CN102580080A - 一种鸡新城疫-鸡传染性支气管炎病毒液的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸡新城疫-鸡传染性支气管炎病毒液的制备方法，具体为，首先将鸡新城疫毒种和鸡传染性支气管炎毒种进行稀释；向鸡胚中接种鸡新城疫毒种稀释液，孵育24小时后，再向同一鸡胚中接种鸡传染性支气管炎毒种稀释液；经过37℃孵育，收获得鸡新城疫-鸡传染性支气管炎病毒液。本发明方法有效减少了两种病毒在接种和繁殖过程中的相互干扰制约，降低了培养过程中的鸡胚死淘率，增加病毒繁殖数量，同时简化工艺，节约原材料，降低了生产成本。

Description

一种鸡新城疫-鸡传染性支气管炎病毒液的制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于制备禽用疫苗的病毒液的制备方法，尤其是一种鸡新城疫-鸡传染性支气管炎病毒液的制备方法。

背景技术

鸡新城疫(ND)及鸡传染性支气管炎(IB)目前仍然是危害我国养鸡业的主要传染病，具有传播迅速、危害大的特点，能引起急性高度接触性疾病。在养禽业趋于集约化、工业化的高密度饲养方式之后，为了预防鸡新城疫及鸡传染性支气管炎的发生，对疫苗的要求也更高，这两类疾病的防控已引起业内极大的重视。

新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的一种禽类急性、高度接触性传染病，被国际兽医局定为A类烈性传染病。该病自1926年首次发现于印尼，同年发现与英国新城，因此命名为新城疫。鸡新城疫广泛分布于世界上许多国家，禽类动物极易感染，其中以鸡的感受性最强，能引起一种急性、发热性的传染病，发病率和死亡率都很高，是严重危害养鸡业的重要疾病之一，造成很大的经济损失。鸡新城疫病毒是副粘病毒科副粘病毒属中的一个具有代表性的种，对外界环境的抵抗力较强，病毒对低温的抵抗力强，在4℃可存活数天，-20℃存活数周，-70℃时数年仍保存感染力。55℃作用45min和直射阳光下作用30min才能使病毒灭活。在新城疫爆发后8周内仍可从鸡舍、羽毛、蛋巢分离出病毒。

鸡传染性支气管炎(IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(IBV)引起的一种高度接触传染的疾病，主要侵害鸡的呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统。雏鸡发病后通常表现流鼻液、呼吸困难等呼吸道症状，甚至会发生死亡；此外，该病还可导致蛋鸡产蛋量下降和蛋白品质下降。该病目前在世界大多数养鸡地区都有发现，我国于1972年由邝荣禄教授在广东首先报道了该病的存在，现已蔓延至全国各地，给家禽养殖业造成重大的经济损失。

随着禽类养殖业的迅速发展，疾病的发生也日益趋向与复杂化。鸡新城疫和鸡传染性支气管炎在养鸡生产中发病率较高，危害尤为严重。免疫接种是预防该病的重要措施，但由于疫苗接种时母源抗体过高，或者疫苗质量和保存不当，免疫接种程序不合理等原因会造成鸡群免疫状态的差异，抵抗水平低的免疫鸡群不能抵抗强毒的侵袭，引起疾病的传播。

禽用疫苗及预防技术的研究受到广泛的关注，疫苗的免疫反应，简化的免疫程序、简单的制苗生产工艺、更低的疫苗生产及使用成本等问题成为关注的重点，禽用疫苗的制备工艺也在随之不断发展中。

目前已有鸡新城疫-鸡传染性支气管炎二联疫苗，用于这两种疾病的防控。在鸡新城疫-鸡传染性支气管炎二联疫苗制备过程中，须首先将两种病毒在鸡胚中增殖培养，病毒效价达到标准要求后，收获得鸡新城疫和鸡传染性支气管炎的病毒液，即制苗用毒液，之后进行相应的制剂手段制苗，获得二联疫苗。

传统的鸡新城疫-鸡传染性支气管炎病毒液的制备工艺是将两种毒种适当稀释后，分别接种鸡胚，分别收获鸡胚液后按照一定比例混合，制剂，得到二联疫苗。这样病毒的繁殖效果达标，但工艺复杂，原材料使用量大。

