BRPI0806336A2 - lentivìrus pseudotipado com hemaglutinina da gripe e métodos de uso - Google Patents

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Abstract

LENTIVìRUS PSEUDOTIPADO COM HEMAGLUTININA DA GRIPE E MéTODOS DE USO. A presente invenção refere-se a pseudotipagem altamente efetiva de vetor lentivirus com constructos de gene de acondicionamento de HA, NA e M2 da gripe nas razões corretas, O vetor lentivirus pseudotipado com HA da gripe, especialmente pseudotipado com H5 e neuraminidase. Métodos de indução de respostas imunes a antígenos da gripe ou para transduçáo de genes em células as quais antígeno da gripe se liga usando-se tais vetores lentivírus. Métodos para classificação de fármacos que inibem infecção de gripe usando-se lentivírus pseudotipado com HA.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "LENTIVÍRUS PSEUDOTIPADO COM HEMAGLUTININA DA GRIPE E MÉTODOS DE USO".
A presente invenção refere-se a lentivírus pseudotipados com proteínas virais de outros tipos de vírus, tais como hemaglutinina de vírus da gripe (HA), neuraminidase (NA) ou proteína M2. A invenção também refe- re-se a lentivírus de vetor modificado e a sistemas de distribuição de gene; e antígenos, imunogenes ou vacinas usando lentivírus pseudotipados; e a métodos para indução de imunidade ou detecção de produtos virais usando lentivírus pseudotipados; e a métodos baseados em lentivírus pseudotipados para classificação de moléculas para atividade antiviral, ou para uma capa- cidade de bloquear entrada viral nas células hospedeiras.
Um vírus é pseudotipado quando uma proteína envelope nor- malmente expressa pelo vírus é substituída com uma proteína envelope exógena de um vírus diferente, ou com uma proteína envelope quimérica ou híbrida. A pseudotipagem confere novas propriedades em um vírus, tal como mudança de sua capacidade de se ligar às células hospedeiras, modificação de sua faixa de hospedeiro natural, ou permitindo que a mesma transfira informação genética adicional nas células hospedeiras.
Lentivírus representam um gênero na família de Retrovírus. Sua estrutura básica inclui um genoma de RNA contido no interior de um núcleo em ou através do qual as proteínas envelopes de ligação de receptor são dispostas. Um vetor lentivírus projetado exibe algumas ou todas das carac- terísticas de um lentivírus, mas podem inclui alterações na estrutura do Ien- tivírus modificando as características funcionais do lentivírus nativo das quais ele é derivado. Por exemplo, o genoma de RNA do vetor lentivírus pode ser modificado para incluir seqüências de polinucleotídeo exógenas ou trans- genes para incorporação em uma célula hospedeira-alvo. As proteínas en- velopes de um lentivírus nativo podem ser pseudotipadas pela substituição com as proteínas envelopes de um vírus exógeno, modificando, desse modo, a faixa de hospedeiro do vetor lentivírus.
Os vetores lentivírus podem ser de replicação competente ou de replicação incompetente. Um vetor de replicação competente codifica todos os materiais que ele necessita para infectar uma célula hospedeira e repro- duzi-la, enquanto um vetor de replicação incompetente não pode. Um vetor de replicação incompetente pode ser preferido para segurança biológica e para sua capacidade geralmente mais alta para conduzir material genético mais exógeno do que um vetor de replicação competente.
Métodos para produção de vetores lentivírus, pseudotipagem de proteínas envelopes de lentivírus, e uso de tais vetores para transdução de seqüências de polinucleotídeo são conhecidos na técnica, e são também incorporados por referência às seguintes publicações.
Kinqsman. et ai.. Patente US N0 6.669.936, descreve infecção e transdução de vetores lentivírus competentes que carecem de produtos de gene auxiliares de lentivírus funcionais.
Leboulch, et ai.. Patente US N0 6.365.150, descreve células de acondicionamento que produzem lentivírus recombinantes proporcionando segurança aumentada, eliminando-se virtualmente a possibilidade de re- combinação molecular conduzindo a produção de vírus auxiliador compe- tente de replicação.
Marasco, et ai.. Patente US N0 6.830.892, descreve vetores Ien- tivírus úteis para classificação de moléculas alvos.
Marasco, et ai., Patente US N0 7.078.031, descreve vetores Ien- tivirais pseudotipados e distribuição de gene usando estes vetores.
Spencer. et al„ Patente US N0 7.090.837 descreve construções de acondicionamento de lentivírus e transdução de gene usando vetores lentivírus.
McKav et al„ Gene Ther. 13:715 (2006) descreve transferência de gene baseada em lentivírus usando hemaglutinina da gripe (HA) de vírus de peste de aves (FPV, H7/Rostok).
Matrosovich et al. (25) indica que NA desempenha um papel importante na fase anterior de infecção de vírus.
Tais vetores e métodos de seu uso são também incorporados por referência a Current Protocols in Molecular Biology, volume 1 (20 de no- vembro de 2006), ver especialmente Capítulo 9 "lntroduction of DNA into Mammalian Células", ou por referência aos documentos acima citados, ou na seção de referência abaixo.
Vetores lentivírus podem também incluir um ou mais genes re- latores, tais como um polinucleotídeo que codifica proteína fluorescente verde (GFP). Genes relatores adequados, métodos para incorporação de genes relatores em vetores lentivírus e métodos para detecção de atividade de gene relator são bem conhecidos na técnica e são incorporados por re- ferência a Current Protocols in Molecular Bioloqy, volume 1 (20 de novembro de 2006), ver especialmente Capítulo 9, Parte II, "Uses of fusion genes in mammalian transfection".
Os vetores Ientivirais pseudotipados com proteínas envelopes de outros vírus proporcionam uma ferramenta poderosa para uma variedade de aplicações de ciência básica e clínicas. Primeiro, como um sistema de dis- tribuição de gene, eles podem direcionar transferência de gene em tecidos e células desejáveis in vitro e in vivo (1, 2). Segundo, como uma ferramenta para pesquisa básica, eles podem ser usados para descobrir o mecanismo molecular de entrada de célula mediada por proteína envelope (3). Terceiro, como um imunogene, eles podem ser usados no desenvolvimento de vacina contra doenças infecciosas e cânceres (4, 5). Quarto, como um antígeno, eles foram usados para desenvolver um novo ensaio de neutralização para medir resposta de anticorpo durante o curso de infecção e vacinação (6, 7). Finalmente, como um veículo de entrada de célula, eles podem ser usados para desenvolver sistemas de produção altos para classificar bloqueadores de entrada, auxiliando, desse modo, no desenvolvimento de novas drogas antivirais (3).
A glicloproteína G de vírus de estomatite vesicular (VSV-G) é amplamente usada para pseudotipagem de vírus Ientivirais devido a sua alta eficiência na pseudotipagem de vetores lentivirais em transferência de gene alvo para uma ampla faixa de células e tecidos (8-10). Contudo, algumas células e tecidos, tais como a membrana apical e tecido epitelial ou mucosal polarizado são refratários a vetores lentivirais pseudotipados com VSV-G (1, 11).
Para superar esta limitação, esforços têm sido feitos para pseu- dotipar vírus com proteínas envelopes de outros vírus, tais como filovírus (1, 2), ortomixovírus (11, 12), paramixovírus (13), vírus da hepatite C (14), e o outros retrovírus (12, 15).
Os vírus da gripe são membros da família ortomixovírus de vírus de RNA. A gripe, comumente conhecida como flu, é uma doença infecciosa de pássaros e mamíferos. Nos humanos, os sintomas comuns de gripe são febre, garganta dolorida, dores musculares, dor de cabeça severa, tosse, fraqueza, e desconforto geral. Em casos mais sérios, a gripe causa pneumonia, que pode ser fatal, particularmente em crianças jovens e nos mais idosos.
Existem três tipos de gripe, designadas gripe A, B e C (dois ou- tros membros desta família, o vírus Dhori e Thorgoto são suportados por carrapatos e são raramente encontrados). O vírus da gripe A (que inclui o vírus de ave ou pássaro) causa a doença mais severa em humanos, embora a gripe B também regularmente cause erupções.
As designações A, B e C originalmente referidas a classes am- plas de resposta de anticorpo ao vírus e são agora conhecidas também para serem relacionadas às diferenças genéticas na respectiva M1 (capsid ou proteína matriz), ou a nucleoproteína (NP) dos três tipos de vírus. Estudos das seqüência genéticas destes vírus indicam que em algum momento eles todos tinham um predecessor comum. A flu de pássaro H5N1 pertence a classe ou tipo de gripe A.
O tipo (A, B ou C) é a primeira parte importante do nome do vírus da gripe. Então vem o subtipo, que é denominado para as classes amplas das proteínas de superfície de hemaglutinina (HA) ou neuraminidase (NA) que se projetam através do envelope viral. Existem 16 subtipos HA (desig- nados H1 - H16) e 9 subtipos NA (designados N1 - N9). Todas das combi- nações possíveis destes subtipos de gripe A infectam pássaros, mas so- mente aquelas contendo o H1, H2, H3, H5, H7 e H9 e as proteínas de su- perfície N1, N2 e N7 infectam humanos e destas, por enquanto, somente H1, Η2, Η3 e N1 e Ν2 fazem assim para qualquer extensão. O subtipo H5 é considerado um candidato para um novo subtipo para infectividade humana ampla. Desde que este subtipo é "novo" aos sistemas imunes de muitas pessoas no planeta, se este subtipo torna-se amplamente infectivo para humanos, é provavelmente para resultar em uma pandemia, que é para produzir uma onda de infecção ao redor do mundo.
A denominação total de um vírus da gripe A, desse modo, inclui ambos o tipo e subtipo, por exemplo, gripe A/H5N1 ou gripe A/H3N2; estes podem também serem escritos usando-se parênteses ao invés de barras, isto é A(H3N2) etc. Na aplicação atual como todos os tipos de vírus da gripe discutidos são tipo A, os vírus são simplesmente designados usando-se a combinação de subtipo, isto é, H3N2.
Três proteínas da gripe importantes são hemaglutinação (HA), neuraminidase (NA) e M2, que são proteínas envelopes na superfície do vírus da gripe.
Na superfície de um virion de gripe maturo, o pico de HA é um complexo trimérico de heterodímeros de HAi e HA2 (16, 17). Eles se ligam a receptores contendo ácido siálico na superfície da célula-alvo, e é respon- sável pela penetração do vírus no citoplasma da célula por mediação da fu- são da membrana de vírus endocitosados com a membrana endossomal (18, 19).
HA é inicialmente sintetizada nos ribossomas ligados a mem- brana e translocada no lúmen do retículo endoplasmático como um precursor de polipeptídeo simples HAo e, em seguida, clivada em duas cadeias ligadas a disulfeto HAi e HA2.
