BR112013007946B1 - Composições farmacêuticas e imunogênicas compreendendo polipeptídeos de hemaglutinina - Google Patents
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Abstract
POLIPEPTÍDEOS HEMAGLUTININA, REAGENTES E MÉTODOS RELACIONADOS AOS MESMOS. A presente provê um sistema para análise de interações entre glicanos e contrapartes de interação que se ligam a eles. A presente invenção também provê polipeptídeos HA que se ligam a glicanos de topologia de guarda-chuva e reagentes e métodos relacionados aos mesmos.
Description
[0001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório U.S. No. 61/389.639 depositado em 4 de outubro de 2010, cujos conteúdos em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência.
[0002] A presente invenção foi realizada com apoio do governo sob números de concessão GM57073 e U54 GM62116 concedidos pelo National Institute of Health. O governo dos Estados Unidos tem certos direitos na invenção.
[0003] A gripe tem uma longa história de pandemias, epidemias, ressurgimentos e surtos. A gripe aviária, incluindo a linhagem H5N1, é um patógeno altamente contagioso e potencialmente fatal, mas ele atualmente tem uma habilidade apenas limitada em infectar humanos. No entanto, os vírus da gripe aviária têm historicamente observado acumular mutações que alteram sua especificidade de hospedeiro e permitem que eles infectem humanos prontamente. Na realidade, duas das maiores pandemias de gripe do último século se originaram de vírus da gripe aviária que mudaram sua formação genética para permitir infecção humana.
[0004] Há uma preocupação significante que as linhagens da gripe H5N1, H7N7, N9N2 e H2N2 atuais possam acumular mutações que alterem sua especificidade de hospedeiro e permitam que elas infectem humanos prontamente. Desta maneira, há uma necessidade de avaliar se a proteína HA nessas linhagens pode, na realidade, converter para uma forma que pode infectar humanos prontamente, e uma necessidade adicional de identificar variantes de HA com tal habilidade. Há ainda uma necessidade de compreender as características de proteínas HA geralmente que permitem ou proíbem infecção de diferentes indivíduos, particularmente humanos. Há também uma necessidade de vacinas e estratégias terapêuticas para tratamento eficaz ou retardo de início de doença causada por vírus da gripe.
[0005] Os agentes de ligação da presente invenção com características de ligação de glicano particulares. Em particular, a presente invenção provê agentes de ligação que se ligam a glicanos sialilados tendo uma topologia tipo guarda-chuva. Em algumas modalidades, os agentes de ligação de acordo com a invenção se ligam a glicanos de topologia de guarda-chuva com alta afinidade e/ou especificidade. Em algumas modalidades, agentes de ligação de acordo com a invenção mostram uma preferência de ligação para glicanos de topologia de guarda-chuva comparado com glicanos de topologia de cone. Em algumas modalidades, os agentes de ligação de acordo com a invenção competem com hemaglutinina para ligação a glicanos em receptores de hemaglutinina. Em algumas modalidades, os agentes de ligação de acordo com a invenção competem com hemaglutinina para ligação a glicanos de topologia de guarda-chuva.
[0006] A presente invenção também provê reagentes de diagnóstico e terapêuticos e métodos associados com os agentes de ligação providos, incluindo vacinas.
[0007] A presente invenção compreende particularmente o reconhecimento que variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes do polipeptídeo de HA H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 ou H16) com glicosilação alterada podem mostrar ligação maior (ou menor) a receptores de HA humanos comparado com um polipeptídeo de HA de referência. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de referência é um polipeptídeo de HA de qualquer um dos que seguem:
[0008] A presente invenção também compreende particularmente o reconhecimento que variantes de polipeptídeos de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 ou H16) com alterações na região da alça de HA podem mostrar ligação maior (ou menor) a receptores de HA humanos comparado com um polipeptídeo de HA de referência (incluindo, por exemplo, um polipeptídeo de HA de qualquer uma das SEQ ID NOs: 43-52).
[0009] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende o reconhecimento que variantes do polipeptídeo de HÁ de H5 com glicosilação alterada podem mostrar ligação maior (ou menor) a receptores de HA humanos comparado com um polipeptídeo de HA de referência. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de referência é um polipeptídeo de HA de qualquer um dos que seguem:
[00010] A presente invenção compreende também particularmente o reconhecimento que variantes de polipeptídeo de HA de H5 com alterações na região de alça de HA podem mostrar ligação maior (ou menor) a receptores de HA humanos comparado com um polipeptídeo de HA de referência (incluindo, por exemplo, um polipeptídeo de HA de qualquer uma das SEQ ID NOs: 50, 51 e 53-55).
[00011] Figuras 1A-1C. Alinhamento de sequências exemplares de HA do tipo selvagem. As sequências foram obtidas do banco de dados de sequência do vírus da gripe NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html). H1_Av (SEQ ID NO: 1). H1_Hu1 (SEQ ID NO: 2). H1_Hu2 (SEQ ID NO: 3). H2_Av (SEQ ID NO: 4). H2_Hu (SEQ ID NO: 5). H3_Av (SEQ ID NO: 6). H3_Hu1 (SEQ ID NO: 7). H3_Hu2 (SEQ ID NO: 8). H4_Av (SEQ ID NO: 9). H5_Av1 (SEQ ID NO: 10). H5_Av2 (SEQ ID NO: 11). H6_Av (SEQ ID NO: 12). H7_Av (SEQ ID NO: 13). H8_Av (SEQ ID NO: 14). H9_Av (SEQ ID NO: 15). H10_Av (SEQ ID NO: 16). H11_Av (SEQ ID NO: 17). H12_Av (SEQ ID NO: 18). H13_Av (SEQ ID NO: 19). H14_Av (SEQ ID NO: 20). H15_Av (SEQ ID NO: 21). H16_Av (SEQ ID NO: 22).
[00012] Figuras 2A-B. Alinhamento de sequência de domínio de ligação de glicano de HA. Cinza: aminoácidos conservados envolvidos em ligação a ácido siálico. Vermelho: aminoácidos particulares envolvidos em ligação a motivos Neu5Acα2-3/6Gal. Amarelo: aminoácidos que influenciam posicionamento de Q226 (137, 138) e E190 (186, 228). Verde: aminoácidos envolvidos em ligação a outros monossacarídeos (ou modificações) ligados a motivo Neu5Acα2- 3/6Gal. As sequências para ASI30, APR34, ADU63, ADS97 e Viet04 foram obtidas de suas respectivas estruturas de cristal. As outras sequências foram obtidas da SwissProt (http://us.expasy.org). Abreviações: ADA76, A/duck/Alberta/35/76 (H1N1) (SEQ ID NO: 23); ASI30, A/Swine/Iowa/30 (H1N1) (SEQ ID NO: 24); APR34, A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (SEQ ID NO: 25); ASC18, A/South Carolina/1/18 (H1N1) (SEQ ID NO: 26); AT91, A/Texas/36/91 (H1N1) (SEQ ID NO: 27); ANY18, A/New York/1/18 (H1N1) (SEQ ID NO: 28); ADU63, A/Duck/Ukraine/1/63 (H3N8) (SEQ ID NO: 29); AAI68, A/Aichi/2/68 (H3N2) (SEQ ID NO: 30); AM99, A/Moscow/10/99 (H3N2) (SEQ ID NO: 31); ADS97, A/Duck/Singapore/3/97 (H5N3) (SEQ ID NO: 32); Viet04, A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) (SEQ ID NO: 33).
[00013] Figura 3. Alinhamento de sequência ilustrando subsequências conservadas características de HA de H1. A Figura 3 apresenta o mesmo alinhamento que foi apresentado na Figura 1A, exceto que a Figura 3A indica a presença de uma subsequência conservada adicional. A Figura 3B apresenta o mesmo alinhamento que foi apresentado na Figura 1C, exceto que a Figura 3A indica a presença de uma subsequência conservada adicional.
[00014] Figura 4. Alinhamento de sequência ilustrando subsequências conservadas características de HA de H3. A Figura 4A apresenta o mesmo alinhamento que foi apresentado na Figura 1A, exceto que a Figura 4A indica a presença de uma subsequência conservada adicional. A Figura 4B apresenta o mesmo alinhamento que foi apresentado na Figura 1C, exceto que a Figura 4A indica a presença de uma subsequência conservada adicional
[00015] Figura 5A-1. Alinhamento de sequência ilustrando subsequências conservadas características de HA de H5. As Figuras 5A-1 apresentam o mesmo alinhamento que foi apresentado na Figura 1A, exceto que a Figura 5A-1 indica a presença de uma subsequente conservada adicional.
[00016] As Figuras 5A-2 apresentam o mesmo alinhamento que foi apresentado na Figura 1C, exceto que as Figuras 5A-2 indicam a presença de uma subsequência conservada adicional.
[00017] As Figuras 5B1-B5 apresentam alinhamentos de sequência de HA de H5 adicionais. Consenso (SEQ ID NO: 34); AAL59142 (SEQ ID NO: 35); AAZ29963 (SEQ ID NO: 36); ABA70758 (SEQ ID NO: 37); ABB87042 (SEQ ID NO: 38); ABD14810 (SEQ ID NO: 39); ABD46740 (SEQ ID NO: 40); ABD85144 (SEQ ID NO: 41); e ABE97569 (SEQ ID NO: 42).
[00018] As Figuras 5B-6 mostram linhagens virais H5N1 (HA) de ave adicionais.
[00019] Figura 6. Estrutura principal para compreensão da especificidade de receptor glicano. Glicanos ligados por α2-3 e/ou α2- 6 podem adotar topologias diferentes. De acordo com a presente invenção, a habilidade de um polipeptídeo de HA em se ligar a certas dessas topologias confere a ele a habilidade em mediar infecção de diferentes hospedeiros, por exemplo, humanos. Conforme ilustrado no Painel A desta figura, a presente invenção define duas topologias particularmente relevantes, uma topologia de "cone" e uma topologia de "guarda-chuva". A topologia de cone pode ser adotada por glicanos ligados por α2-3 e/ou α2-6 e é típica de oligossacarídeos curtos ou oligossacarídeos ramificados ligados a um núcleo (embora esta topologia possa ser adotada por certos oligossacarídeos longos). A topologia de guarda-chuva pode ser apenas adoptada por glicanos ligados por α2-6 (presumivelmente devido à pluralidade conformacional alta fornecida pela ligação extra C5-C6 que está presente na ligação α2-6) e é predominantemente adotada por oligossacarídeos longos ou glicanos ramificados com ramificações de oligossacarídeo longas, particularmente contendo o motivo Neu5Acα2-6Galβ1-3/4GlcNac-. Conforme descrito aqui, a habilidade de polipeptídeos de HA em se ligar à topologia de glicano de guarda- chuva confere ligação a receptores humanos e/ou habilidade em mediar infecção de humanos. O Painel B desta Figura mostra especificamente a topologia de α2-3 e α2-6 conforme governado pelos ângulos de torsão glicosídica de motivos de trissacarídeo - Neu5Acα2-3Galβ1-3/4GlcNac e Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAc, respectivamente. Um parâmetro (θ) - ângulo entre átomo C2 de Neu5Ac e átomos C1 dos açúcares Gal e GlcNAc subsequentes nesses motivos de trissacarídeo foi definido para caracterizar a topologia. Superposição do contorno θ e dos mapas conformacionais dos motivos α2-3 e α2-6 mostra que os motivos adotam 100% de topologia tipo cone e os motivos α2-6 mostraram ambas as topologias tipo cone e tipo guarda-chuva (Painel C). Na topologia tipo cone mostrada por α2-3 e α2-6, GlcNAc e açúcares subsequentes são posicionados ao longo de uma região abrangendo um cone. Interações de HA com topologia tipo cone envolvem principalmente contatos de aminoácidos nas posições numeradas (com base na numeração de HA de H3) com Neu5Ac e açúcares Gal. Por outro lado, na topologia tipo guarda-chuva, que é única para α2-6, \ GlcNAc e açúcares subsequentes se dobram em direção ao sítio de ligação de HA (conforme observado em estruturas de co-cristal de α2-6 de HA). Oligossacarídeos de α2-6 mais longos (por exemplo, pelo menos um tetrassacarídeo) favoreceriam esta conformação uma vez que ela é estabilizada por contato van der Waals intra-açúcar entre grupos acetila de GlcNAc e Neu5Ac. Interações de HA com topologia tipo guarda-chuva envolvem contatos de aminoácidos nas posições numeradas (com base na numeração de HA de H3) com GlcNAc e açúcares subsequentes em adição a contatos com Neu5Ac e açúcares Gal. O painel C desta Figura mostra amostragem conformacional de topologias tipo cone e tipo guarda-chuva por α2-3 e α2-6. As seções (A) - (D) mostram os mapas conformacionais (Φ, v) de ligações Neu5Acα2-3Gal, Neu5Acα2-6Gal, Galβ1-3GlcNAc e Galβ1-4GlcNAc, respectivamente. Esses mapas obtidos da GlycoMaps DB (http://www.glycosciences.de/modeling/glycomapsdb/) foram gerados usando ab initio simulações MD usando o campo de força MM3. A distribuição de energia é codificada colorida começando de escuro (representando energia mais alta) para claro apresentando energia menor. As regiões circuladas 1-5 representam valores (Φ, w) observados para os oligossacarídeos de α2-3 e α2-6 nas estruturas de co-cristal HA-glicano. A conformação trans (região circulada 1) de Neu5Acα2-3Gal predomina na bolsa de ligação de HA com a exceção da estrutura de co-cristal de HA de H3N2 A/Aichi/2/68 com α2-3 em que esta conformação é acanhada (região circulada 2). Por outro lado, a conformação cis de Neu5Acα2-6Gal (região circulada 3) predomina em bolsa de ligação de HA. A topologia tipo cone é amostrada por regiões circuladas 1 e 2 e a topologia tipo guarda-chuva é amostrada pela região circulada 3. As seções (E) - (F) mostram amostragem de topologias tipo cone e tipo guarda-chuva por motivos α2-3 e α2-6, respectivamente. As regiões mais escuras nos mapas conformacionais foram usadas como os limites externos para calcular o parâmetro θ (ângulo entre átomo de C2 de Neu5Ac e átomos de C1 de açúcares Gal e GlcNAc subsequentes) para um dado conjunto de valores (Φ, w). Com base no corte de energia, o valor de θ > 110° foi usado para caracterizar topologia tipo cone e θ < 100° foi usado para caracterizar topologia tipo guarda-chuva. Superposição do contorno θ com o mapa de energia conformacional indicou que o motivo α2-3 adota 100% de topologia tipo cone uma vez que ele é energeticamente desfavorável para adotar topologia tipo guarda-chuva. Por outro lado, o motivo α2-6 amostrou ambas as topologias tipo cone e tipo guarda-chuva e esta amostragem foi classificada com base no ângulo w (O-C6-C5-H5) de ligação Neu5Acα2-6Gal.
[00020] Figura 7. Interações de resíduos de HA com topologias de glicano cone vs. guarda-chuva. Análise de co-cristais de HA-glicano revelou que a posição de Neu5Ac com relação ao sítio de ligação de HA é quase invariante. Contatos com Neu5Ac envolvem resíduos altamente conservados tais como F98, S/T136, W153, H183 e L/I194. Contatos com outros açúcares envolvem resíduos diferentes, dependendo de se a ligação com açúcar é α2-3 ou α2-6 e se a topologia do glicano é cone ou guarda-chuva. Por exemplo, na topologia de cone, os contatos principais são com Neu5Ac e com açúcares Gal. E190 e Q226 desempenham papéis particularmente importantes nesta ligação. Esta Figura também ilustra outras posições (por exemplo, 137, 145, 186, 187, 193, 222) que podem participar na ligação a estruturas de cone. Em alguns casos, resíduos diferentes podem fazer contatos diferentes com estruturas de glicano diferentes. O tipo de aminoácido nessas posições pode influenciar a habilidade de um polipeptídeo de HA em se ligar a receptores com padrões de modificação e/ou ramificação diferentes nas estruturas de glicano. Na topologia de guarda-chuva, os contatos são feitos com açúcares além de Neu5Ac e Gal. Esta Figura ilustra resíduos (por exemplo, 137, 145, 156, 159, 186, 187, 189, 190, 192, 193, 196, 222, 225, 226) que podem participar na ligação a estruturas de guarda-chuva. Em alguns casos, resíduos diferentes podem fazer contatos diferentes com estruturas de glicano diferentes. O tipo de aminoácido nessas posições pode influenciar a habilidade de um polipeptídeo de HA em se ligar a receptores com padrões de modificação e/ou ramificação diferentes nas estruturas de glicano. Em algumas modalidades, um resíduo D na posição 190 e/ou um resíduo D na posição 225 contribui para ligação a topologias de guarda-chuva.
[00021] Figura 8. Topologias de cone exemplares. Esta Figura ilustra certas estruturas de glicano exemplares (mas não exaustivas) que adotam topologias de cone.
[00022] Figura 9. Topologias de guarda-chuva exemplares. (A) Certas estruturas de glicano N- e O-ligadas exemplares (mas não exaustivas) que adotam topologias de guarda-chuva. (B) Certas estruturas de glicano O-ligadas exemplares (mas não exaustivas) que adotam topologias de guarda-chuva.
[00023] Figuras 10A-B. Perfil de glicano de células epiteliais brônquicas humanas e células epiteliais colônicas humanas. Para investigar mais a diversidade de glicano nos tecidos respiratórios superiores, glicanos N-ligados foram isolados de HBEs (uma linhagem de célula respiratória superior representativa) e analisados usando MALDI-MS. A expressão predominante de α2-6 em HBEs foi confirmada através de pré-tratamento da amostra com Sialidase S (específica de α2-3) e Sialidase A (clivagens e SA). A expressão predominante de glicanos com topologia de ramificação longa é apoiada por análise de fragmentação TOF-TOF de picos de massa representativos. Para prover uma referência para diversidade de glicano nos tecidos respiratórios superiores, o perfil de glicano N- ligado de células epiteliais colônicas humanas (HT29: uma linhagem de célula do intestino representativa) foi obtido. Esta linhagem de célula foi escolhida porque os vírus H5N1 atuais foram mostrados infectar células do intestino. Controles de pré-tratamento com Sialidase A e S mostraram expressão predominante de glicanos α2-3 nas células HT-29. Além disso, a topologia de glicano de ramificação longa não é tão prevalente quanto observado para HBEs. Desta maneira, adaptação humana da HA de H5N1 envolveria mutações de HA que permitiriam ligação com alta afinidade com os glicanos diversos expressos nos tecidos respiratórios superiores humanos (por exemplo, glicanos de guarda-chuva).
[00024] Figura 11. Mapa conformacional e acessibilidade de solvente de motivos Neu5Acα2-3Gal e Neu5Acα2-6Gal. O Painel A mostra o mapa conformacional de ligação de Neu5Acα2-3Gal. A região circulada 2 é a conformação trans observada nas estruturas de co-cristal APR34_H1_23, ADU63_H3_23 e ADS97_H5_23. A região circulada 1 é a conformação observada na estrutura de co-cristal de AAI68_H3_23. O Painel B mostra o mapa de conformação de Neu5Acα2-6Gal em que a conformação cis (região circulada 3) é observada em todas as estruturas de co-cristal de glicano sialilado por HA-α2-6. O Painel C mostra diferença entre área de superfície acessível por solvente (SASA) (Solvent Acessible Surface Area) de oligossacarídeos sialilados por α2-3 e α2-6 Neu5Ac nas respectivas estruturas de co-cristal de HA-glicano. As barras vermelhas e ciano, respectivamente, indicam que Neu5Ac em glicanos sialilados por α2-6 (vapor positivo) ou α2-3 (valor negativo) faz mais contato com sítio de ligação de glicano. O Painel D mostra diferença entre SASA de NeuAc em glicanos sialilados por α2-3 ligados a H1 de suíno e humano (H1α2-3), H3 de ave e humano (H3α2-3) e de Neu em glicanos sialilados por α2-6 ligados a H1 de suíno e humano (H1 α2-6). A barra negativa para H3α2-3 indica menos contato da HA de H3 com Neu5Acα2-3Gal comparado com aquele de H3 de ave. Ângulos de torção - Φ: C2-C1-O-C3 (para ligação Neu5Acα2-3/6); y: C1-O-C3-H3 (para Neu5Aca2-3Gal) ou C1-O-C6-C5 (para Neu5Aca2-6Gal); ®: O- C6-C5-H5 (para Neu5Aca2-6Gal). Os mapas Φ, y foram obtidos da GlycoMaps DB (http://www.glycosciences.de/modeling/glycomapsdb/) que foram desenvolvidos pelo Dr. Martin Frank e pelo Dr. Claus- Wilhelm von der Lieth (German Cancer Research Institute, Heidelberg, Alemanha). O esquema de coloração de alta energia para baixa energia é de vermelho brilhante a verde brilhante, respectivamente.
[00025] Figuras 12A-B. Tingimento com Lectina de seções de tecido respiratório superior. Um co-tingimento do tecido traqueal com Jacalina (mais claro) e ConA (mais escuro) revela uma ligação preferencial de Jacalina (se liga especificamente a glicanos O-ligados) a células caliciformes na superfície apical da traqueia e ConA (se liga especificamente a glicanos N-ligados) às células epiteliais da traqueia ciliadas. Sem desejar ser limitado por nenhuma teoria particular, é notado que esta constatação sugere que células caliciformes expressam predominantemente glicanos O-ligados enquanto células epiteliais ciliadas expressam predominantemente glicanos N-ligados. Co-tingimento de traqueia com Jacalina e SNA (escuro; se liga especificamente a α2-6) mostra ligação de SNA a ambas as células caliciformes e ciliadas. Por outro lado, co-tingimento de Jacalina (mais claro) e MAL (mais escuro), que se liga especificamente a glicanos sialilados por α2-3, mostra ligação mínima fraca a nenhuma de MAL ao epitélio traqueal pseudoestratificado, mas ligação extensiva às regiões de base do tecido. Juntos, os dados de tingimento de lectina indicaram expressão predominante e distribuição extensiva de glicanos sialilados por α2-6 como uma parte de ambos os glicanos N- ligados e O-ligados, respectivamente, em células ciliadas e caliciformes no lado apical do epitélio traqueal.
[00026] Figura 13. Comparação de RBS de HAs de H5N1 em clades genéticas diferentes. A/Hong Kong/486/97, Clade Genética 0 (HK_486_97_c0) (SEQ ID NO: 76); A/Duck/Hunan/795/02, Clade Genética 2.1.1 (DK_Hunan_795_02_c.2.1.1) (SEQ ID NO: 77); A/Hong Kong/213/03, Clade Genética 1 (Hk_213_03_c1) (SEQ ID NO: 78); A/Vietnam/1194/04, Clade Genética 1 (Viet_1194_04_c1) (SEQ ID NO: 79); A/Vietnam/1203/04, Clade Genética 1 (Viet_1203_04_c1) (SEQ ID NO: 80); A/Indonesia/5/05, Clade Genética 2.1.3 (Ind_5_05_c2.1.3) (SEQ ID NO: 81); A/Anhui/1/05, Clade Genética 2.3.4 (Anhui_1_05_c2.3.4) (SEQ ID NO: 82); A/Egypt/2786- NAMRU3/06, Clade Genética 2.2 (Egypt_2876-N3_06_c2.2) (SEQ ID NO: 83); A/goose/Guiyang/337/06, Clade Genética 4(Go_Guiy_337_06_c4) (SEQ ID NO: 84); A/Egypt/2321-NAMRU3/07, Clade Genética 2.2.1 (Egypt_2321-N3_07_c2.2.1) (SEQ ID NO: 85); A/Egypt/3300-NAMRU3/08, Clade Genética 2.2.1 (Egypt_3300-N3_08_c.2.2.1) (SEQ ID NO: 86); A/common magpie/Hong Kong/5052/07, Clade Genética 2.3.2 (Mag_HK_5052_07_c.2.3.2) (SEQ ID NO: 87); A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008, Clade Genética 7 (Ck_Viet_NCVD-016_08_c7) (SEQ ID NO: 88).
[00027] Figura 14. Adaptado de Stevens e outros, 2008, J. Mol. Biol., 381:1382-94. Viet0304: A/Vietnam/1203/04. Ind505:A/Indonesia/5/05. LS: mutações Q226L e G228S de RBS de HA.
[00028] Figura 15: HAs de Viet0304-LS e Viet0304-RLS (equivalentes a Ind505-LS) foram analisadas de uma maneira dependente da dose na disposição de glicano da requerente compreendida de receptores de ave e humanos representativos. Ambos os mutantes mostraram ligação de α2-6 mínima (sinais de ligação observados apenas na concentração de HA alta), que contrasta com a ligação de α2-6 de alta afinidade compartilhada por HAs adaptadas para humanos.
[00029] Figura 16: Análise dependente da dose de HAs de H5N1 que não têm glicosilação em N158 no contexto de mutação LS. Remoção de glicosilação em N158 no contexto de mutação LS aumentou a afinidade de ligação com receptor humano para a mesma faixa (Kd’ ~20pM) conforme observado para HAs de H1N1 e H2N2 adaptadas para humano. Remoção de glicosilação em N158 no molde de HA de H5 com mutação Q226L sozinha (isto é, sem G228S da mutação LS) mostrou preferência aperfeiçoada para receptores humanos (com relação a receptores de ave), mas diminuiu substancialmente a afinidade de ligação de receptor humano em comparação com mutante LS desglicosilado em N158.
[00030] Figura 17. Comparação de características salientes de RBS entre HA de H2N2 adaptada para humano (Alb6_58) e HA de H5N1 (Viet1203_04). Quatro diferenças em HA de H2N2 comparado com HA de H5N1 incluem: (1) Composição de alça 130 em HA de H2N2 que inclui uma deleção, (2) falta de glicosilação na posição 158 em HA de H2N2, (3) composição de aminoácido da base do RBS envolvendo posições 137, 221, 226 e 228 e (4) composição de aminoácido na parte superior do RBS envolvendo as posições 188, 192 e 193.
[00031] Figura 18. Comparação do RBS dos mutantes de HA de H5 com aquele de HA de H2N2. A1b6_58_H2N2 (SEQ ID NO: 89): A/Albany/6/58 H2N2 HA; Viet1203_04_D (SEQ ID NO: 90): versão modificada de A/Vietnam/1203/04 HA; Viet1203_04_D_H2RBS (SEQ ID NO: 91): mutante de Viet1203_04_D com deleção nas substituições de aminoácido 130 e 13; Viet1203_04_D_H2RBSmin (SEQ ID NO: 92): mutante de Viet1203_04_D com deleção nas substituições 130 e 7; ckEgy_07 (SEQ ID NO: 93): A/chicken/Egypt/R2/2007 H5N1 HA que já tem deleção em 130; ckEgy_07_H2RBS (SEQ ID NO: 94): mutante de ckEgy_07 com 8 substituições; ckViet_08 (SEQ ID NO: 95): A/chicken/Vietnam/NCVD-093/2008 H5N1 HA que já tem mudança em carga nas posições 192 e 193; ckViet_08_H2RBS (SEQ ID NO: 96): mutante de ckViet_08 com deleção nas substituições 130 e 60; ckViet_08H2RBSmin (SEQ ID NO: 97): mutante de ckViet_08 com deleção nas substituições 130 e 6; ckViet_08_H2RBSmin (SEQ ID NO: 98): mutante de ckViet_08 com deleção nas substituições 130 e 4. As posições do resíduo que são substituídas estão em negrito e destacadas. A deleção na alça 130 é mostrada em negrito destacado. Glicosilação em 158 é destacada.
[00032] Figura 19: Análise dependente da dose de mutante de HA de H5N1 (Viet1203_04_D_H2RBS) projetado de maneira que a composição molecular de seu RBS imite aquela de HA de H2N2 adaptada para humano. Este mutante mostra ligação de afinidade alta altamente específica a receptores humanos que é característica de outras HAs adaptadas para humano. A afinidade de ligação deste mutante para receptor humano (6’SLN-LN) é quantificada através de Kd’ ~3 pM que está na mesma faixa que aquela de HAs de H1N1 e H2N2 adaptadas para humano.
[00033] Figura 20: Propriedades de ligação de receptor glicano características de HAs pandêmicas. As HAs de linhagens H1N1 1918 (S1) e H2N2 1958 (S2) e H1N1 2009 (S3) pandêmicas adaptadas para humano mostram ligação de afinidade alta específica a receptores humanos (6’SLN-LN) com ligação de afinidade substancialmente menor mínima (com relação à afinidade de receptor humano) para receptores de ave (3’SLN-LN). Por outro lado, introdução da mutação LS sinal na sequência de HA de H5N1 Viet1203_04 não muda sua preferência de receptor para a ligação de receptor humano vista com as HAs pandêmicas.
[00034] Figura 21. Árvore de filogenia de sequências representativas de subtipos de HA
[00035] Ramificações levando às HAs de clades 1 e 2 são marcadas e coloridas de vermelho e azul, respectivamente. Subtipos intimamente relacionados estão localizados em ramificações próximas umas às outras.
[00036] Figura 22: Características estruturais chave dentro do RBS de HA de H5
[00037] É mostrada na figura a representação em desenho de RBS de Alb6_58 HA (cinza) e Viet0304 (verde) com cadeias laterais de aminoácido que são diferentes entre essas HAs. As quatro características que distinguem RBS de H2 e H5 conforme descrito no texto são destacadas em círculos vermelhos pontilhados.
[00038] Figura 23: Alinhamento de sequência de RBS de HAs de H2 e H5 representativas
[00039] Sequências de HA de linhagem H2N2 pandêmica (A/Albany/6/58 ou Alb58) (SEQ ID NO: 98), isolatos humanos representativos de 1997-2006 (A/Hong Kong/486/97 ou HK_486_97 (SEQ ID NO: 105), A/Hong Kong/213/03 ou HK_213_03 (SEQ ID NO: 104), A/Vietnam/1203/04 ou Viet1203_04 (SEQ ID NO: 103), A/Indonesia/5/05 ou Ind_5_05 (SEQ ID NO: 102), A/Egypt/2786- NAMRU3 ou Egy_2786-N3_06 (SEQ ID NO: 101)) junto com o molde de HA de H5 escolhido (A/chicken/Egypt/R2/07 ou ckEgy_07 (SEQ ID NO: 100)) para introdução de mutação LS (ckEgy_07mutv5.3 (SEQ ID NO: 99)) são alinhadas.
[00040] Figura 24: Propriedades de ligação a receptor glicano de ckEgy_07 e ckEgy_07 carregando mudanças de aminoácido LS
[00041] Ligação de glicano direta dependente da dose de HAs foi realizada em uma plataforma de disposição de glicano compreendendo receptores humanos e de ave representativos. A, HA de ckEgy_07 do tipo selvagem mostra a característica de ligação a receptor de ave específica e de alta afinidade típica de outras HAs de H5N1 do tipo selvagem. B, Introdução das mutações LS nesta HA muda quantitativamente sua especificidade para receptor humano (6’SLN-LN) e substancialmente reduzindo sua ligação ao receptor de ave para um nível mínimo. C, ligação de mutante de ckEgy_07 a receptores humanos fisiológicos expressos predominantemente na superfície apical e seção de tecido traqueal humano. A especificidade e a afinidade de receptor humano a partir do perfil de ligação dependente da dose junto com o tingimento de tecido traqueal humano da HA mutante é tal de maneira que ela pode ser suficiente para conferir transmissão por aerossol do vírus H5N1 carregando esta HA mutante no contexto de outras mudanças requeridas (tal como PB2).
[00042] Figura 25: Análise de efeito de perda de glicosilação na posição 158 no contexto de mutações de LS sobre a ligação do receptor glicano de HA de H5
[00043] A, os mutantes ckEgy_07_LS mostram uma mudança de receptor humano quantitativa que lembra outras HAs pandêmicas. B, a curva de ligação para HA de H1N1 A/California/04/2009 adaptada de estudo anterior (S3) é mostrada para comparação. C, A mutação T160A em mutantes Viet03_04_ALS remove sequon de glicosilação em N158 levando à perda de glicosilação neste sítio. Embora este mutante mostre aperfeiçoamento drástico em ligação a receptor humano, ele retém a maior parte de sua ligação a receptor de ave que não é característico de HA pandêmica e do mutante ckEgy_07_L (no painel superior). D, Mutações de aminoácido LS introduzidas em sequência de HA de Egy_06 que não tem naturalmente glicosilação em 158 também mostram o mesmo perfil de ligação que o mutante Viet03_04_ALS.
[00044] Figura 26: Mudanças de aminoácido adaptativas para humano em sequência de HA de H5N1 que naturalmente adquiriram a característica 2
[00045] HA de H5N1 de ave A/chicken/Vietnam/NCVD-093/2008 já adquiriu mudanças de aminoácido em hélice 190 em que a posição 192 tipicamente compreendendo Thr mutou para Lys e a posição 193 tipicamente compreendendo Lys/Arg mutou para Met. Introdução de mudanças de 6 aminoácidos e uma deleção para se comparar à característica 1 (deleção na alça 130 + A130T) e à característica 3 (S137R/S221P/Q226L/S227G/G228S) resultaram em uma HA mutante que muda quantitativamente sua preferência para receptores humanos mesmo na presença de glicosilação em 158. No entanto, introdução da perda de glicosilação T160A muda junto com LS, sem a alça 130 deleção resulta em redução drástica em ligação a receptores humanos e de ave (dados não mostrados). Desta maneira, para essas HAs de H5N1, a deleção na alça 130 é uma mudança mais crítica do que a perda de glicosilação no contexto de mutação de LS.
[00046] Figura 27. Emergência de características chave em isolatos de H5 de ave e H5N1 de humano recentes
[00047] A, Porcentagem de isolatos de H5N1 de ave e de humano cuja HA adquiriu mudanças de aminoácido para se comparar às características 1 e 4 de RBS de HA de H2 é posta em gráfico como função de ano quando a linhagem foi isolada. Houve um aumento drástico em porcentagem de isolatos tendo essas características chave desde sua emergência inicial em 2007. Análise filogenética das sequências desses isolatos mostrou que elas pertenciam à clade 2.2.1. B, Porcentagem de isolatos de ave e de humano cuja HA adquiriu mudanças de aminoácido para se comparar à característica 2 de RBS de HA de H2. Apenas uma pequena porcentagem de isolatos de H5N1 adquiriu esta característica. Sequências de HA não redundantes de comprimento integral da NCBI Influenza Virus Resource foram alinhadas, e número de ocorrências de cada uma das características foi calculado em um dado ano e expresso como porcentagem. Um total de 227 sequências de H5N1 não redundantes de comprimento integral foi empregado para a análise.
[00048] Figura 28: Nomenclatura expandida de glicanos usados na disposição de glicano
[00049] Neu5Ac: Ácido N-aceti D-neuramínico; Gal: D-galactose; GlcNAc: N-acetil D-glicosamina. α/β: configuração anomérica dos açúcares piranose. Todos os açúcares são ligados através de um espaçador à biotina (-Sp-LC-LC-Biotin conforme descrito em http://www.functionalglycomics.org/static/consortium/resources/resourc ecored5.shtml).
[00050] O Elemento 1 de Sequência de HA é um elemento de sequência correspondendo aproximadamente aos resíduos 97-185 (em que as posições do resíduo são dadas usando HA de H3 como referência) de muitas proteínas HA encontradas em isolatos de gripe naturais. Este elemento de sequência tem a estrutura básica:
[00051] C (Y/F) P Xi C X2 W X3 W X4 H H P (SEQ ID NO.106), em que: X1 é de aproximadamente 30-45 aminoácidos de comprimento; X2 é de aproximadamente 5-20 aminoácidos de comprimento; X3 é de aproximadamente 25-30 aminoácidos de comprimento; e X4 é de aproximadamente 2 aminoácidos de comprimento.
[00052] Em algumas modalidades, X1 é de cerca de 35-45 ou cerca de 35-43 ou cerca de 35, 36, 37, 38, 38, 40, 41, 42 ou 43 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, X2 é de cerca de 9-15 ou cerca de 9-14 ou cerca de 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, X3 é de cerca de 26-28 ou cerca de 26, 27 ou 28 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, X4 tem a sequência (G/A) (I/V). Em algumas modalidades, X4 tem a sequência GI; em algumas modalidades, X4 tem a sequência GV; em algumas modalidades, X4 tem a sequência AI; em algumas modalidades, X4 tem a sequência AV. Em algumas modalidades, o Elemento 1 da Sequência de HA compreende uma ligação dissulfeto. Em algumas modalidades, esta ligação dissulfeto une resíduos correspondendo às posições 97 e 139 (com base no sistema de numeração de H3 canônico utilizado aqui).
[00053] Em algumas modalidades, e particularmente nos polipeptídeos de H1, X1 é de cerca de 43 aminoácidos de comprimento e/ou X2 é de cerca de 13 aminoácidos de comprimento e/ou X3 é de cerca de 26 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, e particularmente nos polipeptídeos de H1, o Elemento 1 da Sequência de HA tem a estrutura:
[00054] C Y P XIA T (A/T) (A/S) C X2 W X3 W X4 H H P (SEQ ID NO.107), em que:
[00055] X1A é de aproximadamente 27-42 ou aproximadamente 3242 ou aproximadamente 32-40 ou aproximadamente 26-41 ou aproximadamente 31-41 ou aproximadamente 31-39 ou aproximadamente 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 aminoácidos de comprimento e X2-X4 são como acima.
[00056] Em algumas modalidades, e particularmente nos polipeptídeos H1, o Elemento 1 de Sequência de HA tem a estrutura:
[00057] C Y P X1A T (A/T) (A/S) C X2 W (I/L) (T/V) X3A W X4 H H P (SEQ ID NO.108), em que:
[00058] X1A é de aproximadamente 27-42 ou aproximadamente 3242 ou aproximadamente 32-40 ou aproximadamente 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 aminoácidos de comprimento.
[00059] X3A é de aproximadamente 23-38 ou aproximadamente 2426 ou aproximadamente 24, 25 ou 26 aminoácidos de comprimento e X2 e X4 são como acima.
[00060] Em algumas modalidades, e particularmente nos polipeptídeos H1, o Elemento 1 de Sequência de HA inclui a sequência:
[00061] Q L S S I S S F E K (SEQ ID NO.109),
[00062] tipicamente dentro de X1 (incluindo dentro de X1A) e especialmente começando mais ou menos no resíduo 12 de X1 (como ilustrado, por exemplo, nas Figuras 1-3).
[00063] Em algumas modalidades, e particularmente nos polipeptídeos H3, X1 é de cerca de 39 aminoácidos de comprimento e/ou X2 é de cerca de 13 aminoácidos de comprimento e/ou X3 é cerca de 26 aminoácidos de comprimento.
[00064] Em algumas modalidades, e particularmente nos polipeptídeos H3, o Elemento 1 da Sequência de HA tem a estrutura:
[00065] C Y P X1A S (S/N) (A/S) C X2 W X3 W X4 H H P (SEQ ID NO.110), em que:
[00066] X1A é de aproximadamente 27-42 ou aproximadamente 3242 ou aproximadamente 32-40 ou aproximadamente 23-38 ou aproximadamente 28-36 ou aproximadamente 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 aminoácidos de comprimento e X2-X4 são como acima.
[00067] Em algumas modalidades, e particularmente nos polipeptídeos H3, o Elemento 1 de Sequência de HA tem a estrutura:
[00068] C Y P X1A S (S/N) (A/S) C X2 W L (T/H) X3A W X4 H H P (SEQ ID NO.111), em que:
[00069] X1A é de aproximadamente 27-42 ou aproximadamente 3224 ou aproximadamente 32-40 ou aproximadamente 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 aminoácidos de comprimento,
[00070] X3A é de aproximadamente 23-28 ou aproximadamente 2426 ou aproximadamente 24, 25 ou 26 aminoácidos de comprimento e X2 e X4 são como acima.
[00071] Em algumas modalidades, e particularmente nos polipeptídeos H3, o Elemento 1 de Sequência de HA inclui a sequência:
[00072] (L/I) (V/I) A S S G T L E F (SEQ ID NO.112),
[00073] tipicamente dentro de X1 (incluindo dentro de X1A) e especialmente começando mais ou menos no resíduo 12 de X1 (conforme ilustrado, por exemplo, nas Figuras 1, 2 e 4).
[00074] Em algumas modalidades, e particularmente nos polipeptídeos H5, X1 é de cerca de 42 aminoácidos de comprimento e/ou X2 é de cerca de 13 aminoácidos de comprimento e/ou X3 é de cerca de 26 aminoácidos de comprimento.