目前，也有研究分别将NDV和IBV稀释后混合，一次性同胚接种，经过孵化、收获鸡胚液得到鸡新城疫-鸡传染性支气管炎病毒液。这种同胚增殖的技术，通过调整病毒的接种量及收毒时间，试图使两种病毒的增殖均达到最佳状态。

但是，由于鸡传染性支气管炎病毒的生长会明显抑制鸡新城疫病毒的繁殖，同时，繁殖过程中两者之间存在相互干扰现象。在实际生产和应用中，同胚增殖如果是同时一步接种，必然会造成IBV和NDV的繁殖不理想，影响疫苗的质量和免疫效果。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，通过一种将鸡新城疫病毒与鸡传染性支气管炎病毒先后分两步接种同一鸡胚的方法(简称“同胚双毒两步接种法”)，在制苗过程中选择适当的接种浓度和收获时间，有效地减少IBV和NDV之间的干扰，使两种病毒均能得到充分的增殖。

为了解决上述问题，本发明采用的技术方案是，一种鸡新城疫-鸡传染性支气管炎病毒液的制备方法，包括以下步骤；

(1)分别取鸡新城疫毒种和鸡传染性支气管炎毒种，用灭菌生理盐水适当稀释；

(2)取十日龄无特异抗体的鸡胚，每胚接种鸡新城疫毒种稀释液0.1ml，37℃孵育24小时后，再向鸡胚中接种鸡传染性支气管炎毒种稀释液0.1ml，密封针孔；

(3)继续37℃孵育96小时。孵育过程中，60小时以前每24小时照胚一次，死亡的鸡胚弃去，60小时后每6小时照胚一次，死亡的鸡胚随时取出，置于2-8℃冷藏保存，直至96小时后，不论鸡胚死亡与否，全部取出，置于2-8℃冷却4-24小时，无菌收获胎儿病变明显的鸡胚液，既得鸡新城疫-传染性支气管炎病毒液。

所述的鸡新城疫毒种为La Sota株。

所述的鸡传染性支气管炎毒种为M41株。

本发明的有益效果

本发明通过同胚双毒两步接种法，对两种病毒进行培养增殖，减少两种病毒繁殖过程中的相互干扰，提高病毒的效价。

(1)采用分别将NDV和IBV先后在鸡胚10日龄和11日龄时两次接种同一鸡胚的制备工艺，能有效避免两种病毒在接种和繁殖过程中的相互干扰制约，降低了培养过程中的鸡胚的死淘率，提高鸡胚的利用率，增加病毒繁殖数量，增大病毒效价，提高产品质量；

(2)两种病毒向同一鸡胚进行接种，同时收获两种抗原，鸡胚的用量减少一半，节约原材料，降低了生产成本，保证了质量，同时简化了工艺，减少劳动成本，节约工时，适用于大批量生产。

(3)选择收获66-96小时死亡的鸡胚和96小时后所有的鸡胚，使NDV有足够的时间增殖到最佳滴度，也不会因为孵育时间过长而导致IBV毒力减弱。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

本发明公开了一种鸡新城疫-鸡传染性支气管炎病毒液的制备方法，具体是将鸡新城疫毒种和鸡传染性支气管炎毒种稀释后，采用同胚双毒两步接种方法，在鸡胚10日龄时接种接种鸡新城疫毒种稀释液，37℃孵育24小时，再于鸡胚11日龄时，同胚接种鸡传染性支气管炎毒种稀释液。此后，37℃孵育，收取66-96小时死亡的鸡胚，以及96小时后所有的鸡胚，置于2-8℃冷却4-24小时，无菌收获两种病毒均充分增殖的鸡胚液，既得鸡新城疫-鸡传染性支气管炎病毒液。

同胚双毒两步接种法可以减少IBV对NDV的相互干扰。对收获的鸡胚液(病毒液)分别测定IB M41和ND La Sota病毒的效价，ND La Sota病毒效价10^-8.5EID₅₀/0.1ml以上，IBM41病毒效价达到10^-6.3EID₅₀/0.1ml以上，两种病毒均能达到并超过国家标准的要求。

