CN115960842B - 一种提高重组禽流感病毒感染鸡胚能力的方法 - Google Patents
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Abstract
一种提高重组禽流感病毒感染鸡胚能力的方法，属于兽用生物制品技术领域。为了解决重组禽流感病毒在鸡胚中繁殖效果不佳，进而导致抗原液病毒含量低，疫苗生产成本高，免疫效果差的问题，本发明提供了一种提高重组禽流感病毒感染鸡胚能力的方法，该方法针对鸡胚在孵化过程中由于鸡胚组织分化速度加快产生大量的生理热，影响鸡胚的发育的问题，降低孵化温度，并加入生产因子、氨基酸、无机盐等防止孵化温度过低影响鸡胚活性及机体代谢，促进鸡胚组织分化，进而提高病毒在鸡胚中的繁殖，提高抗原液病毒含量，提高疫苗的免疫效果。本发明提供的该方法能够用于禽流感疫苗的生产。
Description
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种提高重组禽流感病毒感染鸡胚能力的方法。
背景技术
高致病性禽流感(avianinfluenza，AI)是由A型流感病毒引起的烈性呼吸道疾病，被世界动物卫生组织(OIE)定为A类传染病，AI不仅给世界养禽业造成了巨大的经济损失，而且严重威胁着人类生命安全，AI防控成了目前人兽共患传染病研究的焦点。
在目前禽流感疫苗生产中，鸡胚培养是常用的病毒培养方式之一，以采用非免疫鸡胚进行生产为主。在实际生产中发现，目前实现商品化的重组禽流感毒株在培养过程中多为利用SPF鸡胚、非免疫鸡胚，接种病毒后36-37℃孵化，病毒在鸡胚中繁殖效果不佳，代表病毒含量的HA值和代表病毒感染能力的EID50值较低，而病毒液的HA和EID50的结果将直接影响疫苗的免疫效果。此外，按照生产标准要求的抗原液需要进行3-5倍数浓缩，此时收获禽流感病毒液的HA值和EID50值的高低决定着疫苗的生产成本。因此提高疫苗半成品抗原液的病毒含量才能保证疫苗的优质高效并降低生产成本。
发明内容
为了解决病毒在鸡胚中繁殖效果不佳，进而导致抗原液病毒含量低，疫苗生产成本高，免疫效果差的问题，本发明提供了一种提高重组禽流感病毒感染鸡胚能力的方法，包括如下步骤：
(1)将稀释后的重组禽流感病毒的原始种子病毒液接种于SPF鸡胚，接种量为每胚0.1mL，于33-34℃培养72h，剔除死胚，活胚冷藏后，取HA效价为10log2-11log2，EID50为109.0-1010.0EID50/mL(若病毒培养的病毒含量HA、EID50值不能达到要求水平，选取HA、EID50值最高的)鸡胚病毒液进行收获，即得F0代种子病毒液；
(2)取步骤(1)获得的F0代病毒液，进行稀释后接种于SPF鸡胚，接种量为每胚0.1mL，于33-34℃培养72h，剔除死胚，活胚冷藏后，选取HA效价为10log2-11log2，EID50为109.0-1010.0EID50/mL(若病毒培养的病毒含量HA、EID50值不能达到要求水平，选取HA、EID50值最高的)的鸡胚病毒液进行收获，即得F1代种子病毒液；
(3)取步骤(2)获得的F1代病毒液，进行稀释后接种于SPF鸡胚，接种量为每胚0.1mL，于33-34℃培养72h，剔除死胚，活胚冷藏后，选取HA效价为10log2-11log2，EID50为109.0-1010.0EID50/mL(若病毒培养的病毒含量HA、EID50值不能达到要求水平，选取HA、EID50值最高的)的鸡胚病毒液进行收获，即得F2代种子病毒液；
所述稀释所用稀释液的组成为碱性成纤维生长因子1-1.5ng/mL，EDTA螯合锌1-3mg/mL，无水硫酸镁0.5-1mg/mL，L-盐酸赖氨酸0.1-0.5mg/mL，余量为磷酸盐缓冲溶液，pH为7.2-7.4。
进一步地限定，步骤(1)所述稀释的稀释度为10-4。
进一步地限定，步骤(2)所述稀释的稀释度为10-5-10-10。
进一步地限定，步骤(3)所述稀释的稀释度为10-5-10-10。
进一步地限定，所述方法中SPF鸡胚的日龄为11日龄。
进一步地限定，所述方法中的冷藏温度为2-8℃。