[00075] Em algumas modalidades, e particularmente nos polipeptídeos H5, o Elemento 1 da Sequência de HA tem a estrutura:
[00076] C Y P X1A S S A C X2 W X3 W X4 H H P (SEQ ID NO.113), em que
[00077] X1A é de aproximadamente 27-42 ou aproximadamente 3242 ou aproximadamente 32-40 ou aproximadamente 23-38 ou aproximadamente 28-38 ou aproximadamente 28-36 ou aproximadamente 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 aminoácidos de comprimento e X2-X4 são como acima.
[00078] Em algumas modalidades, e particularmente polipeptídeos H5, o Elemento 1 da Sequência de HA tem a estrutura:
[00079] C Y P X1A S S A C X2 W L I X3A W X4 H H P (SEQ ID NO.114), em que:
[00080] X1A é de aproximadamente 27-42 ou aproximadamente 3242 ou aproximadamente 32-40 ou aproximadamente 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 aminoácidos de comprimento, e
[00081] X3A é de aproximadamente 23-28 ou aproximadamente 2426 ou aproximadamente 24, 25 ou 26 aminoácidos de comprimento e X2 e X4 são como acima.
[00082] Em algumas modalidades, e particularmente nos polipeptídeos H5, o Elemento 1 de Sequência de HA é prolongado (isto é, em uma posição correspondendo aos resíduos 186-193) pela sequência:
[00083] N D A A E X X (K/R) (SEQ ID NO.115)
[00084] Em algumas modalidades, e particularmente nos polipeptídeos H5, o Elemento 1 de Sequência de HA inclui a sequência:
[00085] Y E E L K H L X S X X N H F E K (SEQ ID NO.116),
[00086] tipicamente dentro de X1, e especialmente começando mais ou menos no resíduo 6 de X1 (conforme ilustrado, por exemplo, nas Figuras 1, 2, e 5).
[00087] O Elemento 2 de Sequência de HA é um elemento de sequência correspondendo aproximadamente aos resíduos 324-340 (novamente usando um sistema de numeração baseado em HA de H3) de muitas proteínas de HA encontradas em isolatos de gripe naturais. Este elemento de sequência tem a estrutura básica:
[00088] G A I A G F I E (SEQ ID NO.117)
[00089] Em algumas modalidades, o Elemento 2 de Sequência de HA tem a sequência:
[00090] P X1G A I A G F I E (SEQ ID NO.118), em que:
[00091] X1 é de aproximadamente 4-14 aminoácidos de comprimento ou cerca de 8-12 aminoácidos de comprimento ou cerca de 12, 11, 10, 9 ou 8 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, este elemento de sequência provê o sítio de clivagem HA0, permitindo a produção de HA1 e HA2.
[00092] Em algumas modalidades, e particularmente em polipeptídeos H1, o Elemento 2 de Sequência de HA tem a estrutura:
[00093] P S (I/V) Q S R X1A G A I A G F I E (SEQ ID NO.119), em que:
[00094] X1A é de aproximadamente 3 aminoácidos de comprimento; em algumas modalidades, X1A é G (L/I) F.
[00095] Em algumas modalidades, e particularmente em polipeptídeos H3, o Elemento 2 de Sequência de HA tem a estrutura:
[00096] P X K X T R X1A G A I A G F I E (SEQ ID NO.120), em que:
[00097] X1A é de aproximadamente 3 aminoácidos de comprimento; em algumas modalidades, X1A é G (L/I)F.
[00098] Em algumas modalidades, e particularmente em polipeptídeos H5, o Elemento 2 de Sequência de HA tem a estrutura:
[00099] P Q R X X X R X X R X1A G A I A G F I E (SEQ ID NO.121), em que:
[000100] X1A é de aproximadamente 3 aminoácidos de comprimento; em algumas modalidades, X1A é G (L/I)F.
[000101] Afinidade: Como é conhecido na técnica, "afinidade" é uma medida da firmeza com a qual um ligante (por exemplo, um polipeptídeo de HA) se liga à sua contraparte (por exemplo, um receptor de HA). Afinidades podem ser medidas de maneiras diferentes.
[000102] Ligação: Será compreendido que o termo "ligação", conforme aqui usado, tipicamente se refere a uma associação não covalente entre ou dentre agentes. Em muitas modalidades aqui, ligação é endereçada com relação a glicanos particulares (por exemplo, glicanos de topologia de guarda-chuva ou glicanos de topologia de cone). Será compreendido por aqueles de habilidade comum na técnica que tal ligação pode ser avaliada em qualquer um de uma variedade de contextos. Em algumas modalidades, ligação é avaliada com relação a glicanos livres. Em algumas modalidades, ligação é avaliada com relação a glicanos ligados a (por exemplo, covalentemente ligados a) um carreador. Em algumas tais modalidades, o carreador é um polipeptídeo. Em algumas modalidades, ligação é avaliada com relação a glicanos ligados a um receptor de HA. Em tais modalidades, referência pode ser feita à ligação de receptor ou ligação de glicano.
[000103] Agente de ligação: Em geral, o termo "agente de ligação" é usado aqui para se referir a qualquer entidade que se ligue a glicanos (por exemplo, a glicanos de topologia de guarda-chuva) conforme aqui descrito. Agentes de ligação podem ser de qualquer tipo químico. Em algumas modalidades, agentes de ligação são polipeptídeos (incluindo, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de anticorpo); em algumas tais modalidades, agentes de ligação são polipeptídeos de HA e/ou variantes dos mesmos e/ou porções características dos mesmos; em algumas modalidades, agentes de ligação são polipeptídeos cuja sequência de aminoácido não inclui uma sequência característica de HA (isto é, "Polipeptídeos não HA"). Em algumas modalidades, agentes de ligação são moléculas pequenas. Em algumas modalidades, agentes de ligação são ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, agentes de ligação são aptâmeros. Em algumas modalidades, agentes de ligação são polímeros; em algumas modalidades, agentes de ligação são não poliméricos. Em algumas modalidades, agentes de ligação são carboidratos. Em algumas modalidades, agente de ligação são lectinas. Em algumas modalidades, agentes de ligação conforme aqui descrito se ligam a glicanos sialilados tendo uma topologia tipo guarda-chuva. Em algumas modalidades, agentes de ligação se ligam a glicanos de topologia de guarda-chuva com alta afinidade e/ou especificidade. Em algumas modalidades, os agentes de ligação mostram uma preferência de ligação a glicanos de topologia de guarda-chuva comparado com glicanos de topologia de cone. Em algumas modalidades, os agentes de ligação competem com hemaglutinina para ligação a glicanos em receptores de hemaglutinina. Em algumas modalidades, os agentes de ligação competem com hemaglutinina para ligação a glicanos de topologia de guarda-chuva. Em algumas modalidades, um agente de ligação provido aqui é um agente de bloqueio de topologia de guarda-chuva. Em algumas modalidades, um agente de ligação provido aqui é um agente de bloqueio específico de topologia de guarda-chuva. Em algumas modalidades, os agentes de ligação se ligam a miméticos de glicano de topologia de guarda-chuva.
[000104] Biologicamente ativo: Conforme aqui usado, a expressão "biologicamente ativo" se refere a uma característica de qualquer agente que tenha atividade em um sistema biológico, e particularmente em um organismo. Por exemplo, um agente que, quando administrado a um organismo, tem um efeito biológico sobre este organismo, é considerado ser biologicamente ativo. Em algumas modalidades, em que uma proteína ou polipeptídeo é biologicamente ativo, uma porção desta proteína ou polipeptídeo que compartilha pelo menos uma atividade biológica da proteína ou polipeptídeo é tipicamente referida como porção "biologicamente ativa".
[000105] Porção característica: Conforme aqui usado, a expressão "porção característica" de uma proteína ou polipeptídeo é uma que contém uma extensão contínua de aminoácidos, ou uma coleção de extensões contínuas de aminoácidos, que juntas são características de uma proteína ou polipeptídeo. Cada tal extensão contínua geralmente vai conter pelo menos dois aminoácido. Ainda, aqueles de habilidade comum na técnica vão compreender que tipicamente pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20 ou mais aminoácidos são requeridos para serem característicos de uma proteína. Em geral, uma porção característica é uma que, em adição à identidade de sequência especificada acima, compartilha pelo menos uma característica funcional com a proteína intacta relevante.
[000106] Sequência característica: Uma "sequência característica" é uma sequência que é encontrada em todos os membros de uma família de polipeptídeos ou ácidos nucleicos e, então, pode ser usada por aqueles de habilidade comum na técnica para definir membros da família.
[000107] Topologia de cone: A expressão "topologia de cone" é usada aqui para se referir a uma disposição 3-dimensional adotada por certos glicanos e em particular por glicanos em receptores de HA. Conforme ilustrado na Figura 6, a topologia de cone pode ser adotada por glicanos sialilados por α2-3 ou por glicanos sialilados por α2-6, e é típica de cadeias de oligonucleotídeo curtas, embora alguns oligonucleotídeos longos também adotem esta conformação. A topologia de cone é caracterizada pelos ângulos de torsão glicosídicos de ligação de Neu5Acα2-3Gal que apresentam três regiões de conformações de energia mínima dadas por valor Φ (C1-C2-O-C3/C6) de cerca de -60, cerca de 60 ou cerca de 180 e y (C2-O-C3/C6-H3/C5) apresenta -60 a 60 (Figura 11). A Figura 8 apresenta certos exemplos representativos (embora não exaustiva) de glicanos que adotam uma topologia de cone.
[000108] Correspondendo a: Conforme aqui usado, o termo "correspondendo a" é frequentemente usado para designar a posição/identidade de um resíduo de aminoácido em um polipeptídeo de HA. Aqueles de habilidade comum vão compreender que, por questão de simplicidade, um sistema de numeração canônico (com base na HA de H3 do tipo selvagem) é utilizado aqui (conforme ilustrado, por exemplo, nas Figuras 1-5), de maneira que um aminoácido "correspondendo a" um resíduo na posição 190, por exemplo, não precisa ser realmente o 190° aminoácido em uma cadeia de aminoácido particular, mas ao contrário corresponde ao resíduo encontrado em 190 na HA de H3 do tipo selvagem; aqueles versados na técnica vão compreender prontamente como identificar aminoácidos correspondentes.
[000109] Grau de separação removido: Conforme aqui usado, aminoácidos que são um "grau de separação removido" são aminoácidos de HA que têm efeitos indiretos sobre ligação de glicano. Por exemplo, aminoácidos de um grau-de-separação-removido podem ou: (1) interagir com os aminoácidos de ligação direta; e/ou (2) de outra maneira afetar a habilidade de aminoácidos de ligação direta em interagir com glicano que está associado com receptores de HA de célula hospedeiro; tais aminoácidos de um-grau-de-separação- removido podem ou não se ligar diretamente aos próprios glicanos. Aminoácidos de dois-graus-de-separação-removidos ou (1) interagem com aminoácidos de um-grau-de-separação-removido; e/ou (2) de outra maneira afetam a habilidade dos aminoácidos de um-grau-de- separação-removido em interagir com aminoácidos de ligação direta, etc.
[000110] Aminoácidos de ligação direta: Conforme aqui usado, a expressão "aminoácidos de ligação direta" se refere a aminoácidos de polipeptídeo de HA que interagem diretamente com um ou mais glicanos que estão associados com receptores de HA de célula hospedeiro.
[000111] Engenheirado: O termo "engenheirado", conforme aqui usado, descreve um polipeptídeo cuja sequência de aminoácido foi selecionada pelo homem. Por exemplo, um polipeptídeo de HA engenheirado tem uma sequência de aminoácido que difere das sequências de aminoácido de polipeptídeos de HA encontrados em isolatos de gripe naturais. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA engenheirado tem uma sequência de aminoácido que difere da sequência de aminoácido de polipeptídeos de HA incluídos no banco de dados NCBI.
[000112] Polipeptídeo de H1: Um "polipeptídeo de H1", como este termo é usado aqui, é um polipeptídeo de HA cuja sequência de aminoácido inclui pelo menos um elemento de sequência que é característico de H1 e distingue H1 de outros subtipos de HA. Representativo de tais elementos de sequência podem ser determinados através de alinhamentos tais como, por exemplo, aqueles ilustrados nas Figuras 1-3 e incluem, por exemplo, aqueles descritos aqui com relação às modalidades específicas de H1 de Elementos de Sequência de HA.
[000113] Polipeptídeo de H3: Um "polipeptídeo de H3", como este termo é usado aqui, é um polipeptídeo de HA cuja sequência de aminoácido inclui pelo menos um elemento de sequência que é característico de H3 e distingue H3 de outros subtipos de HA. Representativo de tais elementos de sequência pode ser determinado por alinhamentos tais como, por exemplo, aqueles ilustrados nas Figuras 1, 2 e 4 e incluem, por exemplo, aqueles descritos aqui com relação a modalidades específicas de H3 de Elementos de Sequência de HA.
[000114] Polipeptídeo de H5: Um "polipeptídeo de H5", como o termo é usado aqui, é um polipeptídeo de HA cuja sequência de aminoácido inclui pelo menos um elemento de sequência que é característico de H5 e distingue H5 de outro subtipo de H5. Representativo de tais elementos de sequência pode ser determinado por alinhamentos tais como, por exemplo, aqueles ilustrados nas Figuras 1, 2 e 5 e incluem, por exemplo, aqueles descritos aqui com relação a modalidades específicas de H5 de Elementos de Sequência de HA.
[000115] Polipeptídeo de HX: Um "polipeptídeo de HX", como o termo usado aqui, é um polipeptídeo de HA cuja sequência de aminoácido inclui pelo menos um elemento de sequência que é característico de HX e distingue HX de outros subtipos de HA, em que "X" se refere à numeração do subtipo de HA (por exemplo, em que "X" = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, "HX" = H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 ou H16, respectivamente).
[000116] Polipeptídeo de hemaglutinina (HA): Conforme aqui usado, o termo "polipeptídeo de hemaglutinina" (ou "polipeptídeo de HA") se refere a um polipeptídeo cuja sequência de aminoácido inclui pelo menos uma sequência característica de HA. Uma ampla variedade de sequências de HA de isolatos de gripe é conhecida na técnica; na verdade, o National Center for Biotechnology Information (NCBI) mantém um banco de dados (www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/flu.html) que, na data de depósito do presente pedido, incluía 9796 sequências de HA. Aqueles de habilidade comum na técnica, com referência a este banco de dados, podem prontamente identificar sequências que são características de polipeptídeos de HA geralmente, e/ou de polipeptídeos de HA particulares (por exemplo, polipeptídeos H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 ou H16); ou de HAs que fazem a mediação de infecção de hospedeiros particulares, por exemplo, ave, camelo, canino, gato, civeta, ambiente, equino, humano, leopardo, marta, camundongo, foca, marta stone marten, suíno, tigre, baleia, etc. Por exemplo, em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA inclui um ou mais elementos de sequência característicos encontrados entre mais ou menos os resíduos 97 e cerca de 185, cerca de 324 e cerca de 240, cerca de 96 e cerca de 100 e/ou cerca de 130 e cerca de 230 de uma proteína HA encontrada em um isolato natural de um vírus da gripe. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA tem uma sequência de aminoácido compreendendo pelo menos um de Elementos 1 e 2 de Sequência de HA, conforme aqui definido. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA tem uma sequência de aminoácido compreendendo os Elementos 1 e 2 de Sequência de HA, em algumas modalidades separados um do outro por cerca de 100 a cerca de 200 ou por cerca de 125 a cerca de 175 ou cerca de 125 a cerca de 160 ou cerca de 125 a cerca de 150 ou cerca de 129 a cerca de 139 ou cerca de 129, cerca de 130, cerca de 131, cerca de 132, cerca de 133, cerca de 134, cerca de 135, cerca de 136, cerca de 137, cerca de 138 ou cerca de 139 aminoácidos. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA tem uma sequência de aminoácido que inclui resíduos nas posições dentro das regiões 96-100 e/ou 130-230 que participam na ligação de glicano. Por exemplo, muitos dos polipeptídeos de HA incluem um ou mais dos resíduos que seguem: Tyr98, Ser/Thr136, Trp153, His183 e Leu/Ile194. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA inclui pelo menos 2, 3, 4 ou 5 desses resíduos.
[000117] Isolado: O termo "isolado", conforme aqui usado, se refere a um agente ou entidade que foi (i) separado de pelo menos alguns dos componentes com os quais ele está associado quando inicialmente produzido (seja na natureza ou em um ambiente experimental); ou (ii) produzido pela mão do homem. Agentes ou entidades isolados podem ser separados de pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou mais dos outros componentes com os quais eles foram inicialmente associados. Em algumas modalidades, agentes isolados são mais do que 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% puros.
[000118] Agente de Bloqueio Específico de Ligação (LSBA) (Linkage Specific Blocking Agent): Conforme aqui usado, o termo "agente de bloqueio específico de ligação" se refere a um agente que se liga a um receptor de HA tendo um glicano sialilado por α2-6. Em algumas modalidades, um LSBA se liga seletivamente a um receptor de HA tendo um glicano sialilado por α2-6 com pelo menos cerca de 40, 50 ou 75% da afinidade daquela para um receptor de HA tendo um glicano sialilado por α2-3. Em algumas modalidades, um LSBA se liga seletivamente a um receptor de HA tendo um glicano sialilado por α2-6 com afinidade pelo menos cerca de 2, 4, 5 ou 10 vezes maior do que aquela para um receptor de HA tendo um glicano sialilado por α2-3. Em algumas modalidades, um LSBA tem uma afinidade para um glicano sialilado por α2-6 que é pelo menos 50, 100, 150 ou 200% de sua afinidade para um glicano sialilado por α2-3. Em algumas modalidades, um LSBA pode competir com hemaglutinina para ligação a um receptor de HA. Por exemplo, um LSBA pode seletivamente inibir a ligação de uma partícula de vírus da gripe (por exemplo, vírus da gripe humano ou aviário) a um receptor de HA com base nas características de ligação (por exemplo, glicano sialilado por α2-6 ou glicano sialilado por α2-3). Em algumas modalidades, um LSBA é um polipeptídeo. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de LSBA tem uma sequência de aminoácido que é substancialmente idêntica ou substancialmente homóloga àquela de um polipeptídeo de ocorrência natural. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de LSBA é um polipeptídeo de HA. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de LSBA é um polipeptídeo de HA de ocorrência natural ou um fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de LSBA tem uma sequência de aminoácido que não é relacionada com aquela de um polipeptídeo de HA. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de LSBA é um anticorpo ou fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de LSBA é uma lectina (por exemplo, SNA-1). Em algumas modalidades, um LSBA não é um polipeptídeo. Em algumas modalidades, um LSBA é uma molécula pequena. Em algumas modalidades, um LSBA é um ácido nucleico.
[000119] Oligossacarídeo longo: Para propósitos da presente descrição, um oligossacarídeo é tipicamente considerado ser "longo" se ele incluir pelo menos uma cadeia linear que tem pelo menos quatro resíduos de sacarídeo.
[000120] Aminoácido não natural: A expressão "aminoácido não natural" se refere a uma entidade tendo a estrutura química de um aminoácido (isto é:
[000121] e então sendo capaz de participar em pelo menos duas ligações de peptídeo, mas tendo um grupo R que difere daqueles encontrados na natureza. Em algumas modalidades, aminoácidos não naturais podem também ter um segundo grupo R ao invés de um hidrogênio e/ou podem ter uma ou mais outras substituições nas porções amino ou ácido carboxílico.
[000122] Polipeptídeo: Um "polipeptídeo", falando de um modo geral, é um cordão de pelo menos dois aminoácidos ligados uns aos outros por uma ligação peptídeo. Em algumas modalidades, um polipeptídeo pode incluir pelo menos 3-5 aminoácidos, cada um deles é ligado a outros por meio de pelo menos uma ligação peptídeo. Aqueles de habilidade comum na técnica vão compreender que polipeptídeos algumas vezes incluem aminoácidos "não naturais" ou outras entidades que, não obstante, são capazes de integrar a cadeia de um polipeptídeo, opcionalmente.
[000123] Puro: Conforme aqui usado, um agente ou entidade é "puro" se ele for substancialmente livre de outros componentes. Por exemplo, uma preparação que contém mais do que cerca de 90% de um agente ou entidade particular é tipicamente considerada ser uma preparação pura. Em algumas modalidades, um agente ou entidade é pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% puro.
[000124] Oligossacarídeo curto: Para propósitos da presente descrição, um oligossacarídeo é tipicamente considerado ser "curto" se ele tiver menos do que 4, ou certamente menos do que 3, resíduos em qualquer cadeia linear.
[000125] Especificidade: Como é conhecido na técnica, "especificidade" é uma medida da habilidade de um ligante particular (por exemplo, um polipeptídeo de HA) em distinguir sua contraparte de ligação (por exemplo, um receptor de HA humano e particularmente um receptor de HA de trato respiratório superior humano) de outras contra- partes de ligação potenciais (por exemplo, um receptor de HA de ave).
[000126] Homologia substancial: A expressão "homologia substancial" é usada aqui para se referir a uma comparação entre sequências de aminoácido ou ácido nucleico. Como será compreendido por aqueles de habilidade comum na técnica, duas sequências são geralmente consideradas ser "substancialmente homólogas" se elas contiverem resíduos homólogos em posições correspondentes. Resíduos homólogos podem ser resíduos idênticos. Alternativamente, resíduos homólogos podem ser resíduos não idênticos com características estruturais e/ou funcionais apropriadamente similares. Por exemplo, como é bem conhecido daqueles de habilidade comum na técnica, certos aminoácidos são tipicamente classificados como aminoácidos "hidrofóbicos" ou "hidrofílicos" e/ou como tendo cadeias laterais "polares" ou "não polares". Substituição de um aminoácido por outro do mesmo tipo pode ser frequentemente considerada uma substituição "homóloga". Categorizações de aminoácido típicas são sumarizadas abaixo: Alanina Ala A não polar neutro 1,8 Arginina Arg R polar positivo -4,5 Asparagina Asn N polar neutro -3,5 Ácido aspártico Asp D polar negativo -3,5 Cisteina Cys C não polar neutro 2,5 Ácido glutâmico Glu E polar negativo -3,5 Glutamina Gln Q polar neutro -3,5 Glicina Gli G não polar neutro -0,4 Histidina His H polar positivo -3,2 Isoleucina Ile I não polar neutro 4,5 Leucina Leu L não polar neutro 3,8 Lisina Lis K polar positivo -3,9 Metionina Met M não polar neutro 1,9 Fenilalanina Phe F não polar neutro 2,8 Prolina Pro P não polar neutro -1,6 Serina Ser S polar neutro -0,8 Treonina Tr T polar neutro -0,7 Triptofano Trp W não polar neutro -0,9 Tirosina Tyr Y polar neutro -1,3 Valina Val V não polar neutro 4,2 Aminoácidos Ambíguos 3-Letras 1-Letra Asparagina ou ácido aspártico Asx B Glutamina ou ácido glutâmico Glx Z Leucina or Isoleucina Xle J Aminoácido não especificado ou Xaa X desconhecido
[000127] Como é bem conhecido na presente técnica, sequências de aminoácido ou ácido nucleico podem ser comparadas usando qualquer um de uma variedade de algoritmos, incluindo aqueles disponíveis em programas de computador comerciais tais como BLASTN para sequências de nucleotídeo e BLASTP, BLAST com lacuna e PSI-BLAST para sequências de aminoácido. Exemplos de tais programas são descritos em Altschul e outros, Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul e outros, Methods in Enzymology; Altschul e outros, "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis e outros, Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; e Misener e outros, (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999; todos acima aqui incorporados a título de referência. Em adição à identificação de sequências homólogas, os programas mencionados acima tipicamente proveem uma indicação do grau de homologia. Em algumas modalidades, duas sequências são consideradas ser substancialmente homólogas se pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de seus resíduos correspondentes forem homólogos em uma extensão relevante de resíduos. Em algumas modalidades, a extensão relevante é uma sequência completa. Em algumas modalidades, a extensão relevante é de pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 35, pelo menos 40, pelo menos 45, pelo menos 50, pelo menos 55, pelo menos 60, pelo menos 65, pelo menos 70, pelo menos 75, pelo menos 80, pelo menos 85, pelo menos 90, pelo menos 95, pelo menos 100, pelo menos 125, pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 225, pelo menos 250, pelo menos 275, pelo menos 300, pelo menos 325, pelo menos 350, pelo menos 375, pelo menos 400, pelo menos 425, pelo menos 450, pelo menos 475, pelo menos 500 ou mais resíduos.
[000128] Identidade substancial: A expressão "identidade substancial" é usada aqui para se referir a uma comparação entre sequências de aminoácido ou ácido nucleico. Como será compreendido por aqueles de habilidade comum na técnica, duas sequências são geralmente consideradas ser "substancialmente idênticas" se elas contiverem resíduos idênticos em posições correspondentes. Como é bem conhecido na presente técnica, sequências de aminoácido ou ácido nucleico podem ser comparadas usando qualquer um de uma variedade de algoritmos, incluindo aqueles disponíveis em programas de computador comerciais tal como BLASTN para sequências de nucleotídeo e BLASTP, BLAST com lacuna e PSI-BLAST para sequências de aminoácido. Exemplos de tais programas são descritos em Altschul e outros, Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul e outros, Methods in Enzymology; Altschul e outros, "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis e outros, Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener e outros, (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999; todos acima são aqui incorporados a título de referência. Em adição à identificação de sequências idênticas, os programas mencionados acima tipicamente proveem uma indicação do grau de identidade. Em algumas modalidades, duas sequências são consideradas substancialmente idênticas se pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de seus resíduos correspondentes forem idênticos em uma extensão relevante de resíduos. Em algumas modalidades, a extensão relevante é uma sequência completa. Em algumas modalidades, a extensão relevante é pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 35, pelo menos 40, pelo menos 45, pelo menos 50, pelo menos 55, pelo menos 60, pelo menos 65, pelo menos 70, pelo menos 75, pelo menos 80, pelo menos 85, pelo menos 90, pelo menos 95, pelo menos 100, pelo menos 125, pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 225, pelo menos 250, pelo menos 275, pelo menos 300, pelo menos 325, pelo menos 350, pelo menos 375, pelo menos 400, pelo menos 425, pelo menos 450, pelo menos 475, pelo menos 500 ou mais resíduos.
[000129] Agente terapêutico: Conforme aqui usado, a expressão "agente terapêutico" se refere a qualquer agente que elicite um efeito biológico ou farmacológico desejado.
[000130] Tratamento: Conforme aqui usado, o termo "tratamento" se refere a qualquer método usado para aliviar, retardar o início, reduzir a severidade ou incidência ou fornecer profilaxia de um ou mais sintomas ou aspectos de uma doença, distúrbio ou condição. Para os propósitos da presente invenção, tratamento pode ser administrado antes, durante e/ou após o início dos sintomas.
[000131] Topologia de guarda-chuva: A expressão "topologia de guarda-chuva" é usada aqui para se referir a uma disposição 3- dimensional adotada por certos glicanos e em particular por glicanos em receptores de HA. A presente invenção compreende o reconhecimento que ligação a glicanos de topologia de guarda-chuva é característica de proteínas HA que fazem a mediação de infecção de hospedeiros humanos. Conforme ilustrado na Figura 6, a topologia de guarda-chuva é tipicamente adotada apenas por glicanos sialilados por α2-6, e é típica de oligossacarídeos longos (por exemplo, maior do que tetrassacarídeo). Em algumas modalidades, glicanos de topologia de guarda-chuva são glicanos exibindo uma estrutura tridimensional substancialmente similar à estrutura apresentada na Figura 6 (painel da direita). Em algumas modalidades, glicanos de topologia de guarda-chuva são glicanos que contatam polipeptídeos de HA através dos resíduos de aminoácido mostrados na Figura 6 (painel da direita). Em algumas modalidades, glicanos de topologia de guarda-chuva são glicanos que são capazes de contatar e/ou se ligar especificamente à bolsa de ligação de aminoácido mostrada na Figura 6 (painel da direita). Em algumas modalidades, topologia estrutural de glicano é classificada com base em parâmetro θ definido como ângulo entre C2 de Sia, C1 de Gal e C1 de GlcNAc. Valores de θ < 100° representam topologia tipo cone adotada por glicanos α2-3 e α2-6 curtos. Valores de θ > 110° representam topologia tipo guarda-chuva, tal como topologia adotada por glicanos α2-6 longos (Figura 6). Um exemplo de topologia guarda-chuva é dado pelo ângulo Φ de ligação de Neu5Acα2- 6Gal em torno de -60 (vide, por exemplo, Figura 11). A Figura 9 apresenta certos exemplos representativos (embora não exaustivos) de glicanos que podem adotar uma topologia de guarda-chuva. Os motivos α2-6 longos apresentados na Figura 9 incluem Neu5Acα2-6 ligado na extremidade de não redução a uma cadeia longa (por exemplo, pelo menos um trissacarídeo) encontrada como uma parte de glicanos N-ligados biológicos, glicanos O-ligados e glicolipídeos. Inserções em caixa mostram exemplos das porções de glicano α2-6 longas de topologia de guarda-chuva que são verificadas como parte de glicanos biológicos que se ligam com alta afinidade com HA. Em algumas modalidades, glicanos de topologia de guarda-chuva (por exemplo, em um sítio) compreendem uma proporção maior de ramificações de oligossacarídeo α2-6 longas (por exemplo, unidades de lactosamina múltiplas) do que ramificações de α2-6 curtas (por exemplo, lactosamina simples). Em algumas modalidades, glicanos de topologia de guarda-chuva (por exemplo, em um sítio) compreendem ramificações de oligossacarídeo α2-6 cerca de 2 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 4 vezes, cerca de 5 vezes, cerca de 10 vezes, cerca de 20 vezes, cerca de 50 vezes ou mais do que cerca de 50 vezes mais longas do que ramificações α2-6 curtas (por exemplo, lactosamina simples). Em algumas modalidades, a característica única de interações de HA com glicanos de topologia de guarda-chuva e/ou armadilhas de glicano é o contato de HA com um glicano compreendendo ácido siálico (SA) e/ou análogos de SA na extremidade de não redução. Em algumas modalidades, o comprimento de cadeia do oligossacarídeo é pelo menos um trissacarídeo (excluindo os análogos de SA ou SA). Em algumas modalidades, uma combinação dos resíduos numerados mostrados no painel da direita da Figura 6 está envolvida em contatos com topologia tipo guarda-chuva. Em algumas modalidades, glicanos de topologia de guarda-chuva são oligossacarídeos da forma que segue: Neu5Acα2-6Sug1-Sug2-Sug3
[000132] em que: (a) Neu5Ac α2-6 está tipicamente (mas não essencialmente) na extremidade de não redução: (b) Sug1: (i) é uma hexose (frequentemente Gal ou Glc) ou hexosamina (GlcNAc ou GalNAc) em configuração α ou β (frequentemente β- para extensão N- e O-ligada e α- no caso de GalNAcα- que é O-ligado à glicoproteína); (ii) quaisquer açúcares que não Neu5Acα2-6 estão ligados a quaisquer das posições de não redução de Sug1 (exceto quando Sug1 é GalNAcα- que é O-ligado à glicoproteína); e/ou (iii) porções não açúcar tais como sulfato, fosfato, guanidínio, amina, N-acetila, etc, podem ser ligadas a posições de não redução (tipicamente posição 6) de Sug1 (por exemplo, para melhorar contatos com HA); (c) Sug2 e/ou Sug3 é/são: (i) hexose (frequentemente Gal ou Glc) ou hexosamina (GlcNAc ou GalNAc) em uma configuração α ou β (frequentemente β); e/ou (ii) porções açúcar (tal como Fuc) ou não açúcar tais como sulfato, fosfato, guanidínio, amina, N-acetila, etc, podem ser ligadas a posições de não redução de Sug2, Sug3 e/ou Sug4; (d) Ligação entre quaisquer dois açúcares no oligossacarídeo exceto a ligação de Neu5Acα2-6 pode ser 1-2, 1-3, 1- 4 e/ou 1-6 (tipicamente 1-3 ou 1-4); e/ou (e) Estrutura em que Neu5Acα2-6 é GalNAcα ligado que é O-ligado à glicoproteína e açúcares adicionais são ligados à extremidade de não redução de GalNAcα, por exemplo (i) Neu5Acα2-6(Neu5Acα2-3Galβ1-3)GalNAcα- (ii) Neu5Aca2-6(Galβ1-3)GalNAca- .
[000133] Agente de bloqueio de topologia de guarda-chuva (UTBA) (Umbrella topology blocking agente): Conforme aqui usado, o termo "agente de bloqueio de topologia de guarda-chuva" se refere a um agente que se liga a um receptor de HA tendo um glicano de topologia de guarda-chuva. Em algumas modalidades, um UTBA se liga a um receptor de HA tendo um glicano de topologia de guarda-chuva encontrado nas vias aéreas superiores humanas. Um UBTA pode se ligar a um glicano de topologia de guarda-chuva e/ou a um glicano de topologia de cone. Em algumas modalidades, um UTBA se liga seletivamente a um glicano de topologia de guarda-chuva com 50, 100, 150 ou 200% de sua afinidade com um glicano de topologia de cone. Em algumas modalidades, um UTBA se liga seletivamente a um glicano de topologia de guarda-chuva com 50-150% de sua afinidade com um glicano de topologia de cone. Em algumas modalidades, um UTBA se liga a um glicano de topologia de guarda-chuva com mais ou menos a mesma afinidade que para um glicano de topologia de cone. Por exemplo, em algumas modalidades, um UTBA se liga a um glicano de topologia de guarda-chuva (por exemplo, 6’SLN-LN) com cerca de 50-200%, 50-150% ou mais ou menos a mesma afinidade com a qual ele se liga a um glicano de topologia de cone (por exemplo, 3’SLN- LN). Em algumas modalidades, um UTBA inibe seletivamente a ligação de uma partícula do vírus da gripe (por exemplo, um vírus da gripe humano ou de ave) ao receptor de HA com base em topologia de glicano do receptor (por exemplo, guarda-chuva ou cone). Em algumas modalidades, um UTBA é um polipeptídeo. Em algumas tais modalidades, um polipeptídeo UTBA tem uma sequência de aminoácido que é substancialmente idêntica ou substancialmente homóloga àquela de um polipeptídeo de ocorrência natural. Em algumas modalidades, um polipeptídeo UTBA é um polipeptídeo de HA. Em algumas modalidades, um polipeptídeo UTBA é um polipeptídeo de HA de ocorrência natural ou um fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, um polipeptídeo UTBA tem uma sequência de aminoácido que não é relacionada com aquela de um polipeptídeo de HA. Em algumas modalidades, um polipeptídeo UTBA é um anticorpo ou fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, um polipeptídeo UTBA é uma lectina (por exemplo, SNA-1). Em algumas modalidades, um UTBA não é um polipeptídeo. Em algumas modalidades, um UTBA é uma molécula pequena. Em algumas modalidades, um UTBA é um ácido nucleico.
[000134] Imitação de glicano de topologia de guarda-chuva: Uma "imitação de glicano de topologia de guarda-chuva" é um agente, outro que não um glicano de topologia de guarda-chuva, que se liga a agentes de ligação conforme aqui descrito. Em algumas modalidades, imitações de glicano de topologia de guarda-chuva são agentes que se ligam a polipeptídeos de HA. Em algumas tais modalidades, imitações de glicano de topologia de guarda-chuva são agentes que interagem com resíduos de polipeptídeo de HA selecionados do grupo consistindo nos resíduos 95, 98, 128, 130, 131, 132, 133, 135, 136, 137, 138, 145, 153, 155, 156, 158, 159, 160, 183, 186, 187, 188, 189, 190, 192, 193, 194, 195, 196, 219, 221, 222, 224, 225, 226, 227, 228 e combinações dos mesmos. Em algumas tais modalidades, imitações de glicano de topologia de guarda-chuva são agentes que interagem com resíduos de polipeptídeo de HA selecionados do grupo consistindo nos resíduos 130, 131, 132, 133, 135, 137, 155, 188, 192, 193, 221, 226, 227, 228 e combinações dos mesmos. Em algumas tais modalidades, imitações de glicano de topologia de guarda-chuva são agentes que interagem com resíduos de polipeptídeo de HA selecionados do grupo consistindo nos resíduos 160, 192 e 193 e combinações dos mesmos. Notar que posições de aminoácido declaradas acima são baseadas em numeração de HA de H3. Em algumas modalidades, uma imitação de glicano de topologia de HA é um agente que compete com glicanos de topologia de guarda-chuva para interação com um polipeptídeo de HA.
[000135] Agente de bloqueio específico de topologia de guarda- chuva (UTSBA) (Umbrella topology specific blocking agente): Conforme aqui usado, o termo "agente de bloqueio específico de topologia de guarda-chuva" se refere a um agente que se liga a um receptor de HA tendo um glicano de topologia de guarda-chuva encontrado nas vias aéreas superiores humanas. Um UTSBA se liga seletivamente a uma HA de glicano de topologia de guarda-chuva. Por exemplo, um UTSBA se liga a um glicano de topologia de guarda- chuva (por exemplo, 6’SLN-LN) com cerca de pelo menos 2, pelo menos 4, pelo menos 5 ou pelo menos 10 vezes mais afinidade do que ele se liga a um glicano de topologia de cone (por exemplo, 3’SLN-LN). Tipicamente, a afinidade de um UTSBA com um glicano de topologia de cone é menos pelo menos dentro de 2 a 3 ordens de magnitude da afinidade de ligação de glicanos de topologia de guarda- chuva com HAs adaptadas para humano tais como SC18, Mos99, Tx91, etc, e lectinas de planta de ligação a α2-6 tal como SNA-I. A afinidade de ligação de UTSBA conforme medido através do ensaio de ligação direta dependente da dose (Figuras 19 e 20) seria pelo menos 1 nM. Tipicamente, a afinidade de um UTSBA para um glicano de topologia de cone é no máximo 1 a 3 ordens de magnitude menos do que a afinidade de ligação de glicanos de topologia de cone com HAs de ave tais como Viet0405, Av18, etc. Em algumas modalidades, um UTSBA inibe seletivamente ligação de uma partícula de vírus da gripe (por exemplo, um vírus da gripe humano ou de ave) ao receptor de HA (por exemplo, um H1, H2 ou H3 ou um H5, H7 ou H9 adaptado para humano) com base em topologia de glicano (por exemplo, guarda- chuva ou cone). Em algumas modalidades, um UTSBA é um polipeptídeo. Em algumas tais modalidades, um polipeptídeo UTSBA tem uma sequência de aminoácido que é substancialmente idêntica ou substancialmente homóloga àquela de um polipeptídeo de ocorrência natural. Em algumas modalidades, um polipeptídeo UTSBA é um polipeptídeo de HA. Em algumas modalidades, um polipeptídeo UTSBA é um polipeptídeo de HA de ocorrência natural ou um fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, um polipeptídeo UTSBA tem uma sequência de aminoácido que não é relacionada com aquela de um polipeptídeo de HA. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de UTSBA é um anticorpo ou fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, um polipeptídeo UTSBA é uma lectina (por exemplo, SNA-1). Em algumas modalidades, um UTSBA não é um polipeptídeo. Em algumas modalidades, um UTSBA é uma molécula pequena. Em algumas modalidades, um UTSBA é um ácido nucleico.
[000136] Vacinação: Conforme aqui usado, o termo "vacinação" se refere à administração de uma composição pretendida gerar uma resposta imune, por exemplo, um agente causador de doença. Para os propósitos da presente invenção, a vacinação pode ser administrada antes, durante e/ou após exposição a um agente causador de doença e, em algumas modalidades, antes, durante e/ou um pouco depois da exposição ao agente. Em algumas modalidades, vacinação inclui administrações múltiplas, apropriadamente espaçadas no tempo, de uma composição de vacinação.
[000137] Variante: Conforme aqui usado, o termo "variante" é um termo relativo que descreve a relação entre um polipeptídeo particular (por exemplo, polipeptídeo de HA) de interesse e um polipeptídeo "parental" ao qual sua sequência está sendo comparada. Um polipeptídeo de interesse é considerado ser uma "variante" de um polipeptídeo parental se o polipeptídeo de interesse tiver uma sequência de aminoácido que é idêntica àquela da origem, exceto um número pequeno de alterações de sequência em posições particulares. Tipicamente, menos do que 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% dos resíduos na variante são substituídos comparado com a origem. Em algumas modalidades, uma variante tem 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 resíduos substituídos comparado com uma origem. Frequentemente, uma variante tem um número muito pequeno (por exemplo, menos do que 5, 4, 3, 2 ou 1) de resíduos funcionais substituídos (isto é, resíduos que participam em uma atividade biológica particular). Ainda, uma variante tipicamente não tem mais do que 5, 4, 3, 2 ou 1 adições ou deleções e frequentemente não tem quaisquer adições ou deleções, conforme comparado com a origem. Além disso, quaisquer adições ou deleções são tipicamente de menos do que cerca de 25, cerca de 20, cerca de 19, cerca de 18, cerca de 17, cerca de 16, cerca de 15, cerca de 14, cerca de 13, cerca de 10, cerca de 9, cerca de 8, cerca de 7, cerca de 6 e geralmente são menos do que cerca de 5, cerca de 4, cerca de 3 ou cerca de 2 resíduos. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de origem é um encontrado na natureza. Por exemplo, um polipeptídeo de HA de origem pode ser um encontrado em um isolato natural (por exemplo, do tipo selvagem) de um vírus da gripe (por exemplo, uma HA do tipo selvagem).
