがマウスにおいて免疫原性であることを示す。ａ：ck/BC/CN-6/04 wtに対する血清中和抗体力価の逆数幾何平均。ｂ：感染後28日目の中和力価と比較してp<0.05（マン・ホイットニーU検定）。図２１（ａ）〜２１（ｉ）は、マウスにおけるH7ウイルスを用いた致死的チャレンジに対してH7N3 BC 04 caが有効であることを示す。50 LD₅₀ A/ck/BC/CN-7/04の致死的チャレンジに対する効力：一回量で免疫後4週間（ａ）、一回量で免疫後8週間（ｂ）、または2回量（2回量は4週間空けて投与した）で免疫後8週間（ｃ）。図２１（ａ）〜２１（ｉ）は、マウスにおけるH7ウイルスを用いた致死的チャレンジに対してH7N3 BC 04 caが有効であることを示す。50 LD₅₀ A/NL/219/03の致死的チャレンジに対する効力：一回量で免疫後4週間（ｄ）、一回量で免疫後8週間（ｅ）、または2回量（2回量は4週間空けて投与した）で免疫後8週間（ｆ）。図２１（ａ）〜２１（ｉ）は、マウスにおけるH7ウイルスを用いた致死的チャレンジに対してH7N3 BC 04 caが有効であることを示す。50 LD₅₀ A/tk/Eng/63の致死的チャレンジに対する効力：一回量で免疫後4週間（ｇ）、一回量で免疫後8週間（ｈ）、または2回量（2回量は4週間空けて投与した）で免疫後8週間（ｉ）。図２２（ａ）および（ｂ）は、H7N3 BC 04 caワクチンがマウスにおいて有効であることを示す。（ａ）鼻甲介および（ｂ）肺において8週間の時点でウイルス力価を測定した。図２２（ａ）および（ｂ）は、H7N3 BC 04 caワクチンがマウスにおいて有効であることを示す。（ａ）鼻甲介および（ｂ）肺において8週間の時点でウイルス力価を測定した。図２３（ａ）および（ｂ）は、フェレットにおいてH9N2 G9/AA caが弱毒化されることを示す。（ａ）鼻甲介および（ｂ）肺においてウイルス力価を測定した。図２４（ａ）および（ｂ）は、マウスにおけるH9N2 caワクチンの効力を示す。図２５は、健常な成人においてH9N2 G9/AA caの複製が高度に制限されることを示す。図２６は、健常な成人における10^7.0 TCID₅₀のH9N2 G9/AA caに対するHI抗体応答を示す。図２７は、健常な成人においてH5N1 VN2004 A/AA caの複製が高度に制限されることを示す。図２８は、健常な成人における10^6.7 TCID₅₀のVN2004 A/AA caに対するHI抗体応答を示す。

詳細な説明
本発明には、インフルエンザ赤血球凝集素およびノイラミニダーゼのポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列ならびにそのような配列を含むベクター、組成物等およびそれらの使用方法が含まれる。以下、本発明の追加の特徴をさらに詳細に説明する。

定義
特に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意義と同じ意義を有する。以下の定義は当技術分野の定義を補うものであり、本出願を対象にし、任意の関連案件または無関係の案件、例えば、任意の公有特許または出願に必ずしも適用されないものとする。本明細書中に記載の方法および材料に類似または等価の任意の方法および材料を本発明の検査のための実施に使用できるが、好ましい材料および方法は本明細書中に記載されるものである。したがって、本明細書中で使用される用語法は特定の実施形態を説明するためだけのものであり、限定的であることを意図しない。

本明細書および特許請求の範囲で使用される、単数形「a」、「an」および「the」には、文脈上明らかに別の指定がされない限り、複数の指示対象が含まれる。ゆえに、例えば、「a virus」への言及には、複数のウイルスが含まれ；「a host cell」への言及には、宿主細胞の混合物が含まれる、等である。

「アミノ酸配列」とは、文脈に応じて、アミノ酸残基のポリマー（タンパク質、ポリペプチド等）またはアミノ酸ポリマーを表す文字列である。

用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「核酸配列」とは、文脈に応じて、一本鎖もしくは二本鎖デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドポリマー、そのキメラもしくはアナログ、またはそれらを表す文字列を表す。本明細書中で使用される該用語には、場合により、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で一本鎖核酸にハイブリダイズする点において天然ヌクレオチドの必須の性質を有する、天然に存在するヌクレオチドのアナログ（例えばペプチド核酸）のポリマーが含まれる。特に指定されない限り、本発明の特定の核酸配列は、場合により、明示的に指定される配列に加えて相補配列を包含する。任意の特定のポリヌクレオチド配列から、所定の核酸または相補ポリヌクレオチド配列（例えば相補核酸）を決定することができる。

用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」はまた、ヌクレオチドの鎖に対応した、モノマー単位の任意の物理的鎖（physical string）を包含し、それには、ヌクレオチド、PNA、修飾オリゴヌクレオチド（例えば、溶液中の生物学的RNAまたはDNAには典型的でない塩基を含むオリゴヌクレオチド、例えば2'-O-メチル化オリゴヌクレオチド）等のポリマー（例えば典型的にはDNAまたはRNAポリマー）が含まれる。核酸は、例えば、一本鎖または二本鎖であってよい。

「部分配列」とは、完全配列を最長とする、配列全体の任意の部分であり、完全配列を包含する。典型的には、部分配列は完全長配列より短い配列を含む。「ユニーク部分配列」とは、以前に決定されたインフルエンザポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のいずれにおいても見出されない部分配列である。

ポリペプチドに関する用語「変異体」とは、リファレンス配列と比べて1個以上のアミノ酸が改変されているアミノ酸配列を表す。変異体は「保存的」変化を有してよく、その置換アミノ酸は類似の構造特性または化学特性を有し、例えばロイシンがイソロイシンで置換されている変異体である。あるいは、変異体は「非保存的」変化を有してよく、例えばグリシンがトリプトファンで置換されている変異体である。類似のマイナーな変異にはまた、アミノ酸欠失もしくは挿入、または両者が含まれうる。生物学的または免疫学的活性を失わせることなく、どのアミノ酸残基を置換、挿入、または欠失させることができるかを決定するための指針は、当技術分野において周知のコンピュータプログラム、例えばDNASTARソフトウェア、を使用して見出すことができる。保存的置換の例は本明細書中でさらに記載される。

用語「遺伝子」は、生物学的機能に関連している任意の核酸を表すために広く使用される。ゆえに、遺伝子には、コード配列および／またはその発現に必要な調節配列が含まれる。用語「遺伝子」は特定のゲノム配列に適用され、ならびに該ゲノム配列によってコードされるcDNAまたはmRNAに適用される。

遺伝子にはまた、例えば、他のタンパク質に対する認識配列を形成する、非発現性の核酸セグメントが含まれる。非発現性の調節配列には、調節タンパク質、例えば転写因子がそこに結合して隣接配列または付近の配列の転写を生じさせる、「プロモーター」および「エンハンサー」が含まれる。「組織特異的」プロモーターまたはエンハンサーとは、特定の組織タイプもしくは細胞タイプ、またはタイプ群における転写を調節するものである。

「遺伝子の発現」または「核酸の発現」とは、文脈での示唆により、DNAからRNAへの転写（場合により、RNAの修飾、例えばスプライシングが含まれる）、RNAからポリペプチドへの翻訳（場合により、ポリペプチドの事後修飾、例えば翻訳後修飾が含まれる）、または転写および翻訳の両者を意味する。

「オープンリーディングフレーム」または「ORF」とは、ポリペプチドに翻訳されることが可能な（例えば遺伝子の）DNAまたはRNAの翻訳読み枠候補である。すなわち、該読み枠は停止コドンによって中断されていない。しかし、用語ORFは、ポリヌクレオチドが実際にポリペプチドに翻訳されることを必ずしも示唆しないことに留意すべきであろう。

用語「ベクター」とは、生物、細胞、または細胞成分間で核酸を増幅および／または伝達するための手段を表す。ベクターには、自律的に複製するか、または宿主細胞の染色体内への組み込みが可能な、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体等が含まれる。ベクターは、自律的に複製しない、裸のRNAポリヌクレオチド、裸のDNAポリヌクレオチド、同一鎖内でDNAおよびRNAの両者からなるポリヌクレオチド、ポリ-リシン-コンジュゲートDNAまたはRNA、ペプチド-コンジュゲートDNAまたはRNA、リポソーム-コンジュゲートDNA等であってもよい。すべてではないが、多数の一般的な実施形態では、本発明のベクターはプラスミドである。

「発現ベクター」とは、そこに組み込まれている核酸の発現ならびに複製を促進可能なベクター、例えばプラスミドである。典型的に、発現対象の核酸はプロモーターおよび／またはエンハンサーに「作動可能に連結」されていて、該プロモーターおよび／またはエンハンサーによって転写調節制御を受ける。

「両方向性発現ベクター」とは、2つのプロモーター間に位置する核酸に対して反対方向に配置されたその2つの二者択一的プロモーターによって特徴付けられ、例えば、プラス（＋）鎖すなわちセンス鎖、およびネガティブ（−）鎖すなわちアンチセンス鎖RNAの両方の転写を生じさせるようにその発現が両方向に開始されうるベクターである。

「ポリペプチド」とは、2個以上のアミノ酸残基を含むポリマー（例えばペプチドまたはタンパク質）である。該ポリマーは、場合により、修飾、例えばグリコシル化等を含んでよい。該ポリペプチドのアミノ酸残基は天然または非天然であってよく、非置換、無修飾、置換または修飾残基であってよい。

本発明の関連で、用語「単離された」とは、その天然環境においてそれに通常付随するか、または相互作用する成分を実質的に含まない生物学的材料、例えばウイルス、核酸またはタンパク質を表す。単離された生物学的材料は、場合により、その天然環境、例えば細胞または野生型ウイルス、において該生物学的材料とともに見出されない追加の材料を含む。例えば、該材料がその天然環境、例えば細胞、中に存在する場合、該材料は、該環境中で見出されるそのような材料にとって天然のものでない細胞中の位置（例えばゲノムまたは遺伝的エレメント内）に位置していてもよい。例えば、天然核酸（例えば、コード配列、プロモーター、エンハンサー等）は、非天然手段によって、該核酸にとって天然のものでないゲノムの遺伝子座（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター等のベクター、またはアンプリコン）に導入されれば、単離された核酸になる。そのような核酸は「異種」核酸とも称される。単離されたウイルスは、例えば、野生型ウイルスの天然環境（例えば感染個体の上咽頭）以外の環境（例えば、細胞培養系、または細胞培養から精製されて）に存在する。

ウイルスに言及する場合の用語「キメラの」または「キメラ」とは、該ウイルスが、2種以上の親ウイルス株または供給源由来の遺伝子および／またはポリペプチド成分を含むことを示す。同様に、ウイルスタンパク質に言及する場合の用語「キメラの」または「キメラ」とは、該タンパク質が、2種以上の親ウイルス株または供給源由来のポリペプチド成分（すなわちアミノ酸部分配列）を含むことを示す。

用語「組換え」とは、材料（例えば核酸またはタンパク質）が人間の介入によって人工的または合成的に（非天然に）改変されていることを示す。該改変は、その天然環境もしくは天然状態の、またはそこから取り出された、材料に対して実施することができる。具体的には、例えば、インフルエンザウイルスが組換え核酸の発現によって生産された場合、それは組換えインフルエンザウイルスである。例えば、「組換え核酸」とは、例えばクローニング、DNAシャフリングまたは他の手法において、核酸の組換えによって、または化学的もしくは他の突然変異誘発によって製造される核酸であり；「組換えポリペプチド」または「組換えタンパク質」とは、組換え核酸の発現によって生産されるポリペプチドまたはタンパク質であり；および「組換えウイルス」、例えば組換えインフルエンザウイルス、は組換え核酸の発現によって生産される。

ウイルスに言及する場合の用語「再集合（reassortant）」とは、該ウイルスが、2種以上の親ウイルス株または供給源由来の遺伝子および／またはポリペプチド成分を含むことを示す。例えば、7:1再集合は、第一の親ウイルス由来の7つのウイルスゲノムセグメント（または遺伝子セグメント）および1つの補完的ウイルスゲノムセグメント（例えば本発明の赤血球凝集素またはノイラミニダーゼをコードするもの）を含む。6:2再集合は、第一の親ウイルス由来の6つのゲノムセグメント（最も一般的には6つの内部遺伝子）および異なる親ウイルス由来の2つの補完的セグメント（例えば赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ）を含む。

異種または単離された核酸に言及する場合の用語「導入された」とは、真核細胞または原核細胞内への核酸の取り込みを表し、該核酸は、該細胞のゲノム（例えば染色体、プラスミド、色素体またはミトコンドリアDNA）内に取り込まれうるか、自律レプリコンに変換されうるか、または一時的に発現されうる（例えばトランスフェクトmRNA）ものである。該用語には、「感染」、「トランスフェクション」、「形質転換」および「形質導入」等の方法が含まれる。本発明の関連では、種々の方法を用いて核酸を細胞内に導入することができ、該方法には、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、脂質媒介トランスフェクション（リポフェクション）等が含まれる。

用語「宿主細胞」とは、異種核酸、例えばベクター、を含有し、かつ該核酸の複製および／または発現を支持する細胞を意味する。宿主細胞は、原核細胞、例えば大腸菌（E. coli）、または真核細胞、例えば酵母、昆虫、両生類、鳥類または哺乳類の細胞（ヒト細胞が含まれる）であってよい。典型的な宿主細胞には、例えば、Vero（アフリカミドリザル腎臓）細胞、BHK（ベビーハムスター腎臓）細胞、プライマリーチック（primary chick）腎臓（PCK）細胞、Madin-Darbyイヌ腎臓（MDCK）細胞、Madin-Darbyウシ腎臓（MDBK）細胞、293細胞（例えば293T細胞）、およびCOS細胞（例えばCOS1、COS7細胞）等が含まれうる。

インフルエンザウイルスの「免疫学的有効量」とは、インフルエンザウイルスに対するその後の曝露に対して個体（例えばヒト）自身の免疫応答を増強するために十分な量である。誘導される免疫レベルは、例えば中和分泌および／または血清抗体の量を測定することによって、例えばプラーク中和、補体結合、酵素結合免疫吸着、またはマイクロ中和アッセイによって、モニターすることができる。

インフルエンザウイルスに対する「防御免疫応答」とは、個体が後にそのようなインフルエンザウイルスに曝露され、かつ／またはそれに感染した場合に、疾患に対して防御性である個体（例えばヒト）が示す免疫応答を表す。一部の場合には、該インフルエンザウイルス（例えば天然に循環するインフルエンザウイルス）は依然として感染を引き起こしうるが、重篤な感染を引き起こすことはできない。典型的に、防御免疫応答は、同一の株および／またはサブグループ（およびおそらく、異なる、非ワクチン株および／またはサブグループ）のウイルスをin vitroおよびin vivoで中和可能な、検出可能なレベルの宿主産生血清および分泌抗体を生じさせる。

本明細書中で使用される「抗体」とは、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的または部分的にコードされる1種以上のポリペプチドを含むタンパク質である。認定されている免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はカッパまたはラムダとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、ひいてはそれらが、それぞれ免疫グロブリンクラス、IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEを規定する。典型的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は四量体を含む。各四量体は2つの同一のポリペプチド鎖ペアからなり、各ペアは1つの「軽」鎖（約25 kD）および1つの「重」鎖（約50〜70 kD）を有する。各鎖のN末端は、抗原認識を主に担う約100〜110個またはそれ以上のアミノ酸からなる可変領域を規定する。可変軽鎖（VL）および可変重鎖（VH）という用語はそれぞれ前記軽鎖および重鎖を表す。抗体は、インタクトの免疫グロブリンとして、または種々のペプチダーゼでの消化によって得られる多数の十分に特徴付けられた断片として、存在する。すなわち、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域のジスルフィド結合の下で抗体を消化してF(ab)'2を生じる。F(ab)'2は、ジスルフィド結合によってVH-CH1に軽鎖が連結されたものであるFabそのものの二量体である。F(ab)'2は穏やかな条件下で還元され、ヒンジ領域のジスルフィド結合が切断され、それによって(Fab')2二量体がFab'単量体に変換される。Fab'単量体は、本質的には、ヒンジ領域の一部を有するFabである（他の抗体断片についてのより詳細な説明に関しては、Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1999)を参照のこと）。種々の抗体断片はインタクトの抗体の消化の観点から定義されるが、当業者は、そのようなFab'断片を、化学的に、または組換えDNA方法論を利用して、新規（de novo）合成することができることを認識するであろう。ゆえに、本明細書中で使用される抗体という用語には、全長抗体の改変によって生産されるか、または組換えDNA方法論を使用して新規（de novo）合成される、抗体もしくは断片が含まれる。抗体には、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多鎖抗体（multiple chain antibodies）または一本鎖抗体、例えば一本鎖Fv（sFvまたはscFv）抗体（可変重鎖および可変軽鎖が（直接またはペプチドリンカーによって）連結されて連続的なポリペプチドを形成しているもの）、およびヒト化抗体またはキメラ抗体が含まれる。

インフルエンザウイルス
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチド、例えば配列番号１〜４５、は、インフルエンザHAおよびNA配列の変異体である。一般に、インフルエンザウイルスは、セグメント化一本鎖RNAゲノムを含有する内部リボ核タンパク質コア、およびマトリックスタンパク質によって裏打ちされている外側リポタンパク質エンベロープからなる。インフルエンザウイルスのゲノムは、免疫原性赤血球凝集素（HA）およびノイラミニダーゼ（NA）タンパク質、および6つの内部コアポリペプチド（すなわち、ヌクレオカプシド核タンパク質（NP）、マトリックスタンパク質（M）、非構造タンパク質（NS）および3つのRNAポリメラーゼ（PA、PB1、PB2）タンパク質）をコードする、線状（−）鎖リボ核酸（RNA）の8つのセグメントからなる。複製時に、ゲノムウイルスRNAは宿主細胞の核中で（＋）鎖メッセンジャーRNAおよび（−）鎖ゲノムcRNAに転写される。8つのゲノムセグメントの各々は、該RNAに加えて、NPおよびポリメラーゼ複合体（PB1、PB2、およびPA）を含有するリボ核タンパク質複合体中にパッケージングされる。

インフルエンザは、一般に、インフルエンザAとインフルエンザBのカテゴリーに分類される。インフルエンザAおよびインフルエンザBウイルスは、それぞれ、ネガティブ極性を有する一本鎖RNAの8つのセグメントを含有する。インフルエンザAゲノムは11のポリペプチドをコードする。セグメント1〜3は3つのポリペプチドをコードし、それらはRNA依存性RNAポリメラーゼを構成する。セグメント1はポリメラーゼ複合体タンパク質PB2をコードする。残りのポリメラーゼタンパク質PB1およびPAは、セグメント2およびセグメント3によってそれぞれコードされる。さらに、いくつかのインフルエンザ株のセグメント1は、PB1コード領域内の別の読み枠から生産される小分子タンパク質、PB1-F2をコードする。セグメント4は、細胞接着および感染時の侵入に関与する赤血球凝集素（HA）表面糖タンパク質をコードする。セグメント5は、ウイルスRNAに関連する主な構造成分であるヌクレオカプシド核タンパク質（NP）ポリペプチドをコードする。セグメント6はノイラミニダーゼ（NA）エンベロープ糖タンパク質をコードする。セグメント7は、M1およびM2と称される、異なる形でスプライシングされたmRNAから翻訳される、2つのマトリックスタンパク質をコードする。セグメント8は、選択的スプライシングがなされたmRNA変異体から翻訳される、2つの非構造タンパク質であるNS1およびNS2をコードする。インフルエンザBの8つのゲノムセグメントは11個のタンパク質をコードする。最も大きい3つの遺伝子は、RNAポリメラーゼの成分、すなわちPB1、PB2およびPAをコードする。セグメント4はHAタンパク質をコードする。セグメント5はNPをコードする。セグメント6はNAタンパク質およびNBタンパク質をコードする。その両タンパク質NBおよびNAは、2シストロン性mRNAの互いに重複した読み枠から翻訳される。インフルエンザBのセグメント7はまた、2つのタンパク質：M1およびBM2をコードする。最小セグメントは2つの産物をコードし、その産物NS1は完全長RNAから翻訳され、一方、NS2はスプライスmRNA変異体から翻訳される。

インフルエンザウイルスワクチン
本明細書中の配列、組成物および方法は、それだけではないが、主に、ワクチン用のインフルエンザウイルスの製造に関する。歴史的に、インフルエンザウイルスワクチンは、主に、選択したウイルス株または関連株の経験的予測に基づくウイルス株を使用してふ化鶏卵中で製造されてきた。最近は、認可されている弱毒化温度感受性マスター株を背景として選択された赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ抗原を組み込んだ再集合ウイルスが製造されている。該ウイルスを鶏卵中で複数回継代培養した後、インフルエンザウイルスを回収し、さらに、場合により、例えばホルムアルデヒドおよび／またはβ-プロピオラクトンを使用して不活性化する（か、あるいは弱毒化生ワクチンとして使用する）。従って、インフルエンザワクチンの構築においてHAおよびNA配列（例えば配列番号１〜４５）が非常に有用であることが理解されよう。本発明には、汎発性インフルエンザ株のHAおよび／またはNA配列を含むウイルス／ワクチン（HA配列が、改変された多塩基性切断部位、例えば本明細書中に記載の改変を含むものが含まれる）が含まれ；および、ウイルス／ワクチンがcaバックボーン（例えばA/AA/6/60）またはPR8のバックボーンを含むものが含まれる。