进一步地限定，所述方法中的冷藏时间为12-18h。
进一步地限定，所述磷酸盐缓冲溶液的组成为NaCl8.0g/L，KCl0.2g/L，KH2PO40.2g/L，Na2HPO412H2O2.9g/L，余量为水，pH为7.2-7.4。
进一步地限定，所述重组禽流感病毒包括重组禽流感病毒H5N8亚型H5-Re14株，重组禽流感病毒H5N6亚型H5-Re13株，重组禽流感病毒H7N9亚型H7-Re4株。
本发明还提供了上述方法获得的种子病毒液。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种提高重组禽流感病毒感染鸡胚能力的方法，该方法针对鸡胚在孵化过程中由于鸡胚组织分化速度加快产生大量的生理热，影响鸡胚的发育的问题，降低孵化温度，并加入生产因子、氨基酸、无机盐等防止孵化温度过低影响鸡胚活性及机体代谢，促进鸡胚组织分化，进而提高病毒在鸡胚中的繁殖，提高抗原液病毒含量，提高疫苗的免疫效果，能够用于禽流感疫苗的生产。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体的实施方式对本发明进行进一步详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法，所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。
本发明涉及的重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活疫苗由重组禽流感病毒H5N6亚型H5-Re13株，重组禽流感病毒H5N8亚型H5-Re14株和重组禽流感病毒H7N9亚型H7-Re4株制备获得，为现有的农业部批准生产的兽用高致病性禽流感疫苗，已于2022年1月批准上市。
毒种来源：本发明涉及的重组禽流感病毒H5N6亚型H5-Re13株，重组禽流感病毒H5N8亚型H5-Re14株和重组禽流感病毒H7N9亚型H7-Re4株均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室发放。
鸡胚来源：SPF鸡胚和非免疫鸡胚来源于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽类实验动物资源库。
鸡胚的发育到中期阶段，尤其是孵化第13天开始，鸡胚在孵化过程中由于鸡胚组织分化速度加快产生大量的生理热，会影响鸡胚的发育。然而降低孵化温度，也会影响鸡胚的发育。
本发明针对鸡胚发育中期产生大量生理热，影响鸡胚发育，且降低孵化温度也会影响鸡胚发育的问题，在降低孵化温度的同时防止孵化温度过低影响鸡胚活性及机体代谢，加入生长因子、氨基酸、无机盐等，促进胚组织分化，病毒繁殖，以提高重组禽流感病毒感染鸡胚能力，具体提供了一种提高重组禽流感病毒感染鸡胚能力的方法。
实施例1：
(1)取重组禽流感病毒H5N8亚型H5-Re14株原始种子病毒液，将其稀释104倍后接种于11日龄SPF鸡胚(0.1mL/胚)，于33℃培养72h，照胚剔除死胚，将活胚置于4℃冷藏15h后，取HA效价为10log2-11log2和109.0-1010.0EID50/mL(若病毒培养的病毒含量HA、EID50值不能达到要求水平，选取HA、EID50值最高的)的鸡胚进行收获，标记为F0代病毒液，放置于-80℃低温冰箱保存；
(2)取步骤(1)获得的F0代病毒液，将其进行108倍稀释后接种于11日龄SPF鸡胚(0.1mL/胚)，于33℃培养72h，照胚剔除死胚，将活胚置于4℃冷藏15h后，取HA效价为10log2-11log2和109.0-1010.0EID50/mL(若病毒培养的病毒含量HA、EID50值不能达到要求水平，选取HA、EID50值最高的)的鸡胚进行收获，即得F1代种子病毒液，放置于-80℃低温冰箱保存；
