CN108348597A - 用于提高家禽蛋的孵化率的方法中的灭活禽呼肠孤病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了通过应用针对禽呼肠孤病毒的免疫接种的特定方案，提高家禽蛋的孵化率的方法。发现在开始产蛋之前，至少两次向家禽施用灭活禽呼肠孤病毒疫苗，可以导致每只种母鸡在一个产蛋期中多生产4‑5只雏鸡。这种有利效果可以通过如本文定义的疫苗接种、方法和用途获得。

Description

用于提高家禽蛋的孵化率的方法中的灭活禽呼肠孤病毒疫苗
本发明涉及兽医疫苗学的领域，更具体地，本发明涉及针对禽呼肠孤病毒的家禽疫苗接种。具体地，本发明涉及用于本发明中的灭活禽呼肠孤病毒疫苗，并且涉及采用所述疫苗的方法和用途。
预期世界人口在未来的增长将导致对食物(例如动物蛋白)的需求增加。来自各种可能的来源，优选的来源之一是来自家禽肉和蛋的蛋白，这是由于其营养高且生产相对有效。当前世界的家禽蛋白生产已经处于令人印象深刻的水平，每年生产8000万吨的家禽肉，和1.5 x 10^12枚蛋(6700万吨)。尽管绝大部分用于鸡的生产，但火鸡、鸭和鹅也具有相当的经济相关性。为了以这样的水平进行生产，现代的密集家禽饲养方法采用了技术工具和优化程序的组合，以保持高水平的动物健康和性能。还已开发了所使用的动物品种，以具有高效的饲料转化。然而，在高体量之外，这个市场还以低利润运行，并且因此具有强烈的成本意识。因此，肉、蛋或后代数量的产量的改进，可以对农场主的经济运作产生显著的影响，并且有助于达到提高的生产目标。
家禽蛋由被称作产蛋鸡的鸟生产，而肉从被称作肉用鸡的鸟获得。进而，这些产蛋鸡和肉用鸡源自被称作种鸡的亲本动物。它们由专门的公司通过精细的杂交和选择系统生产，所述系统将特定的动物品系组合以生产用于不同世代的雄性和雌性品系。这种亲本鸟的品系是商购可得的，例如诸如Hyline™或ISA™的产蛋鸡品种，和诸如Ross™或Cobb™的肉用鸡品种。对于从(曾)祖父母的生产，至父母，至生产动物的不同世代，操作的规模呈指数级提高。因此，家禽育种业也具有可观的经济规模，其中孵化蛋的生产占世界家禽蛋生产的约5%。这种孵化蛋不同于用于消费的蛋(所谓餐桌蛋)之处在于以下事实，即它们(大部分)是受精的，并且旨在用于产生后代。
尽管家禽业中存在可观的垂直整合，但通常使用分离的操作以培养并保持种家禽。种鸡在饲养场从日龄雏鸡饲养到约18周龄。通常将雄性和雌性的鸟分开饲养。在这种类型的农场，种鸡将接受其初始的一系列疫苗接种。
小母鸡将在约20周龄开始产蛋，并且随后每周生产的蛋数量快速增加，并且在28和32周龄之间达到峰值。随后，蛋生产再次缓慢降低，从约60周龄降低至低于经济水平。
在18-20周龄，将种鸡转移至种鸡场，在此它们停留至约60周龄。在驯化期后，以1:5 - 1:10的雄:雌比例引入雄性。通常，种鸡场会具有提供分离的地面区域和筑巢区域的平面图，其中鸟巢允许(自动的)蛋收集。将收集的蛋在受控的条件(例如16℃和80%相对湿度(RH))下贮存有限的时段(2-14天)，以保持受精蛋的健康，但又不刺激胚胎发育。
在放入孵化器之前，对孵化蛋进行选择，其中除去具有污染的、多孔的、破裂的或畸形的蛋壳的蛋，或大小异常的蛋。这确保了只有优质蛋被孵化。任选地，这之后可以是蛋表面的净化，例如通过薰烟法。
在孵化场，随后，将选择的蛋放入孵化器(即所谓的“上蛋(setting)”)，这启动胚胎发育。
允许胚胎生长的蛋孵化条件包括例如在约37℃和约90% RH下孵化，以及将蛋以气室向上放置。还定期改变蛋的位置角度，即所谓的转蛋。
在上蛋和孵化之间，检查蛋的胚胎发育。这种检查通常通过对光检查(candling)完成：在明亮的光前观察蛋，以检查其质量并使胚胎可视化。除去具有死胚胎的蛋或空的、非受精蛋，并将具有健康胚胎的蛋放回孵化。这种胚胎的可视化可以从约三分之一的孵化时间起进行；对于鸡，这与6-8天的胚胎发育相关。然而，这种选择通常在(预期)孵化之前几天进行，并且与向孵化盘的转移组合，以使对蛋的干扰最小化，并且节约处理时间。对于鸡蛋，这通常在胚胎发育的约18天完成。
鸡蛋将在胚胎发育的约21天孵化，对于其他家禽物种，这通常更长：火鸡：28天；鸭：28 (北京鸭)至35 (美洲家鸭)天；日本鹌鹑：17天；珍珠鸡：26天；野鸡，鹧鸪：24天；和鹅：28-32天。
日龄鸡是孵化场的最终产品，并且被销售并运送至产蛋鸡或肉用鸡饲养场。
针对其蛋的质量选择种鸟，以产生大量的健康后代。因此，评估种鸟质量的主要标准之一是其蛋的孵化率，即从一定数量的孵化的蛋产生的活雏鸡的数量。孵化率对于每个种类的家禽是不同的，并且对于同一物种内的不同品种也是不同的。此外，几个其他因素影响孵化率，例如：管理条件；总体健康；蛋的处理、贮存和孵化；以及母鸡的周龄(参见：Yassin等人，2008, Poultry Sci., vol. 87, p. 2408-2417；Mauldin, J., “Commercialchicken meat and egg production”中的第36章，2002, Springer media, New York)。
例如：在约26-60周龄的一个产蛋期中，现代的肉用鸡种母鸡将产约180枚蛋，其产生约140只活雏鸡。对于其他家禽种类和物种，这个数字较低。因此，这个领域中存在改进这种结果的需要，以优化农业经济，并且适应未来对动物蛋白生产的需要。
因此，本发明的目标是改进来自种家禽的蛋的孵化率。