細胞培養において組換えワクチンおよび再集合ワクチンを製造する試みは、ワクチン製造に関して認可されている株のいくつかが標準的な細胞培養条件下で効率的に増殖できないことによって妨げられている。しかし、本発明者らおよびその共同研究者による以前の仕事により、培養中で組換えおよび再集合ウイルスを製造するためのベクター系および方法が提供され、ゆえに、1または多数の選択した抗原性ウイルス株、例えばAまたはB株のいずれか、種々のサブタイプまたは亜株等に対応するワクチン、例えば本明細書中のHAおよび／またはNA配列を含むワクチンを、迅速に製造することが可能になった。Multi-Plasmid System for the production of Influenza virus、2002年10月23日出願の米国出願第60/420,708号、2003年4月25日出願の米国出願第10/423,828号、および2004年5月24日出願の米国出願60/574,117を参照のこと。典型的には、培養は、細胞培養インキュベーター等の系中で、制御湿度およびCO₂条件下で、温度が35℃を超えないことを確保するためにサーモスタット等の温度調節装置を使用して一定温度で維持される。再集合インフルエンザウイルスは、マスターインフルエンザウイルスのゲノムセグメントに対応するベクターのサブセットを、目的の株由来の補完的セグメント（例えば本明細書中のHAおよび／またはNA抗原性変異体）と組み合わせて導入することによって、容易に得ることができる。典型的に、マスター株は、ワクチン投与に関する望ましい特性に基づいて選択される。例えば、ワクチン製造、例えば弱毒化生ワクチンの製造では、マスタードナーウイルス株は弱毒化表現型、低温適応および／または温度感受性に関して選択されうる。本明細書中の別の箇所、および例えば米国特許出願第10/423,828号等で説明されるように、本発明の種々の実施形態では、A/Ann Arbor (AA)/6/60インフルエンザ株を「バックボーン」として利用し、それにHAおよび／またはNA遺伝子（例えば本明細書中で列挙されるそれらの配列等）を付加することにより所望の再集合ウイルスを作製する。ゆえに、例えば6:2再集合体では、2つの遺伝子（すなわちNAおよびHA）が、望ましい免疫原性応答の対象となるインフルエンザ株（群）に由来し、他の6つの遺伝子がAnn Arbor株、または他のバックボーン株に由来する等である。Ann Arborウイルスはその低温適応、弱毒化、温度感受性特性に関して有用である。もちろん、本明細書中のHAおよびNA配列は、多数の他のウイルス遺伝子またはウイルスタイプ（例えば、再集合体中に存在する他のインフルエンザ遺伝子、すなわち非HAおよび非NA遺伝子を含有する、多数の異なる「バックボーン」、例えばPR8等）と再集合させることが可能であることは理解されよう。

本明細書中の種々の実施形態は、汎発性インフルエンザに対する、本明細書中のHAおよび／またはNA配列を有する弱毒化生ワクチンを含みうる。そのようなワクチンは、典型的に、例えば配列番号１１〜２０、２７〜３２、または３９〜４４のHAおよび／またはNA配列、またはそれらに対応する配列番号１〜１０、２１〜２６、３３〜３８、または４５のコードヌクレオチドを含む。卵中のワクチンウイルス株（例えば再集合体）の増殖から生じる1つの問題は、トリ株（大流行に関与する可能性がある）は、ワクチンを生産させようとする卵を死滅させることができ、そのため従来の（非プラスミドレスキューの）再集合体生産の利用による操作や製造等が難しいことである。そのようなトリ株は、ヒトにおいてインフルエンザを引き起こし、かつ大流行を引き起こす可能性があることが証拠により示唆されているため、興味深い。ゆえに、汎発性株、例えば種々のトリ配列（例えば本明細書中のHAおよびNA配列）を用いてインフルエンザ再集合体を作製／操作するためのプラスミドレスキュー系の使用は非常に望まれており、本発明の特徴である。しかし、本配列はまた、非プラスミドまたは従来の系でも使用可能であることは理解されよう。

（とりわけ）水鳥は、15種の赤血球凝集素（HA）サブタイプおよび9種のノイラミニダーゼ（NA）サブタイプのインフルエンザAウイルスによって感染しうる。そのような鳥は保有体として働き、そこから新規インフルエンザサブタイプがヒト集団に導入されて大流行を引き起こす可能性がある。2003年にオランダでトリH7N7インフルエンザAウイルスがヒトに感染し、より早期には香港および中国でトリH5N1およびH9N2ウイルスがヒトに感染したという知見から、これらの（および他の）サブタイプが大流行を引き起こす潜在能力を有するという懸念が生じている。このため、トリインフルエンザAウイルスによるヒト感染を妨げるためのワクチンが必要とされている。ヒトインフルエンザウイルスに対する弱毒化生インフルエンザAウイルスワクチンが、最近、米国で認可された。上記参照のこと。そのワクチンは、再集合H1N1およびH3N2ウイルスであり、該ウイルスでは、A/Ann Arbor (AA)/6/60（H2N2）低温適応（ca）ウイルスの内部タンパク質遺伝子が、その再集合ウイルス（すなわち非Ann Arbor株由来の赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ遺伝子を有するもの）に対しAA caウイルスの低温適応、弱毒化および温度感受性表現型を付与している。従来の遺伝子再集合技術およびプラスミドベースの逆遺伝学技術は、トリインフルエンザAウイルス（H4-H14サブタイプ）由来の赤血球凝集素遺伝子およびノイラミニダーゼ遺伝子、ならびにAA caウイルス由来の6つの内部遺伝子セグメントを含有する再集合ウイルスを作製するために適用されてきた。そのような再集合ウイルスは本発明の特徴である。下記HAおよびNA遺伝子配列を参照のこと。これらのウイルスは、ワクチン候補にとって望ましい生物学的特性を保持する。その理由は、AA caウイルスに関連している表現型が再集合ウイルス中に存在するからである。ワクチン用の種ウイルスとしてのこれらの再集合ウイルスの作製および評価は大流行への備えにおける重要なステップである。臨床試験によって、そのような弱毒化汎発性生ワクチンの安全性、感染性および免疫原性を確立できることが意図される。本発明の他の実施形態には、プラスミドレスキュー再集合（例えばA/Ann Arbor 6/60（すなわちA/AA/6/60）、PR8等との再集合）によって構築される汎発流行病ワクチンを製造するための、本明細書中に列挙されるものに加えて、例えばトリ、ブタ等の汎発性ウイルス株由来の汎発性抗原遺伝子HAおよび／またはNAを含む再集合ウイルス（例えばワクチンにおいて使用されるもの）が含まれる。そのようなウイルスおよびワクチンの構築および使用の方法もまた含まれる。本明細書中で使用される「汎発性ウイルス株」とは、ヒト集団において循環していない、米国疾病対策センター（Centers for Disease Control）または世界保健機関によって汎発性株であると宣言されているかまたは科学界でそのようなものとして一般に認められているインフルエンザ株Aウイルスサブタイプとして定義される。

本明細書中の種々の実施形態では、抗原性配列（例えばHA配列）ならびにウイルスおよびそのようなウイルスから得られるワクチンは、改変された多塩基性切断部位を含む。いくつかの高病原性のトリ汎発性インフルエンザ株は赤血球凝集素配列内に複数の塩基性アミノ酸切断部位を含む。例えば、Li et al., J. of Infectious Diseases, 179:1132-8, 1999を参照のこと。本発明の典型的な実施形態では、そのような切断部位は、例えば、本配列が由来する野生型配列と比較して、その配列中では（例えば、その位置での切断を不可能にするか、またはその切断を低減するように等）改変または変更されている。そのような改変／変更は、野生型配列中の切断部位の種々の配列のせいで、異なる株において異なるものであってよい。例えば、成熟H5の326〜329位の4個の多塩基性残基（RRKK）は、典型的には、本明細書中の配列において除去されている（wtと比較して）。「配列」欄を参照のこと。種々の実施形態では、多塩基性切断部位は様々な様式で改変されうる（そのすべてが本発明の範囲内に含まれる）。例えば、多塩基性切断部位を1アミノ酸ずつ除去することができる（例えば、1個のRを除去するか、2個のRを除去するか、RRKを除去するか、またはRRKKを除去する）。さらに、切断部位のすぐ上流のアミノ酸残基を除去または変更（例えばRからTへの変更等）することもでき；また、切断部位の直後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチドを改変することもできる。例えば、切断部位の改変の説明に関しては図１を参照のこと。さらに、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素ポリペプチド配列はアミノ末端シグナルペプチド配列を含み、そのため、本発明の赤血球凝集素ポリペプチド配列には、赤血球凝集素ポリペプチドの成熟形態（アミノ末端シグナルペプチドが切断されている）と赤血球凝集素の切断前形態の両者が含まれる。任意のインフルエンザ株の任意の赤血球凝集素ポリペプチド配列の切断部位は、当技術分野の各種方法を使用して常套的に評価または予測することができる。

場合により本発明の配列を組み込んだウイルス（典型的にはワクチンとして使用されるか、またはワクチン製造用のもの）に適用される用語「温度感受性」、「低温適応」および「弱毒化」は、当技術分野において周知である。例えば、用語「温度感受性」（ts）とは、例えば、インフルエンザA株のウイルスが、33℃と比較して39℃で100倍以上の力価の減少を示すこと、またはインフルエンザB株のウイルスが、33℃と比較して37℃で100倍以上の力価の減少を示すことを示す。用語「低温適応」（ca）とは、ウイルスが、33℃でのその増殖の100倍以内の増殖を25℃で示すことを示し、用語「弱毒化」（att）とは、ウイルスがフェレットの上気道において複製するが、その肺組織では検出不能であり、かつ該動物においてインフルエンザ様疾病を引き起こさないことを示す。中間表現型を有するウイルス、すなわち39℃（A株ウイルスの場合）または37℃（B株ウイルスの場合）で100倍より少ない力価減少しか示さないか、または33℃でのその増殖と比べて100倍を超える（例えば200倍以内、500倍以内、1000倍以内、10,000倍未満の）増殖を25℃で示し、かつ／またはフェレットの上気道での増殖と比較して肺において低減した増殖を示す（すなわち部分的に弱毒化されている）かおよび／または該動物において低減したインフルエンザ様疾病を示すウイルスはまた、有用なウイルスであり、本明細書中のHAおよびNA配列と組み合わせて使用できることが理解されよう。

同様に、本発明のHAおよびNA配列は、場合により、再集合ワクチンの製造においてまたは該ワクチン中で（および／または他のts、cs、ca、および／またはattウイルスおよびワクチン中で）利用される。しかし、本発明のHAおよびNA配列等は、特定のワクチン組成物または製造方法に限定されず、すなわちそれらを、株特異的HAおよびNA抗原（例えば、配列番号１１〜２０、２７〜３２、または３９〜４４のいずれか、または特定のHAおよびNA抗原をコードする対応するヌクレオチド、例えば配列番号１〜１０、２１〜２６、３３〜３８、または４５）を利用する実質的に任意のワクチンタイプまたはワクチン製造方法において利用できることに留意すべきであろう。

FluMist ^TM
前述の通り、多数の例およびタイプのインフルエンザワクチンが存在する。典型的なインフルエンザワクチンはFluMist^TMである。FluMist^TMは、小児および成人をインフルエンザ疾病に対して防御する弱毒化生ワクチンである（Belshe et al. (1998) The efficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virus vaccine in children N Engl J Med 338:1405-12; Nichol et al. (1999) Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, working adults: a randomized controlled trial JAMA 282:137-44）。典型的で好ましい実施形態では、本発明の方法および組成物を、好ましくは、FluMist^TMワクチンの製造に適合させ／その製造とともに使用する。しかし、本明細書中の配列、方法、組成物等はまた、類似のウイルスワクチンの製造または異なるウイルスワクチンの製造にさえ適合させうることは当業者に理解されよう。

FluMist^TMワクチン株は、例えば、共通のマスタードナーウイルス（MDV）由来の6つの遺伝子セグメントであるPB1、PB2、PA、NP、MおよびNSとともに、該ワクチンの対象とする株（例えば野生型株）由来のHAおよびNA遺伝子セグメントを含有する。すなわち、本明細書中のHA配列は種々のFluMist^TM製剤の一部である。インフルエンザA株のFluMist^TM用のMDV（MDV-A）は、ニワトリ腎臓組織初代培養において連続的に低下させた温度で野生型A/Ann Arbor/6/60（A/AA/6/60）株を連続継代することによって作製された（Maassab (1967) Adaptation and growth characteristics of influenza virus at 25 degrees C Nature 213:612-4）。MDV-Aは25℃で効率良く複製する（ca、低温適応）が、その増殖は38℃および39℃では制限される（ts、温度感受性）。さらに、このウイルスは感染フェレットの肺では複製しない（att、弱毒化）。ts表現型は、気道のうち最も低い温度の領域を除くすべての領域でその複製を制限することによって、ヒトにおける該ワクチンの弱毒化に貢献すると考えられる。この特性の安定性は動物モデルおよび臨床研究で実証されている。化学的突然変異誘発によって作製されたインフルエンザ株のts表現型と対照的に、MDV-Aのts特性は、感染ハムスターを経由する継代後に、または小児からの排出単離体（shed isolates）において復帰しない（最近のレビューに関しては、Murphy & Coelingh (2002) Principles underlying the development and use of live attenuated cold-adapted influenza A and B virus vaccines Viral Immunol 15:295-323を参照のこと）。

12種の別々の6:2再集合株を有する20,000人を超える成人および小児での臨床研究では、これらのワクチンが弱毒化されており、安全で、有効であることが示されている（Belshe et al. (1998) The efficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virus vaccine in children N Engl J Med 338:1405-12; Boyce et al. (2000) Safety and immunogenicity of adjuvanted and unadjuvanted subunit influenza vaccines administered intranasally to healthy adults Vaccine 19:217-26; Edwards et al. (1994) A randomized controlled trial of cold adapted and inactivated vaccines for the prevention of influenza A disease J Infect Dis 169:68-76; Nichol et al. (1999) Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, working adults: a randomized controlled trial JAMA 282:137-44）。MDV-Aの6つの内部遺伝子および野生型ウイルスの2つのHAおよびNA遺伝子セグメントを保持する再集合体（すなわち6:2再集合体）は、一貫して、ca、tsおよびatt表現型を維持する（Maassab et al. (1982) Evaluation of a cold-recombinant influenza virus vaccine in ferrets J. Infect. Dis. 146:780-900）。

B株のインフルエンザを使用するそのような再集合ウイルスの製造はより困難であるが、最近の仕事（例えばMulti-Plasmid System for the Production of Influenza Virus、2002年10月23日出願の米国出願第60/420,708号、2003年4月25日出願の米国出願第10/423,828号、および2004年5月24日出願の米国出願第60/574,117号を参照のこと）により、クローニングされたcDNAからの完全なインフルエンザBウイルスの作製のための8プラスミド系が示されている。ワクチン製剤、例えば鼻腔内投与に有用な生ウイルスワクチン製剤、に好適な弱毒化生インフルエンザAおよびBウイルスの製造方法もまた示された。

前記の系および方法は、組換えおよび再集合インフルエンザAおよびBウイルスの細胞培養における迅速な製造に有用であり、それらウイルスとしては、鼻腔内投与に好適なワクチン等の弱毒化生ワクチンを始めとするワクチンとしての使用に好適なウイルスが含まれる。本発明の配列（例えば、配列番号１〜１０、２１〜２６、３３〜３８、または４５のヌクレオチド配列および、該ヌクレオチド配列によってコードされる、配列番号１１〜２０、２７〜３２、または３９〜４４の、対応するアミノ酸）、方法等は、場合により、ワクチン用のウイルスを製造するために、例えばワクチン製造用の再集合インフルエンザウイルスを用いるそのような以前の仕事により、またはそれと組み合わせて使用される。

ワクチンの予防的投与のための方法および組成物
上述のように、FluMist^TMワクチンの製造における使用に代えて、またはそれに加えて、本発明を他のワクチン製剤に使用することができる。一般に、本発明の組換えおよび再集合ウイルス（例えば、配列番号１〜１０、２１、２３〜２６、３３〜３８、または４５のポリヌクレオチドまたは配列番号１１〜２０、２７〜３２、または３９〜４４のポリペプチド、またはその断片を含むもの）を、免疫学的有効量で、かつ適切な担体または賦形剤中に含めて、予防的に投与することにより、HAおよび／またはNA配列によって決定される1種以上のインフルエンザウイルス株に特異的な免疫応答を刺激することができる。典型的には、担体または賦形剤は、製薬的に許容される担体または賦形剤、例えば滅菌水、水性生理食塩水、水性緩衝化生理食塩水、ブドウ糖水溶液、グリセロール水溶液、エタノール、またはそれらの組み合わせである。滅菌性、pH、等張性、および安定性を保証するそのような溶液の調製は、当技術分野において確立されているプロトコルにしたがって達成される。一般に、担体または賦形剤は、アレルギーおよび他の望ましくない影響を最小にし、かつ特定の投与経路、例えば皮下、筋肉内、鼻腔内等に好適であるよう選択される。

本発明の関連態様では、個体の免疫系を刺激して、インフルエンザウイルスに対する防御免疫応答を生じさせる方法が提供される。該方法では、免疫学的有効量の組換えインフルエンザウイルス（例えば本発明のHAおよび／またはNA分子を含むもの）、免疫学的有効量の本発明のポリペプチド、および／または免疫学的有効量の本発明の核酸を生理学的に許容される担体中で個体に投与する。

一般に、本発明のインフルエンザウイルスは、1種以上のインフルエンザウイルス株に特異的な（すなわち本発明のHAおよび／またはNA株に対する）免疫応答を刺激するために十分な量で投与される。好ましくは、インフルエンザウイルスの投与はそのような株に対する防御免疫応答を誘発する。1種以上のインフルエンザ株に対する防御免疫応答を誘発するための用量および方法は当業者に公知である。例えばUSPN 5,922,326; Wright et al., Infect. Immun. 37:397-400 (1982); Kim et al., Pediatrics 52:56-63 (1973); およびWright et al., J. Pediatr. 88:931-936 (1976)を参照のこと。例えば、インフルエンザウイルスは約1〜1000 HID₅₀（ヒト感染用量）、すなわち約10⁵〜10⁸ pfu（プラーク形成単位）／各投与用量の範囲で提供される。典型的には、該用量は、この範囲内で、例えば年齢、健康状態、体重、性別、食事、投与時、および他の臨床要因に基づいて調節される。予防的なワクチン製剤は、例えば、針およびシリンジ、または針なし注射装置を使用する皮下または筋肉内注射によって、全身投与される。あるいは、ワクチン製剤は、液滴、大粒子エアロゾル（約10ミクロンより大きい）、または上気道内へのスプレーによって、鼻腔内投与される。いずれの上記送達経路も全身防御免疫応答を生じさせるが、鼻腔内投与は、インフルエンザウイルスの侵入部位で粘膜免疫を誘発する追加の利点をもたらす。鼻腔内投与では、弱毒化生ウイルスワクチンが好ましいことが多く、例えば弱毒化、低温適応および／または温度感受性組換えまたは再集合インフルエンザウイルスである。上記参照のこと。単回投与での防御免疫応答の刺激が好ましいが、同じ経路または異なる経路によって追加の用量を投与して所望の予防効果を達成してもよい。

典型的には、ワクチンに使用される本発明の弱毒化組換えインフルエンザは、該弱毒化インフルエンザウイルスで免疫された（か、または他の様式で感染させた）大部分の個体で感染症状または少なくとも重篤感染の症状が生じないように、十分に弱毒化されている。一部の場合には、弱毒化インフルエンザウイルスは、依然として、軽度の疾病（例えば軽度の上気道疾病）の症状をもたらすことができ、および／またはワクチン接種されていない個体へ伝播可能でありうる。しかし、その病原性は、ワクチン接種されたかまたは偶発的な宿主において重篤な下気道感染が生じないように十分に抑制されている。

あるいは、本明細書中の配列を含むインフルエンザウイルスを用いて樹状細胞をex vivoまたはin vivoでターゲティングすることによって、免疫応答を刺激することができる。例えば、樹状細胞によるインフルエンザ抗原の捕捉を可能にするために十分な量かつ十分な期間で、増殖中の樹状細胞をウイルスに曝露する。そして標準静脈内移植法によって、ワクチン接種すべき被験体に該細胞を導入する。

単回投与での防御免疫応答の刺激は好ましいが、同じ経路または異なる経路によって追加の用量を投与して所望の予防効果を達成することができる。新生児および乳児では、例えば、十分なレベルの免疫を誘発するために複数回投与が必要とされうる。野生型インフルエンザ感染に対する十分な防御レベルを維持するため必要に応じて小児期を通じて周期的に投与を継続することができる。同様に、反復的なまたは重篤なインフルエンザ感染に特に罹りやすい成人、例えば保健医療従事者、デイケア従事者、幼児の家族、高齢者、および心肺機能低下を有する個体は、防御免疫応答を確立および／または維持するために複数回の免疫化を必要としうる。免疫の誘発レベルは、例えば中和分泌および血清抗体の量を測定することによって、モニターすることができ、また所望の防御レベルを誘発および維持するために必要に応じて用量を調節したりまたはワクチン接種を反復したりしてもよい。

