JP6029586B2 - 血球凝集素ポリペプチド、ならびにそれに関連する試薬および方法 - Google Patents
血球凝集素ポリペプチド、ならびにそれに関連する試薬および方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6029586B2 JP6029586B2 JP2013531966A JP2013531966A JP6029586B2 JP 6029586 B2 JP6029586 B2 JP 6029586B2 JP 2013531966 A JP2013531966 A JP 2013531966A JP 2013531966 A JP2013531966 A JP 2013531966A JP 6029586 B2 JP6029586 B2 JP 6029586B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polypeptide
- topology
- glycans
- binding
- umbrella
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 531
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 530
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 530
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 title description 879
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 title description 879
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 title description 879
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 title description 879
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 title description 873
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 22
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 193
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 182
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 117
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 109
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 claims description 95
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 72
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 33
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 33
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 30
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 24
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 24
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 23
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 8
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 claims description 6
- 102220535307 Bystin_Q226L_mutation Human genes 0.000 claims description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 claims description 4
- 102200120161 rs121912796 Human genes 0.000 claims description 4
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 claims description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 202
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 181
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 113
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 113
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 101
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 98
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 84
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 78
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 77
- SQVRNKJHWKZAKO-LUWBGTNYSA-N N-acetylneuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)CC(O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-LUWBGTNYSA-N 0.000 description 75
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 61
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 60
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 51
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 48
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 38
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 36
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 36
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 32
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 29
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 29
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 28
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 27
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 150000004043 trisaccharides Chemical group 0.000 description 20
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 19
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 18
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 18
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 18
- 240000005499 Sasa Species 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 16
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 13
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 13
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 12
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 12
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 12
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 12
- 101001014213 Homo sapiens Morphogenetic neuropeptide Proteins 0.000 description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 11
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 10
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 10
- 150000004044 tetrasaccharides Chemical class 0.000 description 10
- 210000005092 tracheal tissue Anatomy 0.000 description 10
- -1 GlcNAc sugars Chemical class 0.000 description 9
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 9
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 9
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 9
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 9
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 9
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 9
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 9
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 9
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 101150038582 PSMC5 gene Proteins 0.000 description 8
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical group OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010084553 jacalin Proteins 0.000 description 8
- 229940060155 neuac Drugs 0.000 description 8
- CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N neuraminic acid Natural products NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 8
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid group Chemical group S(O)(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 7
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 7
- 102220500088 Interferon-induced GTP-binding protein Mx2_T160A_mutation Human genes 0.000 description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 7
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 6
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 210000002175 goblet cell Anatomy 0.000 description 6
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 5
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 description 4
- OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N N-acetyl-D-galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N 0.000 description 4
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710165315 Sialidase A Proteins 0.000 description 4
- 102100032120 Toll/interleukin-1 receptor domain-containing adapter protein Human genes 0.000 description 4
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 4
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 4
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O guanidinium Chemical group NC(N)=[NH2+] ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 150000003384 small molecules Chemical group 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- PNIWLNAGKUGXDO-UHFFFAOYSA-N Lactosamine Natural products OC1C(N)C(O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 PNIWLNAGKUGXDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 3
- DOVBXGDYENZJBJ-ONMPCKGSSA-N lactosamine Chemical group O=C[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O DOVBXGDYENZJBJ-ONMPCKGSSA-N 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 2