种蛋的孵化率没有更高的原因有很多。简单的原因可能是并非每只母鸡都是受精的。这可以通过控制与母鸡饲养在一起以用于受精的雄鸟的数量和质量而管理。更复杂的是雄鸟或雌鸟本身的繁殖力降低的原因，其可以与饲料质量、家禽舍中的管理条件，以及各种(传染)病的影响一样多变。
通常，种鸟在严格的兽医护理之下，并且接受针对各种病毒-和细菌疾病的几次疫苗接种。这些疫苗接种旨在保护接受疫苗接种的种鸡本身，并且还通过鸡蛋的蛋黄中的母源抗体对其后代提供被动免疫保护。常用于种鸟的疫苗接种之一是针对禽呼肠孤病毒。
禽呼肠孤病毒在分类学上归类为禽正呼肠孤病毒种，其在正呼肠孤病毒属内，并且在呼肠弧病毒科中。病毒颗粒没有包膜，但具有双外壳的蛋白衣壳。这个衣壳含有双链RNA基因组，其有10个区段。禽呼肠孤病毒的表征特征的概述给出在Benavente &Martinez-Costas (Virus Res., 2007, vol. 123, p. 105-119)，以及Fields Virology(第四版，2001, Lippincott Williams & Wilkins, ISBN-10: 0781718325)中的双RNA病毒科(Birnavirideae)一章中。
禽呼肠孤病毒是重要的病原体，其导致鸟类中的严重疾病，和商业家禽饲养运作的重大经济损失；鸡、火鸡和其他种类的鸟会受到影响。禽呼肠孤病毒对幼鸟的致病性更高，这是因为针对禽呼肠孤病毒感染的一些周龄相关的抗性在鸟类中从约4周龄才发展。症状和损伤尤其包括肠-和呼吸疾病、心肌炎和肝炎。最典型的是病毒性关节炎(或：呼肠孤病毒性关节炎)和腱鞘炎(一种肌腱层的炎症)。所导致的跛行会导致难以行走至饲料斗，导致饥饿。或者，导致吸收不良的病毒性肠病阻碍饲料的有效转化。此外，与几种其他病毒和细菌性肠病原体组合，禽呼肠孤病毒是所谓的“生长受阻发育障碍综合征”(其具有消瘦和表现不良的总体症状)中的因素。
针对禽呼肠孤病毒的疫苗接种可以应用于较大的鸟和非常幼龄的雏鸡二者。然而，在实践中，仅亲本接种疫苗，保护亲本本身，以及作为胚胎和作为雏鸡的后代。
禽呼肠孤病毒疫苗通常是完整病毒疫苗，其为减毒活类型，或灭活的类型；两种类型通常都通过皮下或肌肉内注射施用。商业禽呼肠孤病毒疫苗(均来自MSD AH，荷兰)的实例为：减毒活疫苗：Nobilis® Reo 1133或Nobilis® Reo 2177；或灭活-佐剂化疫苗，例如Nobilis® Reo Inac (包含毒株1733和2408)。灭活的呼肠孤病毒抗原也包含在灭活的组合疫苗中，如例如Nobilis® Reo+IB+G+ND (MSD AH)中。
在标准的推荐疫苗接种方案中，种鸟两次接种针对禽呼肠孤病毒的疫苗：在幼龄使用活疫苗的初次疫苗接种(引发)，和数周后使用灭活疫苗二次疫苗接种(强化)。对于鸡，这个强化疫苗接种通常在约16-18周龄(即在预期开始产蛋前2-6周)给予(参见：Giambrone&Clay, 1986, Poultry Sci., vol. 65, p. 457-461；De Herdt等人，1999, AvianDiseases, vol. 43, p. 271-278)。在高野外感染压力的情况下，可给予一次或更多的额外强化疫苗接种。
应用使用活疫苗的引发，随后使用灭活疫苗的强化的免疫接种方案是用于针对禽呼肠孤病毒感染和疾病的广泛且持久保护的优选方案。这是因为已知这个方案在目标鸟类中诱导高抗体滴度(参见：R.C. Jones, 2014: Reovirus infections，在Swayne等人编辑的Diseases of Poultry中，第13版，Wiley-Blackwell, Ames, IA., USA, p. 351-374)。然而，一些国家，例如英国和比利时，不允许引入活的禽呼肠孤病毒疫苗。因此，在这些国家中，唯一的备选方案是使用采用以灭活禽呼肠孤病毒疫苗的两次或更多次疫苗接种的疫苗接种方案。很多农场主不满意这种对其疫苗接种方案选择的限制；不仅是因为灭活呼肠孤病毒疫苗比活疫苗更贵，而且还因为这个领域中牢固树立的观点在于活引发和灭活强化的呼肠孤病毒疫苗接种方案是优选的。例如，世界兽医家禽协会(WVPA)的比利时分部在其对种鸡的2015疫苗接种方案建议中写到：“推荐在使用灭活疫苗的最终疫苗接种之前4-6周，应用使用活呼肠孤病毒疫苗的预先疫苗接种。目前，比利时没有注册的活呼肠孤病毒疫苗。”[从荷兰语翻译]，参见http://www.dgz.be/sites/default/files/WVPA_pluimvee_entschema_advies_2015.pdf.，第12页第5段。
因此，在比利时的常规实践是从另一国家进口活禽呼肠孤病毒疫苗，并且在豁免规则下使用该疫苗用于活引发疫苗接种。
预想不到地发现，本发明的目标，即提高种蛋的孵化率，可以通过种家禽的针对禽呼肠孤病毒的特别疫苗接种方案达到：通过将活引发、随后灭活强化(‘活+灭活’)的优选方案改变为至少两次向家禽动物施用灭活呼肠孤病毒疫苗(‘2x灭活’)的方案。以这种方式发现种蛋孵化率显著提高约3.4%。
重要的是认识到，在每只种母鸡约140只雏鸡的平均产出下，本发明允许每只种母鸡生产出额外的4-5只雏鸡。这代表了家禽育种农场主的可观经济收益，其大幅超过了通过动物遗传或其饲养条件的优化而获得的改进。甚至更进一步地：来自这种提高孵化率的经济优势如此大，以至于其远远超过使用灭活疫苗代替活疫苗的较高成本。
因此，通过本发明，家禽育种农场主现在有了可观地改进整体经济表现的选择。