場合により、インフルエンザウイルスの予防的投与のための製剤はまた、インフルエンザ抗原に対する免疫応答を増強するための1種以上のアジュバントを含有する。好適なアジュバントには：完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、サポニン、ミネラルゲル（mineral gels）、例えば水酸化アルミニウム、界面活性剤、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール（pluronic polyols）、ポリアニオン、ペプチド、油または炭化水素エマルジョン、カルメット・ゲラン桿菌（bacille Calmette-Guerin）（BCG）、コリネバクテリウム・パルヴム（Corynebacterium parvum）、および合成アジュバントQS-21が含まれる。

所望であれば、インフルエンザウイルスの予防的ワクチン投与を1種以上の免疫賦活分子の投与と組み合わせて実施することができる。免疫賦活分子には、免疫賦活、免疫増強、および炎症誘発活性を有する種々のサイトカイン、リンホカインおよびケモカイン、例えばインターロイキン（例えば、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13）；成長因子（例えば、顆粒球-マクロファージ(GM)-コロニー刺激因子（CSF））；および他の免疫賦活分子、例えばマクロファージ炎症性因子、Flt3リガンド、B7.1；B7.2等が含まれる。免疫賦活分子はインフルエンザウイルスと同じ製剤中に含めて投与してよいが、別途投与してもよい。タンパク質（例えば本発明のHAおよび／またはNAポリペプチド、例えば配列番号１１〜２０、２７〜３２、または３９〜４４のいずれか）、または該タンパク質をコードする核酸（例えば配列番号１〜１０、２１〜２６、３３〜３８、または４５のいずれか）を含む発現ベクターを投与して、免疫賦活効果を得ることができる。

上記方法は、治療的または予防的に有効なHAおよび／またはNAポリペプチド（またはペプチド）またはHAおよび／またはNA RNA（例えばアンチセンスRNAまたはリボザイム）をコードする異種ポリヌクレオチドを含む本発明のベクターをin vitro、ex vivoまたはin vivoで標的細胞集団に導入することによって、疾患または障害、典型的にはインフルエンザを治療的および／または予防的に処置するために有用である。典型的には、目的のポリペプチド（またはペプチド）、またはRNA、をコードするポリヌクレオチドは、「発現ベクター」および「追加の発現エレメント」と題されるセクションにおいて上述した適切な調節配列に作動可能に連結される。場合により、2種以上の異種コード配列を単一ベクターまたはウイルスに組み込む。例えば、治療的または予防的に活性なHAおよび／またはNAポリペプチドまたはRNAをコードするポリヌクレオチドに加えて、ベクターには、追加の治療的または予防的ポリペプチド、例えば抗原、共刺激分子、サイトカイン、抗体等、および／またはマーカー等を含ませることもできる。

特定サブグループの特定株の弱毒化インフルエンザウイルスで個体にワクチン接種することで、異なる株および／またはサブグループのインフルエンザウイルスに対する交差防御を誘発できるが、所望であれば、少なくとも2つの株（例えばそれぞれ異なるサブグループのもの）由来の弱毒化インフルエンザウイルスで個体にワクチン接種することによって交差防御を増強することができる。さらに、ワクチンの組み合わせには、場合により、汎発流行病ワクチン（例えば、汎発性インフルエンザ株、例えば種々のトリ株（例えば本明細書中の配列を参照のこと）または他の汎発性株、に対するワクチン）と非汎発性株の混合物を包含しうる。ワクチン混合物（または複数回ワクチン接種）はヒト株および／または非ヒトインフルエンザ株（例えばトリとヒト等）由来の成分を含みうる。同様に、本発明の弱毒化インフルエンザウイルスワクチンは、場合により、他の感染物質に対する防御免疫応答を誘発するワクチンと組み合わせることができる。

本発明のポリヌクレオチド
インフルエンザウイルスのHAおよびNAポリヌクレオチドセグメントは（ORFをコードする）コード領域と、HAおよびNAコード配列の5'および3'の両方の非翻訳領域（NCR）とを両方含むことが当技術分野において周知である。これらのNCRの例は配列番号１〜９に示される（ORFの外側）。また、インフルエンザウイルスのHAおよびNAセグメント全体の増幅を容易にするためにこれらのNCRに対してプライマーを作製できることが知られている。（例えばHoffmann et al. Arch Virol. 2001 Dec;146(12):2275-89を参照のこと）。さらに、インフルエンザのHAおよびNAのNCRは再集合体の達成効率を高めることが知られている。したがって、これらのNCRのポリヌクレオチド配列（その断片および変異体（例えば、少なくとも約60％、または少なくとも70％、または少なくとも80％、または少なくとも90％、または少なくとも約91％または少なくとも約92％、または少なくとも約93％、または少なくとも約94％、または少なくとも約95％、または少なくとも約96％、または少なくとも約97％、または少なくとも約98％、または少なくとも約98.5％、または少なくとも約98.7％、または少なくとも約99％、または少なくとも約99.1％、または少なくとも約99.2％、または少なくとも約99.3％、または少なくとも約99.4％、または少なくとも約99.5％、または少なくとも約99.6％または少なくとも約99.7％、または少なくとも約99.8％、または少なくとも約99.9％の同一性）が含まれる）は本発明の範囲内である。任意の汎発性株のHAおよびNAセグメントを増幅する場合、HAおよびNA NCRの保存されている（例えば近縁株間で）領域に結合するポリヌクレオチドプライマーを作製し、増幅（例えばRT-PCRによる）に使用することができる。一実施形態では、本発明のHAおよびNAポリヌクレオチドには、汎発性ウイルス株のHAおよびNA配列（その断片および変異体（例えば、少なくとも約60％、または少なくとも70％、または少なくとも80％、または少なくとも90％、または少なくとも約91％または少なくとも約92％、または少なくとも約93％、または少なくとも約94％、または少なくとも約95％、または少なくとも約96％、または少なくとも約97％、または少なくとも約98％、または少なくとも約98.5％、または少なくとも約98.7％、または少なくとも約99％、または少なくとも約99.1％、または少なくとも約99.2％、または少なくとも約99.3％、または少なくとも約99.4％、または少なくとも約99.5％、または少なくとも約99.6％または少なくとも約99.7％、または少なくとも約99.8％、または少なくとも約99.9％）が含まれる）のNCRおよびORFの両者が含まれる。代替の実施形態では、本発明のHAおよびNAポリヌクレオチドからは、汎発性ウイルス株のHAおよびNA配列（例えば配列番号１〜９）のNCRは除外されるが、ORF（断片および変異体（例えば、その少なくとも約60％、または少なくとも70％、または少なくとも80％、または少なくとも90％、または少なくとも約91％または少なくとも約92％、または少なくとも約93％、または少なくとも約94％、または少なくとも約95％、または少なくとも約96％、または少なくとも約97％、または少なくとも約98％、または少なくとも約98.5％、または少なくとも約98.7％、または少なくとも約99％、または少なくとも約99.1％、または少なくとも約99.2％、または少なくとも約99.3％、または少なくとも約99.4％、または少なくとも約99.5％、または少なくとも約99.6％または少なくとも約99.7％、または少なくとも約99.8％、または少なくとも約99.9％）が含まれる）は含まれる。

本発明のHAおよびNAポリヌクレオチド、例えば配列番号１〜配列番号１０、配列番号２１〜配列番号２６、配列番号３３〜配列番号３８、配列番号４５、およびその断片、は、場合により、上記ワクチンの代わりに、またはそれに加えて、いくつかの異なる可能性で使用される。他の典型的な用途は、説明のために本明細書中に記載されるものであり、実際の用途範囲に関する限定としてではない。本発明のヌクレオチド配列を構築、精製、および特徴付けする異なる方法もまた、本明細書中に記載される。ある実施形態では、1種以上の本発明のポリヌクレオチド配列を含む核酸は、例えば他の種に感染するかまたは別のインフルエンザ大発生に認められる同種インフルエンザ変異体（例えば本明細書中の配列の相同体、等）を見出し、かつ／または特徴付けるための核酸ハイブリダイゼーション実験における等の種々の状況で、対応するまたは関連する核酸を検出するためのプローブとして好都合に使用される。該プローブはDNAまたはRNA分子、例えばゲノムまたはクローン化DNAの制限酵素断片、cDNA、PCR増幅産物、転写産物、およびオリゴヌクレオチドであってよく、約10ヌクレオチド長ほどの短いオリゴヌクレオチドから1 kbを超える全長配列またはcDNAまで、長さは様々であってよい。例えば、ある実施形態では、本発明のプローブには、例えば配列番号１〜配列番号１０、配列番号２１〜配列番号２６、配列番号３３〜配列番号３８、配列番号４５、またはそれらに相補的な配列のうちから選択される、ポリヌクレオチド配列または部分配列が含まれる。あるいは、上記で指定される配列の1つの変異体であるポリヌクレオチド配列をプローブとして使用する。最も典型的には、そのような変異体には、1または2〜3個の保存的ヌクレオチド変異が含まれる。例えば、2つ（またはそれ以上の）ポリヌクレオチド配列が互いの保存的変異体であり、一のポリヌクレオチド配列が第一の変異体に完全に対応し、またはかつ、他の配列（群）が追加の変異体に完全に対応するような、オリゴヌクレオチドのペア（またはセット）を選択することができる。そのようなオリゴヌクレオチドプローブのペアは、例えば、多型ヌクレオチドを検出するための、または、例えば、他の種に感染するか、もしくは異なる（例えば時間的および／または地理的に異なる）インフルエンザの大発生において存在する、例えば本HAおよびNA配列に相同な、同種インフルエンザHAおよびNA変異体を検出するための、特異的ハイブリダイゼーション実験に特に有用である。他の適用では、より多岐にわたるプローブが選択され、すなわち、少なくとも約91％（または約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約98.5％、約98.7％、約99％、約99.1％、約99.2％、約99.3％、約99.4％、約99.5％、または約99.6％またはそれ以上約99.7％、約99.8％、約99.9％またはそれ以上）同一であるプローブが選択される。

例えば本明細書中の配列由来の配列によって例示される、本発明のプローブを使用して、当技術分野においてごく普通の手順にしたがって追加の有用なポリヌクレオチド配列を特定することもできる。1セットの実施形態では、1種以上の上記プローブを利用して、例えば本明細書中の配列の1種以上のプローブと同一の、またはそれと有意な配列類似性を有する配列、すなわち変異体、相同体等を含むクローンを同定するために発現産物または染色体セグメントのライブラリー（例えば発現ライブラリーまたはゲノムライブラリー）をスクリーニングする。ライブラリースクリーニング等の物理的方法に加えて、さらに、コンピュータ支援バイオインフォマティクスアプローチ、例えばBLASTおよび他の配列ホモロジーサーチアルゴリズム等、を使用して関連ポリヌクレオチド配列を同定できることも理解される。このようにして同定されるポリヌクレオチド配列もまた、本発明の特徴である。

オリゴヌクレオチドプローブは、場合により、当業者に周知の種々の方法によって製造される。最も典型的には、周知の合成方法、例えばBeaucage and Caruthers (1981) Tetrahedron Letts 22(20):1859-1862に記載の固相ホスホルアミダイトトリエステル法によって、例えば自動合成機を使用して、またはNeedham-Van Devanter et al. (1984) Nucl Acids Res, 12:6159-6168に記載のように、該プローブを製造する。オリゴヌクレオチドはカスタムメイドで製造してもよく、当業者に公知の種々の市販供給元にオーダーしてもよい。必要であれば、オリゴヌクレオチドの精製を、典型的に、未変性アクリルアミドゲル電気泳動またはアニオン交換HPLCによって、Pearson and Regnier (1983) J Chrom 255:137-149に記載のように実施する。合成オリゴヌクレオチドの配列は、Maxam and Gilbert (1980) in Grossman and Moldave (eds.) Academic Press, New York, Methods in Enzymology 65:499-560の化学分解法を使用して確認することができる。簡単には、カスタムオリゴを当業者に公知の種々の市販供給元にオーダーしてもよい。

例えば本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを発現する細胞または生物（例えば本発明の配列を含むウイルスを担持するもの）の特性に関連するような他の状況では、ポリペプチド、ペプチドまたは抗体であるプローブが好都合に利用される。例えば、本発明のアミノ酸配列（例えば配列番号１１〜２０、配列番号２７〜３２、配列番号３９〜４４）のいずれか由来のもの、および／または、例えば配列番号１〜配列番号１０、配列番号２１〜配列番号２６、配列番号３３〜配列番号３８、および配列番号４５から選択される、本発明のポリヌクレオチド配列によってコードされるものである、単離または組換えポリペプチド、ポリペプチド断片およびペプチドを好都合に使用して、例えばファージディスプレイライブラリー、コンビナトリアルライブラリー、ポリクローナル血清等から抗体を同定および単離する。本発明のポリペプチド断片には、本発明のHAまたはNAポリペプチドのアミノ酸配列（例えば配列番号１１〜２０、配列番号２７〜３２、および配列番号３９〜４４）のアミノ酸配列の少なくとも5個連続したアミノ酸残基、または少なくとも10個連続したアミノ酸残基、または少なくとも15個連続したアミノ酸残基、または少なくとも20個連続したアミノ酸残基、または少なくとも25個連続したアミノ酸残基、または少なくとも40個連続したアミノ酸残基、または少なくとも50個連続したアミノ酸残基、または少なくとも60個連続したアミノ残基、または少なくとも70個連続したアミノ酸残基、または少なくとも連続した80個のアミノ酸残基、または少なくとも連続した90個のアミノ酸残基、または少なくとも連続した100個のアミノ酸残基、または少なくとも連続した125個のアミノ酸残基、または少なくとも150個連続したアミノ酸残基、または少なくとも連続した175個のアミノ酸残基、または少なくとも連続した200個のアミノ酸残基、または少なくとも連続した250個のアミノ酸残基、または少なくとも連続した350個、または少なくとも連続した400個、または少なくとも連続した450個、または少なくとも連続した500個、または少なくとも連続した550個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドが含まれる。該ポリペプチド断片および該ポリペプチドに特異的に結合する抗体をコードするポリヌクレオチドもまた、本発明の好ましい実施形態である。

任意のポリヌクレオチド配列または部分配列、例えば配列番号１１〜配列番号２０、配列番号２７〜配列番号３２、および／または配列番号３９〜配列番号４４のもの、および／または、例えば配列番号１〜配列番号１０、配列番号２１〜配列番号２６、配列番号３３〜配列番号３８、および配列番号４５から選択される、本発明のポリヌクレオチド配列によってコードされるもの、に対して特異的な抗体は、発現産物（例えば細胞または組織由来の）を評価するためのプローブとして同様に有用である。さらに、抗体は、in situで、組織アレイにおいて、細胞、組織または生物（例えば未同定のインフルエンザウイルスが感染した生物）等においてアミノ酸部分配列を含むタンパク質の発現を評価するために特に好適であり、そのような部分配列としては例えば、本明細書中に記載の配列、または、例えば本明細書中で示される配列から選択されるものである、本発明のポリヌクレオチド配列によってコードされるものが挙げられる。抗体は、検出可能な試薬で直接標識してもよく、特異的抗体の重鎖定常領域に特異的な二次抗体（すなわちアイソタイプ）を標識することによって間接的に検出してもよい。特異的抗体の製造に関する追加の詳細を下に提供する。

診断アッセイ
本発明の核酸配列は、例えば本明細書中の配列から選択される、化学合成されたかまたは組換えポリヌクレオチド断片を使用して、サンプル中のインフルエンザ（および／または赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ）を検出し、赤血球凝集素様配列および／またはノイラミニダーゼ様配列を検出し、インフルエンザの臨床分離株の株の差異を検出するために、診断アッセイにおいて使用することができる。例えば、少なくとも10〜20個の範囲のヌクレオチドを含む赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ配列の断片を、当技術分野において周知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法（例えば逆転写PCR）を使用して核酸を増幅するためのプライマーとして、および臨床検体中の標的遺伝物質、例えばインフルエンザRNAを検出するための核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブとして、使用することができる。

例えば本明細書中に記載のものから選択されるユニーク部分配列によって例示される、本発明のプローブは、当技術分野においてごく普通の手順にしたがって、追加の有用な（例えば追加のインフルエンザ株を特徴付けるために）ポリヌクレオチド配列を同定するために使用することもできる。1セットの好ましい実施形態では、1種以上の上記プローブを利用して発現産物またはクローン化ウイルス核酸のライブラリー（例えば発現ライブラリーまたはゲノムライブラリー）をスクリーニングし、本明細書中の配列と同一の、またはそれとかなりの配列同一性を有する配列を含むクローンを同定する。続いて、これらの同定配列の各々を使用してプローブを作製することができ、該プローブには、上記変異体プローブのペアまたはセットが含まれる。ライブラリースクリーニング等の物理的方法に加えて、関連ポリヌクレオチド配列を同定するために、さらに、コンピュータ支援バイオインフォマティクスアプローチ、例えばBLASTおよび他の配列ホモロジーサーチアルゴリズム等も使用できることは理解されよう。

本発明のプローブは、細胞、組織または他の生物学的サンプル（例えば鼻腔洗浄液または気管支洗浄液）中のインフルエンザ核酸の存在を検出するため、およびその正体を決定するために特に有用である。例えば、本発明のプローブを好都合に利用して、生物学的サンプル、例えば被験体（例えばヒト被験体）またはモデル系（例えば培養細胞サンプル）がインフルエンザ、または特定株（群）のインフルエンザに暴露されたかどうかまたはそれらに感染したかどうかを決定する。生物学的サンプルまたはモデル系に由来する（例えば、それらから単離された）核酸に、選択したプローブがハイブリダイズすることが検出されれば、該プローブポリヌクレオチドを選択した元のウイルス（または関連ウイルス）への曝露またはそれらの感染が示唆される。

プローブ設計は目的とする適用によって影響されることが理解される。例えば、単一アッセイにおいて、例えば単一DNAチップ上で、複数のアレル特異的プローブ-標的相互作用を検出することが意図される場合、該プローブのすべてに関して類似の融解温度を有することが望ましい。したがって、プローブの長さは、該アレイ上のプローブのすべてに関する融解温度が非常に類似するように調節される（異なるプローブが異なるGC含量を有する場合、特定のT_mを達成するために該異なるプローブに関して異なる長さが必要とされることが理解される）。融解温度がプローブ設計において主として考慮されるものであるが、場合により、他の要因を使用してプローブ構築をさらに調節する。例えばプライマーの自己相補性等に逆らうように選択される。

ベクター、プロモーターおよび発現系
本発明には、本明細書中に記載の1種以上の核酸配列を組み込んだ組換え構築物が含まれる。そのような構築物には、場合により、ベクター、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、細菌人工染色体（BAC）、酵母人工染色体（YAC）等が含まれ、該ベクターには、例えば配列番号１〜配列番号１０、配列番号２１〜配列番号２６、配列番号３３〜配列番号３８、配列番号４５のいずれかまたはその部分配列等を含む、1種以上の本発明のポリヌクレオチド配列がその中にフォワードまたはリバース方向で挿入されている。例えば、挿入核酸には、本発明のポリヌクレオチド配列の少なくとも1つの全体または部分を含むウイルス染色体配列またはcDNAが含まれうる。一実施形態では、該構築物は、さらに、該配列に作動可能に連結されている調節配列、例えばプロモーターを含む。多数の好適なベクターおよびプロモーターが当業者に公知であり、市販されている。

本発明のポリヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスRNA、および場合により、ポリペプチド（またはペプチド）発現産物（例えば本発明の赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ分子、またはその断片）を作製するために好適な種々のベクターのいずれか1つに含ませることができる。そのようなベクターには、染色体、非染色体および合成DNA配列、例えばSV40の誘導体；細菌プラスミド；ファージDNA；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージDNAの組み合わせから得られるベクター、ウイルスDNA、例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスおよび多数の他のベクター（例えばpCDL）が含まれる。遺伝物質を細胞に導入可能で、かつ、複製が所望であれば、該当する宿主中で複製可能な任意のベクターを使用することができる。

発現ベクター中で、目的のHAおよび／またはNAポリヌクレオチド配列は、mRNA合成を誘導するために適切な転写調節配列（例えばプロモーター、および場合により、1種以上のエンハンサー）に近接し、かつその方向で物理的に配置される。すなわち、目的のポリヌクレオチド配列は適切な転写調節配列に作動可能に連結される。そのようなプロモーターの例には：LTRまたはSV40プロモーター、大腸菌（E. coli）lacまたはtrpプロモーター、ファージラムダP_Lプロモーター、および原核細胞もしくは真核細胞またはそれらのウイルスにおいて遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターが含まれる。

種々のプロモーターが、インフルエンザウイルスゲノムセグメントの転写を調節するための発現ベクターでの使用に好適である。特定の実施形態では、サイトメガロウイルス（CMV）DNA依存性RNAポリメラーゼII（Pol II）プロモーターが利用される。所望であれば、例えば条件付き発現を調節するために、特定条件下でまたは特定組織もしくは細胞中でRNAの転写を誘導する他のプロモーターを代りに使用することができる。多数のウイルスプロモーターおよび哺乳類、例えばヒトプロモーターが利用可能であり、または意図される具体的適用にしたがって単離することができる。例えば、動物およびヒトウイルスのゲノムから得られる代替プロモーターには、アデノウイルス（例えばアデノウイルス2）、パピローマウイルス、B型肝炎ウイルス、ポリオーマウイルス、およびシミアンウイルス40（SV40）、および種々のレトロウイルスのプロモーター等のプロモーターが含まれる。哺乳類プロモーターには、とりわけ、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーター等が含まれる。