毒种的标准及保存方法同《中华人民共和国兽用生物制品规程》(以下简称“规程”)

在实验过程中发现，IBV对NDV的干扰作用受其接种顺序及收毒时间影响，毒株不同干扰作用的强弱也有差异。通常IBV毒株的强度越弱、浓度越小对NDV的影响越小，反之越大。

此外，同胚接种后，孵育时间的选择也很重要。通常NDV的增长高峰为90-96小时，IBV的增长高峰为30小时左右，本发明的所述的同胚双毒增殖方法，经多次实验验证，选择收获66-96小时死亡的鸡胚和96小时后所有的鸡胚，使NDV有足够的时间增殖到最佳滴度，而不至于因为孵育时间过长而导致IBV毒力减弱。

本发明的实施例是为进一步更好的说明本发明，不构成对本发明的限制。

实施例1

两种方法制备鸡新城疫-鸡传染性支气管炎的病毒液的对比

1.同胚双毒两步接种试验方法

1.1毒种稀释

将鸡新城疫毒种和鸡传染性支气管炎毒种用灭菌生理盐水按照规程方法稀释，得毒种稀释液，其中，鸡传染性支气管炎毒种(IB M41)作10^-3倍稀释，鸡新城疫毒种(ND La Sota)作10^-4倍稀释。

1.2接种

取十日龄SPF鸡胚共2500枚，进行平行试验5批，每批次注鸡胚500枚。

接种时每胚接种鸡新城疫毒种稀释液0.1ml，37℃孵育24小时后，再向鸡胚中接种鸡传染性支气管炎毒种稀释液0.1ml，密封针孔，继续37℃孵育。

1.3孵育和收获

经接种过ND La Sota和IB M41的鸡胚，37℃孵育96小时，60小时以前每24小时照胚一次，死亡的鸡胚弃去，60小时后每6小时照胚一次，死亡的鸡胚随时取出，置于2-8℃冷藏保存，直至96小时后，不论鸡胚死亡与否，全部取出，置于2-8℃冷却4-24小时，无菌收获胎儿病变明显的鸡胚液。每批接种500枚鸡胚，收获鸡胚液后合并为一批的病毒液。

2.同胚双毒一步接种试验方法

进行传统的同胚双毒一步注胚方法进行培养，毒种稀释、孵育和收获方法同1.1、1.3，不同之处在于接种方法，接种前将NDV和IBV两种毒种等体积比混合后，一次性接种0.2ml于10日龄SPF鸡胚中，进行37℃孵育、收获鸡胚液。比较各种病毒的效价。进行5个批次的平行试验，每批接种500枚鸡胚，收获鸡胚液后合并为一批的病毒液。

3.病毒含量的检测

3.1检测方法

3.1.1测定鸡传染性支气管炎病毒效价

取鸡新城疫、鸡传染性支气管炎的病毒液稀释后，取1ml加入1号管中，继续向1号管加入等量的2倍稀释的鸡新城疫抗血清，室温中中和1小时，中间震荡一次，再向一号管中加入8ml生理盐水，此时稀释度为10^-5，继续10倍稀释，取10^-5，10^-6，10^-73个稀释度，分别尿囊腔内接种SPF十日胚5个，每胚0.1ml，于37℃观察6日，根据接种后24-144h死胚及6日时存活的鸡胚中出现失水、缩水、发育小(接种胎儿比对照最轻胎儿重量低2g以上)等特异性病变胚的总和，计算EID₅₀。

3.1.2测定鸡新城疫病毒效价

取新城疫、鸡传染性支气管炎的病毒液稀释至10^-6，取1ml加入2号管中继续向2号管中加入等量的4倍稀释的鸡传染性支气管炎抗血清，室温中中和1小时，中间震荡一次，再向2号管中加入8ml生理盐水，此时稀释度为10^-7，继续10倍稀释，取10^-7，10^-8，10^-93个稀释度，分别尿囊腔内接种SPF10日鸡胚5个，每胚0.1ml，48h以前死亡的鸡胚弃去不计，随时取出48-120小时死亡的鸡胚，收获鸡胚液，同稀释度等量混合，至120h取出活胚，逐个收获胚液，分别测定血凝价，1∶160(1∶128)以上判为感染，计算EID₅₀。