本发明可应用于旨在用于生产后代的所有家禽孵化蛋的生产，其用于种鸡-、肉用鸡-或产蛋鸡的雏鸡。
这个效果是完全预想不到的，并且与本领域中“用于呼肠孤病毒疫苗接种的活+灭活方案是优选的”的强大的普遍观点直接相反。
此外，即使2x灭活方案已经在过去应用，但从未有过这种方案将对受精家禽种蛋的孵化率具有积极影响的任何认知或描述。
不知晓用于禽呼肠孤病毒的2x灭活疫苗接种方案与标准的活+灭活方案相比对孵化率具有如此强的积极作用的原因。尽管本发明人不愿受到可能解释这些观察结果的任何理论或模型的束缚，但他们推测这种疫苗接种方案在种鸟中诱导某种健康作用，其可导致生殖性能，例如受精效率的提高。可选地或此外，这些健康作用可导致更强壮且更健康的胚胎，这可见为卵内胚胎死亡率的降低。
如所讨论的，使用灭活呼肠孤病毒疫苗的疫苗接种是已知的：例如，Giambrone &Clay (1986, Poultry Sci., vol. 65, p. 457-461)比较了“用于预防在肉用鸡后代中的临床呼肠孤病毒感染”的肉用鸡种鸡的免疫接种方案。他们结论认为最佳方案由活引发和随后使用灭活疫苗的两次强化组成，所有均在产蛋开始之前进行。然而，他们关注于血清学数据，并且没有提出关于这样的方案对种蛋的孵化率的任何影响的任何参考文献或建议。
几篇出版物已经考虑了禽呼肠孤病毒感染对孵化率的影响。胚胎污染和感染的一个可能机制是通过禽呼肠孤病毒经蛋的垂直传播。然而，与在体外获得的结果不同，在正常野外条件下，发现这种传播非常少(Al-Muffarej等人，1996, Avian Pathol., vol. 25,p. 469-480)。
一篇出版物描述了使用针对禽呼肠孤病毒的活疫苗的种鸡疫苗接种对孵化率的负面影响：Giambrone 等人，1991, Avian Diseases, vol. 35, p. 380-383。然而，在该研究中，活疫苗在产蛋期间应用，而不是在产蛋之前。此外，测试的疫苗被发现是异常毒性的；基于观察到的病理学，在该研究中可能发生了另一种病毒(很可能是传染性支气管炎病毒)的野外感染。
因此，在一个方面，本发明涉及灭活的禽呼肠孤病毒疫苗，其用于提高家禽蛋的孵化率，其中在开始产蛋之前，将所述疫苗向所述家禽施用至少两次。
“禽呼肠孤病毒”，作为属于禽正呼肠孤病毒种的病毒，是本领域中熟知的。这些病毒及其诱导的疾病例如描述于熟知的手册中，如：“The Merck veterinary manual”(第10版，2010, C.M. Kahn编辑, ISBN: 091191093X)，和“Diseases of Poultry”(第13版，如上)。
禽呼肠孤病毒展示了其分类群-成员的表征特征，如形态学、基因组学和生物化学特征，以及生物学特征，如生理学、免疫学、或病理学行为。如本领域所知，微生物的分类基于这些特征的组合。本发明因而也包括这样的禽呼肠孤病毒，其以任何方式由此被亚分类为例如亚种、毒株、分离株、基因型、变体、亚型或亚组等。
众所周知，“疫苗”是具有固有医学作用的组合物。疫苗包含免疫活性组分和药学上可接受的载体。“免疫活性组分”是被目标的免疫系统所识别并且诱导保护性免疫应答的一种或多种抗原分子。所述应答可起源于目标的先天和/或获得性免疫系统，并且可以是细胞和/或体液类型。
疫苗通常有效降低感染的水平或程度，例如，通过减少宿主动物中的病毒载荷，或缩短病毒复制在宿主动物中的持续时间。在此，这涉及减少禽呼肠孤病毒在其靶器官(例如腱、关节或肠)中的感染。
此外，或可能作为其结果，疫苗通常有效减少或改善可由这种病毒感染或复制导致或可以是这种病毒感染或复制的结果的疾病的症状。这样的疫苗俗称为“针对”禽呼肠孤病毒的疫苗，或“禽呼肠孤病毒疫苗”。
如本文描述的灭活禽呼肠孤病毒疫苗，在根据本发明使用时，具有提高家禽蛋的孵化率的作用。本发明人不知晓这是起因于禽呼肠孤病毒感染减少，起因于由这种感染导致的损伤和临床体征减少，还是二者，或甚至起因于相关或不相关的其他作用。
“灭活的”疫苗是包含微生物的疫苗，所述微生物已经通过某种灭活方法而成为非复制型的。灭活的常见方法是通过应用例如热、辐射，或化学品，例如福尔马林、β-丙内酯、二元乙烯亚胺或β-乙醇胺。
待灭活的禽呼肠孤病毒最初是完整病毒颗粒，其可以源自病毒培养物，例如来自细胞团块、培养上清或完整培养基。由于灭活方法影响病毒颗粒的蛋白、脂质和/或核酸，其可能在一定程度上变为受损的。然而，这种类型的疫苗通常被称作完整病毒灭活疫苗。
具体的病毒底物以及灭活方法的选择完全是本领域技术人员的常规能力之内的。
如上文所述，完整病毒灭活疫苗的备选方案是亚单位疫苗。这可以通过应用将病毒颗粒的一个或多个部分的片段化或分离的一个或多个(额外)步骤，从活病毒或从灭活病毒制备。这包括例如制备提取物、级分、匀浆或声波降解物。
在优选的实施方式中，用于本发明中的灭活禽呼肠孤病毒疫苗是完整病毒灭活疫苗。
术语灭活的，相对于“活”疫苗使用。尽管就病毒试剂来说，术语“活”在生物学上是不正确的，但其常用于这个领域中。因此，对于本发明，术语“活”是指能够复制的，即可复制的，非灭活的禽呼肠孤病毒。
在原则上，用于本发明中的疫苗可以是任何灭活的禽呼肠孤病毒疫苗。
对于本发明，术语“孵化率”定义为从一定数量的孵化蛋孵化出的雏鸡的数量，以百分比表示。
测定孵化率的方式的细节是本领域中熟知的。因此，灭活禽呼肠孤病毒疫苗对孵化率的有效性的测定完全在常规从业者的技能之内。此外，测定和比较孵化率的方法和优先选择详细描述在下文中。