場合により、エンハンサー配列を含ませることによって転写を増強する。典型的にエンハンサーは短い（例えば10〜500 bpの）シス作用性DNAエレメントであり、プロモーターと協力して作用して転写を高める。多数のエンハンサー配列が、哺乳類遺伝子（ヘモグロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ-フェトプロテイン、およびインスリン）、および真核細胞ウイルスから単離されている。エンハンサーは、ベクター中の異種コード配列の5'または3'の位置にスプライスされうるが、典型的には、プロモーターの5'側の部位に挿入される。典型的に、プロモーターおよび所望であれば追加の転写増強配列は、異種DNAが導入される宿主細胞種中での発現を最適化するように選択される（Scharf et al. (1994) Heat stress promoters and transcription factors Results Probl Cell Differ 20:125-62; Kriegler et al. (1990) Assembly of enhancers, promoters, and splice signals to control expression of transferred genes Methods in Enzymol 185: 512-27）。場合により、アンプリコンに、翻訳開始のためのリボソーム結合部位または内部リボソーム侵入部位（IRES）を含ませることもできる。

本発明のベクターはまた、好都合には、転写の終結およびmRNAの安定化のために必要な配列、例えばポリアデニル化部位またはターミネーター配列を含む。そのような配列は、一般に、真核生物またはウイルスDNAまたはcDNAの5'および、時には3'の、非翻訳領域から入手可能である。一実施形態では、SV40ポリアデニル化シグナル配列は、（-）鎖ウイルスゲノムの複製を開始するPolIプロモーターから（+）鎖mRNA分子の転写を隔離する両方向性ポリアデニル化部位を、提供することができる。

さらに、上記のように、発現ベクターには、場合により、以前に列挙された遺伝子に加えて、形質転換宿主細胞の選択のための表現型特性を提供する1種以上の選択マーカー遺伝子が含まれ、真核細胞培養中での選択にはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性等のマーカーが好適である。

上記の適切な核酸配列、ならびに適切なプロモーターまたは調節配列、を含有するベクターを用いて、該タンパク質の発現を可能にする宿主細胞を形質転換することができる。本発明のベクターは細菌細胞中で複製できるが、最も頻繁には、発現目的では、それらを哺乳類細胞、例えばVero細胞、BHK細胞、MDCK細胞、293細胞、COS細胞等に導入することが望ましい。

他の箇所で記載のように、本明細書中のHAおよびNA配列は、種々の実施形態において、プラスミドレスキュー再集合に関与するプラスミド内に含ませることができる。例えば2002年10月23日出願の米国出願第60/420,708号；2004年5月24日出願の第60/574,117号；2003年4月25日出願の第10/423,828号；2004年6月12日出願の第60/578,962号；および2004年6月16日出願の第10/870,690号；およびUS20020164770（参照によりここに組み入れられる）を参照のこと。例えば、本発明の好ましい発現ベクターには、非限定的に、pol Iプロモーターおよびターミネーター配列を含むベクターまたはpol Iおよびpol IIプロモーターの両方を使用するベクター「polI／polIIプロモーター系」が含まれる（例えば、Zobel et al., Nucl. Acids Res. 1993, 21:3607; US20020164770; Neumann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:9345; Fodor et al., J. Virol. 1999, 73:9679; およびUS20030035814）。得られる再集合体には、A/Ann Arbor/6/60ドナー株（および／またはその誘導体および改変体）、PR8ドナー株バックボーン、A/Leningrad/17ドナー株バックボーン等由来の他の6つのインフルエンザ遺伝子とともに配置されたHAおよびNA遺伝子が含まれうる。他のバックボーン株は、例えば20040137013および20030147916（参照によりここに組み入れられる）に記載されている。

追加の発現エレメント
最も一般には、インフルエンザウイルスHAおよび／またはNAタンパク質をコードするゲノムセグメントは、その発現（機能的ウイルスタンパク質への翻訳を含む）に必要な任意の追加の配列を含む。他の状況では、ウイルスタンパク質、例えばHAおよび／またはNAタンパク質をコードするミニ遺伝子、または他の人工構築物を用いることができる。やはり、そのような場合、異種コード配列の効率的翻訳に役立つ特定の開始シグナルを含ませることが望ましいことが多い。これらのシグナルには、例えばATG開始コドンおよび隣接配列が含まれうる。挿入物全体の翻訳を保証するために、該ウイルスタンパク質に関して正しい読み枠で開始コドンが挿入される。外来性転写エレメントおよび開始コドンは、天然および合成の両者の種々の起源であってよい。発現効率は、使用される細胞系に適切なエンハンサーを含ませることによって高めることができる。

所望であれば、追加の発現エレメント、例えばシグナル配列、分泌または局在化配列等をコードするポリヌクレオチド配列を、通常は目的のポリヌクレオチド配列とインフレームで、ベクター中に組み入れて、例えばポリペプチド発現を所望の細胞区画、膜、または細胞小器官に向けるか、またはペリプラズム間隙への、もしくは細胞培養培地中へのポリペプチド分泌を誘導することができる。そのような配列は当業者に公知であり、それには、分泌リーダーペプチド、細胞小器官ターゲティング配列（例えば核局在化配列、ER保持シグナル、ミトコンドリア輸送配列）、膜局在化／アンカー配列（例えば輸送停止（stop transfer）配列、GPIアンカー配列）等が含まれる。

本発明の核酸配列によってコードされるポリペプチドの翻訳が望ましい場合、追加の翻訳特異的開始シグナルが翻訳効率を改善しうる。これらのシグナルには、例えばATG開始コドンおよび隣接配列、IRES領域等が含まれうる。ある場合には例えば、例えば本発明のポリヌクレオチド配列（例えば本明細書中の配列のような）を組み込んでいるコード配列、翻訳開始コドンおよび関連配列エレメントを含む全長cDNA分子または染色体セグメントでは、目的のポリヌクレオチド配列と同時に適切な発現ベクターに挿入する。そのような場合、追加の翻訳調節シグナルが必要とされないことが多い。しかし、ポリペプチドコード配列、またはその部分のみが挿入される場合には、該当する配列の発現のために、例えばATG開始コドンを含む、外来性翻訳調節シグナルが用いられることが多い。目的のポリヌクレオチド配列の転写を保証するために、開始コドンは正しい読み枠で配置される。外来性転写エレメントおよび開始コドンは、天然および合成の両方の種々の起源のものであってよい。使用される細胞系に適切なエンハンサーを含ませることによって発現効率を高めることができる（例えばScharf D. et al. (1994) Results Probl Cell Differ 20:125-62; Bittner et al. (1987) Methods in Enzymol 153:516-544を参照のこと）。

組換えウイルスの製造
ネガティブ鎖RNAウイルスを遺伝子改変し、組換え逆遺伝学アプローチを使用して回収することができる（例えばPalese et al.に付与されたUSPN 5,166,057を参照のこと）。そのような方法は、元々、インフルエンザウイルスゲノムを操作するために適用され（Luytjes et al. (1989) Cell 59:1107-1113; Enami et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11563-11567）、多種多様なセグメント化および非セグメント化ネガティブ鎖RNAウイルス、例えば狂犬病ウイルス（Schnell et al. (1994) EMBO J. 13: 4195-4203）；VSV（Lawson et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481）；麻疹ウイルス（Radecke et al.(1995) EMBO J. 14:5773-5784）；牛疫ウイルス（Baron & Barrett (1997) J. Virol. 71: 1265-1271）；ヒトパラインフルエンザウイルス（Hoffman & Banerjee (1997) J. Virol. 71: 3272-3277; Dubin et al. (1997) Virology 235:323-332）；SV5（He et al. (1997) Virology 237:249-260）；イヌジステンパーウイルス（Gassen et al. (2000) J. Virol. 74:10737-44）；およびセンダイウイルス（Park et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5537-5541; Kato et al. (1996) Genes to Cells 1:569-579）にうまく適用された。当業者は、本発明のHAおよびNA配列を含むインフルエンザウイルスを製造するための前記技術および類似の技術を熟知する。本発明の1種以上の核酸および／またはポリペプチドを含む組換えインフルエンザウイルスのように、そのような方法にしたがって製造される組換えインフルエンザウイルスもまた、本特徴の特徴である。

細胞培養および発現宿主
本発明はまた、本発明のベクターを導入（形質導入、形質転換またはトランスフェクト）される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの製造に関する。宿主細胞を本発明のベクター、例えば発現ベクター、で遺伝子改変（すなわち形質導入、形質転換またはトランスフェクト）する。上記のように、該ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形式であってよい。適切な発現宿主の例には：細菌細胞、例えば大腸菌（E. coli）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、およびサルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）；真菌細胞、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、およびニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）；または昆虫細胞、例えばショウジョウバエ（Drosophila）およびスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）が含まれる。

最も一般には、哺乳類細胞を使用して本発明のHAおよびNA分子を培養する。インフルエンザウイルスの複製に好適な宿主細胞には、例えばVero細胞、BHK細胞、MDCK細胞、293細胞およびCOS細胞、例えば293T細胞、COS7細胞等が含まれる。一般に、上記セルラインのうちの2つ、例えばMDCK細胞と293TまたはCOS細胞のいずれかとを含む共培養を例えば1:1の比で用いて、複製効率を改善する。典型的には、標準市販培養培地、例えば血清（例えば10％ウシ胎児血清）を補充したダルベッコ改変イーグル培地中、または無血清培地中で、中性緩衝化pH（例えば7.0〜7.2の範囲のpHで）の維持に好適な制御湿度およびCO₂濃度条件下で、細胞を培養する。場合により、該培地は、細菌の生育を妨げるための抗生物質、例えばペニシリン、ストレプトマイシン等、および／または追加の栄養分、例えばL-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、好都合な生育特性を促すための追加の補充物質、例えばトリプシン、β-メルカプトエタノール等を含有する。

操作された宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択、または挿入ポリヌクレオチド配列の増幅に適切であるように改変された慣用の栄養培地で培養することができる。培養条件、例えば温度、pH等は、典型的に、発現に関して選択される特定の宿主細胞とともに以前に使用された条件であり、当業者に、かつ本明細書中で引用される参考文献、例えばFreshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 3^rd edition, Wiley- Liss, New Yorkおよび該文献で引用される参考文献において、自明である。他の有用な参考文献には、例えばPaul (1975) Cell and Tissue Culture, 5^th ed., Livingston, Edinburgh; Adams (1980) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Cell Culture for Biochemists, Work and Burdon (eds.) Elsevier, Amsterdamが含まれる。in vitroでのインフルエンザウイルスの製造に関する特に興味深い組織培養手順に関する追加の詳細には、例えばMerten et al. (1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation. in Cohen and Shafferman (eds.) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines（すべての目的でその全体がここに組み入れられる）が含まれる。さらに、本発明に適合させた、そのような手順のバリエーションは常套的な実験によって容易に決定することができ、当業者によく知られている。

（例えば本発明のHAおよび／またはNA配列を有する）インフルエンザウイルスの製造用の細胞は、血清添加培地または無血清培地で培養することができる。ある場合には、例えば精製ウイルスの製造では、無血清条件で宿主細胞を培養することが典型的に望ましい。小規模な、例えば25 ml未満の培地、培養試験管またはフラスコ中で、または攪拌しながら大きいフラスコ中で、回転ボトル中で、またはフラスコ、ボトルもしくは反応器培養中のマイクロキャリアビーズ（例えばDEAE-デキストランマイクロキャリアビーズ、例えばDormacell, Pfeifer & Langen; Superbead, Flow Laboratories; スチレンコポリマー-トリ-メチルアミンビーズ, 例えばHillex, SoloHill, Ann Arbor）上で、細胞を培養することができる。マイクロキャリアビーズは、細胞培養の容量あたり接着細胞培養のための広い表面積を提供する小球（直径100〜200ミクロンの範囲）である。例えば、1リットルの培地に、2000万個を超えるマイクロキャリアビーズを含ませることができ、8000平方センチメートルを超える培養表面を提供する。商業的なウイルス製造、例えばワクチン製造では、バイオリアクターまたは発酵槽で細胞を培養することが望ましいことが多い。バイオリアクターは1リットル未満〜100リットル超の容量において利用可能であり、例えばCyto3 Bioreactor（Osmonics, Minnetonka, MN）；NBS bioreactor（New Brunswick Scientific, Edison, NJ）；B. Braun Biotech International（B. Braun Biotech, Melsungen, Germany）製の実験室および商業規模のバイオリアクターがある。

培養容量にかかわらず、本発明の多数の所望の態様では、温度依存性マルチプラスミド系（例えばMulti-Plasmid System for the Production of Influenza Virus、2002年10月23日出願の米国出願第60/420,708号、2003年4月25日出願の米国出願第10/423,828号、および2004年5月24日出願の米国出願第60/574,117号）、ろ過のためのウイルス溶液の加熱、等を使用する組換えおよび／または再集合インフルエンザウイルスの効率的回収を保証するために、培養を適切な温度で維持することが重要である。典型的には、制御装置、例えばサーモスタット、または細胞培養系および／または他の溶液の温度を感知かつ維持するための他の装置、を用いて、適切な時期（例えばウイルス複製等の）において温度が正しいレベルにあることを保証する。

本明細書中のある実施形態（例えばベクター上のセグメントから再集合ウイルスを製造しようとする実施形態）では、異種核酸を真核細胞に導入するための当技術分野において周知の方法、例えばリン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、およびポリアミントランスフェクション試薬を用いるトランスフェクション、にしたがって、インフルエンザゲノムセグメントを含むベクターを宿主細胞に導入（例えばトランスフェクト）する。例えば、再集合ウイルスを製造する等のために、ポリアミントランスフェクション試薬TransIT-LT1（Mirus）を製造元の使用説明書にしたがって使用して、ベクター、例えばプラスミド、を宿主細胞、例えばCOS 細胞、293T細胞、またはCOSもしくは293T細胞とMDCK細胞との組み合わせにトランスフェクトしてもよい。すなわち、一例では、160μl培地、好ましくは無血清培地で希釈された約2μlのTransIT-LT1を用いて、200μlの総量として、約1μgの各ベクターを宿主細胞集団に導入する。DNA：トランスフェクション試薬混合物を室温で45分間インキュベートした後、800μlの培地を加える。トランスフェクション混合物を宿主細胞に加え、当業者に周知の他の方法によって上記のように細胞を培養する。したがって、細胞培養における組換えまたは再集合ウイルスの製造には、8つのゲノムセグメント（例えば本発明の、PB2、PB1、PA、NP、M、NS、HAおよびNA）の各々を組み込んだベクターを約20μl TransIT-LT1と混合し、宿主細胞にトランスフェクトする。場合により、トランスフェクション前に血清添加培地を無血清培地、例えばOpti-MEM Iで置換し、4〜6時間インキュベートする。

あるいは、エレクトロポレーションを用いて、インフルエンザゲノムセグメントを組み込んだそのようなベクターを宿主細胞に導入することができる。例えば、以下の手順にしたがってエレクトロポレーションを使用して、インフルエンザAまたはインフルエンザBウイルスを組み込んだプラスミドベクターをVero細胞に好都合に導入する。簡単には、例えば10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したイーグル改変培地（MEM）中で培養された、約5 x 10⁶ Vero細胞を0.4 ml OptiMEMに再懸濁し、エレクトロポレーションキュベットに入れる。25μlまでの容量の20マイクログラムのDNAをキュベット中の細胞に加えた後、それをタッピングして穏やかに混合する。エレクトロポレーションは、製造元の使用説明書（例えばCapacitance Extender Plusが連結されているBioRad Gene Pulser II）にしたがって、300ボルト、950マイクロファラドで28〜33 msecの範囲の時定数で実施する。穏やかにタッピングすることによって細胞を再混合し、エレクトロポレーションの約1〜2分後に10％FBSを含む0.7 ml MEMをキュベットに直接加える。次いで、2 ml MEM、10％FBSを含有する標準6ウェル組織培養皿の2つのウェルに細胞を移す。キュベットを洗浄してすべての残留細胞を回収し、洗浄懸濁液を2つのウェル間に分割する。最終容量は約3.5 mLである。次いでウイルスの増殖を可能にする条件下、例えば低温適応株では約33℃で、細胞をインキュベートする。

哺乳類宿主細胞では、様々な発現系、例えばウイルスベースの系、を利用することができる。発現ベクターとしてアデノウイルスが使用される場合、場合により、後期プロモーターおよび3部分からなる（tripartite）リーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体にコード配列をライゲートする。ウイルスゲノムの非必須E1またはE3領域内への挿入によって、感染宿主細胞中で目的のポリペプチドを発現可能な生存ウイルスが得られる（Logan and Shenk (1984) Proc Natl Acad Sci 81:3655-3659）。さらに、転写エンハンサー、例えばラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサー、を使用して哺乳類宿主細胞での発現を高めることができる。

宿主細胞株は、場合により、所望の様式で挿入配列の発現をモジュレートするその能力または発現タンパク質をプロセシングするその能力に関して、選択される。そのようなタンパク質修飾には、非限定的に、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（lipidation）およびアシル化が含まれる。タンパク質の前駆形態を成熟形態へと切断する翻訳後プロセシングは、正しい挿入、フォールディングおよび／または機能にしばしば重要である。さらに、宿主細胞内の適正な位置（例えば細胞表面）もまた重要である。様々な宿主細胞、例えばCOS、CHO、BHK、MDCK、293、293T、COS7等が、特異的な細胞機構および、そのような翻訳後活性に関する特徴的な機構を有しており、それらを、導入された外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを保証するように選択することができる。

本発明のポリヌクレオチドによってコードされるか、またはそれによってコードされる部分配列を有する、組換えタンパク質の長期間の高収量の製造のために、場合により、安定な発現系を使用する。例えば、ウイルスの複製起点または内因性発現エレメントおよび選択マーカー遺伝子を含有する発現ベクターを使用して、本発明のポリペプチドを安定に発現するセルラインをトランスフェクトする。例えば、ベクターの導入後、富化培地中で1〜2日間、細胞を増殖させ、その後、それらを選択培地に交換する。選択マーカーの目的は選択に対する耐性を付与することであり、その存在は、導入配列をうまく発現する細胞の生育および回収を可能にする。ゆえに、例えば単一細胞タイプ由来の、安定に形質転換された細胞の耐性凝集塊を、該細胞タイプに適切な組織培養技術を使用して増殖させることができる。

本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、場合により、細胞培養物からのコードタンパク質の発現および回収に好適な条件下で培養される。該タンパク質を発現している細胞を選別、単離および／または精製することができる。組換え細胞によって生産されるタンパク質またはその断片は、使用される配列および／またはベクターに応じて（例えば、膜保持シグナル等をコードする融合タンパク質に依存して）、分泌型、膜結合型であってよく、または細胞内に保持されうる。

本発明の核酸に対応する発現産物は、非動物細胞、例えば植物、酵母、真菌、細菌等で製造することもできる。Sambrook, BergerおよびAusubel（すべて下記）に加えて、細胞培養に関する詳細は、Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) およびAtlas and Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FLに見出すことができる。

細菌系では、発現産物に関して意図される用途に応じて、いくつかの発現ベクターを選択することができる。例えば、大量のポリペプチドまたはその断片が抗体の製造に必要である場合、容易に精製できる融合タンパク質の高レベル発現を導くベクターが好都合に用いられる。そのようなベクターには、非限定的に、多機能性大腸菌（E. coli）クローニングおよび発現ベクター、例えばBLUESCRIPT（Stratagene）（目的のコード配列、例えば本明細書中で見出されるものを含む配列等を、アミノ末端翻訳開始メチオニンおよびその後のベータ-ガラクトシダーゼの7残基の配列とインフレームでベクター内にライゲートして、触媒活性ベータガラクトシダーゼ融合タンパク質を生産することができる）；pINベクター（Van Heeke & Schuster (1989) J Biol Chem 264:5503-5509）；pETベクター（Novagen, Madison WI）；等が含まれる。同様に、酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）では、アルファ因子、アルコールオキシダーゼおよびPGHのような構成的または誘導性プロモーターを含有する様々なベクターを使用して、所望の発現産物を製造することができる。レビューに関しては、Ausubel, 下記, およびGrant et al., (1987); Methods in Enzymology 153:516-544を参照のこと。

核酸ハイブリダイゼーション
比較ハイブリダイゼーションを使用して、本発明の核酸の保存的変異体を包含する、本発明の核酸（例えば、配列番号１〜１０、配列番号２１〜２６、配列番号３３〜３８、配列番号４５）を同定することができる。この比較ハイブリダイゼーション法は本発明の核酸を識別する好ましい方法である。さらに、例えば本明細書中で示される核酸によって代表される核酸に、高ストリンジェンシー、超高ストリンジェンシーおよび超超高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする標的核酸は本発明の特徴である。そのような核酸の例には、所定の核酸配列と比較して1または2〜3個のサイレントまたは保存的核酸置換を有する核酸が含まれる。

試験標的核酸は、プローブ核酸と、完全一致した相補標的に対して該プローブがハイブリダイズする程度の少なくとも2分の1の程度でハイブリダイズする場合には、該プローブ核酸に特異的にハイブリダイズすると言える。すなわち、完全一致プローブは、任意の不一致標的核酸へのハイブリダイゼーションに関して観察されるシグナル対ノイズ比よりも少なくとも約5倍〜10倍高いシグナル対ノイズ比で完全一致相補標的に結合する条件下で、該プローブと標的のハイブリダイゼーションの少なくとも2分の1の強度のシグナル対ノイズ比を有する。

