CN102565390B

CN102565390B - 鸡新城疫诊断用抗原制备方法

Info

Publication number: CN102565390B
Application number: CN201110428929.0A
Authority: CN
Inventors: 楚电峰; 杜元钊; 刘相娥; 刘思思; 徐慧琳; 侯新华
Original assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2011-12-20
Filing date: 2011-12-20
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2031-12-20
Also published as: CN102565390A

Abstract

本发明涉及鸡新城疫诊断抗原制备工艺流程，对如下环节进行详细的说明与阐述，包括制备抗原用种毒的筛选、优化，培养病毒用种胚选择，孵化要求、收获培养物，甲醛灭活工艺，浓缩过程等等。采用该优化工艺制备的鸡新城疫诊断抗原具有效价稳定、保存时间长、测定抗体滴度准确等特点。

Description

鸡新城疫诊断用抗原制备方法

技术领域

本发明涉及一种鸡新城疫诊断用抗原制备方法，属于兽用生物制品领域。

背景技术

新城疫是由新城疫病毒引起的一种禽类急性、热性、败血性传染病，也是危害养禽业的最重要的疾病之一，该病常呈败血症经过，主要特征是呼吸困难，下痢，神经机能紊乱，粘膜和浆膜出血。其传播速度快、死亡率高，危害严重，每年给世界养禽业造成巨大的经济损失，因此被国际兽医局(OIE)列为A类传染病。通过快速、准确的方法鉴定本病，是预防和减少该病危害的有效措施(蔡宝祥，殷震，谢三星等.动物传染病诊断学.南京：江苏科学技术出版社，1993，177～180.)。也有部分学者从事新城疫抗原研究，但均不具体，也没有解决新城设诊断抗原制备工艺的关键控制点，本发明人主要解决了该诊断抗原的实质性关键问题，且实解决了新城疫抗原只停留在研究阶段，从根本上将该工艺应用于生产检验的实践中，为鸡场新城疫的感染与早期诊断预防提供很好的诊断、鉴别用抗原。

发明内容

本发明的目的是制备出适用于鸡新城疫诊断用抗原，为鸡场早期诊断和预防鸡新城疫，减少经济损失，提供优良的诊断制品。本发明采用免疫原性好、效价高，稳定、毒力弱的新城疫病毒IV系La Sota株病毒作为抗原制备用种毒，经适宜条件培养后，收获培养物，经甲醛溶液灭活，超滤浓缩后，辅以相应冻干保护剂，经冷冻干燥后制成。用于诊断和早期预防鸡新城疫。

一、制备诊断抗原用毒株

1.毒株来源

制备诊断抗原的病毒为新城疫病毒(Newcastle disease virus)LaSota-C8株病毒，该病毒已于2011年12月13日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.5576。该新城疫病毒CGMCC No.5576株来自目前世界公认的鸡新城疫诊断抗原的制备与预防用疫苗生产的经典毒株新城疫病毒CVCC AV1615毒株；对CVCC AV1615毒株经系统克隆、筛选、纯化等工艺，优选出病毒血凝(HA)效价高、病毒含量(EID₅₀)高的克隆株病毒，该毒株最大程度的提高了种毒的效价保持原新城疫病毒CVCCAV1615毒株遗传稳定、毒力弱、不返强等特点，安全性能良好等特点。

2.毒株特点

(1)培养特性本病毒株适宜在在9～10日龄的鸡胚上培养，温度为36.5℃、湿度为55％～60％，培养特性良好，繁殖性能高，且遗传稳定性好。

(2)效价病毒血凝(HA)效价高达到2¹¹、病毒含量(EID₅₀)高达到10^9.3～10^9.7/0.1ml。

(3)菌株毒力毒力弱，本病毒株适宜用于鸡新城疫活疫苗与灭活疫苗生产之用，对各日龄鸡均较安全，毒力不返强，且传代稳定性良好。

二、本诊断抗原的制备与检验：

1.抗原制备

(1)病毒种毒该抗原是用鸡毒株为新城疫病毒La Sota-C8株作为抗原生产毒株的；

(2)种蛋选用美国Merial公司9～10日龄的SPF鸡胚进行培养，要求种蛋大小均匀、表面清洁、受精率高、孵化率高、纯净无任何外源病毒或细菌污染；

(3)孵化先对孵化器进行甲醛熏蒸消毒。温度：一般在37.5℃～38℃之间。湿度：立体孵化器的最适宜孵化湿度75％；通风换气：随着鸡胚的发育，产生的热量增多，同时对氧气的需要量也逐渐增大，要保持孵化器内空气新鲜，风扇转速一般为60～180r/min；