Uma forma de HAo possui aminoácidos básicos múltiplos no terminal carboxil de HA-i, ela é clivada por uma endopeptidase celular loca- lizada na rede trans-GoIgi (TGN) (20, 21). Uma segunda forma de HA0 não possui aminoácidos básicos múltiplos no terminal carboxil de HAi, ela é cli- vada in vivo por um dos dois grupos de proteases: pasmem, uma protease similar a fator X de coagulação de sangue, e triptase Clara, um produto de células epiteliais respiratórias especializadas (22-24). Na superfície do virion de gripe maturo, NA está presente como um homotetrâmero. Ele catalisa a clivagem da ligação α-cetosídica entre um ácido siálico terminal e uma D-galactose adjacente ou D-galactosamina (25). Uma função de NA é remover ácido siálico de HA, NA, e a superfície da cé- lula (26). Ela pode também permitir transporte do vírus através da camada de mucin presente no trato respiratório de modo que o vírus pode ter como alvo células epiteliais (27). Algumas proteínas de NA de gripe aviária também têm um local de ligação de receptor que causa hemaglutinação, embora o papel desta função de ligação do receptor no ciclo de vida de vírus da gripe seja ainda desconhecido (28). Recentemente, foi verificado que NA também de- sempenha um papel importante na fase anterior de infecção de vírus (29).
Cerca de 20 a 60 M2 de moléculas de proteína são expressas como homotetrâmeros na superfície do virion maturo. Estas funcionam como canais de íon que permitem que íons entrem no virion durante retirada do revestimento, e também agem como um canal de íon que modula o pH de TGN e transportam vesículas (30). Interessantemente, até agora uma cepa de gripe aviária de vírus de peste de aves A/galinha/Germany/34 (H7N1) (FPV) Rostock é a única cepa cuja HA depende da atividade de canal de íon de M2 em TGN e transporta vesículas para manter a conformação correta durante sua biogenêse (31, 32). Sem M2, FPV H7HA é expresso no ER e raramente alcança a superfície da célula (11, 32).
FPV H7HA tem sido usado para pseudotipar retrovírus e vetores Ientivirais baseados em EIAV- ou HIV-1 (11, 33). Recentemente, McKay et ai. (11) reportou que M2 aumenta significantemente pseudotipagem de FPV H7HA de vetor lentiviral. Em adição, eles mostram que o tratamento de cé- lulas produzindo lentivírus pseudotipado por FPV H7HA/M2 com NA bacterial solúvel ou co-expressão de cDNA que codifica NA aumenta a liberação de pseudovirion de células produtoras. Finalmente, eles demonstram que este lentivírus pseudotipado por FPV H7HA/M2 tranduz eficientemente a mem- brana apical de cultura traqueal de camundongo polarizada ex vivo, bem como epitelial traqueal de camundongo in vivo.
Conforme indicado acima, 16 subtipos de HAforam identificados em aves. Entre eles, HA de sorotipos 1, 2, e 3 foram transmitidos em huma- nos e difundidos de humano para humano; pelo que HA de sorotipos 5, 7, e 9 foram também transmitidos em humano, mas difusão de humano para hu- mano não foi reportada até agora (34), embora em vias aéreas humanas ambos sialiloligosacarídeos terminados por SAa2,6 galactose e por SAa2,3 galactose foram encontrados (35).
Conforme mencionado acima, FPV H7HA, que liga SAa2,3 ga- lactose, tem uma característica única em sua dependência na M2 durante biogênese (31, 32). Antes da presente invenção, se M2 e NAforam requeri- dos para vetores Ientivirais pseudotipados com HA de outras cepas virais, não foi conhecido.
Os inventores, portanto, conseguiram aperfeiçoar lentivírus pseudotipados e vetores derivados a partir destes, por investigação dos e- feitos de vários subtipos de HA quando introduzidos em um lentivírus, bem como os efeitos de NA e M2.
Em particular a presente invenção refere-se um vetor lentivírus pseudotipado com:
uma proteína HA da gripe ou uma proteína contendo um frag- mento de proteína HA compreendendo um epitopo de HA ou um Iigante de fixação celular de HA,
no qual referida proteína HA não é vírus de peste de aves H7. Conforme descrito aqui, tal vetor lentivírus pseudotipado tem muitas propriedades benéficas, em particular os inventores descobriram que um vetor lentivírus pseudotipado com HA somente permite transdução de uma seqüência de polinucleotídeo desejada ou transgene em uma célu- la-alvo a qual HA se liga.
Preferivelmente, a proteína HA é selecionada a partir do grupo consistindo em Hl, H2, H5 e H7 conforme definido acima (isto é, vírus H7 não de peste de aves) e, mais preferivelmente, a partir do grupo consistindo em Η1, H2 e H5. Em particular:
- a proteína H1 pode compreender a seqüência de peptídeo de SEQ ID NO:3; uma seqüência de codificação de ácido nucléico correspon- dente é SEQ ID N0:16;
- a proteína H2 pode compreender a seqüência de peptídeo de SEQ ID NO:1; uma seqüência de codificação de ácido nucléico correspon- dente é SEQ ID NO:18; ou
- a proteína H5 pode compreender a seqüência de peptídeo de uma de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7; seqüên- cias de codificação de nucleotídeo são SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID NO:21.
Outros ácidos nucléicos levemente diferentes, quando capazes de expressar as proteínas aqui acima, podem também serem usados, e po- dem ser deduzidos a partir de referidas proteínas por métodos conhecidos.
A proteína HA é uma determinante de virulência da gripe e es- pecificidade-alvo, e tem sido, consequentemente, submetida a investigação extensiva e prolongada. As várias formas de HA isolada até aqui são cada uma importantes e, desse modo, os novos materiais Ientivirais pseudotipados com tais moléculas de HA da presente invenção proporcionam várias van- tagens conforme detalhado no presente pedido.
Preferivelmente o Ientivirus adicional compreende NA. Em par- ticular, a proteína NA pode compreender a seqüência de peptídeo de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11; seqüências de codi- ficação de nucleotídeo correspondente são SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25.
Enquanto o lentivírus pseudotipado necessita de somente HA para se ligar à célula-alvo e transduzir seu material genético, os inventores descobriram que o aumento substancial na eficiência de transdução resulta quando NA é incorporado no vírus pseudotipado sem adição a HA.
Preferivelmente o vetor Ientivirus compreende NA de uma cepa flu aviária H5N1.
Preferivelmente, o vetor lentivírus compreende adicionalmente NA e M2. O aumento adicional na eficiência de transdução pode ser alcan- çado pela inclusão de ambas NA e M2 no vírus pseudotipado junto com HA. Em particular, a proteína M2 é codificada pela seqüência de codificação de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2.
A cotransfecção de NA sozinha, mas não de M2 sozinha, com H5HA resultou em um aumento de expressão de superfície de célula de H5HA e aumento dramático (4 a 5 logs) na eficiência de transdução. A me- Ihor eficiência de transdução foi obtida quando a proporção de construções de HA e NA variou entre 4:1 e 8:1. Em adição, cotransfecção de M2 com H5HA e NA proporcionou um aumento adicional moderado (2 a 3 vezes) na eficiência de transdução.
Os inventores descobriram que NA, mas não M2, intensifica dramaticamente a eficiência de transdução de pseudotipos de H5HA. Os pseudotipos de H5HA/NA/M2 imitam a etapa de infecção anterior do vírus da gripe, que a torna adequada para desenvolvimento de um alto ensaio de através para avaliar a neutralização da resposta de anticorpo, bem como para classificar bloqueadores de entrada de vírus de flu aviária.
Similar ao vírus de flu aviária tipo selvagem que expressam H5, os pseudotipos de lentivírus H5HA/NA/M2 entram nas células através de endocitose mediada por receptor, e a entrada da célula é efetivamente neu- tralizada por soro específico imune para H5HA. Especificamente a entrada por pseudotipos H5HA/NA/M2 pode ser neutralizada por soro imune em camundongos específicos para H5HA, bem como por soro convalescente de H5N1-infectado, mas em pacientes humanos recuperados.
Os pseudotipos H5HA/NA/M2 transduzem material genético em uma faixa ampla de células com eficiência compatível a pseudotipos VSV-G tornando tais vetores Ientivirais pseudotipados de grande valor potencial como um novo tipo de reagente de transfecção.
Pelo menos em dois aspectos estes resultados são muito dife- rentes daqueles recentemente reportados por McKav et ai. na pseudotipa- gem de PFV H7HA de vetores Ientivirais (11). Primeiro, em seu relatório, M2 foi mostrado ser requerido para a expressão da superfície da célula de PFV H7HA. Sem cotransfecção de M2, PFV H7HA pode somente ser detectado intracelularmente, que indica o dano de tráfico de PFV H7HA através da tra- jetória secretória. Em contraste, os inventores descobriram que expressão de M2 não é necessária para obter a expressão superficial de outras proteínas HA similares a H5 na superfície de células de acondicionamento (Figura 1A).
Enquanto não estando ligado a qualquer explanação particular, a diferença na dependência de M2 na expressão de superfície de células de acondicionamento entre H5HA e PFV H7HA é consistente com o que era anteriormente conhecido sobre a biogênese de HA (27). Até agora PFV H7HA é a única HA cuja biogênese depende da atividade do canal de íon de M2 em TGN e transporta vesículas para manter a conformação correta (27).
Segundo, McKav et al. indica que M2 e NA sinergizam (cerca de 750 vezes) transdução eficiente de vetores Ientivirais PFV H7HA pseudoti- pados. Contudo, na presente invenção, foi verificado que cotransfecção de NA, mas não M2, aumenta 4 a 5 a eficiência de transdução de vetores Ienti- virais H5HA pseudotipados (Figura 2).
Também, cotransfecção de M2 com HA e NA na proporção ótima resulta em um aumento adicional, mas moderado (2 a 3 vezes) na eficiência de transdução (Figura 3). Este aumento de 2 a 3 vezes por M2 em nossos estudos é muito menor do que o aumento de 30 vezes nos estudos passados (11). Esta diferença pode novamente ser explanada pela diferença na de- pendência de M2 para PFV H7HA e H5HA durante a biogênese nas células de acondicionamento (27). Contudo, a razão para intensificação muito maior (perto de 4 logs) por NA na presente invenção comparada aos estudos pas- sados (por exemplo, 25 vezes) na eficiência de transdução de vetores Ienti- virais de HA pseudotipados não é clara. Em seus estudos, muito efeito de NA foi verificado com proteína de NA bacterial solúvel de Vibrio Cholera, embora em alguns experimentos cotransfecção de NA da gripe de A/PR/8/34 foi também testada, mas o efeito visto no presente pedido não foi observado.
O gene de NAfoi derivado de uma cepa de gripe aviária H5N1 e de códon optimizado. Enquanto não estando ligado a um mecanismo de ação particular, uma explanação possível, portanto, é que a intensificação dramática de NA na eficiência de transdução de vetor Ientiviral H5HA pseu- dotipado é a singularidade de NA derivada de uma cepa de gripe aviária al- tamente patogênica.
Em particular, pseudotipos de H5HA/NA/M2 com tal eficiência de transdução intensificada terão muitas aplicações de ciência básica e clínicas.
Primeiro, como um sistema de distribuição de gene, eles podem eficientemente transduzirem células epiteliais através da membrana apical (11). Portanto, provavelmente, eles podem ser usados para introduzir dire- tamente genes no epitélio mucosal in vivo.