针对禽呼肠孤病毒的疫苗的有效性可以例如通过监测在疫苗接种后或在攻击感染后的免疫应答而完成，例如通过监测目标的疾病体征、临床评分、血清学参数，或通过病原体的再分离，并且将这些结果与在模拟疫苗接种动物中所见的疫苗接种-攻击应答相比较。
下文将概述根据本发明使用的灭活禽呼肠孤病毒疫苗的各种实施方式、优先选择和实施例。
孵化率的“提高”是相对于没有应用本发明的2x灭活方案的，针对禽呼肠孤病毒的种家禽疫苗接种方案获得的孵化率；特别是与针对禽呼肠孤病毒的活+灭活的“标准”疫苗接种方案相比。所述提高可以通过本领域中熟知的方法测量，并且如本文所述，并且需要具有统计学显著性，以成为可信的。例如，p值应为0.05或更小。
本发明人已经通过监测比利时的一间大型家禽育种运营中心在2013年和2014年的生产数据，分析了这种疫苗接种方案的作用。收集了来自超过280,000只种鸟及其470万枚蛋的数据。在所涉及的很多变量之中，相关性分析显示，除了母鸡周龄之外，禽呼肠孤病毒疫苗接种方案的类型也与孵化率强相关。随后，通过使用母鸡周龄和疫苗接种方案作为自变量的回归分析，从2x灭活疫苗接种方案发现了对于因变量：孵化率的积极作用：发现在0.662的调整R2值和<0.001的p值，孵化率提高约3.4%。
如技术人员将认识到的，在应用本发明时，对于特定试验或对于一系列试验获得的孵化率提高的精确数值将取决于多个因素。这些因素尤其涉及使用的家禽的总体健康状态，其管理条件，测试动物的数量，以及应用的统计分析。
然而，本发明人已经发现本发明的有利效果甚至在比较不同组成的动物组，并且使用不同类型的分析时，也容易地显现。对于在下文实施例部分中描述的测试组中的动物，计算的由根据本发明的疫苗接种方案导致的孵化率提高，远高于通过管理条件或品种特征导致的任何变化性，其超过了约±1%的孵化率的效果。实际上，取决于所考虑的组的选择，以及应用的统计分析方法，本发明人通常观察到约2.5%和约3.9%之间的孵化率提高。然而，在所有情况下，这是高度显著并且经济相关的。
本发明的效果优选使用相对大型的动物组，并且经过相当长的时间段进行测定；优选至少10,000只种鸡及其250,000枚蛋。对于复杂性较低的分析，例如当母鸡周龄在测试组之间没有变化时，统计分析可以使用ANOVA完成。然而，对于组成不同的动物组，直接比较是不适合的，这是因为周龄对孵化率的影响，并且因此应当使用种母鸡的周龄以及疫苗接种方案作为自变量，应用数据的回归分析，以计算所得孵化率的提高。对于实验性能和计算的细节和优选选择描述于下文的实施例部分。这种回归分析的实例也描述于De Herdt等人， 2012 (Avian Dis., vol. 56, p. 365-368)中。
如技术人员充分知晓的，这种回归分析需要确定回归公式，其中调整自变量的数量和影响，直到获得对于这个数据集的最大R2值。这可以方便地使用用于统计分析的几种可得计算机程序之一计算，例如程序：SPSS™ (IBM)、SAS™ (SAS Institute)，或R™ (Rfoundation)。
回归公式作为一个整体，以及在所述公式中其构成自变量，应具有指示显著作用的p值。因此，对于本发明，回归公式和构成自变量应具有0.05或更小的p值。
对于本发明，“约”表示数字可以在其所示值附近的±25%之间变化；优选约是指其值附近±20%，更优选约是指其值附近±15、12、10、8、6、5、4、3、2%，或甚至约是指其值附近±1%，按照该优先顺序。
“家禽”是指具有农业相关性的鸟类，例如：鸡、火鸡、鸭、鹅、鹧鸪、孔雀、鹌鹑、鸽子、野鸡、珍珠鸡或鸵鸟。
对于本发明，术语“种鸡(breeders)”或“种家禽(breeder poultry)”是指用于生产受精蛋而饲养的亲本家禽动物。后代雏鸡可以是肉用鸡、产蛋鸡或种鸡的类型。因此，用于本发明的种鸡可以命名为肉用鸡-种鸡、产蛋鸡-种鸡，或种鸡(祖)父母。
用于本发明中的疫苗应当以最佳的途径“施用”，这是指当所述疫苗是商业疫苗时，其将如在其产品宣传页上所指定地施用。
当所述疫苗是非商用时，其必须以就其剂量、体积、途径或制剂而言最佳的途径，同样就目标动物的周龄、性别或健康状态而言最佳的途径应用。技术人员完全能够确定这种最佳的疫苗施用条件。对于灭活的禽呼肠孤病毒疫苗，该途径将通常是通过注射，特别是经肌肉内(i.m.)或皮下(s.c.)注射。
对于本发明，“至少两次”施用是指施用2、3或更多次，例如可以在实践上和经济上可行的。此外，这是指向具体动物施用；因此，在要从家禽动物的组获得本发明的有利效果时，则原则上来自该组的每只动物都需要施用所述疫苗至少两次。
“开始产蛋”是家禽母鸡产下其首枚蛋的日期。由于这个日期对于个别鸟不是可以精确预测的，在实践中，这是指预期开始产蛋的日期，作为对于所考虑的一组鸟的预测。出现开始产蛋的周龄对于各种类型家禽是不同的，并且可以对于不同的品种和管理条件是不同的。这是本领域中熟知的，例如，对于鸡，开始产蛋通常在约20-22周龄，但对管理条件(例如饲养-和光照方案)敏感。
对于不同家禽物种和品种的预期的开始产蛋的日期，以及种鸡的管理和运作的最佳条件，是本领域中熟知的，并且例如公开在来自种鸡的主要供应商(例如Aviagen、Cobb-Vantress，或Hendrix Genetics)的手册和袖珍指南中。
对于本发明，“在开始产蛋之前”施用是指本发明的疫苗接种方案要在产蛋开始之前完成。这是为了在生产受精蛋之前，在动物中建立有效的免疫应答(的起始)。在实践中，这是指需要在开始产蛋之前施用强化疫苗接种；在施用多于一次强化疫苗接种的情况下，则在开始产蛋之前施用最后一次的强化疫苗接种。