[000138] Vetor: Conforme aqui usado, "vetor" se refere a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual ela foi ligada. Em algumas modalidades, vetores são capazes de replicação e/ou expressão extracromossomal de ácidos nucleicos aos quais eles são ligados em uma célula hospedeiro tal como uma célula eucariótica ou procariótica. Vetores capazes de direcionamento da expressão de genes operativamente ligados são referidos aqui como "vetores de expressão".
[000139] Tipo selvagem: Como é compreendido na técnica, a expressão "tipo selvagem" se refere em geral a uma forma normal de uma proteína ou ácido nucleico, como é encontrado na natureza. Por exemplo, polipeptídeos de HA do tipo selvagem são encontrados em isolatos naturais de vírus da gripe. Uma variedade de sequências de HA do tipo selvagem diferentes pode ser encontrada no banco de dados de sequência de vírus da gripe NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html.
[000140] A presente invenção provê agentes de ligação (por exemplo, polipeptídeos de HA, variantes de polipeptídeo de HA, LSBAs, UTBAs, etc) que se ligam a glicanos de topologia de guarda- chuva. Em algumas modalidades, a presente invenção provê agentes de ligação que se ligam a glicanos de topologia de guarda-chuva encontrados em receptores de HA de uma espécie alvo particular. Por exemplo, em algumas modalidades, a presente invenção provê agentes de ligação que se ligam a glicanos de topologia de guarda- chuva encontrados em receptores de HA humanos, por exemplo, receptores de HA encontrados em células epiteliais humanas e particularmente agentes de ligação que se ligam a glicanos de topologia de guarda-chuva encontrados em receptores de HA humanos no trato respiratório superior.
[000141] A presente invenção provê agentes de ligação que se ligam a receptores de HA encontrados em células no trato respiratório superior humano e em particular provê agentes de ligação que se ligam a tais receptores (e/ou seus glicanos, particularmente aos seus glicanos guarda-chuva) com uma afinidade e/ou especificidade projetada.
[000142] Em algumas modalidades, os agentes de ligação de acordo com a presente invenção são ou compreendem sequências de polipeptídeo de HA. Em algumas modalidades, os agentes de ligação de acordo com a presente invenção compreendem uma sequência de polipeptídeo de HA que difere de uma sequência de polipeptídeo de HA de ocorrência natural parental em um ou mais resíduos selecionados do grupo consistindo nos resíduos 130, 131, 132, 133, 135, 137, 155, 188, 192, 193, 221, 226, 227, 228 e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, os agentes de ligação de acordo com a presente invenção compreendem uma sequência de polipeptídeo de HA que difere de uma sequência de polipeptídeo de HA de ocorrência natural parental em um ou mais resíduos selecionados do grupo consistindo em resíduos 160, 192, 193 e combinações dos mesmos.
[000143] A presente invenção compreende o reconhecimento que ganho da habilidade em se ligar a glicanos de topologia de guarda- chuva (por exemplo, glicanos sialilados por α2-6 longos), e particularmente uma habilidade em ligar com alta afinidade, pode conferir à variante de polipeptídeo de HA a habilidade em infectar humanos (em que seu polipeptídeo de HA parental não pode). Sem desejar ser limitado por nenhuma teoria particular, os presentes inventores propõem que ligação a glicanos de topologia de guarda- chuva possa ser soberana, e em particular que perda de ligação com outros tipos de glicano possa não ser requerida.
[000144] A presente invenção provê ainda vários reagentes e métodos associados com agentes de ligação de acordo com a invenção (por exemplo, polipeptídeos de HA, variantes de polipeptídeo de HA, UTBAs, UTSBAs, etc) incluindo, por exemplo, sistemas para sua identificação, estratégias para sua preparação, anticorpos que se ligam a eles e vários métodos de diagnóstico e terapêuticos relacionados a eles. Descrição adicional de certas modalidades desses aspectos, e outros, da presente invenção, é apresentada abaixo.
[000145] Vírus da gripe são vírus de RNA que são caracterizados por um envelope de membrana de lipídeo contendo duas glicoproteínas, hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA), incorporadas à membrana do vírus particular. Existem 16 subtipos de HA conhecidos e 9 subtipos de NA, e linhagens de gripe diferentes são nomeadas com base no número dos subtipos de HA e NA da linhagem. Com base em comparações de identidade de sequência de aminoácido e de estruturas de cristal, os subtipos de HA foram divididos em dois grupos principais e quatro clades menores. Os subtipos de HA diferentes não compartilham necessariamente identidade de sequência de aminoácido forte, mas as estruturas em 3D gerais dos subtipos de HA diferentes são similares umas às outras, com várias diferenças sutis que podem ser usadas para propósitos de classificação. Por exemplo, a orientação particular dos subdomínios distais de membrana em relação a uma hélice α central é uma característica estrutural geralmente usada para determinar subtipo de HA (Russell e outros, 2004, Virology, 325:287; incorporado aqui a título de referência).
[000146] HA existe na membrana como um homotrímero de um de 16 subtipos, chamados H1-H16. Apenas três desses subtipos, (H1, H2 e H3) se tornaram até agora adaptados para infecção humana. Uma característica relatada de HAs que se adaptaram para infectar humanos (por exemplo, HAs de subtipos de gripe H1N1 (1918) e H3N2 (1967-68) pandêmicos) é sua habilidade em preferivelmente se ligar a glicanos sialilados por α2-6 em comparação com seus progenitores de ave que preferivelmente se ligam a glicanos sialilados por α2-3 (Skehel & Wiley, 2000, Annu Rev Biochem, 69:531; Rogers, & Paulson, 1983, Virology, 127:361; Rogers e outros, 1983, Nature, 304:76; Sauter e outros, 1992, Biochemistry, 31:9609; Connor e outros, 1994, Virology, 205:17; Tumpey e outros, 2005, Science, 310:77; todos aqui incorporados a título de referência). A presente invenção, no entanto, compreende o reconhecimento que a habilidade em infectar hospedeiros humanos se relaciona menos com ligação a glicanos de uma ligação particular e mais com ligação a glicanos de uma topologia particular. Desta maneira, a presente invenção demonstra que HAs que fazem a mediação de infecção de humanos se ligam a glicanos de topologia de guarda-chuva, frequentemente mostrando preferência para glicanos de topologia de guarda-chuva com relação a glicanos de topologia de cone (embora glicanos de topologia de cone possam ser glicanos sialilados por α2-6).
[000147] Várias estruturas de cristal de HAs de subtipos H1 (humano e suíno), H3 (ave) e H5 (ave) ligados a oligossacarídeos sialilados (de ambas as ligações α2-3 e α2-6) estão disponíveis e proveem compreensão molecular dos aminoácidos específicos que estão envolvidos em interações distintas dos HAs com esses glicanos (Eisen e outros, 1997, Virology, 232:19; Ha e outros, 2001, Proc Natl Acad Sci USA, 98:11181; Ha e outros, 2003, Virology, 309:209; Gamblin e outros, 2004, Science, 303:1838; Stevens e outros, 2004, Science, 303:1866; Russell e outros, 2006, Glycoconj J 23:85; Stevens e outros, 2006, Science, 312:404; todos aqui incorporados a título de referência).
[000148] Por exemplo, as estruturas de cristal de H5 (A/duck/Singapore/3/97) sozinho ou ligado a um oligossacarídeo sialilado por α2-3 ou α2-6 identificam certos aminoácidos que interagem diretamente com glicanos ligados, e também aminoácidos que são um ou mais graus de separação removidos (Stevens e outros, 2001, Proc Natl Acad Sci USA 98:11181; incorporado aqui a título de referência). Em alguns casos, conformação desses resíduos é diferente em estados ligado versus não ligado. Por exemplo, Glu190, Lys193 e Gln226 todos participam em interações de ligação direta e têm conformações diferentes no estado ligado versus não ligado. A conformação de Asn186, que é próxima de Glu190, é também significantemente diferente no estado ligado versus não ligado.
[000149] Conforme acima mencionado, a presente invenção compreende a constatação que ligação a glicanos de topologia de guarda-chuva se relaciona com a habilidade em mediar infecção de hospedeiros particulares, incluindo, por exemplo, humanos. Desta maneira, a presente invenção provê agentes de ligação (por exemplo, polipeptídeos de HA, variantes de polipeptídeo de HA, LSBAs, UTBAs, UTSBAs, etc) que se ligam a glicanos guarda-chuva (e/ou a imitações glicano de topologia de guarda-chuva). Em algumas modalidades, agentes de ligação de acordo com a invenção se ligam a glicanos guarda-chuva (e/ou a imitações de glicano de topologia de guarda- chuva) com alta afinidade. Em algumas modalidades, agentes de ligação de acordo com a invenção se ligam a uma pluralidade de glicanos de topologia de guarda-chuva diferentes, frequentemente com alta afinidade e/ou especificidade.
[000150] Em algumas modalidades, os agentes de ligação de acordo com a invenção se ligam a glicanos de topologia de guarda-chuva (por exemplo, glicanos sialilados por α2-6 longos tais como, por exemplo, Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-) com alta afinidade. Por exemplo, em algumas modalidades, os agentes de ligação de acordo com a invenção se ligam a elementos de topologia de guarda- chuva com uma afinidade comparável àquela observada para um HA do tipo selvagem que faz a mediação de infecção de humanos (por exemplo, HA de H1N1 ou HA de H3N2). Em algumas modalidades, os agentes de ligação de acordo com a invenção se ligam a glicanos guarda-chuva com uma afinidade que é pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% daquela observada sob condições comparáveis para uma HA do tipo selvagem que faz a mediação de infecção de humanos. Em algumas modalidades, agentes de ligação de acordo com a invenção se ligam a glicanos guarda-chuva com uma afinidade que é maior do que aquela observada sob condições comparáveis para uma HA do tipo selvagem que faz a mediação de infecção de humanos.
[000151] Em algumas modalidades, afinidade de ligação de agentes de ligação de acordo com a invenção é avaliada em uma faixa ampla de concentrações. Tal estratégia provê significantemente mais informação, particularmente em ensaios de ligação multivalentes, do que as análises de concentração única. Em algumas modalidades, por exemplo, afinidades de ligação de agentes de ligação de acordo com a invenção são avaliadas em concentrações variando de pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10 ou mais vezes.
[000152] Em algumas modalidades, os agentes de ligação de acordo com a invenção mostram alta afinidade se eles mostrarem um sinal de saturação em um ensaio de ligação de disposição de glicano multivalente tais como aqueles descritos aqui. Em algumas modalidades, os agentes de ligação de acordo com a invenção mostram alta afinidade se eles mostrarem um sinal acima de cerca de 400000 ou mais (por exemplo, acima de cerca de 500000, cerca de 600000, cerca de 700000, cerca de 800000, etc) em tais estudos. Em algumas modalidades, os agentes de ligação conforme descrito aqui mostram ligação de saturação a glicanos de guarda-chuva em uma faixa de concentração de pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes ou mais, e em algumas modalidades em uma faixa de concentração tão grande quanto 10 vezes ou mais.
[000153] Ainda, em algumas modalidades, os agentes de ligação de acordo com a invenção se ligam a glicanos de topologia de guarda- chuva (e/ou a imitações de glicano de topologia de guarda-chuva) mais fortemente do que eles se ligam a glicanos de topologia de cone. Em algumas modalidades, os agentes de ligação de acordo com a invenção mostram uma afinidade relativa com glicanos de guarda-chuva vs. cones de glicano que é cerca de 10, cerca de 9, cerca de 8, cerca de 7, cerca de 6, cerca de 5, cerca de 4, cerca de 3 ou cerca de 2.
[000154] Em algumas modalidades, os agentes de ligação de acordo com a invenção se ligam a glicanos sialilados por α2-6; em algumas modalidades, os agentes de ligação de acordo com a invenção se ligam preferivelmente a glicanos sialilados por α2-6. Em algumas modalidades, os agentes de ligação de acordo com a invenção se ligam a uma pluralidade de glicanos sialilados por α2-6 diferentes. Em algumas modalidades, os agentes de ligação de acordo com a invenção não são capazes de se ligar a glicanos sialilados por α2-3, e em algumas modalidades, os agentes de ligação de acordo com a invenção são capazes de se ligar a glicanos sialilados por α2-3.
[000155] Em algumas modalidades, os agentes de ligação de acordo com a invenção se ligam a receptores encontrados em células epiteliais respiratórias superiores humanas. Em algumas modalidades, os agentes de ligação de acordo com a invenção se ligam a receptores de HA no brônquio e/ou traqueia. Em algumas modalidades, os agentes de ligação de acordo com a invenção não são capazes de se ligar a receptores no pulmão profundo e, em algumas modalidades, os agentes de ligação de acordo com a invenção são capazes de se ligar a receptores no pulmão profundo.
[000156] Em algumas modalidades, os agentes de ligação de acordo com a invenção se ligam a pelo menos cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30% cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou mais dos glicanos encontrados em receptores de HA em tecidos do trato respiratório superior humano (por exemplo, células epiteliais).
[000157] Em algumas modalidades, os agentes de ligação de acordo com a invenção se ligam a um ou mais dos glicanos ilustrados na Figura 9. Em algumas modalidades, os agentes de ligação de acordo com a invenção se ligam a glicanos múltiplos ilustrados na Figura 9. Em algumas modalidades, os agentes de ligação de acordo com a invenção se ligam com alta afinidade e/ou especificidade a glicanos ilustrados na Figura 9. Em algumas modalidades, os agentes de ligação de acordo com a invenção se ligam a glicanos ilustrados na Figura 9 preferivelmente conforme comparado com sua ligação a glicanos ilustrados na Figura 8. Em algumas modalidades, os agentes de ligação de acordo com a invenção se ligam a um oligossacarídeo da forma que segue:Neu5Acα2-6Sug1-Sug2-Sug3
[000158] em que: 1. Neu5Ac α2-6 está sempre ou quase sempre na extremidade de não redução; 2. Sug1: a. é uma hexose (frequentemente Gal ou Glc) ou hexosamina (GlcNAc ou GalNAc) em configuração α ou β (frequentemente β- para extensão N- e O-ligada e α- no caso de GalNAcα- que é O-ligado à glicoproteína); b. quaisquer açúcares que não Neu5Ac α2-6 devem ser ligados a quaisquer das posições de não redução de Sug1 (exceto quando Sug1 é GalNAcα- que é O-ligado à glicoproteína); e/ou c. porções não açúcar tais como sulfato, fosfato, guanidínio, amina, N-acetila, etc, podem ser ligadas a posições de não redução (tipicamente posição 6) de Sug1 para melhorar contatos com HA); 3. Sug2 e/ou Sug3: a. hexose (frequentemente Gal ou Glc) ou hexosamina (GlcNAc ou GalNAc) em uma configuração α ou β (frequentemente β); e/ou b. porções açúcar (tal como Fuc) ou não açúcar tais como sulfato, fosfato, guanidínio, amina, N-acetila, etc, podem ser ligadas a posições de não redução de Sug2, Sug3 e/ou Sug4; 4. Ligação entre quaisquer dois açúcares no oligossacarídeo exceto a ligação de Neu5Acα2-6 pode ser 1-2, 1-3, 1-4 e/ou 1-6 (tipicamente 1-3 ou 1-4); e/ou 5. Estrutura em que Neu5Acα2-6 é GalNAcα ligado que é O-ligado à glicoproteína e açúcares adicionais são ligados à extremidade de não redução de GalNAcα, por exemplo i Neu5Acα2-6(Neu5Acα2-3Galβ1 -3)GalNAca- ii Neu5Aca2-6(Galβ1-3)GalNAca- .
[000159] A presente invenção provê agentes de ligação com especificidade de ligação designada e também provê agentes de ligação com características de ligação designadas com relação a glicanos de guarda-chuva.
[000160] Certos agentes de ligação particulares providos pela presente invenção são descritos em mais detalhes abaixo. Polipeptídeos de HA
[000161] Em algumas modalidades, os agentes de ligação de acordo com a invenção são polipeptídeos de HA. Por exemplo, a presente invenção provê polipeptídeos de HA isolados com especificidade de ligação designada, e também provê polipeptídeos de HA engenheirados com características de ligação designadas com relação a glicanos de guarda-chuva.
[000162] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA providos com características de ligação designadas são polipeptídeos de H1. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção com características de ligação designadas são polipeptídeos de H2. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção com características de ligação designadas são polipeptídeos de H3. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção com características de ligação designadas são polipeptídeos de H4. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção com características de ligação designadas são polipeptídeos de H5. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção com características de ligação designadas são polipeptídeos de H6. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção com características de ligação designadas são polipeptídeos de H7. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção com características de ligação designadas são polipeptídeos de H8. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção com características de ligação designadas são polipeptídeos de H9. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção com características de ligação designadas são polipeptídeos de H10. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção com características de ligação designadas são polipeptídeos de H11. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção com características de ligação designadas são polipeptídeos de H12. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção com características de ligação designadas são polipeptídeos de H13. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção com características de ligação designadas são polipeptídeos de H14. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção com características de ligação designadas são polipeptídeos de H15. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção com características de ligação designadas são polipeptídeos de H16.
[000163] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção não incluem a proteína H1 de nenhuma das linhagens: A/South Carolina/1/1918; A/Puerto Rico/8/1934; A/Taiwan/1/1986; A/Texas/36/1991; A/Beijing/262/1995; A/Johannesburg/92/1996; A/New Caledonia/20/1999; A/Solomon Islands/3/2006.
[000164] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção não são a proteína H2 de nenhuma das linhagens da epidemia de gripe Asiática de 1957-58. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção não incluem a proteína H2 de nenhuma das linhagens: A/Japan/305+/1957; A/Singapore/1/1957; A/Taiwan/1/1964; A/Taiwan/1/1967.
[000165] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção não incluem a proteína H3 de nenhuma das linhagens: A/Aichi/2/1968; A/Philippines/2/1982; A/Mississippi/1/1985; A/Leningrad/360/1986; A/Sichuan/2/1987; A/Shanghai/11/1987; A/Beijing/353/1989; A/Shandong/9/1993; A/Johannesburg/33/1994; A/Nanchang/813/1995; A/Sydney/5/1997; A/Moscow/10/1999; A/Panama/2007/1999; A/Wyoming/3/2003; A/Oklahoma/323/2003; A/California/7/2004; A/Wisconsin/65/2005.
[000166] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA provido é uma variante de um polipeptídeo de HA parental pelo fato de sua sequência de aminoácido ser idêntica àquela da HA parental exceto por um pequeno número de alterações de sequência particulares. Em algumas modalidades, a HA parental é um polipeptídeo de HA encontrado em um isolato natural de um vírus da gripe (por exemplo, um polipeptídeo de HA do tipo selvagem).
[000167] Em algumas modalidades, as variantes do polipeptídeo de HA de acordo com a invenção têm características de ligação de glicano diferentes de seus polipeptídeos de HA parentais correspondentes. Em algumas modalidades, os polipeptídeos variantes de HA de acordo com a invenção têm maior afinidade e/ou especificidade para glicanos guarda-chuva (por exemplo, comparado com glicanos cone) do que seus polipeptídeos de HA parentais cognatos. Em algumas modalidades, tais variantes de polipeptídeo de HA são variantes engenheiradas.
[000168] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de variante de HA de acordo com a invenção têm maior afinidade e/ou especificidade para glicanos guarda-chuva comparado com seus polipeptídeos de HA parentais cognatos. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de variante de HA de acordo com a invenção têm afinidade e/ou especificidade reduzida para glicanos de topologia de cone comparado com seus polipeptídeos de HA parentais cognatos. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de variante de HA de acordo com a invenção têm maior afinidade e/ou especificidade para glicanos guarda-chuva e afinidade e/ou especificidade reduzida para glicanos de topologia de cone comparado com seus polipeptídeos de HA parentais cognatos.
[000169] Em algumas modalidades, os polipeptídeos variantes de HA de acordo com a invenção têm maior afinidade e/ou especificidade para glicanos α2-6 comparado com seus polipeptídeos de HA parentais cognatos. Em algumas modalidades, polipeptídeos variantes de HA de acordo com a invenção têm afinidade e/ou especificidade reduzida para glicanos α2-3 comparado com seus polipeptídeos de HA parentais cognatos. Em algumas modalidades, os polipeptídeos variantes de HA de acordo com a invenção têm maior afinidade e/ou especificidade para glicanos α2-6 e α2-3 comparado com seus polipeptídeos de HA parentais cognatos. Em algumas modalidades, os polipeptídeos variantes de HA de acordo com a invenção têm maior afinidade e/ou especificidade para glicanos α2-6 e afinidade e/ou especificidade reduzida para glicanos α2-3 comparado com seus polipeptídeos de HA parentais cognatos.
[000170] Em algumas modalidades, os polipeptídeos variantes de HA de acordo com a invenção têm maior afinidade e/ou especificidade para glicanos de topologia de guarda-chuva e glicanos α2-3 comparado com seus polipeptídeos de HA parentais cognatos. Em algumas modalidades, os polipeptídeos variantes de HA de acordo com a invenção têm maior afinidade e/ou especificidade para glicanos de topologia guarda- chuva e afinidade e/ou especificidade reduzida para glicanos α2-3 comparado com seus polipeptídeos de HA parentais cognatos.
[000171] Em algumas modalidades, os polipeptídeos variantes de HA de acordo com a invenção têm maior afinidade e/ou especificidade para glicanos α2-6 e glicanos de topologia de cone comparado com seus polipeptídeos de HA parentais cognatos. Em algumas modalidades, os polipeptídeos variantes de HA de acordo com a invenção têm maior afinidade e/ou especificidade para glicanos α2-6 e afinidade e/ou especificidade reduzida para glicanos de topologia de cone comparado com seus polipeptídeos de HA parentais cognatos.
[000172] Em algumas modalidades, as variantes de polipeptídeo de HA de acordo com a invenção contêm uma ou mais alterações de sequência que estão de acordo com sequências de HA encontradas em um subtipo de HA diferente. Para dar um exemplo particular, em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 de acordo com a invenção contém uma ou mais alterações de sequência que tornam a variante de polipeptídeo de HA de H5 mais parecida com um polipeptídeo de HA de H2. Para dar outro exemplo particular, em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 de acordo com a invenção contém uma ou mais alterações de sequência que tornam a variante de polipeptídeo de HA de H5 mais parecida com o polipeptídeo de HA de H1.
[000173] A presente invenção compreende particularmente o reconhecimento que as variantes de polipeptídeo de H5 (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 ou H16) com glicosilação alterada podem mostrar afinidade 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 1000 vezes, 10.000 vezes ou maior com receptores de HA humanos comparado com um polipeptídeo de HA de referência. A presente invenção compreende também particularmente o reconhecimento que as variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 ou H16) com alterações na região de alça de HA podem mostrar afinidade 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 1000 vezes, 10.000 vezes ou maior com receptores de HA humanos comparado com um polipeptídeo de HA de referência (por exemplo, um polipeptídeo de HA de qualquer uma das SEQ ID NOs: 43-55).
[000174] A presente invenção compreende particularmente o reconhecimento que variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 ou H16) com glicosilação alterada podem mostrar afinidade 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 1000 vezes, 10.000 vezes ou maior com receptores de HA humanos comparado com um polipeptídeo de HA de referência. A presente invenção compreende também particularmente o reconhecimento que variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HÁ de H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 ou H16) com alterações na região de alça de HA podem mostrar especificidade 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 1000 vezes, 10.000 vezes ou maior com receptores de HA humanos comparado com um polipeptídeo de HA de referência (por exemplo, um polipeptídeo de HA de qualquer uma das SEQ ID NOs: 43-55).
[000175] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de HA de referência é a HA de A/South Carolina/1/18 (H1N1) (SEQ ID NO: 43). Em algumas modalidades, o polipeptídeo de HA de referência é a HA de A/Brisbane/59/07 (SEQ ID NO: 44). Em algumas modalidades, o polipeptídeo de HA de referência é a HA de A/California/04/09 (SEQ ID NO: 45). Em algumas modalidades, o polipeptídeo de HA de referência é a HA de A/Albany/6/58 (H2N2) (SEQ ID NO: 46). Em algumas modalidades, o polipeptídeo de HA de referência é a HA de A/Aichi/1/68 (SEQ ID NO: 47). Em algumas modalidades, o polipeptídeo de HA de referência é a HA de A/Moscow/10/99 (SEQ ID NO: 48). Em algumas modalidades, o polipeptídeo de HA de referência é a HA de A/Perth/16/09 (SEQ ID NO: 49). Em algumas modalidades, o polipeptídeo de HA de referência é a HA de A/Vietnam/1203/04 (SEQ ID NO: 50). Em algumas modalidades, o polipeptídeo de HA de referência é a HA de A/Egypt/2786- NAMRU3/06 (SEQ ID NO: 51). Em algumas modalidades, o polipeptídeo de HA de referência é a HA de A/New York/107/03 (SEQ ID NO: 52). Em algumas modalidades, o polipeptídeo de HA de referência é a HA de A/Hongkong/486/97 (SEQ ID NO: 53). Em algumas modalidades, o polipeptídeo de HA de referência é a HA de A/Hongkong/213/03 (SEQ ID NO: 54). Em algumas modalidades, o polipeptídeo de HA de referência é a HA de A/Indonesia/5/05 (SEQ ID NO: 55).
[000176] Em algumas modalidades, as variantes do polipeptídeo de HA com características de ligação de glicano alteradas têm uma ou mais alterações de sequência em resíduos dentro ou afetando o sítio de ligação de glicano. Em algumas modalidades, tais substituições são de aminoácidos que interagem diretamente com glicano ligado; em algumas modalidades, tais substituições são de aminoácidos que são um grau de separação removidos daqueles que interagem com glicano ligado, pelo fato que aminoácidos removidos com um grau de separação ou (1) interagem com os aminoácidos de ligação direta; (2) afetam de outra maneira a habilidade dos aminoácidos de ligação direta em interagir com glicano, mas não interagem diretamente com os próprios glicanos; ou (3) afetam de outra maneira a habilidade dos aminoácidos de ligação direta em interagir com glicano, e também interagem diretamente com os próprios glicanos. As variantes de polipeptídeo de HA de acordo com a invenção contêm substituições de um ou mais aminoácidos de ligação direta, um ou mais aminoácidos de primeiro grau de separação, um ou mais aminoácidos de segundo grau de separação ou qualquer combinação desses. Em algumas modalidades, as variantes de polipeptídeo de HA de acordo com a invenção podem conter substituições de um ou mais aminoácidos com graus de separação ainda maiores.
[000177] Em algumas modalidades, as variantes de polipeptídeo de HA com características de ligação a glicano alteradas têm alterações de sequência em resíduos que fazem contato com açúcares além de Neu5Ac e Gal (vide, por exemplo, Figura 7).
[000178] Em algumas modalidades, as variantes de polipeptídeo de HA têm pelo menos uma substituição de aminoácido, conforme comparado com uma HA parental do tipo selvagem. Em algumas modalidades, as variantes de polipeptídeo de HA de acordo com a invenção têm pelo menos duas, três, quatro, cinco ou mais substituições de aminoácido comparado com uma HA parental do tipo selvagem cognata; em algumas modalidades, as variantes de polipeptídeo de HA de acordo com a invenção têm duas, três ou quatro substituições de aminoácido. Em algumas modalidades, todas tais substituições de aminoácido estão localizadas dentro do sítio de ligação de glicano.
[000179] Em algumas modalidades, as variantes de polipeptídeo de HA de acordo com a invenção contêm uma ou mais substituições de aminoácido conforme descrito em qualquer uma das Publicações de Patente U.S. Números 2009/0269342 e 2010/0004195 e no Pedido de Patente U.S. Número de Série 12/829931, depositado em 2 de julho de 2010, intitulado "COMPOSITIONS AND METHODS FOR DIAGNOSING AND/OR TREATING INFLUENZA INFECTION" (todos aqui incorporados a título de referência).
[000180] Em algumas modalidades, as variantes de polipeptídeo de HA têm substituições de sequência nas posições correspondendo a um ou mais de resíduos 95, 98, 128, 130, 131, 132, 133, 135, 136, 137, 138, 145, 153, 155, 156, 158, 159, 160, 183, 186, 187, 188, 189, 190, 192, 193, 194, 195, 196, 219, 221, 222, 224, 225, 226, 227 e 228. Em algumas modalidades, as variantes de polipeptídeo de HA, particularmente as variantes de polipeptídeo de H5, têm uma ou mais substituições de aminoácido com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, H5) em resíduos selecionados do grupo consistindo nos resíduos 95, 98, 128, 130, 131, 132, 133, 135, 136, 137, 138, 145, 153, 155, 156, 158, 159, 160, 183, 186, 187, 188, 189, 190, 192, 193, 194, 195, 196, 219, 221, 222, 224, 225, 226, 227 e 228. Em algumas modalidades, as variantes de polipeptídeo de HA, particularmente variantes de polipeptídeo de H5, têm uma ou mais substituições de aminoácido com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, H5) em qualquer um dos resíduos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 ou 37 selecionados do grupo consistindo nos resíduos 95, 98, 128, 130, 131, 132, 133, 135, 136, 137, 138, 145, 153, 155, 156, 158, 159, 160, 183, 186, 187, 188, 189, 190, 192, 193, 194, 195, 196, 219, 221, 222, 224, 225, 226, 227 e 228.
[000181] Em algumas modalidades, as variantes do polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes do polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência que reduzem ou abolem glicosilação em um sítio correspondendo à posição de amino ácido 158. Em algumas modalidades, as variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência que afetam e/ou alteram a identidade e/ou estrutura do glicano ligado a um sítio correspondendo à posição de aminoácido 158. Em algumas modalidades, tal substituição de sequência é uma mutação em um sítio correspondendo à posição 158, por exemplo, Asn158Xaa, em que Xaa é qualquer aminoácido outro que não Asn. Em algumas modalidades, tal substituição de sequência é uma mutação em um sítio correspondendo à posição 160, por exemplo, Thr160Xaa, em que Xaa é qualquer aminoácido outro que não Asn. Em algumas modalidades, tal substituição de sequência compreende a mutação Thr160Ala. Em algumas modalidades, uma substituição de sequência que reduz, abole, afeta ou altera glicosilação em um sítio correspondendo à posição de aminoácido 158 pode tornar um polipeptídeo de HA não H2 (por exemplo, um polipeptídeo de HA de H5) mais parecido (por exemplo, ambos estruturalmente e funcionalmente) com um polipeptídeo de HA de H2. Em algumas modalidades, uma mutação em um sítio correspondendo à posição 160 (por exemplo, Thr160Xaa, tal como Thr160Ala) pode tornar um polipeptídeo de HA não H2 (por exemplo, um polipeptídeo de HA de H5) mais parecido (por exemplo, ambos estruturalmente e funcionalmente) com um polipeptídeo de HA de H2.
[000182] Em algumas modalidades, variantes do polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes do polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a um ou mais de resíduos 226, 228 e 160. Em algumas modalidades, as variantes do polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes do polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo aos resíduos 226, 228 e 160. Em algumas modalidades, as variantes do polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes do polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) em posições correspondendo aos resíduos 226 e 160. Em algumas modalidades, as variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a um HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo aos resíduos 228 e 160. Em algumas modalidades, as variantes do polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes do polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo aos resíduos 226 e 228.
[000183] Em algumas modalidades, as variantes do polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes do polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a um ou mais resíduos 226, 228 e 158. Em algumas modalidades, as variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) em posições correspondendo aos resíduos 226, 228 e 158. Em algumas modalidades, as variantes do polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes do polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) em posições correspondendo aos resíduos 226 e 158. Em algumas modalidades, as variantes do polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes do polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo aos resíduos 228 e 158. Em algumas modalidades, as variantes de polipeptídeo de HÁ (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) em posições correspondendo aos resíduos 226 e 228.
[000184] Em algumas modalidades, as variantes do polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes do polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência que incluem uma deleção em uma ou mais das regiões de alça de um polipeptídeo de HA. Em algumas modalidades, as variantes do polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes do polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência que incluem uma deleção em um sítio correspondendo à região de alça 128-137 de um polipeptídeo de HA. Em algumas modalidades, as variantes do polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes do polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência que incluem uma deleção em uma ou mais de posições de aminoácido correspondendo aos resíduos 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136 e/ou 137 de um polipeptídeo de HA. Em algumas modalidades, as variantes do polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes do polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência que incluem uma deleção em um sítio correspondendo à região de alça 128-134 de um polipeptídeo de HA. Em algumas modalidades, as variantes do polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes do polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência que incluem uma deleção em uma ou mais de posições de aminoácido correspondendo aos resíduos 128, 129, 130, 131, 132, 133 e/ou 134 de um polipeptídeo de HA. Em algumas modalidades, as variantes do polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes do polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência que incluem uma deleção de um aminoácido correspondendo ao resíduo 130. Em algumas modalidades, tais substituições de região de alça podem tornar um não polipeptídeo de HA de H2 (por exemplo, um polipeptídeo de HA de H5) mais parecido (por exemplo, ambos estruturalmente e funcionalmente) com um polipeptídeo de HA de H2. Em algumas modalidades, uma deleção de um aminoácido correspondendo ao resíduo 130 pode tornar um não polipeptídeo de HA de H2 (por exemplo, um polipeptídeo de HA de H5) mais parecido (por exemplo, ambos estruturalmente e funcionalmente) com um polipeptídeo de HA de H2.
[000185] Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a um ou mais de resíduos 131, 132, 133, 135, 137, 155, 188, 192, 193, 221, 226, 227, 228 e 130. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 de resíduos 131, 132, 133, 135, 137, 155, 188, 192, 193, 221, 226, 227, 228 e 130. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) um ou mais de resíduos 131, 132, 133, 135, 137, 155, 188, 192, 193, 221, 226, 227 e 228. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 de resíduos 131, 132, 133, 135, 137, 155, 188, 192, 193, 221, 226, 227 e 228.
[000186] Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a um ou mais de resíduos 131, 132, 135, 188, 192, 221 e 130. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) em posições correspondendo a qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 de resíduos 131, 132, 135, 188, 192, 221 e 130. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) um ou mais de resíduos 131, 132, 135, 188, 192 e 221. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) qualquer 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 de resíduos 131, 132, 135, 188, 192 e 221.
[000187] Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a um ou mais de resíduos 133, 137, 155, 193, 226, 227, 228 e 130. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou 7 de resíduos 133, 137, 155, 193, 226, 227, 228 e 130. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) um ou mais de resíduos 133, 137, 155, 193, 226, 227 e 228. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 de resíduos 133, 137, 155, 193, 226, 227 e 228.
[000188] Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a um ou mais de resíduos 130, 192 e 193. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a qualquer 1, 2 ou 3 de resíduos 130, 192, 193. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) um ou ambos os resíduos 192 e 193.
[000189] Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a um ou mais de resíduos 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221, 226, 227, 228 e 130. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 de resíduos 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221, 226, 227, 228 e 130. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) um ou mais de resíduos 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221, 226, 227 e 228. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 de resíduos 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221, 226, 227 e 228.
[000190] Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a um ou mais de resíduos 137, 188, 192, 193, 226, 228 e 130. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 de resíduos 137, 188, 192, 193, 226, 228 e 130. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) um ou mais de resíduos 137, 188, 192, 193, 226 e 228. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) qualquer 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 de resíduos 137, 188, 192, 193, 226 e 228.
[000191] Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a um ou mais de resíduos 137, 188, 192, 193, 226, 227, 228, 131, 132, 133 e 130. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 de resíduos 137, 188, 192, 193, 226, 227, 228, 131, 132, 133 e 130. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) um ou mais de resíduos 137, 188, 192, 193, 226, 227, 228, 131, 132 e 133. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de resíduos 137, 188, 192, 193, 226, 227, 228, 131, 132 e 133.
[000192] Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a um ou mais de resíduos 227, 131, 132, 133 e 130. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a qualquer 1, 2, 3, 4 ou 5 de resíduos 227, 131, 132, 133 e 130. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) um ou mais de resíduos 227, 131, 132 e 133. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) qualquer 1, 2, 3 ou 4 de resíduos 227, 131, 132 e 133.
[000193] Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a um ou mais de resíduos 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226, 227, 228 e 130. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 de resíduos 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226, 227, 228 e 130. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) um ou mais de resíduos 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226, 227 e 228. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de resíduos 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226, 227 e 228.
[000194] Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a um ou mais de resíduos 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226, 228 e 130. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de resíduos 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226, 228 e 130. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) um ou mais de resíduos 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226 e 228. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 de resíduos 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226 e 228.
[000195] Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a um ou mais de resíduos 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226, 227, 228 e 130. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 de resíduos 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226, 227, 228 e 130. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) um ou mais de resíduos 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226, 227 e 228. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 de resíduos 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226, 227 e 228.
[000196] Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a um ou mais de resíduos 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226, 228 e 130. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 de resíduos 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226, 228 e 130. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) um ou mais de resíduos 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226 e 228. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 de resíduos 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226 e 228.
[000197] Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a um ou mais de resíduos 137, 188, 192, 193, 226, 228, 131, 132, 133, 221, 227 e 130. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 de resíduos 137, 188, 192, 193, 226, 228, 131, 132, 133, 221, 227 e 130. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) um ou mais de resíduos 137, 188, 192, 193, 226, 228, 131, 132, 133, 221 e 227. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 de resíduos 137, 188, 192, 193, 226, 228, 131, 132, 133, 221 e 227.
[000198] Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a um ou mais de resíduos 131, 132, 133, 221, 227 e 130. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a qualquer 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 de resíduos 131, 132, 133, 221, 227 e 130. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) um ou mais de resíduos 131, 132, 133, 221 e 227. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem (por exemplo, HA de H5) nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) qualquer 1, 2, 3, 4 ou 5 de resíduos 131, 132, 133, 221 e 227.
[000199] Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA, e particularmente uma variante de polipeptídeo de H5, tem uma ou mais substituições de aminoácido com relação a uma HA parental do tipo selvagem em resíduos selecionados de aminoácidos localizados na região do receptor que se liga diretamente ao glicano, incluindo, mas não limitado a, resíduos 98, 136, 153, 155, 183 e 194. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de acordo com a invenção, e particularmente uma variante de polipeptídeo de H5, tem uma ou mais substituições de aminoácido com relação a uma HA parental do tipo selvagem nos resíduos selecionados de aminoácidos localizados adjacentes à região do receptor que se liga diretamente ao glicano, incluindo, mas não limitado a, (a) resíduos 98 e 195, (b) resíduos 98, 138, 186, 187, 195 e 228) ou (c) resíduos 138, 186, 187 e 228.
[000200] Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de acordo com a invenção, e particularmente uma variante de H5, tem uma ou mais das substituições de aminoácido que seguem: Ser132Thr, Ala133Thr, Ser133Thr, Ser137Ala, Ser137Arg, Ile155Thr, Lys156Glu, Asn158Xaa (em que Xaa = qualquer aminoácido além de Asn), Thr160Ala, Asn186Pro, Asp187Ser, Asp187Thr, Ala188Glu, Ala188Asp, Ala189Gln, Ala189Lys, Ala189Thr, Glu190Asp, Glu190Thr, Thr192Arg/Lys, Lys193Arg, Lys193Asn, Lys193His, Lys193Ser, Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val, Ser221Pro, Gly225Asp, Gln226Ile, Gln226Leu, Gln226Val, Ser227Ala, Gly228Ser.