Segundo, eles podem ser usados como uma ferramenta de pesquisa básica para revelar o mecanismo molecular de entrada de vírus, desse modo, patogênese potencial.
E finalmente, local de ligação de receptor bem preservado e de- terminantes antigênicos em pseudotipos de H5HA/NA/M2 demonstrados neste estudo (Figuras 5 e 6) mostram que pseudotipos de H5HA/NA/M2 podem ser usados para desenvolver um alto ensaio total para estudar com- preensivamente o estado imune de indivíduos vacinados e infectados de H5N1, e para classificar bloqueadores de entrada, desse modo, novas dro- gas antivirais.
Preferivelmente o vetor lentivírus adicionalmente compreen- dendo um transgene.
Tal transgene pode ser usado como um marcador adicional se ele é um gene relator apropriado, tal como uma das várias formas de Prote- ína Fluorescente Verde (GFP) ou luciferase. Alternativamente, o transgene pode ser um marcador selecionável, tal como um que confere resistência a uma substância particular, tal como Kanamycin. Ou tal transgene pode ser um produto de gene de interesse que é desejado introduzir-se na célula-alvo. Em particular, este pode ser um gene antiviral que é desejado investigar seus efeitos no lentivírus pseudotipado.
Preferivelmente o polinucleotídeo que expressa HA foi de códon otimizado para uma célula-alvo ou hospedeira.
Tal HA de códon otimizado assegura níveis ótimos de expressão na célula-alvo ou célula hospedeira. Organismos diferentes têm inclinações particulares nos códons que eles usam mais comumente para especificar vários resíduos de aminoácido de um peptídeo particular. Pela modificação da seqüência de codificação tal que ela use os códons preferidos das célu- las-alvo ou hospedeira, isto assegura níveis de expressão melhores e mais consistentes.
Preferivelmente os polinucleotídeos que expressam HA e NA, e M2, se presente, foram otimizados para códon para uma célula-alvo ou hospedeira, e podem ser levemente diferentes a partir das seqüências de ácido nucléico listadas na listagem de seqüência aqui em anexo, provido que elas são capazes de expressar as proteínas de interesse.
Na presente invenção os vetores Ientivirais pseudotipados não são limitados às seqüências de proteína específicas de HA, NA e M2, mas, ao invés, os inventores mostraram que combinações de proteínas HA, NA e M2 a partir dos mesmos ou isolados virais diferentes ou, de fato, isolados de grupos de HA ou NA diferentes quando usados em um vetor Ientiviral pseu- dotipado simples podem ter as propriedades biológicas e imunogênicas re- queridas.
Preferivelmente a proteína de HA consiste em pelo menos duas porções de homólogos de HA diferentes.
Preferivelmente a proteína de NA consiste em pelo menos duas porções de homólogos de NA diferentes.
Os inventores verificaram que pelo uso de proteínas que com- preendem porções de pelo menos duas proteínas nativas que estas proteí- nas de HA ou NA quiméricas são ambas imunogênicas a níveis comparáveis com proteínas originais e têm atividade biológica. Para fazer isto os inven- tores verificaram que pela combinação das porções ou domínios de proteí- nas de HA ou NA diferentes que são separadas por resíduos conservados conforme podem ser identificados com referência às figuras 14 e 15 aqui.
É também provida uma composição compreendendo o vetor Ien- tivírus da presente invenção e um excipiente, transportador e/ou adjuvante imunológico farmaceuticamente aceitável.
É também provido um sistema de acondicionamento de vetor lentivírus compreendendo: pelo menos um vetor de acondicionamento que expressa HA, e
uma construção de vetor de transferência compreendendo se- qüências de produção e de acondicionamento, seqüências que expressam as proteínas de lentivírus Gag e Pol, e, opcionalmente, um transgene,
no qual referida proteína de HA não é vírus de peste de aves H7HA.
É também provido um sistema de acondicionamento de vetor lentivírus compreendendo:
pelo menos um vetor de acondicionamento que expressa HA, e uma construção de vetor de transferência compreendendo se- qüências de produção e de acondicionamento que expressam as proteínas de lentivírus Gag e Pol, e,
opcionalmente, um transgene,
no qual referida proteína HA não é vírus de peste de aves H7HA. É também provido um sistema de acondicionamento de vetor lentivírus compreendendo:
pelo menos um vetor de acondicionamento que expressa HA1
uma construção auxiliadora que expressa as proteínas de lenti- vírus Gag e Pol, e
uma construção de vetor de transferência compreendendo se- qüências de produção e de acondicionamento e, opcionalmente, um trans- gene;
no qual referida proteína HA não é vírus de peste de aves H7HA. Um sistema de acondicionamento de vetor lentivírus contendo pelo menos um vetor de acondicionamento que expressa HA1 e uma cons- trução de vetor de transferência compreendendo seqüências de produção e de acondicionamento, seqüências que expressam as proteínas de lentivírus Gag e Pol, e, opcionalmente, um transgene, é contemplado. Tal sistema de acondicionamento pode também conter pelo menos um vetor de acondicio- namento que expressa HA1 uma construção auxiliadora que expressa as proteínas de lentivírus Gag e Pol, e uma construção de vetor de transferência compreendendo seqüências de produção e de acondicionamento e, opcio- nalmente, um transgene. Preferivelmente1 o vetor não expressa vírus de peste de aves H7HA. Uma célula-alvo ou hospedeira transfectada com o vetor lentivírus acima descrito é também contemplada como são as célu- las-alvos ou hospedeiras transfectadas com o vetor lentivírus da invenção que têm um transgene incorporado no DNAcromossomal. Uma seqüência de polinucleotídeo ou transgene podem ser transduzidos em uma célula pelo contato da mesma com o vetor lentivírus da invenção.
É também provido um método para indução de uma resposta imune compreendendo administrar um vetor lentivírus, conforme definido acima, a um indivíduo em uma quantidade suficiente para induzir uma res- posta imune ao referido vetor.
Outra modalidade da invenção constitui um método para indução de uma resposta imune compreendendo administrar um vetor lentivírus (ou uma célula hospedeira transfectada com ele), conforme definido acima, a um indivíduo em uma quantidade suficiente para induzir uma resposta imune. Tal resposta imune pode ser uma resposta celular ou humoral ao lentivírus pseudotipado, tal como ao componente de HA.
É também provido um método para identificar um anticorpo de neutralização compreendendo:
contactar o vetor lentivírus conforme definido aqui acima com um anticorpo por um tempo e condições adequadas para ligação do anticorpo ao vetor lentivírus, e
determinar os efeitos de referido contato na capacidade de refe- rido vetor lentivírus se ligar a ou infectar uma célula hospedeira.
Os pseudotipos de H5HA/NA/M2 com tal alta eficiência foram desenvolvidos pelos inventores em um ensaio total alto para avaliar neutra- lização de resposta de anticorpo e para classificar bloqueadores de entrada de vírus da gripe aviária H5N1.
Aplicações específicas desta tecnologia incluem o seguinte. Um vetor lentivírus pseudotipado com uma proteína de HA da gripe, ou uma proteína contendo um fragmento de proteína de HA compreendendo um e- pitopo de HÁ, ou um Iigante de fixação celular de HA. Preferivelmente, os genes de HA (ou outros genes, tais como aqueles para NA ou M2) serão otimizados para códon para uma célula-alvo ou hospedeira particular. A oti- mização de códon é bem conhecida nas técnicas biológicas moleculares. Mais preferivelmente, o vetor lentivírus não é pseudotipado com vírus de peste de aves H7HA, e a proteína de HA é Η1, H2, H5 ou H7, preferivelmente Η1, H2 ou H5. Contudo, tal vetor lentivírus pode também ser pseudotipado com NA, tal como NAde uma cepa de gripe aviária H5N1. Preferivelmente, o vetor pode ser pseudotipado usando-se emparelhamento de HA e NA da gripe homólogas que foram descobertos para serem mais eficientes para pseudotipagem de um vetor lentiviral. O vetor pode também envolver ambas NA e M2, bem como HA. Um vetor lentivírus pseudotipado com uma proteína de HA da gripe ou fragmento de proteína de HA pode envolver um transgene. O vetor lentivírus pseudotipado pode ser misturado ou suspenso em um tampão adequado ou meio, ou misturado com um transportador ou adjuvante imunológico. Adjuvantes para promoção de respostas imunes, tais como alum, adjuvante de Freunds incompleto ou completo,adjuvante de Ribi e ou- tros, são bem conhecidos nas técnicas imunológicas.
É também provido uma célula-alvo ou hospedeira transfectada com o vetor lentivírus da presente invenção.
É também provida uma composição compreendendo a célu- la-alvo ou hospedeira da presente invenção, e um excipiente, transportador e/ou adjuvante imunológico farmacêutico aceitável.
Preferivelmente a célula-alvo ou hospedeira transfectada com o vetor lentivírus da presente invenção, no qual referido transgene foi incor- porado no DNA cromossomal de referida célula.
É também provido um método para transdução de uma seqüên- cia de polinucleotídeo ou um transgene em uma célula compreendendo contactar uma célula com o vetor lentivírus da presente invenção por um tempo e sob condições suficientes para transdução.
É também provido um método para transdução de uma seqüên- cia de polinucleotídeo ou um transgene em uma célula compreendendo contactar uma célula com o vetor lentivírus da presente invenção por um tempo e sob condições suficientes para transdução.
É também provido um método para identificação de uma molé- cula que module ligação de vírus a um célula, ou que module infecção viral de uma célula compreendendo:
contactar uma célula com uma molécula candidata e o Ientivirus pseudotipado da presente invenção, e
determinara capacidade de referida molécula candidate modular ligação de vírus à célula, ou inibir infecção viral da célula.
Os vetores lentivírus pseudotipados acima descritos podem ser usados para identificar ou caracterizar um anticorpo de neutralização por contato do vetor lentivírus com um anticorpo por um tempo e sob condições adequadas para ligação do anticorpo ao vetor lentivírus, e determinar os efeitos de referido contato na capacidade de referido vetor lentivírus se ligar a, ou infectar uma célula hospedeira. Outro aspecto da invenção é dirigido a identificação ou caracterização de moléculas que modulam, por exemplo, aumentam ou diminuem, ligação de vírus a uma célula, ou moléculas que atenuam (ou, em alguns casos, promovem) infecção viral.
Tal método pode incluir as etapas de contactar uma célula com uma molécula candidata e o lentivírus pseudotipado da presente invenção, em seguida determinar a capacidade de uma molécula candidata modular ligação de vírus, à referida célula, ou inibir infecção viral da célula. As molé- culas a serem testadas em tal método incluem, mas não estão limitadas a, fármacos de não-proteína, peptídeos ou polipeptídeos que não são anticor- pos, anticorpos ou fragmentos de anticorpo, carboidratos, lipídios, e outras substâncias farmacológicas e fármacos, incluindo ambos agentes orgânicos e inorgânicos. Preferivelmente a molécula é um fármaco de não-proteína.