对于本发明，“之前”是指在最后一次疫苗施用和开始产蛋之间的时间段。这个时间段应为至少1天。
在将本发明的疫苗接种方案应用于雄性种家禽时，基于将放置这些雄性的组中的雌鸟的预期开始产蛋日期计算在开始产蛋之前的时间段。
如对于本发明所述的疫苗接种方案导致家禽蛋的孵化率提高。实现这种效果的一种方式是通过减少孵化蛋中的死胚胎的数量。这在孵化期间是容易检测的，例如在对(在质量选择之后)孵化的蛋的对光检查后，通过计数活胚胎和死胚胎。在将这个数字与以相同方式孵化但源自没有接受如对于本发明所述的疫苗接种方案的种鸡的蛋中的胚胎死亡率数值相比时，差别是明显的。
因此，本发明的进一步有利效果之一是降低家禽胚胎死亡率。
因此，在根据本发明用于提高家禽蛋的孵化率的灭活禽呼肠孤病毒疫苗的一个实施方式中，孵化率的提高是由家禽胚胎死亡率降低导致的。
可选地或额外地，由本发明获得的孵化率提高可以归因于种家禽(雄性和/或雌性)的繁殖力提高，导致生产更多数量的受精蛋，并且因此，生产更多的孵化雏鸡。这种效果可以通过就从孵化的蛋孵出的雏鸡的数量比较禽呼肠孤病毒疫苗接种方案而观察到。
因此，本发明的进一步有利效果之一是提高种家禽的繁殖力。
因此，在根据本发明用于提高家禽蛋的孵化率的灭活禽呼肠孤病毒疫苗的一个实施方式中，孵化率的提高是由家禽繁殖力提高导致的。
如所述，本发明对家禽蛋的孵化率的有利作用的原因尚不清楚，并且可能是源自对接受疫苗接种的亲本家禽的健康和/或繁殖力的影响，其次于或附加于对胚胎健康的影响。因此，对种家禽组的雌鸟或雄鸟进行疫苗接种是有利的。然而，优选向雌性和雄性家禽二者施用疫苗至少两次。
因此，在一个实施方式中，根据本发明用于提高家禽蛋的孵化率的灭活禽呼肠孤病毒疫苗向雌性和雄性家禽二者施用。
如上所述，雄性家禽的疫苗接种时机源自将放置这些雄性的种鸡组中的雌鸟的预期开始产蛋日期。
在一个实施方式中，用于本发明中的灭活禽呼肠孤病毒疫苗包含佐剂。这特别应用于灭活疫苗，其是非复制型的，因此需要额外的免疫刺激以能够诱导有效、广谱且持续的疫苗接种。
“佐剂”是熟知的疫苗成分，其通常是以非特异性的方式刺激目标的免疫应答的物质。很多不同的佐剂是本领域中已知的。佐剂的实例是弗氏完全佐剂或不完全佐剂、维生素E、铝组合物如磷酸铝或氢氧化铝，非离子嵌段聚合物和多胺，例如葡聚糖硫酸酯、Carbopol®、吡喃、皂角苷，例如：Quil A®或Q-vac®。皂角苷和疫苗组分可以组合在ISCOM® (EP109.942, EP 180.564, EP 242.380)中。
此外，肽类，例如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸、特夫素(tuftsin)常用作佐剂，以及油-乳剂，其使用矿物油，例如Bayol™或Markol™，Montanide™或轻质矿物(石蜡)油；或非矿物油，例如角鲨烯、角鲨烷，或植物油，例如油酸乙酯。还可以有利地使用组合产品，例如ISA™ (来自Seppic)或DiluvacForte™。
乳剂可以是油包水(w/o)，水包油(o/w)，水包油包水(w/o/w)，或双重油-乳剂(DOE)等。
在优选的实施方式中，包含佐剂的疫苗是油包水乳剂。
这样的乳剂在疫苗接种的动物中提供储库效果，其缓慢地释放抗原，从而提供对目标的免疫系统的长期刺激。
在更优选的实施方式中，油包水乳剂疫苗的油相包含矿物油，或油酸乙酯。
在一个实施方式中，用于本发明中的灭活禽呼肠孤病毒疫苗包含来自单一生物源，例如来自一个亚型、血清型或基因型的灭活禽呼肠孤病毒。
在优选的实施方式中，所述疫苗包含来自两个或更多如本文定义的亚分类的灭活禽呼肠孤病毒；例如为不同的亚型、血清型、基因型等。例如，用于本发明中的疫苗包含一个或多个如下的禽呼肠孤病毒株：1133 (又名S1133)、2177、ERS、1733、2408、GEL系列，和/或ISR系列。这些都是本领域中熟知的，参见例如：Kant等人(2003, Vet. Res., vol. 34, p.203-212)；Liu等人(2003, Virology, vol. 314, p. 336-349)，和Lublin等人(2011,vaccine, vol. 29, p. 8683-8688)。
在一个实施方式中，用于本发明中的灭活禽呼肠孤病毒疫苗是Nobilis® ReoInac。
在一个实施方式中，用于本发明中的灭活禽呼肠孤病毒疫苗包含来自不同基因型的灭活禽呼肠孤病毒。这例如描述于欧洲专利申请号EP 14187650中。
因此，在一个实施方式中，用于本发明中的灭活禽呼肠孤病毒疫苗包含来自两种基因型组：基因型组1和基因型组4的每一种的灭活禽呼肠孤病毒，如欧洲专利申请号EP14187650中所定义的。
如本文所用的术语“包含(comprising)”(以及变式，如“包含(comprise)”、“包含(comprising)”和“包含(comprised)”)是指被使用该术语的文本部分、段落、权利要求书等涵盖或包括的所有要素，并且在可设想用于本发明的任何可能组合中，即使没有明确引用此类要素或组合；并且不是指排除任何此类要素或组合。因此，任何此类文本部分、段落、权利要求书等也可以涉及一个或多个实施方式，其中所述术语“包含”(或其变式)被术语如“由…组成(consist of)”、“由…组成(consisting of)”或“基本上由…组成(consistessentially of)”所替换。