核酸は、それらが、典型的には溶液中で、会合すると、「ハイブリダイズ」することになる。核酸は、種々の十分に特徴付けられている物理化学力、例えば水素結合、溶媒排除、塩基スタッキング等によりハイブリダイズする。核酸ハイブリダイゼーションに関する多数のプロトコルが当技術分野において周知である。核酸ハイブリダイゼーションの広範囲な指針は、Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," (Elsevier, New York), ならびにAusubel, Sambrook, およびBerger and Kimmel（すべて下記）に見出せる。Hames and Higgins (1995) Gene Probes 1 IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England, (Hames and Higgins 1) およびHames and Higgins (1995) Gene Probes 2 IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England (Hames and Higgins 2)は、オリゴヌクレオチドを含めたDNAおよびRNAの合成、標識、検出および定量に関する詳細を提供する。

サザンまたはノーザンブロットにおける、フィルター上の100個を超える相補残基を有する相補核酸のハイブリダイゼーションに関するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、1 mgのヘパリンを伴う50％ホルマリンで42℃でハイブリダイゼーションを一晩行うものである。ストリンジェントな洗浄条件の例は、65℃で15分間の0.2x SSC洗浄を含む（SSCバッファーおよび他の核酸ハイブリダイゼーションパラメータの説明に関しては、Sambrook（下記）を参照のこと）。高ストリンジェンシー洗浄の前に、バックグラウンドのプローブシグナルを除去するための低ストリンジェンシー洗浄を行うことが多い。低ストリンジェンシー洗浄の例は40℃で15分間の2x SSCである。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて、シグナル対ノイズ比が、無関係のプローブに関して観察されるシグナル対ノイズ比より5倍（またはそれ以上）であれば、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示す。

ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしていない核酸を一連の洗浄によって除去することができ、所望の結果に応じて該洗浄のストリンジェンシーを調節することができる。低ストリンジェンシー洗浄条件（例えば高い塩濃度および低い温度を使用する）は感度を高めるが、非特異的ハイブリダイゼーションシグナルおよび高いバックグラウンドシグナルを生じさせうる。高ストリンジェンシー条件（例えば低い塩濃度および、T_mに近い高い温度を使用する）はバックグラウンドシグナルを低下させ、典型的には、主に特異的シグナルが残る。また、Rapley, R. and Walker, J.M. eds., Molecular Biomethods Handbook (Humana Press, Inc. 1998)を参照のこと。

核酸ハイブリダイゼーション実験、例えばサザンおよびノーザンハイブリダイゼーションの関連での「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存的であり、異なる環境パラメータ下で異なる。核酸ハイブリダイゼーションの広範な指針は、Tijssen (1993), 上記およびHames and Higgins, 1 and 2に見出せる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、任意の試験核酸に関して経験的に、容易に決定することができる。例えば、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の決定では、選択した基準セットが満たされるまで、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を次第に高める（例えば、ハイブリダイゼーションまたは洗浄において、温度を上げ、塩濃度を下げ、界面活性剤濃度を上げ、かつ／または有機溶媒、例えばホルマリンの濃度を上げることによって）。例えば、プローブが、不一致標的に対する該プローブのハイブリダイゼーションに関して観察されるシグナル対ノイズ比より少なくとも5倍高いシグナル対ノイズ比で完全一致相補標的に結合するまで、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を次第に高める。

一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて、シグナル対ノイズ比が、無関係のプローブに関して観察されるシグナル対ノイズ比より少なくとも2倍（またはそれ以上、例えば少なくとも5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、またはそれ以上）であれば、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示す。本発明の関連で、2つの配列間で少なくともストリンジェントなハイブリダイゼーションが検出されれば、例えば本願の配列表に提供される本発明の核酸に対する、比較的強い構造類似性が示される。

「非常にストリンジェントな」条件は、特定のプローブに関する熱融点（T_m）に等しいように選択される。T_mは、（規定したイオン強度およびpH条件下で）試験配列の50％が完全一致プローブにハイブリダイズする温度である。本発明の目的では、概して、「高度にストリンジェントな」ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、規定したイオン強度およびpHで特定配列に対してT_mより約5℃低くなるように選択される（下で述べるように、高度にストリンジェントな条件は比較語としても言及されうる）。目的のヌクレオチド配列（例えば「プローブ」）に密接に関連するか、または同一である標的配列は、ストリンジェントまたは高度にストリンジェントな条件下で同定することができる。低ストリンジェンシー条件は相補性が低い配列に適切である。

「超高ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件とは、完全一致相補標的核酸に対するプローブの結合に関するシグナル対ノイズ比が、任意の不一致標的核酸に対するハイブリダイゼーションに関して観察されるシグナル対ノイズ比より少なくとも10倍高くなるまで、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件のストリンジェンシーが高められた条件である。そのような条件下でプローブにハイブリダイズし、シグナル対ノイズ比が完全一致相補標的核酸のシグナル対ノイズ比の少なくとも2分の1である、標的核酸は、超高ストリンジェンシー条件下で該プローブに結合すると考えられる。

ストリンジェントまたは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション（またはさらによりストリンジェントなハイブリダイゼーション）および洗浄条件の決定では、選択した基準セットが満たされるまで、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を次第に高める（例えば、ハイブリダイゼーションまたは洗浄において、温度を上げ、塩濃度を下げ、界面活性剤濃度を上げ、かつ／または有機溶媒、例えばホルムアミドの濃度を上げることによって）。例えば、1種以上の本発明のポリヌクレオチド配列、例えば本明細書中に記載のもの（例えば、配列番号１〜１０、２１〜２６、３３〜３８、配列番号４５）および／または相補ポリヌクレオチド配列から選択される配列またはユニーク部分配列、を含むプローブが、所望のように、不一致標的（例えば、出願時に公的データベース、例えばGenBankに存在する既知のインフルエンザ配列、および／またはその相補ポリヌクレオチド配列から選択される1種以上の配列または部分配列を含むポリヌクレオチド配列）に対する該プローブのハイブリダイゼーションに関して観察されるシグナル対ノイズ比より少なくとも2倍（および場合により5倍、10倍、または100倍またはそれ以上）高いシグナル対ノイズ比で、完全一致相補標的（同様に、本明細書中に記載のものおよび／またはその相補ポリヌクレオチド配列から選択される1種以上の核酸配列または部分配列を含む核酸）に結合するまで、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を次第に高める。

本発明のポリヌクレオチド、またはその部分配列、を使用して、新規標的核酸を得ることができる；そのような標的核酸もまた、本発明の特徴である。例えば、そのような標的核酸には、本発明のポリヌクレオチド（例えば、配列番号１〜１０、２１〜２６、３３〜３８、４５）のいずれかに対応するユニークオリゴヌクレオチドプローブに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列が含まれる。

同様に、さらに高レベルのストリンジェンシーは、該当するハイブリダイゼーションアッセイのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を次第に高めることによって決定することができる。例えば、完全一致相補標的核酸に対する該プローブの結合に関するシグナル対ノイズ比が、任意の不一致標的核酸に対するハイブリダイゼーションに関して観察されるシグナル対ノイズ比より少なくとも10倍、20倍、50倍、100倍、または500倍またはそれ以上高くなるまで、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件のストリンジェンシーを高めた条件である。特定のシグナルは、該当するアッセイにおいて使用される標識、例えば蛍光標識、比色標識、放射性標識等に依存する。そのような条件下でプローブにハイブリダイズし、シグナル対ノイズ比が、完全一致相補標的核酸のシグナル対ノイズ比の少なくとも2分の1である、標的核酸は、超超高ストリンジェンシー条件下で該プローブに結合すると考えられ、それもまた本発明の特徴である。

ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸であっても、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であれば、依然として実質的に同一である。このことは、例えば遺伝暗号によって許容される最大コドン縮重を使用して核酸のコピーが作製された場合に生じる。

目的の生体分子のクローニング、突然変異誘発および発現
本発明に適用可能な分子生物学的技術、例えばクローニング、突然変異、細胞培養等を説明する一般的な教科書には、Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2000 ("Sambrook") およびCurrent Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 2002) ("Ausubel")が含まれる。これらの教科書は、突然変異誘発、ベクターの使用、プロモーターおよび、例えばHAおよび／またはNA分子の作製に関連する、多数の他の該当するトピック等を説明する。

場合により、種々のタイプの突然変異誘発を本発明において使用して、例えば新規または新たに単離されたHAおよび／またはNA分子を例えば製造および／または単離し、かつ／または本発明のポリペプチド（例えば、配列番号１１〜２０または２７〜３２または３９〜４４にあるようなHAおよびNA分子）をさらに改変し／突然変異させる。それらには、非限定的に、部位特異的、ランダム点突然変異誘発、相同組換え（DNAシャフリング）、ウラシル含有鋳型を使用する突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、ホスホロチオアート修飾DNA突然変異誘発、ギャップ二重らせんDNAを使用する突然変異誘発等が含まれる。追加の好適な方法には、ポイントミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使用する突然変異誘発、制限選択および制限精製、欠失突然変異誘発、全遺伝子合成による突然変異誘発、二本鎖切断修復等が含まれる。例えばキメラ構築物を用いる、突然変異誘発もまた、本発明に含まれる。一実施形態では、突然変異誘発は、天然に存在する分子または改変型もしくは突然変異型の天然に存在する分子についての既知の情報、例えば配列、配列比較、物性、結晶構造等を指針とすることができる。

上記教科書および本明細書中で見出される実施例、ならびに以下の刊行物（および該刊行物で引用される参考文献）は、前記手法を説明する：Sieber, et al., Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001); Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem 254(2): 157-178 (1997); Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol Biol 57:369-374 (1996); I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res 23, 3067-8 (1995); W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994); Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4:450-455 (1993); Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242:240-245 (1988); Fritz et al., Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl Acids Res 16: 6987-6999 (1988); Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl Acids Res 16: 7207 (1988); Sakamar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl Acids Res 14: 6361-6372 (1988); Sayers et al., Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl Acids Res 16:791-802 (1988); Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl Acids Res 16: 803-814; Carter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol 154: 382-403 (1987); Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol 154:350-367 (1987); Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D.M.J. eds., Springer Verlag, Berlin)) (1987); Kunkel et al., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol 154, 367-382 (1987); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol 154:329-350 (1987); Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem J 237:1-7 (1986); Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl Acids Res 14: 5115 (1986); Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc Natl Acad Sci USA, 83:7177-7181 (1986); Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl Acids Res 14: 9679-9698 (1986); Wells et al., Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil Trans R Soc Lond A 317: 415-423 (1986); Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1193-1201(1985); Carter et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl Acids Res 13: 4431-4443 (1985); Grundstroem et al., Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis, Nucl Acids Res 13: 3305-3316 (1985); Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc Natl Acad Sci USA 82:488-492 (1985); Smith, In vitro mutagenesis, Ann Rev Genet 19:423-462(1985); Taylor et al., The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl Acids Res 13: 8749-8764 (1985); Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl Acids Res 13: 8765-8787 (1985); Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985); Kramer et al., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl Acids Res 12: 9441-9456 (1984); Kramer et al., Point Mismatch Repair, Cell 38:879-887 (1984); Nambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol 100:468-500 (1983); およびZoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucl Acids Res 10:6487-6500 (1982)。多数の上記方法に関する追加の詳細はMethods in Enzymol Volume 154に見出せる。該刊行物はまた、種々の突然変異誘発、遺伝子単離、発現、および他の方法に伴う問題のトラブルシューティングに有用な制御を記載している。

例えば本発明の突然変異誘発、例えば本発明のHAおよび／またはNA分子のライブラリーの突然変異、またはその改変において使用するためのオリゴヌクレオチドは、典型的に、Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letts 22(20):1859-1862, (1981)に記載の固相ホスホルアミダイトトリエステル法にしたがって、例えば自動合成機を使用して、Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res, 12:6159-6168 (1984)に記載のように、化学合成される。

さらに、本質的にいかなる核酸も、種々の市販供給元、例えばThe Midland Certified Reagent Company (mcrc@oligos.com), The Great American Gene Company (www.genco.com), ExpressGen Inc. (www.expressgen.com), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) および多数の他の供給元のいずれかにカスタムまたはスタンダードオーダーすることができる。同様に、ペプチドおよび抗体を、種々の供給元、例えばPeptidoGenic (pkim@ccnet.comで利用可能), HTI Bio-products, Inc. (www.htibio.com), BMA Biomedicals Ltd. (U.K.), Bio.Synthesis, Inc., および多数の他の供給元のいずれかにカスタムオーダーすることができる。

本発明はまた、本発明のHAおよび／またはNA分子または他のポリペプチドおよび／または核酸、例えば配列番号１〜４５、を含む宿主細胞および生物に関する。宿主細胞は、本発明のベクターで遺伝子改変（例えば、形質転換、形質導入またはトランスフェクト）され、該ベクターは、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであってよい。該ベクターは、例えば、プラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド、またはコンジュゲートポリヌクレオチドの形式であってよい。該ベクターは標準的方法によって細胞および／または微生物に導入され、該方法には、エレクトロポレーション（From et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 5824 (1985)を参照のこと）、ウイルスベクターによる感染、小ビーズもしくは粒子のマトリックス内、またはその表面に核酸を伴う小粒子による高速弾丸導入（ballistic penetration）（Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987)）が含まれる。Berger、Sambrook、およびAusubelは種々の適切な形質転換法を提供する。上記参照のこと。

標的核酸を細菌細胞に導入するいくつかの周知の方法が利用可能であり、そのいずれかを本発明において使用することができる。これらには：レシピエント細胞と、該DNAを含有する細菌プロトプラストの融合、エレクトロポレーション、粒子衝突（projectile bombardment）、およびウイルスベクターでの感染、等が含まれる。細菌細胞を使用して、本発明のDNA構築物を含有するプラスミドの数を増幅することができる。該細菌を対数期まで培養し、当技術分野において公知の種々の方法によって細菌内のプラスミドを単離することができる（例えばSambrookを参照のこと）。さらに、細菌からプラスミドを精製するための多数のキットが市販されている（例えばEasyPrep^TM、FlexiPrep^TM（ともにPharmacia Biotech）；StrataClean^TM（Stratagene）；およびQIAprep^TM（Qiagen）を参照のこと）。次いで単離および精製済みプラスミドをさらに操作して他のプラスミドを製造し、それを使用して細胞をトランスフェクトするか、または関連ベクターに組み込んで生物を感染させる。典型的ベクターは、転写および翻訳ターミネーター、転写および翻訳開始配列、および特定の標的核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含有する。該ベクターは、場合により、少なくとも1つの独立のターミネーター配列を含有する汎用発現カセット、真核生物、もしくは原核生物、または両者での該カセットの複製を可能にする配列（例えばシャトルベクター）および原核生物および真核生物系の両者に関する選択マーカーを含む。ベクターは、原核生物、真核生物、または場合により両者における複製および組込みに好適である。Giliman & Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts, et al., Nature, 328:731 (1987); Schneider, B., et al., Protein Expr Purif 6435:10 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger (すべて上記)を参照のこと。クローニングに有用な細菌およびバクテリオファージの目録は例えばATCCによって提供されている。例えばATCCによって刊行されたThe ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage (1992) Gherna et al. (eds.)である。シークエンシング、クローニングおよび、分子生物学の他の態様に関する追加の基本手順および基礎をなす理論的考察もまた、Watson et al. (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NYに見出せる。上記参照のこと。本明細書中の配列とともに有用な追加のベクターは、上記のワクチン用インフルエンザウイルスの製造に関するセクションおよびそこで引用される参考文献において説明されている。

ポリペプチド製造および回収
好適な宿主セルラインまたは株に形質導入し、かつ宿主細胞を適切な細胞密度まで培養した後、適切な手段（例えば温度シフトまたは化学誘導）によって選択プロモーターを誘導し、追加の期間、細胞を培養する。ある実施形態では、その後、分泌ポリペプチド産物、例えば分泌融合タンパク質の形式のHAおよび／またはNAポリペプチド等を培養培地から回収する。他の実施形態では、本発明のHAおよび／またはNAポリペプチドを含有するウイルス粒子を細胞から生じさせる。あるいは、細胞を遠心分離によって回収し、物理的または化学的手段によって破壊し、得られた粗製抽出物を後の精製のために保持することができる。タンパク質の発現に用いられる真核細胞または微生物細胞は、任意の好都合な方法によって破壊することができ、該方法には、凍結解凍サイクル処理、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用、または当業者に周知の他の方法が含まれる。さらに、本発明のHAおよび／またはNAポリペプチド産物を発現する細胞を、該ポリペプチドを細胞から分離することなく利用することができる。そのような状況では、本発明のポリペプチドを場合により細胞表面で発現させ、（例えば細胞表面のHAおよび／またはNA分子（またはその断片、例えば融合タンパク質等を含む）を抗体に結合させる、等によって）検査する。そのような細胞もまた、本発明の特徴である。

発現ポリペプチドは、当技術分野において周知のいくつかの方法のいずれかによって組換え細胞培養から回収および精製することができ、該方法には、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（例えば当業者に公知の任意のタギング系を使用して）、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが含まれる。成熟タンパク質の立体配置を完成させるために、タンパク質のリフォールディングステップを所望のように使用することができる。また、最終精製ステップで高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いることができる。本明細書中に記載の参考文献に加えて、種々の精製方法が当技術分野において周知であり、該方法には、例えばSandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; およびBollag et al. (1996) Protein Methods, 2^nd Edition Wiley-Liss, NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Harris and Angal Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3^rd Edition Springer Verlag, NY; Janson and Ryden (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY; およびWalker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJに記載の方法が含まれる。

本発明の発現ポリペプチドをウイルスにおいて製造する場合、典型的に、感染（トランスフェクト）細胞が培養された培養培地から該ウイルスを回収する。典型的に、インフルエンザウイルスを濃縮する前に粗製培地を精製する。一般的方法には、限外ろ過、硫酸バリウムでの吸着および溶出、および遠心分離が含まれる。例えば、まず、感染培養由来の粗製培地を、例えば1000〜2000 x gで、細胞片および他の大きい粒状物質を除去するために十分な、例えば10〜30分の範囲の時間、遠心分離することによって精製することができる。場合により、その後、精製済み培地上清を、例えば15,000 x gで約3〜5時間、遠心分離して、インフルエンザウイルスをペレットにする。ウイルスペレットを適切なバッファー、例えばSTE（0.01 M Tris-HCl; 0.15 M NaCl; 0.0001 M EDTA）またはリン酸緩衝食塩水（PBS）pH 7.4に再懸濁した後、ショ糖（60％〜12％）または酒石酸カリウム（50％〜10％）での密度勾配遠心分離によってウイルスを濃縮する。連続勾配またはステップ勾配、例えば4 x 12％ステップの12％〜60％の範囲のショ糖勾配、が好適である。回収のためウイルスを可視バンドに濃縮させるのに十分な速度および時間で、該勾配を遠心分離する。あるいは、およびほとんどの大規模商業的適用では、連続的様式で作動するゾーン遠心ローターを使用して密度勾配からウイルスを洗浄排出する。組織培養からのインフルエンザウイルスの調製を通じて当業者に指針を与えるために十分な追加の詳細は、例えばFurminger. Vaccine Production, in Nicholson et al. (eds.) Textbook of Influenza pp. 324-332; Merten et al. (1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation, in Cohen & Shafferman (eds.) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines pp. 141-151, および米国特許第5,690,937号に提供される。所望であれば、安定剤であるショ糖-リン酸-グルタミン酸（SPG）の存在下で-80℃で、回収されたウイルスを保存することができる。

あるいは、無細胞転写／翻訳系を用いて、例えば本明細書中に記載の配列、例えば配列番号１１〜２０または２７〜３２または３９〜４４の、または本発明のポリヌクレオチド配列、例えば配列番号１〜１０または２１〜２６または３３〜３８または４５、によってコードされる、アミノ酸配列または部分配列を含むポリペプチドを製造することができる。いくつかの好適なin vitro転写および翻訳系が市販されている。in vitro転写および翻訳プロトコルの一般的指針は、Tymms (1995) In vitro Transcription and Translation Protocols: Methods in Molecular Biology Volume 37, Garland Publishing, NYに見出せる。

さらに、ポリペプチド、またはその部分配列、例えば抗原ペプチドを含む部分配列、は、手動でまたは自動系を使用して、固相技術を使用する直接ペプチド合成によって製造することができる（Stewart et al. (1969) Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co, San Francisco; Merrifield J (1963) J Am Chem Soc 85:2149-2154を参照のこと）。典型的な自動系には、Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer（Perkin Elmer, Foster City, CA）が含まれる。所望であれば、部分配列を別々に化学合成し、化学的方法を使用して結合させ、全長ポリペプチドを得ることができる。

修飾アミノ酸
本発明の発現ポリペプチドは1つ以上の修飾アミノ酸を含有しうる。修飾アミノ酸の存在は、例えば（a）ポリペプチド血清半減期を増加させ、（b）ポリペプチド抗原性を低減／増加させ、（c）ポリペプチド保存安定性を増加させる、等の点で有益でありうる。アミノ酸（群）は、例えば組換え生産期間中に翻訳と同時または翻訳後に修飾（例えば哺乳類細胞における発現期間中のN-X-S/TモチーフでのN-結合グリコシル化）するか、または合成手段によって修飾（例えばペグ化による修飾）する。