Alternativamente a molécula é um peptídeo ou polipeptídeo que não seja um anticorpo.
Mais preferivelmente, a molécula é um anticorpo.
Mais preferivelmente, a molécula compreende um carboidrato ou lipídio.
Para uma melhor compreensão da invenção e para mostrar co- mo a mesma pode ser conduzida com efeito, ela será agora mostrada por meio de exemplo somente, modalidades específicas, métodos e processos de acordo com a presente invenção com referência aos desenhos acompa- nhantes nos quais:
A Figura 1 mostra diagrama esquemático dos vetores de trans- ferência e de acondicionamento, bem como construções de DNA expres- sando H5HA, NA e M2. A expressão de superfície de célula de H5HA em células de acondicionamento 293T transfectadas com imitação (controle negativo), H5HA (1A), H5HA e M2 (1B), H5HA e NA (1C), e H5HA, NA e M2 (1D). As células transfectadas foram manchadas com soro imune reunido específico para H5HA e seguido por anticorpo UgG anticamundongo de ca- bra conjugado por FITC.
A Figura 2 mostra a atividade relativa de Iuciferase (RLA) em células de MDCK transduzidas com subrenadantes derivados de células transfectdas 293T com imitação, H5HA, com ou sem as várias quantidades indicadas de pseudotipos de NA (2A), e em células MDCK transduzidas com sobrenadantes derivados de células transfectadas, 293T, com imitação, H5HA, com ou sem as várias quantidades indicadas de pseudotipos de M2 (2B).
A Figura 3 mostra a atividade relativa de Iuciferase (RLA) em células transduzidas de MDCK com sobrenadantes derivados de células transfectdas, 293T, com H5HA e NA na proporção 4:1 com ou sem as várias quantidades indicadas de M2.
A Figura 4 mostra a atividade relativa de Iuciferase (RLA) em células CHO, MDCK, 293 T1 HeLa, Vero, Caco2, HT29 e CEMss transduzidas com imitação ou subrenadantes contendo pseudotipos H5HA/NA/M2 ou VSV-G equivalentes a 10 ng HIV-1 gag p24. Durante a transfecção, as célu- las 293T foram transfectadas com H5HA, NA, e M2 a uma proporção ótima de 8:2:1.
A Figura 5 mostra a atividade relativa de Iuciferase (RLA) em células de MDCK pré-tratadas com bafilomicin A1 (5a) ou NH4CI (5b) e, em seguida, transduzidas com sobrenadantes contendo pseudotipos Η5ΗΑ/ΝΑ/Μ2. Durante a transfecção, células 293T foram transfectadas com H5HA, NA, e M2 a uma proporção ótima de 8:2:1.
A Figura 6 mostra a percentagem de inibição de eficiência de transdução de pseudotipos H5HA/NA/M2 ou VSV-G pré-tratados com amos- tras de soro ou pré-imunes ou pós-imune específicas para H5HA.
A Figura 7 mostra os resultados de atividade de luciferase de vetores lentivirais pseudotipados com HA e NA da gripe derivadas de vários subtipos de vírus aviários e humanos. O emparelhamento de HA e NA da gripe homólogas é mais eficiente para pseudotipagem de vetores lentivirais, e esta descoberta tem implicações para a investigação adicional de vírus da gripe.
A Figura 8 mostra um western de sobrenadante e Iisato de célula de células transfectadas com H5HA sozinho com ou sem tratamento exógeno de NA ou cotransfectadas com H5HA/NA.
A Figura 9 mostra um western sob frações isoladas de células transfectadas com H5HA sozinho com ou sem tratamento exógeno de NA1 ou cotransfectadas com H5HA/NA em que, o painel A é células não-transfectadas, o painel B é células transfectadas com H5HA sozinho, o painel C é células cotransfectadas com H5HA/NA, e o painel D é células transfectadas com H5HA tratada com tratamento exógeno de NA.
A Figura 10 mostra a filogenia de H5HA e as várias subclades desta.
A Figure 11 mostra os resultados de Hl (figura 11 A) e ensaio de microneutralização (figura 11B) realizado como uma comparação ao novo ensaio de H5HA/NA sob soro de camundongo anti-H5HA (subclade 1.1) e soro humano convalescente para H5N1 (subclade 2.3).
A Figure 12 mostra os resultados do novo ensaio de 5HA/NA sob soro de camundongo anti-HA (subclade 1.1) e os resultados do novo ensaio de H5HA/NA sob soro humano convalescente para H5N1 (subclade 2.3).
A Figure 13 mostra como o EC50 (13A e 13C) e o CC50 (13B e 13D) de dois compostos isolados a partir de várias ervas Chinesas tradicio- nais por HPLC (composto 1: figuras 13A e B; composto 2: figuras 13C e D). A Figura 14 mostra uma comparação de seqüência de peptídeo da seqüência de HIHAcom mutações para criar local multibásico e seqüên- cias de H5MA de cepas diferentes.
A Figura 15 mostra uma comparação de seqüência de peptídeo de seqüências de NA diferentes.
A presente invenção também refere-se a um número de se- qüências, listadas na listagem de seqüência aqui em anexo e resumida daqui por diante:
SEQ ID NO: 1 é a seqüência de peptídeo de H2HA
SEQ ID NO: 2 é s seqüência de codificação de nucleotídeo do gene M
SEQ ID NO: 3 é a seqüência de peptídeo de H1HAWSN
SEQ ID NO: 4 é a seqüência de peptídeo de H5HA 2004 da Tailandia
SEQ ID NO: 5 é a seqüência de peptídeo de H5HA 2005 do Camboja
SEQ ID NO: 6 é a seqüência de peptídeo de H5HA 2006 do Camboja
SEQ ID NO: 7 é a seqüência de peptídeo de H5HA 2006 de Shangai
SEQ ID NO: 8 é a seqüência de peptídeo de H5N1 NA 2004 da Tailandia
SEQ ID NO: 9 é a seqüência de peptídeo de H5N1 NA 2005 Combiant
SEQ ID NO: 10 é a seqüência de peptídeo de H5N1 NA 2006 de Shangai
SEQ ID NO: 11 é a seqüência de peptídeo de T-NA(WU)-2
SEQ ID NO: 12 é a seqüência de peptídeo de H151HA
SEQ ID NO: 13 é a seqüência de peptídeo de H515HA
SEQ ID NO: 14 é a seqüência de codificação de nucleotídeo de H151HA
SEQ ID NO: 15 é a seqüência de codificação de nucleotídeo de Η515ΗΑ
SEQ ID NO: 16 é a seqüência de codificação de nucleotídeo de
H1HAWSN
SEQ ID NO: 17 é a seqüência de codificação de nucleotídeo de H5HA 2004 da Tailândia
SEQ ID NO: 18 é a seqüência de codificação de nucleotídeo de
H2HA
SEQ ID NO: 19 é a seqüência de codificação de nucleotídeo de H5HA 2005 do Camboja
SEQ ID NO: 20 é a seqüência de codificação de nucleotídeo de H5HA 2006 do Camboja
SEQ ID NO: 21 é a seqüência de codificação de nucleotídeo de H5HA 2006 de Shangai
SEQ ID NO: 22 é a seqüência de codificação de nucleotídeo de H5N1 NA 2004 da Tailândia
SEQ ID NO: 23 é a seqüência de codificação de nucleotídeo de H5N1 NAde Combiant
SEQ ID NO: 24 é a seqüência de codificação de nucleotídeo de H5N1 NAdeShangai
SEQ ID NO: 25 é a seqüência de codificação de nucleotídeo de T-NA(WU)-2
Será agora descrito por meio de exemplo um modo específico contemplado pelos inventores. Na descrição seguinte, numerosos detalhes específicos são colocados de modo a proporcionar uma compreensão total. Será aparente, contudo, a um técnico no assunto, que a presente invenção pode ser praticada sem limitação a estes detalhes específicos. Em outros exemplos, métodos e estruturas bem conhecidos não tinham sido descritos de modo a não obscurecer desnecessariamente a descrição. EXEMPLO 1: Materiais e Métodos
Os seguintes materiais e métodos foram usados para obter os dados descritos abaixo.
Linhas de Célula. A linha de célula de acondicionamento 293T foi mantida em meio de DMEM completo [isto é, DMEM de glicose alto suple- mentado com 10% de FBS1 2 mM de L-glutamina, piruvato de sódio a 1 mM, penicilina (100 U/ml)) estreptomicina (100 Mg/ml); Invitrogen Life Technolo- gies] contendo 0,5 mg/ml de G418. HeLa1 Vero, linha de célula CD4 T hu- mana CEMss, CHO, e linhas de célula MDCK foram mantidas em meio de DMEM completo. Linhas de célula epitelial humana HT29 e Caco-2 foram compradas e mantidas em meio de DMEM completo.
Vetorde transferência, vetor de acondicionamento, e plasmídeos de DNA expressando H5HA de códon otimizado, NA e M2. Vetor de transfe- rência pHR'CMV-Luc e vetor de acondicionamento pCMVAR8.2 foram origi- nalmente desenvolvidos por Naldini et al. (36). As seqüências de H5HA, NA, e M2 de códon otimizado de uma cepa de gripe aviária H5N1 A/Tailândia/1(KAN-1)2004 foram determinadas usando-se um Acondiciona- mento GCG (Genetic Computer Group, Inc. Madison, Wl), e geradas por uma PCR recursiva conforme anteriormente descrito (37), e inseridas em um vetor de expressão de mamífero CMV/R derivado de pNGVL-3 (38). As constru- ções de plasmídeo resultantes foram designadas como CMV/R-H5HA, CMV/R-NAe CMV/R-M2, respectivamente (Figura 1A).
Produção de pseudotipos. Para gerar pseudotipos de vetor HIV-1, 4,5 χ 106 de células de acondicionamento 293T foram cotransfectadas com 14 pg de pHR*CMV-Luc, 14 pg de pCMVAR8.2, e 2 pg de plasmídeo de DNA que codifica H5HAde códon otimizado (ver acima) com ou sem várias quan- tidades indicadas de plasmídeos de DNA que codificam NA e M2 de códon otimizado usando-se um método de precipitação de fosfato de cálcio. Como um controle, células 293T foram também cotransfectadas com vetor de transferência HIV-1 -Iuciferase e plasmídeo de DNA que codifica VSV-G. Após incubação durante a noite, as células foram lavadas uma vez com HBSS e cultivadas em 10 ml de DMEM completo suplementado com 100 μΜ de bu- tirato de sódio. 8 horas mais tarde, as células foram lavadas uma vez com HBSS e cultivadas em 10 ml de DMEM completo. Os sobrenadantes con- tendo peseudotipos foram colhidos em 16 a 20 horas, e a quantidade HIV-1 gag p24 nos sobrenadantes e/ou nos Iisatos de célula de células de acondi- cionamento 293FT foi medida por ELISA conforme descrito antes (39).