在一个实施方式中，用于本发明的家禽选自鸡、火鸡、鸭和鹅。在优选的实施方式中，所述家禽是鸡，因为对于这个家禽物种，孵化率提高的经济影响对家禽饲养部门而言是最大的。
在根据本发明在开始产蛋前施用的实施方式中，在开始产蛋之前至少一周，完成至少两次施用用于本发明中的灭活禽呼肠孤病毒疫苗的疫苗接种方案。优选地，以该优选顺序，在开始产蛋之前至少两周、三周或甚至四周完成施用。
在一个实施方式中，用于本发明效果的统计学评估的回归公式采用“调整的”R2值。这补偿了自变量之间的可能的相互作用。对于本发明，回归公式优选具有至少0.200的调整的R2值。
更优选地，回归公式优选具有至少0.300的调整的R2值。更优选地，按照该优选顺序，回归公式具有至少0.350、0.400、0.450、0.500、0.550、0.600、0.650、0.700、0.750的调整的R2值，或者甚至至少0.800的调整的R2值。
在一个实施方式中，回归公式作为一个整体，和构成自变量具有0.05或更小的p值。更优选地，按照该优选顺序，回归公式和构成自变量具有至少0.04、0.03、0.02、0.01、0.005、0.001或更小的p值，或者甚至小于0.001的p值。
在根据本发明用于提高家禽蛋的孵化率的灭活禽呼肠孤病毒疫苗的一个实施方式中，一个或多个或所有的应用条件选自以下：
- 所述疫苗是佐剂化的油包水乳剂，
- 所述佐剂化的油包水乳剂疫苗包含矿物油或油酸乙酯，
- 至少两次并且在开始产蛋之前至少一周施用疫苗，
- 向雌性和雄性家禽二者施用疫苗，
- 所述家禽是鸡，
- 所述疫苗包含来自如本文定义的两个或更多亚分类的灭活禽呼肠孤病毒，
- 用于本发明效果的统计学评估的回归公式采用至少0.200的调整的R2值，
- 用于本发明效果的统计学评估的回归公式作为一个整体，和构成自变量具有0.05或更小的p值，和
- 用于本发明中的灭活禽呼肠孤病毒疫苗是Nobilis® Reo Inac。
因此，在一个实施方式中，根据本发明用于提高家禽蛋的孵化率的灭活禽呼肠孤病毒疫苗是佐剂化的油包水乳剂，在开始产蛋之前至少一周施用至少两次，向雌性和雄性家禽二者施用，并且所述家禽是鸡。
本发明的有利的医疗效果也可以使用不同的措辞描述。
因此，在进一步的方面，本发明涉及禽呼肠孤病毒用于制造用于提高家禽蛋的孵化率的疫苗的用途，其中所述疫苗是灭活的禽呼肠孤病毒疫苗，并且所述疫苗在开始产蛋之前向所述家禽施用至少两次。
在禽呼肠孤病毒用于制造用于提高家禽蛋的孵化率的疫苗的用途的一个实施方式中，一个或多个或所有的应用条件选自以下：
- 孵化率的提高是由家禽胚胎死亡率降低导致的，
- 孵化率的提高是由家禽繁殖力提高导致的，
- 所述疫苗是佐剂化的油包水乳剂，
- 所述佐剂化的油包水乳剂疫苗包含矿物油或油酸乙酯，
- 至少两次并且在开始产蛋之前至少一周施用疫苗，
- 向雌性和雄性家禽二者施用疫苗，
- 所述家禽是鸡，
- 所述疫苗包含来自如本文定义的两个或更多亚分类的灭活禽呼肠孤病毒，
- 用于本发明效果的统计学评估的回归公式采用至少0.200的调整的R2值，
- 用于本发明效果的统计学评估的回归公式作为一个整体，和构成自变量具有0.05或更小的p值，和
- 用于本发明中的灭活禽呼肠孤病毒疫苗是Nobilis® Reo Inac。
在根据本发明的制造用途的一个实施方式中，所述疫苗是佐剂化的油包水乳剂，在开始产蛋之前至少一周施用至少两次，向雌性和雄性家禽二者施用，并且所述家禽是鸡。
在根据本发明的制造用途的优选实施方式中，所述疫苗是Nobilis® Reo Inac。
根据本发明的不同疫苗的制造是本领域中熟知的，并且在技术人员的常规能力之内。这样的制造方法将通常包含用于以下步骤：繁殖禽呼肠孤病毒，例如在体外细胞培养中；灭活所述病毒，例如使用福尔马林；将灭活的禽呼肠孤病毒抗原材料与药学上可接受的赋形剂混合并配制；随后分配到适当大小的容器中。制造方法的各个阶段将需要通过足够的测试来监测，例如通过用于抗原质量和数量的免疫学测试；通过用于灭活、无菌和不存在外来物质的微生物学测试；并且最终通过体外或体内实验以测定疫苗功效和安全性。所有这些都是技术人员熟知的，并且描述在政府规程中，例如药典以及手册，例如“Remington:the science and practice of pharmacy”(2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472)和“Veterinary vaccinology”(P. Pastoret等人编辑, 1997, Elsevier, Amsterdam,ISBN 0444819681)中。
药学上可接受的载体是例如液体，如水、生理盐溶液，或磷酸盐缓冲盐水溶液。在更复杂的形式中，所述载体可以例如是包含进一步添加剂(例如稳定剂或防腐剂)的缓冲剂。
将用于本发明的疫苗制造成适合用于施用至鸟类目标，并且与期望的应用途径匹配，并且具有期望效果的形式。
将所述疫苗配制为可注射的液体，例如：悬浮液、溶液、分散液或乳剂。这样的疫苗通常是无菌制备的。
在根据本发明的制造用途的一个实施方式中，用于施用本发明的灭活禽呼肠孤病毒疫苗的疫苗接种方案整合到目标家禽可能需要的其他疫苗的现有疫苗接种方案中，以减少对动物的应激并且降低劳动成本。这些其他疫苗可以同步、同时或顺次的方式，以与其登记用途相容的方式施用。