修飾アミノ酸の非限定的な例には、グリコシル化アミノ酸、硫酸化アミノ酸、プレニル化（prenlyated）（例えば、ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化）アミノ酸、アセチル化アミノ酸、アシル化アミノ酸、ペグ化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、カルボキシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸、等、ならびに例えば脂質部分または他の有機誘導体化物質へのコンジュゲートによって修飾されたアミノ酸が含まれる。アミノ酸の修飾に関して当業者に指針を与えるために適切な参考文献は文献中に充実している。プロトコルの例は、Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Human Press, Towata, NJに見出せる。

融合タンパク質
本発明はまた、（例えば、配列番号１１〜２０、２７〜３２、および３９〜４４によって例示されるHAおよび／またはNAポリペプチドをコードする）本発明の配列またはその断片と、例えば免疫グロブリン（またはその部分）、例えばGFP（緑色蛍光タンパク質）、または他の同様のマーカーをコードする配列、等との融合物を含む融合タンパク質を提供する。そのような融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は本発明の別の態様である。本発明の融合タンパク質は、場合により、例えば本発明の非融合タンパク質と類似の適用（例えば本明細書中に記載の治療的、予防的、診断的、実験的等の適用が含まれる）に使用される。免疫グロブリン配列およびマーカー配列との融合に加えて、場合により、本発明のタンパク質はまた、例えば融合タンパク質の選別および／または特定の細胞タイプ、領域等への融合タンパク質のターゲティングを可能にする配列と、融合される。

抗体
本発明のポリペプチドを使用して、本明細書中に記載のポリペプチドおよび／または本発明のポリヌクレオチド、例えば本明細書中で示されるポリヌクレオチド、によってコードされるポリペプチド、およびその保存的変異体に特異的な抗体を製造することができる。上述のポリペプチドに特異的な抗体は、例えば、（例えば標的ポリペプチドの活性、分布、および発現に関する）診断および治療目的で有用である。

本発明のポリペプチドに特異的な抗体は、当技術分野において周知の方法によって作製することができる。そのような抗体には、非限定的に、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、一本鎖、Fab断片および、Fab発現ライブラリーによって生産される断片が含まれうる。

抗体生産のためにはポリペプチドは生物学的活性を必要としない（例えば全長機能的赤血球凝集素またはノイラミニダーゼは必要とされない）。しかし、該ポリペプチドまたはオリゴペプチドは抗原性でなければならない。特異的抗体を誘導するために使用されるペプチドは、典型的に、少なくとも約4アミノ酸のアミノ酸配列を有し、しばしば少なくとも5または10アミノ酸のアミノ酸配列を有する。ポリペプチドの短い鎖を別のタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニンと融合して、そのキメラ分子に対して抗体を産生させることができる。

ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を製造するための多数の方法が当業者に公知であり、本発明のポリペプチド、および／または本発明のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド等に特異的な抗体の製造に適合させることができる。例えばColigan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; Paul (ed.) (1998) Fundamental Immunology, Fourth Edition, Lippincott-Raven, Lippincott Williams & Wilkins; Harlow and Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY; Stites et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, および該文献で引用される参考文献; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed.) Academic Press, New York, NY; およびKohler and Milstein (1975) Nature 256: 495-497を参照のこと。他の好適な抗体製造技術には、ファージまたは類似のベクターにおける組換え抗体ライブラリーの選択が含まれる。Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; およびWard, et al. (1989) Nature 341: 544-546を参照のこと。特異的モノクローナルおよびポリクローナル抗体および抗血清は、通常、例えば、少なくとも約0.1μM、少なくとも約0.01μMまたはそれ以上、典型的には、少なくとも約0.001μMまたはそれ以上のK_Dで結合する。

特定の治療的適用のためには、ヒト化抗体が望ましい。キメラ（ヒト化）抗体の製造のための詳細な方法は米国特許5,482,856に見出せる。ヒト化および他の抗体製造および操作技術に関する追加の詳細は、Borrebaeck (ed.) (1995) Antibody Engineering, 2^nd Edition Freeman and Company, NY (Borrebaeck); McCafferty et al. (1996) Antibody Engineering, A Practical Approach IRL at Oxford Press, Oxford, England (McCafferty), およびPaul (1995) Antibody Engineering Protocols Humana Press, Towata, NJ (Paul)に見出せる。具体的手法に関する追加の詳細は、例えば、Ostberg et al. (1983), Hybridoma 2: 361-367, Ostberg, 米国特許第4,634,664号, およびEngelman et al., 米国特許第4,634,666号に見出せる。

免疫反応性によるポリペプチドの特徴付け
本発明のポリペプチドは種々の新規ポリペプチド配列（例えばHAおよびNA分子を含む）を提供することから、該ポリペプチドはまた、例えば免疫学的アッセイにおいて認識できる新規の構造的特徴を提供する。本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗血清、ならびにそのような抗血清が結合するポリペプチド、の作製は本発明の特徴である。

例えば、本発明には、本明細書中に記載の1種以上の配列（例えば配列番号１１〜２０、２７〜３２、および３９〜４４）等から選択されるアミノ酸配列を含む免疫原に対して産生された抗体または抗血清に特異的に結合するか、またはそれらに対して特異的に免疫反応性であるポリペプチド（例えばHAおよびNA分子）が含まれる。他の相同体との交差反応性を排除するために、出願時の公的データベースに見出されるHAおよび／またはNA分子、例えば「コントロール」ポリペプチド（群）を用いて、該抗体または抗血清をサブトラクト（差し引き）する。他のコントロール配列が核酸と一致する場合、該核酸によってコードされるポリペプチドを作製して、抗体／抗血清サブトラクション目的で使用する。

典型的な一形式では、免疫アッセイで、本明細書中の配列に対応する1種以上の配列（例えば配列番号１１〜２０、２７〜３２、および３９〜４４）、等またはその実質的部分配列（すなわち、提供される全長配列の少なくとも約30％）を含む1種以上のポリペプチドに対して産生されたポリクローナル抗血清を使用する。以下、本配列に由来する潜在的ポリペプチド免疫原のセットを、包括的に、「免疫原性ポリペプチド」と称する。得られた抗血清は、場合により、コントロール赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ相同体に対して低い交差反応性を有するように選択し、1種以上のコントロール赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ相同体を用いて、例えば免疫吸着（immunoabsorbtion）によって任意のそのような交差反応性を除去した後に、免疫アッセイにおいてポリクローナル抗血清を使用する。

免疫アッセイにおいて使用するための抗血清を製造するために、1種以上の免疫原性ポリペプチドを本明細書に記載のように製造し、精製する。例えば、組換え細胞において組換えタンパク質を製造することができる。マウスの近交系（該マウスの実質的な遺伝的同一性のせいで結果がより再現可能であるため、このアッセイにおいて使用される）を、標準アジュバント、例えばフロイントアジュバント、および標準マウス免疫化プロトコルと組み合わせて、免疫原性タンパク質（群）で免疫化する（抗体作製、特異的免疫反応性を決定するために使用できる免疫アッセイ形式および条件の標準的説明に関しては、例えばHarlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New Yorkを参照のこと）。抗体についての追加の参考文献および考察はさらに本明細書中で見出され、免疫反応性によってポリペプチドを定義するためにここで適用することができる。あるいは、本明細書中で開示される配列由来の1種以上の合成または組換えポリペプチドを担体タンパク質にコンジュゲートして、免疫原として使用する。

ポリクローナル血清を回収し、免疫アッセイ、例えば固体支持体上に固定された1種以上の免疫原性タンパク質を用いる固相免疫アッセイにおいて、免疫原性ポリペプチドに対して滴定する。10⁶以上の力価を有するポリクローナル抗血清を選択し、プールし、コントロール赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼポリペプチド（群）でサブトラクトし、サブトラクトしプールした力価測定済みポリクローナル抗血清を生成する。

サブトラクトしプールした力価測定済みポリクローナル抗血清を、比較免疫アッセイにおいてコントロール相同体（群）に対する交差反応性に関して検査する。この比較アッセイでは、コントロール相同体に対する結合と比較して、免疫原性ポリペプチドに対する力価測定済みポリクローナル抗血清の結合に関して少なくとも約5〜10倍高いシグナル対ノイズ比を生じさせるような、サブトラクトした力価測定済みポリクローナル抗血清に関して、識別可能な結合条件を決定する。すなわち、非特異的競合因子、例えばアルブミンまたは脱脂粉乳を加えることによって、かつ／または塩条件、温度、および／または同様の条件を調節することによって、結合反応のストリンジェンシーを調節する。これらの結合条件を、試験ポリペプチド（免疫原性ポリペプチドおよび／またはコントロールポリペプチドと比較されるポリペプチド）に対して、プールしサブトラクトしたポリクローナル抗血清が特異的に結合するかどうかを決定するために以後のアッセイにおいて使用する。特に、識別可能な結合条件下で、コントロール受容体相同体より少なくとも2〜5倍高いシグナル対ノイズ比、および免疫原性ポリペプチド（群）と比較して少なくとも約2分の1のシグナル対ノイズ比を示す試験ポリペプチドは、公知の受容体等と比較して、免疫原性ポリペプチドと実質的な構造類似性を共有し、したがってそれは本発明のポリペプチドである。

別の例では、競合結合形式の免疫アッセイを使用して試験ポリペプチドを検出する。例えば、上述のように、コントロールポリペプチドとの免疫吸着によってプールした抗血清混合物から交差反応性抗体を除去する。次いで免疫原性ポリペプチド（群）を固体支持体に固定し、該固体支持体をサブトラクトしプールした抗血清に曝露する。試験タンパク質をアッセイに加えて、プールしサブトラクトした抗血清に対する結合に関して競合させる。固定されたタンパク質（群）と比較したプールしサブトラクトした抗血清に対する結合に関する試験タンパク質（群）の競合能を、アッセイに加えられた免疫原性ポリペプチド（群）（該免疫原性ポリペプチドは、該プールした抗血清に対する結合に関して、固定された免疫原性ポリペプチドと効果的に競合する）の結合に対する競合能と比較する。標準的算出法を使用して試験タンパク質に関する交差反応性パーセントを算出する。

並行アッセイにおいて、コントロールタンパク質（群）の、プールしサブトラクトした抗血清に対する結合に関する競合能は、場合により、免疫原性ポリペプチド（群）の、該抗血清に対する結合に関する競合能と比較して決定する。同様に、標準的算出法を使用してコントロールポリペプチド（群）に関する交差反応性パーセントを算出する。コントロールポリペプチド（群）と比較して、試験ポリペプチドに関する交差反応性パーセントが少なくとも5〜10倍高い場合、および／または試験ポリペプチドの結合が、ほぼ、免疫原性ポリペプチドの結合の範囲内である場合、該試験ポリペプチドはプールしサブトラクトした抗血清に対し特異的に結合すると言える。

一般に、免疫吸着しプールした抗血清を、本明細書中に記載の競合結合免疫アッセイにおいて使用して、任意の試験ポリペプチドを免疫原性および／またはコントロールポリペプチド（群）と比較することができる。この比較を行うために、免疫原性ポリペプチド、試験ポリペプチドおよびコントロールポリペプチドを広範囲の濃度でそれぞれアッセイし、例えば固定したコントロールタンパク質、試験タンパク質または免疫原性タンパク質に対するサブトラクトした抗血清の結合を50％阻害するために必要とされる各ポリペプチドの量を、標準的技術を使用して決定する。競合アッセイにおける結合に必要な試験ポリペプチドの量が、必要な免疫原性ポリペプチドの量の2倍未満である場合、該量がコントロールポリペプチドについてのその量より少なくとも約5〜10倍多いことを条件として、該試験ポリペプチドは、免疫原性タンパク質に対して産生された抗体に特異的に結合すると言うことができる。

特異性の追加的な決定として、場合により、免疫吸着において使用される免疫原性ポリペプチド（群）に対する、免疫原性ポリペプチドをサブトラクトしプールした得られた抗血清の結合が、ほとんど検出されなくなるか、まったく検出されなくなるまで、プールした抗血清を免疫原性ポリペプチド（群）（コントロールポリペプチド（群）ではなく）に対し十分に免疫吸着させる。次いでこの十分に免疫吸着させた抗血清を試験ポリペプチドとの反応性に関して検査する。反応性がほとんど観察されないか、全く観察されなければ（すなわち、免疫原性ポリペプチドに対する十分に免疫吸着させた抗血清の結合に関して観察されるシグナル対ノイズ比のせいぜい2倍であれば）、該試験ポリペプチドは、該免疫原性タンパク質によって誘導される抗血清に特異的に結合する。

核酸およびポリペプチド配列変異体
本明細書中に記載のように、本発明は、核酸ポリヌクレオチド配列およびポリペプチドアミノ酸配列、例えば赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ配列、および例えば該配列を含む組成物および方法を提供する。該配列の例は本明細書中で開示されている（例えば配列番号１〜４５）。しかし、本発明は、本明細書中で開示されている配列に必ずしも限定されず、本発明はまた、例えばHAおよび／またはNA分子をコードする、本明細書中に記載の機能を有する多数の関連配列および無関係の配列を提供することを当業者は認識する。

当業者はまた、開示配列の多数の変異体が本発明に含まれることを認識する。例えば、機能的に同一の配列を生じさせる、開示配列の保存的変異は、本発明に含まれる。少なくとも1つの開示配列にハイブリダイズする、核酸ポリヌクレオチド配列の変異体は、本発明に含まれるとみなされる。例えば標準的配列比較技術によって決定される、本明細書中で開示される配列のユニーク部分配列もまた、本発明に含まれる。

サイレント変異
遺伝暗号の縮重により、場合により、本発明のポリペプチドおよび／またはウイルスをコードする任意の種々の核酸配列を製造できるが、そのいくつかは、本明細書中のHAおよびNA核酸およびポリペプチド配列に対する低レベルの配列同一性しか有さない可能性がある。以下に、多数の生物学および生化学の教科書で見出される、遺伝暗号を指定する典型的なコドン表を挙げる。

このコドン表は、多数のアミノ酸が2種以上のコドンによってコードされることを示す。例えば、コドンAGA、AGG、CGA、CGC、CGG、およびCGUはすべてアミノ酸アルギニンをコードする。ゆえに、コドンによってアルギニンが指定される本発明の核酸中の各位置で、コード対象のポリペプチドを変更することなく、該コドンを、上記の対応するコドンのいずれかに変更することができる。RNA配列中のUはDNA配列中のTに対応することは理解されよう。

そのような「サイレント変異」は、下で考察される「保存的に改変された変異」の一種である。核酸中の各コドン（通常メチオニンに関する唯一のコドンであるATG、および通常トリプトファンに関する唯一のコドンであるTTGを除く）を、機能的に同一のポリペプチドをコードするように標準的技術によって改変できることを当業者は認識する。したがって、あるポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、任意の記載される配列に暗に含まれる。したがって本発明は、可能なコドン選択に基づいて組み合わせを選択することによって作製できる、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の各およびすべての可能な変異を明示的に提供する。これらの組み合わせは、本発明の赤血球凝集素またはノイラミニダーゼポリペプチドをコードする核酸配列に適用される（例えば表1に記載されるか、または当技術分野において一般に利用可能な）標準トリプレット遺伝暗号にしたがって作製される。本明細書中の各核酸のすべてのそのような変異は、配列を遺伝暗号と組み合わせて考察することによって、具体的に提供され、記載される。当業者は本明細書中の方法を使用してこれらのサイレント置換を施すことが十分に可能である。

保存的変異
遺伝暗号の縮重のせいで、「サイレント置換」（すなわち、コード対象のポリペプチド中の変更を生じさせない核酸配列中の置換）は、アミノ酸をコードする本発明のすべての核酸配列の、暗に含まれる特徴である。同様に、アミノ酸配列中の1個または数個のアミノ酸が、非常に類似の特性を有する異なるアミノ酸で置換されている「保存的アミノ酸置換」もまた、本明細書中の構築物等の開示構築物に非常に類似していると容易に特定される。各開示配列のそのような保存的変異もまた、本発明の特徴である。

特定の核酸配列の「保存的変異」とは、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一の配列を表す。下の表2を参照のこと。コード化配列中の単一アミノ酸または少ないパーセンテージ（典型的に5％未満、より典型的には4％、3％、2％または1％未満）のアミノ酸を変更、付加または除去する個々の置換、欠失または付加は、該変化がアミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、または化学的に類似のアミノ酸でのアミノ酸の置換を生じさせる場合、「保存的に改変された変異」であることを当業者は認識する。ゆえに、列挙される本発明のポリペプチド配列の「保存的変異」には、ポリペプチド配列の少ないパーセンテージ、典型的に5％未満、より典型的には4％、3％、2％または1％未満、のアミノ酸を、同じ保存的置換群の保存的に選択されるアミノ酸で置換することが含まれる。最後に、核酸分子のコード化活性を変更しない配列の付加、例えば非機能的配列の付加は、基礎とする核酸の保存的変異である。

ユニークポリペプチドおよびポリヌクレオチド部分配列
一態様では、本発明は、本明細書中で開示されるHAおよびNA分子の配列、例えば配列番号１〜１０、２１〜２６、３３〜３８、および４５、から選択される核酸中のユニーク部分配列を含む核酸を提供する。ユニーク部分配列は、例えば出願時のGenBankまたは他の類似の公的データベースに見出される核酸等の核酸と一致する核酸と比較して、独自のもの（unique）である。アライメントは、例えばデフォルトパラメータに設定されたBLASTを使用して実施することができる。任意のユニーク部分配列は、例えば本発明の核酸を同定するためのプローブとして、有用である。上記参照のこと。

同様に、本発明には、本明細書中で開示されるHAおよびNA分子の配列、例えば配列番号１１〜２０、２７〜３２、および３９〜４４、から選択されるポリペプチド中のユニーク部分配列を含むポリペプチドが含まれる。ここで、ユニーク部分配列は、例えば、出願時の例えばGenBankまたは他の類似の公的データベースに見出されるポリヌクレオチド配列に対応するアミノ酸に相当するポリペプチドと比較して、独自のものである。

本発明はまた、本発明のHAおよびNA分子の配列から選択されるポリペプチド中のユニーク部分配列をコードするユニークコーディングオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする標的核酸を提供する。該ユニーク部分配列は、コントロールポリペプチド（例えば、出願時の例えばGenBankまたは他の類似の公的データベースに見出されるものに相当する核酸の配列）のいずれかに相当するポリペプチドと比較して、独自のものである。ユニーク配列は上記のように決定される。

配列比較、同一性、および相同性
2種以上の核酸またはポリペプチド配列に関して用語「同一」または「同一性」パーセントとは、下記配列比較アルゴリズム（または当業者が利用可能な他のアルゴリズム）の1つを使用してまたは視覚的検査によって測定して最大一致度を達成するように比較されアライメントされた場合に、同一であるか、または同一アミノ酸残基またはヌクレオチドを特定の割合で有する、2種以上の配列または部分配列を表す。

2つの核酸またはポリペプチド（例えばHAもしくはNA分子をコードするDNA、またはHAもしくはNA分子のアミノ酸配列）に関してフレーズ「実質的に同一」とは、配列比較アルゴリズムを使用して、または視覚的検査による測定で最大一致度を達成するように比較およびアライメントされた場合に、少なくとも約90％、好ましくは91％、最も好ましくは92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有する2種以上の配列または部分配列を表す。そのような「実質的に同一」の配列は、通常は、実際の起源を参照することなく、「同種（homologous）」であるとみなされる。好ましくは、「実質的同一性」は、比較対象の2つの配列の、少なくとも約200残基長、少なくとも約250残基、少なくとも約300残基、350残基、400残基、425残基、450残基、475残基、480残基、490残基、495残基、499残基、500残基、502残基、559残基、565残基、または566残基であるアミノ酸配列領域、またはその全長にわたって、存在する。

配列比較およびホモロジー決定では、典型的に1配列がリファレンス配列として機能し、それに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験およびリファレンス配列をコンピュータに入力し、必要であれば部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次いで配列比較アルゴリズムは、指定のプログラムパラメータに基づいて、リファレンス配列と比較された試験配列（群）に関する配列同一性パーセントを算出する。

比較用配列の最適アライメントは、例えばSmith & Waterman, Adv Appl Math 2:482 (1981)のローカルホモロジーアルゴリズムによって、Needleman & Wunsch, J Mol Biol 48:443 (1970)のホモロジーアライメントアルゴリズムによって、Pearson & Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 85:2444 (1988)の類似性方法のための検索によって、Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA等のアルゴリズムのコンピュータ実装によって、または視覚的検査によって実行することができる（一般にAusubel et al., 上記を参照のこと）。

配列同一性および配列類似性パーセントの決定に好適なアルゴリズムの一例はBLASTアルゴリズムである。BLASTアルゴリズムはAltschul et al., J Mol Biol 215:403-410 (1990)に記載されている。BLAST解析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information（www.ncbi.nlm.nih.gov/）から公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列中の同一の長さのワードとアライメントされた場合に、いくらかの正値の閾値スコアTに適合するか、またはそれを満たす、クエリ配列中の長さWのショートワードを特定することによってハイスコア配列ペア（HSP）を特定することを含む。Tは隣接ワードスコア閾値と称される（Altschul et al., 上記を参照のこと）。これらの初期隣接ワードヒットは、それらを含有する、より長いHSPを発見するための検索を開始するためのシードとして機能する。次いで該ワードヒットを、累積アライメントスコアが増加しうる限り、各配列に沿って両方向に伸長する。累積スコアは、ヌクレオチド配列では、パラメータM（一致残基のペアに関する報酬スコア；常に> 0）およびN（ミスマッチ残基に関するペナルティースコア；常に< 0）を使用して算出する。アミノ酸配列では、スコア行列を使用して累積スコアを算出する。累積アライメントスコアがその最大達成値から量Xだけ低下した場合；1種以上の負のスコアの残基アライメントの蓄積に起因して累積スコアがゼロ以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に達した場合に、ワードヒットの各方向の伸長を停止する。BLASTアルゴリズムパラメータW、T、およびXはアライメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列用）では、デフォルトとして、ワード長（W）11、期待値（expectation）（E）10、カットオフ100、M=5、N=-4、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列用のBLASTPプログラムでは、デフォルトとして、ワード長（W）3、期待値（E）10、およびBLOSUM62スコア行列を使用する（Henikoff & Henikoff (1989) Proc Natl Acad Sci USA 89:10915を参照のこと）。