(3)取步骤(2)获得的F1代病毒液，将其进行108倍稀释后接种于11日龄SPF鸡胚(0.1mL/胚)，于33℃培养72h，照胚剔除死胚，将活胚置于4℃冷藏15h后，选取HA效价为10log2-11log2和109.0-1010.0EID50/mL(若病毒培养的病毒含量HA、EID50值不能达到要求水平，选取HA、EID50值最高的)的鸡胚进行收获，即得F2代种子病毒液，放置于-80℃低温冰箱保存；
上述各步骤中稀释所用稀释液的组成为碱性成纤维生长因子1.2ng/mL，EDTA螯合锌2mg/mL，无水硫酸镁0.7mg/mL，L-盐酸赖氨酸0.3mg/mL，余量为磷酸盐缓冲溶液，pH为7.2；磷酸盐缓冲溶液的组成为NaCl8.0g/L，KCl0.2g/L，KH2PO40.2g/L，Na2HPO412H2O2.9g/L，余量为水，pH为7.2。
实施例2：
(1)取重组禽流感病毒H5N8亚型H5-Re14株原始种子病毒液，将其稀释104倍后接种于11日龄SPF鸡胚(0.1mL/胚)，于34℃培养72h，照胚剔除死胚，将活胚置于4℃冷藏15h后，取HA效价为10log2-11log2和109.0-1010.0EID50/mL(若病毒培养的病毒含量HA、EID50值不能达到要求水平，选取HA、EID50值最高的)的鸡胚进行收获，标记为F0代病毒液，放置于-80℃低温冰箱保存；
(2)取步骤(1)获得的F0代病毒液，将其进行108倍稀释后接种于11日龄SPF鸡胚(0.1mL/胚)，于34℃培养72h，照胚剔除死胚，将活胚置于4℃冷藏15h后，取HA效价为10log2-11log2和109.0-1010.0EID50/mL(若病毒培养的病毒含量HA、EID50值不能达到要求水平，选取HA、EID50值最高的)的鸡胚进行收获，即得F1代种子病毒液，放置于-80℃低温冰箱保存；
(3)取步骤(2)获得的F1代病毒液，将其进行108倍稀释后接种于11日龄SPF鸡胚(0.1mL/胚)，于34℃培养72h，照胚剔除死胚，将活胚置于4℃冷藏15h后，取HA效价为10log2-11log2和109.0-1010.0EID50/mL(若病毒培养的病毒含量HA、EID50值不能达到要求水平，选取HA、EID50值最高的)的鸡胚进行收获，即得F2代种子病毒液，放置于-80℃低温冰箱保存；
上述各步骤中稀释所用稀释液的组成为碱性成纤维生长因子1.2ng/mL，EDTA螯合锌2mg/mL，无水硫酸镁0.7mg/mL，L-盐酸赖氨酸0.3mg/mL，余量为磷酸盐缓冲溶液，pH为7.2；磷酸盐缓冲溶液的组成为NaCl8.0g/L，KCl0.2g/L，KH2PO40.2g/L，Na2HPO412H2O2.9g/L，余量为水，pH为7.2。
对比例1：
(1)取重组禽流感病毒H5N8亚型H5-Re14株原始种子病毒液，将其稀释104倍后接种于11日龄SPF鸡胚(0.1mL/胚)，于36℃培养72h，照胚剔除死胚，将活胚置于4℃冷藏15h后取HA为10log2-11log2和109.0-1010.0EID50/mL(若病毒培养的病毒含量HA、EID50值不能达到要求水平，选取HA、EID50值最高的)的鸡胚进行收获，标记为F0代病毒液，放置于-80℃低温冰箱保存；
(2)取步骤(1)获得的F0代病毒液，将其进行108倍稀释后接种于11日龄SPF鸡胚(0.1mL/胚)，于36℃培养72h，照胚剔除死胚，将活胚置于4℃冷藏15h后，选取HA效价为10log2-11log2和109.0-1010.0EID50/mL(若病毒培养的病毒含量HA、EID50值不能达到要求水平，选取HA、EID50值最高的)的鸡胚进行收获，即得F1代种子病毒液，放置于-80℃低温冰箱保存；
(3)取步骤(2)获得的F1代病毒液，将其进行108倍稀释后接种于11日龄SPF鸡胚(0.1mL/胚)，于36℃培养72h，照胚剔除死胚，将活胚置于4℃冷藏15h后，选取HA效价为10log2-11log2和109.0-1010.0EID50/mL(若病毒培养的病毒含量HA、EID50值不能达到要求水平，选取HA、EID50值最高的)的鸡胚进行收获，即得F2代种子病毒液，放置于-80℃低温冰箱保存；
上述各步骤中稀释所用稀释液为0.9％生理盐水。
实施例3：