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 description 2
- 125000003412 L-alanyl group Chemical group [H]N([H])[C@@](C([H])([H])[H])(C(=O)[*])[H] 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 210000005058 airway cell Anatomy 0.000 description 2
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000000424 bronchial epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 210000004922 colonic epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 238000001906 matrix-assisted laser desorption--ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283153 Cetacea Species 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000402754 Erythranthe moschata Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 125000003440 L-leucyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001176 L-lysyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(N([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000002842 L-seryl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000282339 Mustela Species 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 description 1
- 241000845082 Panama Species 0.000 description 1
- 241000282373 Panthera pardus Species 0.000 description 1
- 241000282376 Panthera tigris Species 0.000 description 1
- 241000283216 Phocidae Species 0.000 description 1
- 108010089814 Plant Lectins Proteins 0.000 description 1
- 101100042881 Sambucus nigra SNA-I gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 210000000746 body region Anatomy 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical group 0.000 description 1
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003726 plant lectin Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 150000003214 pyranose derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 102220011074 rs730881001 Human genes 0.000 description 1
- 102220319835 rs761360080 Human genes 0.000 description 1
- 102220069665 rs794727719 Human genes 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 125000000467 secondary amino group Chemical group [H]N([*:1])[*:2] 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1018—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
本出願は、1010年10月4日に出願した米国仮出願第61/389,639号の利益を主張する。米国仮出願第61/389,639号の内容全体は、本明細書中に参考として援用される。
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられた助成第GM57073号および同第U54 GM62116号下の政府援助により行った。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
インフルエンザは、大流行、流行、再流行、および大発生の長い歴史を有する。H5N1株を含めたトリインフルエンザは、高度に接触伝染性であり潜在的に致死性の病原体であるが、現在のところ、ヒトに感染する能力は限定されたものであるにとどまる。しかし、トリインフルエンザウイルスは歴史的に、その宿主特異性を変化させ、それが容易にヒトに感染することを可能とする、突然変異を累積させることが観察されている。実際、前世紀におけるインフルエンザの主要な大流行のうちの2つは、それらの遺伝子組成を変化させてヒトへの感染を可能とした、トリインフルエンザウイルスに由来していた。
最新型のH5N1、H7N7、H9N2、およびH2N2のトリインフルエンザ株は、その宿主特異性を変化させ、それが容易にヒトに感染することを可能とする、突然変異を累積させうることが強く憂慮されている。したがって、これらの株におけるHAタンパク質が実際に、容易にヒトに感染しうる形態へと転換されうるかどうかを評価することが必要とされており、このような能力を伴うHA変異体(variant)を同定することもさらに必要とされている。異なる被験体、特に、ヒトの感染を可能とするかまたは妨害するHAタンパク質の特徴を一般に理解することもさらに必要とされている。また、インフルエンザウイルスにより引き起こされる疾患を有効に処置するか、またはその発症を遅延させるためのワクチンおよび治療戦略も必要とされている。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
基準のH5 HAポリペプチド配列のアミノ酸配列と、残基130、131、132、133、135、137、155、188、192、193、221、226、227、228、およびこれらの組合せからなる群から選択される残基のうちの1またはそれより多くで異なるアミノ酸配列を有するH5 HAポリペプチドを含む結合剤
を含む医薬組成物。
(項目2)
前記結合剤が、アンブレラトポロジーグリカンとHAポリペプチドとの間でのグリカン−HAポリペプチド相互作用と競合する、項目1に記載の医薬組成物。
(項目3)
前記H5 HAポリペプチドの長さが19〜55アミノ酸の範囲にある、項目1に記載の医薬組成物。
(項目4)
前記H5 HAポリペプチドが、長さが少なくとも19アミノ酸である部分を包含するアミノ酸配列を有し、配列番号50、51、53、54、または55からなる群から選択されるH5 HAポリペプチドの対応する部分と少なくとも95%の配列全体の同一性を示す、項目1に記載の医薬組成物。
(項目5)
前記H5 HAポリペプチドが、アミノ酸1〜55に対応する領域にわたり、配列番号50、51、53、54、または55からなる群から選択される基準のH5 HAと少なくとも95%の同一性を示すアミノ酸配列を有するが、前記基準のHAのアミノ酸配列と、残基130、192、193、およびこれらの組合せからなる群から選択される1またはそれより多くの残基が異なる、項目1に記載の医薬組成物。
(項目6)
前記H5 HAポリペプチドが、アミノ酸1〜55に対応する領域にわたり、配列番号50、51、53、54、または55からなる群から選択される基準のH5 HAと少なくとも95%の同一性を示すアミノ酸配列を有するが、前記基準のHAのアミノ酸配列と、残基128〜137、およびこれらの組合せからなる群から選択される1またはそれより多くの残基が異なる、項目1に記載の医薬組成物。
(項目7)
前記H5 HAポリペプチドが、アミノ酸1〜55に対応する領域にわたり、配列番号50、51、53、54、または55からなる群から選択される基準のH5 HAと少なくとも95%の同一性を示すアミノ酸配列を有するが、前記基準のHAのアミノ酸配列と、アミノ酸残基130の欠失が存在することにより異なる、項目1に記載の医薬組成物。
(項目8)
前記H5 HAポリペプチドが、アミノ酸1〜55に対応する領域にわたり、配列番号50、51、53、54、または55からなる群から選択される基準のH5 HAと少なくとも95%の同一性を示すアミノ酸配列を有するが、前記基準のHAのアミノ酸配列と、残基160、226、228、およびこれらの組合せからなる群から選択される1またはそれより多くの残基が異なる、項目1に記載の医薬組成物。
(項目9)
前記H5 HAポリペプチドが、アミノ酸1〜55に対応する領域にわたり、配列番号50、51、53、54、または55からなる群から選択される基準のH5 HAと少なくとも95%の同一性を示すアミノ酸配列を有するが、前記基準のHAのアミノ酸配列と、残基158、226、228、およびこれらの組合せからなる群から選択される1またはそれより多くの残基が異なる、項目1に記載の医薬組成物。
(項目10)
前記アンブレラトポロジーグリカンが、長鎖α2−6シアル化グリカンを含む、項目2に記載の医薬組成物。
(項目11)
前記長鎖α2−6シアル化グリカンが、
からなる群から選択される、項目10に記載の医薬組成物。
(項目12)
前記結合剤が、アンブレラトポロジーグリカンに、同等の条件下でヒトの感染を媒介する野生型のHAについて観察される親和性の少なくとも50%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも100%の親和性で結合する、項目2に記載の医薬組成物。
(項目13)
前記結合剤が、アンブレラトポロジーグリカンに、コーントポロジーグリカンに結合するより強力に結合する、項目2に記載の医薬組成物。
(項目14)
前記結合剤が、アンブレラトポロジーグリカン対コーントポロジーグリカンについて少なくとも2の相対的親和性を示す、項目2に記載の医薬組成物。
(項目15)
前記結合剤が、アンブレラトポロジーグリカン対コーントポロジーグリカンについて少なくとも5の相対的親和性を示す、項目2に記載の医薬組成物。
(項目16)
前記結合剤が、アンブレラトポロジーグリカン対コーントポロジーグリカンについて少なくとも10の相対的親和性を示す、項目2に記載の医薬組成物。
(項目17)
前記相互作用が、前記HAポリペプチドと、ヒト上気道上皮細胞、気管支、気管、または肺深部において見出される受容体との間で生じる、項目2に記載の医薬組成物。
(項目18)
アンブレラトポロジーグリカンとHAポリペプチドとの間のグリカン−HAポリペプチド相互作用と競合する結合剤
を含むワクチン組成物であって、
前記ワクチンが、任意のH5インフルエンザウイルスに対して広く防御的であるワクチン組成物。
(項目19)
前記H5インフルエンザウイルスが、ヒト適応型H5ウイルスまたはトリ適応型H5ウイルスである、項目18に記載のワクチン組成物。
(項目20)
前記適応型H5ウイルスが、基準のH5 HAポリペプチド配列と、残基130、131、132、133、135、137、155、188、192、193、221、226、227、228、およびこれらの組合せからなる群から選択される残基のうちの1またはそれより多くで異なるH5 HAポリペプチド配列を含む、項目19に記載のワクチン組成物。
(項目21)
被験体においてH5インフルエンザウイルスのアンブレラトポロジーを有する血球凝集素受容体への結合を阻害するか、アンブレラトポロジーを有する血球凝集素受容体に結合するインフルエンザウイルスによる被験体の感染の危険性を最小化するか、または被験体を処置する方法であって、
インフルエンザウイルスによる感染に対して感受性であるかまたはこれを患っている被験体を同定するステップと、
アンブレラトポロジーグリカンとHAポリペプチドとのグリカン−HAポリペプチド間相互作用と競合する結合剤を選択するステップと、
前記ウイルスによるアンブレラトポロジーグリカンを有する血球凝集素受容体への結合を低減するか、前記危険性を最小化するか、または前記患者を処置するように、有効量の前記結合剤を投与するステップと
を含む方法。
(項目22)
前記結合剤が、基準のH5 HAポリペプチド配列と、残基130、131、132、133、135、137、155、188、192、193、221、226、227、228、およびこれらの組合せからなる群から選択される残基のうちの1またはそれより多くでH5 HAポリペプチド配列を含む、項目21に記載の方法。
(項目23)
前記選択するステップが、結合剤を、前記結合剤がアンブレラトポロジーグリカンを有する血球凝集素受容体に結合することが可能であることに基づいて選択することを包含する、項目21に記載の方法。
(項目24)
前記結合剤がLSBAである、項目21に記載の方法。
(項目25)
前記結合剤がUTBAである、項目21に記載の方法。
(項目26)
前記結合剤がUTSBAである、項目21に記載の方法。
(項目27)
前記UTSBAを、前記ウイルスへの曝露前に前記被験体に投与する、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記UTSBAを、前記ウイルスへの曝露後に前記被験体に投与する、項目26に記載の方法。
(項目29)
投与する量が、前記被験体のアンブレラトポロジーグリカンを含有するHA受容体を飽和させるのに十分である、項目21に記載の方法。
(項目30)
前記UTSBAを、吸入により投与する、項目26に記載の方法。
(項目31)
前記UTSBAが、抗体、レクチン、アプタマー、および非HAポリペプチドからなる群から選択される、項目26に記載の方法。
(項目32)
前記UTSBAを、第2の治療剤の投与と組み合わせて投与する、項目26に記載の方法。
(項目33)
前記第2の治療剤が抗ウイルス剤である、項目32に記載の方法。
HA配列エレメント1
HA配列エレメント1とは、天然のインフルエンザウイルス単離物中に見出される多くのHAタンパク質の残基97〜185(ここでは、基準としてのH3 HAを用いて残基の位置を割り当てる)にほぼ対応する配列エレメントである。この配列エレメントは、基本構造:
C(Y/F)PX1CX2WX3WX4HHP(配列番号106):
[配列中、
X1を約30〜45アミノ酸長とし、
X2を約5〜20アミノ酸長とし、
X3を約25〜30アミノ酸長とし、
X4を約2アミノ酸長とする]
を有する。
X1Aを約27〜42アミノ酸長、または約32〜42アミノ酸長、または約32〜40アミノ酸長、または約26〜41アミノ酸長、または約31〜41アミノ酸長、または約31〜39アミノ酸長、または約31、32、33、34、35、36、37、38、39、もしくは40アミノ酸長とし、X2〜X4を上記の通りとする]
を有する。
X1Aを約27〜42アミノ酸長、または約32〜42アミノ酸長、または約32〜40アミノ酸長、または約32、33、34、35、36、37、38、39、もしくは40アミノ酸長とし、
X3Aを約23〜28アミノ酸長、または約24〜26アミノ酸長、または約24、25、もしくは26アミノ酸長とし、X2およびX4を上記の通りとする]
を有する。
X1Aを約27〜42アミノ酸長、または約32〜42アミノ酸長、または約32〜40アミノ酸長、または約23〜38アミノ酸長、または約28〜38アミノ酸長、または約28〜36アミノ酸長、または約28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、もしくは40アミノ酸長とし、X2〜X4を上記の通りとする]
を有する。