3.2试验结果与分析

3.2.1试验数据

同胚双毒两步接种方法培养，按照1.1、1.2、1.3的方法将鸡新城疫毒种和鸡传染性支气管炎毒种进行稀释，接种。依照3.1.1、3.1.2的方法对两种病毒的含量进行检测，考察NDV和IBV的增殖情况。

同时进行传统的同胚双毒一步注胚方法进行培养，比较各种病毒的效价。

按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》方法检测胚液中NDV和IBV各自的效价EID₅₀，最后取5批的EID₅₀平均值。具体试验数据如表1。

表1：两种不同接种方法培养的鸡胚液中NDV和IBV的效价(EID₅₀)：

3.2.2试验分析

根据表1的数据，按照本发明的同胚双毒两步注胚方法，培养后获得的病毒液经检测，NDV和IBV的效价明显高于一步法注胚的培养方法获得病毒液的效价，NDV和IBV的效价均超过国家标准，ND La Sota病毒效价10^-8.5EID₅₀/0.1ml以上，IB M41病毒效价达到10^-6.3EID₅₀/0.1ml以上，说明采取本发明方法，可以更大程度的减小IBV和NDV之间的干扰，病毒液中两种病毒的含量较高。

相比之下，同胚双毒一步接种方法不利于NDV的增殖，NDV仅有一批效价达到10^-8.5EID₅₀/0.1ml以上，IBV也只有2批效价达到10^-6.3EID₅₀/0.1ml以上，而且两种病毒效价检测结果的平均值相比二步法也有较大的差异。可见，IBV毒株和NDV采用同胚双毒两步接种的培养方法较一步法更有利于鸡新城疫和鸡传染性支气管炎的增殖，相互之间的干扰作用更小。

实验数据说明采取本发明的同胚双毒两步接种的方法获得增殖的病毒液，减少了IBV和NDV的相互干扰，同时可以增加病毒增值周期，推迟IBV增值高峰期，使其病毒能在鸡胚中更好的繁殖。孵育后两种病毒的效价较高，均超过国家标准的要求，说明增殖情况理想，方法可行。

4.结论

将NDV与IBV，分两步进行同胚双毒接种，获得的鸡胚液中两种病毒含量均达到并超过《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000年版)含量要求的标准，并且NDV病毒效价10^-8.5EID₅₀/0.1ml以上，IBV病毒效价达到10^-6.3EID₅₀/0.1ml以上。

实验结果表明，本专利采取同胚双毒两步法的接种方法，收获66-96小时死亡的鸡胚和96小时后所有的鸡胚，使两种病毒的增殖均达到最佳状态。本试验证明，本专利的同胚双毒接种方法在技术上是可行的，既降低了生产成本，降低了鸡胚的死淘率，延长鸡胚的增长期限，增加病毒繁殖数量，增大病毒效价，提高产品质量，同时又简化了工艺，减少劳动成本，适合大批量生产。

Claims (3)

1.一种鸡新城疫-鸡传染性支气管炎病毒液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤；

(1)将鸡新城疫毒种和鸡传染性支气管炎毒种用灭菌生理盐水适当稀释；

(2)取十日龄无特异抗体的鸡胚，每胚接种鸡新城疫毒种稀释液0.1ml，经过37℃孵育24小时后，再向鸡胚中接种鸡传染性支气管炎毒种稀释液0.1ml，密封针孔；

(3)37℃孵育96小时，孵育过程中，60小时以前每24小时照胚一次，死亡的鸡胚弃去，60小时后每6小时照胚一次，死亡的鸡胚随时取出，置于2-8℃冷藏保存，直至96小时后，不论鸡胚死亡与否，全部取出，置于2-8℃冷却4-24小时，无菌收获胎儿病变明显的鸡胚液，既得鸡新城疫-鸡传染性支气管炎病毒液。

2.根据权利要求1所述的鸡新城疫-鸡传染性支气管炎病毒液的制备方法，所述的鸡新城疫毒种为La Sota株。

3.根据权利要求1所述的鸡新城疫-鸡传染性支气管炎病毒液的制备方法，所述的鸡传染性支气管炎毒种为M41株。