(1)取重组禽流感病毒H5N6亚型H5-Re13株原始种子病毒液，将其稀释104倍后接种于11日龄SPF鸡胚(0.1mL/胚)，于33℃培养72h，照胚剔除死胚，将活胚置于4℃冷藏15h后，取HA效价为10log2-11log2和109.0-1010.0EID50/mL(若病毒培养的病毒含量HA、EID50值不能达到要求水平，选取HA、EID50值最高的)的鸡胚进行收获，标记为F0代病毒液，放置于-80℃低温冰箱保存；
(2)取步骤(1)获得的F0代病毒液，将其进行108倍稀释后接种于11日龄SPF鸡胚(0.1mL/胚)，于33℃培养72h，照胚剔除死胚，将活胚置于4℃冷藏15h后，取HA效价为10log2-11log2和109.0-1010.0EID50/mL(若病毒培养的病毒含量HA、EID50值不能达到要求水平，选取HA、EID50值最高的)的鸡胚进行收获，即得F1代种子病毒液，放置于-80℃低温冰箱保存；
(3)取步骤(2)获得的F1代病毒液，将其进行108倍稀释后接种于11日龄SPF鸡胚(0.1mL/胚)，于33℃培养72h，照胚剔除死胚，将活胚置于4℃冷藏15h后，取HA效价为10log2-11log2和109.0-1010.0EID50/mL(若病毒培养的病毒含量HA、EID50值不能达到要求水平，选取HA、EID50值最高的)的鸡胚进行收获，即得F2代种子病毒液；
上述各步骤中稀释所用稀释液的组成为碱性成纤维生长因子1ng/mL，EDTA螯合锌1mg/mL，无水硫酸镁0.5mg/mL，L-盐酸赖氨酸0.1mg/mL，余量为磷酸盐缓冲溶液，pH为7.2；磷酸盐缓冲溶液的组成为NaCl8.0g/L，KCl0.2g/L，KH2PO40.2g/L，Na2HPO412H2O2.9g/L，余量为水，pH为7.2。
实施例4：
(1)取重组禽流感病毒H5N6亚型H5-Re13株原始种子病毒液，将其稀释104倍后接种于11日龄SPF鸡胚(0.1mL/胚)，于34℃培养72h，照胚剔除死胚，将活胚置于4℃冷藏15h后，取HA效价为10log2-11log2和109.0-1010.0EID50/mL(若病毒培养的病毒含量HA、EID50值不能达到要求水平，选取HA、EID50值最高的)的鸡胚进行收获，并标记为F0代病毒液，放置于-80℃低温冰箱保存。
(2)取步骤(1)获得的F0代病毒液，将其进行108倍稀释后接种于11日龄SPF鸡胚(0.1mL/胚)，于34℃培养72h，照胚剔除死胚，将活胚置于4℃冷藏15h后，取HA效价为10log2-11log2和109.0-1010.0EID50/mL(若病毒培养的病毒含量HA、EID50值不能达到要求水平，选取HA、EID50值最高的)的鸡胚进行收获，即得F1代种子病毒液，放置于-80℃低温冰箱保存；
(3)取步骤(2)获得的F1代病毒液，将其进行108倍稀释后接种于11日龄SPF鸡胚(0.1mL/胚)，于34℃培养72h，照胚剔除死胚，将活胚置于4℃冷藏15h后，取HA效价为10log2-11log2和109.0-1010.0EID50/mL(若病毒培养的病毒含量HA、EID50值不能达到要求水平，选取HA、EID50值最高的)的鸡胚进行收获，即得F2代种子病毒液，放置于-80℃低温冰箱保存；
上述各步骤中稀释所用稀释液的组成为碱性成纤维生长因子1ng/mL，EDTA螯合锌1mg/mL，无水硫酸镁0.5mg/mL，L-盐酸赖氨酸0.1mg/mL，余量为磷酸盐缓冲溶液；磷酸盐缓冲溶液的组成为NaCl8.0g/L，KCl0.2g/L，KH2PO40.2g/L，Na2HPO412H2O2.9g/L，余量为水。
对比例2：
(1)取重组禽流感病毒H5N6亚型H5-Re13株原始种子病毒液，将其稀释104倍后接种于11日龄SPF鸡胚(0.1mL/胚)，于36℃培养72h，照胚剔除死胚，将活胚置于4℃冷藏15h后，取HA效价HA为10log2-11log2和109.0-1010.0EID50/mL(若病毒培养的病毒含量HA、EID50值不能达到要求水平，选取HA、EID50值最高的)的鸡胚进行收获，标记为F0代病毒液，放置于-80℃低温冰箱保存；