X1Aを約27〜42アミノ酸長、または約32〜42アミノ酸長、または約32〜40アミノ酸長、または約32、33、34、35、36、37、38、39、もしくは40アミノ酸長とし、
X3Aを約23〜28アミノ酸長、または約24〜26アミノ酸長、または約24、25、もしくは26アミノ酸長とし、X2およびX4を上記の通りとする]
を有する。
X1Aを約27〜42アミノ酸長、または約32〜42アミノ酸長、または約32〜40アミノ酸長、または約23〜38アミノ酸長、または約28〜38アミノ酸長、または約28〜36アミノ酸長、または約28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、もしくは40アミノ酸長とし、X2〜X4を上記の通りとする]
を有する。
X1Aを約27〜42アミノ酸長、または約32〜42アミノ酸長、または約32〜40アミノ酸長、または約32、33、34、35、36、37、38、39、もしくは40アミノ酸長とし、
X3Aを約23〜28アミノ酸長、または約24〜26アミノ酸長、または約24、25、もしくは26アミノ酸長とし、X2およびX4を上記の通りとする]
を有する。
HA配列エレメント2とは、天然のインフルエンザウイルス単離物中に見出される多くのHAタンパク質の残基324〜340(ここでもまた、H3 HAに基づく番号付けシステムを用いる)にほぼ対応する配列エレメントである。この配列エレメントは、基本構造:
X1を約4〜14アミノ酸長、または約8〜12アミノ酸長、または約12、11、10、9、もしくは8アミノ酸長とする]
を有する。一部の実施形態では、この配列エレメントが、HA1およびHA2の生成を可能とするHA0の切断部位をもたらす。
X1Aを約3アミノ酸長とし、一部の実施形態では、X1AをG(L/I)Fとする]を有する。
X1Aを約3アミノ酸長とし、一部の実施形態では、X1AをG(L/I)Fとする]を有する。
X1Aを約3アミノ酸長とし、一部の実施形態では、X1AをG(L/I)Fとする]を有する。
親和性:当技術分野で公知の「親和性」とは、特定のリガンド(例えば、HAポリペプチド)がそのパートナー(例えば、HA受容体)に結合する緊密さの尺度である。親和性は、異なる方法で測定することができる。
a new generation of protein database search programs」、Nucleic Acids Res.、25巻:3389〜3402頁、1997年;Baxevanisら、「Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of
Genes and Proteins」、Wiley、1998年;およびMisenerら(編)、「Bioinformatics Methods and Protocols」(「Methods in Molecular Biology」、132巻)、Humana Press、1999年において記載されている。同一な配列を同定するステップに加えて、上述のプログラムは典型的に、同一性の程度の指標ももたらす。一部の実施形態では、それらの対応する残基のうちの少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%以上が関連する残基の連なりにわたり同一である場合に、2つの配列を実質的に同一であると考える。一部の実施形態では、関連する連なりを、完全な配列とする。一部の実施形態では、関連する連なりを、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも100、少なくとも125、少なくとも150、少なくとも175、少なくとも200、少なくとも225、少なくとも250、少なくとも275、少なくとも300、少なくとも325、少なくとも350、少なくとも375、少なくとも400、少なくとも425、少なくとも450、少なくとも475、少なくとも500以上の残基とする。
Neu5Acα2−6Sug1−Sug2−Sug3
[配列中、
(a)Neu5Acα2−6が、典型的に(本質的にではないが)非還元末端にあり、
(b)Sug1を、
(i)α配置もしくはβ配置(N結合型伸長鎖およびO結合型伸長鎖ではβ配置とすることが多く、糖タンパク質にO結合するGalNAcα配置の場合はα配置とする)のヘキソース(GalまたはGlcとすることが多い)もしくはヘキソサミン(GlcNAcまたはGalNAc)とし、
(ii)Neu5Acα2−6以外の糖が、Sug1(Sug1を、糖タンパク質にO結合したGalNAcα配置とする場合を除く)の非還元位置のうちのいずれにも結合しないとし、かつ/または
(iii)硫酸、リン酸、グアニジウム、アミン、N−アセチルなどの非糖部分を、Sug1(例えば、HAとの接触を改善するために)の非還元位置(典型的には6位)に結合させることができ、
(c)Sug2および/またはSug3を、
(i)α配置もしくはβ配置(β配置とすることが多い)のヘキソース(GalまたはGlcとすることが多い)もしくはヘキソサミン(GlcNAcまたはGalNAc)とし、かつ/または
(ii)糖(Fucなど)もしくは硫酸、リン酸、グアニジウム、アミン、N−アセチルなどの非糖部分を、Sug2、Sug3、および/もしくはSug4の非還元位置に結合させることができ、
(d)Neu5Acα2−6結合とは別に、オリゴ糖における任意の2つの糖の間の結合を、1−2結合、1−3結合、1−4結合、および/または1−6結合(典型的に1−3結合または1−4結合)とすることができ、かつ/または
(e)Neu5Acα2−6が、糖タンパク質にO結合したGalNAcαに結合し、さらなる糖がGalNAcαの非還元末端に結合する構造、例えば
のオリゴ糖とする。
本発明は、アンブレラトポロジーグリカンに結合する結合剤(例えば、HAポリペプチド、HAポリペプチド変異体、LSBA、UTBA、UTSBAなど)を提供する。一部の実施形態では、本発明が、特定の標的種のHA受容体において見出されるアンブレラトポロジーグリカンに結合する結合剤を提供する。例えば、一部の実施形態では、本発明が、ヒトHA受容体、例えば、ヒト上皮細胞において見出されるHA受容体において見出されるアンブレラトポロジーグリカンに結合する結合剤、特に上気道のヒトHA受容体において見出されるアンブレラトポロジーグリカンに結合する結合剤を提供する。
インフルエンザウイルスは、特定のウイルスの膜に埋め込まれた2つの糖タンパク質である、血球凝集素(HA)およびノイラミニダーゼ(NA)を含有する脂質膜エンベロープを特徴とするRNAウイルスである。16のHA亜型および9つのNA亜型が公知であり、異なるインフルエンザ株は、株のHA亜型およびNA亜型の番号に基づいて命名されている。アミノ酸配列の同一性および結晶構造の比較に基づき、HA亜型は、2つの主要な群および4つの小クレードに分けられている。異なるHA亜型は必ずしも高度のアミノ酸配列の同一性を共有するわけでないが、異なるHA亜型の全体的な3D構造は、分類目的に用いうる複数の微細な差違を伴いながらも、互いと類似している。例えば、膜遠位側のサブドメインの、中央のα螺旋に対する特定の配向性は、HA亜型を決定するのに一般に用いられる1つの構造的特徴である(参照により本明細書に組み込まれる、Russellら、2004年、Virology、325巻:287頁)。
上記で言及した通り、本発明は、アンブレラトポロジーグリカンへの結合が、例えば、ヒトを含めた特定の宿主の感染を媒介する能力と相関することの知見を包含する。したがって、本発明は、アンブレラグリカンに結合する(および/またはアンブレラトポロジーグリカンの模倣体に結合する)結合剤(例えば、HAポリペプチド、HAポリペプチド変異体、LSBA、UTBA、UTSBAなど)を提供する。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、アンブレラグリカンに高親和性で結合する(および/またはアンブレラトポロジーグリカンの模倣体に高親和性で結合する)。一部の実施形態では、本発明による結合剤が、複数の異なるアンブレラトポロジーグリカンに、高度な親和性および/または特異性で結合することが多い。
Neu5Acα2−6Sug1−Sug2−Sug3
[配列中、
1.Neu5Acα2−6が、常にまたはほとんど常に非還元末端にあり、
2.Sug1を、
a.α配置もしくはβ配置(N結合型伸長鎖およびO結合型伸長鎖ではβ配置とすることが多く、糖タンパク質にO結合するGalNAcα配置の場合はα配置とする)のヘキソース(GalまたはGlcとすることが多い)もしくはヘキソサミン(GlcNAcまたはGalNAc)とし、
b.Neu5Acα2−6以外の糖が、Sug1(Sug1を糖タンパク質にO結合したGalNAcα配置とする場合を除く)の非還元位置のうちのいずれにも結合しないものとし、かつ/または
c.硫酸、リン酸、グアニジウム、アミン、N−アセチルなどの非糖部分を、HAとの接触を改善するために、Sug1の非還元位置(典型的には6位)に結合させることができ、
3.Sug2および/またはSug3を、
a.α配置もしくはβ配置(β配置とすることが多い)のヘキソース(GalまたはGlcとすることが多い)もしくはヘキソサミン(GlcNAcまたはGalNAc)とし、かつ/または
b.糖(Fucなど)もしくは硫酸、リン酸、グアニジウム、アミン、N−アセチルなどの非糖部分を、Sug2、Sug3、および/もしくはSug4の非還元位置に結合させることができ、
4.Neu5Acα2−6結合とは別に、オリゴ糖における任意の2つの糖の間の結合を、1−2結合、1−3結合、1−4結合、および/または1−6結合(典型的に1−3結合または1−4結合)とすることができ、かつ/または
5.Neu5Acα2−6が、糖タンパク質にO結合したGalNAcαに結合し、さらなる糖がGalNAcαの非還元末端に結合する構造、例えば、
のオリゴ糖に結合する。
一部の実施形態では、本発明による結合剤をHAポリペプチドとする。例えば、本発明は、結合特異性が指定された、単離されたHAポリペプチドを提供し、また、結合特徴がアンブレラグリカンとの関係で指定された、操作されたHAポリペプチドも提供する。
一部の実施形態では、そのアミノ酸配列が少数の特定の配列変化を除き親HAポリペプチドのアミノ酸配列と同一である点において、提供されるHAポリペプチドを、親HAの変異体とする。一部の実施形態では、親HAを、インフルエンザウイルスの天然の単離物中に見出されるHAポリペプチド(例えば、野生型のHAポリペプチド)とする。
HAポリペプチド変異体をH2 HAポリペプチドに酷似させる1またはそれより多くの配列変化を含有する。別の具体例を挙げると、一部の実施形態では、本発明によるH5
HAポリペプチド変異体が、H5 HAポリペプチド変異体をH1 HAポリペプチドに酷似させる1またはそれより多くの配列変化を含有する。
HAポリペプチド(例えば、H5 HAポリペプチド)を、H2 HAポリペプチドに酷似させる(例えば、構造的にも機能的にも酷似させる)ことができる。一部の実施形態では、160位に対応する部位における突然変異(例えば、Thr160AlaなどのThr160Xaa)により、非H2 HAポリペプチド(例えば、H5 HAポリペプチド)を、H2 HAポリペプチドに酷似させる(例えば、構造的にも機能的にも酷似させる)ことができる。
HAポリペプチド変異体)が、HAポリペプチドの128〜137のループ領域に対応する部位において欠失を包含する配列置換を有する。一部の実施形態では、HAポリペプチド変異体(例えば、H5 HAポリペプチド変異体)が、HAポリペプチドの残基128、129、130、131、132、133、134、135、136、および/または137に対応するアミノ酸位置のうちの1またはそれより多くにおいて欠失を包含する配列置換を有する。一部の実施形態では、HAポリペプチド変異体(例えば、H5 HAポリペプチド変異体)が、HAポリペプチドの128〜134のループ領域に対応する部位において欠失を包含する配列置換を有する。一部の実施形態では、HAポリペプチド変異体(例えば、H5 HAポリペプチド変異体)が、HAポリペプチドの残基128、129、130、131、132、133、および/または134に対応するアミノ酸位置のうちの1またはそれより多くにおいて欠失を包含する配列置換を有する。一部の実施形態では、HAポリペプチド変異体(例えば、H5 HAポリペプチド変異体)が、残基130に対応するアミノ酸の欠失を包含する配列置換を有する。一部の実施形態では、このようなループ領域の置換により、非H2 HAポリペプチド(例えば、H5 HAポリペプチド)を、H2 HAポリペプチドに酷似させる(例えば、構造的にも機能的にも酷似させる)ことができる。一部の実施形態では、残基130に対応するアミノ酸の欠失により、非H2 HAポリペプチド(例えば、H5 HAポリペプチド)を、H2 HAポリペプチドに酷似させる(例えば、構造的にも機能的にも酷似させる)ことができる。
HA)と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、HAポリペプチド変異体(例えば、H5 HAポリペプチド変異体)が、残基133、137、155、193、226、227、228、および130のうちの任意の1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、または8個に対応する位置において、野生型の親HA(例えば、H5 HA)と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、HAポリペプチド変異体(例えば、H5
HAポリペプチド変異体)が、(1)130、ならびに(2)残基133、137、155、193、226、227、および228のうちの1またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親HA(例えば、H5 HA)と比べて配列置換を有する。一部の実施形態では、HAポリペプチド変異体(例えば、H5 HAポリペプチド変異体)が、(1)130、ならびに(2)残基133、137、155、193、226、227、および228のうちの任意の1個、2個、3個、4個、5個、6個、または7個に対応する位置において、野生型の親HA(例えば、H5 HA)と比べて配列置換を有する。
HAポリペプチド変異体)が、残基188に対応する位置においてAspを有し、残基192に対応する位置においてLysを有し、残基193に対応する位置においてThrを有する。一部の実施形態では、HAポリペプチド変異体(例えば、H5 HAポリペプチド変異体)が、残基188に対応する位置においてGluを有し、残基192に対応する位置においてArgを有し、残基193に対応する位置においてThr、Ala、Met、またはValを有する。一部の実施形態では、HAポリペプチド変異体(例えば、H5 HAポリペプチド変異体)が、残基188に対応する位置においてAspを有し、残基192に対応する位置においてArgを有し、残基193に対応する位置においてThr、Ala、Met、またはValを有する。一部の実施形態では、HAポリペプチド変異体(例えば、H5 HAポリペプチド変異体)が、残基188に対応する位置においてGluを有し、残基192に対応する位置においてLysを有し、残基193に対応する位置においてThr、Ala、Met、またはValを有する。一部の実施形態では、HAポリペプチド変異体(例えば、H5 HAポリペプチド変異体)が、残基188に対応する位置においてAspを有し、残基192に対応する位置においてLysを有し、残基193に対応する位置においてThr、Ala、Met、またはValを有する。