[000201] Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) de acordo com a invenção tem uma substituição de aminoácido em uma posição correspondendo ao resíduo 192, que muda a carga nesta posição. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) de acordo com a invenção tem uma substituição de aminoácido em uma posição correspondendo ao resíduo 193, que muda a carga nesta posição. Por exemplo, em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA (por exemplo, um polipeptídeo de HA de H5) de acordo com a invenção tem um Thr ou um resíduo hidrofóbico (por exemplo, Val ou Ila) na posição correspondendo ao resíduo 192, e uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) (por exemplo, uma variante adaptada para humano) tem um resíduo hidrofílico em uma posição correspondendo ao resíduo 192. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) (por exemplo, uma variante adaptada para humano) tem um resíduo hidrofílico em uma posição correspondendo ao resíduo 192. Para dar outro exemplo, em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA (por exemplo, um polipeptídeo de HA de H5) de acordo com a invenção tem um Thr ou um resíduo hidrofóbico (por exemplo, Val ou Ile) em uma posição correspondendo ao resíduo 192 e uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) (por exemplo, uma variante adaptada para humano) tem um resíduo básico (por exemplo, Lys ou Arg) em uma posição correspondendo ao resíduo 192. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) (por exemplo, uma variante adaptada para humano) tem um resíduo básico (por exemplo, Lys ou Arg) em uma posição correspondendo ao resíduo 192. Para dar ainda outro exemplo, em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA (por exemplo, um polipeptídeo de HA de H5) de acordo com a invenção tem um resíduo básico (por exemplo, Lys ou Arg) em uma posição correspondendo ao resíduo 193 e uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) (por exemplo, uma variante adaptada para humano) tem um resíduo neutro ou ácido em uma posição correspondendo ao resíduo 193. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) (por exemplo, uma variante adaptada para humano) tem um resíduo neutro ou ácido em uma posição correspondendo ao resíduo 193. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) (por exemplo, uma variante adaptada para humano) tem um Thr, Ala, Met ou Val em uma posição correspondendo ao resíduo 193.
[000202] Em algumas modalidades, adaptação humana de polipeptídeos de HA (por exemplo, polipeptídeos de HA de H5) está associada com as propriedade(s) do resíduo na posição 188. Em HA de H5, o resíduo 188 é frequentemente Ala, que faz contato com Thr ou um resíduo hidrofóbico em 192. Em contraste, em HA de H2, o resíduo 188 é frequentemente Glu ou Asp, que faz contato com Arg ou Lys em 192. Desta maneira, em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) tem um Glu na posição 188. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) tem um Asp na posição 188. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) tem uma substituição Ala188Glu. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) tem uma substituição Ala188Asp.
[000203] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA (por exemplo, um polipeptídeo de HA de H5) tem um Ala em uma posição correspondendo ao resíduo 188 e um Thr em uma posição correspondendo ao resíduo 192. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA (por exemplo, um polipeptídeo de HA de H5) tem um Ala em uma posição correspondendo ao resíduo 188 e um resíduo hidrofóbico em uma posição correspondendo ao resíduo 192. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) tem um Glu em uma posição correspondendo ao resíduo 188 e um Arg em uma posição correspondendo ao resíduo 192. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) tem um Asp em uma posição correspondendo ao resíduo 188 e um Arg em uma posição correspondendo ao resíduo 192. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) tem um Glu em uma posição correspondendo ao resíduo 188 e um Lys em uma posição correspondendo ao resíduo 192. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) tem um Asp em uma posição correspondendo ao resíduo 188 e um Lys em uma posição correspondendo ao resíduo 192.
[000204] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA (por exemplo, um polipeptídeo de HA de H5) tem um Ala em uma posição correspondendo ao resíduo 188, um Thr em uma posição correspondendo ao resíduo 192 e um Lys em uma posição correspondendo ao resíduo 193. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA (por exemplo, um polipeptídeo de HA de H5) tem um Ala em uma posição correspondendo ao resíduo 188, um resíduo hidrofóbico em uma posição correspondendo ao resíduo 192 e um Lys em uma posição correspondendo ao resíduo 193. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA (por exemplo, um polipeptídeo de HA de H5) tem um Ala em uma posição correspondendo ao resíduo 188, um Thr em uma posição correspondendo ao resíduo 192 e um Arg em uma posição correspondendo ao resíduo 193. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA (por exemplo, um polipeptídeo de HA de H5) tem um Ala em uma posição correspondendo ao resíduo 188, um resíduo hidrofóbico em uma posição correspondendo ao resíduo 192 e um Arg em uma posição correspondendo ao resíduo 193. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) tem um Glu em uma posição correspondendo ao resíduo 188, um Arg em uma posição correspondendo ao resíduo 192 e um Thr em uma posição correspondendo ao resíduo 193. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) tem um Asp em uma posição correspondendo ao resíduo 188, um Arg em uma posição correspondendo ao resíduo 192 e um Thr em uma posição correspondendo ao resíduo 193. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) tem um Glu em uma posição correspondendo ao resíduo 188, um Lys em uma posição correspondendo ao resíduo 192 e um Thr em uma posição correspondendo ao resíduo 193. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) tem um Asp em uma posição correspondendo ao resíduo 188, um Lys em uma posição correspondendo ao resíduo 192 e um Thr em uma posição correspondendo ao resíduo 193. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) tem um Glu em uma posição correspondendo ao resíduo 188, um Arg em uma posição correspondendo ao resíduo 192 e um Thr, Ala, Met ou Val em uma posição correspondendo ao resíduo 193. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) tem um Asp em uma posição correspondendo ao resíduo 188, um Arg em uma posição correspondendo ao resíduo 192 e um Thr, Ala, Met ou Val em uma posição correspondendo ao resíduo 193. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) tem um Glu em uma posição correspondendo ao resíduo 188, um Lys em uma posição correspondendo ao resíduo 192 e um Thr, Ala, Met ou Val em uma posição correspondendo ao resíduo 193. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) tem um Asp em uma posição correspondendo ao resíduo 188, um Lys em uma posição correspondendo ao resíduo 192 e um Thr, Ala, Met ou Val em uma posição correspondendo ao resíduo 193.
[000205] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA (por exemplo, um polipeptídeo de HA de H5) tem um Ala em uma posição correspondendo ao resíduo 131. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) tem um Thr em uma posição correspondendo ao resíduo 131.
[000206] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA (por exemplo, um polipeptídeo de HA de H5) tem um Ser em uma posição correspondendo ao resíduo 132. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) tem um Thr em uma posição correspondendo ao resíduo 132.
[000207] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA (por exemplo, um polipeptídeo de HA de H5) tem um Ser em uma posição correspondendo ao resíduo 133. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) tem um Thr em uma posição correspondendo ao resíduo 133.
[000208] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA (por exemplo, um polipeptídeo de HA de H5) inclui Ala, Thr e/ou Ser em qualquer posição correspondendo aos resíduos 131, 132 e/ou 133. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) inclui Ala, Thr e/ou Ser em qualquer posição correspondendo aos resíduos 131, 132 e/ou 133. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) inclui Thr em todas as posições correspondendo a 131, 132 e 133.
[000209] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA (por exemplo, um polipeptídeo de HA de H5) tem um Val em uma posição correspondendo ao resíduo 135. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) tem qualquer aminoácido que não Val em uma posição correspondendo ao resíduo 135.
[000210] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA (por exemplo, um polipeptídeo de HA de H5) tem um Ser em uma posição correspondendo ao resíduo 137. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) tem um Arg em uma posição correspondendo ao resíduo 137.
[000211] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA (por exemplo, um polipeptídeo de HA de H5) tem um Ile em uma posição correspondendo ao resíduo 155. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) tem um Thr em uma posição correspondendo ao resíduo 155. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA (por exemplo, um polipeptídeo de HA de H5) inclui um Thr em uma posição correspondendo ao resíduo 155. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) inclui um Thr em uma posição correspondendo ao resíduo 155.
[000212] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA (por exemplo, um polipeptídeo de HA de H5) tem um Ser em uma posição correspondendo ao resíduo 221. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) tem um Pro em uma posição correspondendo ao resíduo 221.
[000213] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA (por exemplo, um polipeptídeo de HA de H5) inclui um Ser em uma posição correspondendo ao resíduo 221. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) inclui um Pro em uma posição correspondendo ao resíduo 221. Sem desejar ser limitado por nenhuma teoria particular, Pro221 poderia influenciar a conformação da alça 220 que está envolvida com o RBS de HA de H2.
[000214] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA (por exemplo, um polipeptídeo de HA de H5) tem um Gln em uma posição correspondendo ao resíduo 226. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) tem um Leu em uma posição correspondendo ao resíduo 226.
[000215] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA (por exemplo, um polipeptídeo de HA de H5) tem um Ser em uma posição correspondendo ao resíduo 227. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) tem um Gly em uma posição correspondendo ao resíduo 227.
[000216] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA (por exemplo, um polipeptídeo de HA de H5) tem um Gly em uma posição correspondendo ao resíduo 228. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) tem um Ser em uma posição correspondendo ao resíduo 228.
[000217] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA (por exemplo, um polipeptídeo de HA de H5) inclui resíduos Gln, Ser e Gly nas posições correspondendo aos resíduos 226, 227 e 228, respectivamente. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) inclui um Leu, Gly e Ser nas posições correspondendo aos resíduos 226, 227 e 228, respectivamente.
[000218] Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de acordo com a invenção, e particularmente uma variante de H5, tem um ou mais dos aminoácidos que seguem nas posições indicadas (a numeração dessas posições corresponde à numeração de HA de H3):
[000219] Glu190Asp, Lys193Ser, Gly225Asp, Gln226Leu
[000220] Glu190Asp, Lys193Ser, Gln226Leu, Gly228Ser
[000221] Ala189Gln, Lys193Ser, Thr160Ala
[000222] Ala189Gln, Lys193Ser, Gln226Leu, Gly228Ser
[000223] Asp187Ser/Thr, Ala189Gln, Lys193Ser, Gln226Leu, Gly228Ser
[000224] Ala189Lys, Lys193Asn, Gln226Leu, Gly228Ser
[000225] Asp187Ser/Thr, Ala189Lys, Lys193Asn, Gln226Leu, Gly228Ser
[000226] Lys156Glu, Ala189Lys, Lys193Asn, Gln226Leu, Gly228Ser
[000227] Lys193His, Gln226Leu/Ile/Val, Gly228Ser
[000228] Lys193Arg, Gln226Leu/Ile/Val, Gly228Ser
[000229] Ala189Lys, Lys193Asn, Gly225Asp
[000230] Lys156Glu, Ala189Lys, Lys193Asn, Gly225Asp
[000231] Ser137Ala, Lys156Glu, Ala189Lys, Lys193Asn, Gly225Asp
[000232] Glu190Thr, Lys193Ser, Gly225Asp
[000233] Asp187Thr, Ala189Thr, Glu190Asp, Lys193Ser, Gly225Asp
[000234] Asn186Pro, Asp187Thr, Ala189Thr, Glu190Asp, Lys193Ser, Gly225Asp
[000235] Asn186Pro, Asp187Thr, Ala189Thr, Glu190Asp, Lys193Ser, Gly225Asp, Ser227Ala
[000236] Gln226Leu, Gly228Ser, Thr160Ala
[000237] Gln226Leu, Gly228Ser, Thr160Ala
[000238] Gly228Ser, Thr160Ala
[000239] Gln226Leu, Thr160Ala
[000240] Gln226Leu, Gly228Ser
[000241] Thr160Ala
[000242] Gln226Leu, Gly228Ser, Asn158Xaa (em que Xaa = qualquer aminoácido além de Asn)
[000243] Gly228Ser, Asn158Xaa
[000244] Gln226Leu, Asn158Xaa
[000245] Gln226Leu, Gly228Ser
[000246] Asn158Xaa
[000247] 130 (em que "130" indica uma deleção em um aminoácido correspondendo à posição 130) mais qualquer combinação possível de mutações em posições correspondendo aos resíduos 131, 132, 133, 135, 137, 155, 188, 192, 193, 221, 226, 227 e 228
[000248] 130 mais qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo aos resíduos 131, 132, 135, 188, 192 e 221
[000249] 130 mais qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo aos resíduos 133, 137, 155, 193, 226, 227 e 228
[000250] 130 mais qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo aos resíduos 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221, 226, 227 e 228
[000251] 130 mais qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo aos resíduos 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226, 227 e 228
[000252] 130 mais qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo aos resíduos 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226 e 228
[000253] 130 mais qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo aos resíduos 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226, 227 e 228
[000254] 130 mais qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo aos resíduos 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226 e 228
[000255] 130 mais qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo aos resíduos 137, 188, 192, 193, 226, 228, 131, 132, 133, 221 e 227
[000256] 130 mais qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo aos resíduos 131, 132, 133, 221 e 227
[000257] 130 mais qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo aos resíduos 137, 188, 192, 193, 226 e 228
[000258] 130 mais qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo aos resíduos 137, 188, 192, 193, 226, 227, 228, 131, 132 e 133
[000259] 130 mais qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo aos resíduos 227, 131, 132 e 133
[000260] Gln226Leu, Gly228Ser, Thr160Ala, 130
[000261] Gln226Leu, Gly228Ser, 130
[000262] Gln226Leu, Thr160Ala, 130
[000263] Gly228Ser, Thr160Ala, 130
[000264] Gln226Leu, 130
[000265] Gly228Ser, 130
[000266] Thr160Ala, 130
[000267] 130
[000268] 130, Ala131Thr, Leu133Thr, Ser137Arg, Ile155Thr, Ala188Glu, Thr/Ile192Arg/Lys, Arg/Lys193Thr/Ala, Gln226Leu, Ser227Gly, Gly228Ser
[000269] 130, Ala131Thr, Leu133Thr, Ser137Arg, Ile155Thr, Ala188Glu, Thr/Ile192Arg/Lys, Arg/Lys193Thr/Ala, Gln226Leu, Gly228Ser
[000270] 130, Ala131Thr, Leu133Thr, Ser137Arg, Ile155Thr,Asn159Asp (ou Thr160Ala ou ambos), Ala188Glu, Thr/Ile192Arg/Lys,Arg/Lys193Thr/Ala, Gln226Leu, Ser227Gly, Gly228Ser
[000271] 130, Ala131Thr, Leu133Thr, Ser137Arg, Ile155Thr,Asn159Asp (ou Thr160Ala ou ambos), Ala188Glu, Thr/Ile192Arg/Lys, Arg/Lys193Thr/Ala, Gln226Leu, Gly228Ser
[000272] 130, Ser137Arg, Ala188Glu, Thr192Arg/Lys,Arg/Lys193Thr/Met/Ala/Val, Gln226Leu, Gly228Ser
[000273] 130, Ser137Arg, Ala188Glu, Thr192Arg/Lys,Arg/Lys193Thr/Met/Ala/Val, Gln226Leu, Gly228Ser, Xaa131Ser/Thr, Xaa132Ser/Thr, Xaa133Ser/Thr, Ser221Pro, Ser227Gly (em que Xaa = qualquer aminoácido)
[000274] 130, Xaa131Ser/Thr, Xaa132Ser/Thr, Xaa133Ser/Thr, Ser221Pro, Ser227Gly (em que Xaa = qualquer aminoácido)
[000275] 130, Xaa192Xaa’ (em que Xaa = qualquer aminoácido hidrofóbico e Xaa’ = qualquer aminoácido hidrofílico)
[000276] 130, Xaa192Lys/Arg (em que Xaa = qualquer resíduo hidrofóbico)
[000277] 130, Xaa193Xaa’ (em que Xaa = um resíduo básico, por exemplo, Lys ou Arg e Xaa’ = um resíduo neutro ou ácido)
[000278] 130, Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val
[000279] 130, Xaa192Xaa’ (em que Xaa = qualquer aminoácido hidrofóbico e Xaa’ = qualquer aminoácido hidrofílico), Xaa193Xaa’ (em que Xaa = um resíduo básico, por exemplo, Lys ou Arg e Xaa’ = um resíduo neutro ou ácido)
[000280] 130, Xaa192Lys/Arg (em que Xaa = qualquer resíduo hidrofóbico), Xaa193Xaa’ (em que Xaa = um resíduo básico, por exemplo, Lys ou Arg e Xaa’ = um resíduo neutro ou ácido)
[000281] 130, Xaa192Xaa’ (em que Xaa = qualquer aminoácido hidrofóbico e Xaa’ = qualquer aminoácido hidrofílico), Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val
[000282] 130, Xaa192Lys/Arg (em que Xaa = qualquer resíduo hidrofóbico), Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val
[000283] 130, Ala188Glu
[000284] 130, Ala188Asp
[000285] 130, Xaa192Xaa’ (em que Xaa = qualquer aminoácido hidrofóbico e Xaa’ = qualquer aminoácido hidrofílico), Ala188Glu
[000286] 130, Xaa192Lys/Arg (em que Xaa = qualquer resíduo hidrofóbico), Ala188Glu
[000287] 130, Xaa193Xaa’ (em que Xaa = um resíduo básico, por exemplo, Lys ou Arg e Xaa’ = um resíduo neutro ou ácido), Ala188Glu
[000288] 130, Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val, Ala188Glu
[000289] 130, Xaa192Xaa’ (em que Xaa = qualquer aminoácido hidrofóbico e Xaa’ = qualquer aminoácido hidrofílico), Ala188Asp
[000290] 130, Xaa192Lys/Arg (em que Xaa = qualquer resíduo hidrofóbico), Ala188Asp
[000291] 130, Xaa193Xaa’ (em que Xaa = um resíduo básico, por exemplo, Lys ou Arg e Xaa’ = um resíduo neutro ou ácido), Ala188Asp
[000292] 130, Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val, Ala188Asp
[000293] 130, Xaa192Xaa’ (em que Xaa = qualquer aminoácido hidrofóbico e Xaa’ = qualquer aminoácido hidrofílico), Xaa193Xaa’ (em que Xaa = um resíduo básico, por exemplo, Lys ou Arg e Xaa’ = um resíduo neutro ou ácido), Ala188Glu
[000294] 130, Xaa192Lys/Arg (em que Xaa = qualquer resíduo hidrofóbico), Xaa193Xaa’ (em que Xaa = um resíduo básico, por exemplo, Lys ou Arg e Xaa’ = um resíduo neutro ou ácido), Ala188Glu
[000295] 130, Xaa192Xaa’ (em que Xaa = qualquer aminoácido hidrofóbico e Xaa’ = qualquer aminoácido hidrofílico), Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val, Ala188Glu
[000296] 130, Xaa192Lys/Arg (em que Xaa = qualquer resíduo hidrofóbico), Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val, Ala188Glu
[000297] 130, Xaa192Xaa’ (em que Xaa = qualquer aminoácido hidrofóbico e Xaa’ = qualquer aminoácido hidrofílico), Xaa193Xaa’ (em que Xaa = um resíduo básico, por exemplo, Lys ou Arg e Xaa’ = um resíduo neutro ou ácido), Ala188Asp
[000298] 130, Xaa192Lys/Arg (em que Xaa = qualquer resíduo hidrofóbico), Xaa193Xaa’ (em que Xaa = um resíduo básico, por exemplo, Lys ou Arg e Xaa’ = um resíduo neutro ou ácido), Ala188Asp
[000299] 130, Xaa192Xaa’ (em que Xaa = qualquer aminoácido hidrofóbico e Xaa’ = qualquer aminoácido hidrofílico), Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val, Ala188Asp
[000300] 130, Xaa192Lys/Arg (em que Xaa = qualquer resíduo hidrofóbico), Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val, Ala188Asp
[000301] Em algumas modalidades, a presente invenção provê polipeptídeos de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA, polipeptídeos de HA engenheirados e/ou variantes de polipeptídeo de HA engenheirados) cuja sequência de aminoácido inclui um elemento conforme mostrado abaixo:
[000302] X190, X193, X225 e X226
[000303] X190, X193, X226 e X228
[000304] X189, X193, X160
[000305] X189, X193, X226, X228
[000306] X187, X189, X193, X226, X228
[000307] X189, X193, X226, X228
[000308] X187, X189, X193, X226, X228
[000309] X156, X189, X193, X226, X228
[000310] X193, X226, X228
[000311] X193, X226, X228
[000312] X189, X193, X225
[000313] X156, X189, X193, X225
[000314] X137, X156, X189, X193, X225
[000315] X190, X193, X225
[000316] X187, X189, X190, X193, X225
[000317] X186, X187, X189, X190, X193, X225
[000318] X186, X187, X189, X190, X193, X225, X227
[000319] X226, X228, X160
[000320] X226, X228, X160
[000321] X228, X160
[000322] X226, X160
[000323] X226, X228
[000324] X160
[000325] X226, X228, Xaa158 (em que Xaa = qualquer aminoácido além de Asn)
[000326] X228, Xaa158 (em que Xaa = qualquer aminoácido além de Asn)
[000327] X226, Xaa158 (em que Xaa = qualquer aminoácido além de Asn)
[000328] X226, X228
[000329] X158 (em que Xaa = qualquer aminoácido além de Asn)
[000330] X130 mais qualquer combinação possível de X131, X132, X133, X135, X137, X155, X188, X192, X193, X221, X226, X227 e X228
[000331] X130 mais qualquer combinação possível de X131, X132, X135, X188, X192 e X221
[000332] X130 mais qualquer combinação possível de X133, X137, X155, X193, X226, X227 e X228
[000333] X130 mais qualquer combinação possível de X131, X132, X133, X135, X137, X155, Xaa158 (em que Xaa = qualquer aminoácido além de Asn), X160, X188, X192, X193, X221, X226, X227 e X228
[000334] X130 mais qualquer combinação possível de X131, X133, X137, X155, X188, X192, X193, X226, X227 e X228
[000335] X130 mais qualquer combinação possível de X131, X133, X137, X155, X188, X192, X193, X226 e X228
[000336] X130 mais qualquer combinação possível de X131, X133, X137, X155, X159, X160, X188, X192, X193, X226, X227 e X228
[000337] X130 mais qualquer combinação possível de X131, X133, X137, X155, X159, X160, X188, X192, X193, X226 e X228
[000338] X130 mais qualquer combinação possível de X137, X188, X192, X193, X226, X228, X131, X132, X133, X221 e X227
[000339] X130 mais qualquer combinação possível de X131, X132, X133, X221 e X227
[000340] X130 mais qualquer combinação possível de X137, X188,X192, X193, X226 e X228
[000341] X130 mais qualquer combinação possível de X137, X188, X192, X193, X226, X227, X228, X131, X132 e X133
[000342] X130 mais qualquer combinação possível de X227, X131, X132 e X133
[000343] X226, X228, X160, X130
[000344] X226, X228, X130
[000345] X226, X160, X130
[000346] X228, X160, X130
[000347] X226, X130
[000348] X228, X130
[000349] X160, X130
[000350] X130
[000351] X130, X131, X133, X137, X155, X188, X192, X193, X226, X227, X228
[000352] X130, X131, X133, X137, X155, X188, X192, X193, X226, X228
[000353] X130, X131, X133, X137, X155, X159, X160, X188, X192, X193, X226, X227, X228
[000354] X130, X131, X133, X137, X155, X159, X160, X188, X192,X193, X226, X228
[000355] X130, X137, X188, X192, X193, X226, X228
[000356] X130, X137, X188, X192, X193, X226, X228, X131, X132, X133, X221, X227
[000357] X130, X131, X132, X133, X221, X227
[000358] X130, X192
[000359] X130, X193
[000360] X130, X192, X193
[000361] X130, X188
[000362] X130, X192, X188
[000363] X130, X193, X188
[000364] X130, X192, X193, X188
[000365] em que X = qualquer aminoácido (a menos que de outra maneira especificado) e/ou X = um aminoácido faltante. A numeração dessas posições corresponde à numeração de HA de H3.
[000366] Em algumas modalidades, X130 é uma deleção na posição 130. Em algumas modalidades, X160 é um Ala. Em algumas modalidades, X158 é qualquer aminoácido que não Asn.
[000367] Em algumas tais modalidades, a variante do polipeptídeo de HA de H5 tem pelo menos uma substituição adicional comparado com uma HA de H5 do tipo selvagem, de maneira que afinidade e/ou especificidade da variante para glicanos guarda-chuva é aumentada.
[000368] Em algumas tais modalidades, o polipeptídeo de HA tem pelo menos uma substituição adicional comparado com uma HA do tipo selvagem, de maneira que afinidade e/ou especificidade da variante para glicanos guarda-chuva é aumentada.
[000369] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção (incluindo as variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem L226, S228 e A160. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem L226 e A160. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem S228 e A160. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem A160.
[000370] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem L226, S228 e X158 (em que X = qualquer aminoácido além de Asn). Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção (incluindo as variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem L226 e X158. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem S228 e X158. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção (incluindo as variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem X158.
[000371] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem 130 e qualquer combinação possível de mutações em posições correspondendo aos resíduos 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221, 226, 227 e 228.
[000372] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem 130, L226, S228, A160 e qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo aos resíduos 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 188, 192, 193, 221 e 227. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem 130, L226, A160 e qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo aos resíduos 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 188, 192, 193, 221, 227 e 228. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem 130, S228, A160 e qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo aos resíduos 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 188, 192, 193, 221 e 227. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem 130, L226, S228 e qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo aos resíduos 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221 e 227.
[000373] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem 130, A160 e qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo aos resíduos 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 188, 192, 193, 221, 226, 227 e 228. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem 130, L226 e qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo aos resíduos 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221 e 227 e 228. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem 130, S228 e qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo aos resíduos 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221, 226 e 227.
[000374] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem 130, L226, S228, X158 (em que X = qualquer aminoácido além de Asn) e qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo aos resíduos 131, 132, 133, 135, 137, 155, 160, 188, 192, 193, 221 e 227. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem 130, L226, X158 e qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo aos resíduos 131, 132, 133, 135, 137, 155, 160, 188, 192, 193, 221, 227 e 228. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem 130, S228, X158 e qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo aos resíduos 131, 132, 133, 135, 137, 155, 160, 188, 192, 193, 221 e 227. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem 130, L226, S228 e qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo aos resíduos 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221 e 227.
[000375] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem 130, X158 (em que X = qualquer aminoácido além de Asn) e qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo aos resíduos 131, 132, 133, 135, 137, 155, 160, 188, 192, 193, 221, 226, 227 e 228.
[000376] Em algumas modalidades, as variantes de polipeptídeo de HA de H5 (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) de acordo com a invenção têm um sítio de ligação aberto comparado com uma HA parental, e particularmente com uma HA do tipo selvagem parental.
[000377] Em algumas modalidades, polipeptídeos de HA (por exemplo, polipeptídeos de HA de H5) de acordo com a invenção se ligam aos glicanos sialilados por α2-6 que seguem:
e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de H5 de acordo com a invenção se ligam a glicanos da estrutura
e combinações dos mesmos; e/ou
e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA (por exemplo, polipeptídeos de HA de H5) de acordo com a invenção se ligam a
e/ou
em algumas modalidades a
em algumas modalidades a
e em algumas modalidades a
[000378] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA (por exemplo, polipeptídeos de HA de H5) de acordo com a invenção se ligam a glicanos de topologia de guarda-chuva. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de H5 de acordo com a invenção se ligam a pelo menos alguns dos glicanos (por exemplo, glicanos sialilados por α2-6) mostrados na Figura 9. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA (por exemplo, polipeptídeos de HA de H5) de acordo com a invenção se ligam a glicanos múltiplos mostrados na Figura 9.
[000379] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA (por exemplo, polipeptídeos de HA de H5) de acordo com a invenção se ligam a pelo menos cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30% cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90% cerca de 95% ou mais dos glicanos encontrados em receptores de HA em tecidos do trato respiratório superior humano (por exemplo, células epiteliais).
[000380] Em um aspecto, a presente invenção provê o reconhecimento particular que ligação com alta afinidade a glicanos de topologia de guarda-chuva sozinha pode não ser suficiente para conferir transmissão e/ou infectividade eficaz de humanos. A presente invenção provê a compreensão que ligação reduzida a glicanos de topologia de cone pode ser também importante. Em algumas modalidades, ligação com alta afinidade a glicanos de topologia de guarda-chuva e ligação com afinidade reduzida a glicanos de topologia de cone podem estar envolvidas em conferência de transmissão e/ou infectividade eficaz de humanos. Em algumas modalidades, ligação com alta afinidade a glicanos de topologia de guarda-chuva é suficiente para conferir transmissão a/infectividade eficaz de humanos. Em algumas modalidades, ligação com alta afinidade a glicanos de topologia de guarda-chuva é suficiente para conferir transmissão a/infectividade eficaz de humanos, mesmo se a afinidade de ligação com glicanos de topologia de cone não for reduzida (por exemplo, não modificada, aumentada, etc).
[000381] Em algumas modalidades, afinidade e/ou especificidade de ligação aumentada de uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) a glicanos de topologia de guarda-chuva e afinidade e/ou especificidade de ligação reduzida com glicanos de topologia de cone podem estar envolvidas em aumento de transmissão para/infectividade de humanos com relação a um polipeptídeo de referência (por exemplo, o polipeptídeo de HA parental cognato da variante do polipeptídeo de HA). Em algumas modalidades, afinidade e/ou especificidade alta de ligação de uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) com glicanos de topologia de guarda-chuva é suficiente para aumentar a transmissão e/ou infectividade de humanos com relação a um polipeptídeo de referência (por exemplo, o polipeptídeo de HA parental cognato da variante do polipeptídeo de HA). Em algumas modalidades, afinidade e/ou especificidade alta de ligação de uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) a glicanos de topologia de guarda-chuva é suficiente para aumentar a transmissão a/infectividade de humanos com relação a um polipeptídeo de referência (por exemplo, o polipeptídeo de HA parental cognato da variante do polipeptídeo de HA), mesmo se a afinidade e/ou especificidade de ligação a glicanos de topologia de cone não for reduzida (por exemplo, não mudada, aumentada, etc). Em algumas modalidades, afinidade e/ou especificidade de ligação alta de uma variante de polipeptídeo de HA (por exemplo, uma variante de polipeptídeo de HA de H5) a glicanos de topologia guarda-chuva é suficiente para aumentar a transmissão a/infectividade de humanos com relação a um polipeptídeo de referência (por exemplo, o polipeptídeo de HA parental cognato da variante do polipeptídeo de HA), mesmo se a afinidade e/ou especificidade de ligação a glicanos de topologia de cone for igual a e/ou maior do que a afinidade e/ou especificidade a glicanos de topologia de guarda-chuva.
[000382] A presente invenção provê ainda porções características (que podem ou não ser agentes de ligação) de polipeptídeos de HA de acordo com a invenção e ácidos nucleicos que os codificam. Em geral, uma porção característica é uma que contém uma extensão contínua de aminoácidos, ou uma coleção de extensões contínuas de aminoácidos, que juntas são características do polipeptídeo de HA. Cada tal extensão contínua geralmente vai conter pelo menos dois aminoácidos. Ainda, aqueles de habilidade comum na técnica vão compreender que tipicamente pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20 ou mais aminoácidos precisam ser característicos de um polipeptídeo de HA de H5. Em geral, uma porção característica é uma que, em adição à identidade de sequência especificada acima, compartilha pelo menos uma característica funcional com o polipeptídeo de HA intacto relevante. Em algumas modalidades, porções características de polipeptídeos de HA de acordo com a invenção compartilham características de ligação a glicano com polipeptídeos de HA de comprimento integral relevantes.
[000383] Em algumas modalidades, os agentes de ligação providos de acordo com a presente invenção são polipeptídeos cuja sequência de aminoácido não inclui uma sequência de HA característica. Tais polipeptídeos são referidos aqui como "Polipeptídeos não HA". Em algumas modalidades, um polipeptídeo não HA tem uma sequência de aminoácido selecionada previamente (por exemplo, através de projeto rotacional, incluindo, por exemplo, introdução de alterações de aminoácido estratégicas [por exemplo, adições, deleções e/ou substituições] comparado com uma sequência de referência). Em algumas modalidades, um polipeptídeo não HA tem uma sequência de aminoácido que é determinada estocasticamente e, por exemplo, identificada com base nas características de ligação desejáveis definidas aqui.
[000384] Em algumas modalidades, os agentes de ligação providos de acordo com a presente invenção são anticorpos (por exemplo, que se ligam a glicanos de topologia de guarda-chuva e/ou a imitações de glicano de topologia de guarda-chuva). Os anticorpos adequados para a invenção incluem anticorpos ou fragmentos de anticorpos que se ligam imunoespecificamente a qualquer epítopo de glicano de topologia de guarda-chuva. Conforme aqui usado, o termo "anticorpos" pretende incluir imunoglobulinas e fragmentos das mesmas que são especificamente reativas à proteína ou peptídeo projetado, ou fragmentos dos mesmos. Anticorpos adequados incluem, mas não estão limitados a, anticorpos humanos, anticorpos primatizados, anticorpos quiméricos, anticorpos biespecíficos, anticorpos humanizados, anticorpos conjugados (isto é, anticorpos conjugados ou fundidos a outras proteínas, radiomarcadores, citotoxinas),
[000385] Small Modular ImmunoPharmaceuticals ("SMIPs®"), anticorpos de cadeia simples, anticorpos cameloides e fragmentos de anticorpo. Conforme aqui usado, o termo "anticorpos" também inclui anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos de domínio simples (por exemplo, anticorpos de domínio simples de tubarão (por exemplo, IgNAR ou fragmentos do mesmo)), anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) formados de pelo menos dois anticorpos intactos e fragmentos de anticorpo contanto que eles exibam a atividade biológica desejada. Os polipeptídeos de anticorpo para uso aqui podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM).
[000386] Conforme aqui usado, um "fragmento de anticorpo" inclui uma porção de um anticorpo intacto, tal como, por exemplo, a região de ligação a antígeno ou variável de um anticorpo. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2 e Fv; triacorpos; tetracorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia simples; e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpo. O termo "fragmento de anticorpo" também inclui qualquer proteína sintética ou geneticamente engenheirada que age como um anticorpo através de ligação a um antígeno específico para formar um complexo. Por exemplo, fragmentos de anticorpo incluem fragmentos isolados, fragmentos "Fv", consistindo nas regiões variáveis das cadeias pesadas e leves, moléculas de polipeptídeo de cadeia simples recombinantes em que regiões variáveis de cadeias leve e pesada são conectadas por um ligante de peptídeo ("proteínas ScFv") e unidades de reconhecimento mínimo consistindo nos resíduos de aminoácido que imitam a região hipervariável.
[000387] Anticorpos podem ser gerados usando métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, protocolos para produção de anticorpo são descritos para Harlow e Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual; incorporado aqui a título de referência. Tipicamente, os anticorpos podem ser gerados em camundongo, rato, porquinho-da-índia, hamster, camelo, lhama, tubarão ou outro hospedeiro apropriado. Alternativamente, os anticorpos podem ser produtos em galinhas, produzindo moléculas IgY (Schade e outros, 1996, ALTEX 13(5):80-85; incorporado aqui a título de referência). Em algumas modalidades, os anticorpos adequados para a presente invenção são anticorpos de primata sub-humanos. Por exemplo, técnicas gerais para criação de anticorpos terapeuticamente úteis em babuínos podem ser encontradas, por exemplo, em Goldenberg e outros, publicação de patente internacional número WO 91/11465, 1991; e em Losman e outros, 1990, Int. J. Cancer 46:310; ambos aqui incorporados a título de referência). Em algumas modalidades, os anticorpos monoclonais podem ser preparados usando métodos de hibridoma (Milstein e Cuello, 1983, Nature 305(5934):537-40; incorporado aqui a título de referência). Em algumas modalidades, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos através de métodos recombinantes (Número de Patente U.S. 4.166.452, 1979; incorporada aqui a título de referência).
[000388] Em algumas modalidades, os anticorpos adequados para a invenção podem incluir anticorpos humanizados ou humanos. Formas humanizadas de anticorpos não humanos são Igs quiméricas, cadeias de Ig ou fragmentos (tais como Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2 ou outras subsequências de ligação a antígeno de Abs) que contêm sequência mínima derivada de Ig não humana. Em geral, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácido introduzidos de uma fonte não humana. Esses resíduos de aminoácido não humanos são frequentemente referidos como resíduos "de importação", que são tipicamente obtidos de um domínio variável "de importação". Humanização é realizada substituindo sequências de um anticorpo humano por regiões de determinação de complementaridade (CDRs) ou sequências de CDR de anticorpo de roedor correspondentes (Riechmann e outros, 1988, Nature 332(6162):323-7; Verhoeyen e outros, 1988, Science. 239(4847):1534-6; ambos aqui incorporados a título de referência). Tais anticorpos "humanizados" são Abs quiméricos (Patente U.S. Número 4.816.567, 1989; incorporada aqui a título de referência), em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído por sequência correspondente de uma espécie não humana. Em algumas modalidades, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em Abs de roedor. Anticorpos humanizados incluem Igs humanas (anticorpo recipiente) em que resíduos de uma CDR do recipiente são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato ou coelho, tendo as especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos não humanos correspondentes substituem resíduos de estrutura de Fv de Ig humana. Anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo recipiente nem nas sequências de CDR ou estrutura principal importadas. Em geral, os anticorpos humanizados compreendem substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que a maioria, se não todas, das regiões de CDR correspondem àquelas de uma Ig não humana e a maioria, se não todas, das regiões de FR são aquelas de uma sequência de consenso de Ig humana. O anticorpo humanizado também compreende otimamente pelo menos uma porção de uma região constante de Ig (Fc), tipicamente aquela de Ig humana (Riechmann e outros, 1988, Nature 332(6162):323-7; Verhoeyen e outros, 1988, Science. 239(4847):1534-6; ambos aqui incorporados a título de referência).
[000389] Anticorpos humanos podem ser também produzidos usando várias técnicas, incluindo bibliotecas de exibição de fago (Hoogenboom e outros, 1991, Mol Immunol. 28(9):1027-37; Marks e outros, 1991, J Mol Biol. 222(3):581-97; ambos aqui incorporados a título de referência) e a preparação de anticorpos monoclonais humanos
[000390] (Reisfeld e Sell, 1985, Cancer Surv. 4(1):271-90; incorporado aqui a título de referência). Similarmente, introdução de genes de Ig humanos em animais transgênicos em que os genes de Ig endógenos foram parcialmente ou completamente inativados pode ser explorada para sintetizar anticorpos humanos. Quando da provocação, a produção de anticorpo humano é observada, o que lembra muito aquela vista em humanos em todos os aspectos, incluindo rearranjo, montagem e repertório de anticorpo (Fishwild e outros, 1996, Nat Biotechnol. 14(7):845-51; Lonberg e outros, 1994, Nature368(6474):856-9; Lonberg e Huszar, 1995, Int. Rev. Immunol. 13(1):65-93; Marks e outros, 1992, Biotechnology (N Y). 10(7):779-83; todos aqui incorporados a título de referência).
[000391] Em algumas modalidades, agentes de ligação providos de acordo com a presente invenção são lectinas. As lectinas são proteínas de ligação a açúcar que se ligam a um carboidrato solúvel ou a uma porção carboidrato que é parte de um glicoconjugado (por exemplo, um glicopeptídeo ou glicolipídeo). As lectinas tipicamente aglutinam certas células animais e/ou precipitam glicoconjugados através de reconhecimento de uma porção açúcar particular. Por exemplo, SNA-1 é uma lectina que tem uma afinidade alta com ácidos siálicos α2-6. Como ainda outro exemplo, lectinas escamosas poliporosas (PSL1a e PLS1b) têm alta afinidade de ligação a glicoconjugados sialilados contendo sequências de trissacarídeo
[000392] Neu5Acα2,6Galβ1,4Glc/GlcNAc de glicoproteínas ligadas à asparagina. Lectinas exemplares não limitantes que podem agir como agentes de ligação incluem SNA-1, SNA-1’, PSL1a, PSL1b e polipeptídeos derivados das mesmas.
[000393] As sequências de aminoácido de lectinas exemplares são providas abaixo:
[000394] Em algumas modalidades, os agentes de ligação providos de acordo com a presente invenção são aptâmeros. Os aptâmeros são macromoléculas compostas de ácido nucleico (por exemplo, RNA, DNA) que se ligam firmemente a um alvo molecular específico (por exemplo, um glicano de topologia de guarda-chuva). Um aptâmero particular pode ser descrito por uma sequência de nucleotídeo linear e é tipicamente cerca de 15 a cerca de 60 nucleotídeos de comprimento. Sem desejar ser limitado por nenhuma teoria, é compreendido que a cadeia de nucleotídeos em um aptâmero forma interações intramoleculares que dobram a molécula em um formato tridimensional complexo, e este formato tridimensional permite que o aptâmero se ligue firmemente à superfície de sua molécula alvo. Dada a extraordinária diversidade de formatos de moléculas que existe dentro do universo de todas as possíveis sequências de nucleotídeo, os aptâmeros podem ser obtidos para uma ampla variedade de alvos moleculares, incluindo proteínas e moléculas pequenas. Em adição à alta especificidade, os aptâmeros têm afinidades muito altas com seus alvos (por exemplo, afinidades na faixa de picomolar a nanomolar baixa para proteínas). Os aptâmeros são quimicamente estáveis e podem ser fervidos ou congelados sem perda de atividade. Devido ao fato deles serem moléculas sintéticas, eles são condescendentes a uma variedade de modificações, que podem otimizar sua função para aplicações particulares. Por exemplo, os aptâmeros podem ser modificados para reduzir drasticamente sua sensibilidade à degradação por enzimas no sangue para uso em aplicações in vivo. Ainda, os aptâmeros podem ser modificados para alterar sua biodistribuição ou tempo de residência no plasma.