(2)取步骤(1)获得的F0代病毒液，将其进行108倍稀释后接种于11日龄SPF鸡胚(0.1mL/胚)，于36℃培养72h，照胚剔除死胚，将活胚置于4℃冷藏15h后，取HA效价为10log2-11log2和109.0-1010.0EID50/mL(若病毒培养的病毒含量HA、EID50值不能达到要求水平，选取HA、EID50值最高的)的鸡胚进行收获，即得F1代种子病毒液，放置于-80℃低温冰箱保存；
(3)取步骤(2)获得的F1代病毒液，将其进行108倍稀释后接种于11日龄SPF鸡胚(0.1mL/胚)，于36℃培养72h，照胚剔除死胚，将活胚置于4℃冷藏15h后，选取HA效价为10log2-11log2和109.0-1010.0EID50/mL(若病毒培养的病毒含量HA、EID50值不能达到要求水平，选取HA、EID50值最高的)的鸡胚进行收获，即得F2代种子病毒液，放置于-80℃低温冰箱保存；
上述各步骤中稀释所用稀释液为0.9％生理盐水。
实施例5：
(1)取重组禽流感病毒H7N9亚型H7-Re4株原始种子病毒液，将其稀释104倍后接种于11日龄SPF鸡胚(0.1mL/胚)，于33℃培养72h，照胚剔除死胚，将活胚置于4℃冷藏15h后，取HA效价为10log2-11log2和109.0-1010.0EID50/mL(若病毒培养的病毒含量HA、EID50值不能达到要求水平，选取HA、EID50值最高的)的鸡胚进行收获，标记为F0代病毒液，放置于-80℃低温冰箱保存；
(2)取步骤(1)获得的F0代病毒液，将其进行108倍稀释后接种于11日龄SPF鸡胚(0.1mL/胚)，于33℃培养72h，照胚剔除死胚，将活胚置于4℃冷藏15h后，取HA效价为10log2-11log2和109.0-1010.0EID50/mL(若病毒培养的病毒含量HA、EID50值不能达到要求水平，选取HA、EID50值最高的)的鸡胚进行收获，即得F1代种子病毒液，放置于-80℃低温冰箱保存；
(3)取步骤(2)获得的F1代病毒液，将其进行108倍稀释后接种于11日龄SPF鸡胚(0.1mL/胚)，于33℃培养72h，照胚剔除死胚，将活胚置于4℃冷藏15h后，取HA效价为10log2-11log2和109.0-1010.0EID50/mL(若病毒培养的病毒含量HA、EID50值不能达到要求水平，选取HA、EID50值最高的)的鸡胚进行收获，即得F2代种子病毒液，放置于-80℃低温冰箱保存；
上述各步骤中稀释所用稀释液的组成为碱性成纤维生长因子1.5ng/mL，EDTA螯合锌3mg/mL，无水硫酸镁1mg/mL，L-盐酸赖氨酸0.5mg/mL，余量为磷酸盐缓冲溶液，pH为7.2；磷酸盐缓冲溶液的组成为NaCl8.0g/L，KCl0.2g/L，KH2PO40.2g/L，Na2HPO412H2O2.9g/L，余量为水，pH为7.2。
实施例6：
(1)取重组禽流感病毒H7N9亚型H7-Re4株原始种子病毒液，将其稀释104倍后接种于11日龄SPF鸡胚(0.1mL/胚)，于34℃培养72h，照胚剔除死胚，将活胚置于4℃冷藏15h后，取HA效价为10log2-11log2和109.0-1010.0EID50/mL(若病毒培养的病毒含量HA、EID50值不能达到要求水平，选取HA、EID50值最高的)的鸡胚进行收获，标记为F0代病毒液，放置于-80℃低温冰箱保存；
(2)取步骤(1)获得的F0代病毒液，将其进行108倍稀释后接种于11日龄SPF鸡胚(0.1mL/胚)，于34℃培养72h，照胚剔除死胚，将活胚置于4℃冷藏15h后，取HA效价为10log2-11log2和109.0-1010.0EID50/mL(若病毒培养的病毒含量HA、EID50值不能达到要求水平，选取HA、EID50值最高的)的鸡胚进行收获，即得F1代种子病毒液，放置于-80℃低温冰箱保存；
(3)取步骤(2)获得的F1代病毒液，将其进行108倍稀释后接种于11日龄SPF鸡胚(0.1mL/胚)，于34℃培养72h，照胚剔除死胚，将活胚置于4℃冷藏15h后，取HA效价为10log2-11log2和109.0-1010.0EID50/mL(若病毒培养的病毒含量HA、EID50值不能达到要求水平，选取HA、EID50值最高的)的鸡胚进行收获，即得F2代种子病毒液，放置于-80℃低温冰箱保存；