配列同一性パーセントの算出に加えて、BLASTアルゴリズムはまた、2つの配列間の類似性の統計解析を実施する（例えばKarlin & Altschul, Proc Natl Acad Sci USA 90:5873-5787 (1993)を参照のこと）。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の一尺度は最小合計確率（smallest sum probability）（P(N)）であり、2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然によって生じる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸とリファレンス核酸の比較において最小合計確率が、約0.1未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満であれば、リファレンス配列に類似しているとみなされる。

別の有用な配列アライメントアルゴリズムの例はPILEUPである。PILEUPは、プログレッシブ・ペアワイズアライメントを使用して、関連配列の群からマルチプル配列アライメントを作成する。それはまた、アライメントの作成に使用されるクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることができる。PILEUPでは、Feng & Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35:351-360のプログレッシブアライメント法の単純化を使用する。使用される方法は、Higgins & Sharp (1989) CABIOS5:151-153に記載の方法と類似している。該プログラムは、例えば5,000文字の最大長の300までの配列をアライメントすることができる。マルチプルアライメント手順は、最も類似している2つの配列のペアワイズアライメントから開始し、アライメント済みの2つの配列のクラスターを得る。次いでこのクラスターを、次に最も関連している配列またはアライメント済み配列のクラスターとアライメントすることができる。2つのクラスターの配列は、個々の2つの配列のペアワイズアライメントを単純に拡張することによってアライメントすることができる。最終アライメントは、一連のプログレッシブ、ペアワイズアライメントによって達成される。該プログラムを使用して、クラスタリング関係のデンドグラムまたはツリー表示をプロットすることもできる。該プログラムは、配列比較の領域に関する具体的配列およびそのアミノ酸またはヌクレオチド座標を指定することによって実行される。

複数のDNA、またはアミノ酸、配列アライメントに好適なアルゴリズムの追加の例は、CLUSTALWプログラムである（Thompson, J. D. et al. (1994) Nucl. Acids. Res. 22: 4673-4680）。CLUSTALWは、配列の群間のマルチプルペアワイズ比較を実施し、相同性に基づいてそれらをマルチプルアライメントに組み立てる。ギャップオープンおよびギャップ伸長ペナルティは、例えば、それぞれ10および0.05であってよい。アミノ酸アライメントでは、タンパク質重量マトリックスとしてBLOSUMアルゴリズムを使用することができる。例えばHenikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919を参照のこと。

デジタルシステム
本発明は、本明細書中の核酸および単離または組換えポリペプチド（例えば本明細書中で示される配列が含まれる）およびその種々のサイレント置換および保存的置換に関する本明細書中の配列情報に対応する文字列を含む、デジタルシステム、例えばコンピュータ、コンピュータ読み取り可能媒体および統合システムを提供する。統合システムは、例えば該文字列に対応する遺伝子を作製するための遺伝子合成装置をさらに含みうる。

当技術分野において公知の種々の方法を使用して、異なる文字列間の相同性または類似性を検出することができ（上記参照のこと）、該方法を使用して、他の望ましい機能を実施することもできる。例えば出力ファイルを管理し、配列を含めた情報のプレゼンテーションを作成するための基礎を提供する等である。その例には、上で考察されるBLASTが含まれる。本発明のコンピュータシステムには、例えば本明細書中に記載の配列を含む1種以上のデータファイルまたはデータベースとともに、そのようなプログラムを含ませることができる。

ゆえに、種々のHAまたはNA配列または断片等の間の種々のストリンジェンシーおよび長さについての、異なるタイプの相同性および類似性を、本明細書中の統合システムにおいて検出かつ識別することができる。例えば、多数のホモロジー決定法は、生体高分子の配列の比較解析、ワードプロセシングにおけるスペルチェック、および種々のデータベースからのデータ検索用に設計されている。天然ポリヌクレオチド中の4種の主要核酸塩基間のダブルヘリックスペアワイズ相補的相互作用の理解を伴って、相補的相同ポリヌクレオチド列のアニーリングをシミュレートするモデルを、配列アライメントまたは、典型的に本明細書中の配列に対応する文字列に対して実施される他の操作（例えば、ワードプロセシング操作、配列または部分配列文字列を含む図の構築、出力表、等）の基礎として使用することもできる。

ゆえに、標準デスクトップアプリケーション、例えばワードプロセシングソフトウェア（例えばMicrosoft Word^TMまたはCorel WordPerfect^TM）およびデータベースソフトウェア（例えば、Microsoft Excel^TM、Corel Quattro Pro^TM等の表計算ソフトウェア、またはMicrosoft Access^TM、Paradox^TM、GeneWorks^TM、またはMacVector^TM等のデータベースプログラムまたは他の類似のプログラム）を、1種以上の本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド（核酸もしくはタンパク質のいずれか、または両者）に対応する文字列を入力することによって本発明に適合させることができる。例えば、本発明のシステムには、例えば本明細書中の配列に対応する文字列を操作するためのユーザーインターフェース（例えば、Windows、MacintoshまたはLINUXシステム等の標準オペレーティングシステムにおけるGUI）とともに使用される、適切な文字列情報を有する前記ソフトウェアを含ませることができる。上記のように、専用のアライメントプログラム、例えばBLASTを、核酸またはタンパク質（または対応する文字列）のアライメントのための本発明のシステムに組み入れることもできる。

本発明のシステムは、典型的に、本明細書中の配列のいずれかを含むソフトウェアシステムにデータセットが入力されているデジタルコンピュータを含む。コンピュータは、例えばPC（Intel x86またはPentiumチップ適合性DOS^TM、OS2^TM WINDOWS^TM WINDOWSNT^TM、WINDOWS95^TM、WINDOWS2000^TM、WINDOWS98^TM、LINUXベースマシン、MACINTOSH^TM、Power PC、またはUNIXベース（例えばSUN^TMワークステーション）マシン）または当業者に公知の他の市販コンピュータであってよい。配列のアライメントまたは他の操作のためのソフトウェアは入手可能であるか、または当業者が標準的プログラミング言語、例えばVisualbasic、PERL、Fortran、Basic、Java、等を使用して容易に構築することができる。

任意のコントローラまたはコンピュータは、場合により、モニターを含む。該モニターは、ブラウン管（「CRT」）ディスプレイ、フラットパネルディスプレイ（例えばアクティブマトリックス液晶ディスプレイ、液晶ディスプレイ）、等であることが多い。コンピュータ回路は、多数の集積回路チップ、例えばマイクロプロセッサ、メモリー、インターフェース回路、等が含まれるボックス中に配置されることが多い。該ボックスはまた、場合により、ハードディスクドライブ、フロッピーディスクドライブ、高容量リムーバブルドライブ、例えば書き込み可能CD-ROM、および他の一般的周辺機器を含む。入力デバイス、例えばキーボードまたはマウスは、場合により、ユーザーからの入力を提供し、該当するコンピュータシステムにおける比較または他の操作対象の配列についてのユーザー選択を提供する。

該コンピュータは、典型的に、例えばGUIのパラメータフィールドセットへのユーザー入力の形式で、または前もってプログラムされた、例えば種々の異なる特定操作を得るために前もってプログラムされた指示の形式でユーザーの指示を受けるための適切なソフトウェアを含む。次いで該ソフトウェアは、これらの指示を、例えば適切な機構または輸送コントローラの、操作を指示するための適切な言語に変換して、所望の操作を実行する。該ソフトウェアにはまた、（例えば本明細書中の配列または配列のアライメントに基づく）核酸合成の制御、示差的遺伝子発現に関するサンプルの比較、または他の操作のための出力エレメントを含ませることができる。

キットおよび試薬
本発明は、場合により、キットとしてユーザーに提供される。例えば、本発明のキットは、（例えば本発明のHAおよび／またはNA分子を含むか、または伴う）本明細書中に記載の1種以上の核酸、ポリペプチド、抗体、またはセルラインを含有する。該キットは、診断用の核酸またはポリペプチド、例えば抗体、プローブセットを、例えば好適な容器にパッケージされたcDNAマイクロアレイとして、または他の核酸、例えば1種以上の発現ベクターを含有しうる。該キットにはまた、1種以上の追加の試薬、例えば基質、ラベル、プライマー（発現産物を標識するためのもの）、チューブおよび／または他の付属品、サンプルを回収するための試薬、バッファー、ハイブリダイゼーションチャンバー、カバーガラス、等をさらに含ませることができる。該キットは、場合により、診断セット、等の発見または適用のためにキット成分を使用する好ましい方法を詳説するインストラクションセットまたはユーザーマニュアルをさらに含む。

該キットを使用説明書にしたがって使用すると、例えば疾患状態または症状を評価するために、細胞または生物における疾患状態または症状の進行に対する医薬品または他の処置介入の効果を評価するために、またはワクチンとして使用するため等に、使用することができる。

追加の態様では、本発明は、本明細書中の方法、組成物、システムおよび装置を具現化するシステムキットを提供する。本発明のシステムキットは、場合により、1種以上の以下のもの：（1）装置、システム、システム構成要素または装置構成要素；（2）本明細書中に記載の方法を実施するため、および／または本明細書中の装置または装置構成要素を操作するためおよび／または本明細書中の組成物を使用するための使用説明書を含む。別の態様では、本発明は、本明細書中の任意の装置、装置構成要素、組成物またはキットの使用、本明細書中の任意の方法またはアッセイの実施、および／または本明細書中の任意のアッセイまたは方法を実施するための任意の装置またはキットの使用を提供する。

さらに、該キットには、1種以上の上記翻訳系（例えば細胞）を、キットの成分を保持するための適切なパッケージング材料、容器、本明細書中の方法を実施するための指示材料および／または同種のものとともに含ませることができる。同様に、キット形式で、例えばキットの成分を保持するための容器、本明細書中の方法を実施するための指示材料および／または同種のものとともに、翻訳系の産物（例えばHAおよび／またはNA分子等のタンパク質）を提供することができる。

本発明の方法および組成物の使用を容易にするために、任意のワクチン成分および／または組成物、例えば尿膜腔液中の再集合ウイルス等、および実験用または治療用ワクチン目的のインフルエンザウイルスのパッケージングおよび感染に有用な追加の成分、例えばバッファー、細胞、培養培地を、キットの形式でパッケージングすることができる。典型的に、該キットは、上記成分に加えて、追加の材料を含有し、該材料には、例えば、本発明の方法を実施するための使用説明書、パッケージング材料、および容器が含まれうる。

実施例

実施例１： H5N1 caウイルスおよびワクチンの構築および分析
H5N1 HA/NA配列を含む本明細書中の種々の配列を使用して、インフルエンザウイルスおよびワクチンを作製した。そのようなワクチン中のHA配列は、HA内の多塩基性切断部位を除去することによって野生型から改変した。該HA/NA配列をca A/AA/6/60（ts、att、caウイルス、上記参照のこと）と再構成（reassort）（6:2の再集合として）させた。

この実施例では3株のH5N1インフルエンザ：A/VN/1203/2004、A/HK/491/1997、およびA/HK/213/2003を使用した。そのような株は、この実施例内では、その年表示に基づいて'97、'03、および'04株とも称される。これら3株のHA配列の相同性は95〜96％である。図１は、ウイルス／ワクチンの構築に使用される典型的なHA配列、'04 HA配列の多塩基性切断部位の改変を説明する。上記のように、本発明の種々の実施形態は、多塩基性切断部位の異なる領域が除去されている配列を含む。上記参照のこと。

上記のように、改変されたH5N1配列（すなわち改変された'97、'03、および'04遺伝子）を使用して、ca A/AA/6/60との6:2再集合ウイルスを構築した。他の望ましいバックボーン（例えばPR8等）も使用できたことは理解されるであろうし、本明細書中の別の箇所でも指摘されている。

この実施例の6:2再集合では、HAおよびNA遺伝子配列は1種以上の野生型親ウイルス由来であり、すなわち、'03ウイルスのHAおよびNA遺伝子配列はA/HK/213/2003由来であり、'04ウイルスのHAおよびNA遺伝子配列はA/VN/1203/2004由来であり、'97ウイルスのHA遺伝子配列はA/HK/491/1997由来であり、NA遺伝子配列はA/HK/486/1997由来であった。6:2再集合の残りの遺伝子はA/AA/6/60 ca親ウイルス由来であることが配列解析によって特徴付けられた。再集合ウイルスは卵中で8.0〜8.5 log₁₀ TCID₅₀になるまで複製した。しかし、log₁₀ TCID₅₀が約7.0〜約9.0、約7.5〜8.5、または約8.0〜8.5を含む他の実施形態もまた、本発明の範囲内であることが理解される。その構築ウイルス中の改変HAの内因性プロテアーゼによる切断性は、in vitroで制限され、該ウイルスの増殖はトリプシン（例えば約0.1μg/ml〜約1.0μg/ml）に依存した。in vitroアッセイによってアッセイすると、構築ウイルスは温度感受性であった。

H5N1 ca再集合ウイルス（改変された'97、'03、または'04 HA遺伝子を有する）はニワトリにとって致死的ではなかった。例えば、4週齢SPF白色Plymouth Rockチキンにストックウイルス（10^8〜8.75 TCID₅₀/ml）の1:10希釈液を静脈内接種して10日間観察すると、野生型'97、'03、および'04 H5N1が使用された場合には1〜2日以内に8羽のニワトリのうち8羽が死んだが、一方、H5N1 ca再集合ウイルスが使用された場合には8羽のニワトリのうち1羽も死ななかったことが観察された。図２に見られるように、鼻腔内投与されたH5N1 ca再集合ウイルスはニワトリ中で複製しなかった。

H5N1/AA ca再集合はまた、マウスにとっても致死的ではなかった。図３を参照のこと。図３はさらに、H5N1野生型株に関するTCID₅₀を示す。図４は、1997および2004 H5N1 ca再集合ウイルスの複製がマウスにおいて制限されたことを示す。図５は、H5N1 ca再集合ウイルス群の複製はマウスの肺において制限されることを示す。

ワクチンの一回の鼻腔内投与後にマウスにおいて誘導される血清HAI抗体力価の比較（2003野生型に対して比較された2003 ca）を図６に示す。図７および１５は類似の測定値を示すが、血清中和抗体力価を使用している。

図８は、H5N1 ca再集合ウイルスが、50、500、または5,000 LD₅₀の野生型H5N1ウイルスによる致死的チャレンジに対してマウスを防御することを示す。図９は、マウスにおける同種および異種H5N1チャレンジウイルスの肺複製に対する防御の効力を示す。図に見られるように、野生型ウイルスの複製と比べてca再集合ウイルスはあまり複製しなかった。図１０は、マウスの上気道を使用する関連データを示す。当業者は、同種および異種チャレンジ（例えば2003ワクチンが2003野生型チャレンジ（同種）に対して防御するかどうか、または2003ワクチンが1997野生型チャレンジ（異種）に対して防御するかどうか等を試験すること）について熟知しているであろう。

図１１は、マウスにおける同種または異種H5N1野生型ウイルスを用いた高用量（10⁵TCID₅₀）チャレンジに対する、2004 H5N1 caワクチンによって付与される防御の効力を示す。図１２は、マウスにおける同種または異種H5N1野生型ウイルスを用いた高用量（10⁵TCID₅₀）チャレンジに対する、1997および2003 H5N1 caワクチンによって付与される防御の効力を示す。図１３は、マウスにおける低または高用量の同種H5N1野生型ウイルスチャレンジに対する、2004 H5N1 caワクチンによって付与される防御の効力を示す。図１１〜１３は、試験ワクチンが他の関連ウイルスに対して防御できたことを実証する。

健常なヒト成人の鼻内スプレー投与では、'04ワクチンが耐容性良好であり、その複製は高度に制限された。健常な成人における該ワクチンの複製制限に関しては図２７を参照のこと。また、健常な成人のうち数匹において、10^6.7 TCID₅₀の'04ワクチンに対するHI抗体応答が観察された。図２８を参照のこと。

この実施例は、本発明の典型的なH5N1 ca再集合ウイルス／ワクチンに関するいくつかのポイントを実証する。改変されたca再集合'97、'03、および'04ウイルスは、in vitroでts表現型、ニワトリでの病原性の喪失およびマウスでの弱毒化を有することが示された。また、フェレットにおいても弱毒化が存在することが予測される。マウスにおける野生型ウイルスを用いた致死的チャレンジおよび全身性伝播に対する防御および交差防御の効力がさらに示された。マウスの気道における野生型チャレンジウイルスの複製に対する防御および交差防御の効力も予測される。

これらの（および類似の）ウイルス／ワクチンを使用して、2回のワクチン投与後に免疫原性および効力が改善されるかどうかを判定し；非ヒト霊長類において免疫原性を評価し；フェレットにおいて弱毒性およびワクチン効力を評価し；マウスにおいて、得られたワクチンについて観察される効力に対する体液性および細胞性免疫の寄与を決定し；2003 HAのどの残基が免疫原性の増強に寄与するかを決定し、かつそれらを1997および2004 HAに導入し；および多塩基性（multibasic）アミノ酸切断部位の欠失および遺伝子配置（gene constellation）の影響を決定することが意図される。

実施例２： H6 caウイルスおよびワクチンの構築および分析
H6 HA配列を含む3種の組換えインフルエンザウイルスおよびワクチンのセット：（a）A/Duck（A/Duck77のH6 HAおよびN9 NAを含む）；（b）A/Teal（A/Teal97のH6 HAおよびN1 NAを含む）；および（c）A/Mallard（A/Mallard85のH6 HAおよびN2 NAを含む）を製造した。各組換えウイルスの6つの内部ゲノムセグメントはca A/AA/6/60のセグメントであった。

A/Duck、A/Teal、およびA/Mallardの各組換えウイルスはフェレットの鼻甲介および肺において弱毒化された。10⁷ TCID₅₀組換えH6インフルエンザウイルス（ca；直前のパラグラフを参照のこと）または野生型（wt）H6インフルエンザウイルスをフェレットに鼻腔内接種した。検査のために、感染3日後にフェレットから鼻甲介および肺組織を回収した。図１６は、組換えウイルス（ca）を接種されたフェレットの鼻甲介および肺組織が、それぞれの対応するwtウイルスを接種されたフェレットの鼻甲介および肺組織よりも低いウイルス力価を示したことを示す。

A/Duck、A/Teal、およびA/Mallardの各組換え（ca）ウイルスはフェレットにおいても免疫原性であった。図１７を参照のこと。

図１８は、A/Duck、A/Teal、およびA/Mallardワクチンによって付与される防御の効力を示す。一回量の7 log₁₀ PFU 組換えA/Duck、A/Teal、またはA/Mallardワクチンでフェレットにワクチン接種した。次いで、7 log₁₀ PFU wt A/Duck、A/Teal、またはA/Mallardウイルスを用いてフェレットをチャレンジした。チャレンジ3日後に、フェレットの肺および鼻甲介を回収し、組織中のウイルス力価を測定した。図１８は、フェレットにおける同種および異種野生型H6ウイルスに対する、組換え（ca）H6ワクチンによって付与される防御の効力を示す。

実施例３： H7N3、BC 04 ca、ウイルスおよびワクチンの構築および分析
A/ck/BC/CN-6/04（BC 04 ca）のHA H7およびNA N3配列を使用して、追加の組換えインフルエンザウイルスおよびワクチンを製造した。これらのHAおよびNA配列はca A/AA/6/60の6つの内部ゲノムセグメントと組み合わせた。

BC 04 caワクチンはフェレットにおいて弱毒化された。0.5 mL中の10⁷ TCID₅₀ワクチンをフェレットに鼻腔内接種した。接種3日後、フェレットの鼻甲介、肺、脳、および嗅球を回収した。これらの各組織中のウイルス力価は、wtウイルスA/BC/CN-6/04またはA/BC/CN-7/04で接種されたフェレットと比べて、ワクチンウイルスで接種されたフェレットにおいては減少した。図１９を参照のこと。

BC 04 caワクチンはマウスにおいて免疫原性であった。BC 04 ca ワクチンを投与されたマウスでは、4週の時点で中和抗体が検出され、これらの力価は8週にわたって増加した。第二のワクチン投与によって抗体力価はブーストされたが、達成された最終力価は単回投与後の力価と同様であった。図２０を参照のこと。

図２１および２２は、同種および異種H7 wtウイルスの両者に対する、BC 04 caワクチンによって付与される防御の効力を示す。図２１では、チャレンジの4週前に1回量ワクチン、チャレンジの8週前に1回量ワクチン、または50 LD₅₀の同種（A/ck/BC/CN-7/04）および異種（A/NL/219/03またはA/tk/Eng/63）H7 wtウイルスでの致死的チャレンジの前に2回量のワクチン（4週間空けて投与される）をマウスに鼻腔内接種した。致死的チャレンジ後のマウスの体重変化を14日間毎日モニターして、wtインフルエンザウイルスチャレンジに伴う罹患率をモニターした。