[000395] Seleção de aptâmeros que podem se ligar a glicanos de topologia de guarda-chuva (e/ou a imitações de glicano de topologia de guarda-chuva) pode ser conseguida através de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, os aptâmeros podem ser selecionados usando o método SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) ((Tuerk e Gold, 1990, Science 249:505-510; incorporado aqui a título de referência). No método SELEX, uma biblioteca grande de moléculas de ácido nucleico (por exemplo, 105 moléculas diferentes) é produzida e/ou avaliada com a molécula alvo (por exemplo, um glicano de topologia de guarda-chuva de epítopo de glicano de topologia de guarda-chuva). A molécula alvo é deixada incubar com a biblioteca de sequências de nucleotídeo por um período de tempo. Vários métodos, conhecidos na técnica, podem ser então usados para isolar fisicamente as moléculas alvo do aptâmero das moléculas não ligadas na mistura, que podem ser descartadas. Os aptâmeros com a afinidade mais alta para a molécula alvo podem então ser purificados da molécula alvo e amplificados enzimaticamente para produzir uma nova biblioteca de moléculas que é substancialmente enriquecida em aptâmeros que podem se ligar à molécula alvo. A biblioteca enriquecida pode ser então usada para iniciar um novo ciclo de seleção, divisão e amplificação. Após 5-15 ciclos deste processo de seleção, divisão e amplificação iterativo, a biblioteca é reduzida para um número pequeno de aptâmeros que se ligam firmemente à molécula alvo. Moléculas individuais na mistura podem ser então isoladas, suas sequências de nucleotídeo determinadas e suas propriedades com relação à afinidade e especificidade de ligação medidas e comparadas. Os aptâmeros isolados podem ser então refinados mais para eliminar quaisquer nucleotídeos que não contribuam para ligação a alvo e/ou estrutura de aptâmero, desta maneira produzindo aptâmeros truncados no seu domínio de ligação a núcleo. Vide Jayasena, 1999, Clin. Chem. 45:1628-50 para uma revisão de tecnologia de aptâmero; cujos ensinamentos em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência.
[000396] Os polipeptídeos de acordo com a invenção (por exemplo, polipeptídeos de HA e/ou polipeptídeos não HA) e/ou porções características dos mesmos, ou ácidos nucleicos codificando os mesmos, podem ser produzidos através de qualquer meio adequado.
[000397] Os polipeptídeos de acordo com a invenção (ou porções características dos mesmos) podem ser produzidos, por exemplo, utilizando um sistema de célula hospedeiro engenheirado para expressar um ácido nucleico codificando polipeptídeo de acordo com a invenção.
[000398] Qualquer sistema pode ser usado para produzir polipeptí- deos (ou porções características), tais como células de ovo, baculoví- rus, planta, levedura, células de Rim Canino Madin-Darby (MDCK) (Mardin-Darby Canine Kidney cells) ou células Vero (rim de macaco verde Africano). Alternativamente ou adicionalmente, os polipeptídeos (ou porções características) podem ser expressos em células usando técnicas recombinantes, tal como através do uso de um vetor de expressão (Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSHL Press, 1989; incorporado aqui a título de referência).
[000399] Alternativamente ou adicionalmente, os polipeptídeos de acordo com a invenção (ou porções características dos mesmos) podem ser produzidos através de meios sintéticos.
[000400] Alternativamente ou adicionalmente, os polipeptídeos de acordo com a invenção (ou porções características dos mesmos), e particularmente polipeptídeos de HA, podem ser produzidos no contexto de vírus intacto, seja do tipo selvagem, atenuado, morto, etc. Os polipeptídeos de acordo com a invenção (por exemplo, polipeptídeos de HA), ou porções características dos mesmos, podem também ser produzidos no contexto de partículas do tipo vírus.
[000401] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA (ou porções características dos mesmos) podem ser isolados e/ou purificados a partir do vírus da gripe. Por exemplo, o vírus pode ser cultivado em ovos, tais como ovos de galinha embrionados, caso em que o material coletado é tipicamente fluido alantoico. Alternativamente ou adicionalmente, o vírus da gripe pode ser derivado de qualquer método usando cultura de tecido para cultivar o vírus. Substratos de célula adequados para cultivo do vírus incluem, por exemplo, células de rim de cachorro tal como MDCK ou células de um clone de MDCK, células tipo MDCK, células de rim de macaco tais como células AGMK incluindo células Vero, células epiteliais culturadas como linhagens de célula contínuas, células 293T, células BK-21, células CV-1 ou qualquer outro tipo de célula de mamífero adequado para a produção de vírus da gripe para propósitos de vacina, prontamente disponível de fontes comerciais (por exemplo, ATCC, Rockville, MD). Substratos de célula adequados também incluem células humanas tais como células MRC-5. Substratos de célula adequados não são limitados a linhagens de célula; por exemplo, células primárias tais como fibroblastos de embrião de galinha são também incluídas.
[000402] Também, será compreendido por aqueles de habilidade comum na técnica que polipeptídeos, e particularmente polipeptídeos de HA variantes conforme aqui descrito, podem ser gerados, identificados, isolados e/ou produzidos através de cultura das células ou orgânicos que produzem o polipeptídeo (sozinhos ou como parte de um complexo, incluindo como parte de uma partícula de vírus ou vírus), sob condições que permitam avaliação e/ou seleção imediata de polipeptídeos capazes de se ligar a glicanos de topologia de guarda-chuva. Para dar apenas um exemplo, em algumas modalidades, pode ser útil produzir e/ou estudar uma coleção de polipeptídeos (por exemplo, polipeptídeos variantes de HA) sob condições que revelem e/ou favoreçam aquelas variantes que se ligam a glicanos de topologia de guarda-chuva (por exemplo, com especificidade e/ou afinidade particular). Em algumas modalidades, tal coleção de polipeptídeos (por exemplo, polipeptídeos variantes de HA) resulta da evolução na natureza. Em algumas modalidades, tal coleção de polipeptídeos (por exemplo, polipeptídeos variantes de HA) resulta de engenharia. Em algumas modalidades, tal coleção de polipeptídeos (por exemplo, polipeptídeos variantes de HA) resulta de uma combinação de engenharia e evolução natural.
[000403] HA interage com a superfície de células através de ligação a um receptor de glicoproteína. Ligação de HA a receptores de HA é predominantemente mediada por glicanos N-ligados nos receptores. Especificamente, HA na superfície de partículas de vírus da gripe reconhece glicanos sialilados que estão associados com receptores de HA na superfície do hospedeiro celular. Após reconhecimento e ligação, a célula hospedeiro engolfa a célula viral e o vírus é capaz de replicar e produzir muito mais partículas de vírus para serem distribuídas a células vizinhas. Algumas estruturas de cristal de interações de HA-glicano foram identificadas e são apresentadas na Tabela 1:Tabela 1. Estruturas de Cristal de Complexos de HA-Glicano
[000404] Complexos de HA-glicano sialilado por α2-6 foram gerados através de superposição do traço CA da subunidade de HA1 de
[000405] ADU63_H3 e ADS97_H5 e Viet04_H5 on ASI30_H1_26 e APR34_H1_26 (H1). Embora os complexos estruturais do
[000406] A/Aichi/2/68 (H3N2) humano com glicanos sialilados com α2-6 sejam publicados (Eisen e outros, 1997, Virology, 232:19; incorporado aqui a título de referência), suas coordenadas não estavam disponíveis no Banco de Dados de Proteína. O programa SARF (http://123d.ncifcrf.gov/sarf2.html) foi usado para obter o alinhamento estrutural das subunidades de HA1 diferentes para superposição.
[000407] Os receptores de HA são modificados por glicanos sialilados ou por α2-3 ou α2-6 próximo do sítio de ligação de HA do receptor, e o tipo de ligação do glicano ligado ao receptor pode afetar a conformação do sítio de ligação de HA do receptor, desta maneira afetando a especificidade do receptor para HAs diferentes.
[000408] Por exemplo, a bolsa de ligação de glicano de HA de ave é estreita. De acordo com a presente invenção, esta bolsa se liga à conformação trans de glicanos sialilados por α2-3 e/ou a glicanos de topologia de cone, sejam α2-3 ou α2-6 ligados.
[000409] Receptores de HA em tecidos de ave, e também em tecidos do pulmão profundo e trato gastrintestinal (GI) humanos, são caracterizados por ligações de glicano sialilados por α2-3 e, ainda (de acordo com a presente invenção), são caracterizados por glicanos, incluindo glicanos sialilados por α2-3 e/ou por α2-6, que adotam predominantemente topologias de cone. Receptores de HA tendo tais glicanos de topologia de cone podem ser referidos aqui como CTHArs.
[000410] Em contraste, receptores de HA humanos nos brônquios e traqueia do trato respiratório superior são modificados por glicanos sialilados por α2-6. Diferente do motivo α2-3, o motivo α2-6 tem um grau adicional de liberdade de conformação devido à ligação C6-C5 (Russell e outros, 2006, Glycoconj J 23:85; incorporado aqui a título de referência). HAs que se ligam a tais glicanos sialilados por α2-6 têm uma bolsa de ligação mais aberta para acomodar a diversidade de estruturas que surge desta liberdade conformacional. Além disso, de acordo com a presente invenção, HAs podem precisar se ligar a glicanos (por exemplo, glicanos sialilados por α2-6) em uma topologia de guarda-chuva, e particularmente podem precisar se ligar a tais glicanos de topologia de guarda-chuva com afinidade e/ou especificidade forte, a fim de mediar com eficácia infecção de tecidos do trato respiratório superior humano. Receptores de HA tendo glicanos de topologia de guarda-chuva podem ser referidos aqui como UTHArs.
[000411] Como resultado desses perfis de glicosilação espacialmente restritos, humanos geralmente não são infectados por vírus contendo muitas HAs de ave do tipo selvagem (por exemplo, H5 de ave). Especificamente, devido ao fato das porções do trato respiratório humano que são mais prováveis de encontrar vírus (isto é, a traqueia e os brônquios) não terem receptores com glicanos em cone (por exemplo, glicanos sialilados por α2-3 e/ou glicanos curtos) e HAs de ave do tipo selvagem tipicamente se ligam principalmente ou exclusivamente a receptores associados com glicanos em cone (por exemplo, glicanos sialilados por α2-3 e/ou glicanos curtos), os humanos raramente ficam infectados com vírus de ave. Apenas quando em contato suficientemente íntimo com vírus que ele pode acessar receptores do pulmão profundo e/ou trato gastrintestinal tendo glicanos de guarda-chuva (por exemplo, glicanos sialilados por α2-6) para humanos ficarem infectados.
[000412] Para expandir rapidamente o conhecimento atual de interações de proteína de ligação glicano-glicano específicas conhecidas (GBP) (Glycan-Glycan Binding Protein), o Consortium for Functional Glycomics (CFG; www.functionalglycomics.org), uma iniciativa de pesquisa colaborativa internacional, desenvolveu disposições de glicano compreendendo várias estruturas de glicano que permitiram avaliação de alto rendimento de GBPs quanto a novas especificidades de ligante de glicano. As disposições de glicano compreendem ambos os motivos de glicano monovalentes e polivalentes (isto é, ligados à estrutura principal de poliacrilamida) e cada disposição compreende 264 glicanos com concentrações baixas (10 μM) e altas (100 μM) e seis pontos para cada concentração (vide http://www.functionalglycomics.org/static/consortium/resources/resourc ecoreh5.shtml).
[000413] As disposições compreendem predominantemente glicanos sintéticos que capturam a diversidade fisiológica de glicanos N- e O- ligados. Em adição aos glicanos sintéticos, misturas de glicano N- ligado derivado de glicoproteínas de mamífero diferentes são também representadas na disposição.
[000414] Conforme aqui usado, uma "disposição" de glicano se refere a um conjunto de um ou mais glicanos, opcionalmente imobilizados em um apoio sólido. Em algumas modalidades, uma "disposição" é uma coleção de glicanos presentes como uma disposição ou padrão organizado em dois ou mais locais que são fisicamente separados em espaço. Tipicamente, uma disposição de glicano terá pelo menos 4, pelo menos 8, pelo menos 16, pelo menos 24, pelo menos 48, pelo menos 96 ou várias centenas ou milhares de locais diferentes. Em geral, as disposições de glicano de acordo com a invenção podem ter qualquer um de uma variedade de formatos. Vários formatos de disposição diferentes aplicáveis a biomoléculas são conhecidos na técnica. Por exemplo, um número grande de disposições de proteína e/ou ácido nucleico é bem conhecido. Aqueles de habilidade comum na técnica vão imediatamente reconhecer formatos de disposição padrão apropriados para disposições de glicano da presente invenção.
[000415] Em algumas modalidades, disposições de glicano de acordo com a invenção estão presentes em formatos de "microdisposição". Uma microdisposição pode tipicamente ter locais de amostra separados por uma distância de cerca de 50 μ a cerca de 200 μ ou menos e amostra imobilizada na faixa nano a micromolar ou faixa nano a picograma. Formatos de disposição conhecidos na técnica incluem, por exemplo, aqueles em que cada local de amostra separado tem uma escala de, por exemplo, dez μ.
[000416] Em algumas modalidades, as disposições de glicano de acordo com a invenção compreendem uma pluralidade de glicanos espacialmente imobilizados sobre um apoio. A presente invenção provê moléculas de glicano dispostas sobre um apoio. Conforme aqui usado, "apoio" se refere a qualquer material que seja adequado para ser usado para dispor moléculas de glicano. Como será compreendido por aqueles de habilidade comum na técnica, qualquer um de uma variedade de materiais pode ser empregado. Para citar alguns exemplos, materiais de apoio que podem ser de uso na invenção incluem membranas hidrofóbicas, por exemplo, nitrocelulose, PVDF ou membranas de náilon. Tais membranas são bem conhecidas na técnica e podem ser obtidas da, por exemplo, Bio-Rad, Hemel Hempstead, RU.
[000417] Em algumas modalidades, o apoio sobre o qual glicanos são dispostos pode compreender um óxido de metal. Óxidos de metal adequados incluem, mas não estão limitados a, óxido de titânio, óxido de tântalo e óxido de alumínio. Exemplos de tais materiais podem ser obtidos da Sigma-Aldrich Company Ltd, Fancy Road, Poole, Dorset. BH12 4QH RU.
[000418] Em algumas modalidades, tal apoio é ou compreende um gel de óxido de metal. Um gel de óxido de metal é considerado prover uma área de superfície grande dentro de uma dada área macroscópica para auxiliar a imobilização das moléculas contendo carboidrato.
[000419] Materiais de apoio adicionais ou alternativos que podem ser usados de acordo com a presente invenção incluem géis, por exemplo, géis de sílica ou géis de óxido de alumínio. Exemplos de tais materiais podem ser obtidos da, por exemplo, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha.
[000420] Em algumas modalidades, as disposições de glicano são imobilizadas em um apoio que pode resistir à mudança em tamanho ou formato durante uso normal. Por exemplo, um apoio pode ser uma lâmina de vidro revestida com um material componente adequado para ser usado para dispor glicanos. Também, alguns materiais compósitos podem desejavelmente prover solidez a um apoio.
[000421] Conforme aqui demonstrado, as disposições de acordo com a invenção são úteis para a identificação e/ou caracterização de polipeptídeos de HA diferentes e suas características de ligação. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de acordo com a invenção são testados em tais disposições para avaliar sua habilidade em se ligar a glicanos de topologia de guarda-chuva (por exemplo, a glicanos sialilados por α2-6 e particularmente a glicanos sialilados por α2-6 dispostos em uma topologia de guarda-chuva).
[000422] Na verdade, a presente invenção provê disposições de glicanos sialilados por α2-6, e opcionalmente glicanos sialilados por α2-3, que podem ser usadas para caracterizar capacidades de ligação de polipeptídeo de HA e/ou como um diagnóstico para detectar, por exemplo, polipeptídeos de HA de ligação humanos. Em algumas modalidades, as disposições de acordo com a invenção contêm glicanos (por exemplo, glicanos sialilados por α2-6, e particularmente glicanos sialilados por α2-6 longos) em uma topologia de guarda- chuva). Como será claro para aqueles de habilidade comum na técnica, tais disposições são úteis para caracterização ou detecção de quaisquer polipeptídeos de HA, incluindo, por exemplo, aqueles encontrados em isolatos de gripe naturais em adição àqueles projetados e/ou preparados por pesquisadores.
[000423] Em algumas modalidades, tais disposições incluem glicanos representativos de cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30% cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90% cerca de 95% ou mais dos glicanos (por exemplo, os glicanos de guarda-chuva, que serão frequentemente glicanos sialilados por α2-6, particularmente glicanos sialilados por α2-6 longos) encontrados em receptores de HA humanos e particularmente em receptores de HA do trato respiratório superior humano. Em algumas modalidades, as disposições de acordo com a invenção incluem algumas ou todas as estruturas de glicano mostradas na Figura 10. Em algumas modalidades, as disposições incluem pelo menos cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30% cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou mais desses glicanos mostrados.
[000424] A presente invenção provê métodos para identificação ou caracterização de proteínas HA usando disposições de glicano. Em algumas modalidades, por exemplo, tais métodos compreendem as etapas de (1) provisão de uma amostra contendo polipeptídeo de HA, (2) contato da mostra com uma disposição de glicano compreendendo e (3) detecção da ligação de polipeptídeo de HA a um ou mais glicanos na disposição.
[000425] Fontes adequadas para amostras contendo polipeptídeos de HA a serem contatados com disposições de glicano de acordo com a presente invenção incluem, mas não estão limitadas a, amostras patológicas tais como sangue, soro/plasma, células mononucleares de sangue periférico/linfócitos de sangue periférico (PBMC/PBL), esputo, urina, fezes, esfregaços da garganta, esfregaços de lesão dermal, fluidos cerebroespinhais, secreção cervical, amostras de pus, matrizes de alimento e tecidos de várias partes do corpo tais como cérebro, baço e fígado. Alternativamente ou adicionalmente, outras fontes adequadas para amostras contendo polipeptídeos de HA incluem, mas não estão limitadas a, amostras ambientais tais como solo, água e flora. Ainda outra amostra inclui amostras de laboratório, por exemplo, de polipeptídeos de HA engenheirados projetados e/ou preparados por pesquisadores. Outras amostras que não foram listadas podem ser também aplicáveis.
[000426] Uma ampla variedade de sistemas de detecção adequados para ensaio de ligação de polipeptídeo de HA a disposições de glicano de acordo com a invenção é conhecida na técnica. Por exemplo, polipeptídeos de HA podem ser detectavelmente marcados (diretamente ou diretamente) antes ou após serem contatados com a disposição; ligação pode então ser detectada através de detecção de marcador localizado. Em algumas modalidades, dispositivos de varredura podem ser utilizados para examinar locais particulares em uma disposição.
[000427] Alternativamente ou adicionalmente, ligação a glicanos dispostos pode ser medida usando, por exemplo, sistemas de detecção calorimétricos, de fluorescência ou radioativos, ou outros métodos de marcação, ou outros métodos que não requeiram marcação. Em geral, detecção fluorescente tipicamente envolve sondagem diretamente da disposição com uma molécula fluorescente e monitoramento de sinais fluorescentes. Alternativamente ou adicionalmente, as disposições podem ser sondadas com uma molécula que é marcada (por exemplo, com biotina) para detecção por fluorescência indireta (neste caso, através de teste quanto à ligação de estreptavidina fluorescentemente marcada). Alternativamente ou adicionalmente, métodos de extinção de fluorescência podem ser utilizados em que os glicanos dispostos são fluorescentemente marcados e sondados com uma molécula de teste (que pode ou não ser marcada com um fluoróforo diferente). Em tais modalidades, ligação à disposição age para conter a fluorescência emitida a partir do glicano disposto, desta maneira ligação é detectada através de perda de emissão de fluorescência. Alternativamente ou adicionalmente, glicanos dispostos podem ser sondados com uma amostra de tecido vivo que foi cultivada na presença de um substrato radioativo, dando uma sonda radioativamente marcada. Ligação em tais modalidades pode ser detectada através da medição de emissão radioativa.
[000428] Tais métodos são úteis para determinar o fato de ligação e/ou extensão de ligação pelos polipeptídeos de HA a disposições de glicano de acordo com a invenção. Em algumas modalidades, tais métodos podem ser ainda usados para identificar e/ou caracterizar agentes que interferem com ou de outra maneira alteram interações de glicano-polipeptídeo de HA.
[000429] Os métodos descritos abaixo podem ser de uso particular em, por exemplo, identificação de se uma molécula pensada ser capaz de interação com um carboidrato pode realmente fazer isso ou identificar se uma molécula tem inesperadamente a capacidade de interação com um carboidrato.
[000430] A presente invenção também provê métodos de uso de disposições de acordo com a invenção, por exemplo, para detectar um agente particular em um agente de teste. Por exemplo, tais métodos podem compreender as etapas de (1) contato de uma disposição de glicano com uma amostra de teste (por exemplo, com uma amostra pensada conter um polipeptídeo de HA); e (2) detecção da ligação de qualquer agente na amostra de teste à disposição.
[000431] Ainda, ligação a disposições de acordo com a invenção pode ser utilizada, por exemplo, para determinar cinética de interação entre agente de ligação e glicano. Por exemplo, métodos de acordo com a invenção para determinação de cinética de interação podem incluir etapas de (1) contato de uma disposição de glicano com a molécula sendo testada e (2) medição de cinética de interação entre o agente de ligação e glicano(s) disposto.
[000432] A cinética de interação de um agente de ligação com qualquer um dos glicanos em uma disposição de acordo com a invenção pode ser medida através de mudanças em tempo real em, por exemplo, sinais colorimétricos ou fluorescentes, conforme detalhado acima. Tais métodos podem ser de uso particular em, por exemplo, determinação de se um agente de ligação particular é capaz de interagir com um carboidrato específico com um grau de ligação maior do que um agente de ligação diferente interagindo com o mesmo carboidrato.
[000433] Será compreendido, com certeza, que ligação a glicano por polipeptídeos de HA de acordo com a invenção pode ser avaliada em amostras de glicano ou fontes não presentes em um formato de disposição per se. Por exemplo, polipeptídeos de HA de acordo com a invenção podem ser ligados a amostras de tecido e/ou linhagens de célula para avaliar suas características de ligação a glicano. Linhagens de célula apropriadas incluem, por exemplo, qualquer uma de uma variedade de linhagens de célula de mamífero, particularmente aquelas expressando receptores de HA contendo glicanos de topologia de guarda-chuva (por exemplo, pelo menos alguns dos quais podem ser glicanos sialilados por α2-6 e particularmente glicanos sialilados por α2- 6 longos). Em algumas modalidades, as linhagens de célula utilizadas expressam glicanos individuais com topologia de guarda-chuva. Em algumas modalidades, as linhagens de célula utilizadas expressam uma diversidade de glicanos. Em algumas modalidades, as linhagens de célula são obtidas de isolatos clínicos; em algumas elas são mantidas ou manipuladas para terem uma distribuição e/ou prevalência de glicano desejada. Em algumas modalidades, amostras de tecido e/ou linhagens de célula expressam características de glicanos de células epiteliais respiratórias superiores.
[000434] Em algumas modalidades, a presente invenção provê ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo de HA ou uma porção característica ou biologicamente ativa de um polipeptídeo de HA. Em algumas modalidades, a invenção provê ácidos nucleicos que são complementares a ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo de HA ou uma porção característica ou biologicamente ativa de um polipeptídeo de HA.
[000435] Em algumas modalidades, a invenção provê moléculas de ácido nucleico que hibridizam para ácidos nucleicos codificando um polipeptídeo de HA ou uma porção característica ou biologicamente ativa de um polipeptídeo de HA. Tais ácidos nucleicos podem ser usados, por exemplo, como primers ou como sondas. Para dar alguns exemplos, tais ácidos nucleicos podem ser usados como primers em reação em cadeia da polimerase (PCR), como sondas para hibridização (incluindo hibridização in situ) e/ou como primers para transcrição reversa-PCR (RT-PCR).
[000436] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos podem ser DNA ou RNA, e podem ser de filamento simples ou filamento duplo. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos de acordo com a invenção podem incluir um ou mais nucleotídeos não naturais; em algumas modalidades, os ácidos nucleicos de acordo com a invenção incluem apenas nucleotídeos naturais.
[000437] A presente invenção provê anticorpos para polipeptídeos de agente de ligação de acordo com a invenção (por exemplo, polipeptídeos de HA). Esses podem ser monoclonais ou policlonais e podem ser preparados através de qualquer uma de uma variedade de técnicas conhecidas daqueles de habilidade comum na técnica (por exemplo, vide Harlow e Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; incorporado aqui a título de referência). Por exemplos, os anticorpos podem ser produzidos através de técnicas de cultura celular, incluindo a geração de anticorpos monoclonais, ou através de transfecção de genes de anticorpo em hospedeiros bacterianos ou de célula de mamífero, a fim de permitir a produção de anticorpos recombinantes.
[000438] A presente invenção provê métodos para teste de agentes de ligação de acordo com a invenção (por exemplo, polipeptídeos de HA, LSBAs, USBAs, UTSBAs, etc) em um hospedeiro animal. Conforme aqui usado, um "hospedeiro animal" inclui qualquer modelo animal adequado para pesquisa de gripe. Por exemplo, hospedeiros animais adequados para a invenção podem ser quaisquer hospedeiros mamífero, incluindo primatas, furões, gatos, cachorros, vacas, cavalos, roedores tais como camundongos, hamsters, coelhos e ratos. Em algumas modalidades, um hospedeiro animal usado para a invenção é um furão. Em particular, em algumas modalidades, um hospedeiro animal nunca sofreu exposição ou infecção viral antes da administração de um agente de ligação de acordo com a invenção (opcionalmente em uma composição de acordo com a invenção). Em algumas modalidades, o hospedeiro animal é inoculado com, infectado com ou de outra maneira exposto a vírus antes ou concomitante com administração de um agente de ligação de acordo com a invenção. Um hospedeiro animal usado na prática da presente invenção pode ser inoculado com, infectado com ou de outra maneira exposto a vírus através de qualquer método conhecido na técnica. Em algumas modalidades, um hospedeiro animal pode ser inoculado com, infectado com ou exposto a vírus intranasalmente.
[000439] Em algumas modalidades, um hospedeiro animal adequado pode ter uma distribuição similar de glicanos de topologia de guarda- chuva vs. cone e/ou glicanos α2-6 vs. glicanos α2-3 para a distribuição encontrada no trato respiratório humano. Por exemplo, é compreendido que um furão como um hospedeiro animal pode ser mais representativo do que um camundongo quando usado como modelo de doença causada por vírus da gripe em humanos
[000440] (Tumpey e outros, 2007, Science 315; 655-59; incorporado aqui a título de referência). Sem desejar ser limitado por quaisquer teorias, a presente invenção compreende a ideia que furões podem ter uma distribuição mais similar de glicanos no trato respiratório àqueles no trato respiratório humano do que camundongo para humano. Animais que nunca foram infectados e/ou inoculados podem ser usados para qualquer um de uma variedade de estudos. Por exemplo, tais modelos de animal podem ser usados para estudos de transmissão de vírus como é conhecido na técnica. É compreendido que o uso de furões em estudos de transmissão de vírus pode servir como um previsor confiável para transmissão de vírus em humanos. Por exemplo, transmissão pelo ar de gripe viral a partir de animal inoculado (por exemplo, furões) para animais que nunca foram infectados é conhecida na técnica (Tumpey e outros, 2007, Science 315; 655-59; incorporado aqui a título de referência). Estudos de transmissão de vírus podem ser usados para testar polipeptídeos de agente de ligação de acordo com a invenção (por exemplo, polipeptídeos de HA). Por exemplo, agentes de ligação de acordo com a invenção podem ser administrados a um hospedeiro animal adequado antes, durante ou após estudos de transmissão de vírus a fim de determinar a eficácia do dito agente de ligação em bloqueio de ligação de vírus e/ou infectividade no hospedeiro animal. Usando informação reunida de estudos de transmissão de vírus em um hospedeiro animal, poderia ser prevista a eficácia de um agente de ligação no bloqueio de ligação e/ou infectividade de vírus em um hospedeiro humano.
[000441] Em algumas modalidades, a presente invenção provê composições farmacêuticas incluindo agentes de ligação de acordo com a invenção (por exemplo, polipeptídeos de HA, LSBAs, UTBAs, UTBSAs, etc) e/ou entidades relacionadas. Por exemplo, em algumas modalidades, o polipeptídeo(s) de agente de ligação (por exemplo, polipeptídeos de HA), ácidos nucleicos codificando tais polipeptídeos, fragmentos característicos ou biologicamente ativos de tais polipeptídeos ou ácidos nucleicos, anticorpos que se ligam a e/ou competem com tais polipeptídeos ou fragmentos, moléculas pequenas que interagem com ou competem com tais polipeptídeos ou com glicanos que se ligam a eles, etc, estão incluídos na composição farmacêutica de acordo com a invenção.
[000442] A invenção compreende tratamento de infecções de gripe através da administração de tais composições farmacêuticas de acordo com a invenção. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas de acordo com a invenção são administradas a um indivíduo sofrendo de ou suscetível a uma infecção por gripe. Em algumas modalidades, um indivíduo é considerado estar sofrendo de uma infecção por gripe quando o indivíduo está mostrando um ou mais sintomas geralmente associados com infecção por gripe. Em algumas modalidades, o indivíduo é conhecido ou acreditado ter sido exposto a vírus da gripe. Em algumas modalidades, um indivíduo é considerado ser suscetível a uma infecção por gripe se for sabido ou acreditado que o indivíduo foi exposto ao vírus da gripe. Em algumas modalidades, um indivíduo é conhecido ou acreditado ter sido exposto ao vírus da gripe se o indivíduo tiver tido contato com outros indivíduos conhecidos ou suspeitos de terem sido infectados com o vírus da gripe e/ou se o indivíduo estiver ou esteve presente em um local em que infecção por gripe é conhecida ou pensada ser prevalente.
[000443] Em algumas modalidades, os indivíduos sofrendo de ou suscetíveis à infecção por gripe são testados quanto a anticorpos para agentes de ligação de acordo com a invenção antes, durante ou após administração de composições farmacêuticas de acordo com a invenção. Em algumas modalidades, os indivíduos tendo tais anticorpos não são administrados com as composições farmacêuticas compreendendo agentes de ligação de acordo com a presente invenção. Em algumas modalidades, uma dose apropriada de composição farmacêutica e/ou agente de ligação é selecionada com base na detecção (ou falta) de tais anticorpos.
[000444] Em algumas modalidades, seleção de um indivíduo particular para tratamento, agente de ligação particular ou composição para administração e/ou dose ou regime particular para administração, é memorizada, por exemplo, em uma forma de armazenamento escrita, impressa ou eletrônica.
[000445] As composições de acordo com a invenção podem ser administradas antes ou após desenvolvimento de um ou mais sintomas de infecção por gripe.
[000446] A invenção compreende tratamento de infecções por gripe através da administração de compostos descritos aqui. Em algumas modalidades, tratamento de infecções por gripe de acordo com a presente invenção é realizado através da administração de uma vacina. Até agora, embora realizações significantes tenham sido feitas no desenvolvimento de vacinas para gripe, há ainda capacidade de mais aperfeiçoamento. A presente invenção provê vacinas compreendendo agentes de ligação de acordo com a invenção (por exemplo, polipeptídeos de HA, LSBAs, UTBAs, TBSAs, etc), e particularmente compreendendo agentes de ligação que se ligam a glicanos de guarda-chuva (por exemplo, glicanos de guarda-chuva ligados a α2-6 tais como, por exemplo, glicanos sialilados por α2-6 longos).
[000447] Para dar apenas um exemplo, tentativas em gerar vacinas específicas para a linhagem H5N1 em humanos geralmente não foram bem sucedidas devido, pelo menos em parte, à baixa imunogenicidade de HAs de H5. Em um estudo, uma vacina direcionada à linhagem de H5N1 foi mostrada fornecer títulos de anticorpo de 1:40, que não é um título alto o suficiente para garantir proteção contra infecção. Ainda, a dosagem requerida para gerar um título bem modesto de anticorpo de 1:40 (duas doses de 90 μg de vírus ou antígeno morto purificado) era 1-2 vezes aquela normalmente usada no caso da vacina para o vírus da gripe sazonal (Treanor e outros, 2006, N Eng J Med, 354:1343; incorporado aqui a título de referência). Outros estudos mostraram similarmente que vacinas para H5 atuais não são altamente imunogênicas (Bresson e outros, 2006, Lancet, 367:1657; incorporado aqui a título de referência). Em algumas modalidades, as vacinas de acordo com a invenção são formuladas utilizando uma ou mais estratégias (vide, por exemplo, Enserink, 2005, Science, 309:996; incorporado aqui a título de referência) pretendidas permitir uso de doses menor de proteína HA de H5 e/ou obter imunogenicidade maior. Por exemplo, em algumas modalidades, multivalência é aperfeiçoada (por exemplo, através do uso de dendrímeros); em algumas modalidades, um ou mais adjuvantes são utilizados, etc.
[000448] Em algumas modalidades, a presente invenção provê vacinas e a administração dessas vacinas a um indivíduo humano. Em algumas modalidades, as vacinas são composições compreendendo um ou mais do que segue: (1) vírus inativado, (2) vírus da gripe atenuado vivo, por exemplo, vírus defeituoso em replicação, (3) agente de ligação de acordo com a invenção (por exemplo, polipeptídeos de HA, LSBAs, UTBAs, UTBSAs, etc), (4) ácido nucleico codificando polipeptídeo de agente de ligação (por exemplo, polipeptídeo de HA) ou sua porção característica ou biologicamente ativa, (5) vetor de DNA que codifica polipeptídeo de agente de ligação de acordo com a invenção (por exemplo, polipeptídeo de HA) ou sua porção característica ou biologicamente ativa e/ou (6) sistema de expressão, por exemplo, células expressando uma ou mais proteínas da gripe a serem usadas como antígenos.
[000449] Desta maneira, em algumas modalidades, a presente invenção provê vacinas para gripe inativadas. Em algumas modalidades, as vacinas para gripe inativadas compreendem um de três tipos de preparação de antígeno: vírus integral inativado, subvirions em que partículas de vírus purificadas são rompidas com detergentes ou outros reagentes para solubilizar o envelope de lipídeo (vacina "fracionada") ou polipeptídeo de HA purificado (vacina de "subunidade"). Em algumas modalidades, o vírus pode ser inativado através de tratamento com formaldeído, beta-propiolactona, éter, éter com detergente (tal como TWEEN-80®), brometo de cetil trimetil amônio (CTAB) e Triton N101, desoxicolato de sódio e fosfato de tri(n- butila). Inativação pode ocorrer após ou antes da clarificação de fluido alantoico (de vírus produzido em ovos); os virions são isolados e purificados através de centrifugação (Nicholson e outros, eds., 1998, Textbook of Influenza, Blackwell Science, Malden, MA; incorporado aqui a título de referência). Para avaliar a potência da vacina, o teste de imunodifusão radial simples (SRD) (Single Radial Immunodifusion) pode ser usado (Schild e outros, 1975, Bull. World Health Organ., 52:43-50 & 223-31; Mostow e outros, 1975, J. Clin. Microbiol., 2:531; ambos aqui incorporados a título de referência).
[000450] A presente invenção também provê vacinas para gripe atenuadas, vivas, e métodos para atenuação são bem conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, atenuação é obtida através do uso de genética reversa, tal como mutagênese direcionada a sítio.
[000451] Em algumas modalidades, vírus da gripe para uso em vacinas é cultivado em ovos, por exemplo, em ovos de galinha embriogênicos, caso em que o material coletado é fluido alantoico. Alternativamente ou adicionalmente, o vírus da gripe pode ser derivado de qualquer método usando cultura de tecido para cultivar o vírus. Substratos de célula adequados para cultivo do vírus incluem, por exemplo, células de rim de cachorro tais como MDCK ou células de um clone de MDCK, células tipo MDCK, células de rim de macaco tais como células AGMK incluindo células Vero, células epiteliais culturadas como linhagens de célula contínuas, células 293T, células BK-21, células CV-1 ou qualquer outro tipo de célula de mamífero adequado para produção de vírus da gripe (incluindo células epiteliais da via aérea superior) para propósitos de vacina, prontamente disponível de fontes comerciais (por exemplo, ATCC, Rockville, Md.). Substratos de célula adequados também incluem células humanas tais como células MRC-5. Substratos de célula adequados não são limitados a linhagens de célula; por exemplo, células primárias tais como fibroblastos de embrião de galinha são também incluídas.
[000452] Em algumas modalidades, as vacinas de acordo com a invenção compreendem ainda um ou mais adjuvantes. Por exemplo, sais de alumínio (Baylor e outros, 2002, Vaccine, 20:S18; incorporado aqui a título de referência) e lipídeo A de monofosforila (MPL; Ribi e outros, 1986, Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p.407; incorporado aqui a título de referência) podem ser usados como adjuvantes em vacinas humanas. Alternativamente ou adicionalmente, novos compostos estão sendo atualmente testados como adjuvantes em vacinas humanas, tal como MF59 (Chiron Corp., http://www.chiron.com/investors/pressreleases/2005/051028.html), CPG 7909 (Cooper e outros, 2004, Vaccine, 22:3136; incorporado aqui a título de referência) e saponinas, tal como QS21 (Ghochikyan e outros, 2006, Vaccine, 24:2275; incorporado aqui a título de referência).
[000453] Ainda, alguns adjuvantes são conhecidos na técnica aumentar a imunogenicidade de vacinas para a gripe, tal como poli[di(carboxilatofenoxi)fosfazeno] (PCCP; Payne e outros, 1998, Vaccine, 16:92; incorporado aqui a título de referência), interferon-Y (Cao e outros, 1992, Vaccine, 10:238; incorporado aqui a título de referência), copolímero em bloco P1205 (CRL1005; Katz e outros, 2000, Vaccine,. 18:2177; incorporado aqui a título de referência), interleucina-2 (IL-2; Mbwuike e outros, 1990, Vaccine, 8:347; incorporado aqui a título de referência) e polimetil metacrilato (PMMA; Kreuter e outros, 1981, J. Pharm. Sci., 70:367; incorporado aqui a título de referência).
[000454] Em algumas modalidades, as composições de acordo com a invenção, por exemplo, composições de agentes de ligação, não incluem adjuvantes (por exemplo, as composições providas são essencialmente livres de adjuvantes). Em algumas modalidades, as composições de acordo com a invenção não incluem um adjuvante de alume (por exemplo, as composições providas são essencialmente livres de alume).
[000455] Em adição a vacinas, a presente invenção provê outras composições terapêuticas úteis no tratamento de infecções virais. Em algumas modalidades, o tratamento é realizado através de administração de um agente que interfere com a expressão ou atividade de um polipeptídeo de HA.
[000456] Em algumas modalidades, a presente invenção provê composições farmacêuticas compreendendo anticorpos ou outros agentes relacionados aos polipeptídeos providos. Por exemplo, a invenção provê composições contendo anticorpos que reconhecem partículas de vírus contendo um polipeptídeo de HA particular (por exemplo, um polipeptídeo de HA que se liga a glicanos guarda-chuva), ácidos nucleicos (tais como sequências de ácido nucleico complementares a sequências de HA, que podem ser usadas para RNAi), glicanos que competem por ligação a receptores de HA, moléculas pequenas ou glicomiméticos que competem pela interação glicano-polipeptídeo de HA ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, coleções de agentes diferentes, tendo estruturas diversas, são utilizadas. Em algumas modalidades, as composições terapêuticas compreendem um ou mais agentes multivalentes. Em algumas modalidades, o tratamento compreende administração urgente um pouco depois da exposição ou suspeita de exposição.
[000457] Em algumas modalidades, qualquer uma das vacinas descritas aqui oferece proteção cruzada ampla contra diferentes variedades de vírus da gripe. Por exemplo, em algumas modalidades, as vacinas descritas aqui oferecem proteção cruzada contra ambos os vírus H5 de ave e adaptado para humano. Em algumas modalidades, qualquer uma das vacinas descritas aqui oferece proteção cruzada contra qualquer linhagem ou variante de vírus da gripe H5. Em algumas modalidades, qualquer uma das vacinas descritas aqui oferece proteção cruzada contra qualquer linhagem ou variante do vírus da gripe H2. Em algumas modalidades, qualquer uma das vacinas descritas aqui oferece proteção cruzada contra qualquer linhagem ou variante do vírus da gripe H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 ou H16.