上述各步骤中稀释所用稀释液的组成为碱性成纤维生长因子1.5ng/mL，EDTA螯合锌3mg/mL，无水硫酸镁1mg/mL，L-盐酸赖氨酸0.5mg/mL，余量为磷酸盐缓冲溶液，pH为7.2；磷酸盐缓冲溶液的组成为NaCl8.0g/L，KCl0.2g/L，KH2PO40.2g/L，Na2HPO412H2O2.9g/L，余量为水，pH为7.2。
对比例3：
(1)取重组禽流感病毒H7N9亚型H7-Re4株原始种子病毒液，将其稀释104倍后接种于11日龄SPF鸡胚(0.1mL/胚)，于36℃培养72h，照胚剔除死胚，将活胚置于4℃冷藏15h后，取HA效价为10log2-11log2和109.0-1010.0EID50/mL(若病毒培养的病毒含量HA、EID50值不能达到要求水平，选取HA、EID50值最高的)的鸡胚进行收获，标记为F0代病毒液，放置于-80℃低温冰箱保存；
(2)取步骤(1)获得的F0代病毒液，将其进行108倍稀释后接种于11日龄SPF鸡胚(0.1mL/胚)，于36℃培养72h，照胚剔除死胚，将活胚置于4℃冷藏15h后，取HA效价为10log2-11log2和109.0-1010.0EID50/mL(若病毒培养的病毒含量HA、EID50值不能达到要求水平，选取HA、EID50值最高的)的鸡胚进行收获，即得F1代种子病毒液，放置于-80℃低温冰箱保存；
(3)取步骤(2)获得的F1代病毒液，将其进行108倍稀释后接种于11日龄SPF鸡胚(0.1mL/胚)，于36℃培养72h，照胚剔除死胚，将活胚置于4℃冷藏15h后，选取HA效价为10log2-11log2和109.0-1010.0EID50/mL(若病毒培养的病毒含量HA、EID50值不能达到要求水平，选取HA、EID50值最高的)的鸡胚进行收获，即得F2代种子病毒液，放置于-80℃低温冰箱保存；
上述各步骤中稀释所用稀释液为0.9％生理盐水。
对上述实施例和对比例获得的F2代种子病毒液进行HA和EID50检测，检测结果见表1。
表1实施例1-6及对比例1-3获得的F2代种子病毒液的HA和EID50检测结果
由表1可知，相比于进行36℃培养的对照组，进行33-34℃低温培养的实施例1-6能够获得病毒含量更高，病毒感染能力更强的病毒液。
分别选取实施例1-6获得的F2代种子病毒液，将F2代种子病毒液进行稀释，稀释度为10-4。取稀释后的病毒液，尿囊腔接种11日龄非免疫鸡胚，每胚接种0.1mL。接种后将鸡胚分别进行33℃和34℃孵化，不必翻蛋。孵化72h后进行照胚，将死胚剔除，活胚全部取出置于4℃冷库进行冷胚15h。将冷却的鸡胚取出，对鸡胚表面进行消毒。利用全自动收获机对鸡胚进行逐枚收获，通过真空泵、收获管路将尿囊液收获至50L收获罐内。全部鸡胚收获后对收获的尿囊液进行取样，取样不少于1mL，将样品进行HA效价和EID50测定。对照组分别取对比例1-3获得的F2代种子病毒液，按照上述步骤制备样品，区别在于分别进行34℃和36℃孵化，并对样品进行HA效价和EID50测定。测定结果见表2。
表2对实验例1-6和对比例1-3接种后的抗原进行检测的结果
由表2可知，在更改接种稀释液后，接种鸡胚在34℃孵化，可以提高重组禽流感病毒对鸡胚的感染能力。
将34℃孵化的实验组病毒液，收获后的抗原液经过连续流离心、过滤，进行超滤浓缩。分别取各样品的浓缩3倍、浓缩5倍的抗原液，放置于玻璃瓶中。按照抗原量加入0.01％的甲醛溶液，甲醛分批次均匀加入，将抗原液与甲醛充分混匀后，置于36-37℃温箱12-16小时进行灭活。灭活后进行取样并将灭活液放置2-8℃保存，进行无菌检验、灭活检验，检验合格后进行疫苗制备。将白油分别与3倍浓缩、5倍浓缩的灭活液按照2:1的比例进行混合，其中吐温80占水相的7％、司盘占油相的5％，制备成油乳剂灭活疫苗。同时取36℃孵化的对照组按照上述步骤制备3倍浓缩灭活液、5倍浓缩的灭活液，采用相同方法和比例配制成油乳剂灭活疫苗。每组疫苗中重组禽流感病毒H5N6亚型H5-Re13株、重组禽流感病毒H7N9亚型H7-Re4株、重组禽流感病毒H5N8亚型H5-Re14株采用相同法法制备。将3种疫苗和对照组疫苗分别进行免疫。选取21日龄SPF鸡共40只，分4组每组10只，具体分组见表3。每只免疫0.3mL。免疫后将每组鸡只放入单独隔离器进行饲养。效力检验：接种21天后，将全部免疫鸡只进行采血，测定每种病毒的HI抗体(见表3)。