Transdução de pseudotipos. Em um ensaio de ciclo simples para medir a eficiência de transdução de pseudotipos, 1 x 105 de MDCK (ATCC CCL-34), CEMss (uma linha de célula CD4 T humana provida por Dr. Jon Allan de Southwest Foundation for Biomedical Research, san Antonio, Texas), células de CHO (ATCC CRL-11398), 293T (ATCC CRL-1573), HeLa (ATCC CCL-2), Vero (ATCC CCL-81), HT-29 (ATcc HTB-38) e Caco2 (ATCC HTB-37) foram transduzidas com várias quantidades de sobrenadantes contendo pseudotipo na presença de 1 pg/ml de polibreno durante a noite. As células foram, em seguida, lavadas duas vezes com HBSS, e cultivadas em meio de DMEM complete por 2 dias. As células foram então colhidas e lavadas uma vez com HBSS (sem fenol vermelho), e ressuspensas em 200 μΙ de HBSS (sem fenol vermelho). A atividade de Iuciferase em 50 μΙ de suspensões de célula foi medida por um ensaio de BrightGIo Luciferase de acordo com as instruções do fabricante (Promega).
Imunização de camundonqos com DNA de plasmídeo que codi- fica H5HA. Camundongos BALB/c fêmeas na idade de 6 semanas (5 ca- mundongos por grupo) foram injetados (i.m.) com 100 ug de vetor de ex- pressão de DNAde plasmídeo CMV/R, MV/R-HA, CMV/R-HA-mutante-1, ou CMV/R-HA-mutante-2, respectivamente, por três vezes, em intervalos de 3 semanas. Soro pré-imune e pós-imune foram tomados nos 7 dias antes da primeira imunização e 2 semanas após a terceira imunização, respectiva- mente. Respostas de anticorpo anti-H5HA foram determinadas por ELISA e ensaio de neutralização (ver abaixo).
Análise de FACS. Para estudar expressão da superfície da célula de H5HA, 1 X 106 de imitação, H5HA, H5HA/NA, H5/M2, e H5HA/NA/M2-transduzido, células 293 T foram incubadas com o soro de camundongo imunizado de DNA de plasmídeo de H5HA (ver acima) por 40 minutos no gelo. As células, em seguida, foram lavadas duas vezes com de tampão FACS (PBS contendo 1% de BSA e 0,02% de NaN3) e adicional- mente incubadas com IgG Ab anticamundongo de cabra conjugado por FITC por 40 minutos no gelo. As células em seguida foram lavadas com tampão FACS e fixadas com 1 % de formaldeído em 0,5 ml de tampão de FACS. A análise de FACS foi realizada em um FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA).
Ensaio de neutralização. Para determinar se a transdução de pseudotipos H5HA/NA/M2 pode ser neutralizada por soro derivado de ca- mundongos imunizados por H5HA, 100 μΙ dos subtipos H5HA/NA/M2 e VSV-G produzidos acima foram incubados com ou sem diluições em série 5 vezes de amostras de soro pré- e pós-imune inativadas por calor por 1 hora a 37°C. As misturas foram, em seguida, adicionadas em células de MDCK em placas de 24 cavidades. Após incubação durante a noite, sobrenadantes contendo vírus foram removidos e substituídos com meio complete fresco. A eficiência de transdução foi determinada a 48 horas pós-transdução pela medição da quantidade de atividade de Iuciferase em células transduzidas conforme descrito acima. A atividade de neutralização é revelada como a percentagem de inibição de transdução (atividade de luciferase) em cada diluição de amostra de soro pós-imune comparada com amostra de soro pré-imune: % de inibição = {1 - [luciferase em amostra de soro pós-imune/luciferase em amostra de soro pré-imune]} χ 100. As titulações foram calculadas como a recíproca da diluição de soro conferindo 50 ou 90% de inibição (IC50 ou IC90).
Inibição farmacológica de entrada de pseudotipo de H5HA/NA/M2. Para determinar se pseudotipos de H5HA/NA/M2 entram nas células através da endocitose mediada por receptor, agente lisosomotrópico de cloreto de amônia (NH4CI) e inibidor vacuolar H+-ATPase bafilomicin A1 (BafAI) (Sigma, St. Louis, MO) foram usados para tratar alvos de célula an- tes e durante transdução de pseudotipos de H5HA/NA/M2. Soluções de o- peração de BafAI foram preparadas em dimetil sulfóxido (DMSO), e arma- zenadas a -20°C. Soluções de estoque de NH4CI foram preparadas em água destilada e esterilizadas através de um filtro de 0,22 um.
Para avaliar o efeito de BafAI e NH4CI na entrada de pseudotipo de H5HA/NA/M2, 2 χ 104 de células de MCDK por cavidade foram semeadas em placas de 24 cavidades e pré-tratadas com ou sem várias quantidades indicadas de BafAI e NH4CI por 1 hora antes da transdução. Durante a transdução, 100 ul de sobrenadantes contendo pseudotipos de H5HA/NA/M2 foram adicionados a cada cavidade e incubados a 37°C durante a noite na presença do mesmo fármaco. Os sobrenadantes foram, em seguida, remo- vidos e substituídos com meio completo fresco. 48 horas após a transdução, as células foram colhidas, e a atividade de Iuciferase nas células transduzi- das foi medida conforme descrito acima.
Construção de H151 HAe H515 HAquiméricas. H151 HAe H515 HA quiméricas foram produzidas por permuta de domínio entre duas proteí- nas HA e, em particular, entre dois resíduos de cisteína conservados nas posições 72 e 294 de H1HA (WSN) SEQ ID NO: 3. Para produzir a estrutura de leitura aberta H151 de molécula quimérica, em uma primeira e segunda reação de PCR, os primeiro e terceiro domínios foram isolados de um plas- mídeo contendo a estrutura de leitura aberta de H1HA (WSN), SEQ ID NO: 16. Em uma terceira reação, o segundo domínio foi isolado por PCR de um plasmídeo contendo a estrutura de leitura aberta de HA 2004 da Tailândia, SEQ ID NO: 17. Em uma reação final contendo todos os produtos reunidos das reações de PCR acima, e usando-se prímeres que reconhecem e forta- lecem para a porção mais externa 5' do primeiro domínio, e a porção mais externa 3' do terceiro domínio, uma reação final foi realizada e produtos de PCR de comprimento total foram obtidos por purificação de gel e DNA se- quenciado para assegurar que eles eram o produto correto e tinham a se- qüência de DNA correta. A seqüência de codificação de ácido nucléico re- sultante para H151 HA foi SEQ ID NO: 14, e foi subclonada em um vetor lentiviral conforme descrito acima para uso e estudo adicionais. As condições de ciclização de PCR eram padrões para a enzima e gabarito usados, e prímeres foram designados usando-se técnicas padrões.
Para produzir a estrutura de leitura aberta de H55 HA de molé- cula quimérica, em uma primeira e segunda reação de PCR, os primeiro e terceiro domínios foram isolados de um plasmídeo contendo a estrutura de leitura aberta de H5HAda Tailândia, SEQ ID NO: 17. Em uma terceira reação, o segundo domínio foi isolado por PCR de um plasmídeo contendo a estru- tura de leitura aberta de H1HA (WSN)1 SEQ ID NO: 16. Em uma reação final contendo todos os produtos reunidos das reações de PCR acima, e usan- do-se prímeres que reconhecem e fortalecem para a porção mais externa 5' do primeiro domínio, e a porção mais externa 3' do terceiro domínio, uma reação final foi realizada e produtos de PCR de comprimento total foram ob- tidos por purificação de gel e DNA sequenciado para assegurar que eles eram o produto correto. A seqüência de codificação de ácido nucléico resul- tante para H151 HAfoi SEQ ID NO: 15, e foi subclonada em um vetor Ienti- viral conforme descrito acima para uso e estudo adicionais. EXEMPLO 2: Cotransfecção de NA, mas não M2 sozinho, intensifica a ex- pressão da superfície da célula de H5HAem células de acondicionamento.
Para determinar o efeito de cotransfecção de plasmídeo de DNA que codifica NA ou M2 na expressão de superfície de célula de H5HA, célu- las de acondicionamento 293 T foram transfectadas com um vetor de trans- ferência Ientiviral pHR'CMV-Luc e um vetor de acondicionamento pCMVAR8.2 e plasmídeo de DNA que codifica H5HA com ou sem várias quantidades de plasmídeos de DNA que codificam NA ou M2 (Figura 1 A). Em 48 horas pós-transdução, as células de acondicionamento 293 T foram manchadas com soro imune específico anti-H5HA.
Em contraste ao relatório anterior no FPV H7HA (11), sem co- transfecção de NA e/ou M2, H5HA sozinho não expressa na superfície da célula de células de acondicionamento (Figura 1A), e cotransfecção de H5HA e M2 não intensifica a expressão da superfície de célula de H5HA (Figura 1B).
A cotransfecção de H5HA e NA, ou cotransfecção de H5HA, NA e M2 intensificam a expressão da superfície de célula de H5HA. Contudo, o nível de expressão de H5HA nas células cotransfectadas com H5HA e NA, e em células cotransfectadas com H5HA, NA e M2 é muito similar, indicando que é NA, mas não M2, que intensifica a expressão da superfície de célula de H5HAem células de acondicionamento (Figuras 1C e 1D).
Em adição, foi verificado que sobrenadantes colhidos de células cotransfectadas com H5HA e NA e de células cotransfectadas com H5HA, NA e Μ2 contêm uma quantidade similar de p24, que é cerca de 2 vezes mais alta do que sobrenadantes colhidos de células transfectadas com H5HA sozinha.
EXEMPLO 3: Cotransfeccão de NA. mas não M2 sozinho, intensifica siani- ficantemente eficiência de transducão de vetores Ientivirais pseudotipados por H5HA.
Para determinar o efeito de cotransfecção de plasmídeo de DNA que codifica NA ou M2 na eficiência de transdução de vetor lentiviral, células de acondicionamento 293 T foram transfectadas com um vetor de transfe- rência HIV-1-Iuciferase e plasmídeo de DNA que codifica H5HA com ou sem várias quantidades de plasmídeos de DNA que codificam NA ou M2. Sobre- nadantes contendo pseudotipos recombinantes foram colhidos e usados para transduzir células de MDCK com uma quantidade igual de HIV-1 gag p24. A eficiência de transdução foi medida por atividade relativa de Iuciferase a 48 horas pós-transdução.
Conforme mostrado na Figura 2A, sem cotransfecção de DNA de plasmídeo que codifica NA ou M2, muito baixa, mas mensurável, a atividade relativa de Iuciferase (RLA acima de 1.000) foi detectada em vetor lentiviral pseudotipado sozinho H5HA. Contudo, cotransfecção de DNA de plasmídeo que codifica NA com H5HA aumenta significantemente a eficiência de transdução (RLA variando de 500.000 a 7.000.000) dependente das quanti- dades de DNA de plasmídeo de NA cotransfectadas.