[000458] Em geral, uma composição farmacêutica vai incluir um agente terapêutico em adição a um ou mais agentes inativos tal como um carreador biocompatível, estéril, incluindo, mas não limitado a, água estéril, solução salina, solução salina tamponada ou solução de dextrose. Alternativamente ou adicionalmente, a composição pode conter qualquer um de uma variedade de aditivos, tais como estabilizadores, tampões, excipientes (por exemplo, açúcares, aminoácidos, etc) ou preservativos.
[000459] Em algumas modalidades, o agente terapêutico presente em uma composição farmacêutica de acordo com a invenção vai consistir em um ou mais agentes de ligação conforme aqui descrito. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica de acordo com a invenção contém um agente de ligação (por exemplo, um polipeptídeo de HA, LSBA, UTBA, UTSBA, etc) que se liga a glicanos de topologia de guarda-chuva (e/ou a imitações de glicano de topologia de guarda-chuva). Em algumas modalidades, a composição de acordo com a invenção é substancialmente livre de agentes relacionados (por exemplo, de outros polipeptídeos de HA, etc) que não se ligam a glicanos de topologia de guarda-chuva. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas de acordo com a invenção não contêm mais do que 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% ou 1% de um agente que se liga a glicanos de receptor de HA outros que não glicanos de topologia de guarda-chuva.
[000460] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica vai incluir um agente terapêutico que é encapsulado, aprisionado ou ligado dentro de uma vesícula de lipídeo, uma matriz biodisponível e/ou biocompatível e/ou biodegradável ou outra micropartícula.
[000461] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica provida vai incluir um agente de ligação (por exemplo, um polipeptídeo de HA, LSBA, UTBA, UTSBA, etc) que não é agregado. Por exemplo, em algumas modalidades, menos do que 1%, 2%, 5%, 10%, 20% ou 30% em peso seco ou número do agente de ligação estão presentes em um agregado.
[000462] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica provida vai incluir um agente de ligação (por exemplo, um polipeptídeo de HA, LSBA, UTBA, UTSBA, etc) que não é desnaturado. Por exemplo, em algumas modalidades, menos do que 1%, 2%, 5%, 10%, 20% ou 30% em peso seco ou número do UTSBA administrado são desnaturados.
[000463] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica provida vai incluir um agente de ligação (por exemplo, um polipeptídeo de HA, LSBA, UTBA, UTSBA, etc) que não é inativo. Por exemplo, em algumas modalidades, menos do que 1%, 2%, 5%, 10%, 20% ou 30% em peso seco ou número do UTSBA administrado são inativos.
[000464] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas de acordo com a invenção são formuladas para reduzir a imunogenicidade de agentes de ligação providos. Por exemplo, em algumas modalidades, um agente de ligação provido é associado com (por exemplo, ligado) um agente, tal como polietileno glicol e/ou carboximetil celulose, que mascara sua imunogenicidade. Em algumas modalidades, um agente de ligação provido tem glicosilação adicional que reduz imunogenicidade.
[000465] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas ou sozinhas ou em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos incluindo, mas não limitado a, vacinas e/ou anticorpos. Por "em combinação com" não é pretendido implicar que os agentes devam ser administrados ao mesmo tempo ou formulados para aplicação juntos, embora esses métodos de aplicação estejam dentro do escopo da invenção. Em geral, cada agente será administrado em uma dose e em um programa de tempo determinado para esse agente. Ainda, a invenção compreende a aplicação de composições farmacêuticas de acordo com a invenção em combinação com agentes que podem aperfeiçoar a biodisponibilidade, reduzir ou modificar seu metabolismo, inibir sua excreção ou modificar sua distribuição dentro do corpo. Embora as composições farmacêuticas da presente invenção possam ser usadas para tratamento de qualquer indivíduo (por exemplo, qualquer animal) com necessidade do mesmo, elas são mais preferivelmente usadas no tratamento de humanos. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas de acordo com a invenção e/ou agentes de ligação são administrados em combinação com um ou mais de um agente antiviral (por exemplo, Oseltamivir [TAMIFLU®], Zanamavir [RELEZA®], etc.) e/ou uma sialidase.
[000466] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas através de uma variedade de vias, incluindo oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, subcutânea, intraventricular, transdermal, interdermal, retal, intravaginal, intraperitoneal, tópica (como através de pós, unguentos, cremes ou gotas), mucosal, nasal, bucal, enteral, sublingual; através de instilação intratraqueal, instilação bronquial e/ou inalação; e/ou como um spray oral, spray nasal e/ou aerossol. Em geral, a via de administração mais apropriada vai depender de uma variedade de fatores incluindo a natureza do agente (por exemplo, sua estabilidade no ambiente do trato gastrintestinal), a condição do paciente (por exemplo, se o paciente é capaz de tolerar administração oral), etc.
[000467] No momento a via oral ou spray nasal ou aerossol (por exemplo, através de inalação) é mais comumente usado para aplicar agentes terapêuticos diretamente aos pulmões e sistema respiratório. No entanto, a invenção compreende a aplicação da composição farmacêutica de acordo com a invenção através de qualquer via apropriada levando em consideração prováveis avanços na ciência de aplicação de fármaco.
[000468] Em algumas modalidades, preparações para aplicação inalada ou aerossol compreendem uma pluralidade de partículas. Em algumas modalidades, tais preparações têm um tamanho de partícula médio de cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 11, cerca de 12 ou cerca de 13 mícrons. Em algumas modalidades, preparações para aplicação inalada ou aerossol são formuladas como um pó seco. Em algumas modalidades, preparações para aplicação inalada ou aerossol são formuladas como um pó úmido, por exemplo, através de inclusão de um agente umectante. Em algumas modalidades, o agente umectante é selecionado do grupo consistindo em água, solução salina ou outro líquido de pH fisiológico.
[000469] Em algumas modalidades, as composições de acordo com a invenção são administradas como gotas à cavidade nasal ou bucal. Em algumas modalidades, uma dose pode compreender uma pluralidade de gotas (por exemplo, 1-100, 1-50, 1-20, 1-10, 1-5, etc).
[000470] Em algumas modalidades, as composições de acordo com a invenção são administradas usando um dispositivo que aplica uma dosagem medida de composição (por exemplo, de agente de ligação).
[000471] Os dispositivos adequados para uso em aplicação de composições farmacêuticas intradermais descritas aqui incluem dispositivos de agulha curta tais como aqueles descritos nas Pat. U.S. No. 4.886.499. Pat. U.S. No. 5.190.521. Pat. U.S. No. 5.328.483. Pat. U.S. No. 5.527.288. Pat. U.S. No. 4.270.537. Pat. U.S. No. 5.015.235. Pat. U.S. No. 5.141.496. Pat. U.S. No. 5.417.662 (todas aqui incorporadas a título de referência). As composições intradermais podem também ser administradas por dispositivos que limitam o comprimento de penetração eficaz de uma agulha na pele, tais como aquelas descritas no WO99/34850, incorporada aqui a título de referência e seus equivalentes funcionais. São também adequados aqui dispositivos para injeção que aplicam vacinas líquidas à derme através de um injetor de jato líquido ou através de uma agulha que fura o estrato córneo e produz um jato que atinge a derme. Dispositivos para injeção de jato são descritos, por exemplo, nas Pat. U.S. No. 5.480.381. Pat. U.S. No. 5.599.302. Pat. U.S. No. 5.334.144. Pat. U.S. No. 5.993.412. Pat. U.S. No. 5.649.912. Pat. U.S. No. 5.569.189. Pat. U.S. No. 5.704.911. Pat. U.S. No. 5.383.851. Pat. U.S. No. 5.893.397. Pat. U.S. No. 5.466.220. Pat. U.S. No. 5.339.163. Pat. U.S. No. 5.312.335. Pat. U.S. No. 5.503.627. Pat. U.S. No. 5.064.413. Pat. U.S. No. 5.520.639. Pat. U.S. No. 4.596.556. Pat. U.S. No. 4.790.824. Pat. U.S. No. 4.941.880. Pat. U.S. No. 4.940.460. WO 97/37705 e WO 97/13537 (todos aqui incorporados a título de referência). Também adequados são dispositivos de aplicação de pó/partícula balísticos que usam gás comprimido para acelerar a vacina em forma de pó através das camadas externas da pele para a derme. Ainda, seringas convencionais podem ser usadas no método mantoux clássico de administração intradermal.
[000472] Considerações gerais na formulação e na fabricação de agentes farmacêuticas podem ser encontradas, por exemplo, em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995; incorporado aqui a título de referência.
[000473] As composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem ser administradas em qualquer dose apropriada para obter um resultado desejado. Em algumas modalidades, o resultado desejado é redução em intensidade, severidade e/ou frequência e/ou retardo do início de um ou mais sintomas de infecção por gripe.
[000474] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas de acordo com a invenção são formuladas para administrar uma dose de agente de ligação eficaz para competir com HA da gripe pela ligação a glicanos de topologia de guarda-chuva. Em algumas modalidades, tal ligação por HA da gripe é reduzida após administração de uma ou mais doses de uma composição de acordo com a invenção comparado com seu nível ausente tal administração. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas de acordo com a invenção são formuladas para administrar uma dose de agente de ligação eficaz para saturar pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais sítios de ligação de HA (por exemplo, sítios de ligação de HA contendo glicanos de topologia de guarda-chuva) presentes no indivíduo (por exemplo, no trato respiratório do indivíduo) recebendo a composição.
[000475] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas de acordo com a invenção são formuladas para aplicar uma dose unitária de agente de ligação dentro da faixa de 0,0001 a 1000 mg/kg.
[000476] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas de acordo com a invenção são administradas em doses múltiplas. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas de acordo com a invenção são administradas em doses múltiplas/dia. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas de acordo com a invenção são administradas de acordo com um regime de dosagem contínuo, de maneira que o indivíduo não sofre períodos de menos do que dosagem terapêutica interpostos entre períodos de dosagem terapêutica. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas de acordo com a invenção são administradas de acordo com um regime de dosagem intermitente, de maneira que o indivíduo sofre pelo menos um período de menos do que a dosagem terapêutica interposto entre dois períodos de dosagem terapêutica.
[000477] A presente invenção provê estojos para detecção de agentes de ligação (por exemplo, polipeptídeos de HA, LSBAs, UTBAs, UTSBAs, etc) e particular para detecção de agentes de ligação com características de ligação de glicano particulares (por exemplo, ligação a glicanos de guarda-chuva, a glicanos sialilados por α2-6, a glicanos sialilados por α2-6 longos, etc) em amostras patológicas incluindo, mas não limitado a, sangue, soro/plasma, células mononucleares de sangue periférico/linfócitos de sangue periférico (PBMC/PBL), esputo, urina, fezes, esfregaços da garganta, esfregaços de lesão dérmica, fluidos cerebroespinhais, secreções cervicais, amostras de pus, matrizes de alimento e tecidos de várias partes do corpo tais como cérebro, baço e fígado. A presente invenção também provê estojos para detecção de agentes de ligação (por exemplo, polipeptídeos de HA, LSBAs, UTBAs, UTSBAs, etc) de interesse em amostras ambientais, incluindo, mas não limitado a, solo, água e flora. Outras amostras que não foram listadas podem ser também aplicáveis.
[000478] Em algumas modalidades, a presente invenção provê estojos para detecção de polipeptídeos de HA conforme aqui descrito sejam ou não tais polipeptídeos agentes de ligação.
[000479] Em algumas modalidades, os estojos de acordo com a invenção podem incluir um ou mais agentes que detectam especificamente agentes de ligação (por exemplo, polipeptídeos de HA, LSBAs, UTBAs, UTSBAs, etc) com características de ligação a glicano particulares. Tais agentes de detecção podem incluir, por exemplo, anticorpos que reconhecem especificamente certos agentes de ligação (por exemplo, agentes de ligação que se ligam a glicanos guarda-chuva e/ou glicanos sialilados por α2-6 e/ou glicanos sialilados por α2-6 longos), que podem ser usados para detectar especifica-mente tais agentes de ligação através de ELISA, imunofluorescência e/ou immunoblotting.
[000480] Os anticorpos que se ligam a polipeptídeos de HA podem ser também usados em testes de neutralização de vírus, em que uma amostra é tratada com anticorpo específico para polipeptídeos de HA de interesse e testada quanto à sua habilidade em infectar células culturadas com relação à amostra não tratada. Se o vírus nesta amostra contiver tais polipeptídeos de HA, o anticorpo vai neutralizar o vírus e prevenir que ele infecte as células culturadas. Alternativamente ou adicionalmente, tais anticorpos podem ser usados em testes de infecção por HA, em que a proteína HA é isolada de uma dada amostra, tratada com anticorpo específico para um polipeptídeo de HA particular ou conjunto de polipeptídeos de HA e testada quanto à sua habilidade em aglutinar eritrócitos com relação à amostra não tratada. Se o vírus na amostra contiver tal polipeptídeo de HA, o anticorpo vai neutralizar a atividade do polipeptídeo de HA e prevenir que ele aglutine eritrócitos
[000481] (Harlow & Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, CSHL Press; www.who.int/csr/resources/publications/influenza/WHO_CDS_CSR_N CS_2002_5/en/index.html; www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/labtests/en/index. html). Em algumas modalidades, tais agentes podem incluir ácidos nucleicos que se ligam especificamente a nucleotídeos que codificam polipeptídeos de HA particulares e que podem ser usados para detectar especificamente tais polipeptídeos de HA através de RT-PCR ou hibridização in situ
[000482] (www.who.int/csr/resources/publications/influenza/WHO_C DS_CSR_NCS_2002_5/en/index.html;www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/labtests/en/index. html). Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos que foram isolados de uma amostra são amplificados antes da detecção. Em algumas modalidades, reagentes de diagnóstico podem ser marcados detectavelmente.
[000483] A presente invenção também provê estojos contendo reagentes de acordo com a invenção para a geração de vírus e vacinas da gripe. Os teores dos estojos incluem, mas não estão limitados a, plasmídeos de expressão contendo nucleotídeos de HA (ou porções características ou biologicamente ativas) codificando polipeptídeos de HA de interesse (ou porções características ou biologicamente ativas). Alternativamente ou adicionalmente, os estojos podem conter plasmídeos de expressão que expressam polipeptídeos de HA de interesse (ou porções características ou biologicamente ativas). Os plasmídeos de expressão não contendo genes de vírus podem ser também incluídos de maneira que os usuários sejam capazes de incorporar nucleotídeos de HA de qualquer vírus da gripe de interesse. Linhagens de célula de mamífero podem ser também incluídas com os estojos, incluindo, mas não limitado a, linhagens de célula Vero e MDCK. Em algumas modalidades, os reagentes de diagnóstico podem ser detectavelmente marcados.
[000484] Em algumas modalidades, os estojos para uso de acordo com a presente invenção podem incluir, como uma amostra de referência, instruções para processamento de amostras, realização do teste, instruções para interpretação dos resultados, tampões e/ou outros reagentes necessários para realização do teste. Em algumas modalidades o estojo pode compreender um painel de anticorpos.
[000485] Em algumas modalidades da presente invenção, disposições de glicano, conforme acima discutido, podem ser utilizadas como diagnósticos e/ou estojos.
[000486] Em algumas modalidades, as disposições de glicano e/ou estojos de acordo com a invenção são usados para realizar estudos de resposta de dose para avaliar ligação de polipeptídeos de HA a glicanos guarda-chuva em doses múltiplas (por exemplo, conforme aqui descrito). Tais estudos dão compreensão particularmente valiosa para as características de ligação de polipeptídeos de HA testados e são particularmente úteis para avaliar ligação específica. Estudos de ligação de resposta de dose deste tipo encontram muitas aplicações úteis. Para dar apenas um exemplo, eles podem ser de auxílio no rastreamento da evolução de características de ligação em uma série relacionada de variantes de polipeptídeo de HA, seja a série gerada através de evolução natural, engenharia intencional ou combinação das duas.
[000487] Em algumas modalidades, disposições de glicano e/ou estojos de acordo com a invenção são usados para induzir, identificar e/ou selecionar agentes de ligação (por exemplo, polipeptídeos de HA e/ou variantes de polipeptídeo de HA) tendo características de ligação desejadas. Por exemplo, em algumas modalidades, disposições de glicano e/ou estojos de acordo com a invenção são usados para exercer pressão evolucionária (por exemplo, avaliação e/ou seleção) em uma população de agentes de ligação de polipeptídeo (por exemplo, polipeptídeos de HA).
[000488] A presente invenção provê estojos para administração de composições farmacêuticas de acordo com a invenção. Por exemplo, em algumas modalidades, a invenção provê um estojo compreendendo pelo menos uma dose de um agente de ligação. Em algumas modalidades, a invenção provê um estojo compreendendo uma dose unitária inicial e uma dose unitária subsequente de um agente de ligação. Em algumas tais modalidades, a dose unitária inicial é maior do que a dose unitária subsequente ou em que as duas doses são iguais.
[000489] Em algumas modalidades, os estojos de acordo com a invenção (particularmente aqueles para administração de composições farmacêuticas de acordo com a invenção) compreendem pelo menos um componente de um dispositivo de aplicação, por exemplo, um inalador. Em algumas modalidades, a invenção provê um estojo compreendendo pelo menos um componente de um dispositivo de aplicação, por exemplo, um inalador e uma dose de um agente de ligação.
[000490] Em algumas modalidades, os estojos providos compreendem instruções para uso.
[000491] O vírus da gripe aviária H5N1 é um patógeno altamente infeccioso e mortal. Desde 1996, vários surtos de H5N1 ocorreram em três continentes matando milhões de aves. Desde sua emergência, o vírus também mostrou potencial em infectar humanos com uma taxa de mortalidade excedendo 60%. Os humanos não têm virtualmente nenhuma imunidade para o vírus H5N1, mas o vírus ainda não se adaptou ao hospedeiro humano para ser capaz de infectar e ser transmitido eficientemente entre humanos. O vírus adquiriria mutações que permitiriam que ele ganhasse uma base na população humana.
[000492] Hemaglutinina (HA), a glicoproteína de superfície do vírus da gripe A, é responsável pelo início da entrada na célula hospedeiro. HA se liga a receptores glicano sialilados (glicanos complexos terminados por ácido siálico ligados a α2^3 ou α2^6). A HA de H5N1 se liga preferivelmente a receptores glicano terminados por ácidos siálico ligados a α2^3. Os presentes inventores demonstraram que os receptores glicano no hospedeiro humano para vírus A da gripe adaptado para humanos são glicanos sialilados por α2^6 que adotam a topologia do tipo guarda-chuva característica (referidos daqui em diante como receptores humanos) no sítio de ligação de receptor glicano (RBS) de HA
[000493] (Chandrasekharan e outros, 2008, Nat Biotech, 26:107; incorporado aqui a título de referência). Os presentes inventores também mostraram que ligação de alta afinidade a esses receptores glicano humanos é uma característica de HA adaptada para humano e se relaciona com a capacidade de transmissão pelo ar eficiente dos vírus H1N1 e H3N2 adaptados para humano (Chandrasekharan e outros, 2008, Nat Biotech, 26:107; Srinivasan e outros, 2008, PNAS, 105: 2800; ambos aqui incorporados a título de referência). No presente estudo, os presentes inventores proveram um vírus H5N1 em que HA tem substituições de sequência no RBS que permitem que ela se ligue com alta afinidade a receptores humanos.
[000494] A HA da gripe é uma proteína homotrimérica, em que um monômero contém 552 aminoácidos. Cada monômero é composto de duas porções ligadas a dissulfeto, HA1 e HA2. HA1 compreende o sítio de ligação de receptor glicano (RBS), enquanto H2 está envolvido na fusão das membranas viral e celular. A bolsa de RBS envolve posições de HA 95, 131, 133, 136, 137, 138, 145, 153, 155, 156, 158, 159, 183, 186, 187, 189, 190, 192, 193, 194, 195, 196, 219, 222, 224, 225, 226, 227, 228 (numeração de H3 usada).
[000495] Os presentes inventores conduziram uma análise detalhada de contatos moleculares entre H5N1 e um receptor humano representativo e compararam esses contatos com aqueles entre HAs de H1N1, H2N2 e H3N2 pandêmicos adaptados para humanos e receptores humanos. Através desta abordagem, os presentes inventores definiram estratégias para geração de formas mutantes de HA de H5N1. As mutações Q226L e G228S (ou LS) foram introduzidas em várias clades genéticas de HA de H5N1. Essas mutações são baseadas nas substituições de aminoácido características nas posições 226 e 228 de HAs de H2N2 e H3N2 que levaram à sua adaptação humana, respectivamente.
[000496] Essas mutações foram introduzidas no contexto do RBS de clades genéticas diferentes de HA de H5N1 (Figura 13). Estudos anteriores (por exemplo, Stevens e outros, 2008, J. Mol. Biol., 381:1382-94; e Stevens e outros, 2006, Science, 312:404; ambos aqui incorporados a título de referência) analisaram ambos HA recombinante e vírus integral compreendendo as mutações LS em linhagens de H5N1 diferentes em plataformas de disposição de glicano e mostraram que algumas dessas linhagens adquiriram ligação a glicanos sialilados por α2^6 (Figura 14). No entanto, o objetivo desses estudos era avaliar a ligação em concentração de proteína ou títulos virais altos para determinar quantos glicanos α2^3 ou α2^6 mostraram sinais de ligação.
[000497] Em contraste, os presente inventores realizaram uma análise dependente da dose de HAs recombinantes carregando a mutação LS no RBS de várias linhagens de H5N1 (Figura 15). Os presentes dados demonstram que nenhum desses mutantes mostrou as características de afinidade de ligação alta a receptores humanos que é compartilhada por HAs adaptadas para humanos. Os presentes resultados também se relacionaram com a transmissão ineficiente de vírus H5N1 carregando apenas a mutação LS no RBS. No entanto, nenhum desses mutantes mostrou ligação a receptor humano de alta afinidade. Desta maneira, estratégias adicionais foram necessárias para definir formas mutantes de HA de H5N1.
[000498] Desta maneira, os presentes inventores introduziram 5 substituições de aminoácido em 128, 133, 145, 159, 193 (resíduos em negrito e sublinhados abaixo) na HA
[000499] Viet_1203_04_c1 (A/Viet Nam/1203/04 que é uma linhagem da clade 1) a fim de deixar seu RBS similar àquele das clades genéticas mais recentes (que incluem linhagens tal como A/Indonesia/5/05).
[000500] Os presentes inventores reconheceram que glicosilação na posição de aminoácido N158 interferiria com a topologia tipo guarda- chuva de receptor humano no RBS de HA de H5N1. Desta maneira, a primeira estratégia dos inventores envolvia a geração de formas mutantes de HA de H5N1 que continham substituições Q228L e/ou G228S e uma mutação T160A adicional que anula glicosilação em N158.
[000501] Este sítio de glicosilação não é conservado em todas as clades genéticas. Se a ausência de glicosilação em N158 melhora a ligação ao receptor humano de HA de H5N1 com mutações LS, então as mutações LS sozinhas seriam suficientes para obter adaptação humana de vírus pertencentes às clades genéticas que não têm naturalmente este sítio de glicosilação (c2.2, c2.2.1, etc; vide Figura 13). A sequência de molde para essas clades foi mostrada como Egypt_2876-N3_06_c2.2 (A/Egypt/2786-N3/06 pertencente à clade 2.2). Os presentes inventores também definiram formas mutantes que carregam a mutação Q226L sozinha (no contexto de desglicosi- lação na posição 158) para checar o grau de aperfeiçoamento da afinidade de ligação a receptor humano, dado que em HA de H2, a mutação Q226L é suficiente para melhorar substancialmente a afinidade.
[000502] Análise dependente da dose dos mutantes acima (Figura 16) mostrou que remoção da glicosilação em Asn-158 através de mutação de Thr-160^Ala no contexto de mutação de LS melhora substancialmente ligação a receptores humanos. Isto foi observado para ambos o mutante T160A/Q226L/G228S em Viet1203_04_D bem como mutação LS em Egypt_2876-N3_06_c2.2 HA. Os presentes inventores demonstraram ainda que a mutação Q226L sozinha (sem G228S) não é suficiente para prover a afinidade de ligação a receptor humano alta no contexto da remoção de glicosilação em N158. A presente invenção, no entanto, compreende o reconhecimento que uma mutação em Q226 (por exemplo, Q226L) sozinha seria suficiente para prover a afinidade de ligação a receptor humano alta no contexto da remoção de glicosilação em N518 no contexto de algumas linhagens de vírus particulares. A presente invenção também compreende o reconhecimento que uma mutação em G228 (por exemplo, G228S) sozinha seria suficiente para prover a afinidade de ligação a receptor humano alta no contexto da remoção de glicosilação em N158 no contexto de algumas linhagens de vírus particulares. A presente invenção também compreende o reconhecimento que mutações em ambos Q226 e G228 (por exemplo, Q226L e G228S) poderiam ser necessárias para prover a afinidade de ligação a receptor humano alta no contexto da remoção de glicosilação em N158 no contexto de algumas linhagens de vírus particulares.
[000503] Ainda, os inventores constataram que ligação dos mutantes acima a receptores de ave (particularmente a 3’SLN-LN-LN e 3’SLN- LN) foi também muito alta, que não é típico de HAs adaptadas para humano. Por exemplo, mesmo no caso da HA de H2N2 pandêmica prototípica (A/Albany/6/58) que mostrou ligação a ambos os receptores humano e de ave, a afinidade de ligação a receptor humano foi ordens de magnitude maiores do que aquela afinidade de ligação de receptor de ave.
[000504] Os presentes inventores projetaram formas mutantes de HA de H5N1 de maneira que os contatos moleculares entre seu RBS e receptor humano imitam muito proximamente aqueles contatos entre HAs de H2N2 adaptado para humano e receptores humanos. Com base no trabalho anterior do inventor na compreensão da composição molecular do RBS de HA de H2N2 e como ele governa especificidade de receptor glicano, os inventores primeiros realizaram uma comparação molecular detalhada do RBS da HA de H5N1 com aquele de uma HA de H2N2 adaptado para humano prototípico de uma linhagem pandêmica 1957-58 (A/Albany/6//58 ou Alb6_58) (Figura 17). A fim de minimizar as diferenças na composição molecular de RBS entre HA de H5 e HA de Alb6_58, os inventores geraram um mutante no molde Viet1203_04_D ("Viet1203_04_D_H2RBS"; SEQ ID NO: 61) que compreende 13 substituições de aminoácido em 131, 132, 133, 135, 137, 155, 188, 192, 193, 221, 226, 227 e 228 e uma deleção em 130. O presente estudo, pela primeira vez, foca no projeto e teste de mutações no RBS de HA de H5N1 que apresenta uma combinação de deleção e substituições com base em comparação compreensiva entre HA de H2 e H5. A deleção foi feita na posição 130. Embora HA de H2N2 não tenha glicosilação na posição 158, o sítio de glicosilação de N158 (de Viet1203_04_D) na HA mutante foi retido. Desta maneira, a presente invenção compreende o reconhecimento que mutações que anulam glicosilação no sítio 158 em adição às mutações mencionadas acima poderiam aumentar a ligação humana ainda mais. Os presentes inventores também projetaram outra versão deste mutante ("Viet1203_04_D_H2RBSmin"; SEQ ID NO: 63) com menos mutações com base em substituições conservativas.
[000505] Os presentes inventores também pesquisaram sequências de HA de outras linhagens de H5N1 que poderiam estar naturalmente mais próximas de Alb6_58 H2N2 HA em termos de composição molecular do RBS. A invenção identificou dois conjuntos de moldes exemplares: (1) com a mudança em propriedades de carga das posições 192 e 193 (A/chicken/Vietnam/NCVD-093/2008 ou ckViet_08) e (2) com uma deleção na alça 130 (A/chicken/Egypt/R2/2007 ou ckEgy_07). Formas mutantes adicionais com menos mutações nas posições mencionadas acima nesses novos moldes de HA de H5N1 foram projetadas para fazer a imitação de RBS de HA de H5N1 daquele RBS de HA de H2N2 adaptado para humano.
[000506] Afinidade de ligação de receptor humano mutante usando disposição de glicano dependente da dose foi testada. O mutante Viet1203_04_D_H2RBS mostrou ligação com afinidade alta altamente específica a receptores humanos que é característica de HAs de H1N1 e H2N2 adaptados para humano (Figura 19). A presente invenção compreende o reconhecimento que mutações adicionais podem ser projetadas para compreender a relação entre (1) a composição da alça 130 e deleção, (2) mudança nos resíduos carregados nas posições 192 e 193 e (3) glicosilação na posição 158 e como esta relação governa a afinidade de ligação a receptor humano da HAs de H5N1 mutante. Sequências exemplares de moldes de H5N1 usados e polipeptídeos mutantes exemplares projetados de acordo com os princípios acima e os princípios mostrados no Exemplo 2
[000507] Um alinhamento de moldes de H5N1 exemplares e polipeptídeos de HA de H5 mutantes exemplares projetados de acordo com os princípios acima e os princípios mostrados no Exemplo 2 é apresentado na Figura 18 e abaixo:
[000508] Nas sequências que seguem, itálico e destacado denotam a região em que as mutações são feitas e negrito e sublinhado indicam os resíduos que foram mutados.
[000509] Vários estudos experimentais tentaram identificar determinantes de especificidade de receptor humano de HA de H5. No entanto, esses estudos focaram na substituição de aminoácidos nos sítios RBS diretamente sem considerar a influência das posições vizinhas. Ainda, nenhum estudo anterior nem mesmo considerou inserções ou deleções como possíveis determinantes de especificidade de hospedeiro. Investigações baseadas em estrutura não conseguiram identificar os determinantes chave de HA de H5 principalmente porque os efeitos estruturais de uma deleção não podem ser avaliados precisamente usando análise in silico. Em contraste, os presentes inventores, pela primeira vez, reconheceram a importância de e empregaram uma abordagem de alinhamento de sequência para engenheirar proteínas com propriedades novas. A presente invenção compreende o reconhecimento que uma abordagem similar pode ser usada para identificação de determinantes de especificidade de hospedeiro de outros subtipos de HA que mostraram potencial em infectar humanos nos últimos anos (H7, H9, etc).
[000510] Ensaios de ligação direta tipicamente utilizam disposições de glicano em que estruturas de glicano definidas (por exemplo, monovalentes ou multivalentes) são apresentadas em um apoio (por exemplo, lâminas de vidro ou placas de cavidade), frequentemente usando uma estrutura principal de polímero. Nos chamados ensaios "sequenciais", polipeptídeo de HA trimérica é ligado à disposição e então é detectado, por exemplo, usando anticorpos primários e secundários marcados (por exemplo, com FITC ou peroxidase de rábano). Em ensaios "multivalentes" HA trimérica é primeiro complexada com anticorpos primários e secundários (tipicamente em uma razão 4:2:1 HA:primário:secundário), de maneira que há 12 sítios de ligação de glicano por HA pré-complexada, e isto é contatado com a disposição. Ensaios de ligação são tipicamente realizados em uma faixa de concentrações de HA, de maneira que informação é obtida com relação a afinidades relativas para glicanos diferentes na disposição.
[000511] Por exemplo, estudos de ligação direta foram realizados com disposições tendo glicanos diferentes tais como 3’SLN, 6’SLN, 3’SLN-LN, 6’SLN-LN e 3’SLN-LN-LN, em que LN representa
[000512] Galβ1-4GlcNAc, 3’ representa Neu5Acα2-3 e 6’ representa Neu5Acα2-6). Especificamente, glicanos biotinilados foram (50 μl a 120 pmol/ml) foram incubados da noite para o dia (em PBS a 4° C) com uma placa de 384 cavidades de Capacidade de Ligação Alta revestida com estreptavidina que foi previamente enxaguada três vezes com PBS. As placas foram então lavadas três vezes com PBS para remover glicano em excesso e foram usadas sem processamento adicional.
[000513] Quantidades apropriadas de proteína HA marcada com His, anticorpo primário (marcador His 6x anticamundongo) e anticorpo secundário (IgG anticamundongo de cabra conjugado à HRP) foram incubadas em uma razão de 4:2:1 de HA:primário:secundário por 15 minutos em gelo. A mistura (isto é, HA pré-complexada) foi então levada para um volume final de 250 μl com BSA 1% em PBS. 50 μl da HA pré-complexada foram adicionados às cavidades revestidas com glicano na placa de 384 cavidades e foram incubados em temperatura ambiente por 2 horas. As cavidades foram subsequentemente lavadas três vezes com PBS contendo TWEEN-20 0,05% e então três vezes com PBS. Atividade de HRP foi estimada usando Amplex Red Peroxidase Kit (Invitrogen, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Diluições seriais de pré-complexos de HA foram estudadas. Controles negativos (glicanos não sialilados) e de base (quaisquer glicanos ou nenhuma HA) apropriados foram incluídos, e todos os ensaios foram feitos em triplicata.
[000514] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA são polipeptídeos de H5. Em algumas tais modalidades, os polipeptídeos de H5 de acordo com a invenção mostram ligação (por exemplo, ligação de alta afinidade e/ou especificidade) a glicanos guarda-chuva. Em algumas tais modalidades, os polipeptídeos de H5 de acordo com a invenção mostram ou ligação de alta afinidade comparável (à ligação de topologia de guarda-chuva) a glicanos de topologia de cone ou ligação reduzida (por exemplo, afinidade e/ou especificidade menor com relação a glicanos de topologia guarda-chuva) a glicanos de topologia de cone.
[000515] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de H5 de acordo com a invenção se ligam a receptores encontrados em células epiteliais respiratórias superiores humanas. Ainda, os polipeptí- deos de HA de H5 de acordo com a invenção se ligam a uma pluralidade de glicanos sialilados por α2-6. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de H5 se ligam a glicanos de guarda-chuva.
[000516] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de H5 de acordo com a invenção se ligam a receptores de HA nos brônquios e/ou traqueia. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de H5 não são capazes de se ligar a receptores no pulmão profundo e, em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de H5 são capazes de se ligar a receptores no pulmão profundo. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de H5 não são capazes de se ligar a glicanos sialilados por α2-3 e em algumas modalidades os polipeptídeos de HA de H5 são capazes de se ligar a glicanos sialilados por α2-3.
[000517] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de H5 de acordo com a invenção são variantes de HA de H5 parental (por exemplo, uma HA de H5 encontrada em isolato de gripe natural). Por exemplo, em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de H5 de acordo com a invenção têm pelo menos uma substituição de aminoácido, comparado com HA de H5 do tipo selvagem, dentro ou afetando o sítio de ligação de glicano. Em algumas modalidades, tais substituições são de aminoácidos que interagem diretamente com glicano ligado; em algumas modalidades, tais substituições são de aminoácidos que são um grau de separação removidos daqueles que interagem com glicano ligado, pelo fato que aminoácidos de um grau de separação removidos ou (1) interagem com os aminoácidos de ligação direta; (2) afetam de outra maneira a habilidade dos aminoácidos de ligação direta em interagir com glicano, mas não interagem diretamente com glicanos eles mesmos; (3) afetam de outra maneira a habilidade dos aminoácidos de ligação direta em interagir com glicano, e também interagem diretamente com os glicanos eles mesmos. Os polipeptídeos de HA de H5 de acordo com a invenção contêm substituições de um ou mais aminoácidos de ligação direta, um ou mais aminoácidos de primeiro grau de separação, um ou mais aminoácidos de segundo grau de separação ou qualquer combinação desses. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de H5 de acordo com a invenção podem conter substituições de um ou mais aminoácidos com graus ainda mais altos de separação.
[000518] Em algumas modalidades, as variantes de polipeptídeo de HA de H5 de acordo com a invenção têm pelo menos duas, três, quatro, cinco ou mais substituições de aminoácido comparado com HA de H5 do tipo selvagem; em algumas modalidades, as variantes do polipeptídeo de HA de H5 de acordo com a invenção têm duas, três ou quatro substituições de aminoácido. Em algumas modalidades, todas tais substituições de aminoácido estão localizadas dentro do sítio de ligação de glicano.
[000519] Em algumas modalidades, as variantes do polipeptídeo de HA de acordo com a invenção contêm uma ou mais substituições de aminoácido conforme descrito em qualquer uma de Publicações de Patente U.S. Números 2009/0269342 e 2010/0004195 e no Pedido de Patente U.S. Número de Série 12/829931 depositado em 2 de julho de 2010 intitulado "COMPOSITIONS AND METHODS FOR DIAGNOSING AND/OU TREATING INFLUENZA INFECTION" (todos aqui incorporados a título de referência).
[000520] Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA de H5 têm substituições de sequência nas posições correspondendo a um ou mais de resíduos 95, 98, 128, 130, 131, 132, 133, 135, 136, 137, 138, 145, 153, 155, 156, 158, 159, 160, 183, 186, 187, 188, 189, 190, 192, 193, 194, 195, 196, 219, 221, 222, 224, 225, 226, 227 e 228. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA de H5 têm uma ou mais substituições de aminoácido com relação a uma HA de H5 parental do tipo selvagem em resíduos selecionados do grupo consistindo nos resíduos 95, 98, 128, 130, 131, 132, 133, 135, 136, 137, 138, 145, 153, 155, 156, 158, 159, 160, 183, 186, 187, 188, 189, 190, 192, 193, 194, 195, 196, 219, 221, 222, 224, 225, 226, 227 e 228. Em algumas modalidades, variantes do polipeptídeo de HA de H5 têm uma ou mais substituições de aminoácido com relação a uma HA de H5 parental do tipo selvagem em qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 ou 37 resíduos selecionados do grupo consistindo nos resíduos 95, 98, 128, 130, 131, 132, 133, 135, 136, 137, 138, 145, 153, 155, 156, 158, 159, 160, 183, 186, 187, 188, 189, 190, 192, 193, 194, 195, 196, 219, 221, 222, 224, 225, 226, 227 e 228.
[000521] Em algumas modalidades, as variantes de polipeptídeo de HA de H5 têm substituições de sequência que reduzem ou abolem glicosilação em um sítio correspondendo à posição 158. Em algumas modalidades, as variantes do polipeptídeo de HA de H5 têm substituições de sequência que afetam e/ou alteram a identidade e/ou estrutura do glicano ligado a um sítio correspondendo à posição 158. Em algumas modalidades, tal substituição de sequência é uma mutação em um sítio correspondendo à posição 158, por exemplo, Asn158Xaa, em que Xaa é qualquer aminoácido que não Asn. Em algumas modalidades, tal substituição de sequência é uma mutação em um sítio correspondendo à posição 160, por exemplo, Thr160Xaa, em que Xaa é qualquer aminoácido que não Asn. Em algumas modalidades, tal substituição de sequência compreende a mutação Thr160Ala. Em algumas modalidades, uma substituição de sequência que reduz, abole, afeta ou altera glicosilação em um sítio correspondendo à posição 158 pode tornar um polipeptídeo de HA de H5 mais parecido (por exemplo, ambos estruturalmente e funcionalmente) com um polipeptídeo de HA de H2. Em algumas modalidades, uma mutação em um sítio correspondendo à posição 160 (por exemplo, Thr160Xaa, tal como Thr160Ala) pode tornar um polipeptídeo de HA de H5 mais parecido (por exemplo, ambos estruturalmente e funcionalmente) a um polipeptídeo de HA de H2.
[000522] Em algumas modalidades, uma variante do polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA de H5 parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a um ou mais de resíduos 226, 228 e 160. Em algumas modalidades, uma variante do polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA de H5 parental do tipo selvagem nas posições correspondendo aos resíduos 226, 228 e 160. Em algumas modalidades, uma variante do polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA de H5 parental do tipo selvagem nas posições correspondendo aos resíduos 226 e 160. Em algumas modalidades, uma variante do polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA de H5 parental do tipo selvagem nas posições correspondendo aos resíduos 228 e 160. Em algumas modalidades, uma variante do polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA de H5 parental do tipo selvagem nas posições correspondendo aos resíduos 226 e 228.
[000523] Em algumas modalidades, uma variante do polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA de H5 parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a um ou mais de resíduos 226, 228 e 158. Em algumas modalidades, uma variante do polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA de H5 parental do tipo selvagem nas posições correspondendo aos resíduos 226, 228 e 158. Em algumas modalidades, uma variante do polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA de H5 parental do tipo selvagem nas posições correspondendo aos resíduos 226 e 158. Em algumas modalidades, uma variante do polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA de H5 parental do tipo selvagem nas posições correspondendo aos resíduos 228 e 158. Em algumas modalidades, uma variante do polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA de H5 parental do tipo selvagem nas posições correspondendo aos resíduos 226 e 228.