表3各组疫苗的HI抗体检测结果
由表3结果可知，将34℃孵化并更改接种稀释液的实验组抗原液3倍浓缩制备疫苗，各毒株的抗体水平均高于传统常规孵化条件抗原5倍浓缩制备的疫苗。
综上所述，本发明的一种提高重组禽流感病毒感染鸡胚能力的方法，有效提高病毒接种后的病毒滴度及繁殖能力，免疫效力高于传统生产工艺生产的禽流感疫苗，可以应用于重组禽流感灭活疫苗的生产。并可节约生产成本，提高生产劳动效率。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (9)
1.一种提高重组禽流感病毒感染鸡胚能力的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将稀释后的重组禽流感病毒的原始种子病毒液接种于SPF鸡胚，接种量为每胚0.1mL，于33-34℃培养72 h，剔除死胚，活胚冷藏后，取HA效价为10log2-11log2和109.0-1010.0EID50/mL的鸡胚病毒液进行收获，即得F0代种子病毒液；
（2）取步骤（1）获得的F0代病毒液，进行稀释后接种于SPF鸡胚，接种量为每胚0.1 mL，于33-34℃培养72 h，剔除死胚，活胚冷藏后，选取HA效价为10log2-11log2和109.0-1010.0EID50/mL的鸡胚病毒液进行收获，即得F1代种子病毒液；
（3）取步骤（2）获得的F1代病毒液，进行稀释后接种于SPF鸡胚，接种量为每胚0.1 mL，于33-34℃培养72 h，剔除死胚，活胚冷藏后，选取HA效价为10log2-11log2和109.0-1010.0EID50/mL的鸡胚病毒液进行收获，即得F2代种子病毒液；
所述稀释所用稀释液的组成为碱性成纤维生长因子1-1.5 ng/mL，EDTA螯合锌1-3 mg/mL，无水硫酸镁0.5-1 mg/mL，L-盐酸赖氨酸0.1-0.5 mg/mL，pH为7.2-7.4，余量为磷酸盐缓冲溶液；
所述重组禽流感病毒为重组禽流感病毒H5N8亚型H5-Re14株或重组禽流感病毒H5N6亚型H5-Re13株或重组禽流感病毒H7N9亚型H7-Re4株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述稀释的稀释度为10-4。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述稀释的稀释度为10-5-10-10。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述稀释的稀释度为10-5-10-10。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中SPF鸡胚的日龄为11日龄。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中的冷藏温度为2-8℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中的冷藏时间为12-18 h。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲溶液的组成为NaCl 8.0g/L，KCl 0.2 g/L，KH2PO4 0.2 g/L，Na2HPO4 12H2O 2.9 g/L，余量为水，pH为7.2-7.4。
9.由权利要求1-8任意一项所述方法获得的种子病毒液。
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