(4)收获接种种毒后的鸡胚，后孵化要求温度36.5℃、湿度55％～60％，培养96～120小时；逐个无菌收获鸡胚尿囊液，混合均匀后成为制备抗原的病毒液；

(5)灭活按病毒液体积的1‰体积(V/V)加入福尔马林溶液，置于100～120r/min摇床上摇晃，于2℃～8℃灭活间48小时；

(6)浓缩工艺采用美国Millipore高密度浓缩机对抗原用病毒液进行浓缩，去除大分子杂蛋白、尿酸盐等外源杂质干扰，提高病毒液的纯度和效价；

(7)冻干采用明胶蔗糖保护剂，经高压灭菌后与灭活后的病毒液按1∶1的比例混合均匀，等量分装后冻干。

2.抗原检验

按现行《中华人民共和国兽用生物制品规程》(中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程2000年版.中国农业出版社，2000，以下简称《规程》)中要求，分别进血凝效价HA、纯粹性检验、外源病毒检验和灭活检验。

本发明的详细描述

一.诊断抗原的制备

1.制备用种毒的筛选与优化

为提高种毒的效价，我们采用CEF细胞培养蚀斑法和鸡胚传代筛选法，对制备抗原用种毒进行逐代筛选、纯化，经过反复试验，最终得到一株较好的病毒侯选株。该筛选病毒株的效价，繁殖特性、生物学活性等都有一定程度的提高，且传代稳定性良好。经过不断优化、筛选的病毒株血凝(HA)效价提高2个滴度，病毒含量(EID50)提高10^1.0～10^1.5次方，最大程度的提高了制备抗原用病毒液的种毒效价。

2.抗原制备用种蛋的选择

9～10日龄鸡胚为该病毒株培养的最适宜培养基，我们选择纯净来源清楚，资质可靠的胚源，美国梅里亚公司的SPF种蛋进行病毒的培养。把选种蛋均经过严格的外源病毒等的检测，保证无任何外源病毒或细菌污染。对所选种蛋要求如下：

(1)SPF种蛋外观：要求蛋面清洁，蛋大小均匀，沙皮蛋、畸形蛋、硬壳蛋都会影响孵化率。蛋托和箱子都要严格消毒，密封后。运输工具也要进行消毒。

(2)SPF种蛋的运输：SPF种蛋在运输过程中注意防寒、防雨、防晒，避免强烈的震动，造成气室移位或蛋壳破裂。

(3)SPF种蛋的接收：接收SPF种蛋后，将SPF种蛋放置在消毒过的场所，保存温度在10℃～15℃之间，保存湿度在70℃～75℃之间。保存时间越短越好，一般以不超过7天为宜。由专门的检验人员抽样进行外源病毒检测。

3.种蛋的孵化要求

在种蛋入孵之前，先对孵化器进行甲醛熏蒸消毒，待种蛋入孵后，再对孵化环境和种蛋表面进行一次TH4+的喷洒消毒，保证整个环境洁净，无活菌等影响种蛋质量的微生物存在，在同一个孵化器内不能同时孵化其它非SPF胚或普通鸡胚。温度要求：前孵化时温度一般控制在37.5℃～38℃之间。湿度要求：立体孵化器的最适宜孵化湿度为75％，保证整个孵化过程的湿度不低于70％。通风换气要求：随着鸡胚的发育，不断长大，自身产生的热量逐渐增多，同时对氧气等的需求量也逐渐增大，要保持孵化器内空气新鲜，通风口畅通，风扇转速一般控制在60～180r/min。

4.培养物的收获

接种经筛选优化后的种毒后，SPF胚的后孵化要求在温度36.5度、湿度55％～60％环境下，培养4～5天(即96～120小时)。每天照胚2～3次，观察鸡胚的健活情况，发现有死胚或弱胚，随时取出，置2℃～8℃，气室向上直立，等到孵化时间结束后，连同活胚一起置入2℃～8℃环境下8～12小时。以无菌手术操作方式，逐个收获鸡胚培养的尿囊液，分别检测效价与纯净性，将合格的病毒液均匀混合后作为诊断用抗原的半成品。

5.病毒液的灭活

取无菌方式收获的病毒液均匀混合后，采用福尔马林溶液(分析纯AR：国药集团)灭活，按病毒液体积的1‰体积加入福尔马林溶液，在2℃～8℃的温度下灭活，灭活时间为48小时，整个灭活过程保持缓慢摇晃，摇床转速为100～120转/分钟。

6.浓缩工艺

采用美国Millipore公司生产的高密度浓缩机对制备抗原用病毒液进行浓缩，去除大分子异物、杂蛋白、尿酸盐等外源杂质干扰，同时却除部分水分，使收获的病毒液更纯净，病毒液的效价更高、可用成分更高。