在进一步的实施方式中，用于本发明的灭活禽呼肠孤病毒疫苗可以与一种或多种其他家禽疫苗物理组合在一起包含，前提是其不显著干扰在本发明背景下这种呼肠孤病毒疫苗接种的有利效果。例如，用于本发明的灭活禽呼肠孤病毒疫苗可以添加到另一家禽疫苗的组合物、稀释物或乳剂中。或者，可以将一种或多种其他疫苗或疫苗组分添加到用于本发明的灭活禽呼肠孤病毒疫苗中，以产生这种组合。
因此，在根据本发明的制造用途的一个实施方式中，所述疫苗与另一种家禽疫苗组合施用。
在进一步的方面，本发明涉及用于提高家禽蛋的孵化率的方法，所述方法包括在开始产蛋之前，将灭活的禽呼肠孤病毒疫苗向所述家禽施用至少两次的步骤。
在根据本发明的用于提高家禽蛋的孵化率的方法的一个实施方式中，一个或多个或所有的应用条件选自以下：
- 孵化率的提高是由家禽胚胎死亡率降低导致的，
- 孵化率的提高是由家禽繁殖力提高导致的，
- 所述疫苗是佐剂化的油包水乳剂，
- 所述佐剂化的油包水乳剂疫苗包含矿物油或油酸乙酯，
- 至少两次并且在开始产蛋之前至少一周施用疫苗，
- 向雌性和雄性家禽二者施用疫苗，
- 所述家禽是鸡，
- 所述疫苗包含来自如本文定义的两个或更多亚分类的灭活禽呼肠孤病毒，
- 用于本发明效果的统计学评估的回归公式采用至少0.200的调整的R2值，
- 用于本发明效果的统计学评估的回归公式作为一个整体，和构成自变量具有0.05或更小的p值，和
- 用于本发明中的灭活禽呼肠孤病毒疫苗是Nobilis® Reo Inac。
因此，在根据本发明的用于提高家禽蛋的孵化率的方法的一个实施方式中，所述疫苗是佐剂化的油包水乳剂，在开始产蛋之前至少一周施用至少两次，向雌性和雄性家禽二者施用，并且所述家禽是鸡。
在根据本发明的用于提高家禽蛋的孵化率的方法的优选实施方式中，所述疫苗是Nobilis® Reo Inac。
在另一个方面，本发明涉及灭活禽呼肠孤病毒疫苗用于提高家禽蛋的孵化率的用途，其中在开始产蛋之前，将所述疫苗向所述家禽施用至少两次。
在根据本发明的灭活禽呼肠孤病毒疫苗用于提高家禽蛋的孵化率的用途的一个实施方式中，一个或多个或所有的应用条件选自以下：
- 孵化率的提高是由家禽胚胎死亡率降低导致的，
- 孵化率的提高是由家禽繁殖力提高导致的，
- 所述疫苗是佐剂化的油包水乳剂，
- 所述佐剂化的油包水乳剂疫苗包含矿物油或油酸乙酯，
- 至少两次并且在开始产蛋之前至少一周施用疫苗，
- 向雌性和雄性家禽二者施用疫苗，
- 所述家禽是鸡，
- 所述疫苗包含来自如本文定义的两个或更多亚分类的灭活禽呼肠孤病毒，
- 用于本发明效果的统计学评估的回归公式采用至少0.200的调整的R2值，
- 用于本发明效果的统计学评估的回归公式作为一个整体，和构成自变量具有0.05或更小的p值，和
- 用于本发明中的灭活禽呼肠孤病毒疫苗是Nobilis® Reo Inac。
因此，在根据本发明的灭活禽呼肠孤病毒疫苗用于提高家禽蛋的孵化率的用途的一个实施方式中，所述疫苗是佐剂化的油包水乳剂，在开始产蛋之前至少一周施用至少两次，向雌性和雄性家禽二者施用，并且所述家禽是鸡。
在根据本发明的灭活禽呼肠孤病毒疫苗用于提高家禽蛋的孵化率的用途的优选实施方式中，所述疫苗是Nobilis® Reo Inac。
现将通过以下非限定性的实施例，进一步描述本发明。
实施例
实施例1：孵化率的测定
本发明的有利效果，即家禽种蛋的孵化率提高，优选地如下测定：
1.1. 将种家禽母鸡分配至不同的处理组
将种家禽母鸡在商业的标准最佳管理条件下饲养并保持，并且除了用于禽呼肠孤病毒的那些之外，接受推荐的疫苗接种。不同处理组中的母鸡接受使用灭活禽呼肠孤病毒疫苗的2次疫苗接种，或接受另一方式的呼肠孤病毒疫苗接种，例如活呼肠孤病毒疫苗，给予一次或多次，或活疫苗和灭活疫苗的组合；前提是所述灭活的呼肠孤病毒疫苗不给予超过一次。
需要足够的组大小，以允许具有p ≤ 0.05的足够统计学显著性的分析和比较。
1.2. 要在预期开始产蛋之前完成疫苗接种方案
对于鸡，开始产蛋通常在20-22周龄。因此，对于鸡，禽呼肠孤病毒疫苗接种方案要在动物为20周龄之前完成。
1.3. 在开始产蛋之前，将母鸡在可育公鸡存在下饲养，从而可使其受精
从母鸡约20周龄开始，在相同组中需要存在足够数量和质量的雄性家禽，以允许有效的受精。
1.4. 母鸡一旦全面产蛋，收集蛋，并贮存有限的时间
小心收集并处理蛋，并且将来自不同处理组的蛋以无创的方式标记，或保持分离，从而能够区分它们。为了保持良好的活力，每周至少两次收集蛋，并在孵化之前，在适当的条件下，优选约16-18℃和约75% RH下，贮存不超过14天。
在开始产蛋后约4周达到全面产蛋；对于鸡，这是约26周龄。对于本发明，将使用来自26至59周龄之间的母鸡的蛋，如下文所述。
1.5. 可任选地净化蛋
在这个阶段，可以通过熟知，但无创的技术，例如薰烟法，进行蛋壳的净化。
1.6. 根据质量选择贮存的蛋，并放入孵化器以允许胚胎生长
在这个阶段，蛋的质量选择包括除去具有污染的、多孔的、破裂的或畸形的蛋壳的蛋，或双黄蛋；这样的双黄蛋易于识别，因为其与来自相同批次的其他蛋相比特别大；例如从蛋的尖端至尖端测量，具有超过25%的更大高度。
在这个阶段，放入孵化器的蛋的数量是用于计算孵化率的数量。
允许胚胎生长的孵化条件是本领域中熟知的，并且包括例如在约37℃和约90% RH下孵化，并且将蛋以气室向上且小头向下放置。还定期旋转蛋；在实践中，这是指通过构建在孵化器中的装置，使保持蛋的托盘板的倾角大约每小时改变一次，约90°。