・Δ130+残基131、132、135、188、192、および221に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ130+残基133、137、155、193、226、227、および228に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ130+残基131、132、133、135、137、155、158、160、188、192、193、221、226、227、および228に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ130+残基131、133、137、155、188、192、193、226、227、および228に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ130+残基131、133、137、155、188、192、193、226、および228に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ130+残基131、133、137、155、159、160、188、192、193、226、227、および228に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ130+残基131、133、137、155、159、160、188、192、193、226、および228に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ130+残基137、188、192、193、226、228、131、132、133、221、および227に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ130+残基131、132、133、221、および227に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ130+残基137、188、192、193、226、および228に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ130+残基137、188、192、193、226、227、228、131、132、および133に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ130+残基227、131、132、および133に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ130、Xaa131Ser/Thr、Xaa132Ser/Thr、Xaa133Ser/Thr、Ser221Pro、Ser227Gly(Xaa=任意のアミノ酸)
・Δ130、Xaa192Xaa’(Xaa=任意の疎水性アミノ酸、およびXaa’=任意の親水性アミノ酸)
・Δ130、Xaa192Lys/Arg(Xaa=任意の疎水性残基)
・Δ130、Xaa193Xaa’(Xaa=塩基性残基、例えば、LysまたはArg、およびXaa’=中性残基または酸性残基)
・Δ130、Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val
・Δ130、Xaa192Xaa’(Xaa=任意の疎水性アミノ酸、およびXaa’=任意の親水性アミノ酸)、Xaa193Xaa’(Xaa=塩基性残基、例えば、LysまたはArg、およびXaa’=中性残基または酸性残基)
・Δ130、Xaa192Lys/Arg(Xaa=任意の疎水性残基)、Xaa193Xaa’(Xaa=塩基性残基、例えば、LysまたはArg、およびXaa’=中性残基または酸性残基)
・Δ130、Xaa192Xaa’(Xaa=任意の疎水性アミノ酸、およびXaa’=任意の親水性アミノ酸)、Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val
・Δ130、Xaa192Lys/Arg(Xaa=任意の疎水性残基)、Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val
・Δ130、Ala188Glu
・Δ130、Ala188Asp
・Δ130、Xaa192Xaa’(Xaa=任意の疎水性アミノ酸、およびXaa’=任意の親水性アミノ酸)、Ala188Glu
・Δ130、Xaa192Lys/Arg(Xaa=任意の疎水性残基)、Ala188Glu
・Δ130、Xaa193Xaa’(Xaa=塩基性残基、例えば、LysまたはArg、およびXaa’=中性残基または酸性残基)、Ala188Glu
・Δ130、Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val、Ala188Glu
・Δ130、Xaa192Xaa’(Xaa=任意の疎水性アミノ酸、およびXaa’=任意の親水性アミノ酸)、Ala188Asp
・Δ130、Xaa192Lys/Arg(Xaa=任意の疎水性残基)、Ala188Asp
・Δ130、Xaa193Xaa’(Xaa=塩基性残基、例えば、LysまたはArg、およびXaa’=中性残基または酸性残基)、Ala188Asp
・Δ130、Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val、Ala188Asp
・Δ130、Xaa192Xaa’(Xaa=任意の疎水性アミノ酸、およびXaa’=任意の親水性アミノ酸)、Xaa193Xaa’(Xaa=塩基性残基、例えば、LysまたはArg、およびXaa’=中性残基または酸性残基)、Ala188Glu
・Δ130、Xaa192Lys/Arg(Xaa=任意の疎水性残基)、Xaa193Xaa’(Xaa=塩基性残基、例えば、LysまたはArg、およびXaa’=中性残基または酸性残基)、Ala188Glu
・Δ130、Xaa192Xaa’(Xaa=任意の疎水性アミノ酸、およびXaa’=任意の親水性アミノ酸)、Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val、Ala188Glu
・Δ130、Xaa192Lys/Arg(Xaa=任意の疎水性残基)、Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val、Ala188Glu
・Δ130、Xaa192Xaa’(Xaa=任意の疎水性アミノ酸、およびXaa’=任意の親水性アミノ酸)、Xaa193Xaa’(Xaa=塩基性残基、例えば、LysまたはArg、およびXaa’=中性残基または酸性残基)、Ala188Asp
・Δ130、Xaa192Lys/Arg(Xaa=任意の疎水性残基)、Xaa193Xaa’(Xaa=塩基性残基、例えば、LysまたはArg、およびXaa’=中性残基または酸性残基)、Ala188Asp
・Δ130、Xaa192Xaa’(Xaa=任意の疎水性アミノ酸、およびXaa’=任意の親水性アミノ酸)、Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val、Ala188Asp
・Δ130、Xaa192Lys/Arg(Xaa=任意の疎水性残基)、Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val、Ala188Asp
のうちの1またはそれより多くを有する。
・X130+X131、X132、X135、X188、X192、およびX221のうちの任意の可能な組合せ
・X130+X133、X137、X155、X193、X226、X227、およびX228のうちの任意の可能な組合せ
・X130+X131、X132、X133、X135、X137、X155、Xaa158(Xaa=Asn以外の任意のアミノ酸)、X160、X188、X192、X193、X221、X226、X227、およびX228のうちの任意の可能な組合せ
・X130+X131、X133、X137、X155、X188、X192、X193、X226、X227、およびX228のうちの任意の可能な組合せ
・X130+X131、X133、X137、X155、X188、X192、X193、X226、およびX228のうちの任意の可能な組合せ
・X130+X131、X133、X137、X155、X159、X160、X188、X192、X193、X226、X227、およびX228のうちの任意の可能な組合せ
・X130+X131、X133、X137、X155、X159、X160、X188、X192、X193、X226、およびX228のうちの任意の可能な組合せ
・X130+X137、X188、X192、X193、X226、X228、X131、X132、X133、X221、およびX227のうちの任意の可能な組合せ
・X130+X131、X132、X133、X221、およびX227のうちの任意の可能な組合せ
・X130+X137、X188、X192、X193、X226、およびX228のうちの任意の可能な組合せ
・X130+X137、X188、X192、X193、X226、X227、X228、X131、X132、およびX133のうちの任意の可能な組合せ
・X130+X227、X131、X132、およびX133のうちの任意の可能な組合せ
を包含する、HAポリペプチド(例えば、HAポリペプチド変異体、操作されたHAポリペプチド、および/または操作されたHAポリペプチド変異体)を提供する。
HAポリペプチド変異体を含めた)が、L226およびX158を包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるHAポリペプチド(H5 HAポリペプチド変異体を含めた)が、S228およびX158を包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるHAポリペプチド(H5 HAポリペプチド変異体を含めた)が、X158を包含する配列を有する。
本発明は、本発明によるHAポリペプチドの特徴的部分(これらは結合剤の場合もあり、結合剤でない場合もある)およびそれらをコードする核酸をさらに提供する。一般に、特徴的部分とは、それらが併せてHAポリペプチドの特徴となる、アミノ酸の連続的な連なりまたはアミノ酸の連続的な連なりの集合を含有する部分である。このような連続的連なりの各々は一般に、少なくとも2つのアミノ酸を含有する。さらに当業者は、典型的に少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20以上のアミノ酸が、H5 HAポリペプチドの特徴となるように要求されることを理解するであろう。一般に、特徴的部分とは、上記で指定した配列同一性に加えて、関連するインタクトHAポリペプチドと少なくとも1つの機能的特徴を共有する部分である。一部の実施形態では、本発明によるHAポリペプチドの特徴的部分が、関連する全長HAポリペプチドとグリカン結合特徴を共有する。
一部の実施形態では、本発明により提供される結合剤が、それらのアミノ酸配列が特徴的なHA配列を包含しないポリペプチドである。本明細書では、このようなポリペプチドを「非HAポリペプチド」と称する。一部の実施形態では、非HAポリペプチドが、あらかじめ(例えば、例えば、基準配列と比較した戦略的なアミノ酸変化[例えば、付加、欠失、および/または置換]の導入を含めた合理的なデザインを介して)選択されるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、非HAポリペプチドが、化学量論的に決定され、例えば、本明細書で規定される所望の結合特徴に基づいて同定されるアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、本発明により提供される結合剤を、抗体(例えば、アンブレラトポロジーグリカンおよび/またはアンブレラトポロジーグリカンの模倣体に結合する抗体)とする。本発明に適する抗体は、任意のアンブレラトポロジーグリカンのエピトープに免疫特異的に結合する抗体または抗体断片を包含する。本明細書で用いられる「抗体」という用語は、指定されたタンパク質またはペプチド、またはその断片に対して特異的に反応性である免疫グロブリンおよびこれらの断片を包含することを意図する。適切な抗体には、ヒト抗体、霊長動物化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、コンジュゲート抗体(すなわち、他のタンパク質、放射性標識、細胞毒素にコンジュゲートするかまたは融合させた抗体)、Small Modular ImmunoPharmaceuticals(「SMIP(商標)」)、単鎖抗体、ラクダ抗体、および抗体断片が含まれるがこれらに限定されない。本明細書で用いられる「抗体」という用語にはまた、インタクトモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一ドメイン抗体(例えば、サメの単一ドメイン抗体(例えば、IgNARまたはその断片))、少なくとも2つのインタクト抗体から形成される多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、およびそれらが所望の生物学的活性を呈示する限りにおける抗体断片も含まれる。本明細書で用いられる抗体ポリペプチドは、任意の種類(例えば、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM)でありうる。
一部の実施形態では、本発明により提供される結合剤を、レクチンとする。レクチンとは、可溶性の炭水化物、または糖コンジュゲート(例えば、糖ペプチドまたは糖脂質)の一部である炭水化物部分に結合しうる糖結合タンパク質である。レクチンは典型的に、特定の動物細胞を凝集させ、かつ/または特定の糖部分を認識することにより、糖コンジュゲートを沈殿させる。例えば、SNA−1とは、α2−6シアル酸に対する親和性が高いレクチンである。さらに別の例として述べると、Polyporus squamosusのレクチン(PSL1aおよびPSL1b)は、アスパラギン結合型糖タンパク質の三糖配列であるNeu5Acα2,6Galβ1,4Glc/GlcNAcを含有するシアル化糖コンジュゲートに結合するときの親和性が高い。結合剤として作用しうる非限定的な例示的レクチンには、SNA−1、SNA−1’、PSL1a、PSL1b、およびこれらに由来するポリペプチドが含まれる。
一部の実施形態では、本発明により提供される結合剤をアプタマーとする。アプタマーとは、特定の分子標的(例えば、アンブレラトポロジーグリカン)に緊密に結合する核酸(例えば、RNA、DNA)からなる高分子である。特定のアプタマーは、直鎖状のヌクレオチド配列を介して記載することができ、典型的には長さが約15〜約60ヌクレオチドである。いかなる理論により拘束されることも望まないが、アプタマー中のヌクレオチド鎖が、この分子を複雑な3次元的形状へとフォールディングする分子内相互作用を形成し、この3次元的形状により、アプタマーがその標的分子の表面に緊密に結合することが可能となることが目論まれる。全ての可能なヌクレオチド配列の母集団内に存在する分子的形状の並外れた多様性を踏まえるなら、タンパク質および低分子を含めた多彩な分子標的についてもアプタマーを得ることができる。高度な特異性に加えて、それらの標的に対するアプタマーの親和性は極めて高い(例えば、タンパク質に対して、ピコモル〜低濃度のナノモル範囲の親和性)。アプタマーは化学的に安定であり、活性を喪失させることなく煮沸することもでき、凍結させることもできる。アプタマーは合成分子であるため、それらの機能を特定の適用に最適化しうる各種の修飾を施しやすい。例えば、in vivoの適用において用いるために、アプタマーを修飾して、それらの血中の酵素による分解に対する感受性を劇的に低減することができる。加えて、アプタマーを修飾して、それらの生体内分布または血漿中貯留時間を変化させることもできる。
本発明によるポリペプチド(例えば、HAポリペプチドおよび/または非HAポリペプチド)、および/もしくはそれらの特徴的部分、またはそれらをコードする核酸は、任意の利用可能な手段を介して生成させることができる。
HAは、糖タンパク質受容体に結合することにより、細胞表面と相互作用する。HAのHA受容体への結合は主に、HA受容体におけるN結合型グリカンを介する。とりわけ、インフルエンザウイルス粒子の表面におけるHAは、細胞宿主の表面におけるHA受容体と会合するシアル化したグリカンを認識する。認識および結合の後、宿主細胞がウイルス細胞を取り込むと、ウイルスは近傍の細胞に分布するさらに多くのウイルス粒子を複製し、これらを生成させることが可能となる。例示的なHA−グリカン間相互作用の一部の結晶構造が同定されており、これらを表1に提示する:
公知の特定のグリカン間結合タンパク質(GBP)相互作用についての最新の知識を迅速に拡張するため、国際的な研究協力イニシアチブであるConsortium for
Functional Glycomics(CFG; www.functionalglycomics.org)は、新規のグリカンリガンド特異性についてGBPをハイスループットでスクリーニングすることを可能とした複数のグリカン構造を含むグリカンアレイを開発した。グリカンアレイは、一価および多価のグリカンモチーフ(すなわち、ポリアクリルアミド骨格に結合した)の両方を含み、各アレイは、低濃度(10μM)および高濃度(100μM)の264のグリカンおよび各濃度に応じた6カ所のスポットを含む(http://www.functionalglycomics.org/static/consortium/resources/resourcecoreh5.shtmlを参照されたい)。
Ltd、Fancy Road、Poole、Dorset.BH12 4QH UKから得ることができる。
一部の実施形態では、本発明が、HAポリペプチド、またはHAポリペプチドの特徴的部分もしくは生物学的に活性な部分をコードする核酸を提供する。一部の実施形態では、本発明が、HAポリペプチド、またはHAポリペプチドの特徴的部分もしくは生物学的に活性な部分をコードする核酸と相補的な核酸を提供する。