A melhor eficiência de transdução foi obtida quando a razão de construções de HA e NA estava em 4:1 ou 8:1. Em contraste, a cotransfec- ção de DNA de plasmídeo que codifica várias quantidades de M2 sozinho com H5HA resultou em nenhuma eficiência de transdução no todo (RLA menor do que 100) (Figura 2B). Os experimentos foram repetidos cinco mais vezes com resultados similares. Desse modo, estes resultados demonstram claramente que cotransfecção de NA, mas não M2, com H5HA, intensifica significantemente (perto de 4 log) a eficiência de transdução de vetor lenti- viral pseudotipado por H5HA.
EXEMPLO 4: Efeito de M2 na eficiência de transdução de vetor lentiviral pseudotipado por H5HA/NA.
Os inventores em seguida investigaram o efeito de M2 na efici- ência de transdução de vetor Ientiviral cotransfectado com ambos H5HA e NA. Para efetuar isto, células de acondicionamento 293 T foram cotransfec- tadas com H5HA e NA na proporção ótima (4:1) com ou sem várias quanti- dades de M2. Os sobrenadantes contendo pseudotipos recombinantes foram colhidos e usados para transduzir células de MDCK. A eficiência de trans- dução foi medida por atividade relativa de Iuciferase em 48 horas pós-transdução.
A Figura 3 mostra as RLAs de células de MDCK transduzidas com pseudotipos de H5HA/NA com ou sem cotransfecção de várias quanti- dades de M2. Comparada às células transduzidas com vetor Ientiviral pseu- dotipado com cotransfecção de H5HAe NA (RLA 7.000.000), a cotransfecção de M2 resulta em aumento moderado (cerca de 2 a 3 vezes) na eficiência de transdução. Em adição, os inventores também verificaram que nas propor- ções sub-ótimas de H5HA e NA (1:1.25 ou 16:1), a cotransfecção de M2 re- sulta em aumento mínimo, ou mesmo diminuição da eficiência de transdução (dados não mostrados). Desse modo, parece que o aumento moderado (2 a 3 vezes) por M2 é não somente dependente da dose de M2, mas também depende da proporção correta de H5HA e NA. Além disso, este aumento é muito menor do que o aumento visto no vetor Ientiviral pseudotipado repor- tado anteriormente com FPV H7HA, NA, e M2 (11).
EXEMPLO 5: Faixa de hospedeiro de vetores Ientivirais pseudotipados H5HA/NA/M2.
Os inventores também compararam a eficiência de transdução de vetores Ientivirais pseudotipados H5HA/NA/M2- e VSV-G em oito linhas de células diferentes CHO, MDCK, 293 T, HeLa, Vero, Caco2, HT29 e CEMss. Para fazer isto, as células foram transduzidas com sobrenadantes contendo oito vetores Ientivirais pseudotipados H5HA/NA/M2- ou VSV-G (e- quivalente a 10 ng de HIV-1 gag p24) na presença de polibreno. Em 48 horas pós-transdução, a atividade de Iuciferase em células transduzidas foi medida conforme descrito acima. A Figura 4 mostra a atividade relativa de Iuciferase detectada em cada uma destas 8 linhas de célula. Exceto para células Vero, a eficiência de transdução em todas as outras linhas de célula é comparável ou mais alta quando transduzida por pseudotipos de H5HA/NA/M2 do que por pseudoti- pos de VSV-G.
EXEMPLO 6: Entrada de célula de vetor Ientiviral pseudotipado de H5HA/NA/M2 é através de endocitose mediada por receptor.
Em seguida, foi determinado se as células entram nos pseudo- tipos de H5HA/NA/M2 através da endocitose mediada por receptor. Para efetuar isto, células-alvos MDCK foram pré-tratadas com várias doses de bafilomicin A1 ou NH4CI. Desde que bafilomicin A1 foi dissolvida em DMSO1 as células-alvos MDCK foram também pré-tratadas com quantidade igual de DMSO como controles. Após o pré-tratamento, as células foram transduzidas com sobrenadantes contendo pseudotipos de H5HA/NA/M2. A atividade de Iuciferase foi medida em 48 horas pós-transdução.
A Figura 5 mostra a atividade relativa de Iuciferase detectada nas células MDCK com ou sem o pré-tratamento de bafilomicin A1 ou NH4CI. Em ambos os pré-tratamentos, RLA foi reduzida em uma maneira de dose de- pendente. O pré-tratamento de células com 10 nM de bafilomicin A1 resultou em 1 Iog de redução de eficiência de transdução. O pré-tratamento de célu- las com 50 e 100 nM de bafilomicin A1 resultou em 2 Iog ou mais de redução de eficiência de transdução (Figura 5A). O pré-tratamento de células com 1 MM de NH4CI resultou em 50% de redução de eficiência de transdução. O pré-tratamento de células com 10 MM de NH4CI resultou em 1 Iog de redução de eficiência de transdução (Figure 5B). Desse modo, os inventores deter- minaram que as células entram nos pseudotipos de 5HA/NA/M2 através de endocitose mediada por receptor.
EXEMPLO 7: Soro imune específico de H5HA, mas não soro pré-imune, neutraliza a entrada de célula de pseudotipos de H5HA/NA/M2.
Os inventores determinaram se os pseudotipos de H5HA/NA/M2 podem ser neutralizados por anticorpos específicos de H5HA. Para testar isto, 100 μΙ de sobrenadantes contendo, ou pseudotipos de H5HA/NA/M, ou VSV-G1 foram incubados com várias diluições de soro específico pré-imune ou pós-imune para H5HA (ver os Materiais e Métodos para o detalhe) a 37°C por 1 hora. Após a incubação, mistura de pseudotipos e soro foi adicionada em células-alvos de MDCK para a transdução. A atividade de Iuciferase foi medida a 48 horas pós transdução. Devido a VSV-G envelope interagir com porção de lipídio na bicamada de lipídio da membrana citoplásmica, os pseudotipos de VSV-G derivam o requerimento da interação entre HA enve- lope, e seus receptores contendo ácido siálico entram nas células. Portanto, eles foram usados como um controle negativo. A atividade de neutralização de amostras de soro pós-imune é revelada como a percentagem de inibição de transdução (atividade de luciferase) em cada diluição de amostras pós-imune comparada com amostras de soro pré-imune: % de inibição = {1 - [luciferase em amostra de soro pós-imune/luciferase em amostra de soro pré-imune]} χ 100. As titulações foram calculadas como a recíproca da dilui- ção de soro, conferindo 50 ou 90% de inibição (IC50 ou IC90).
A Figura 6 mostra a percentagem de inibição de amostras de soro pós-imune reunidas de camundongos imunizados com DNA de plas- mídeo contendo um mutante de H5HA (ver os Materiais e os Métodos). Na diluição de 1 para 250, a inibição é quase 100%. Na diluição de 1 para 500, a inibição é 90%. Na diluição de 1 para 1000, a inibição é quase 62%. Na di- luição de 1 para 2000, a inibição é 50%. Mas nas mesmas diluições, ne- nhuma inibição contra pseudotipos de VSV-G foi detectada (Figura 6). EXEMPLO 8: Investigação adicional no mecanismo de intensificação de NA de H5HA
Para determinar o mecanismo de intensificação de NA, os in- ventores compararam a quantidade de HA e HIV-1 gag proteína em células transfectadas, sobrenadantes concentrados, e pseudopartículas entre célu- las transfectadas com H5HA sozinho com ou sem tratamento exógeno de NA ou cotransfectadas com H5HA/NA.
Foi verificado que embora H5HA possuísse um local de clivagem multibásico, somente 50% de HA0 foi clivado em HAi e HA2 e a quantidade de HA0, HA e HIV-1 gag clivado foi similar, indiferente de células transfecta- das com H5HA sozinho, ou cotransfectadas com H5HA/NA, ver painel de lysis de célula da figura 8.
Contudo, HA e HIV-1 gag muito mais clivado e HA0 pouco foi detectado em sobrenadantes concentrados de células cotransfectadas com H5HA/NA do que transfectadas com H5HA sozinho, ver figura 8, painel de sobrenadante.
Além disso, foi verificado que muito mais H5HA foi detectado em pseudopartículas produzidas por células cotransfectadas com H5HA/NA do que por células transfectadas com H5HA sozinho mais tratamento exógeno de NA, ver figura 9.
Desse modo, em vetor Ientiviral pseudotipado de H5HA/NA, Na cotransfectado usa dois mecanismos anteriormente desconhecidos para in- tensificar eficiência de transdução de pseudotipos, isto é, liberação prefe- rencial de pseudotipos com H5HA clivado e incorporação aumentada da quantidade de H5HA em pseudopartículas.
EXEMPLO 9: Novo ensaio de atividade de neutralização de anticorpo an- ti-HA
Atualmente os ensaios padrões para medir atividade de neutra- lização de anticorpos anti-HA, soro de indivíduos imunes e também soro de indivíduos infectados, são 1) ensaio de inibição de hemaglutinina (HI) e 2) ensaio de microneutralização. O ensaio de Hl é um ensaio substituto, que não pode refletir a atividade de neutralização real de anticorpos. Este teste faz uso do princípio que hemaglutinina aglutina eritrócitos (células de sangue vermelhas para identificar vírus). Quando os anticorpos ocorridos contra o antígeno de he- maglutinina são adicionados, eles se ligarão aos locais antigênicos na mo- lécula de HA e inibirão a ligação entre a HA e os receptores nas RBCs. Desse modo, quando existe presença de HA, os anticorpos se ligarão à HA e impedirão hemaglutinação das RBCs.
O ensaio de microneutralização usa vírus tipo selvagem e um ensaio baseado em célula que mede mais precisamente a atividade de neu- tralização de anticorpos anti-HA. Contudo, a leitura deste ensaio é um efeito citopático (CPE) que é observado sob o microscópio. Portanto, ela é uma medição subjetiva e, desse modo, difícil de quantificar e se desenvolver em um sistema reprodutível entre amostras e usuários. Em adição, devido ao ensaio usar vírus tipo selvagem para infecção, ele pode ser realizado segu- ramente em um nível de bioretenção 3, ou de laboratório mais alto, se um vírus da gripe patogênico alto, tal como H5N1, é usado.
Portanto, os inventores se basearam no trabalho descrito neste pedido de patente colocado para se desenvolver um novo ensaio de neutra- lização baseado em vetor Ientiviral pseudotipado H5HA/NA que, acredita-se, substituirá eventualmente os ensaios atuais usados para medir atividade de neutralização de anticorpos anti-HA, soros de indivíduos imunes, e também soros infectados; devido a isto, ensaio de neutralização baseado em vetor lentiviral pseudotipado H5HA/NA proporciona dados objetivos e quantificados. Ele requer somente nível de bioretenção 2 devido ao uso de pseudotipos, ao invés de vírus tipo selvagem.
Para alcançar isto, os inventores geraram um painel de pseudo- tipos de H5HA/NA que cobre subclades maiores de H5HA, ver figura 10. Usando-se soros imunes de camundongo específicos contra um H5HA (sub- clade 1.1) e soros humanos convalescentes para H5N1 (subclade 2.3) em indivíduo humano infectado, os inventores efetuaram estudos de neutraliza- ção paralelos.