1.7. 可对光检查孵化的蛋，选择，放入孵化盘中并继续孵化
对光检查是用于评估孵化的家禽蛋的熟知方法，其中将蛋在明亮的光前观察。这允许将具有健康生长胚胎的蛋从具有死胚胎的蛋或没有受精的蛋选出。将具有健康胚胎的蛋放回孵化。
对光检查和死亡/未受精蛋的选择可以在孵化的约前三分之一过去后的任何时间完成；对于鸡蛋，这将是约6-8天的孵化。对光检查可以使用各种装置完成，甚至完全自动化的对光检查和选择机器都是可用的。
将经过对光检查和选择的蛋放入孵化盘，以允许雏鸡室进行孵化。将盘返回孵化器；不再需要旋转。
对于本发明，蛋的对光检查、选择以及将蛋移动至孵化盘的步骤在一个操作中进行，(对于鸡蛋)在胚胎发育的约第18天。
1.8. 计数孵化的雏鸡，并计算孵化率
在孵化当日，计数最终孵化的雏鸡数量(对于鸡，在e.d.的第21天)。
随后，以孵化出的雏鸡数量除以(在初步质量选择后)最初放入孵化器的蛋数量。该比率得到孵化率数，其方便地以百分比表示。
对测试的每个种鸡组计算该百分比。在不同周龄的种鸡组之间比较孵化率时，必须进行回归分析以计算在周龄作用之外，疫苗接种方案的作用。
1.9. 计算方法
为了观察根据本发明的禽呼肠孤病毒疫苗接种方案对家禽种蛋的孵化率的有利效果，优选地将鸟在野外条件下饲养。此外，还有必要考虑来自整个产蛋期的数据，因为孵化率随着母鸡的周龄而改变。因此，来自不同周龄的种母鸡的孵化率数据不能直接比较，除非通过设置并入作为自变量的“种母鸡的周龄”的回归公式。为了能够评估疫苗接种方案的作用，还必须使用“疫苗接种方案”作为自变量。
在开发适当的回归公式时考虑的要素为：
- 力求公式的尽可能最高的解释潜力。这可以基于调整的R2值来评价，所述调整的R2值可以在0 (完全没有解释潜力)至1 (100%的解释潜力)变化，但高于约0.2的数值已经具有可信性。为了达到这一点，有必要将自变量“以周计的种母鸡周龄”转化成指数函数，例如，如将“以周计的种母鸡周龄”转化成6次方。
- 所得回归公式的p-值必须为0.05或更小，并且
- 公式中的每个构成自变量的p-值必须为0.05或更小。
可以从回归公式读出针对鸟的周龄校正的，与可选疫苗接种方案相比使用2x灭活方案疫苗接种的种鸡之间的孵化率差异，作为修饰自变量“疫苗接种方案”的系数。
实施例2：测试禽呼肠孤病毒疫苗接种方案对种鸡蛋的孵化率的影响
将在2013年从一个大型比利时种鸡运营中心孵化的Ross种鸡群，在随后几轮中在8个不同农场中饲养18-20周，并且随后在14个生产农场中分配。各个农场使用相似的管理条件运行，并且除了禽呼肠孤病毒疫苗之外，在所有种鸡群中使用标准的疫苗接种程序。在14个农场中，7个农场的种鸡在8周龄时接受一个剂量的活Nobilis® Reo 1133疫苗(MSD AH)，并在18周龄时接受一个剂量的灭活Nobilis® Reo灭活疫苗(MSD AH)。另外7个农场在相似的时间点仅使用2个连续剂量的灭活禽呼肠孤病毒疫苗进行疫苗接种。
如下所述，收集、选择并孵化蛋。计数从这些种鸡的蛋孵化出的日龄雏鸡，并测定每个组的孵化率得分。为了对其进行比较，并且测定禽呼肠孤病毒疫苗接种方案的整体作用，构建回归公式，其显示出0.662的调整的R2值，反映出高的解释潜力。所有统计分析使用SPSS Statistics 23 (IBM)，在0.05的显著性水平下进行。
对于使用2x灭活作为“疫苗接种方案”的自变量的回归公式，结果为：
孵化率% = 86.288 –52.753x10^-11x (以周计的种母鸡周龄)^6+3.348x(2x灭活方案)。
这表明，与周龄无关，接受2x灭活禽呼肠孤病毒疫苗接种方案的种鸡具有3.348%更高的孵化率，对应于每只种母鸡在产蛋期中4-5只雏鸡的生产增加。

Claims (11)

1.用于提高家禽蛋的孵化率的灭活禽呼肠孤病毒疫苗，其中所述疫苗在开始产蛋之前向所述家禽施用至少两次。
2.根据权利要求1使用的灭活禽呼肠孤病毒疫苗，其中所述孵化率的提高是由家禽胚胎死亡率降低导致的。
3.根据权利要求1或2使用的灭活禽呼肠孤病毒疫苗，其中所述孵化率的提高是由家禽繁殖力提高导致的。
4.根据权利要求1-3中任一项使用的灭活禽呼肠孤病毒疫苗，其中所述疫苗向雌性和雄性家禽二者施用。
5.根据权利要求1-4中任一项使用的灭活禽呼肠孤病毒疫苗，其中所述疫苗是佐剂化的油包水乳剂，并且所述疫苗在开始产蛋之前至少一周施用至少两次。
6.禽呼肠孤病毒用于制造用于提高家禽蛋的孵化率的疫苗的用途，其中所述疫苗是灭活禽呼肠孤病毒疫苗，并且所述疫苗在开始产蛋之前向所述家禽施用至少两次。
7.根据权利要求6的用途，其中所述疫苗是佐剂化的油包水乳剂，所述疫苗在开始产蛋之前至少一周施用至少两次，并且所述疫苗向雌性和雄性家禽二者施用。
8.用于提高家禽蛋的孵化率的方法，所述方法包括在开始产蛋之前，至少两次向所述家禽施用灭活禽呼肠孤病毒疫苗的步骤。
9.根据权利要求8的方法，其中所述疫苗是佐剂化的油包水乳剂，所述疫苗在开始产蛋之前至少一周施用至少两次，并且所述疫苗向雌性和雄性家禽二者施用。
10.灭活的禽呼肠孤病毒疫苗用于提高家禽蛋的孵化率的用途，其中所述疫苗在开始产蛋之前向所述家禽施用至少两次。
11.根据权利要求10的用途，其中所述疫苗是佐剂化的油包水乳剂，所述疫苗在开始产蛋之前至少一周施用至少两次，并且所述疫苗向雌性和雄性家禽二者施用。
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