[000524] Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência que incluem uma deleção em uma ou mais das regiões de alça de um polipeptídeo de HA. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência que incluem uma deleção em um sítio correspondendo à região de alça 128-137 de um polipeptídeo de HA. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência que incluem uma deleção em uma ou mais posições de aminoácido correspondendo aos resíduos 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136 e/ou 137 de um polipeptídeo de HA. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência que incluem uma deleção em um sítio correspondendo à região de alça 128-134 de um polipeptídeo de HA. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência que incluem uma deleção em uma ou mais de posições de aminoácido correspondendo aos resíduos 128, 129, 130, 131, 132, 133 e/ou 134 de um polipeptídeo de HA. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência que incluem uma deleção de um aminoácido correspondendo ao resíduo 130. Em algumas modalidades, tais substituições de região de alça podem tornar um polipeptídeo de HA de H5 mais parecido (por exemplo, ambos estruturalmente e funcionalmente) com um polipeptídeo de HA de H2. Em algumas modalidades, uma deleção de um aminoácido correspondendo ao resíduo 130 pode tornar um polipeptídeo de HA de H5 mais parecido (por exemplo, ambos estruturalmente e funcionalmente) com um polipeptídeo de HA de H2.
[000525] Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a um ou mais de resíduos 131, 132, 133, 135, 137, 155, 188, 192, 193, 221, 226, 227, 228 e 130. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a qualquer um 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 de resíduos 131, 132, 133, 135, 137, 155, 188, 192, 193, 221, 226, 227, 228 e 130. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) um ou mais de resíduos 131, 132, 133, 135, 137, 155, 188, 192, 193, 221, 226, 227 e 228. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) qualquer um de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 de resíduos 131, 132, 133, 135, 137, 155, 188, 192, 193, 221, 226, 227 e 228.
[000526] Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a um ou mais de resíduos 131, 132, 135, 188, 192, 221 e 130. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 de resíduos 131, 132, 135, 188, 192, 221 e 130. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) um ou mais de resíduos 131, 132, 135, 188, 192 e 221. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) qualquer 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 de resíduos 131, 132, 135, 188, 192 e 221.
[000527] Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a um ou mais de resíduos 133, 137, 155, 193, 226, 227, 228 e 130. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou de resíduos 133, 137, 155, 193, 226, 227, 228 e 130. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) um ou mais de resíduos 133, 137, 155, 193, 226, 227 e 228. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 de resíduos 133, 137, 155, 193, 226, 227 e 228.
[000528] Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a um ou mais de resíduos 130, 192 e 193. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a qualquer 1, 2 ou 3 de resíduos 130, 192, 193. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) um ou ambos os resíduos 192 e 193.
[000529] Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a um ou mais de resíduos 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221, 226, 227, 228 e 130. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 de resíduos 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221, 226, 227, 228 e 130. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) um ou mais de resíduos 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221, 226, 227 e 228. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 de resíduos 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221, 226, 227 e 228.
[000530] Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a um ou mais de resíduos 137, 188, 192, 193, 226, 228 e 130. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 de resíduos 137, 188, 192, 193, 226, 228 e 130. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) um ou mais de resíduos 137, 188, 192, 193, 226 e 228. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) qualquer 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 de resíduos 137, 188, 192, 193, 226 e 228.
[000531] Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a um ou mais de resíduos 137, 188, 192, 193, 226, 227, 228, 131, 132, 133 e 130. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 de resíduos 137, 188, 192, 193, 226, 227, 228, 131, 132, 133 e 130. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) um ou mais de resíduos 137, 188, 192, 193, 226, 227, 228, 131, 132 e 133. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de resíduos 137, 188, 192, 193, 226, 227, 228, 131, 132 e 133.
[000532] Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a um ou mais de resíduos 227, 131, 132, 133 e 130. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a qualquer 1, 2, 3, 4 ou 5 de resíduos 227, 131, 132, 133 e 130. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) um ou mais de resíduos 227, 131, 132 e 133. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) qualquer 1, 2, 3 ou 4 de resíduos 227, 131, 132 e 133.
[000533] Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a um ou mais de resíduos 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226, 227, 228 e 130. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 de resíduos 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226, 227, 228 e 130. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) um ou mais de resíduos 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226, 227 e 228. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de resíduos 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226, 227 e 228.
[000534] Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a um ou mais de resíduos 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226, 228 e 130. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de resíduos 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226, 228 e 130. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) um ou mais de resíduos 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226 e 228. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 de resíduos 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226 e 228.
[000535] Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a um ou mais de resíduos 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226, 227, 228 e 130. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 de resíduos 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226, 227, 228 e 130. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) um ou mais de resíduos 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226, 227 e 228. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 de resíduos 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226, 227 e 228.
[000536] Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a um ou mais de resíduos 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226, 228 e 130. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 de resíduos 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226, 228 e 130. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) um ou mais de resíduos 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226 e 228. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 de resíduos 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226 e 228.
[000537] Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a um ou mais de resíduos 137, 188, 192, 193, 226, 228, 131, 132, 133, 221, 227 e 130. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 de resíduos 137, 188, 192, 193, 226, 228, 131, 132, 133, 221, 227 e 130. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) um ou mais de resíduos 137, 188, 192, 193, 226, 228, 131, 132, 133, 221 e 227. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 de resíduos 137, 188, 192, 193, 226, 228, 131, 132, 133, 221 e 227.
[000538] Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a um ou mais de resíduos 131, 132, 133, 221, 227 e 130. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a qualquer 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 de resíduos 131, 132, 133, 221, 227 e 130. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) um ou mais de resíduos 131, 132, 133, 221 e 227. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5) tem substituições de sequência com relação a uma HA parental do tipo selvagem nas posições correspondendo a (1) 130 e (2) qualquer 1, 2, 3, 4 ou 5 de resíduos 131, 132, 133, 221 e 227.
[000539] Em algumas modalidades, uma variante do polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de aminoácido com relação a uma HA de H5 parental do tipo selvagem em resíduos selecionados de aminoácidos localizados na região do receptor que se liga diretamente ao glicano, incluindo, mas não limitado aos, resíduos 98, 136, 153, 155, 183 e 194. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem uma ou mais substituições de aminoácido com relação a uma HA de H5 parental do tipo selvagem em resíduos selecionados de aminoácidos localizados adjacentes à região do receptor que se liga ao glicano, incluindo, mas não limitado aos, resíduos 98 e 195, (b) resíduos 98, 138, 186, 187, 195 e 228) ou (c) resíduos 138, 186, 187 e 228.
[000540] Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA, e particularmente uma variante de polipeptídeo de H5, tem uma ou mais substituições de aminoácido com relação a uma HA parental do tipo selvagem em resíduos selecionados de aminoácidos que são um grau de separação removidos daqueles que interagem com glicano ligado, pelo fato que aminoácidos removidos um grau de separação ou (1) interagem com os aminoácidos de ligação direta; (2) afetam de outra maneira a habilidade dos aminoácidos de ligação direta em interagir com glicanos, mas não interagem diretamente com glicanos eles mesmos; ou (3) afetam de outra maneira a habilidade dos aminoácidos de ligação direta em interagir com glicano, e também interagem diretamente com os glicanos eles mesmos, incluindo, mas não limitado aos, resíduos 98, 138, 186, 187, 195 e 228.
[000541] Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA, e particularmente uma variante de polipeptídeo de H5, tem uma ou mais substituições de aminoácido com relação a uma HA parental do tipo selvagem em resíduos selecionados de aminoácidos que são um grau de separação removidos daqueles que interagem com glicano ligado, pelo fato que os aminoácidos removidos um grau de separação ou (1) interagem com os aminoácidos de ligação direta; (2) de outra maneira afetam a habilidade dos aminoácidos de ligação direta em interagir com glicano, mas não interagem diretamente com glicanos eles mesmos; ou (3) de outra maneira afetam a habilidade dos aminoácidos de ligação direta em interagir com glicano, e também interagem diretamente com os glicanos eles mesmos, incluindo, mas não limitado aos resíduos 138, 186, 187 e 228.
[000542] Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA, e particularmente uma variante de polipeptídeo de H5, tem uma ou mais substituições de aminoácido com relação a uma HA parental do tipo selvagem em resíduos selecionados de aminoácidos que são um grau de separação removidos daqueles que interagem com glicano ligado, pelo fato que os aminoácidos removidos um grau de separação ou (1) interagem com os aminoácidos de ligação direta; (2) de outra maneira afetam a habilidade dos aminoácidos de ligação direta em interagir com glicano, mas não interagem diretamente com glicanos eles mesmos; ou (3) de outra maneira afetam a habilidade dos aminoácidos de ligação direta em interagir com glicano, e também interagem diretamente com os glicanos eles mesmos, incluindo, mas não limitado aos resíduos 98 e 195.
[000543] Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA, e particularmente uma variante de polipeptídeo de H5, tem uma substituição de aminoácido com relação a uma HA parental do tipo selvagem no resíduo 159.
[000544] Em algumas modalidades, uma variante do polipeptídeo de HA, e particularmente uma variante de polipeptídeo de H5, tem uma ou mais substituições de aminoácido com relação a uma HA parental do tipo selvagem em resíduos selecionados de 190, 193, 225 e 226. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de há, e particularmente uma variante de polipeptídeo de H5, tem uma ou mais substituições de aminoácido com relação a uma HA parental do tipo selvagem nos resíduos selecionados de 190, 193, 226 e 228.
[000545] Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 de acordo com a invenção tem uma ou mais das substituições de aminoácido que seguem: Ser132Thr, Ala133Thr, Ser133Thr, Ser137Ala, Ser137Arg, Ile155Thr, Lys156Glu, Asn158Xaa (em que Xaa = qualquer aminoácido além de Asn), Thr160Ala, Asn186Pro, Asp187Ser, Asp187Thr, Ala188Glu, Ala188Asp, Ala189Gln, Ala189Lys, Ala189Thr, Glu190Asp, Glu190Thr, Thr192Arg/Lys, Lys193Arg, Lys193Asn, Lys193His, Lys193Ser, Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val, Ser221Pro, Gly225Asp, Gln226Ile, Gln226Leu, Gln226Val, Ser227Ala, Gly228Ser.
[000546] Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 de acordo com a invenção tem uma substituição de aminoácido em uma posição correspondendo ao resíduo 192, que muda a carga nesta posição. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 de acordo com a invenção tem uma substituição de aminoácido em uma posição correspondendo ao resíduo 193, que muda a carga nesta posição. Por exemplo, em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA de H5 de acordo com a invenção tem um resíduo Thr ou um hidrofóbico (por exemplo, Val ou Ile) em uma posição correspondendo ao resíduo 192 e uma variante de polipeptídeo de HA de H2 (por exemplo, uma variante adaptada para humano) tem um resíduo hidrofílico em uma posição correspondendo ao resíduo 192. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 (por exemplo, uma variante adaptada para humano) tem um resíduo hidrofílico em uma posição correspondendo ao resíduo 192. Para dar outro exemplo, em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA de H5 de acordo com a invenção tem um resíduo Thr ou um hidrofóbico (por exemplo, Val ou Ile) em uma posição correspondendo ao resíduo 192 e uma variante de polipeptídeo de HA de H5 (por exemplo, variante adaptada para humano) tem um resíduo básico (por exemplo, Lys ou Arg) em uma posição correspondendo ao resíduo 192. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 (por exemplo, uma variante adaptada a humano) tem um resíduo básico (por exemplo, Lys ou Arg) em uma posição correspondendo ao resíduo 192. Para dar ainda outro exemplo, em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA de H5 de acordo com a invenção tem um resíduo básico (por exemplo, Lys ou Arg) em uma posição correspondendo ao resíduo 193 e uma variante de polipeptídeo de HA de H5 (por exemplo, uma variante adaptada para humano) tem um resíduo neutro ou ácido em uma posição correspondendo ao resíduo 193. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 (por exemplo, uma variante adaptada para humano) tem um resíduo neutro ou ácido em uma posição correspondendo ao resíduo 193. Em algumas modalidades, uma variante do polipeptídeo de HA de H5 (por exemplo, uma variante adaptada para humano) tem um Thr, Ala, Met ou Val em uma posição correspondendo ao resíduo 193.
[000547] Em algumas modalidades, adaptação humana de um polipeptídeo de HA de H5 está associada com a propriedade(s) do resíduo na posição 188. Em HA de H5, o resíduo 188 é frequentemente Ala, que faz contato com Thr ou um resíduo hidrofóbico em 192. Em contraste, em HA de H2, o resíduo 188 é frequentemente Glu ou Asp, que faz contato com Arg ou Lys em 192. Desta maneira, em algumas modalidades, uma variante do polipeptídeo de HA de H5 tem um Glu na posição 188. Em algumas modalidades, uma variante do polipeptídeo de HA de H5 tem um Asp na posição 188. Em algumas modalidades, uma variante do polipeptídeo de HA de H5 tem uma substituição Ala188Glu. Em algumas modalidades, uma variante do polipeptídeo de HA de H5 tem uma substituição Ala188Asp.
[000548] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA de H5 tem um Ala em uma posição correspondendo ao resíduo 188 e um Thr em uma posição correspondendo ao resíduo 192. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA de H5 tem um Ala em uma posição correspondendo ao resíduo 188 e um resíduo hidrofóbico em uma posição correspondendo ao resíduo 192. Em algumas modalidades, uma variante do polipeptídeo de HA de H5 tem um Glu em uma posição correspondendo ao resíduo 188 e um Arg em uma posição correspondendo ao resíduo 192. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem um Asp em uma posição correspondendo ao resíduo 188 e um Arg em uma posição correspondendo ao resíduo 192. Em algumas modalidades, uma variante do polipeptídeo de HA de H5 tem um Glu em uma posição correspondendo ao resíduo 188 e um Lys em uma posição correspondendo ao resíduo 192. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem um Asp em uma posição correspondendo ao resíduo 188 e um Lys em uma posição correspondendo ao resíduo 192.
[000549] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA de H5 tem um Ala em uma posição correspondendo do resíduo 188, um Thr em uma posição correspondendo ao resíduo 192 e um Lys em uma posição correspondendo ao resíduo 193. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA de H5 tem um Ala em uma posição correspondendo ao resíduo 188, um resíduo hidrofóbico em uma posição correspondendo ao resíduo 192 e um Lys em uma posição correspondendo ao resíduo 193. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA de H5 tem um Ala em uma posição correspondendo ao resíduo 188, um Thr em uma posição correspondendo ao resíduo 192 e um Arg em uma posição correspondendo ao resíduo 193. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA de H5 tem um Ala em uma posição correspondendo ao resíduo 188, um resíduo hidrofóbico em uma posição correspondendo ao resíduo 192 e um Arg em uma posição correspondendo ao resíduo 193. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem um Glu em uma posição correspondendo ao resíduo 188, um Arg em uma posição correspondendo ao resíduo 192 e Thr em uma posição correspondendo ao resíduo 193. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem um Asp em uma posição correspondendo ao resíduo 188, um Arg em uma posição correspondendo ao resíduo 192 e um Thr em uma posição correspondendo ao resíduo 193. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem um Glu em uma posição correspondendo ao resíduo 188, um Lys em uma posição correspondendo ao resíduo 192 e um Thr em uma posição correspondendo ao resíduo 193. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem um Asp em uma posição correspondendo ao resíduo 188, um Lys em uma posição correspondendo ao resíduo 192 e um Thr em uma posição correspondendo ao resíduo 193. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem um Glu em uma posição correspondendo ao resíduo 188, um Arg em uma posição correspondendo ao resíduo 192 e um Thr, Ala, Met ou Val em uma posição correspondendo ao resíduo 193. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem um Asp em uma posição correspondendo ao resíduo 188, um Arg em uma posição correspondendo ao resíduo 192 e um Thr, Ala, Met ou Val em uma posição correspondendo ao resíduo 193. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem um Glu em uma posição correspondendo ao resíduo 188, um Lys em uma posição correspondendo ao resíduo 192 e um Thr, Ala, Met ou Val em uma posição correspondendo ao resíduo 193. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem um Asp em uma posição correspondendo ao resíduo 188, um Lys em uma posição correspondendo ao resíduo 192 e um Thr, Ala, Met ou Val em uma posição correspondendo ao resíduo 193.
[000550] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA de H5 tem um Ala em uma posição correspondendo ao resíduo 131. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem um Thr em uma posição correspondendo ao resíduo 131.
[000551] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA de H5 tem um Ser em uma posição correspondendo ao resíduo 132. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem um Thr em uma posição correspondendo ao resíduo 132.
[000552] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA de H5 tem um Ser em uma posição correspondendo ao resíduo 133. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem um Thr em uma posição correspondendo ao resíduo 133.
[000553] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA de H5 inclui Ala, Thr e/ou Ser em qualquer posição correspondendo aos resíduos 131, 132 e/ou 133. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 inclui Ala, Thr e/ou Ser em qualquer posição correspondendo aos resíduos 131, 132 e/ou 133. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 inclui Thr em todas as posições correspondendo aos resíduos 131, 132 e 133.
[000554] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA de H5 tem um Val em uma posição correspondendo ao resíduo 135. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem qualquer aminoácido que não Val em uma posição correspondendo ao resíduo 135.
[000555] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA de H5 tem um Ser em uma posição correspondendo ao resíduo 137. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem um Arg em uma posição correspondendo ao resíduo 137.
[000556] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA de H5 tem um Ile em uma posição correspondendo ao resíduo 155. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem um Thr em uma posição correspondendo ao resíduo 155. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA de H5 inclui um Thr em uma posição correspondendo ao resíduo 155. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 inclui um Thr em uma posição correspondendo ao resíduo 155.
[000557] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA de H5 tem um Ser em uma posição correspondendo ao resíduo 221. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem um Pro em uma posição correspondendo ao resíduo 221.
[000558] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA de H5 inclui um Ser em uma posição correspondendo ao resíduo 221. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 inclui um Pro em uma posição correspondendo ao resíduo 221. Sem desejar ser limitado por nenhuma teoria particular, Pro221 poderia influenciar a conformação de alça 200 que está envolvida com o RBS de HA de H2.
[000559] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA de H5 tem um Gln em uma posição correspondendo ao resíduo 226. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem um Leu em uma posição correspondendo ao resíduo 226.
[000560] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA de H5 tem um Ser em uma posição correspondendo ao resíduo 227. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem um Gly em uma posição correspondendo ao resíduo 227.
[000561] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA de H5 tem um Gly em uma posição correspondendo ao resíduo 228. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 tem um Ser em uma posição correspondendo ao resíduo 228.
[000562] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de HA de H5 inclui resíduos Gln, Ser e Gly nas posições 226, 227 e 228, respectivamente. Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 inclui a Leu, Gly e Ser nas posições 226, 227 e 228, respectivamente.
[000563] Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 de acordo com a invenção tem um ou mais dos aminoácidos que seguem nas posições indicadas:
[000564] Em algumas modalidades, uma variante de polipeptídeo de HA de H5 de acordo com a invenção tem um ou mais dos aminoácidos que seguem nas posições indicadas:
[000565] Glu190Asp, Lys193Ser, Gly225Asp, Gln226Leu
[000566] Glu190Asp, Lys193Ser, Gln226Leu, Gly228Ser
[000567] Ala189Gln, Lys193Ser, Thr160Ala
[000568] Ala189Gln, Lys193Ser, Gln226Leu, Gly228Ser
[000569] Asp187Ser/Thr, Ala189Gln, Lys193Ser, Gln226Leu, Gly228Ser
[000570] Ala189Lys, Lys193Asn, Gln226Leu, Gly228Ser
[000571] Asp187Ser/Thr, Ala189Lys, Lys193Asn, Gln226Leu, Gly228Ser
[000572] Lys156Glu, Ala189Lys, Lys193Asn, Gln226Leu, Gly228Ser
[000573] Lys193His, Gln226Leu/Ile/Val, Gly228Ser
[000574] Lys193Arg, Gln226Leu/Ile/Val, Gly228Ser
[000575] Ala189Lys, Lys193Asn, Gly225Asp
[000576] Lys156Glu, Ala189Lys, Lys193Asn, Gly225Asp
[000577] Ser137Ala, Lys156Glu, Ala189Lys, Lys193Asn, Gly225Asp
[000578] Glu190Thr, Lys193Ser, Gly225Asp
[000579] Asp187Thr, Ala189Thr, Glu190Asp, Lys193Ser, Gly225Asp
[000580] Asn186Pro, Asp187Thr, Ala189Thr, Glu190Asp, Lys193Ser, Gly225Asp
[000581] Asn186Pro, Asp187Thr, Ala189Thr, Glu190Asp, Lys193Ser, Gly225Asp, Ser227Ala
[000582] Gln226Leu, Gly228Ser, Thr160Ala
[000583] Gln226Leu, Gly228Ser, Thr160Ala
[000584] Gly228Ser, Thr160Ala
[000585] Gln226Leu, Thr160Ala
[000586] Gln226Leu, Gly228Ser
[000587] Thr160Ala
[000588] Gln226Leu, Gly228Ser, Asn158Xaa (em que Xaa =qualquer aminoácido além de Asn)
[000589] Gly228Ser, Asn158Xaa
[000590] Gln226Leu, Asn158Xaa
[000591] Gln226Leu, Gly228Ser
[000592] Asn158Xaa
[000593] 130 (em que "130" indica uma deleção em um aminoácido correspondendo à posição 130) mais qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo a 131, 132, 133, 135, 137, 155, 188, 192, 193, 221, 226, 227 e 228
[000594] 130 mais qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo a 131, 132, 135, 188, 192 e 221
[000595] 130 mais qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo a 133, 137, 155, 193, 226, 227 e 228
[000596] 130 mais qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo a 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221, 226, 227 e 228
[000597] 130 mais qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo a 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226, 227 e 228
[000598] 130 mais qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo a 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226 e 228
[000599] 130 mais qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo a 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226, 227 e 228
[000600] 130 mais qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo a 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192,193, 226 e 228
[000601] 130 mais qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo a 137, 188, 192, 193, 226, 228, 131, 132, 133, 221 e 227
[000602] 130 mais qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo a 131, 132, 133, 221 e 227
[000603] 130 mais qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo a 137, 188, 192, 193, 226 e 228
[000604] 130 mais qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo a 137, 188, 192, 193, 226, 227, 228, 131, 132 e 133
[000605] 130 mais qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo a 227, 131, 132 e 133
[000606] Gln226Leu, Gly228Ser, Thr160Ala, 130
[000607] Gln226Leu, Gly228Ser, 130
[000608] Gln226Leu, Thr160Ala, 130
[000609] Gly228Ser, Thr160Ala, 130
[000610] Gln226Leu, 130
[000611] Gly228Ser, 130
[000612] Thr160Ala, 130
[000613] 130
[000614] 130, Ala131Thr, Leu133Thr, Ser137Arg, Ile155Thr, Ala188Glu, Thr/Ile192Arg/Lys, Arg/Lys193Thr/Ala, Gln226Leu, Ser227Gly, Gly228Ser
[000615] 130, Ala131Thr, Leu133Thr, Ser137Arg, Ile155Thr,Ala188Glu, Thr/Ile192Arg/Lys, Arg/Lys193Thr/Ala, Gln226Leu, Gly228Ser
[000616] 130, Ala131Thr, Leu133Thr, Ser137Arg, Ile155Thr,Asn159Asp (ou Thr160Ala ou ambos), Ala188Glu, Thr/Ile192Arg/Lys, Arg/Lys193Thr/Ala, Gln226Leu, Ser227Gly, Gly228Ser
[000617] 130, Ala131Thr, Leu133Thr, Ser137Arg, Ile155Thr, Asn159Asp (ou Thr160Ala ou ambos), Ala188Glu, Thr/Ile192Arg/Lys, Arg/Lys193Thr/Ala, Gln226Leu, Gly228Ser
[000618] 130, Ser137Arg, Ala188Glu, Thr192Arg/Lys,Arg/Lys193Thr/Met/Ala/Val, Gln226Leu, Gly228Ser
[000619] 130, Ser137Arg, Ala188Glu, Thr192Arg/Lys,Arg/Lys193Thr/Met/Ala/Val, Gln226Leu, Gly228Ser, Xaa131Ser/Thr, Xaa132Ser/Thr, Xaa133Ser/Thr, Ser221Pro, Ser227Gly (em que Xaa = qualquer aminoácido)
[000620] 130, Xaa131Ser/Thr, Xaa132Ser/Thr, Xaa133Ser/Thr, Ser221Pro, Ser227Gly (em que Xaa = qualquer aminoácido)
[000621] 130, Xaa192Xaa’ (em que Xaa = qualquer aminoácido hidrofóbico e Xaa’ = qualquer aminoácido hidrofílico)
[000622] 130, Xaa192Lys/Arg (em que Xaa = qualquer resíduo hidrofóbico)
[000623] 130, Xaa193Xaa’ (em que Xaa = um resíduo básico, por exemplo, Lys ou Arg e Xaa’ = um resíduo neutro ou ácido)
[000624] 130, Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val
[000625] 130, Xaa192Xaa’ (em que Xaa = qualquer aminoácido hidrofóbico e Xaa’ = qualquer aminoácido hidrofílico), Xaa193Xaa’ (em que Xaa = um resíduo básico, por exemplo, Lys ou Arg e Xaa’ = um resíduo neutro ou ácido)
[000626] 130, Xaa192Lys/Arg (em que Xaa = qualquer resíduo hidrofóbico), Xaa193Xaa’ (em que Xaa = um resíduo básico, por exemplo, Lys ou Arg e Xaa’ = um resíduo neutro ou ácido)
[000627] 130, Xaa192Xaa’ (em que Xaa = qualquer aminoácido hidrofóbico e Xaa’ = qualquer aminoácido hidrofílico), Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val
[000628] 130, Xaa192Lys/Arg (em que Xaa = qualquer resíduo hidrofóbico), Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val
[000629] 130, Ala188Glu
[000630] 130, Ala188Asp
[000631] 130, Xaa192Xaa’ (em que Xaa = qualquer aminoácido hidrofóbico e Xaa’ = qualquer aminoácido hidrofílico), Ala188Glu
[000632] 130, Xaa192Lys/Arg (em que Xaa = qualquer resíduo hidrofóbico), Ala188Glu
[000633] 130, Xaa193Xaa’ (em que Xaa = um resíduo básico, por exemplo, Lys ou Arg e Xaa’ = um resíduo neutro ou ácido), Ala188Glu
[000634] 130, Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val, Ala188Glu
[000635] 130, Xaa192Xaa’ (em que Xaa = qualquer aminoácido hidrofóbico e Xaa’ = qualquer aminoácido hidrofílico), Ala188Asp
[000636] 130, Xaa192Lys/Arg (em que Xaa = qualquer resíduo hidrofóbico), Ala188Asp
[000637] 130, Xaa193Xaa’ (em que Xaa = um resíduo básico, por exemplo, Lys ou Arg e Xaa’ = um resíduo neutro ou ácido), Ala188Asp
[000638] 130, Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val, Ala188Asp
[000639] 130, Xaa192Xaa’ (em que Xaa = qualquer aminoácido hidrofóbico e Xaa’ = qualquer aminoácido hidrofílico), Xaa193Xaa’ (em que Xaa = um resíduo básico, por exemplo, Lys ou Arg e Xaa’ = um resíduo neutro ou ácido), Ala188Glu
[000640] 130, Xaa192Lys/Arg (em que Xaa = qualquer resíduo hidrofóbico), Xaa193Xaa’ (em que Xaa = um resíduo básico, por exemplo, Lys ou Arg e Xaa’ = um resíduo neutro ou ácido), Ala188Glu
[000641] 130, Xaa192Xaa’ (em que Xaa = qualquer aminoácido hidrofóbico e Xaa’ = qualquer aminoácido hidrofílico), Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val, Ala188Glu
[000642] 130, Xaa192Lys/Arg (em que Xaa = qualquer resíduo hidrofóbico), Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val, Ala188Glu
[000643] 130, Xaa192Xaa’ (em que Xaa = qualquer aminoácido hidrofóbico e Xaa’ = qualquer aminoácido hidrofílico), Xaa193Xaa’ (em que Xaa = um resíduo básico, por exemplo, Lys ou Arg e Xaa’ = um resíduo neutro ou ácido), Ala188Asp
[000644] 130, Xaa192Lys/Arg (em que Xaa = qualquer resíduo hidrofóbico), Xaa193Xaa’ (em que Xaa = um resíduo básico, por exemplo, Lys ou Arg e Xaa’ = um resíduo neutro ou ácido), Ala188Asp
[000645] 130, Xaa192Xaa’ (em que Xaa = qualquer aminoácido hidrofóbico e Xaa’ = qualquer aminoácido hidrofílico), Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val, Ala188Asp
[000646] 130, Xaa192Lys/Arg (em que Xaa = qualquer resíduo hidrofóbico), Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val, Ala188Asp
[000647] Em algumas modalidades, a presente invenção provê polipeptídeos de HA de H5 (por exemplo, variantes de polipeptídeo de HA de H5, polipeptídeos de HA de H5 engenheirados e/ou variantes de polipeptídeo de HA de H5 engenheirados) cuja sequência de aminoácido inclui um elemento conforme mostrado abaixo (a numeração dessas posições corresponde à numeração de HA de H3):
[000648] X190, X193, X225 e X226
[000649] X190, X193, X226 e X228
[000650] X189, X193, X160
[000651] X189, X193, X226, X228
[000652] X187, X189, X193, X226, X228
[000653] X189, X193, X226, X228
[000654] X187, X189, X193, X226, X228
[000655] X156, X189, X193, X226, X228
[000656] X193, X226, X228
[000657] X193, X226, X228
[000658] X189, X193, X225
[000659] X156, X189, X193, X225
[000660] X137, X156, X189, X193, X225
[000661] X190, X193, X225
[000662] X187, X189, X190, X193, X225
[000663] X186, X187, X189, X190, X193, X225
[000664] X186, X187, X189, X190, X193, X225, X227
[000665] X226, X228, X160
[000666] X226, X228, X160
[000667] X228, X160
[000668] X226, X160
[000669] X226, X228
[000670] X160
[000671] X226, X228, Xaa158 (em que Xaa = qualquer aminoácido além de Asn)
[000672] X228, Xaa158 (em que Xaa = qualquer aminoácido além de Asn)
[000673] X226, Xaa158 (em que Xaa = qualquer aminoácido além de Asn)
[000674] X226, X228
[000675] X158 (em que Xaa = qualquer aminoácido além de Asn)
[000676] X130 mais qualquer combinação possível de X131, X132, X133, X135, X137, X155, X188, X192, X193, X221, X226, X227 e X228
[000677] X130 mais qualquer combinação possível de X131, X132, X135, X188, X192 e X221
[000678] X130 mais qualquer combinação possível de X133, X137, X155, X193, X226, X227 e X228
[000679] X130 mais qualquer combinação possível de X131, X132, X133, X135, X137, X155, Xaa158 (em que Xaa = qualquer aminoácido além de Asn), X160, X188, X192, X193, X221, X226, X227 e X228
[000680] X130 mais qualquer combinação possível de X131, X133, X137, X155, X188, X192, X193, X226, X227 e X228
[000681] X130 mais qualquer combinação possível de X131, X133, X137, X155, X188, X192, X193, X226 e X228
[000682] X130 mais qualquer combinação possível de X131, X133, X137, X155, X159, X160, X188, X192, X193, X226, X227 e X228
[000683] X130 mais qualquer combinação possível de X131, X133, X137, X155, X159, X160, X188, X192, X193, X226 e X228
[000684] X130 mais qualquer combinação possível de X137, X188, X192, X193, X226, X228, X131, X132, X133, X221 e X227
[000685] X130 mais qualquer combinação possível de X131, X132, X133, X221 e X227
[000686] X130 mais qualquer combinação possível de X137, X188,X192, X193, X226 e X228
[000687] X130 mais qualquer combinação possível de X137, X188, X192, X193, X226, X227, X228, X131, X132 e X133
[000688] X130 mais qualquer combinação possível de X227, X131, X132 e X133
[000689] X226, X228, X160, X130
[000690] X226, X228, X130
[000691] X226, X160, X130
[000692] X228, X160, X130
[000693] X226, X130
[000694] X228, X130
[000695] X160, X130
[000696] X130
[000697] X130, X131, X133, X137, X155, X188, X192, X193, X226, X227, X228
[000698] X130, X131, X133, X137, X155, X188, X192, X193, X226, X228
[000699] X130, X131, X133, X137, X155, X159, X160, X188, X192, X193, X226, X227, X228
[000700] X130, X131, X133, X137, X155, X159, X160, X188, X192, X193, X226, X228
[000701] X130, X137, X188, X192, X193, X226, X228
[000702] X130, X137, X188, X192, X193, X226, X228, X131, X132, X133, X221, X227
[000703] X130, X131, X132, X133, X221, X227
[000704] X130, X192
[000705] X130, X193
[000706] X130, X192, X193
[000707] X130, X188
[000708] X130, X192, X188
[000709] X130, X193, X188
[000710] X130, X192, X193, X188
[000711] em que X = qualquer aminoácido (a menos que de outro modo especificado) e/ou X = um aminoácido faltante. A numeração dessas posições corresponde à numeração de HA de H3.
[000712] Em algumas modalidades, X130 é uma deleção em um sítio correspondendo à posição 130. Em algumas modalidades, X160 é um Ala. Em algumas modalidades, X158 é qualquer aminoácido que não Asn.
[000713] Em algumas tais modalidades, a variante do polipeptídeo de HA de H5 tem pelo menos uma substituição adicional comparado com uma HA de H5 do tipo selvagem, de maneira que a afinidade e/ou especificidade da variante para glicanos de guarda-chuva é aumentada.
[000714] Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA de H5 de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem L226, S228 e A160. Em algumas modalidades, as variantes do polipeptídeo de HA de H5 de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem L226 e A160. Em algumas modalidades, as variantes do polipeptídeo de HA de H5 de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem S228 e A160. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA de H5 de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem A160.
[000715] Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA de H5 de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem L226, S228 e X158 (em que X = qualquer aminoácido além de Asn). Em algumas modalidades, as variantes de polipeptídeo de HA de H5 de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem L226 e X158. Em algumas modalidades, as variantes do polipeptídeo de HA de H5 de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem S228 e X158. Em algumas modalidades, as variantes do polipeptídeo de HA de H5 de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem X158.
[000716] Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA de H5 de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem 130 e qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo a 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221, 226, 227 e 228.
[000717] Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA de H5 de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem 130, L226, S228, A160 e qualquer combinação possível de mutações em posições correspondendo a 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 188, 192, 193, 221 e 227. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA de H5 de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem 130, L226, S228, A160 e qualquer combinação possível de mutações em posições correspondendo a 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 188, 192, 193, 221, 227 e 228. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA de H5 de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem 130, L226, S228, A160 e qualquer combinação possível de mutações em posições correspondendo a 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 188, 192, 193, 221 e 227. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA de H5 de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem 130, L226, S228 e qualquer combinação possível de mutações em posições correspondendo a 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221 e 227.
[000718] Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA de H5 de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem 130, A160 e qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo a 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 188, 192, 193, 221, 226, 227 e 228. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA de H5 de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem 130, L226 e qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo a 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221 e 227 e 228. Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA de H5 de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem 130, S228 e qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo a 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221, 226 e 227.
[000719] Em algumas modalidades, polipeptídeos de HA de H5 de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem 130, L226, S228, X158 (em que X = qualquer aminoácido além de Asn) e qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo a 131, 132, 133, 135, 137, 155, 160, 188, 192, 193, 221 e 227. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de H5 de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem 130, L226, X158 e qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo a 131, 132, 133, 135, 137, 155, 160, 188, 192, 193, 221, 227 e 228. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de H5 de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem 130, S228, X158 e qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo a 131, 132, 133, 135, 137, 155, 160, 188, 192, 193, 221 e 227. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de H5 de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem 130, L226, S228 e qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo a 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221 e 227.
[000720] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de H5 de acordo com a invenção (incluindo variantes de polipeptídeo de HA de H5) têm sequências que incluem 130, X158 (em que X = qualquer aminoácido além de Asn) e qualquer combinação possível de mutações nas posições correspondendo a 131, 132, 133, 135, 137, 155, 160, 188, 192, 193, 221, 226, 227 e 228.
[000721] Em algumas modalidades, variantes de polipeptídeo de HA de H5 de acordo com a invenção têm um sítio de ligação aberto comparado com uma HA de H5, e particularmente com uma HAs de H5 tipo selvagem parental.
[000722] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de H5 de acordo com a invenção se ligam aos glicanos sialilados por α2-6 que seguem:
e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, polipeptídeos de HA de H5 de acordo com a invenção se ligam a glicanos da estrutura:
e combinações dos mesmos; e/ou
e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de H5 de acordo com a invenção se ligam a
em algumas modalidades a
em algumas modalidades a
e em algumas modalidades
[000723] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de H5 de acordo com a invenção se ligam a glicanos de topologia de guarda- chuva. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de H5 de acordo com a invenção se ligam a pelo menos um dos glicanos (por exemplo, glicanos sialilados por α2-6) mostrados na Figura 9. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de H5 de acordo com a invenção se ligam a pelo menos cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou mais dos glicanos encontrados nos receptores de HA em tecidos do trato respiratório superior humano (por exemplo, células epiteliais).
[000724] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de HA de H5 (incluindo as variantes de polipeptídeo de HA de H5) são qualquer um daqueles mostrados nas SEQ ID NOs: 50, 51, 53-55 e 60-75.
[000725] Em um aspecto, a presente invenção provê o reconhecimento particular que ligação com alta afinidade a glicanos de topologia de guarda-chuva sozinha pode não ser suficiente para conferir transmissão para/infectividade de humanos eficaz. A presente invenção provê a compreensão que ligação reduzida a glicanos de topologia de cone pode ser também importante. Em algumas modalidades, ligação com alta afinidade a glicanos de topologia de guarda-chuva e ligação de afinidade reduzida a glicanos de topologia de cone podem estar envolvidas na conferência de transmissão para/infectividade de humanos eficaz. Em algumas modalidades, ligação com alta afinidade a glicanos de topologia de guarda-chuva é suficiente para conferir transmissão para/infectividade de humanos eficaz. Em algumas modalidades, ligação com alta afinidade de glicanos de topologia de guarda-chuva é suficiente para conferir transmissão para/infectividade eficaz de humanos, mesmo se a afinidade de ligação a glicanos de topologia de cone não for reduzida (por exemplo, não mudada, aumentada, etc).
[000726] Em algumas modalidades, afinidade e/ou especificidade alta de ligação de uma variante de polipeptídeo de HA de H5 a glicanos de topologia de guarda-chuva e afinidade e/ou especificidade reduzida de ligação a glicanos de topologia de cone pode estar envolvida em aumentou da transmissão e/ou infectividade de humanos com relação a um polipeptídeo de referência (por exemplo, o polipeptídeo de HA parental cognato da variante do polipeptídeo de HA de H5). Em algumas modalidades, afinidade e/ou especificidade alta de ligação de uma variante de polipeptídeo de HA de H5 para glicanos de topologia de guarda-chuva é suficiente para aumentar a transmissão para/infectividade de humanos com relação a um polipeptídeo de referência (por exemplo, o polipeptídeo de HA parental cognato da variante do polipeptídeo de HA de H5). Em algumas modalidades, afinidade e/ou especificidade de ligação alta de uma variante de polipeptídeo de HA de H5 a glicanos de topologia de guarda-chuva é suficiente para aumentar a transmissão para/infectividade de humanos com relação a um polipeptídeo de referência (por exemplo, o polipeptídeo de HA parental cognato da variante do polipeptídeo de HA de H5), mesmo se a afinidade para/ou especificidade de ligação a glicanos de topologia de cone não for reduzida (por exemplo, não modificada, aumentada, etc). Em algumas modalidades, afinidade e/ou especificidade alta de ligação de uma variante de polipeptídeo de HA de H5 com glicanos de topologia de guarda-chuva é suficiente para aumentar transmissão para/infectividade de humanos com relação a um polipeptídeo de referência (por exemplo, o polipeptídeo de HA parental cognato da variante do polipeptídeo de HA de H5), mesmo se a afinidade e/ou especificidade de ligação com glicanos de topologia de cone for igual a e/ou maior do que aquela afinidade e/ou especificidade de ligação com glicanos de topologia de guarda-chuva.
[000727] Estudos de ligação de lectina mostraram diversidade na distribuição de α2-3 e α2-6 nos tecidos respiratórios superiores. Estudos de tingimento indicam distribuição predominante de glicanos sialilados por α2-6 como parte de ambos os glicanos N-ligados (células ciliadas) e O-ligados (nas células calciformes) no lado apical do epitélio traqueal (Figura 12). Por outro lado, as regiões internas do tecido traqueal compreendem predominantemente α2-3 distribuídos em glicanos N-ligados.