Os inventores compararam titulações de neutralização de ensaio de Hl, ver figura 11A, ensaio de microneutralização, ver figure 11B, e o novo ensaio de neutralização baseado em vetor Ientiviral pseudotipado H5HA/NA, ver figura 12.
Os resultados desta comparação demonstraram que não so- mente o ensaio de neutralização baseado em pseudotipo deram resultados paralelos ao ensaio de microneutralização, ele está também longe de mais sensível (pelo menos dois Iogs mais) e quantificável.
Mais importantemente, os inventores verificaram que embora exista certo grau de reatividade cruzada entre subclades 1.1 e 2.3, titulações de neutralização contra subclades homólogas são muito mais altas do que subclades heterólogas, enfatizando a importância de usar um painel de pseudotipos que cobre todas as subclades maiores de H5HA para qualquer inspeção sorológica de atividade de neutralização de indivíduos vacinados ou infectados (vide Figuras 10 a 12).
Desse modo, os inventores demonstraram claramente que este novo ensaio de neutralização baseado em vetor Ientiviral pseudotipado de H5HA/NA é muito mais sensível e quantificável do que o ensaio de micro- neutralização. Em adição, devido aos materiais usados neste novo ensaio, e pode ser seguramente realizado em um faixa maior de laboratórios por indi- víduos menos experimentados.
EXEMPLO 10: Uso de lentivírus pseodotipados de H5HA/NA em um novo método de classificação para compostos antivirais
Os inventores também usaram o vetor Ientiviral pseudotipado de H5HA/NA, para também se desenvolver um ensaio baseado em célula para classificação antivirais.
Usando-se este ensaio para classificar biblioteca de composto pequeno isolada de algum remédio chinês tradicional por HPLC, dois com- postos (1 e 2) com EC50 a cerca de 5 μΜ (figuras 13A e 13C) e Sl >25, e 9.12, respectivamente foram identificados (vide Figura 13). CC50 é a dose de composto que resulta em 50% de citotoxicidade; EC50 é a dose de composto que resulta em 50% de inibição de transdução viral ou infecção. SI, ou índice de segurança, foi calculado conforme segue: Sl = CC50/EC50. Usualmente, um composto com um Sl alto é mais seguro (menos citotoxicidade). Igual- mente importantemente, durante o desenvolvimento de ensaio, os inventores também organizaram com sucesso etapas do ensaio em um formato de 96 cavidades por combinação de transdução, cultura e medição de célula de atividade de Iuciferase em uma cavidade simples. EXEMPLO 11: Pseudotipos virais adicionais
Os inventores continuaram a expandir o painel de pseudotipos de HA/NA, além das subclades maiores de H5HA acima mencionadas, e geraram também pseudotipos de HA/NA que expressam H1HA, H2HA, e H7HA. Em adição, eles também produziram HA quimérica entre H1HA e Η5ΗΑ (Tabela 1) e comprovaram que elas tinham atividade biológica e alta- mente imunogênica.
Estes novos pseudotipos expressando HA quimérica serão fer- ramentas muito úteis para analisar antigenicidade e imunogenecidade de moléculas de HA1 que, por sua vez, conduzirão a desenvolver novas e me- lhores vacinas candidatas.
Tabela I
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Na Tabela I, Th refere-se a proteínas derivadas de cepa de gripe aviária A/Tailândia/(KAN-1 )/2004 H5N1.
A Tabela I mostra atividade relativa de Iuciferase de células de MDCK transduzidas com pseudotipos expressando H1HA/N1NA, H5HA/N1NA, H151HA/N1NA quimérica, ou H515HA/N1NA quimérica. O H151HA de peptídeo quimérico (SEQ ID NO: 12) e H515HA de peptídeo quimérico (SEQ ID NO: 13) foram construídos por troca de domínio entre H1HA (SEQ ID NO: 3) e H5HA (SEQ ID NO: 4) entre os resíduos de cisteína conservados localizados nas posições 72 e 294 em SEQ ID NO: 3. Conse- quentemente, H151HA (SEQ ID NO: 12) compreende resíduos 1 a 72 de H1HA(SEQ ID NO: 3), resíduos 72 a 293 de H5HA (SEQ ID NO: 4) e resí- duos 295 a 569 de H1HA(SEQ ID NO: 3). Do mesmo modo, H515HA (SEQ ID NO: 13) compreende resíduos 1 a 71 de H5HA (SEQ ID NO: 4), resíduos 73 a 294 de H1HA (SEQ ID NO: 3) e resíduos 294 a 568 de H5HA (SEQ ID NO: 4). No mesmo modo outras combinações de porções de dois ou mais domínios de proteína HA podem ser criados pela troca dos domínios entre resíduos conservados. Com referência aos alinhamentos das proteínas de HA e NA aqui em anexo nas figuras 14 e 15, vários resíduos conservados variados através destas duas proteínas são mostrados. Isto junto com as seqüências de peptídeo completas destas várias proteínas de HA e NA pro- porcionam a base para a criação de várias combinações destas proteínas em novas formas quiméricas.
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ZHOU Paul TSAI Cheguo TOYADA Tetsuya BUCHY Philippe
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<130> F226 - 154 PCT
<160> 25
<170> PatentIn versão 3.3
<210> 1
<211> 566
<212> PRT
<213> Influenza virus
<400> 1
Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly Asp
15 10 15
Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Lys Val Asp
20 25 30
Thr Ile Leu Glu Arg Asn Val Thr Val Thr His Ala Lys Asp Ile Leu
35 40 45
Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Asn Gly Ile Pro Pro
50 55 60
Leu Glu Leu Gly Asp Cys Ser Ile Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro 65 70 75 80
Glu Cys Asp Arg Leu Leu Ser Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Met Glu
85 90 95
Lys Glu Asn Pro Arg Asp Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Ser Phe Asn Asp
100 105 110
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115 120 125
Val Lys Ile Leu Pro Lys Asp Arg Trp Thr Gln His Thr Thr Thr Gly 130 135 140
Gly Ser Arg Ala Cys Ala Val Ser Gly Asn Pro Ser Phe Phe Arg Asn 145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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245 250 255
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260 265 270
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325 330 335
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340 345 350
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370 375 380
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Gln Cys Arg Ile Cys Ile 565
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<212> DNA
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agcaaaagca ggtagatgtt gaaagatgag tcttctaacc gaggtcgaaa cgtacgttct 60
ctctatcatc ccgtcaggcc ccctcaaagc cgagatcgcg cagaaacttg aagatgtctt 12 0
tgcaggaaag aacaccgatc tcgaggctct catggagtgg ctaaagacaa gaccaatcct 180
gtcacctctg actaaaggga ttttgggatt tgtattcacg ctcaccgtgc ccagtgagcg 24 0 aggactgcag cgtagacgct ttgtccagaa tgccctaaat ggaaatggag atccaaataa 300
tatggataga gcagtcaagc tatataagaa gctgaaaaga gaaataacat tccatggggc 360
taaggaggtc gcactcagct actcaaccgg tgcacttgcc agttgcatgg gtctcatata 420
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gcagattgca gattcacagc atcggtctca cagacagatg gcaactacca ccaacccact 54 0
aatcagacat gagaacagaa tggtgctggc cagcactaca gctaaggcta tggagcagat 600
ggcaggatca agtgagcagg cagcggaagc catggagatc gctaatcagg ctaggcagat 660
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gtgatcctat tgttgttgcc gcaaatatca ttgggatctt gcacttgata ttgtggattc 84 0
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ctgtggatgt tgacgatggt cattttgtca acatagaatt ggagtaaaaa actaccttgt 1020 ttctactaat acggaagac 1039
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Met Lys Ala Lys Leu Leu Val Leu Leu Tyr Ala Phe Val Ala Thr Asp 15 10 15
Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
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Leu Leu Glu Asp Arg His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Lys Gly Lys
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Leu Ser Arg Gly Phe Glu Ser Gly Ile Ile Thr Ser Asn Ala Ser Met
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515 520 525
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<211> 449
<212> PRT
<213> Influenza virus
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Lys
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<212> PRT
<213> Influenza virus
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Lys
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<213> Artificial
<220>
<223> Peptídeo quimérico HA
<400> 13
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<210> 14
<211> 1707
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Codificação Seq para H151HA
<400> 14
atgaaggcca agctgctggt gctgctgtac gccttcgtgg ccaccgacgc cgacaccatc 60
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ctgaagggca aggcccccct gcagctgggc aagtgcagcg tggccggctg gctgctgggc 240
aaccccatgt gcgacgagtt catcaacgtg cccgagtgga gctacatcgt ggagaaggcc 300
aaccccgtga acgacctgtg ctaccccggc gacttcaacg actacgagga gctgaagcac 360
ctgctgagca gaatcaacca cttcgagaag atccagatca tccccaagag cagctggagc 420
agccacgagg ccagcctggg cgtgagcagc gcctgcccct accagagaaa gagcagcttc 480
ttcagaaacg tggtgtggct gatcaagaag aacagcacct accccaccat caagagaagc 540
tacaacaaca ccaaccagga ggacctgctg gtgctgtggg gcatccacca ccccaacgac 600
gccgccgagc agaccaagct gtaccagaac cccaccacct acatcagcgt gggcaccagc 660
accctgaacc agagactggt gcccagaatc gccaccagaa gcaaggtgaa cggccagagc 720
ggcagaatgg agttcttctg gaccatcctg aagcccaacg acgccatcaa cttcgagagc 780
aacggcaact tcatcgcccc cgagtacgcc tacaagatcg tgaagaaggg cgacagcacc 840
atcatgaaga gcgagctgga gtacggcaac tgcaacacca agtgccagac cccccagggc 900
agcatcaaca gcaacctgcc cttccagaac atccaccccg tgaccatcgg cgagtgcccc 960
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cagtacagaa gaaagaagag aggcctgttc ggcgccatcg ccggcttcat cgagggcggc 1080
tggaccggca tgatcgacgg ctggtacggc taccaccacc agaacgagca gggcagcggc 1140
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ggcaacggct gcttcgagtt ctaccacaag tgcgacaacg agtgcatgga gagcgtgaga 1500
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gacggcgtga agctggagag catgggcgtg taccagatcc tggccatcta cagcaccgtg 1620
gccagcagcc tggtgctgct ggtgagcctg ggcgccatca gcttctggat gtgcagcaac 1680
ggcagcctga agtgcagaat ctgcatc 1707
<210> 15
<211> 1704
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Η515ΗΑ DNA Coding SEQ