本発明は、本発明による結合剤ポリペプチド(例えば、HAポリペプチド)に対する抗体を提供する。これらは、モノクローナル抗体の場合もあり、ポリクローナル抗体の場合もあり、当業者に公知の各種の技法のうちのいずれかを介して調製することができる(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、HarlowおよびLane、1988年、「Antibodies: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratoryを参照されたい)。例えば、抗体は、モノクローナル抗体の生成を含めた細胞培養法を介して生成させることもでき、組換え抗体の生成を可能とするために、抗体遺伝子の、適切な細菌細胞宿主または哺乳動物細胞宿主へのトランスフェクションを介して生成させることもできる。
本発明は、本発明による結合剤(例えば、HAポリペプチド、LSBA、USBA、UTSBAなど)を動物宿主において調べる方法を提供する。本明細書で用いられる「動物宿主」は、インフルエンザの研究に適する任意の動物モデルを包含する。例えば、本発明に適する動物宿主は、霊長動物、フェレット、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、マウス、ハムスター、ウサギ、およびラットなどの齧歯動物を含めた任意の哺乳動物宿主でありうる。一部の実施形態では、本発明に用いられる動物宿主を、フェレットとする。特に、一部の実施形態では、本発明による結合剤(場合によって、本発明による組成物中の)を投与する前に、動物宿主を、ウイルス曝露または感染に対してナイーブとする。一部の実施形態では、本発明による結合剤の投与前に、または投与と共時的に、動物宿主にウイルスを接種するか、動物宿主をウイルスに感染させるか、または動物宿主を他の形でウイルスに曝露する。当技術分野で公知の任意の方法を介して、本発明を実施するのに用いられる動物宿主にウイルスを接種するか、動物宿主をウイルスに感染させるか、または動物宿主を他の形でウイルスに曝露することができる。一部の実施形態では、動物宿主にウイルスを鼻腔内接種するか、動物宿主をウイルスに鼻腔内感染させるか、または動物宿主をウイルスに鼻腔内曝露することができる。
一部の実施形態では、本発明が、本発明による結合剤(例えば、HAポリペプチド、LSBA、UTBA、UTBSAなど)および/または類縁の実体を包含する医薬組成物を提供する。例えば、一部の実施形態では、本発明による医薬組成物中に、結合剤ポリペプチド(複数可)(例えば、HAポリペプチド)、このようなポリペプチドをコードする核酸、このようなポリペプチドまたは核酸の特徴的な断片または生物学的に活性な断片、このようなポリペプチドまたは断片に結合し、かつ/またはこれと競合する抗体、このようなポリペプチドまたはそれらに結合するグリカンなどと相互作用するかまたはこれと競合する低分子などが包含される。
本発明は、血液、血清/血漿、末梢血単核細胞/末梢血リンパ球(PBMC/PBL)、痰、尿、糞便、咽頭スワブ、皮膚病変スワブ、脳脊髄液、頸管スミア、膿試料、食物マトリックス、ならびに脳、脾臓、および肝臓など、体内の多様な部分に由来する組織が含まれるがこれらに限定されない病理学的試料中に、結合剤(例えば、HAポリペプチド、LSBA、UTBA、UTSBAなど)を検出するため、および特に特定のグリカン結合特徴(例えば、アンブレラグリカン、α2−6シアル化グリカン、長鎖α2−6シアル化グリカンなどへの結合特徴)を伴う結合剤を検出するためのキットを提供する。本発明はまた、土壌、水、および微生物叢が含まれるがこれらに限定されない環境試料中に被験体の結合剤(例えば、HAポリペプチド、LSBA、UTBA、UTSBAなど)を検出するためのキットも提供する。また、列挙されていない他の試料も適用可能でありうる。
広範なスペクトルにわたるヒト結合型HAポリペプチドの分子的決定因子の同定
序説
H5N1トリインフルエンザウイルス(「鳥類インフルエンザ」または「トリインフルエンザ」)とは、感染性および致死性が高い病原体である。1996年以来、3つの大陸にわたり複数のH5N1の大発生が起こり、数百万羽の家禽を死滅させている。その出現以来、このウイルスはまた、ヒトに感染する潜在的可能性も示しており、死亡率は60%を超えている。ヒトは事実上、H5N1ウイルスに対する免疫を有さないが、このウイルスはいまだ、ヒトの間で効率的に感染および伝染することが可能となるようにヒト宿主に適応してはいない。このウイルスは、ヒト集団内に足場を得ることを可能とする突然変異を獲得するであろう。
インフルエンザHAは、単量体が552アミノ酸を含有するホモ三量体のタンパク質である。単量体の各々は、2つのジスルフィド結合した部分である、HA1およびHA2からなる。HA1がグリカン受容体結合部位(RBS)を含むのに対し、HA2はウイルスと細胞膜との融合に関与している。RBSポケットは、HAの95、131、133、136、137、138、145、153、155、156、158、159、183、186、187、189、190、192、193、194、195、196、219、222、224、225、226、227、228位(H3の番号付けを用いる)を伴う。
HAの突然変異体形態を発生させるための戦略を規定した。突然変異Q226LおよびG228S(またはLS突然変異)を、H5N1 HAの複数の遺伝的クレードにわたり導入した。これらの突然変異は、それらのヒトへの適応をもたらした、それぞれ、H2N2 HAおよびH3N2 HAの226位および228位における特徴的なアミノ酸置換に基づく。
したがって、そのRBSを、より近年の遺伝的クレード(A/Indonesia/5/05などの株を包含する)のRBSと類似させるために、本発明者らは、128、133、145、159、193(以下の太字および下線を付した残基)における5カ所のアミノ酸置換を、Viet_1203_04_c1(クレード1株であるA/Viet Nam/1203/04)HAへと導入した。
本発明者らは、H5N1 HAの突然変異体形態を、そのRBSとヒト受容体との間の分子的な接触が、ヒト適応型H2N2 HAとヒト受容体との間の接触を緊密に模倣するように、デザインした。H2N2 HAのRBSの分子組成、およびそれがいかにしてグリカン受容体の特異性を統御するのかについて理解しようとする本発明者らのかつての研究に基づき、本発明者らは、まず、H5N1 HAのRBSの、1957年〜58年型の流行株(A/Albany/6//58またはAlb6_58)に由来する原型的なヒト適応型H2N2 HAのRBSとの詳細な分子的比較を実施した(図17)。H5 HAとAlb6_58 HAとの間のRBSの分子組成の差違を最小化するために、本発明者らは、Viet1203_04_D鋳型(「Viet1203_04_D_H2RBS」;配列番号61)において、131、132、133、135、137、155、188、192、193、221、226、227、および228位における13カ所のアミノ酸置換、ならびに130位における欠失を含む突然変異体を発生させた。H2 HAとH5 HAとの間の包括的な比較に基づき、欠失および置換の組合せを表す、H5N1 HAのRBSにおける突然変異のデザインおよび試験に焦点を絞るのは、本研究が全く初めてである。欠失は、130位において行った。H2N2 HAは、158位におけるグリコシル化は欠くが、突然変異体HAにおけるN158のグリコシル化部位(Viet1203_04_Dのグリコシル化部位)は保持した。したがって、本発明は、前述の突然変異に、158位におけるグリコシル化を失効化させる突然変異が加われば、ヒトへの結合がなおさらに増強されうることの認識を包含する。本発明者らはまた、保存的置換に基づくより少数の突然変異により、この突然変異体の別の変化形(「Viet1203_04_D_H2RBSmin」;配列番号63)もデザインした。
HAおよびヒト適応型H2N2 HAの特徴である高度に特異的な高親和性によるヒト受容体への結合が示された(図19)。本発明は、さらなる突然変異をデザインして、(1)130ループの組成および欠失、(2)192位および193位における荷電残基のスイッチ、(3)158位におけるグリコシル化の関係、ならびにこの関係がいかにして突然変異体のH5N1 HAのヒト受容体への結合親和性を統御するのかを理解しうることの認識を包含する。
例示的なH5N1鋳型ならびに上記の原理および実施例2に示される原理に従いデザインされる例示的な突然変異体H5 HAポリペプチドのアライメントを、図18および以下に提示する。
複数の実験的研究が、H5 HAのヒト受容体特異性の決定因子を同定することを試みている。しかし、これらの研究は、近傍の位置の影響を考慮せずに、RBS部位におけるアミノ酸の置換に直接焦点を当てている。さらに、宿主特異性の可能な決定因子としての挿入または欠失について考慮した先行研究さえ見られない。構造ベースの探索はまた、主に、欠失の構造的効果を、コンピュータによる解析を用いて正確に評価することができないため、H5 HAの重要な決定因子を同定することにも満たない。これに対し、新規の特性を伴うタンパク質を操作することの重要性を認識し、これに配列アライメント法を用いたのは、本発明者らが初めてである。本発明は、近年においてヒトに感染する潜在的可能性を示してきた他のHA亜型(H7、H9など)の宿主特異性の決定因子を同定するのに同様の手法を用いうることの認識を包含する。
野生型のHAポリペプチドの異なるトポロジーのグリカンへの直接的結合の用量反応関係
直接的結合アッセイは、規定されるグリカン構造(例えば、一価構造または多価構造)が、ポリマー骨格を用いることが多い支持体(例えば、スライドガラスまたはウェルプレート)上に提示されるグリカンアレイを典型的に用いる。いわゆる「シーケンシャル」アッセイでは、三量体のHAポリペプチドを、アレイに結合させ、次いで、例えば、標識した(例えば、FITCまたは西洋ワサビペルオキシダーゼで)一次抗体および二次抗体を用いて検出する。「多価」アッセイでは、三量体のHAを、まず、あらかじめ複合体化させたHA1つ当たり12ずつのグリカン結合部位が存在するように、一次抗体および二次抗体と複合体化させ(典型的には、HA:一次抗体:二次抗体の比を4:2:1として)、次いで、アレイと接触させる。アレイにおける異なるグリカンについての相対的親和性について情報が得られるように、結合アッセイは、典型的に、あるHA濃度の範囲にわたり実施する。
例示的なヒト結合H5 HAポリペプチド変異体
一部の実施形態では、HAポリペプチドをH5ポリペプチドとする。一部のこのような実施形態では、本発明によるH5ポリペプチドが、アンブレラグリカンへの結合(例えば、高度な親和性および/または高度な特異的結合)を示す。一部のこのような実施形態では、本発明によるH5ポリペプチドが、同等な(アンブレラトポロジーへの結合と)高親和性によるコーントポロジーグリカンへの結合またはコーントポロジーグリカンへの結合の低減(例えば、アンブレラトポロジーグリカンと比べた低親和性および/または低特異性)を示す。
HAポリペプチド変異体が、158位に対応する部位に結合したグリカンの同一性および/または構造に影響を及ぼし、かつ/またはこれを変化させる配列置換を有する。一部の実施形態では、このような配列置換は、158位に対応する部位における突然変異、例えば、Asn158Xaa[XaaはAsn以外の任意のアミノ酸である]である。一部の実施形態では、このような配列置換は、160位に対応する部位における突然変異、例えば、Thr160Xaa[XaaはAsn以外の任意のアミノ酸である]である。一部の実施形態では、このような配列置換が、突然変異Thr160Alaを含む。一部の実施形態では、158位に対応する部位におけるグリコシル化を低減するか、消失させるか、これに影響を及ぼすか、またはこれを変化させる配列置換により、H5 HAポリペプチドを、H2 HAポリペプチドに酷似させる(例えば、構造的にも機能的にも酷似させる)ことができる。一部の実施形態では、160位に対応する部位における突然変異(例えば、Thr160AlaなどのThr160Xaa)により、H5 HAポリペプチドを、H2 HAポリペプチドに酷似させる(例えば、構造的にも機能的にも酷似させる)ことができる。
HAポリペプチド変異体が、残基227、131、132、133、および130のうちの任意の1個、2個、3個、4個、または5個に対応する位置において、野生型の親HAと比べて1またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、H5 HAポリペプチド変異体が、(1)130、および(2)残基227、131、132、および133のうちの1またはそれより多くに対応する位置において、野生型の親HAと比べて1またはそれより多くの配列置換を有する。一部の実施形態では、H5 HAポリペプチド変異体が、(1)130、および(2)残基227、131、132、および133のうちの任意の1個、2個、3個、または4個に対応する位置において、野生型の親HAと比べて1またはそれより多くの配列置換を有する。
HAポリペプチド変異体(例えば、ヒト適応型変異体)が、残基192に対応する位置において塩基性残基(例えば、LysまたはArg)を有する。一部の実施形態では、H5 HAポリペプチド変異体(例えば、ヒト適応型変異体)が、残基192に対応する位置において塩基性残基(例えば、LysまたはArg)を有する。さらに別の例を挙げれば、一部の実施形態では、本発明によるH5 HAポリペプチドが、残基193に対応する位置において塩基性残基(例えば、LysまたはArg)を有し、H5 HAポリペプチド変異体(例えば、ヒト適応型変異体)が、残基193に対応する位置において中性残基または酸性残基を有する。一部の実施形態では、H5 HAポリペプチド変異体(例えば、ヒト適応型変異体)が、残基193に対応する位置において中性残基または酸性残基を有する。一部の実施形態では、H5 HAポリペプチド変異体(例えば、ヒト適応型変異体)が、残基193に対応する位置においてThr、Ala、Met、またはValを有する。
・Δ130+131、132、135、188、192、および221に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ130+133、137、155、193、226、227、および228に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ130+131、132、133、135、137、155、158、160、188、192、193、221、226、227、および228に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ130+131、133、137、155、188、192、193、226、227、および228に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ130+131、133、137、155、188、192、193、226、および228に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ130+131、133、137、155、159、160、188、192、193、226、227、および228に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ130+131、133、137、155、159、160、188、192、193、226、および228に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ130+137、188、192、193、226、228、131、132、133、221、および227に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ130+131、132、133、221、および227に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ130+137、188、192、193、226、および228に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ130+137、188、192、193、226、227、228、131、132、および133に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
・Δ130+227、131、132、および133に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せ