[000728] Análises de perfil de glicano MALDI-MS mostraram uma diversidade substancial (Figura 10) bem como expressão predominante de glicanos sialilados por α2-6 nas vias aéreas superiores humanas. Fragmentação de picos de massa representativos usando MALDI TOF-TOF apoia topologias de glicano de em que ramificações de oligossacarídeos mais longas com repetições lactosamina múltiplas são extensivamente distribuídas comparado com ramificações de oligossacarídeo curtas (Figura 10). Para prover uma referência para uma diversidade na distribuição e na topologia de glicanos na via aérea superior, análise MALDI-TOF foi realizada em glicanos N- ligados de células epiteliais colônicas humanas (HT29). Vírus H5N1 recentes têm infectado principalmente o intestino, e, então, essas células são escolhidas como células intestinais representativas. O perfil de glicano de células HT29 é significantemente diferente daquele de HBEs em que há uma distribuição predominante de α2-3 e a topologia de glicano de ramificação de oligossacarídeo longa não é observada (Figura 10).
[000729] Os dados na Figura 12 foram gerados através do método que segue. Seções de tecido traqueal humano fixadas com formalina e incrustradas em parafina foram compradas da US Biological. Após as seções de tecido terem sido desparafinizadas e reidratadas, biotina endógena foi bloqueada usando o estojo de bloqueio de estreptavidina/biotina (Vector Labs). As seções foram então incubadas com Jacalina marcada com FITC (específica para glicanos O-ligados), Concanavalina A biotinilada (Con A, específica para resíduos de manose α-ligados, que são parte da estrutura de oligossacarídeo de núcleo que constituem glicanos N-ligados), lectina de Maackia amurensis biotinilada (MAL, específica para SAα2,3-gal) e aglutinina de Sambuca nigra biotinilada (SNA, específica para SAα2,6-gal) (Vector labs; 10 μg/ml em PBS com Tween- 20 0,5%) por 3 horas. Após lavagem com TBST (solução salina tamponada Tris com Tween- 20 1%), as seções foram incubadas com estreptavidina Alexa fluor 546 (2 μg/ml em PBS com Tween-20 0,5%) por 1 hora. As lâminas foram lavadas com TBST e vistas sob um microscópio confocal (microscopia confocal de varredura a laser Zeiss LSM510). Todas as incubações foram realizadas em temperatura ambiente (RT).
[000730] Os dados na Figura 10 foram gerados usando o método que segue. As células (~70 x 106) foram coletadas quando elas eram >90% confluentes com tampão de solução salina de citrato 100 mM e a membrana celular foi isolada após tratamento com inibidor de protease (Calbiochem) e homogeneização. A fração de membrana celular foi tratada com PNGaseF (New England Biolabs) e a mistura de reação foi incubada da noite para o dia a 37° C. A mistura de reação foi fervida por 10 minutos para desativar a enzima e os peptídeos e as proteínas desglicosilados foram removidos usando um cartucho Sep- Pak C18 SPE (Waters). Os glicanos foram dessalinizados adicionalmente e purificados em frações neutras (fração de acetonitrila 25%) e ácidas (acetonitrila 50% contendo ácido trifluoracético 0,05%) usando colunas de extração de fase sólida de carbono grafitizado (Supelco). As frações ácidas foram analisadas através de MALDI-TOF MS em modos positivo e negativo, respectivamente, com condições de ionização suave (tensão de aceleração 22 kV, tensão de rede 93%, fio-guia 0,3% e tempo de retardo de extração de 150 ns). A expressão predominante de glicanos sialilados por α2-6 foi confirmada através de pré-tratamento de amostras usando Sialidas A e S. Glicanos isolados foram subsequentemente incubados com 0,1 U de sialidase de Arthrobacter ureafaciens (Sialidase A, não específica) ou sialidase de Streptococcus pneumoniae (Sialidase S, específica para glicanos sialilados por α2-3) em um volume final de 100 mL de fosfato de sódio 50 mM, pH 6,0 a 37° C por 24 horas. As frações neutras e as ácidas foram analisadas através de MALDI-TOF MS em modos positivo e negativo, respectivamente.
[000731] Ligação de seções de pulmão e traqueais de tecido humano fixadas com formalina e encrustadas em formalina é provida (por exemplo, compradas da US Biomax, Inc. e da US Biological, respectivamente). As seções de tecido são desparafinizadas, reidratadas e incubadas com BSA 1% em PBS por 30 minutos para prevenir ligação não específica. HAs de H5 são pré-complexadas com anticorpo primário (marcador His 6x anticamundongo) e anticorpo secundário (anticamundongo de cabra 488 Alexa-fluor) em uma razão de 4:2:1, respectivamente, por 20 minutos em gelo. Os complexos formados são diluídos em BSA-PBS 1% para uma concentração final de HA de 40, 20 ou 10 μg/ml. As seções de tecido foram então incubadas com os complexos de HA-anticorpo por 3 horas em RT. As seções são contratingidas com iodeto de propídio (Invitrogen; 1:100 em TBST), lavadas extensivamente e então vistas sob um microscópio confocal (microscopia confocal de varredura a laser Zeiss LSM510).
[000732] HAs de H5 pré-complexadas são também usadas junto com outras lectinas tal como Jacalina (marcador para células mucinosas não ciliadas tais como células calciformes) para co-tingir seções de tecido para obter informação adicional de se HA tinge células ciliadas e/ou não ciliadas no epitélio de tecido.
[000733] Conforme aqui descrito, a presente invenção compreende o reconhecimento que o uso de hospedeiros animais (por exemplo, furões) para o estudo de transmissão de vírus pode prover um indicador confiável de transmissão de vírus humano. Similarmente, a presente invenção compreende o reconhecimento que o uso de hospedeiros animais (por exemplo, furões) tratados com agente de ligação de acordo com a invenção (por exemplo, polipeptídeos de HA) para o estudo de transmissão de vírus pode prover um indicador confiável da eficácia de tais agentes de ligação de acordo com a invenção para prevenção ou tratamento de vírus em um hospedeiro humano.
[000734] Um ensaio de transmissão de vírus é usado na presença ou ausência de agentes de ligação de acordo com a invenção para determinar transmissão viral em um modelo de animal adequado. Por exemplo, hospedeiros animais, por exemplo, furões, são alojados em gaiolas adjacentes que previnem contatos direto e indireto entre animais. No entanto, essas condições de alojamento permitem o espalhamento de vírus da gripe através do ar. Uma primeira porção dos animais é inoculada através de métodos conhecidos na técnica (por exemplo, intranasalmente, intramuscularmente ou qualquer um dos modos de administração descritos aqui) com uma quantidade eficaz de vírus ("animais inoculados"). Animais nunca infectados podem então ser introduzidos em gaiolas adjacentes aos animais inoculados um, dois, três ou mais dias depois.
[000735] Os animais usados no estudo podem ser mortos em qualquer momento um, dois, três ou mais dias pós-inoculação ou transmissão para análise. Análise adequada para estudos de transmissão de vírus pode incluir, mas não está limitada a, determinação de títulos de vírus infeccioso (por exemplo, através de lavagens nasais), observação de sintomas físicos nos animais (por exemplo, letargia, anorexia, rinorreia, espirro, febre alta e/ou morte), análise imunoistoquímica de tecidos respiratórios, dentre outros.
[000736] O ensaio de transmissão de vírus descrito acima pode também incorporar o tratamento do animal hospedeiro com um agente de ligação de acordo com a invenção descrita anteriormente, durante ou após inoculação ou transmissão de vírus. Métodos analíticos descritos aqui são então usados para determinar a eficácia do(s) agente(s) de ligação em bloqueio de transmissão e/ou infecção do hospedeiro animal com o vírus.
[000737] Os agentes de ligação e/ou as composições de vacina compreendendo agentes de ligação são administrados intramuscularmente em furões no dia 0, seguido por uma dose de reforço no dia 21. Sangue de cada animal é recuperado nos dias 0, 14, 21 e 35. O soro coletado é examinado in vitro quanto à sua habilidade em inibir aglutinação de vírus e neutralizar infecção por vírus.
[000738] Titulações de HAI são realizadas em placas de fundo em V de 96 cavidades (Corning). Os soros são serialmente diluídos 2 vezes e adicionados a 4 doses de aglutinação de vírus da gripe em um volume total de 200 μl. Em seguida, 25 μl de uma solução de eritrócito 2% (vol/vol) são adicionados. Soros, vírus e eritrócitos são misturados suavemente e o ensaio é lido após incubação por 30 minutos. Os títulos são registrados como o inverso da diluição de anticorpo mais alta que inibiu 4 doses de aglutinação de vírus.
[000739] Diluições seriais de soros são misturadas com vírus e incubadas em temperatura ambiente por 30 minutos e então incubadas com células MDCK por 1 hora a 37° C. As células são então lavadas duas vezes com meios livres de soro, e então meios frescos com ou sem tripsina são adicionados. Crescimento de vírus é classificado através de efeito citopático. Os dados são expressos como a diluição inversa de diluição mais alta de soros que causa neutralização.
[000740] Furões vacinados são provocados intranasalmente com linhagens de H5N1 do tipo selvagem e mutantes homólogas e heterólogas. Lavagens nasais são obtidas de furões nos dias 1, 3 e 5 pós-provocação. O vírus é titulado em células MDCK para determinar derramamento de vírus no trato respiratório.
[000741] H5N1 altamente patogênico é uma preocupação global que iniciou vários surtos localizados em humanos desde 2003 (Heumann e outros, 2010, Cell Res, 20:51; Guan e outros, 2009, Rev Sci Tech, 28:39; ambos aqui incorporados a título de referência). Linhagens de H5N1 existentes são incapazes de transmissão aerossol, mas são principalmente transmitidas através de contato direto com animais infectados. No entanto, a alta taxa de morbidez e mortalidade associada com infecção (~60%) bem como a habilidade conhecida de subtipos de gripe (incluindo H5N1) em adquirir características fenotípicas através ou de mutação ou rearranjo de gene sugerem que uma linhagem de H5N1 poderia adquirir capacidade de transmissão aerossol (Yen e outros, 2009, Curr Top Microbiol Immunol, 333:3; incorporado aqui a título de referência). Acoplado com o potencial para tal vírus causar infecção severa, o fato que a população humana não tem nenhuma imunidade para H5N1 preexistente sugere que uma futura epidemia ou pandemia pode ocorrer se tal linhagem surgisse (Subbarao e outros, 2007, PLoS pathogens, 3:e40; incorporado aqui a título de referência).
[000742] O uso de sistemas genéticos reversos indicou que dos 11 produtos de gene, aquisição de certas mudanças de aminoácido em hemaglutinina (HA) e na polimerase (PB2) são vitais para transmissão aerossol humana (Hoeven e outros, 2009, Pro Natl Acad Sci USA, 106:3366; incorporado aqui a título de referência). Se endereçar ao efeito funcional de alterações genéticas nessas proteínas é então especialmente importante para identificar o potencial para alterações fenotípicas. No caso de PB2, uma alteração crítica de lisina para glutamato na posição 627 é chave para aquisição de capacidade de transmissão aerossol (Hoeven et. al., 2009, Pro Natl Acad Sci USA, 106:3366; incorporado aqui a título de referência). No entanto, dado o papel biológico de HA, viz., ligação a receptores glicano levando à fusão do virion e infecção, mutações específicas que levam à adaptação humana são pensadas ser específicas de subtipo e linhagem (Stevens e outros, 2006, Nat Rev Microbiol, 4:857; Russell e outros, 2006, Glycoconj J, 23:85; ambos aqui incorporados a título de referência).
[000743] Estudos anteriores identificaram que o receptor para HA são glicanos terminados pelas estruturas de glicano particulares (por exemplo, ácido siálico ligado por α2^3 ou α2^6 de "topologia de guarda-chuva" ou "topologia de cone"). HAs deH5N1 adaptadas para ave se ligam preferivelmente a receptores glicano terminados por glicanos de topologia de cone, muitos dos quais têm ácido siálico ligado por α2^3 (receptores de ave) (Stevens e outros, 2006, J Mol Biol, 355:1143; Gambaryan e outros, 2006, Virology, 344:432; ambos aqui incorporados a título de referência). HAs de linhagens de H1N1, H2N2 e H3N2 adaptadas para humanos demonstraram mudança em preferência de ligação de topologia de cone (por exemplo, muitos α2^3) para topologia de guarda-chuva (por exemplo, muitos glicanos sialilados por α2^6) (receptores humanos) e uma ligação de alta afinidade a receptores humanos característica, que foi mostrada se relacionar com a capacidade de transmissão aérea desses vírus adaptados para humano (Pappas e outros, 2010, PLoS One, 5:e11158; Tumpey e outros, 2007, Science, 315:655; ambos aqui incorporados a título de referência). Utilizando esta estrutura, estudos recentes identificaram conjuntos de mutações que levariam à adaptação humana das linhagens atualmente em circulação de H2N2, H7N7 e H9N2 (Viswanathan e outros, 2010, PLoS One, 5:e13768; Belser e outros, 2008, Proc Natl Acad Sci USA, 105:7558; Sorrell e outros, 2009, Proc Natl Acad Sci USA, 106:7565; todos aqui incorporados a título de referência). Esses estudos demonstraram que mutações requeridas para conversão podem diferir com base no subtipo, e mesmo a linhagem particular, estudado. Estudos anteriores (Maines e outros, 2011, Virology, 413:139; Stevens e outros, 2008, J Mol Biol, 381:1382; Stevens e outros, 2006, Science, 312:404; todos aqui incorporados a título de referência) que mutaram linhagens H5N1 para incluir quaisquer mudanças de distinção para mutações de H2/H3 (Q226L e G228S ou LS) e/ou H1 (E190D, G225D ou DD) mostraram que nenhum desses mutantes ‘muda’ quantitativamente para especificidade e afinidade de receptor humano que são características de HAs de linhagem ‘pandêmica’ adaptadas para humano (Figura 20). Tentativas em introduzir os resíduos LS de distinção na sequência A/Vietnam/1203/04 (Viet03_04) não forneceram a mudança. Os presentes inventores estabeleceram características estruturais chave que são necessárias para acomodar adequadamente os resíduos de LS de distinção. Os presente inventores também determinaram quais características estruturais são requeridas para facilitar uma mudança em especificidade de receptor que permite ligação com alta afinidade a receptores humanos.
[000744] HA da gripe é uma proteína homotrimérica, em que um monômero contém 552 aminoácidos. Cada monômero é composto de duas porções ligadas dissulfeto, HA1 e HA2. HA1 compreende o sítio de ligação a receptor glicano (RBS), enquanto HA2 está envolvida na fusão das membranas viral e celular. A bolsa de RBS envolve as posições de HA 95, 131, 133, 136, 137, 138, 145, 153, 155, 156, 158, 159, 183, 186, 187, 189, 190, 192, 193, 194, 195, 196, 219, 222, 224, 225, 226, 227, 228 (numeração de H3 usada).
[000745] A fim de determinar as características estruturais e corrigir as sequências de HA de H5 que vão acomodar os resíduos de LS, os presente inventores realizaram uma comparação estrutural detalhada de H2 de RBS e HA de H5, uma vez que HA de H5 é próxima a HA de H3 filogeneticamente (Figura 21). Para este estudo, HA de H2 pandêmica prototípica (A/Albany/6/58 ou Alb6_58) com a HA de H5N1 representativa de um isolato humano anterior (A/Vietnam/1203/04 ou Viet03_04) foi escolhida. Tendo feito uma análise comparativa, o presente estudo identificou quatro características distintas que distinguem o RBS de HA de H5 daquele de HA de H2 (Figura 22). Primeiro, a composição da alça de HA de H2 é diferente da HA de H5, que inclui uma deleção na posição 130 (numeração de H3) em HA de H5. Segundo, há diferenças em composição de aminoácido "na parte superior" do RBS ou na ‘hélice 190’ (tal como nas posições 188, 192 e 193) que interage com resíduos de açúcar além do motivo Neu5Acα2-6Gal terminal do receptor humano. Terceiro, há diferenças em composições de aminoácido na ‘base’ do RBS (tal como nas posições 137, 221, 226 e 228 que incluem mudanças de LS) que interage com o motivo Neu5Acα2-6Gal do receptor humano. Quarto, o sítio de glicosilação na posição 158 em HA de H5 está ausente em HA de H2. Glicosilação neste sítio poderia interferir potencialmente com resíduos de açúcar além do motivo Neu5Acα2- 6Gal terminal do receptor humano ligado ao RBS (Stevens e outros, 2008, J Mol Biol, 381:1382; Wang e outros, 2010, Journal of Virology, 84:6570; ambos aqui incorporados a título de referência). As constatações da invenção compreendem a comparação detalhada de RBS de H2 e HA de H5, que sugere diferenças de aminoácido particulares que vão além das mudanças de LS mais características anteriormente observadas. Os presentes inventores procuraram identificar sequências de HA de H5 apropriadas que facilitassem correspondência das características estruturais de RBS de HA de H2 no contexto das mutações LS.
[000746] Análise de todas as sequências de H5N1 até a data (ambos isolatos de ave e de humano) permitiu que os inventores fizessem mais três observações: 1) HAs de H5 de muitos dos isolatos de ave e de humano recentes (após 2007) já adquiriram a deleção na alça 130 correspondendo à primeira característica, 2) mudanças de aminoácido chaves já foram observadas na característica 2 correspondendo à ‘hélice 190’ e 3) perda de glicosilação na posição 158 (característica 4) é também observada em muitas sequências de HA de H5. No contexto de características estruturais chaves de RBS de HA, os inventores determinaram que a deleção na alça 130 junto com uma perda de glicosilação (características 1 e 4) concomitantemente na mesma HA foi crítica na evolução de HA de H5. A presente invenção, no entanto, compreende o reconhecimento que a perda de glicosilação é concomitante com a deleção do resíduo da alça 130 e não vice versa. A presente invenção compreende a observação que linhagens de HA de H5 atuais específicas divergiram consideravelmente de isolatos humanos mais velhos (tal como Viet03_04), mas também adquiriram características estruturais chaves necessárias para corresponder ao RBS de HA de H2 pandêmica.
[000747] Desta maneira, os presente inventores avaliaram se as linhagens que têm as características 1 e 4 seriam a sequência de HA de H5 correta para acomodar adequadamente os resíduos de LS de distinção. Para o experimento, a linhagem A/chicken/Egypt/R2/2007 (ou ckEgy_07) foi escolhida como uma HA de H5 representativa que naturalmente adquiriu as características 1 e 4 (Figura 23). Introdução apenas da mutação LS (ckEgy_07_LS) nesta sequência de HA de H5 mostrou uma mudança e ligação de alta afinidade a receptores humanos (e afinidade relativamente pobre a receptores de ave), desta maneira lembrando as características de ligação a glicano de HAs ‘pandêmicas’ adaptadas para humano (Figuras 24A, B e Figura 25). Constatações adicionais demonstram ligação desta HA de H5 mutante a receptores humanos na superfície apical do epitélio traqueal humano (Figura 24C) que lembra o tingimento deste tecido por HAs pandêmicas (Viswanathan e outros, 2010, PLoS One, 5:e13768; Maines e outros, 2009, Science, 325:484; ambos aqui incorporados a título de referência).
[000748] Esforços anteriores por outros em introduzir as mudanças de LS sozinhas em isolatos humanos mais velhos tal como Viet03_04 não levaram a uma mudança e enfatizaram a necessidade de compreensão das características estruturais de RBS de HA de H5 que podem acomodar as mutações de LS. Dado que (ckEgy_07_LS) também adquiriu naturalmente a característica 4, os inventores avaliaram se esta característica sozinha, isto é, perda de glicosilação (obtida através de mutação de T160A) junto com LS muda a preferência de ligação a receptor glicano de Viet03_04 (Figura 25). Comparado com HA do tipo selvagem Viet03_04, a ligação a glicano direta dependente da dose desta linhagem mutante mostrou ligação a receptor humano, mas também reteve sua afinidade alta de ligação a receptor de ave que não é característica de HAs adaptadas para humanos pandêmicas (Figura 25). Introdução da mudança de LS sozinha em outra linhagem (A/Egypt/2786-NAMRU3/06 ou Egy_06), que adquiriu naturalmente a característica 4, corrobora esta observação. Finalmente, de acordo com esta estrutura principal estrutural, mutações em uma HA de H5 (A/chicken/Vietnam/NCVD-093/08 ou ckViet_08), que naturalmente adquiriu a característica 2 (Figura 22C), conferiram afinidade de ligação a receptor humano, mas também retiveram ligação a receptor de ave de alta afinidade (Figura 26).
[000749] Os presente inventores, pela primeira vez, definiram certas características estruturais que são necessárias para acomodar adequadamente os resíduos de LS de distinção. Ainda, os resultados dos inventores proveram a compreensão que certas HAs de H5 em circulação atuais apenas requerem duas mudanças de aminoácido, LS de distinção, para mudar a preferência de HA de H5 para receptores humanos desta maneira levando à sua adaptação para humano. Usando a informação da invenção, os inventores selecionaram racionalmente sequências de HA de H5 apropriadas (embora de um pequeno grupo representativo de HAs de HN1 totais) que eram condescendentes à mudança de especificidade de receptor através da incorporação apenas das mudanças de LS. Uma propriedade característica dessas HAs de H5 atuais é que elas evoluíram naturalmente para aquisição de características 1, 2 e 4 (Figura 27). Embora apenas 6% das 2277 sequências de HA de H5N1 não redundantes no banco de dados NCBI tenham adquirido as características 1 e 4, no entanto, ela representa cerca de 45% de linhagens de H5N1 isoladas em 2009 e 2010. Análises filogenéticas adicionais de HAs de H5N1 revelaram que as características naturalmente adquiridas 1 e 4 pertencem à clade 2.2.1. Até agora, ocorrência da característica 1 parece ser exclusiva da clade 2.2.1, no entanto a existência da característica 4 não é restrita a 2.2.1. Criticamente, as linhagens da clade 2.2.1 já divergiram consideravelmente de isolatos humanos mais velhos (tal como Viet03_04) e estão mais próximas de adaptações para humano do que essas linhagens anteriores. Todos os isolatos de H5N1 humanos relatados pertencentes à clade 2.2.1 são do Egito e Israel. Desta maneira, é importante monitorar a evolução das linhagens da clade 2.2.1.
[000750] Linhagens de H5N1 exemplares com um resíduo positivamente carregado na posição 129 (característica 2)
[000751] ABJ96761/204-204 Avian China 2005 da clade 2.3.4; ABJ96763/204-204 Avian China 2005 da clade 2.3.4; ABJ96764/204- 204 Avian China 2006 da clade 2.3.4; ACN39415/204-204 Avian China 2007 da clade 2.3.4; ACO07037/204-204 Avian Viet Nam 2008 da clade 7; ADG28677/204-204 Avian Egypt 2009 da clade 2.2.1;ADI58758/204-204 Avian Israel 2010 da clade 2.2.1; ADM85869/204-204 Avian Egypt 2010 da clade 2.2.1; e ADG28684/204-204 Avian Egypt 2010 da clade 2.2.1.
[000752] Linhagens de H5N1 Exemplares com uma deleção em 130 (e perda de glicosilação em 158) na mesma HA pertencente à clade 2.2.1 (característica 1) incluem, mas não estão limitadas a:
[000753] Sequências de HA de H5 do tipo selvagem e mutantes foram otimizadas no códon para expressão em célula de inseto e sintetizadas em DNA2.0 (Menlo Park, CA). Os genes sintetizados foram então subclonados em plasmídeo pAcGP67A e baculovírus foram criados usando Baculogold system (BD Biosciences, San Jose, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Os baculovírus recombinantes foram então usados para infectar culturas de suspensão de células Sf9 em BD Baculogold Max-XP SFM (BD Biosciences, San Jose, CA). A infecção foi monitorada e o meio condicionado foi coletado 3-4 dias pós-infecção. A HA solúvel do meio condicionado coletado foi purificada usando cromatografia de afinidade de Níquel (colunas HisTrap, GE Healthcare, Piscataway, NJ). Frações de eluição contendo HA foram agrupadas, concentradas e tampão mudado para PBS 1X pH 8,0 (Gibco) usando colunas giratórias MWCO 100K (Millipore, Billerica, MA). A proteína purificada foi quantificada usando método BCA (Pierce).
[000754] Seções de tecido traqueal humano (US Biological) parafinizadas foram desparafinizadas, reidratadas e incubadas com BSA 1% em PBS por 30 minutos para prevenir ligação não específica. HA foi pré-complexada com anticorpo primário (marcador His 6X anticamundongo, Abcam) e anticorpo secundário (anticamundongo de cabra Alexa fluor 488, Invitrogen) em uma razão molar de 4:2:1, respectivamente, por 20 minutos em gelo. A ligação a tecido foi realizada em concentrações de HA diferentes através de diluição da HA pré-complexada em BSA 1%-PBS. As seções de tecido foram então incubadas com os complexos de HA-anticorpo por 3 horas em temperatura ambiente. As seções de tecido foram contratingidas por iodeto de propídio (Invitrogen; 1:100 em TBST). As seções de tecido foram montadas e então imagem feita usando um microscópio confocal (microscopia confocal de varredura a laser Zeiss LSM510).
[000755] Para investigar as interações de HA-glicano multivalentes uma disposição de placa de estreptavidina compreendendo glicanos sialilados por α2^3 e α2^6 biotinilados foi usada conforme anteriormente descrito. 3’SLN, 3’SLN-LN, 3’SLN-LN-LN são receptores de ave representativos. 6’SLN e 6’SLN-LN são receptores humanos representativos. LN corresponde à lactosamina (Galβ1-4GlcNAc) e 3’SLN e 6’SLN, respectivamente, correspondem a Neu5Aca2-3 e Neu5Aca2-6 ligados a LN (Figura 28). Os glicanos biotinilados foram obtidos do Consortium of Functional Glycomics através de seu programa de requisição de recurso. Placas de 384 cavidades de Capacidade de Ligação Alta revestidas com Estreptavidina (Pierce) foram carregadas para a capacidade máxima de cada cavidade através de incubação da cavidade com 50 μl de 2,4 μM de glicanos biotinilados da noite para o dia a 4° C. Glicanos em excesso foram removidos através de lavagem extensiva com PBS. A unidade de HA trimérica compreende três monômeros de HA (e então três RBS, um para cada monômero). A disposição espacial dos glicanos biotinilados nas cavidades da disposição da placa de estreptavidina favorece ligação a apenas um dos três monômeros de HA na unidade de HA trimérica. Desta maneira a fim de aumentar especificamente a multivalência nas interações de HA-glicano, as proteínas HA recombinantes foram pré- complexadas com os anticorpos primário e secundário na razão molar de 4:2:1 (HA:primário:secundário). A disposição idêntica de 4 unidades de HA trimérica no pré-complexo para todas as HAs permite comparação entre suas afinidade de ligação a glicano. Uma solução de estoque contendo quantidades apropriadas de proteína HA marcada com Histidina, anticorpo primário (marcador His 6X anticamundongo da Abcam) e anticorpo secundário (IgG anticamundongo de cabra conjugado a HRP da Santacruz Biotechnology) na razão 4:2:1 e incubada em gelo por 20 minutos. Quantidades apropriadas de HA de estoque pré-complexada foram diluídas para 250 μl com BSA 1% em PBS. 50 μl desta HA pré-complexada foram adicionados a cada uma das cavidades revestidas com glicano e incubados em temperatura ambiente por 3 h seguido pelas etapas de lavagem com PBS e PBST (PBX 1X + Tween-20 0,05%). O sinal de ligação foi determinado com base em atividade de HRP usando Amplex Red Peroxidase Assay kit (Invitrogen, CA) de acordo com as instruções do fabricante.
[000756] Aqueles versados na técnica vão reconhecer, ou serão capazes de determinar usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes para modalidades da invenção descrita aqui. O escopo da presente invenção não pretende ser limitado à Descrição acima, mas é conforme mostrado nas reivindicações que seguem.
Claims (9)
1. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: um agente de ligação que compreende um polipeptídeo de hemaglutinina (HA) H5 tendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 50 com uma deleção na posição 130.
2. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o agente de ligação compete com uma interação do polipeptídeo de HA glicano entre glicano de topologia de guarda-chuva e um polipeptídeo de HA.
3. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que os glicanos de topologia de guarda-chuva compreendem glicanos sialilados α2-6 longos.
4. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que os glicanos sialilados α2-6 longos são selecionados dentre o grupo consistindo em Neu5Aca2- 6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc, Neu5Acα2-6GalNAcβ1 - 4GlcNAcβ1 -3GalNAcβ1 -4GlcNAc, Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1- 3Galβ1-4GalNAc, Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1- 3Galβ1-3GalNAc, Neu5Acα2-6GalNAcβ1 -4GlcNAcβ1 -3Galβ1 - 4GalNAc, Neu5Acα2-6GalNAcβ1-4GlcNAcβ1 -3GalNAcβ1-4GlcNAcβ1- 3Galβ1-3GalNAc, NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAcα2-6Neu5Ac, Neu5Aca2- 6Galβ1-4GlcNAcβ1-3/6GalNAc, Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1- 3Galβ1-4GlcNAcβ1-3/6GalNAc, Neu5Acα2-6GalNAcβ1-4GlcNAcβ1- 3/6GalNAc, Neu5Acα2-6GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3GalNAcβ1 - 4GlcNAcβ1 -3/6GalNAc, NeuAcα2-6Galβ1 -4GalNAcβ1-6GlcNAcβ1- 3Galα2-3Neu5Ac, NeuAca2-6Galβ1-4GalNAcβ1-3/6GlcNAcβ1 - 3/6Galα2-3/6Neu5Ac, Neu5Aca2-6Galβ1-3GalNAcβ1 -4Galα1-3Galβ1- 4Glc, Neu5Acα2-6Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc, Neu5Acα2- 6Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc e Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1- 3Galβ1-4Glc.
5. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o agente de ligação se liga a glicanos de topologia de guarda-chuva com uma afinidade que é 50% ou maior do que daquela observada sob condições comparáveis para uma HA do tipo selvagem que faz a mediação de infecção de humanos.
6. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o agente de ligação se liga a glicanos de topologia de guarda-chuva mais fortemente do que ele se liga a glicanos de topologia de cone.
7. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o agente de ligação mostra uma afinidade relativa com glicanos de topologia de guarda-chuva versus glicanos de topologia de cone de 2 ou mais.
8. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a interação ocorre entre o polipeptídeo de HA e receptores encontrados em células epiteliais respiratórias superiores humanas, nos brônquios, traqueia ou no pulmão profundo.
9. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende: agente de ligação, como definido na reivindicação 1, em que o agente de ligação: carece de glicosilação na posição 158 em que o agente de ligação é definido por uma atividade selecionada dentre o grupo que consiste em: compete com uma interação do polipeptídeo de HA glicano entre o glicano de topologia de guarda-chuva e um polipeptídeo de HA; e ) liga-se a tecidos pulmonares humanos.
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| EP3374390A1 (en) | 2015-11-13 | 2018-09-19 | Visterra, Inc. | Compositions and methods for treating and preventing influenza |
| EP3946613A1 (en) | 2019-03-25 | 2022-02-09 | Visterra, Inc. | Compositions and methods for treating and preventing influenza |
| CN110172452B (zh) * | 2019-05-21 | 2021-07-06 | 广州医科大学 | 一种高致病性h7n9禽流感病毒、疫苗、检测试剂以及病毒、疫苗的制备方法 |
| JP2022038604A (ja) | 2020-08-27 | 2022-03-10 | 株式会社Subaru | 車両の制御装置 |
Family Cites Families (63)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4166452A (en) | 1976-05-03 | 1979-09-04 | Generales Constantine D J Jr | Apparatus for testing human responses to stimuli |
| US4270537A (en) | 1979-11-19 | 1981-06-02 | Romaine Richard A | Automatic hypodermic syringe |
| US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
| US4692411A (en) | 1983-09-06 | 1987-09-08 | Ghose Rabindra N | Separation of specific biological cells by a biochemical filter |
| US4596556A (en) | 1985-03-25 | 1986-06-24 | Bioject, Inc. | Hypodermic injection apparatus |
| CA1283827C (en) | 1986-12-18 | 1991-05-07 | Giorgio Cirelli | Appliance for injection of liquid formulations |
| GB8704027D0 (en) | 1987-02-20 | 1987-03-25 | Owen Mumford Ltd | Syringe needle combination |
| US4790824A (en) | 1987-06-19 | 1988-12-13 | Bioject, Inc. | Non-invasive hypodermic injection device |
| US4941880A (en) | 1987-06-19 | 1990-07-17 | Bioject, Inc. | Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly |
| US4940460A (en) | 1987-06-19 | 1990-07-10 | Bioject, Inc. | Patient-fillable and non-invasive hypodermic injection device assembly |
| US5698390A (en) | 1987-11-18 | 1997-12-16 | Chiron Corporation | Hepatitis C immunoassays |
| US5339163A (en) | 1988-03-16 | 1994-08-16 | Canon Kabushiki Kaisha | Automatic exposure control device using plural image plane detection areas |
| FR2638359A1 (fr) | 1988-11-03 | 1990-05-04 | Tino Dalto | Guide de seringue avec reglage de la profondeur de penetration de l'aiguille dans la peau |
| US5064413A (en) | 1989-11-09 | 1991-11-12 | Bioject, Inc. | Needleless hypodermic injection device |
| US5312335A (en) | 1989-11-09 | 1994-05-17 | Bioject Inc. | Needleless hypodermic injection device |
| DE69030172T2 (de) | 1990-01-26 | 1997-06-19 | Immunomedics Inc | Impfstoffe gegen Krebs und Infektionskrankheiten |
| US5190521A (en) | 1990-08-22 | 1993-03-02 | Tecnol Medical Products, Inc. | Apparatus and method for raising a skin wheal and anesthetizing skin |
| US5527288A (en) | 1990-12-13 | 1996-06-18 | Elan Medical Technologies Limited | Intradermal drug delivery device and method for intradermal delivery of drugs |
| GB9118204D0 (en) | 1991-08-23 | 1991-10-09 | Weston Terence E | Needle-less injector |
| SE9102652D0 (sv) | 1991-09-13 | 1991-09-13 | Kabi Pharmacia Ab | Injection needle arrangement |
| US5328483A (en) | 1992-02-27 | 1994-07-12 | Jacoby Richard M | Intradermal injection device with medication and needle guard |
| US5383851A (en) | 1992-07-24 | 1995-01-24 | Bioject Inc. | Needleless hypodermic injection device |
| US5569189A (en) | 1992-09-28 | 1996-10-29 | Equidyne Systems, Inc. | hypodermic jet injector |
| US5334144A (en) | 1992-10-30 | 1994-08-02 | Becton, Dickinson And Company | Single use disposable needleless injector |
| US5500161A (en) | 1993-09-21 | 1996-03-19 | Massachusetts Institute Of Technology And Virus Research Institute | Method for making hydrophobic polymeric microparticles |
| WO1995024176A1 (en) | 1994-03-07 | 1995-09-14 | Bioject, Inc. | Ampule filling device |
| US5466220A (en) | 1994-03-08 | 1995-11-14 | Bioject, Inc. | Drug vial mixing and transfer device |
| US5599302A (en) | 1995-01-09 | 1997-02-04 | Medi-Ject Corporation | Medical injection system and method, gas spring thereof and launching device using gas spring |
| US5730723A (en) | 1995-10-10 | 1998-03-24 | Visionary Medical Products Corporation, Inc. | Gas pressured needle-less injection device and method |
| US5893397A (en) | 1996-01-12 | 1999-04-13 | Bioject Inc. | Medication vial/syringe liquid-transfer apparatus |
| GB9607549D0 (en) | 1996-04-11 | 1996-06-12 | Weston Medical Ltd | Spring-powered dispensing device |
| US5993412A (en) | 1997-05-19 | 1999-11-30 | Bioject, Inc. | Injection apparatus |
| IT1298087B1 (it) | 1998-01-08 | 1999-12-20 | Fiderm S R L | Dispositivo per il controllo della profondita' di penetrazione di un ago, in particolare applicabile ad una siringa per iniezioni |
| BRPI0111830B8 (pt) | 2000-06-23 | 2021-05-25 | American Cyanamid Co | método de produção de partículas semelhantes ao vírus da influenza (vlps), vlps da influenza, vlps quiméricas, composições imunogênica e farmacêutica, e, usos de vlps da influenza e de vlps quiméricas |
| US8592197B2 (en) | 2003-07-11 | 2013-11-26 | Novavax, Inc. | Functional influenza virus-like particles (VLPs) |
| JP4980896B2 (ja) * | 2004-05-25 | 2012-07-18 | メディミューン，エルエルシー | インフルエンザ赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ変異体 |
| US20090220537A1 (en) | 2005-04-12 | 2009-09-03 | The University Of Queensland | Vaccine delivery system |
| CA2627105A1 (en) | 2005-10-26 | 2007-05-03 | Protelix, Inc. | Influenza combinatorial antigen vaccine |
| CA2638815A1 (en) * | 2006-02-02 | 2007-08-16 | Globeimmune, Inc. | Yeast-based vaccine for inducing an immune response |
| US8778353B2 (en) | 2006-05-01 | 2014-07-15 | Technovax, Inc. | Influenza virus-like particle (VLP) compositions |
| US9101578B2 (en) | 2006-05-01 | 2015-08-11 | Technovax, Inc. | Polyvalent influenza virus-like particle (VLP) compositions |
| US20100143393A1 (en) | 2006-05-11 | 2010-06-10 | Gale Smith | Novel influenza m2 vaccines |
| US20100143406A1 (en) | 2006-06-30 | 2010-06-10 | Gale Smith | Methods of enhancing protein incorporation into virus like particles |
| CA2659275C (en) | 2006-07-27 | 2017-01-10 | Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. | Chimeric influenza virus-like particles |
| AU2007345682B2 (en) | 2006-07-27 | 2013-07-18 | Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. | Chimeric virus-like particles |
| KR101586971B1 (ko) * | 2006-08-09 | 2016-02-22 | 메디뮨 엘엘씨 | 인플루엔자 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제 변이체 |
| US20090269342A1 (en) | 2006-08-14 | 2009-10-29 | Massachusetts Institute Of Technology | Hemagglutinin Polypeptides, and Reagents and Methods Relating Thereto |
| JP2010501074A (ja) | 2006-08-14 | 2010-01-14 | マサチューセッツ・インスティテュート・オブ・テクノロジー | グリカンのデータマイニングシステム |
| CN101553502A (zh) | 2006-08-14 | 2009-10-07 | 麻省理工学院 | 血球凝集素多肽和其相关试剂和方法 |
| EP2061887B1 (en) | 2006-10-04 | 2018-01-24 | The University Of Queensland | Vlp based influenza vaccine delivery system |
| KR20090101883A (ko) * | 2006-10-10 | 2009-09-29 | 더 거번먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카 애즈 레프리젠티드 바이 더 세크러터리 오브 더 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 써비시즈 | 조류 인플루엔자 백신 |
| US8202967B2 (en) | 2006-10-27 | 2012-06-19 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | H5 proteins, nucleic acid molecules and vectors encoding for those, and their medicinal use |
| WO2008061243A2 (en) | 2006-11-16 | 2008-05-22 | Novavax, Inc. | Respiratory syncytial virus-virus like particle (vlps) |
| JP2010514439A (ja) * | 2006-12-29 | 2010-05-06 | インスティティ パスツール オブ シャンハイ | インフルエンザヘマグルチニンで偽型化したレンチウイルス及びその使用方法 |
| WO2008148104A1 (en) | 2007-05-25 | 2008-12-04 | Novavax, Inc. | Novel vlps derived from cells that do not express a viral matrix or core protein |
| CA2615372A1 (en) | 2007-07-13 | 2009-01-13 | Marc-Andre D'aoust | Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin |
| US20110008838A1 (en) | 2007-07-19 | 2011-01-13 | Gale Smith | Chimeric varicella zoster virus virus-like particles |
| EP2238146A4 (en) * | 2008-01-03 | 2012-03-21 | Massachusetts Inst Technology | HEMAGGLUTININ POLYPEPTIDES, REAGENTS, AND METHODS RELATING THERETO |
| AU2009204345A1 (en) | 2008-01-03 | 2009-07-16 | Massachusetts Institute Of Technology | Decoy influenza therapies |
| MY161965A (en) | 2008-07-18 | 2017-05-15 | Medicago Inc | New influenza virus immunizing epitope |
| WO2011003100A2 (en) | 2009-07-02 | 2011-01-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Compositions and methods for diagnosing and/or treating influenza infection |
| SG189236A1 (en) | 2010-10-04 | 2013-05-31 | Massachusetts Inst Technology | Hemagglutinin polypeptides, and reagents and methods relating thereto |
| CN105263954B (zh) | 2013-02-07 | 2019-12-03 | 麻省理工学院 | H5流感的人类适应 |
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