<400> 15
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ttcatcagct gcagccacct ggagtgcaga accttcttcc tgacccaggg cgccctgctg 360 aacgacaagc acagcaacgg caccgccaag gacagaagcc cccacagaac cctgatgagc 420
tgccccgtgg gcgaggcccc cagcccctac aacagcagat tcgagagcgt ggcctggagc 4 80
gccagcgcct gccacgacgg caccagctgg ctgaccatcg gcatcagcgg ccccgacaac 54 0
ggcgccgtgg ccgtgctgaa gtacaacggc atcatcaccg acaccatcaa gagctggaga 600
aacaacatcc tgagaaccca ggagagcgag tgcgcctgcg tgaacggcag ctgcttcacc 660
gtgatgaccg acggccccag caacggccag gccagccaca agatcttcaa gatggagaag 720
ggcaaggtgg tgaagagcgt ggagctggac gcccccaact accactacga ggagtgcagc 780
tgctaccccg acgccggcga gatcacctgc gtgtgcagag acaactggca cggcagcaac 84 0
agaccctggg tgagcttcaa ccagaacctg gagtaccaga tcggctacat ctgcagcggc 900
gtgttcggcg acaaccccag acccaacgac ggcaccggca gctgcggccc cgtgagcagc 960
aacggcgcct acggcgtgaa gggcttcagc ttcaagtacg gcaacggcgt gtggatcggc 102 0
agaaccaaga gcaccaacag cagaagcggc ttcgagatga tctgggaccc caacggctgg 1080
accgagaccg acagcagctt cagcgtgaag caggacatcg tggccatcac cgactggagc 1140
ggctacagcg gcagcttcgt gcagcacccc gagctgaccg gcctggactg catcagaccc 12 00
tgcttctgga tcgagctgat cagaggcaga cccaaggaga gcaccatctg gaccagcggc 1260
agcagcatca gcttctgcgg cgtgaacagc gacaccgtgg gctggagctg gcccgacggc 1320 gccgagctgc ccttcaccat cgacaag 134 7 <210> 24 <211> 1347 <212> DNA
<213> Influenza virus
<400> 24
atgaacccca accagaagat catcaccatc ggcagcatct gcatggtgat cggcatcgtg 60
agcctgatgc tgcagatcgg caacatggtg agcctgtggg tgagccacag catccagacc 12 0
ggcaaccagc accaggtgga gcccatcagc aacaccaact tcctgaccga gaaggccgtg 180
gccagcgtga ccctggccgg caacagcagc ctgtgcccca tcagaggctg ggccgtgcac 240
agcaaggaca acagcatcag aatcggcagc aagggcgacg tgttcgtgat cagagagccc 300
ttcatcagct gcagccacct ggagtgcaga accttcttcc tgacccaggg cgccctgctg 360
aacgacaagc acagcaacgg caccgtgaag gacagaagcc cccacagaac cctgatgagc 420
tgccccgtgg gcgaggcccc cagcccctac aacagcagat tcgagagcgt ggcctggagc 4 80
gccagcgcct gccacgacgg caccagctgg ctgaccatcg gcatcagcgg ccccgacaac 540
ggcgccgtgg ccgtgctgaa gtacaacggc atgatcaccg acaccatcaa gagctggaga 600 aacaacatcc tgagaaccca ggagagcgag tgcgcctgcg tgaacggcag ctgcttcacc 660
gtgatgaccg acggccccag caacggccag gccagctaca agatcttcaa gatggagaag 720
ggcaaggtgg tgaagagcgt ggagctggac gcccccaact accactacga ggagtgcagc 780
tgctaccccg acgccggcga gatcacctgc gtgtgcagag acaactggca cggcagcaac 840
agaccctggg tgagcttcaa ccagaacctg gagtaccaga tcggctacat ctgcagcggc 900
gtgttcggcg acaaccccag acccaacggc ggcaccggca gctgcggccc cgtgagcccc 960
aacggcgcct acggcgtgaa gggcttcagc ttcaagtacg gcaacggcgt gtggatcggc 1020
agaaccaaga gccccagcag cagaagcggc ttcgagatga tctgggaccc caacggctgg 1080
accgagaccg acagcagctt cagcgtgaag caggacatcg tggccatcac cgactggagc 1140
ggctacagcg gcagcttcgt gcagcacccc gagctgaccg gcctggactg catcagaccc 1200
tgcttctggg tggagctgat cagaggcaga cccaaggaga gcaccatctg gaccagcggc 1260
agcagcatca gcttctgcgg cgtgaacagc gacaccgtga gctggagctg gcccgacggc 1320
gccgagctgc ccttcaccat cgacaag 1347
<210> 25
<211> 1347
<212> DNA
<213> Influenza virus
<400> 25
atgaacccca accagaagat catcaccatc ggcagcatct gcatggtgat cggcatcgtg 60
agcctgatgc tgcagatcgg caacatgatc agcatctggg tgagccacag catccagacc 120
ggcaaccagc accaggccga gcccatcagc aacaccaact tcctgaccga gaacgccgtg 180
gccagcgtga ccctggccgg caacagcagc ctgtgcccca tcagaggctg ggccgtgcac 240
agcaaggaca acagcatcag aatcggcagc aagggcgacg tgttcgtgat cagagagccc 300
ttcatcagct gcagccacct ggagtgcaga accttcttcc tgacccaggg cgccctgctg 360
aacgacaagc acagcaacgg caccgtgaag gacagaagcc cccacggcac cctgatgagc 420
tgccccatgg gcgaggcccc cagcccctac aacagcagat tcgagagcgt ggcctggagc 480
gccagcgcct gccacgacgg caccagctgg ctgaccatcg gcatcagcgg ccccgacaac 540
ggcgccgtgg ccgtgctgaa gtacaacggc atcatcaccg acaccatcaa gagctggaga 600
aacaacatcc tgagaaccca ggagagcgag tgcgcctgcg tgaacggcag ctgcttcacc 660
gtgatgaccg acggccccag caacggccag gccagctaca agatcttcaa gatggagaag 720
ggcaaggtgg tgaagagcgt ggagctgaac gcccccaact accactacga ggagtgcagc 780
tgctaccccg acgccggcga gatcatctgc gtgtgcagag acaactggca cggcagcaac 840 agaccctggg tgagcttcaa ccagaacctg gtgttcggcg acaaccccag acccaacgac aacggcgcct acggcatcaa gggcttcagc agaaccaaga gcaccaacag cagaagcggc accggcaccg acagcgactt cagcgtgaag ggctacagcg gcagcttcgt gcagcacccc tgcttctggg tggagctgat cagaggcaga agcagcatca gcttctgcgg cgtgaacagc gccgagctgc ccttcaccat cgacaag
gagtaccaga tcggctacat ctgcagcggc 900
ggcaccggca gctgcggccc cgtgagcccc 960
ttcaagtacg gcaacggcgt gtggatcggc 1020
ttcgagatga tctgggaccc caacggctgg 1080
caggacatcg tggccatcac cgactggagc 114 0
gagctgaccg gcctggactg catcagaccc 1200
cccaaggaga gcaccatctg gaccagcggc 1260
gacaccgtga gctggagctg gcccgacggc 132 0
1347

Claims (27)

1. Vetor lentivírus pseudotipado com: uma proteína HA da gripe ou uma proteína contendo um frag- mento de proteína HA compreendendo um epitopo de HA ou um ligante de fixação celular de HA, no qual a referida proteína HA não é vírus de peste aviária H7HA.
2. Vetor lentivírus, de acordo com a reivindicação 1, no qual a referida proteína HA é selecionada a partir do grupo consistindo em Hl, H2, H5 e H7.
3. Vetor lentivírus, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, no qual a referida proteína HA é selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13.
4. Vetor lentivírus, de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, compreendendo adicionalmente NA.
5. Vetor lentivírus, de acordo com a reivindicação 1, 2, 3 ou 4, compreendendo adicionalmente NA de uma cepa de gripe aviária H5N1.
6. Vetor lentivírus, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, no qual referida NA é selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11.
7. Vetor lentivírus, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 6, compreendendo adicionalmente NA e M2.
8. Vetor lentivírus, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 7, compreendendo adicionalmente um transgene.
9. Vetor lentivírus, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 8, no qual o polinucleotídeo que expressa HA foi otimizado para códon para uma célula-alvo ou hospedeira.
10. Vetor lentivírus, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 9, no qual os polinucleotídeos que expressam HA e NA e M2, se presentes, foram otimizados para códon para uma célula-alvo ou hospedeira.
11. Vetor lentivírus, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 10, no qual a referida proteína HAconsiste em pelo menos duas porções de homólogos de HA diferentes.
12. Vetor lentivírus, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 3 a 10, no qual a referida proteína NA consiste em pelo menos duas porções de homólogos de NA diferentes.
13. Composição compreendendo o vetor lentivírus como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, e um excipiente, transportador e/ou adjuvante imunológico farmaceuticamente aceitável.
14. Sistema de acondicionamento de vetor lentivírus compreen- dendo: pelo menos um vetor de acondicionamento que expressa HA, e um construto de vetor de transferência compreendendo seqüências de pro- dução e de acondicionamento que expressam as proteínas de lentivírus Gag e Pol, e, opcionalmente, um transgene, no qual a referida proteína HA não é H7HA.
15. Sistema de acondicionamento de vetor lentivírus compreen- dendo: pelo menos um vetor de acondicionamento que expressa HA, um constructo auxiliador que expressa as proteínas de lentivírus Gag e Pol, e um constructo de vetor de transferência compreendendo se- qüências de produção e de acondicionamento e, opcionalmente, um trans- gene; no qual a referida proteína HA não é H7HA.
16. Método para indução de uma resposta imune compreen- dendo administrar o vetor lentivírus como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 12, a um indivíduo em uma quantidade suficiente para induzir uma resposta imune ao referido vetor.
17. Método para identificar um anticorpo de neutralização com- preendendo: contactar o vetor lentivírus de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, com um anticorpo por um tempo e condições ade- quadas para ligação do anticorpo ao vetor lentivírus, e determinar os efeitos do referido contato na capacidade do refe- rido vetor lentivírus se ligar a ou infectar uma célula hospedeira.
18. Célula-alvo ou hospedeira transfectada com o vetor lentivírus como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12.
19. Composição compreendendo a célula-alvo ou hospedeira de acordo com a reivindicação 18, e um excipiente, veículo e/ou adjuvante i- munológico farmacêutico aceitável.
20. Célula-alvo ou hospedeira com um vetor lentivírus como de- finido na reivindicação 8, no qual o referido transgene foi incorporado no DNA cromossomal da referida célula.
21. Método para transdução de uma seqüência de polinucleotí- deo de um transgene em uma célula compreendendo contactar uma célula com o vetor lentivírus como definido na reivindicação 8 por um tempo e sob condições suficientes para transdução.
22. Método para identificação de uma molécula que modula vírus de ligação a uma célula, ou que modula infecção viral de uma célula com- preendendo: contactar uma célula com uma molécula candidata e o lentivírus pseudotipado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, e determinar a capacidade da referida molécula candidata modular vírus de ligação à referida célula, ou inibir infecção viral da célula.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, no qual a referida molécula é um fármaco de não-proteína.
24. Método, de acordo com a reivindicação 22, no qual areferida molécula é um peptídeo ou polipeptídeo que não seja um anticorpo.
25. Método, de acordo com a reivindicação 22, no qual referida molécula é um anticorpo.
26. Método, de acordo com a reivindicação 22, no qual referida molécula compreende um carboidrato ou lipídio.
27. Método de usar um vetor lentivírus como definido na reivin- dicação 8 para transfectar pelo menos uma célula-alvo, no qual as referidas HA, NA e M2 são usadas na razão 8:2:1.
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