X=任意のアミノ酸(上記で別段に指定しない限り)とし、かつ/またはX=欠失アミノ酸である。これらの位置の番号付けは、H3 HAの番号付けに対応する]
に示されるエレメント(これらの位置の番号付けは、H3 HAの番号付けに対応する)を包含する、H5 HAポリペプチド(例えば、H5 HAポリペプチド変異体、操作されたH5 HAポリペプチド、および/または操作されたH5 HAポリペプチド変異体)を提供する。
HAポリペプチド変異体を含めた)が、Δ130、L226、A160、ならびに131、132、133、135、137、155、158、188、192、193、221、227、および228に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるH5 HAポリペプチド変異体(H5 HAポリペプチド変異体を含めた)が、Δ130、S228、A160、ならびに131、132、133、135、137、155、158、188、192、193、221、および227に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。一部の実施形態では、本発明によるH5 HAポリペプチド変異体(H5 HAポリペプチド変異体を含めた)が、Δ130、L226、S228、ならびに131、132、133、135、137、155、158、160、188、192、193、221、および227に対応する位置における突然変異のうちの任意の可能な組合せを包含する配列を有する。
ヒト上気道組織におけるグリカンの多様性
レクチン結合研究により、上気道組織におけるα2−3グリカンおよびα2−6グリカンの分布の多様性が示された。染色研究により、気管上皮の先端側におけるN結合型グリカン(絨毛細胞)およびO結合型グリカン(杯細胞における)の両方の一部としてのα2−6シアル化グリカンの分布が優勢であることが示される(図12)。他方、気管組織の内部領域は主に、N結合型グリカンにおいて分布するα2−3グリカンを含む。
fluor 546ストレプトアビジン(0.5%のTween−20を伴うPBS中に2μg/ml)と共に、1時間にわたりインキュベートした。スライドをTBSTで洗浄し、共焦点顕微鏡(Zeiss LSM510レーザー走査共焦点顕微鏡)下で観察した。全てのインキュベーションは、室温(RT)で実施した。
H5 HAポリペプチド変異体のヒト肺組織への結合
ホルマリンで固定し、パラフィンで包埋したヒト肺組織切片およびヒト気管組織切片(それぞれ、例えば、US Biomax,Inc.およびUS Biologicalから購入した)への結合が提示される。組織切片は、脱パラフィン化し、再水和させ、PBS中に1%のBSAと共に30分間にわたりインキュベートして、非特異的結合を防止した。H5 HAポリペプチドは、それぞれ4:2:1の比で、一次抗体(マウス抗6×Hisタグ抗体)および二次抗体(Alexa−fluor 488ヤギ抗マウス抗体)と共に、氷上で20分間にわたりあらかじめ複合体化させた。形成された複合体は、1%のBSA−PBSにより40、20または10μg/mlの最終HA濃度へと希釈する。次いで、組織切片を、HA−抗体複合体と共にRTで3時間にわたりインキュベートする。切片は、ヨウ化プロピジウム(Invitrogen;TBST中に1:100)で対比染色し、十分に洗浄し、次いで、共焦点顕微鏡(Zeiss LSM510レーザー走査共焦点顕微鏡)下で観察する。
動物宿主におけるH5 HAポリペプチドの試験
本明細書で記載する通り、本発明は、ウイルスの伝染について研究するために動物宿主(例えば、フェレット)を用いることにより、ヒトへのウイルス伝染について信頼できる指標がもたらされうることの認識を包含する。同様に、本発明は、ウイルスの伝染について研究するために本発明による結合剤(例えば、HAポリペプチド)により処置される動物宿主(例えば、フェレット)を用いることにより、ヒト宿主におけるウイルスの防止または処置のための本発明によるこのような結合剤の有効性について信頼できる指標がもたらされうることの認識も包含する。
ウイルス伝染アッセイを、本発明による結合剤の存在下または非存在下において用いて、適切な動物モデルにおけるウイルス伝染を決定する。例えば、動物宿主、例えば、フェレットを、動物間の直接的および間接的な接触を防止する、隣接するケージ内で飼育する。しかし、これらの飼育条件は、空気を介するインフルエンザウイルスの拡散を可能とする。動物のうちの第1の部分に、当技術分野で公知の方法(例えば、鼻腔内投与、筋肉内投与、または本明細書で記載される投与方式のうちのいずれか)を介して有効量のウイルスを接種する(「接種された動物」)。次いで、1、2、3日以上後で、ナイーブの動物を、接種された動物と隣接するケージに導入することができる。
結合剤および/または結合剤を含むワクチン組成物をフェレットに0日目に筋肉内投与した後、21日目に追加投与を実施する。各動物に由来する血液を、0、14、21、および35日目に回収する。回収された血清を、in vitroにおいて、それがウイルスの凝集を阻害し、ウイルス感染を中和する能力について検討した。
HAIの滴定は、96−ウェルのv型底プレート(Corning)内で実施する。血清を2倍に系列希釈し、200μlの全容量中に血球凝集用量の4倍のA型インフルエンザウイルスへと添加する。次に、2%の(vol/vol)赤血球溶液25μlを添加する。血清、ウイルス、および赤血球を静かに混合し、30分間にわたりインキュベートした後にアッセイを読み取る。血球凝集用量の4倍のウイルスを阻害する最大の抗体希釈率の逆数としての力価を記録する。
血清の系列希釈液を、ウイルスと混合し、室温で30分間にわたりインキュベートし、次いで、MDCK細胞と共に37℃で1時間にわたりインキュベートする。次いで、細胞を無血清培地で2回にわたり洗浄し、次いで、トリプシンを伴うかまたは伴わない新鮮な培地を添加する。ウイルスの増殖は、細胞変性効果を介して評価する。データは、中和を引き起こす血清の最大の希釈率の逆数として作成する。
ワクチン接種されたフェレットを、同種および異種の野生型および突然変異体のH5N1株で鼻腔内感作する。感作後1、3、および5日目に、フェレットから鼻腔内洗浄液を採取する。MDCK細胞におけるウイルスを滴定して、気道内に放出されるウイルスを決定する。
H5N1血球凝集素の近年の単離物における2カ所のアミノ酸変化は、そのヒト受容体への優先性をスイッチするのに十分である
序説
高度に病原性のH5N1は、2003年以来、ヒトにおける複数の局在化された大発生を開始して、地球規模の憂慮をもたらしている(これらのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる、Heumannら、2010年、Cell Res、20巻:51頁;Guanら、2009年、Rev Sci Tech、28巻:39頁)。既存のH5N1株はエアロゾル伝染が不可能であり、むしろ、主に感染した動物との直接的な接触を介して伝染する。しかし、感染と関連する罹患率および死亡率の高さ(約60%)、ならびに公知のインフルエンザ亜型(H5N1を含めた)が突然変異または遺伝子再集合を介して表現型形質を獲得する能力により、H5N1株もエアロゾル伝染性を獲得しうることが示唆される(参照により本明細書に組み込まれる、Yenら、2009年、Curr Top Microbiol Immunol、333巻:3頁)。このようなウイルスが重度の感染を引き起こす潜在的可能性と共に、ヒト集団がH5N1に対して事前に免疫を有さないという事実により、このような株が発生すれば、将来において流行または大流行が生じうることが示唆される(参照により本明細書に組み込まれる、Subbaraoら、2007年、PLoS pathogens、3巻:e40頁)。
インフルエンザHAは、単量体が552アミノ酸を含有するホモ三量体のタンパク質である。単量体の各々は、2つのジスルフィド結合した部分である、HA1およびHA2からなる。HA1がグリカン受容体結合部位(RBS)を含むのに対し、HA2はウイルスと細胞膜との融合に関与している。RBSポケットは、HAの95、131、133、136、137、138、145、153、155、156、158、159、183、186、187、189、190、192、193、194、195、196、219、222、224、225、226、227、228位(H3の番号付けを用いる)を伴う。
顕著な特徴であるLS残基に適切に対応するのに必要とされる特定の構造的特徴を規定したのは、本発明者らが初めてである。加えて、本発明者らは、現在広く生じている特定のH5 HAポリペプチドが、H5 HAのヒト受容体への優先性をスイッチし、これにより、それらのヒトへの適応をもたらすのに、2カ所のアミノ酸変化、顕著な特徴であるLSを要求するのみであることの洞察も提示する。本発明に由来する情報を用いて、本発明者らは、LS変化だけを組み込むことにより受容体の特異性のスイッチ切換えを施しやすい、適切なH5 HA配列(全H5N1 HAのうちの小規模な代表的プールに由来する配列ではあるが)を合理的に選択した。これらの最新型のH5 HAポリペプチドの1つの特徴的特性は、それらが、特徴1、2、および4(図27)を獲得するように天然で進化したことである。特徴1および4を獲得した配列は、NCBIデータベースにおける2277の非冗長H5N1 HA配列のうちの6%に過ぎないが、しかし、これが、2009年および2010年に単離されたH5N1株のうちの約45%を表す。H5N1 HAについてのさらなる系統解析により、天然で獲得した特徴1および4は、クレード2.2.1に属することが明らかとなる。これまでのところ、特徴1の発生は、クレード2.2.1に限られると考えられるが、しかし、特徴4の存在がクレード2.2.1に制約されるわけではない。クレード2.2.1株は、既に旧型のヒト単離物(Viet03_04など)から大幅に分岐しており、これらの旧来の株よりヒトに対して緊密に適応していることが極めて重要である。クレード2.2.1に属する、報告されたヒトH5N1単離物の全ては、エジプトおよびイスラエルに由来する。したがって、クレード2.2.1株の進化をモニタリングすることが重要である。
HAのクローニング、バキュロウイルスによる合成、発現、および精製
WTのH5 HA配列および突然変異体のH5 HA配列を、昆虫細胞による発現のためにコドン最適化し、DNA2.0(Menlo Park、CA)により合成した。次いで、合成された遺伝子を、pAcGP67Aプラスミドへとサブクローニングし、製造元による指示書に従い、Baculogoldシステム(BD Biosciences、San Jose、CA)を用いて、バキュロウイルスを創出した。次いで、BD Baculogold Max−XP SFM(BD Biosciences、San Jose、CA)により培養したSf9細胞の懸濁液培養物に感染させるのに、組換えバキュロウイルスを用いた。感染をモニタリングし、感染の3〜4日後に条件付け培地を採取した。ニッケル親和性クロマトグラフィー(HisTrap HPカラム、GE Healthcare、Piscataway、NJ)を用いて、採取した条件付け培地から可溶性のHAを精製した。HAを含有する溶出画分をプールし、100K MWCOスピンカラム(Millipore、Billerica、MA)を用いて、pH8.0の1倍濃度PBS(Gibco)へと濃縮および緩衝液交換した。精製されたタンパク質は、BCA法(Pierce)を用いて定量化した。
パラフィン包埋したヒト気管(US Biological)組織切片を、PBS中に1%のBSAで30分間にわたり脱パラフィン化し、再水和し、インキュベートして、非特異的結合を防止した。HAを、氷上で20分間にわたり、一次抗体(マウス抗6×Hisタグ、Abcam)および二次抗体(Alexa fluor 488ヤギ抗マウス抗体、Invitrogen)と、それぞれ、4:2:1のモル比であらかじめ複合体化させた。1%のBSA−PBS中であらかじめ複合体化させたHAを希釈することにより、異なるHA濃度にわたり組織への結合を実施した。次いで、組織切片を、RTで3時間にわたり、HA−抗体複合体と共にインキュベートした。組織切片は、ヨウ化プロピジウム(Invitrogen;TBST中で1:100)で対比染色した。組織切片をマウントし、次いで共焦点顕微鏡(Zeiss LSM510レーザー走査共焦点顕微鏡)を用いて造影した。
多価HA−グリカン間相互作用を探索するため、ビオチニル化した代表的なα2→3シアル化グリカンおよびα2→6シアル化グリカンを含むストレプトアビジンプレートアレイを、既に記載した通りに用いた。3’SLN、3’SLN−LN、3’SLN−LN−LNは、代表的なトリ受容体である。6’SLNおよび6’SLN−LNは、代表的なヒト受容体である。LNは、ラクトサミン(Galβ1−4GlcNAc)に対応し、3’SLNおよび6’SLNは、それぞれ、LNに結合したNeu5Acα2−3およびNeu5Acα2−6に対応する(図28)。ビオチニル化グリカンは、それらのリソースリクエストプログラムを介して、Consortium of Functional Glycomicsから得た。ストレプトアビジンでコーティングした高結合能の384ウェルプレート(Pierce)で、ウェルを2.4μMのビオチニル化グリカン50μlと共に、4℃で一晩にわたりインキュベートすることにより、各ウェルの容量いっぱいまで投入した。過剰なグリカンは、PBSによる十分な洗浄を介して除去した。三量体のHA単位は、3つのHA単量体(および、したがって、各単量体につき1つずつである3つのRBS)を含む。ストレプトアビジンプレートアレイのウェル内のビオチニル化グリカンの空間的配置が好適なのは、三量体のHA単位中の3つのHA単量体のうちのただ1つへの結合である。したがって、HA−グリカン間相互作用における多価性を特異的に増強するために、組換えHAタンパク質を、4:2:1(HA:一次抗体:二次抗体)のモル比で一次抗体および二次抗体とあらかじめ複合体化させた。プレ複合体中で4つの三量体のHA単位が全てのHAについて同一な配置により、それらのグリカン結合親和性の間の比較が可能となる。適量のヒスチジンタグづけしたHAタンパク質、一次抗体(Abcam製のマウス抗6×HisタグIgG)、および二次抗体(Santacruz Biotechnology製のHRPコンジュゲートヤギ抗マウスIgG)を、4:2:1の比で含有する原液を、氷上で20分間にわたりインキュベートした。適量のあらかじめ複合体化させたHA原液を、PBS中に1%のBSAで250μlへと希釈した。この50μlのあらかじめ複合体化させたHAを、グリカンでコーティングしたウェルの各々へと添加し、室温で3時間にわたりインキュベートした後、PBSおよびPBST(1倍濃度のPBS+0.05%のTween−20)による洗浄ステップを実施した。製造元による指示書に従い、Amplex Red Peroxidase Assayキット(Invitrogen、CA)を用いて、HRP活性に基づき、結合シグナルを決定した。
当業者は、日常的な実験だけを用いて、本明細書で記載される本発明の実施形態との多くの同等物を認識するかまたはこれらを確認することが可能である。本発明の範囲は、上記の「説明」に限定されることを意図するものではなく、以下の特許請求の範囲に示される通りである。
Claims (8)
- (i)A/Vietnam/1203/04(配列番号50)である基準のH5 HAポリペプチド配列と少なくとも95%の同一性を示し;かつ
(ii)前記基準のH5 HAポリペプチド配列と比較して置換Q226LおよびG228Sを含み;かつ
(iii)前記基準のH5 HAポリペプチド配列と比較して少なくとも1つの欠失を含み、前記欠失が、128、129、130、131、132、133、134、135、136、およびこれらの組合せからなる群から選択される1またはそれより多い位置にある、
アミノ酸配列を有するH5 HAポリペプチドを含む結合剤
を含む医薬組成物であって、位置番号付けは、カノニカルのH3番号付けシステムに基づく、医薬組成物。 - 前記結合剤のアミノ酸配列が、前記基準のH5 HAポリペプチド配列と比較して、残基137、155、188、192、193、221、227、およびこれらの組合せからなる群から選択される残基のうちの1またはそれより多くで、少なくとも1つのさらなるアミノ酸置換をさらに含む、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記結合剤が、アンブレラトポロジーグリカンとHAポリペプチドとの間でのグリカン−HAポリペプチド相互作用と競合する、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記H5 HAポリペプチドが、アミノ酸1〜55に対応する領域にわたり、前記基準のH5 HAと少なくとも95%の同一性を示すアミノ酸配列を有するが、