7.冻干保存

采用明胶蔗糖保护剂，经高压灭菌后与灭活后的病毒液按1∶1的比例混合均匀，等量分装入小青瓶中，轧盖、抽真空，按一定的冻干曲线冻干保存，冻干成品置2℃～8℃保存。

8.抽样检测

冻干成品出箱后，按照现行《中华人民共和国兽用生物制品规程》要求进行抽样检验。

二.诊断抗原的检验

1.效价测定

对所抽取的诊断用抗原制品，进行血凝效价(HA)的测定，达不到2¹⁰的，全部报废。对制备的3批鸡新城疫诊断抗原制品进行检测，结果均符合要求：

批号	HA效价	结果
			2011001	2¹²	合格
2011002	2¹¹	合格
			2011003	2¹²	合格

2.灭活检验

抽取诊断用抗原制品，在洁净工作台内打开，用灭菌PBS稀释后，接种9～10日龄SPF鸡胚，36.5℃培养5天，测定鸡胚病毒液的血凝效价，如果无血凝效价，说明抗原制品灭活彻底，无活微生物存在；如果有血凝性，再盲传一次，若无血凝性，则说明灭活彻底，只是病毒效价较高，而引起的血凝性，若仍有血凝性，则灭活不彻底，为不合格产品，需报废该批产品。

3.特异性鉴定

对冻干的诊断抗原制品，需进行特异性鉴别检验。采用标准阳性血清中和，25℃作用1小时，接种9～10日龄SPF鸡胚，36.5℃培养5天，测定鸡胚病毒液的血凝效价，如果无血凝效价，说明抗原制品灭活彻底，无活微生物存在；如果有血凝性，再盲传一次，若无血凝性，则说明灭活彻底，只是病毒效价较高，而引起的血凝性，若仍有血凝性，则灭活不彻底，为不合格产品，该批产品需报废处理。

4.纯净性鉴定

分别采用硫乙醇酸盐(T.G)、葡萄糖蛋白胨(G.A)、酪胨琼脂(G.P)对冻干的诊断抗原制品进行厌氧菌、需氧菌、霉菌和腐生菌等的检测，按现行《中华人民共和国兽药典》2010年版进行，37℃培养观察7天，阴性者再移植五支小试管继续培养3天，若仍为阴性，说明纯净性良好，无细菌污染，如果呈现阳性，则说明有外源细菌污染，则该批冻干制品应作报废处理。

5.冻干抗原效力检验

分别抽取三批诊断抗原样品，经检验合格后，按说明书进行稀释(说明书：2ml/瓶)，即取2ml灭菌PBS液加入到一瓶冻干诊断抗原制品中，观察到冻干制品立即溶解，轻轻摇晃即成均匀、颜色一致的抗原液，略呈微黄色。

分别取三批样品，进行HA测定，根据HA效价，按照现行《中华人民共和国兽药典》2010年版中四单位抗原制备要求进行四单位诊断抗原的配制，并按其内零规定的HI试验要求，同时对同一批鸡血清进行抗体的测定，结果如下：

本发明涉及的微生物：

本发明涉及的微生物NDV La Sota-C8株，该病毒已于2011年12月13日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.5576。

本发明的积极意义：

本发明是从筛选纯化优良种毒开始，对鸡新城疫诊断用抗原的制备，提供优良、高效价的种毒来源；又在种蛋的选择、种胚的孵化条件上进行优化，培养出高效价的诊断用抗原半成品，辅以冷链系统的灭活工艺，加之先进的超滤浓缩技术，保证了成品的纯净、单一和高浓度，最后配以良好的冻干保护剂，冻干保存。整个过程全在无菌环境下操作，保证了产品的纯净性，排除了对检测结果的干扰性。该诊断抗原具有纯度高、灭活彻底、安全性好、检测效力高且保存期长等优点。

Claims

1.一种鸡新城疫诊断用抗原制备方法，其特征在于：

（1）病毒种毒该抗原是用鸡毒株为新城疫病毒La Sota-C8株作为抗原生产毒株的，该病毒已于2011年12月13日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.5576；

（2）种蛋选用美国Merial公司9～10日龄的SPF鸡胚进行培养，要求种蛋大小均匀、表面清洁、受精率高、孵化率高、纯净无任何外源病毒或细菌污染；

（3）孵化先对孵化器进行甲醛熏蒸消毒，温度：在37.5℃～38℃之间；湿度，立体孵化器的最适宜孵化湿度75%；通风换气：随着鸡胚的发育，产生的热量增多，同时对氧气的需要量也逐渐增大，要保持孵化器内空气新鲜，风扇转速为60～180r/min；

（4）收获接种种毒后的鸡胚，后孵化要求温度36.5℃、湿度55%～60%，培养96～120小时；逐个无菌收获鸡胚尿囊液，混合均匀后成为制备抗原的病毒液；

（5）灭活按病毒液体积的1‰体积（V/V）加入福尔马林溶液，置于100～120r/min摇床上摇晃，于2℃～8℃灭活间48小时；

（6）浓缩工艺采用美国Millipore高密度浓缩机对抗原用病毒液进行浓缩，去除大分子杂蛋白、尿酸盐等外源杂质干扰，提高病毒液的纯度和效价；

（7）抗原效价抗原的病毒HA价达到2¹¹；病毒EID₅₀达10^9.3～10^9.7/0.1ml。