同種A/ck/BC/CN-7/04ウイルスでの致死的チャレンジを受けた各マウスでは、チャレンジ4週前に1回量のワクチンを投与したか（a）、チャレンジ8週前に1回量のワクチンを投与したか（b）、またはチャレンジ前に2回量のワクチンを投与したか（c）にかかわらず、体重変化がほとんどまたはまったく観察されなかった。同様に、異種インフルエンザウイルスA/NL/2109/03（d、e、f）またはA/tk/Eng/63（g、h、i）のいずれかを用いてマウスをチャレンジした後に体重減少はほとんどないかまったく生じなかった。やはり、チャレンジ4週前に1回量のワクチンを投与したか（dまたはg）、チャレンジ8週前に1回量のワクチンを投与したか（eまたはh）、またはチャレンジ前に2回量のワクチンを投与したか（fまたはi）にかかわらず、体重減少の欠如が観察された。

図２２は、H7N3 BC 04 caワクチンの効力についての追加の証拠を提供する。H7N3 BC 04 caワクチンを投与されたマウスの鼻甲介（a）および肺（b）の両者において、ck/BC/CN-6/04（H7N3）、ck/BC/CN-7/04（H7N3）、NL/219/03（H7N7）、tk/Eng/63（H7N3）、tk/UT/95（H7N3）、およびtk/VA/02（H7N2）ウイルスを用いるチャレンジに対する防御が観察された。

実施例４： H9N2 G9/AA ca、ウイルスおよびワクチンの構築および分析
A/ck/Hong Kong/G9/97（G9/AA ca）のHA H9およびNA N2配列を使用して、追加の組換えインフルエンザウイルスおよびワクチンを製造した。これらのHAおよびNA配列はca A/AA/6/60の6つの内部ゲノムセグメントと組み合わせた。

H9N2 G9/AA caワクチンはフェレットにおいて弱毒化された。図２３を参照のこと。図２３は、H9N2 G9 wtウイルスと比べて、H9N2 G9/AA caウイルスの投与後にフェレットの鼻甲介（a）および肺（b）において低減したウイルス力価を示す。

図２４は、マウスにおけるH9N2 G9 caワクチンの効力の証拠を提供する。H9N2 G9 caワクチンを投与されたマウスでは、H9N2 G9 wtおよびA/HK/1073/99ウイルスを用いるチャレンジに対する防御が観察された。

H9N2 G9/AA caワクチンはまた、臨床試験設定で、健常な成人において耐容性良好であった。点鼻によってH9N2 G9/AA caワクチンを健常な成人に投与した。健常な成人では、H9N2 G9/AA caワクチンの複製が高度に制限された。図２５を参照のこと。さらにまた、10^7.0 TCID₅₀のH9N2 G9/AA caワクチンの投与は、92％の健常なボランティアにおいてHI力価の4倍以上の増加を誘導した。図２６を参照のこと。

前記発明は、明確さと理解のために、やや詳細に記載されているが、本開示内容を読むことにより、本発明の真の範囲から逸脱することなく、形式および詳細の種々の変更を施しうることが当業者には明らかであろう。例えば、すべての上記技術および装置は種々の組み合わせで使用することができる。この出願において引用されるすべての刊行物、特許、特許出願、または他の文書は、個別の各刊行物、特許、特許出願、または他の文書が、個別に、参照によりすべての目的で組み入れられる旨が記載されているのと同程度に、参照により、すべての目的でその全体が組み入れられる。特に、2006年8月9日出願の米国仮出願第60/821,832号、および2007年6月8日出願の第60/942,804号は、すべての目的でその全体がここに組み入れられる。

特定の実施形態
本発明の追加の実施形態を表3および4に記載する。

配列
ca A/Vietnam/1203/04
ca A/Vietnam/1203/04 H5のヌクレオチド配列（配列番号１）
分子全長：1767 nt

ca A/Vietnam/1203/04 H5のアミノ酸配列（配列番号１１）
分子全長：564 aa

ca A/Vietnam/1203/04 N1のヌクレオチド配列（配列番号２）
分子全長：1398 nt

ca A/Vietnam/1203/04 N1のアミノ酸配列（配列番号１２）
分子全長：449 aa

ca A/Hong Kong/213/03
ca A/Hong Kong/213/03 H5のヌクレオチド配列（配列番号３）
分子全長：1767 nt

ca A/Hong Kong/213/03 H5のアミノ酸配列（配列番号１３）
分子全長：564 aa

ca A/Hong Kong/213/03 N1のヌクレオチド配列（配列番号４）
分子全長：1458 nt

ca A/Hong Kong/213/03 N1のアミノ酸配列（配列番号１４）
分子全長：469 aa

ca A/Hong Kong/491/97 (HA) + A/Hong Kong/486/97 (NA)
ca A/Hong Kong/491/97 H5のヌクレオチド配列（配列番号５）
分子全長：1767 nt

ca A/Hong Kong/491/97 H5のアミノ酸配列（配列番号１５）
分子全長：564 aa

ca A/Hong Kong/486/97 N1のヌクレオチド配列（配列番号６）
分子全長：1401 nt

ca A/Hong Kong/486/97 N1のアミノ酸配列（配列番号１６）
分子全長：450 aa

ca A/Hong Kong/491/97 (Ser211) (HA) + ca A/Hong Kong/486/97 (NA)
ca A/Hong Kong/491/97 (Ser211) H5のヌクレオチド配列（配列番号７）
分子全長：1767 nt

ca A/Hong Kong/491/97 (Ser211) H5のアミノ酸配列（配列番号１７）
分子全長：564 aa

ca A/Hong Kong/486/97 N1のヌクレオチド配列（配列番号８）
分子全長：1401 nt

ca A/Hong Kong/486/97 N1のアミノ酸配列（配列番号１８）
分子全長：450 aa

ca A/ck/Hong Kong/G9/97
ca A/ck/Hong Kong/G9/97のヌクレオチド配列（配列番号９）
分子全長：1690 bp

ca A/ck/Hong Kong/G9/97 H9のアミノ酸配列（配列番号１９）
分子全長：558 aa

ca A/ck/Hong Kong/G9/97 N2のヌクレオチド配列（配列番号１０）
分子全長：1428 bp

ca A/ck/Hong Kong/G9/97 N2のアミノ酸配列（配列番号２０）
分子全長：469 aa

A/Netherlands/219/03
A/Netherlands/219/03 H7のヌクレオチド配列（配列番号２１）
分子全長：1737 bp

A/Netherlands/219/03 H7のアミノ酸配列（配列番号２７）
分子全長：562 aa

A/Netherlands/219/03 N7のヌクレオチド配列（配列番号２２）
分子全長：1465 nt

A/Netherlands/219/03 N7のヌクレオチド配列（配列番号４５）
分子全長：1464 nt

A/Netherlands/219/03 N7のアミノ酸配列（配列番号２８）
分子全長：471 aa

A/ck/BC/CN-7/04
A/ck/BC/CN-7/04 H7のヌクレオチド配列（配列番号２３）
分子全長：1754 bp

A/ck/BC/CN-7/04 H7のアミノ酸配列（配列番号２９）
分子全長：567 aa

A/ck/BC/CN-7/04 N3のヌクレオチド配列（配列番号２４）
分子全長：1453 nt

A/ck/BC/CN-7/04 N3のアミノ酸配列（配列番号３０）
分子全長：469 aa

ca A/ck/BC/CN-6/04
ca A/ck/BC/CN-6/04 H7のヌクレオチド配列（配列番号２５）
分子全長：1734 bp

ca A/ck/BC/CN-6/04 H7のアミノ酸配列（配列番号３１）
分子全長：560 aa

ca A/ck/BC/CN-6/04 N3のヌクレオチド配列（配列番号２６）
分子全長：1453 nt

ca A/ck/BC/CN-6/04 N3のアミノ酸配列（配列番号３２）
分子全長：469 aa

ca A/Duck
ca A/Duck H6のヌクレオチド配列（配列番号３３）
分子全長：1743 bp

ca A/Duck H6のアミノ酸配列（配列番号３９）
分子全長：566 aa

ca A/Duck N9のヌクレオチド配列（配列番号３４）
分子全長：1460 nt

ca A/Duck N9のアミノ酸配列（配列番号４０）
分子全長：470 aa

ca A/Teal
ca A/Teal H6のヌクレオチド配列（配列番号３５）
分子全長：1747 bp

ca A/Teal H6のアミノ酸配列（配列番号４１）
分子全長：567 aa

ca A/Teal N1のヌクレオチド配列（配列番号３６）
分子全長：1401 nt

ca A/Teal N1のアミノ酸配列（配列番号４２）
分子全長：450 aa

ca A/Mallard
ca A/Mallard H6のヌクレオチド配列（配列番号３７）
分子全長：1745 bp

ca A/Mallard H6のアミノ酸配列（配列番号４３）
分子全長：566 aa

ca A/Mallard N2のヌクレオチド配列（配列番号３８）
分子全長：1467 nt

ca A/Mallard N2のアミノ酸配列（配列番号４４）
分子全長：469 aa

Claims

以下の（a）〜（e）からなる群から選択される、単離されたポリペプチド：
（a）配列番号２１〜２６または３３〜３８または４５のいずれか1つで示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（b）配列番号２７〜３２または３９〜４４のいずれか1つで示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（c）配列番号２７〜３２または３９〜４４のいずれか1つで示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの成熟形態；
（d）（a）（b）または（c）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに対して、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
（e）（b）のポリペプチドに対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド。
請求項１記載の少なくとも1つのポリペプチドの免疫学的有効量を含む免疫原性組成物。
請求項１記載のポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体。
個体の免疫系を刺激して、インフルエンザウイルスに対する防御免疫応答を生じさせるための方法であって、生理学的に許容される担体中に含めた請求項１記載のポリペプチドの免疫学的有効量を個体に投与するステップを含む方法。
請求項１記載のポリペプチドを含む組換えインフルエンザウイルス。
請求項５記載の組換えインフルエンザウイルスの免疫学的有効量を含む免疫原性組成物。
個体の免疫系を刺激して、インフルエンザウイルスに対する防御免疫応答を生じさせるための方法であって、生理学的に許容される担体中に含めた請求項５記載の組換えインフルエンザウイルスの免疫学的有効量を個体に投与するステップを含む方法。
以下の（a）〜（d）からなる群から選択される、単離されたポリヌクレオチド：
（a）配列番号２１〜２６または３３〜３８または４５のいずれか1つで示されるヌクレオチド配列、またはその相補配列、を含むポリヌクレオチド；
（b）配列番号２７〜３２または３９〜４４のいずれか1つで示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはその相補ヌクレオチド配列、を含むポリヌクレオチド；
（c）（a）のポリヌクレオチドの実質的に全長にわたって、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
（d）（a）のポリヌクレオチドに対して少なくとも98％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
請求項８記載の少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む免疫原性組成物。
請求項８記載の少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む細胞。
請求項８記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、またはウイルスの断片である、請求項１１記載のベクター。
発現ベクターである、請求項１２記載のベクター。
請求項１３記載のベクターを含む細胞。
請求項８記載の1つ以上のポリヌクレオチドを含むインフルエンザウイルス。
再集合ウイルス（reassortant virus）である、請求項１５記載のウイルス。
A/Ann Arbor/6/60由来の6つの内部ゲノムセグメント、ならびに配列番号２７〜３２および３９〜４４のポリペプチドからなる群から選択されるHAおよび／またはNAポリペプチドをコードする2つのゲノムセグメントを含む、6:2再集合インフルエンザウイルス。
再集合インフルエンザウイルスの製造方法であって、請求項１４記載の細胞を、前記ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で、好適な培養培地中で培養するステップ；および、該細胞を含む細胞集団または該培地から再集合インフルエンザウイルスを単離するステップを含む方法。
請求項１７記載の再集合インフルエンザウイルスの免疫学的有効量を含む免疫原性組成物。
個体の免疫系を刺激して、インフルエンザウイルスに対する防御免疫応答を生じさせるための方法であって、生理学的に有効な担体中に含めた請求項１７記載の再集合インフルエンザウイルスの免疫学的有効量を個体に投与するステップを含む方法。
単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドの製造方法であって、請求項１０記載の細胞を、前記ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で、好適な培養培地中で培養するステップ；および、該細胞または該培地からポリペプチドを単離するステップを含む方法。
被験体のウイルス感染を予防的または治療的に処置する方法であって、ウイルス感染に対する免疫原性応答を生じさせるために有効な量の請求項１７記載のウイルスを被験体に投与するステップを含む方法。
被験体がヒトである、請求項２２記載の方法。
赤血球凝集素が、改変された多塩基性切断部位を含む、請求項１９記載の免疫原性組成物。
請求項１９記載の組成物を含む弱毒化生インフルエンザワクチン。
請求項１９記載の組成物を含むスプリット・ウイルスまたは死滅ウイルスワクチン。
請求項２４記載の組成物を含む弱毒化生インフルエンザワクチン。
請求項２４記載の組成物を含むスプリット・ウイルスまたは死滅ウイルスワクチン。
細胞培養においてインフルエンザウイルスを製造する方法であって、以下のステップを含む方法：
（i） A/Ann Arbor/6/60の少なくとも6つの内部ゲノムセグメント、ならびに配列番号２７〜３２および３９〜４４のポリペプチドからなる群から選択されるHAおよび／またはNAポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも1つのゲノムセグメント、に対応するヌクレオチド配列を含む複数のベクターを、インフルエンザウイルスの複製を支持可能な宿主細胞集団に導入するステップ；
（ii） 35℃より低いか、または35℃に等しい温度でその宿主細胞集団を培養するステップ；および
（iii）インフルエンザウイルスを回収するステップ。
HAおよび／またはNAポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、以下の（a）〜（d）からなる群から選択される、請求項２９記載の方法：
（a）配列番号２１、２３〜２６または３３〜３８または４５のいずれか1つのヌクレオチド配列、またはその相補ヌクレオチド配列、を含むポリヌクレオチド；
（b）配列番号２７〜３２または３９〜４４のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはその相補ヌクレオチド配列、を含むポリヌクレオチド；
（c）（a）のポリヌクレオチドの実質的に全長にわたって、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
（d）（a）のポリヌクレオチドに対して少なくとも98％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
請求項２９記載の方法によって製造されるインフルエンザウイルスの免疫学的有効量を含む免疫原性組成物。
請求項３０記載の方法によって製造されるインフルエンザウイルスの免疫学的有効量を含む免疫原性組成物。
個体の免疫系を刺激して、インフルエンザウイルスに対する防御免疫応答を生じさせるための方法であって、生理学的に有効な担体中に含めた、請求項２９記載の方法によって製造されるインフルエンザウイルスの免疫学的有効量を個体に投与するステップを含む方法。
個体の免疫系を刺激して、インフルエンザウイルスに対する防御免疫応答を生じさせるための方法であって、生理学的に有効な担体中に含めた、請求項３０記載の方法によって製造されるインフルエンザウイルスの免疫学的有効量を個体に投与するステップを含む方法。
個体の免疫系を刺激して、インフルエンザウイルスに対する防御免疫応答を生じさせるための方法であって、請求項３１記載の免疫原性組成物を個体に投与するステップを含む方法。
個体の免疫系を刺激して、インフルエンザウイルスに対する防御免疫応答を生じさせるための方法であって、請求項３２記載の免疫原性組成物を個体に投与するステップを含む方法。
請求項３１記載の免疫原性組成物を含む弱毒化生インフルエンザワクチン。
請求項３２記載の免疫原性組成物を含むスプリット・ウイルスまたは死滅ウイルスワクチン。
A/Ann Arbor/6/60以外の1種以上のドナーウイルス由来の6つの内部ゲノムセグメント、ならびに配列番号２７〜３２および３９〜４４のポリペプチドからなる群から選択されるHAおよび／またはNAポリペプチドをコードする2つのゲノムセグメントを含む、6:2再集合インフルエンザウイルス。
ドナーウイルスが、以下の表現型：温度感受性、低温適応、または弱毒化のうち1種以上を含む、請求項３９記載の6:2再集合インフルエンザウイルス。
ドナーウイルスがPR8である、請求項３９記載の6:2再集合インフルエンザウイルス。
ドナーウイルスがA/Leningrad/17である、請求項３９記載の6:2再集合インフルエンザウイルス。
請求項３９記載の再集合インフルエンザウイルスの免疫学的有効量を含む免疫原性組成物。
請求項４０記載の再集合インフルエンザウイルスの免疫学的有効量を含む免疫原性組成物。
請求項４１記載の再集合インフルエンザウイルスの免疫学的有効量を含む免疫原性組成物。
請求項４２記載の再集合インフルエンザウイルスの免疫学的有効量を含む免疫原性組成物。
個体の免疫系を刺激して、インフルエンザウイルスに対する防御免疫応答を生じさせるための方法であって、生理学的に有効な担体中に含めた請求項３９記載の再集合インフルエンザウイルスの免疫学的有効量を個体に投与するステップを含む方法。
個体の免疫系を刺激して、インフルエンザウイルスに対する防御免疫応答を生じさせるための方法であって、生理学的に有効な担体中に含めた請求項４０記載の再集合インフルエンザウイルスの免疫学的有効量を個体に投与するステップを含む方法。
個体の免疫系を刺激して、インフルエンザウイルスに対する防御免疫応答を生じさせるための方法であって、生理学的に有効な担体中に含めた請求項４１記載の再集合インフルエンザウイルスの免疫学的有効量を個体に投与するステップを含む方法。
個体の免疫系を刺激して、インフルエンザウイルスに対する防御免疫応答を生じさせるための方法であって、生理学的に有効な担体中に含めた請求項４２記載の再集合インフルエンザウイルスの免疫学的有効量を個体に投与するステップを含む方法。
被験体のウイルス感染を予防的または治療的に処置する方法であって、ウイルス感染に対する免疫原性応答を生じさせるために有効な量の請求項３９記載のウイルスを被験体に投与するステップを含む方法。
被験体のウイルス感染を予防的または治療的に処置する方法であって、ウイルス感染に対する免疫原性応答を生じさせるために有効な量の請求項４１記載のウイルスを被験体に投与するステップを含む方法。
被験体のウイルス感染を予防的または治療的に処置する方法であって、ウイルス感染に対する免疫原性応答を生じさせるために有効な量の請求項４２記載のウイルスを被験体に投与するステップを含む方法。
前記ウイルスが死滅しているか、または不活性化されている、請求項５１記載の方法。
前記ウイルスが死滅しているか、または不活性化されている、請求項５２記載の方法。
前記ウイルスが死滅しているか、または不活性化されている、請求項５３記載の方法。
赤血球凝集素が、改変された多塩基性切断部位を含む、請求項４３記載の免疫原性組成物。
赤血球凝集素が、改変された多塩基性切断部位を含む、請求項４４記載の免疫原性組成物。
赤血球凝集素が、改変された多塩基性切断部位を含む、請求項４５記載の免疫原性組成物。
赤血球凝集素が、改変された多塩基性切断部位を含む、請求項４６記載の免疫原性組成物。
被験体がヒトである、請求項４７記載の方法。
被験体がヒトである、請求項４８記載の方法。
被験体がヒトである、請求項４９記載の方法。
請求項４５記載の組成物を含む弱毒化生インフルエンザワクチン。
請求項４６記載の組成物を含む弱毒化生インフルエンザワクチン。
細胞培養においてインフルエンザウイルスを製造する方法であって、以下のステップを含む方法：
（i）以下の（a）または（b）に対応するヌクレオチド配列を含む複数のベクターを、インフルエンザウイルスの複製を支持可能な宿主細胞集団に導入するステップ：
（a） A/Ann Arbor/6/60ではない第一のインフルエンザ株の少なくとも6つの内部ゲノムセグメント、ならびに配列番号２７〜３２および３９〜４４のポリペプチドからなる群から選択されるHAまたはNAポリペプチドをコードする少なくとも1つのゲノムセグメント；または
（b） A/Ann Arbor/6/60ではなく弱毒化、低温適応および温度感受性からなる群から選択される1種以上の表現型特性を含む第一のインフルエンザ株の、少なくとも6つの内部ゲノムセグメント、ならびに配列番号２７〜３２および３９〜４４のポリペプチドからなる群から選択されるHAまたはNAポリペプチドをコードする少なくとも1つのゲノムセグメント；
（ii） 35℃より低いか、または35℃に等しい温度でその宿主細胞集団を培養するステップ；および
（iii）インフルエンザウイルスを回収するステップ。
請求項６６記載の方法によって製造されるインフルエンザウイルスの免疫学的有効量を含む免疫原性組成物。
個体の免疫系を刺激して、インフルエンザウイルスに対する防御免疫応答を生じさせるための方法であって、生理学的に有効な担体中に含めた、請求項６６記載の方法によって製造されるインフルエンザウイルスの免疫学的有効量を個体に投与するステップを含む方法。
個体の免疫系を刺激して、インフルエンザウイルスに対する防御免疫応答を生じさせるための方法であって、請求項６７記載の免疫原性組成物を個体に投与するステップを含む方法。
請求項６７記載の免疫原性組成物を含む弱毒化生インフルエンザワクチン。
請求項６７記載の免疫原性組成物を含むスプリット・ウイルスまたは死滅ウイルスワクチン。