(i)前記基準のHAのアミノ酸配列と、残基192、193、およびこれらの組合せからなる群から選択される1またはそれより多くの残基が異なるか、あるいは
(ii)前記基準のHAのアミノ酸配列と、残基158または160からなる群から選択される1またはそれより多くの残基が異なる、請求項1に記載の医薬組成物。 - 前記結合剤が、アンブレラトポロジーグリカンに、
(i)同等の条件下でヒトの感染を媒介する野生型のHAについて観察される親和性の少なくとも50%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも100%の親和性で結合するか、または
(ii)コーントポロジーグリカンに結合するより強力に結合する、請求項1に記載の医薬組成物。 - 前記結合剤が、アンブレラトポロジーグリカン対コーントポロジーグリカンについて少なくとも2、少なくとも5、または少なくとも10の相対的親和性を示す、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記相互作用が、前記HAポリペプチドと、ヒト上気道上皮細胞、気管支、気管、または肺深部において見出される受容体との間で生じる、請求項1に記載の医薬組成物。
- H5インフルエンザウイルスを予防および/または処置する際にワクチンとして使用するための、請求項1に記載の医薬組成物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US38963910P | 2010-10-04 | 2010-10-04 | |
US61/389,639 | 2010-10-04 | ||
PCT/US2011/054831 WO2012047941A2 (en) | 2010-10-04 | 2011-10-04 | Hemagglutinin polypeptides, and reagents and methods relating thereto |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016030091A Division JP6143902B2 (ja) | 2010-10-04 | 2016-02-19 | 血球凝集素ポリペプチド、ならびにそれに関連する試薬および方法 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013543499A JP2013543499A (ja) | 2013-12-05 |
JP2013543499A5 JP2013543499A5 (ja) | 2014-11-20 |
JP6029586B2 true JP6029586B2 (ja) | 2016-11-24 |
Family
ID=44860519
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013531966A Active JP6029586B2 (ja) | 2010-10-04 | 2011-10-04 | 血球凝集素ポリペプチド、ならびにそれに関連する試薬および方法 |
JP2016030091A Active JP6143902B2 (ja) | 2010-10-04 | 2016-02-19 | 血球凝集素ポリペプチド、ならびにそれに関連する試薬および方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016030091A Active JP6143902B2 (ja) | 2010-10-04 | 2016-02-19 | 血球凝集素ポリペプチド、ならびにそれに関連する試薬および方法 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US10226527B2 (ja) |
EP (1) | EP2624864B1 (ja) |
JP (2) | JP6029586B2 (ja) |
CN (1) | CN103328002B (ja) |
AU (1) | AU2011312178B2 (ja) |
BR (1) | BR112013007946B1 (ja) |
CA (1) | CA2813078A1 (ja) |
RU (1) | RU2663718C2 (ja) |
SG (2) | SG10201709806VA (ja) |
WO (1) | WO2012047941A2 (ja) |
Families Citing this family (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10226527B2 (en) | 2010-10-04 | 2019-03-12 | Massachusetts Institute Of Technology | Hemagglutinin polypeptides, and reagents and methods relating thereto |
AR083533A1 (es) * | 2010-10-22 | 2013-03-06 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Proteinas de hemaglutinina 5 (h5) para el tratamiento y prevencion de las infecciones de gripe |
US11155581B2 (en) | 2011-09-30 | 2021-10-26 | Medicago Inc. | Increasing virus-like particle yield in plants |
US11390878B2 (en) | 2011-09-30 | 2022-07-19 | Medicago Inc. | Increasing protein yield in plants |
EP3492101A3 (en) | 2012-05-10 | 2019-10-23 | Massachusetts Institute Of Technology | Agents for influenza neutralization |
US9969794B2 (en) | 2012-05-10 | 2018-05-15 | Visterra, Inc. | HA binding agents |
SG11201505744XA (en) * | 2013-02-07 | 2015-08-28 | Massachusetts Inst Technology | Human adaptation of h5 influenza |
US10022434B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-07-17 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Influenza nucleic acid molecules and vaccines made therefrom |
CN105247059B (zh) * | 2013-03-28 | 2021-07-06 | 莫迪卡戈公司 | 植物中流感样病毒颗粒的产生 |
BR112016015875A2 (pt) | 2014-01-10 | 2017-09-19 | Medicago Inc | Elementos intensificadores de cpmv |
US10548965B2 (en) | 2014-12-19 | 2020-02-04 | Oregon Health & Science University | Synergistic co-administration of computationally optimized broadly reactive antigens for human and avian H5N1 influenza |
WO2017083627A1 (en) | 2015-11-13 | 2017-05-18 | Visterra, Inc. | Compositions and methods for treating and preventing influenza |
AU2020248404A1 (en) | 2019-03-25 | 2021-09-30 | Visterra, Inc. | Compositions and methods for treating and preventing influenza |
CN110172452B (zh) * | 2019-05-21 | 2021-07-06 | 广州医科大学 | 一种高致病性h7n9禽流感病毒、疫苗、检测试剂以及病毒、疫苗的制备方法 |
JP2022038604A (ja) | 2020-08-27 | 2022-03-10 | 株式会社Subaru | 車両の制御装置 |
Family Cites Families (63)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4166452A (en) | 1976-05-03 | 1979-09-04 | Generales Constantine D J Jr | Apparatus for testing human responses to stimuli |
US4270537A (en) | 1979-11-19 | 1981-06-02 | Romaine Richard A | Automatic hypodermic syringe |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US4692411A (en) | 1983-09-06 | 1987-09-08 | Ghose Rabindra N | Separation of specific biological cells by a biochemical filter |
US4596556A (en) | 1985-03-25 | 1986-06-24 | Bioject, Inc. | Hypodermic injection apparatus |
CA1283827C (en) | 1986-12-18 | 1991-05-07 | Giorgio Cirelli | Appliance for injection of liquid formulations |
GB8704027D0 (en) | 1987-02-20 | 1987-03-25 | Owen Mumford Ltd | Syringe needle combination |
US4941880A (en) | 1987-06-19 | 1990-07-17 | Bioject, Inc. | Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly |
US4790824A (en) | 1987-06-19 | 1988-12-13 | Bioject, Inc. | Non-invasive hypodermic injection device |
US4940460A (en) | 1987-06-19 | 1990-07-10 | Bioject, Inc. | Patient-fillable and non-invasive hypodermic injection device assembly |
US5698390A (en) | 1987-11-18 | 1997-12-16 | Chiron Corporation | Hepatitis C immunoassays |
US5339163A (en) | 1988-03-16 | 1994-08-16 | Canon Kabushiki Kaisha | Automatic exposure control device using plural image plane detection areas |
FR2638359A1 (fr) | 1988-11-03 | 1990-05-04 | Tino Dalto | Guide de seringue avec reglage de la profondeur de penetration de l'aiguille dans la peau |
US5064413A (en) | 1989-11-09 | 1991-11-12 | Bioject, Inc. | Needleless hypodermic injection device |
US5312335A (en) | 1989-11-09 | 1994-05-17 | Bioject Inc. | Needleless hypodermic injection device |
SG46445A1 (en) | 1990-01-26 | 1998-02-20 | Immunomedics Inc | Vaccines against cancer and infectious diseases |
US5190521A (en) | 1990-08-22 | 1993-03-02 | Tecnol Medical Products, Inc. | Apparatus and method for raising a skin wheal and anesthetizing skin |
US5527288A (en) | 1990-12-13 | 1996-06-18 | Elan Medical Technologies Limited | Intradermal drug delivery device and method for intradermal delivery of drugs |
GB9118204D0 (en) | 1991-08-23 | 1991-10-09 | Weston Terence E | Needle-less injector |
SE9102652D0 (sv) | 1991-09-13 | 1991-09-13 | Kabi Pharmacia Ab | Injection needle arrangement |
US5328483A (en) | 1992-02-27 | 1994-07-12 | Jacoby Richard M | Intradermal injection device with medication and needle guard |
US5383851A (en) | 1992-07-24 | 1995-01-24 | Bioject Inc. | Needleless hypodermic injection device |
US5569189A (en) | 1992-09-28 | 1996-10-29 | Equidyne Systems, Inc. | hypodermic jet injector |
US5334144A (en) | 1992-10-30 | 1994-08-02 | Becton, Dickinson And Company | Single use disposable needleless injector |
US5500161A (en) | 1993-09-21 | 1996-03-19 | Massachusetts Institute Of Technology And Virus Research Institute | Method for making hydrophobic polymeric microparticles |
WO1995024176A1 (en) | 1994-03-07 | 1995-09-14 | Bioject, Inc. | Ampule filling device |
US5466220A (en) | 1994-03-08 | 1995-11-14 | Bioject, Inc. | Drug vial mixing and transfer device |
US5599302A (en) | 1995-01-09 | 1997-02-04 | Medi-Ject Corporation | Medical injection system and method, gas spring thereof and launching device using gas spring |
US5730723A (en) | 1995-10-10 | 1998-03-24 | Visionary Medical Products Corporation, Inc. | Gas pressured needle-less injection device and method |
US5893397A (en) | 1996-01-12 | 1999-04-13 | Bioject Inc. | Medication vial/syringe liquid-transfer apparatus |
GB9607549D0 (en) | 1996-04-11 | 1996-06-12 | Weston Medical Ltd | Spring-powered dispensing device |
US5993412A (en) | 1997-05-19 | 1999-11-30 | Bioject, Inc. | Injection apparatus |
IT1298087B1 (it) | 1998-01-08 | 1999-12-20 | Fiderm S R L | Dispositivo per il controllo della profondita' di penetrazione di un ago, in particolare applicabile ad una siringa per iniezioni |
WO2002000885A2 (en) | 2000-06-23 | 2002-01-03 | American Cyanamid Company | Assembly of wild-type and chimeric influenza virus-like particles (vlps) |
US8592197B2 (en) | 2003-07-11 | 2013-11-26 | Novavax, Inc. | Functional influenza virus-like particles (VLPs) |
WO2005116260A2 (en) | 2004-05-25 | 2005-12-08 | Medimmune Vaccines, Inc. | Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants |
WO2006108226A1 (en) | 2005-04-12 | 2006-10-19 | The University Of Queensland | Vaccine delivery system |
CA2627105A1 (en) | 2005-10-26 | 2007-05-03 | Protelix, Inc. | Influenza combinatorial antigen vaccine |
JP5198290B2 (ja) * | 2006-02-02 | 2013-05-15 | グローブイミューン,インコーポレイテッド | 免疫反応を誘発する酵母ベースワクチン |
US8778353B2 (en) | 2006-05-01 | 2014-07-15 | Technovax, Inc. | Influenza virus-like particle (VLP) compositions |
US9101578B2 (en) | 2006-05-01 | 2015-08-11 | Technovax, Inc. | Polyvalent influenza virus-like particle (VLP) compositions |
EP1998814A4 (en) | 2006-05-11 | 2010-06-16 | Novavax Inc | NEW VACCINES AGAINST INFLUENZA M2 |
US20100143406A1 (en) | 2006-06-30 | 2010-06-10 | Gale Smith | Methods of enhancing protein incorporation into virus like particles |
US9439959B2 (en) | 2006-07-27 | 2016-09-13 | Takeda Vaccines, Inc. | Chimeric influenza virus-like particles |
AU2007345682B2 (en) | 2006-07-27 | 2013-07-18 | Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. | Chimeric virus-like particles |
CA2659267C (en) * | 2006-08-09 | 2016-12-13 | Medimmune, Llc | Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants |
CN101553502A (zh) | 2006-08-14 | 2009-10-07 | 麻省理工学院 | 血球凝集素多肽和其相关试剂和方法 |
US20090269342A1 (en) | 2006-08-14 | 2009-10-29 | Massachusetts Institute Of Technology | Hemagglutinin Polypeptides, and Reagents and Methods Relating Thereto |
EP2052340A4 (en) | 2006-08-14 | 2010-11-17 | Massachusetts Inst Technology | SYSTEM FOR EXPLORING DATA ON GLYCANES |
US8512711B2 (en) | 2006-10-04 | 2013-08-20 | The University Of Queensland | VLP based vaccine delivery system |
EP2069393A2 (en) * | 2006-10-10 | 2009-06-17 | The Government of the United States of America as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services | Avian influenza vaccine |
US8202967B2 (en) | 2006-10-27 | 2012-06-19 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | H5 proteins, nucleic acid molecules and vectors encoding for those, and their medicinal use |
US20080233150A1 (en) | 2006-11-16 | 2008-09-25 | Gale Smith | Respiratory syncytial virus-virus like particle (vlps) |
BRPI0806336A2 (pt) | 2006-12-29 | 2011-09-06 | Inst Pasteur Of Shanghai | lentivìrus pseudotipado com hemaglutinina da gripe e métodos de uso |
WO2008148104A1 (en) | 2007-05-25 | 2008-12-04 | Novavax, Inc. | Novel vlps derived from cells that do not express a viral matrix or core protein |
CA2615372A1 (en) | 2007-07-13 | 2009-01-13 | Marc-Andre D'aoust | Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin |
SI2540312T1 (sl) | 2007-07-19 | 2015-08-31 | Novavax, Inc. | Ptičji influenčni himerni VLP |
EP2238146A4 (en) | 2008-01-03 | 2012-03-21 | Massachusetts Inst Technology | HEMAGGLUTININ POLYPEPTIDES, REAGENTS, AND METHODS RELATING THERETO |
JP2011508785A (ja) | 2008-01-03 | 2011-03-17 | マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー | デコイインフルエンザ処置 |
DK2318530T3 (en) | 2008-07-18 | 2016-10-03 | Medicago Inc | Ny epitope to immunization against influenza |
WO2011003100A2 (en) | 2009-07-02 | 2011-01-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Compositions and methods for diagnosing and/or treating influenza infection |
US10226527B2 (en) | 2010-10-04 | 2019-03-12 | Massachusetts Institute Of Technology | Hemagglutinin polypeptides, and reagents and methods relating thereto |
SG11201505744XA (en) | 2013-02-07 | 2015-08-28 | Massachusetts Inst Technology | Human adaptation of h5 influenza |
-
2011
- 2011-10-04 US US13/253,060 patent/US10226527B2/en active Active
- 2011-10-04 SG SG10201709806VA patent/SG10201709806VA/en unknown
- 2011-10-04 CN CN201180057213.2A patent/CN103328002B/zh active Active
- 2011-10-04 SG SG2013024617A patent/SG189236A1/en unknown
- 2011-10-04 BR BR112013007946-0A patent/BR112013007946B1/pt active IP Right Grant
- 2011-10-04 EP EP11774134.8A patent/EP2624864B1/en active Active
- 2011-10-04 JP JP2013531966A patent/JP6029586B2/ja active Active
- 2011-10-04 WO PCT/US2011/054831 patent/WO2012047941A2/en active Application Filing
- 2011-10-04 AU AU2011312178A patent/AU2011312178B2/en active Active
- 2011-10-04 CA CA2813078A patent/CA2813078A1/en active Pending
- 2011-10-04 RU RU2013114424A patent/RU2663718C2/ru active
-
2016
- 2016-02-19 JP JP2016030091A patent/JP6143902B2/ja active Active
-
2019
- 2019-01-17 US US16/250,920 patent/US20190142931A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2012047941A2 (en) | 2012-04-12 |
RU2663718C2 (ru) | 2018-08-08 |
CA2813078A1 (en) | 2012-04-12 |
SG189236A1 (en) | 2013-05-31 |
JP2016094483A (ja) | 2016-05-26 |
WO2012047941A3 (en) | 2013-04-11 |
US20120213819A1 (en) | 2012-08-23 |
BR112013007946A2 (pt) | 2018-04-17 |
SG10201709806VA (en) | 2017-12-28 |
BR112013007946B1 (pt) | 2022-07-12 |
EP2624864A2 (en) | 2013-08-14 |
JP6143902B2 (ja) | 2017-06-07 |
US20190142931A1 (en) | 2019-05-16 |
AU2011312178A1 (en) | 2013-05-02 |
RU2013114424A (ru) | 2014-11-20 |
CN103328002B (zh) | 2020-01-14 |
JP2013543499A (ja) | 2013-12-05 |
AU2011312178B2 (en) | 2016-05-12 |
US10226527B2 (en) | 2019-03-12 |
CN103328002A (zh) | 2013-09-25 |
EP2624864B1 (en) | 2017-12-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6143902B2 (ja) | 血球凝集素ポリペプチド、ならびにそれに関連する試薬および方法 | |
US9709567B2 (en) | Compositions and methods for diagnosing and/or treating influenza infection | |
KR20090050056A (ko) | 헤마글루티닌 폴리펩티드 및 시약 그리고 방법 | |
JP2010500880A5 (ja) | ||
US9745352B2 (en) | Influenza treatment and/or characterization, human-adapted HA polypeptides; vaccines | |
US20090269342A1 (en) | Hemagglutinin Polypeptides, and Reagents and Methods Relating Thereto | |
JP6518597B2 (ja) | H5インフルエンザのヒトへの適応 | |
CA2711334A1 (en) | Hemagglutinin polypeptides, and reagents and methods relating thereto |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140930 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20140930 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150820 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20151119 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20151218 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20160119 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160219 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20160219 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160330 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20160621 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160829 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160926 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20161018 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6029586 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |