CN106232808A - 禽类呼肠孤病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及禽类呼肠孤病毒的新颖菌株，这些新颖菌株从美国东南部鸡中的病毒性关节炎/腱鞘炎的临床病例中分离出来。本发明涉及这些新颖的类群1和类群2禽类呼肠孤病毒，使用此类病毒的核苷酸特异性或氨基酸特异性组分、如编码σC蛋白的S1基因进行的诊断测定，并且涉及保护鸡免于由此类病毒引起的疾病的疫苗。

Description

禽类呼肠孤病毒疫苗
继续申请数据
本申请要求于2014年1月29日提交的美国临时申请序列号61/932,995的权益，通过引用将其结合在此。
背景
禽类呼肠孤病毒与家禽中的若干疾病相关联，这些疾病包括吸收不良综合征和生长障碍与营养吸收不良综合症(RSS)，尽管这些禽类呼肠孤病毒在这些临床综合征上作为原发性病原体的作用尚不清楚。相比之下，禽类呼肠孤病毒与病毒性关节炎/腱鞘炎的临床病例的关联是相当清楚的，因为呼肠孤病毒已经从受影响的禽类的腱中分离出来。对呼肠孤病毒诱导的病毒性关节炎/腱鞘炎的控制可以通过用活疫苗和/或灭活疫苗与传递给子代、用于针对场激发的早期保护的母源性免疫组合接种肉种鸡而达到。在肉仔鸡中，减毒活疫苗对于在孵化当天使用和在卵中使用是可用的。目前商用的疫苗株(S1133、1733、2408、以及2177，仅举几例)已经使用了数十年，以控制与呼肠孤病毒相关联的疾病。可是，这些商用的疫苗株是在二十世纪六十至七十年代被分离的并且不提供保护对抗来自病毒性关节炎/腱鞘炎的确定案例的目前流行的呼肠孤病毒菌株。因此，对分离和表征目前流行的禽类呼肠孤病毒以及研制有效的疫苗存在着需求。
发明概述
本发明包括遗传学和血清学差异的类群1和类群2禽类呼肠孤病毒，这些禽类呼肠孤病毒是从鸡中的病毒性关节炎(VA)/腱鞘炎的临床病例中分离的。本发明包括分离的类群1禽类呼肠孤病毒，其中类群1禽类呼肠孤病毒包含σC蛋白，该σC蛋白具有与SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:4具有至少约80％序列一致性、至少约85％序列一致性、至少约90％序列一致性、至少约95％序列一致性、至少约96％序列一致性、至少约97％序列一致性、至少约98％序列一致性、或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。在一些方面，类群1禽类呼肠孤病毒包含σC蛋白，该σC蛋白具有与SEQ ID NO:2具有至少约99％序列一致性的氨基酸序列。在一些方面，类群1禽类呼肠孤病毒包含σC蛋白，该σC蛋白具有与SEQ ID NO:4具有至少约99％序列一致性的氨基酸序列。在一些方面，类群1禽类呼肠孤病毒包含σC蛋白，该σC蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:2。在一些方面，类群1禽类呼肠孤病毒包含σC蛋白，该σC蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:4。在一些方面，类群1禽类呼肠孤病毒是减毒的、灭活的、或杀死的。在一些方面，类群1禽类呼肠孤病毒通过在蛋或宿主细胞系中至少25个传代进行减毒。
本发明包括分离的类群1禽类呼肠孤病毒，其中类群1禽类呼肠孤病毒包含S1基因，该S1基因具有与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:3具有至少约80％序列一致性、至少约85％序列一致性、至少约90％序列一致性、至少约95％序列一致性、至少约96％序列一致性、至少约97％序列一致性、至少约98％序列一致性、或至少约99％序列一致性的核苷酸序列。在一些方面，类群1禽类呼肠孤病毒包含S1基因，该S1基因具有与SEQ ID NO:1具有至少约99％序列一致性的核苷酸序列。在一些方面，类群1禽类呼肠孤病毒包含S1基因，该S1基因具有与SEQ ID NO:3具有至少约99％序列一致性的核苷酸序列。在一些方面，类群1禽类呼肠孤病毒包含S1基因，该S1基因具有核苷酸序列SEQ ID NO:1。在一些方面，类群1禽类呼肠孤病毒包含S1基因，该S1基因具有核苷酸序列SEQ ID NO:3。在一些方面，类群1禽类呼肠孤病毒包含σC蛋白，该σC蛋白具有与SEQ ID NO:4具有至少约99％序列一致性的氨基酸序列。在一些方面，类群1禽类呼肠孤病毒是减毒的、灭活的、或杀死的。在一些方面，类群1禽类呼肠孤病毒通过在蛋或宿主细胞系中至少25个传代进行减毒。
本发明包括分离的类群2禽类呼肠孤病毒，其中类群2禽类呼肠孤病毒包含σC蛋白，该σC蛋白具有与SEQ ID NO:6具有至少约85％序列一致性、至少约90％序列一致性、至少约95％序列一致性、至少约96％序列一致性、至少约97％序列一致性、至少约98％序列一致性、或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。在一些方面，类群2禽类呼肠孤病毒包含σC蛋白，该σC蛋白具有与SEQ ID NO:6具有至少约99％序列一致性的氨基酸序列。在一些方面，类群2禽类呼肠孤病毒包含σC蛋白，该σC蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:6。在一些方面，类群2禽类呼肠孤病毒是减毒的、灭活的、或杀死的。在一些方面，类群2禽类呼肠孤病毒通过在蛋或宿主细胞系中至少25个传代进行减毒。
本发明包括分离的类群1禽类呼肠孤病毒，其中类群1禽类呼肠孤病毒包含S1基因，该S1基因包含与SEQ ID NO:5具有至少约85％序列一致性、至少约90％序列一致性、至少约95％序列一致性、至少约96％序列一致性、至少约97％序列一致性、至少约98％序列一致性、或至少约99％序列一致性的核苷酸序列。在一些方面，类群2禽类呼肠孤病毒包含S1基因，该S1基因具有与SEQ ID NO:5具有至少约99％序列一致性的核苷酸序列。在一些方面，类群2禽类呼肠孤病毒包含S1基因，该S1基因具有核苷酸序列SEQ ID NO:5。在一些方面，类群2禽类呼肠孤病毒是减毒的、灭活的、或杀死的。在一些方面，类群2禽类呼肠孤病毒通过在蛋或宿主细胞系中至少25个传代进行减毒。
在一些方面，本发明包括类群1禽类呼肠孤病毒，其中类群1禽类呼肠孤病毒包括禽类呼肠孤病毒株94594以及其衍生物和子代。在一些方面，禽类呼肠孤病毒株94595是杀死的、灭活的或通过在蛋或宿主细胞系中至少25个传代减毒的。
在一些方面，本发明包括类群1禽类呼肠孤病毒，其中类群1禽类呼肠孤病毒包括禽类呼肠孤病毒株94826以及其衍生物和子代。在一些方面，株948264是杀死的、灭活的或通过在蛋或宿主细胞系中至少25个传代减毒的。
在一些方面，本发明包括类群2禽类呼肠孤病毒，其中该禽类呼肠孤病毒包括禽类呼肠孤病毒株96139以及其衍生物和子代。在一些方面，禽类呼肠孤病毒株96139是杀死的、灭活的、或通过在蛋或宿主细胞系中至少25个传代减毒的。
本发明包括组合物，这些组合物包含如在此所述的禽类呼肠孤病毒中的一种或多种。此类组合物可以进一步包含佐剂和/或抗原决定簇，该抗原决定簇来自感染家禽的一种或多种另外的病原体。
本发明包括疫苗，该疫苗包含如在此所述的本发明的禽类呼肠孤病毒中的一种或多种。此类疫苗可以进一步包含佐剂和/或抗原决定簇，该抗原决定簇来自感染家禽的一种或多种另外的病原体。
本发明包括用于在家禽中培育抗体的免疫学组合物，该免疫学组合物包含以上所述的和在此所述的禽类呼肠孤病毒中的一种或多种。此类组合物可以进一步包含佐剂和/或抗原决定簇，该抗原决定簇来自感染家禽的一种或多种另外的病原体。
本发明包括诊断试剂盒，该诊断试剂盒包含以上所述的和在此所述的禽类呼肠孤病毒中的一种或多种。
本发明包括在家禽中产生抗呼肠孤病毒抗体的方法，该方法包括向鸟给予本发明的分离的禽类呼肠孤病毒、组合物或疫苗。
本发明包括保护鸡形目(Galliformes)的鸟对抗由禽类呼肠孤病毒诱导的病变或疾病的方法，该方法包括向鸟给予本发明的分离的禽类呼肠孤病毒、组合物或疫苗。
本发明包括降低鸡形目的鸟对由禽类呼肠孤病毒诱导的病变或疾病的易感性的方法，该方法包括向鸟给予本发明的分离的禽类呼肠孤病毒、组合物或疫苗。
本发明包括减轻鸡形目的鸟中的病毒性关节炎和/或腱鞘炎的方法，该方法包括向鸟给予本发明的分离的禽类呼肠孤病毒、组合物或疫苗。
本发明包括预防鸡形目的鸟中的病毒性关节炎和/或腱鞘炎的方法，该方法包括向鸟给予本发明的分离的禽类呼肠孤病毒、组合物或疫苗。
在本发明的方法的一些方面，鸟包括鸡或火鸡。
在本发明的方法的一些方面，给予包括孵化前或孵化后给予。
在本发明的方法的一些方面，给予包括卵内给予。在一些方面，卵内给予包括在约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、或其任何范围时给予。
在本发明的方法的一些方面，给予包括向种母鸡给予。
本发明包括抗体，该抗体与如在此所述的类群1或类群2禽类呼肠孤病毒结合，并且不与禽类呼肠孤病毒株S1133、1733、2408、和/或2177结合。在一些方面，该抗体是单克隆抗体。
本发明包括检测鸟中禽类呼肠孤病毒暴露的方法，该方法包括测定从该鸟获得的抗血清样本与本发明的禽类呼肠孤病毒或其组分的特异性结合。
本发明包括检测鸟中禽类呼肠孤病毒暴露的方法，该方法包括测定从该鸟获得的抗血清样本与本发明的类群1禽类呼肠孤病毒或类群2禽类呼肠孤病毒的σC蛋白的特异性结合。
本发明包括检测样本中禽类呼肠孤病毒感染原(infectious agent)的方法，该方法包括检测多核苷酸与该样本的杂交，该多核苷酸包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、或SEQID NO5或其片段。
本发明包括检测样本中禽类呼肠孤病毒的方法，该方法包括用衍生自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:5的至少一种引物产生聚合酶链式反应(PCR)扩增产物。
附图简要说明
图1.来自类群1 2012VA变种野生型分离株94594的编码σC蛋白(碱基对1-931)的S1核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。
图2.来自类群1 2012VA变种野生型分离株94594的编码σC(氨基酸1-310)的S1氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。
图3.来自类群1 2012VA变种野生型分离株94826的编码σC蛋白(碱基对1-931)的S1核苷酸序列(SEQ ID NO:3)。
图4.来自类群1 2012VA变种野生型分离株94826的编码σC(氨基酸1-310)的S1氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。
图5.来自类群2 2012VA变种野生型分离株96139的编码σC蛋白(碱基对1-931)的S1核苷酸序列(SEQ ID NO:5)。
图6.来自类群2 2012VA变种野生型分离株96139的编码σC蛋白(氨基酸1-310)的S1氨基酸序列(SEQ ID NO:6)。
图7.使用Clustal W进行σC氨基酸序列的多重比对，并且产生具有1000个自引导复本(bootstrap replicate)的系统树。自引导置信水平由在每个树节点上的数字表明。
图8.基于使用Clustal W算法产生的多重比对的百分比一致性和离散。
图9.在X轴上指示的天数处，以毫米计的平均足垫测量。在七日龄时开始，与阴性对照相比，在S1133和94286激发类群中观察到鸟的大小的显著差异。针对每个类群由条形表示标准差。
图10.在终止那天(14日龄)的平均体重。针对每个类群由条形表示标准差。
图11.在指屈肌腱上方(就在跗关节下)，在10日龄时并且再次在终止当天即14日龄时进行测量。在14天时在94286激发类群中观察到明显的肿胀。针对每个类群由条形表示标准差。
图12.在终止当天记录的临床征象。由于跛行和无法获得饲料或水，在10天时注意将6只鸟从该S1133类群去除。
图13.在该研究终止时(23日龄)以克计的平均体重。由封端线表示标准差。
图14.在12、14、16、19、21、以及23日龄时进行以毫米计的平均足垫测量。第一次测量在12日龄时、恰好在激发前进行。
图15.在19、21、以及23日龄时进行的以毫米计的平均跗关节测量。在跗关节处进行跗关节1测量并且在就在跗关节下的指屈肌腱上方进行跗关节2测量。
图16.在终止当天(23天)的临床征象和损伤。
图17.孵化当天血清学。
图18.在类群2激发的鸟中的体重。
图19.针对类群2激发的鸟，为体重百分比的足垫肿胀的第14天测量值。
图20.针对类群2激发的鸟，为体重百分比的腱肿胀的测量值。
图21.针对类群1和类群2分离株的基因库(Genbank)登录号。有灰色阴影的条目表示类群2禽类呼肠孤病毒。其他的所有条目表示类群1呼肠孤病毒。
说明性实施例的详细说明
伴随本发明，禽类呼肠孤病毒的两种遗传学和血清学差异的类群已经从病毒性关节炎(VA)/腱鞘炎的临床病例(来自美国和加拿大全国各地)中分离出来。禽类呼肠孤病毒σC蛋白的遗传分析揭示了新颖的类群1和类群2基因型与目前的禽类呼肠孤病毒疫苗株是无关的。这些病毒的血清学的评估揭示了与针对目前商用的呼肠孤病毒疫苗的已知的抗血清很少交叉中和或不交叉中和。此外，致病性和子代保护研究证实目前商用的疫苗不向来自接种疫苗的种母鸡的子代提供足够的保护。目前的呼肠孤病毒疫苗株是在二十世纪六十至七十年代被分离的并且不提供保护对抗来自病毒性关节炎/腱鞘炎的确定案例的目前流行的呼肠孤病毒菌株。
禽类呼肠孤病毒，连同哺乳动物呼肠孤病毒，包括呼肠孤病毒科中的正呼肠孤病毒属。这些病毒包含10个dsRNA基因组片段，这些基因组片段封闭于约80nm的无包膜、二十面体双衣壳内。这些基因组片段可以基于电泳迁移率被分离成三个大的(L1，L2，L3)、三个中的(M1，M2，M3)以及四个小的(S1，S2，S3，S4)片段，这些片段各自编码蛋白λ1、λ2、λ3、μ1、μ2、μNS、σ3、σ1、σ2、σNS。该σ2蛋白是一种携带类群特异性中和表位的外部衣壳蛋白。它还结合双链RNA并且已经被鉴定为一种锌金属蛋白。该σC蛋白，即通过该σ1片段编码的较小外部衣壳蛋白，是禽类呼肠孤病毒的分子表征的标靶并且对细胞附着连同类型特异性中和抗体的诱导负责。
禽类呼肠孤病毒粒子包含衣壳、核心以及核蛋白复合物。该病毒衣壳是不包膜的。该衣壳/核衣壳是二十面体对称等距的并且具有约80-82nm的直径。该病毒粒子的衣壳是由两层构成的。通常所有的壳是存在的，或者外壳经常在制备期间消失。衣壳呈圆形。该衣壳表面结构揭示出具有明显特征的规则模式。该衣壳粒排列是清楚可见的。表面突起是不存在的。内衣壳核具有约60nm的直径。病毒制品包含一种粒子组分。该具有约49nm的直径的核心是球形的并且由dsRNA基因组组成。这些纤维的末端几乎突出穿过该衣壳表面。
在该禽类呼肠孤病毒疫苗株S1133中，该s1mRNA转录物是1644个核苷酸长并且包含三个不同相的和部分重叠的顺反子。第一个顺反子(ORF-1，核苷酸25–319)表达p10，第二个顺反子(ORF-2，核苷酸293–731)表达p17并且第三个顺反子(ORF-3，核苷酸630–1608)表达细胞附着蛋白C。
呼肠孤病毒疫苗株S1133、1733、2408以及2177的σC氨基酸序列的分析揭示了在这些疫苗株中的>99％的相似性。呼肠孤病毒野生型分离株的基因型表征包含野生型分离株与疫苗株，连同所有在公开的结构域和PDRC数据库中可利用的呼肠孤病毒序列的比较。针对野生型分离株的基因型的相似性报道出无论野生型分离株或疫苗株的另一序列呈最高百分比。
伴随本发明，禽类呼肠孤病毒的两种遗传学和血清学差异的类群已经从腱鞘炎的临床病例中分离出来。禽类呼肠孤病毒σC蛋白的遗传分析揭示了新颖的基因型与目前的禽类呼肠孤病毒疫苗株是无关的。这些病毒的血清学的评估揭示了与针对目前商用的呼肠孤病毒疫苗的已知的抗血清很少交叉中和或不交叉中和。此外，已经进行了致病性和子代保护研究以证实目前商用的疫苗不向来自接种疫苗的种母鸡的子代提供足够的保护。
这两种在此所述的野生型分离株的遗传的/血清学的类群被称作类群1 2012VA变种(在此还称作“类群1禽类呼肠孤病毒”)和类群2 2012VA变种(在此还称作“类群2禽类呼肠孤病毒”)。来自该类群1 2012VA变种和/或类群2 2012VA变种的呼肠孤病毒可以用于减毒活疫苗和杀死的/灭活的疫苗。在一些方面，此类疫苗可以是自身疫苗。
本发明的类群1禽类呼肠孤病毒可以具有Cσ蛋白，该Cσ蛋白具有与SEQ ID NO:2具有至少约50％序列一致性、至少约55％序列一致性、至少约60％序列一致性、至少约65％序列一致性、至少约70％序列一致性、至少约75％序列一致性、至少约80％序列一致性、至少约85％序列一致性、至少约90％序列一致性、至少约95％序列一致性、至少约96％序列一致性、至少约97％序列一致性、至少约98％序列一致性、或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。在一些方面，本发明的类群1禽类呼肠孤病毒可以具有Cσ蛋白，该Cσ蛋白具有SEQ IDNO:2的氨基酸序列。在一些实施例中，如在此所述的类群1禽类呼肠孤病毒具有Cσ蛋白，该Cσ蛋白相对于SEQ ID NO:2具有至少一种取代修饰。
本发明的类群1禽类呼肠孤病毒可以具有Cσ蛋白，该Cσ蛋白具有与SEQ ID NO:4具有至少约50％序列一致性、至少约55％序列一致性、至少约60％序列一致性、至少约65％序列一致性、至少约70％序列一致性、至少约75％序列一致性、至少约80％序列一致性、至少约85％序列一致性、至少约90％序列一致性、至少约95％序列一致性、至少约96％序列一致性、至少约97％序列一致性、至少约98％序列一致性、或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。在一些方面，本发明的类群1禽类呼肠孤病毒可以具有Cσ蛋白，该Cσ蛋白具有SEQ IDNO:4的氨基酸序列。在一些实施例中，如在此所述的类群1禽类呼肠孤病毒具有Cσ蛋白，该Cσ蛋白相对于SEQ ID NO:4具有至少一种取代修饰。
本发明的类群1禽类呼肠孤病毒可以具有Cσ蛋白，该Cσ蛋白由核苷酸序列编码，该核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有至少约50％序列一致性、至少约55％序列一致性、至少约60％序列一致性、至少约65％序列一致性、至少约70％序列一致性、至少约75％序列一致性、至少约80％序列一致性、至少约85％序列一致性、至少约90％序列一致性、至少约95％序列一致性、至少约96％序列一致性、至少约97％序列一致性、至少约98％序列一致性、或至少约99％序列一致性。在一些方面，本发明的类群1禽类呼肠孤病毒可以具有Cσ蛋白，该Cσ蛋白由具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列编码。在一些实施例中，如在此所述的类群1禽类呼肠孤病毒具有Cσ蛋白，该Cσ蛋白由核苷酸序列编码，该核苷酸序列相对于SEQ ID NO:1具有至少一种取代修饰。
本发明的类群1禽类呼肠孤病毒可以具有Cσ蛋白，该Cσ蛋白由核苷酸序列编码，该核苷酸序列与SEQ ID NO:3具有至少约50％序列一致性、至少约55％序列一致性、至少约60％序列一致性、至少约65％序列一致性、至少约70％序列一致性、至少约75％序列一致性、至少约80％序列一致性、至少约85％序列一致性、至少约90％序列一致性、至少约95％序列一致性、至少约96％序列一致性、至少约97％序列一致性、至少约98％序列一致性、或至少约99％序列一致性。在一些方面，本发明的类群1禽类呼肠孤病毒可以具有Cσ蛋白，该Cσ蛋白由具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列编码。在一些实施例中，如在此所述的类群1禽类呼肠孤病毒具有Cσ蛋白，该Cσ蛋白由核苷酸序列编码，该核苷酸序列相对于SEQ ID NO:3具有至少一种取代修饰。
在一些实施例中，类群1禽类呼肠孤病毒是表示于表21中的那些中的一个，或其子代或衍生物。
在一些实施例中，类群1禽类呼肠孤病毒是禽类呼肠孤病毒CK/945494/腱/GA/2012(在此还称作“类群1 2012VA变种野生型分离株94594，”或“94594”)，或其子代或衍生物。
在一些实施例中，类群1禽类呼肠孤病毒是禽类呼肠孤病毒CK/94826/腱/GA/2012(在此还称作“类群1 2012VA变种野生型分离株94826，”或“94826”)，或其子代或衍生物。
本发明的类群2禽类呼肠孤病毒可以具有Cσ蛋白，该Cσ蛋白具有与SEQ ID NO:6具有至少约85％序列一致性、至少约90％序列一致性、至少约95％序列一致性、至少约96％序列一致性、至少约97％序列一致性、至少约98％序列一致性、或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。在一些方面，本发明的类群2禽类呼肠孤病毒可以具有Cσ蛋白，该Cσ蛋白具有SEQID NO:6的氨基酸序列。在一些实施例中，如以上所述的类群2禽类呼肠孤病毒具有Cσ蛋白，该Cσ蛋白相对于SEQ ID NO:6具有至少一种取代修饰。
本发明的类群2禽类呼肠孤病毒可以具有Cσ蛋白，该Cσ蛋白由核苷酸序列编码，该核苷酸序列与SEQ ID NO:5具有至少约85％序列一致性、至少约90％序列一致性、至少约95％序列一致性、至少约96％序列一致性、至少约97％序列一致性、至少约98％序列一致性、或至少约99％序列一致性。在一些方面，本发明的类群1禽类呼肠孤病毒可以具有Cσ蛋白，该Cσ蛋白由具有SEQ ID NO:5的核苷酸序列编码。在一些实施例中，如在此所述的类群1禽类呼肠孤病毒具有Cσ蛋白，该Cσ蛋白由核苷酸序列编码，该核苷酸序列相对于SEQ IDNO:5具有至少一种取代修饰。
在一些实施例中，类群2禽类呼肠孤病毒是表示于表21中的那些中的一个，或其子代或衍生物。
在一些实施例中，类群2禽类呼肠孤病毒是禽类呼肠孤病毒CK/96139/腱/GA/2012(也在此称作“类群2 2012VA变种野生型分离株96139，”或“96139”)，或其子代或衍生物。
如在此所述的禽类呼肠孤病毒，或被此类病毒感染的细胞系，可以保藏于美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection)中，美国弗吉尼亚州马纳萨斯大学大道10801号，20110-2209(10801University Boulevard，Manassas，VA20110-2209，USA)。遵照用于专利程序目的的国际承认的微生物保藏的布达佩斯条约进行此类保藏。
依据本发明的禽类呼肠孤病毒可以通过常规方法制备，这些方法包括但不限于此文包括的实例部分中所述的那些方法中的任何方法。简而言之，能够支持禽类呼肠孤病毒复制的底物是用本发明的禽类呼肠孤病毒接种的并且繁殖直至该病毒复制至希望的感染效价或抗原量容量。然后收获包含原料的呼肠孤病毒。适合的底物可以包括原发性(禽类)细胞培养物(例如像，鸡胚肝细胞、鸡胚成纤维细胞、或鸡肾细胞)，哺乳动物细胞系(例如像，VERO细胞系或BGM-70细胞系)，或禽类细胞系(例如像，QT-35、QM-7或LMH)。在一些应用中，可以使用受胚卵。
本发明包括检测鸟中类群1和/或类群2禽类呼肠孤病毒暴露的方法，该方法包括测定无论是否从该鸟获得的抗血清样本与本发明的病毒、细胞系、细胞沉淀、上清液和/或多肽的特异性结合。例如，本发明包括本发明的一种或多种禽类呼肠孤病毒在检测鸟中禽类呼肠孤病毒暴露的方法中的用途，该方法包括测定从该鸟获得的抗血清样本与本发明的禽类呼肠孤病毒结合。此类禽类呼肠孤病毒包括，那些如在此所述的中的任何一个，包括但不限于图21所列出的禽类呼肠孤病毒株中的任何一个，包括但不限于禽类呼肠孤病毒株94594、94826、或96139。此类禽类呼肠孤病毒可以是灭活的、杀死的、和/或冻干的。本发明还包括诊断试剂盒，这些诊断试剂盒包括本发明的禽类呼肠孤病毒中的一种或多种。此类试剂盒可以包括另外的组分，例如像，阳性对照病毒，阴性对照病毒、第二抗体、和/或可检测标记。
本发明包括分离的σC多肽，该σC多肽具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、和/或SEQID NO:6具有至少约50％序列一致性、具有至少约55％序列一致性、具有至少约60％序列一致性、具有至少约65％序列一致性、具有至少约70％序列一致性、具有至少约75％序列一致性、具有至少约80％序列一致性、至少约85％序列一致性、至少约90％序列一致性、至少约95％序列一致性、至少约96％序列一致性、至少约97％序列一致性、至少约98％序列一致性、或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。在一些方面，本发明包括分离的σC多肽，该σC多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、和/或SEQ ID NO:6。在一些方面，本发明包括分离的σC多肽，该σC多肽具有氨基酸序列，该氨基酸序列相对于SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4、和/或SEQ ID NO:6具有至少一个取代修饰。
本发明包括分离的σC多肽，该σC多肽具有由核苷酸序列编码的氨基酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、和/或SEQ ID NO:5具有至少约50％序列一致性、具有至少约55％序列一致性、具有至少约60％序列一致性、具有至少约65％序列一致性、具有至少约70％序列一致性、具有至少约75％序列一致性、具有至少约80％序列一致性、至少约85％序列一致性、至少约90％序列一致性、至少约95％序列一致性、至少约96％序列一致性、至少约97％序列一致性、至少约98％序列一致性、或至少约99％序列一致性。在一些方面，本发明包括分离的σC多肽，该σC多肽具有由核苷酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、和/或SEQ ID NO:5编码的氨基酸序列。在一些方面，本发明包括分离的σC多肽，该σC多肽具有由核苷酸序列编码的氨基酸序列，该核苷酸序列相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、和/或SEQ ID NO:5具有至少一个取代修饰。
本发明包括如在此所述的多肽，其截断以及片段。截断包括但不限于如下氨基酸序列，在这些氨基酸序列中一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、或更多氨基酸被从氨基酸序列的氨基末端去除和/或一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、或更多氨基酸被从氨基酸序列的羧基末端去除。
片段包括但不限于，例如，具有在此所述的序列的约5个、约10个、约15个、约20个、约25个、约50个、约75个、约100个、约150个、约200个、约250个、约300个、约350个、约400个、约450个、约500个、约550个、约600个、约650、以及约700个连续的氨基酸残基的片段。片段也包括，例如，具有以上片段大小的任意组合的大小范围的片段。片段包括但不限于，例如，具有在此所述的序列的至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少50个、至少75个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少500个、至少550个、至少600个、至少650个、以及至少700连续的氨基酸残基的片段。
本发明包括多肽，这些多肽具有与在此所述的氨基酸序列具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个或更多氨基酸改变的氨基酸序列，或其片段。此类氨基酸改变包括但不限于连续氨基酸改变。
本发明包括本发明的一种或多种多肽在检测鸟中禽类呼肠孤病毒暴露的方法中的用途，该方法包括测定从该鸟获得的抗血清样本与本发明的多肽的特异性结合。此类多肽包括，那些如在此所述的中的任何一个，包括但不限于SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、以及SEQ ID NO:6，以及其衍生物和片段。本发明还包括诊断试剂盒，这些诊断试剂盒包括本发明的多肽中的一种或多种。此类试剂盒可以包括如另外的组分，例如像，阳性对照多肽、阴性对照多肽、第二抗体、检测标记。
本发明包括分离的多核苷酸序列，该多核苷酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:5具有至少约50％序列一致性、至少约55％序列一致性、至少约60％序列一致性、至少约65％序列一致性、至少约70％序列一致性、至少约75％序列一致性、至少约80％序列一致性、至少约85％序列一致性、至少约90％序列一致性、至少约95％序列一致性、至少约98％序列一致性、或至少约99％序列一致性。本发明包括分离的多核苷酸序列，该多核苷酸序列具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:5、截断、或其片段。在一些方面，本发明包括如在此所述的分离的多核苷酸序列，该多核苷酸序列相对于SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3、或SEQ ID NO:5具有至少一个取代修饰。
本发明包括分离的多核苷酸序列，该多核苷酸序列与编码SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4、或SEQ ID NO:6的核苷酸序列具有至少约50％序列一致性、至少约55％序列一致性、至少约60％序列一致性、至少约65％序列一致性、至少约70％序列一致性、至少约75％序列一致性、至少约80％序列一致性、至少约85％序列一致性、至少约90％序列一致性、至少约95％序列一致性、至少约98％序列一致性、或至少约99％序列一致性。在一些方面，本发明包括分离的多核苷酸序列，该多核苷酸序列具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:6。在一些方面，本发明包括如在此所述分离的多核苷酸序列，该多核苷酸序列编码氨基酸序列，该氨基酸序列相对于SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:6具有至少一个取代修饰。
本发明包括多核苷酸序列，该多核苷酸序列在多种条件下与在此所述的核苷酸序列及其片段进行杂交。严格条件包括但不限于中等严格和高严格。高严格杂交条件可以是，例如，将6X SSC、5X Denhardt、0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)、以及100ug/ml片段化的和变性的鲑鱼精子DNA在65℃下过夜杂交，并且在2X SSC、0.1％SDS中在室温下洗涤至少一次持续约10分钟，随后在65℃下洗涤至少一次持续约15分钟，随后在0.2X SSC、0.1％SDS中在室温下洗涤至少一次持续至少3分钟至5分钟。
本发明包括在此所述的多核苷酸序列，该多核苷酸序列具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、二十个、或更多核苷酸的取代。本发明还包括在此所述的多核苷酸序列，在这些多核苷酸序列中密码子使用已经被适配成优化给定的宿主细胞中的表达。例如，密码子使用可以被适配成优化宿主细胞中的表达，这些宿主细胞包括但不限于杆状病毒、酵母菌、大肠杆菌、家禽、或人类细胞。此类适配可以通过本领域已知的技术进行。
本发明包括引物，包括但不限于在此所述的引物中的任何一个，以及在PCR反应中可以用于生成在此所述的序列或其片段的引物。在一些实施例中，引物可以包括至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、或至少40个核苷酸残基。在一些实施例中，引物可以包括不超过10个、不超过15个、不超过20个、不超过25个、不超过30个、不超过35个、不超过40个、不超过45个、不超过50个、不超过55个、或不超过60个核苷酸残基。此类核苷酸残基可以是连续的序列或其补体。也包括引物对，这些引物对包括在此所述的引物中的至少一个、其补体、或衍生自此类序列的引物。本发明还包括由此类引物产生的扩增产物。
本发明包括载体，该载体包含本发明的多核苷酸序列。在一些方面，该载体是疫苗载体。本发明包括分离的多肽，该多肽由本发明的多核苷酸编码。
本发明包括本发明的一种或多种多核苷酸序列在检测样本中禽类呼肠孤病毒感染原的方法中的用途。此类方法包括，例如，包括检测本发明的多核苷酸序列与样本杂交的方法，和包括用衍生自本发明的多核苷酸序列的至少一种引物产生聚合酶链式反应(PCR)扩增产物的方法。此类多核苷酸序列包括，如在此所述的那些中的任何一个、包括但不限于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、以及SEQ ID NO:5。本发明还包含诊断试剂盒，该诊断试剂盒包括本发明的多核苷酸序列中的一种或多种。本发明包括诊断试剂盒，该诊断试剂盒包括本发明的病毒、细胞系、细胞沉淀、上清液、多核苷酸序列、载体、和/或多肽中的一种或多种。
如在此所述的禽类呼肠孤病毒可以是灭活的或杀死的病毒。病毒灭活的目的是阻止这些病毒复制，并且一般可以通过化学或物理方法实现。可以通过用例如酶类、甲醛、β-丙酸内酯、乙烯-亚胺或其衍生物处理这些病毒实现化学灭活。可以例如通过使这些病毒经受能量辐射如UV光进行物理灭活。
如在此所述的禽类呼肠孤病毒可以证明降低毒力并且充当用于接种目的的减毒病毒。在本发明的实践中有用的禽类呼肠孤病毒的减毒可以出于此目的通过本领域熟知的方法获得。例如，依据本发明的分离的禽类呼肠孤病毒可以通过在含胚鸡蛋，活动物或适合的细胞系中传代进行减毒。此类细胞系可以包括，例如，原发性(禽类)细胞培养系(例如像，鸡胚肝细胞、鸡胚成纤维细胞、或鸡肾细胞)，哺乳动物细胞系(例如像，VERO细胞系或BGM-70细胞系)，或禽类细胞系(例如像，QT-35、QM-7或LMH)。此类回传代病毒可以例如用约10次至约100次传代获得。此类回传代病毒可以例如用一次或多次回传代、两次或多次回传代、三次或多次回传代、四次或多次回传代、五次或多次回传代、十次或多次回传代、十五次或多次回传代、二十次或多次回传代、二十五次或多次回传代、五十次或多次传代、七十五次或多次传代、或一百次或多次传代获得。此类回传代病毒可以例如用约一次回传代、约两次回传代、约三次回传代、约四次回传代、约五次回传代、约十次回传代、约十五次回传代、约二十次回传代、约二十五次回传代、约五十次传代、约七十五次、约一百次传代、或其任何范围获得。
例如，本发明包括禽类呼肠孤病毒，该禽类呼肠孤病毒通过在初级鸡胚成纤维细胞中传代随后是空斑纯化而进行减毒。该过程可以被重复例如约10次至约100次以减毒该病毒。致病性测试可以在不同时间点进行，例如，在传代25次、在传代50次、在传代75次、在传代100次、以及在另外的时间点进行。
本发明包括在家禽中产生抗类群1和/或类群2禽类呼肠孤病毒免疫应答的方法，该方法包括施用本发明的分离的病毒、细胞系、细胞沉淀、上清液、多核苷酸序列、载体、和/或多肽。在一些方面，免疫包含体液免疫和/或细胞免疫。在一些方面，免疫包含黏膜免疫。
本发明包括预防在家禽中感染禽类呼肠孤病毒的方法，该方法包括施用组合物，该组合物包括本发明的分离的病毒、细胞系、细胞沉淀、上清液、多核苷酸序列、载体、和/或多肽。
在本发明的方法的一些方面，给予包括注射、喷雾、口服给予、或呼吸给予。在本发明的方法的一些方面，给予诱导黏膜免疫。在本发明的方法的一些方面，给予包括卵内给予。在一些方面，卵内给予包括在约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、或其任何范围时给予。
本发明包括免疫原性组合物和疫苗，这些免疫原性组合物和疫苗包含在此所述的分离的病毒、多核苷酸序列、载体、和/或多肽中的一种或多种。在一些实施例中，该病毒是活的。在一些实施例中，该病毒是减毒的或灭活的。在一些实施例中，该病毒是灭活的或杀死的。在一些实施例中，病毒、组合物、或疫苗是冻干的。在一些实施例中，病毒、组合物、或疫苗是冷冻的。
此类组合物和疫苗可以作为活性组分施用以使鸟免疫从而引起对类群1和/或类群2禽类呼肠孤病毒的免疫应答和/或从而诱导对抗此类禽类呼肠孤病毒的免疫。免疫可以包括接种后与未接种的类群相比，在鸟种群中诱导较高水平的保护。该免疫应答可以赋予或不赋予保护性免疫。免疫应答可以例如包括细胞介导的免疫应答和/或体液免疫应答中的一种或多种，细胞介导的免疫应答包含淋巴细胞响应于抗原暴露的产生，体液免疫应答包含血浆淋巴细胞(B细胞)响应于连续的抗原暴露的产生，随后是抗体产生。免疫作用可以导致减轻、抑制或预防禽类呼肠孤病毒相关的病毒性关节炎(VA)/腱鞘炎的症状中的一种或多种。此类症状可以包括体重抑制、产蛋下降、死亡率、肉眼可见的损伤(包括但不限于腱肿胀、腱鞘炎、腱破裂、以及心包积液)、以及组织学变化(包括但不限于淋巴细胞性腱鞘炎、淋巴细胞性心外膜炎、和淋巴细胞性心肌炎)中的一种或多种。
本发明的免疫原性组合物或疫苗还可以包括一种或多种具有佐剂活性的化合物。出于此目的的适合的化合物或组合物包括氢氧化铝、磷酸铝、氧化铝、植物油、动物油、基于例如矿物油(如贝约尔(Bayol)FTM或Marcol 52TM、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂)、或植物油(vegetable oil)(如维生素E醋酸酯)的水包油或油包水乳液、以及皂甙类。
本发明的免疫原性组合物或疫苗可以包括一种或多种适合的药学上可接受的载体或稀释剂。本发明的免疫原性组合物或疫苗还可以包括一种或多种稳定剂。可以使用任何适合的稳定剂，包括碳水化合物如山梨糖醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、糊精、或葡萄糖，蛋白如白蛋白或酪蛋白；以及缓冲剂如碱金属磷酸盐等。当通过冻干法制备干疫苗制品时，稳定剂是特别有利的。
本发明的免疫原性组合物或疫苗可以进一步包括一种或多种源自其他感染家禽的病原体的免疫原。此类免疫原可以源自，例如，马立克氏病病毒(Marek's diseasevirus)(MDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)(NDV)、产蛋下降综合征(EDS)病毒、火鸡鼻气管炎病毒(TRTV)、痘病毒、呼肠孤病毒、鸡细小病毒、以及禽类肾炎病毒(包括但不限于ANV-1和ANV-2)。
可以通过接种家禽的任何适合的已知的方法给予本发明的免疫原性组合物或疫苗，包括包括经鼻、经眼、通过注射、在饮水中、在饲料中、通过暴露、在卵内、经母体、通过呼吸吸入、等等。可以通过许多给予技术给予该免疫原性组合物或疫苗，如通过放置该疫苗在饮水中或通过喷雾环境。当通过注射给予时，免疫原性组合物或疫苗可以肠胃外给予。肠胃外给予包括，例如，通过静脉内、皮下、肌内、或腹膜内注射给予。
在一些实施例中，活疫苗能以每只鸟不少于102滴定单位(其中滴定单位是在联邦法规法典(Code of Federal Regulations)，部分113.332，标题9中定义的)的剂量给予，并且灭活的疫苗可以包括每只鸟104-1010TCID50的抗原当量(其中TCID是组织培养感染剂量的缩写)。
本发明的组合物和疫苗可以是基本上纯的。如在此使用的，“基本上纯的”意味着材料基本上不含通常会与它在自然界中发现的类似的任何大分子或其它生物实体。
本发明的组合物和疫苗可以对许多禽类物种的任何一种中的鸟给予，包括但不限于家禽、鸡形目的鸟以及外来鸟物种，这些禽类物种易感染禽类呼肠孤病毒。鸡形目的鸟包括但不限于鸡、火鸡、松鸡、鹌鹑以及野鸡。如在此使用的，家禽包括出于收集它们的蛋的目的而饲养或为了它们的肉和/或羽毛的目的而杀死的驯化的鸟。这些最典型的是鸡雁小纲(Galloanserae)总目(家禽)，尤其是鸡形目(包括例如，鸡、鹌鹑、火鸡以及松鸡)和鸭(Anatidae)科(在雁形目(Anseriformes)中)，通常称作“水禽”(包括例如，鸭、鹅、以及天鹅)的成员。家禽还可以包括其他鸟，这些鸟因它们的肉被杀死，如鸽或白鸽或被认为是猎物的鸟如野鸡。鸡包括但不限于，母鸡、公鸡、肉仔鸡、公鸡(roaster)、种鸡、种母鸡的子代、以及蛋鸡(layer)。如在此使用的，术语“易感”是指对于对照的微生物的有害的响应的可能性或现实性，例如像，当与非易感的个体或类群相比时减弱的活力或不能茁壮生长、和/或禽类病毒感染指示的一个或多个病理状态。
可以在孵化之前或之后向家禽给予本发明的疫苗。家禽可以在多个年龄时接受疫苗。例如，肉仔鸡可以在卵内在一日龄、或在2-3周龄时疫苗接种。产蛋家畜或繁育家畜可以例如在约6至12周龄时疫苗接种并且在约16至20周龄时加强。这种产蛋家畜或繁育家畜可以在约6、在约7、在约8、在约9、在约10、在约11、或在约12周龄时疫苗接种。这种产蛋家畜或繁育家畜可以在约16、在约17、在约18、在约19、或在约20周龄时加强。此类产蛋家畜或繁育家畜的后代可以展示对如在此所述的多肽的一种抗体效价，这将预防或缓解该后代中的禽类呼肠孤病毒感染症状。卵内疫苗接种可以例如，在约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、或在其任何范围时发生。
可以在任何适合的年龄并且通常在第一次疫苗接种前的约一至三日龄对鸡进行疫苗接种。这些鸡可以仅疫苗接种一次。或者，如果使用两个剂量疫苗，例如当这些鸡是3日龄至一周龄时给予第一剂量并且在另外的1-10周后随后给予第二剂量。
可以贯穿鸡的一生给予该组合物的多剂量。由于母源性免疫是给肉仔鸡子代提供保护的原始来源，所以种鸡典型地被疫苗接种，虽然如果需要的话肉鸡也可以疫苗接种。
本发明还包括与类群1禽类呼肠孤病毒和/或类群2禽类呼肠孤病毒结合的抗血清和抗体。在一些方面，抗血清或抗体不针对禽类呼肠孤病毒的目前商用的疫苗株，例如像，禽类呼肠孤病毒株S1133、1733、2408、和/或2177。在本发明的实践中有用的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、人源化抗体、嵌合抗体、或其片段，还包括双特异性抗体、合成抗体、抗体片段(例如Fab、FV、F(ab)2或scFv片段)、单链抗体或这些中任一种的化学修饰的衍生物。此类抗体可以用于诊断方法和诊断试剂盒。在一些方面，抗禽类呼肠孤病毒抗体可以与固体底物附接。
本发明提供了检测和/或测量从鸟中获得的样本中的类群1或类群2禽类呼肠孤病毒的量的方法。在一些方面，类群1禽类呼肠孤病毒包括具有如在此所述的氨基酸序列的σC蛋白，包括但不限于具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO4、或其片段的σC蛋白或其衍生物。在一些方面，类群2禽类呼肠孤病毒包括具有如在此所述的氨基酸序列的σC蛋白，包括但不限于具有SEQ ID NO:6、或其片段的σC蛋白或其衍生物。此类方法可以包括将样本与抗体接触，该抗体选择性地与如在此所述的禽类呼肠孤病毒和/或如在此所述的σC蛋白结合，并且测量抗体与样本中的病毒或蛋白结合的量。该样本可以是任何生物材料，如组织、骨骼、血液、尿液或粪便。本发明的这一方面的方法例如对于测定家禽是否被本发明的禽类呼肠孤病毒感染是有用的。为了阻止该呼肠孤病毒扩散至其他动物，可以杀死感染的动物。
如在此使用的，“分离的”是指从其原始环境(例如，如果它是天然存在的，那么是自然环境)移除的材料并且因此“通过人工”从其自然状态改变。
术语“和/或”意指所列举的要素的一个或所有或所列举的要素的任何两个或更多个的组合。
词语“优选的”和“优选地”是指本发明的在某些情况下可以提供某些益处的实施例。然而，在相同或其他情况下，其他实施例也可以是优选的。此外，一个或多个优选实施例的叙述不意味着其他实施例是无用的，并且不旨在将其他实施例排除在本发明的范围之外。
术语“包含”及其变化形式在这些术语出现在说明书和权利要求书中时不具有限制意义。
除非另外说明，“一个(a)”、“一个(an)”、“该”、以及“至少一个”可互换使用，并且意指一个或多于一个。
并且在此，通过端点详述的数值范围包括该范围内所归纳的所有数值(例如1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
对于本文中披露的、包括分离步骤的任何方法，这些步骤可以按任何可行顺序实施。并且，如果适宜，两个或更多个步骤的任何组合可以同时实施。
除非另外指明，所有表示组分、分子量的数字，以及在说明书和权利要求书中使用的等要理解为在所有情况下由术语“约”进行修饰。因此，除非另外相反地指明，在本说明书和权利要求书中阐述的数值参数是近似值，这些近似值可以取决于本发明所寻求获得的所希望的特性而不同。最低限度并且不试图限制等效物原则应用到本权利要求书的范围，每一个数值参数至少应该按照报告的有效数字的数量以及通过应用普通的舍入方法来解释。
虽然阐述本发明的广泛范围的数字范围和参数是近似值，但是在具体实例中阐述的数值被尽可能地精确地报道。然而，全部数值内在地含有因其相应的检验度量中存在的标准偏差而必然产生的范围。
全部标题旨在方便读者并且不应当用来限制该标题后续文本的意思，除非如此说明。
贯穿本申请，在几个地方中，通过一系列实例提供指导，这些实例能以多种组合形式使用。在每种情况下，所述系列仅作为代表性群组发挥作用并且不应当解释为排他性系列。应该理解地是，具体实例、材料、量和程序应根据如本文所阐述的本发明的范围和精神来宽泛地解释。
本发明通过以下实例来阐明。应该理解地是，具体实例、材料、量和程序应根据如本文所阐述的本发明的范围和精神来宽泛地解释。
实例
实例1
呼肠孤病毒变种的分离和表征
该实例描述了从肉仔鸡中许多腱鞘炎和/或跛行临床病例的腱中分离呼肠孤病毒变种，这些肉仔鸡年龄范围从提交于家禽诊断和研究中心(Poultry Diagnostic andResearch Center)2.5-8周。通过测序σC蛋白和血清学测定表征这些禽类呼肠孤病毒。
材料和方法
病毒分离。在乔治亚大学(the University of Georgia)的家禽诊断和研究中心(the Poultry Diagnostic and Research Center)，从表现出病毒性关节炎和腱鞘炎的临床症状的商用肉仔鸡的腱中分离呼肠孤病毒野生型分离株Ck/94594腱/GA/2012、Ck/94826腱/GA/2012以及Ck/96139腱/GA/2012。将来自临床感染的鸡的腱和滑液抽吸物分别用抗生素在病毒传输介质中均质化。将该均质化的组织通过0.45微米针筒式滤器过滤。将滤液用呼肠孤病毒S1133抗血清(查尔斯河(Charles River)，SPAFAS，威尔明顿(Wilmington)，马萨诸塞州(MA))在37℃下培养1小时。随后中和，将0.2ml匀浆在原代鸡胚肝细胞中总共培养4代。随着70％-80％细胞病变效应的发展，当观察到合胞体形成时，将细胞培养物冷冻并且在-80℃下贮存。在随后的细胞传代培养之前，将细胞培养物冷冻并且解冻三次。
RNA提取。使用RNeasy试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，巴伦西亚(Valencia)，加利福尼亚州(CA))根据制造商的建议，将全部的病毒RNA从原代鸡胚肝细胞传代中提取。简而言之，感染后48小时，将细胞培养基倾去，将该单细胞层用包含0.143Mβ-巯基乙醇的300μl RLT缓冲液覆盖并且用细胞刮棒按生产商建议的刮出。
RT-PCR。通过反转录和PCR，使用具有先前公开的P1(AGTATTTGTGAGTACG ATTG(SEQID NO:7))和P4(GGCGCCACACCTTAGGT(SEQ ID NO:8))引物的SUPERSRIPTTM III RNA酶H-反转录酶和Taq DNA聚合酶(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚州)产生对应于该S1基因的cDNA(康德(Kant)等人，2003，兽医研究(Vet Res)；34:203-212)。将该1.1kb的扩增产物在1.0％琼脂糖凝胶上分离，用溴化乙锭染色并且用紫外透射器可视化。将片段切割，用QIAEX II凝胶提取试剂盒(凯杰公司(QiagenInc.)，巴伦西亚(Valencia)，加利福尼亚州)纯化，在焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水中洗脱，并且在-80℃下贮存。
扩增产物和S1克隆的核苷酸序列测定。将凝胶纯化的PCR产物直接使用具有荧光标记的双脱氧核苷酸和Taq聚合酶的双链DNA序列测定进行测序并且在ABI 9700自动测序仪(应用生物系统有限公司(Applied Biosystems Inc.)，福斯特市(Foster City)，加利福尼亚州)上操作。使用PCR引物P1和P4进行测序，还按需使用保守的内部S1基因引物以完成测序。在请求后可获得用于测序的引物序列。此外，根据制造商的建议将凝胶纯化的产物克隆到质粒pCR2TOPO(英杰公司(Invitrogen))中并且转化进入大肠杆菌中。将来自每种分离株的若干克隆通过PCR使用M13正向和反向引物进行鉴定，这些分离株包含具有1.1kb插入片段的质粒。将这些克隆进行扩增并且根据制造商的方法使用质粒微量制备试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，巴伦西亚(Valencia)，加利福尼亚州)纯化质粒。使用M13通用正向和反向引物进行测序，还按需使用内部S1引物以完成测序。将包含S1基因的来自三次扩增的至少三种克隆或PCR产物在两个方向上都进行测序并且用于获得共有区。针对分离株94594、94826以及96139的核苷酸和氨基酸序列在图1-6中进行鉴定。
序列分析。使用CLUSTAL W(Lasergene，v.5.0，DNASTAR，麦迪逊(Madison)，威斯康星州(WI))进行该S1基因和σC蛋白的核苷酸、预测的氨基酸序列分析以及多重比对。先前公开的禽类呼肠孤病毒的S1基因的序列从基因库获得。
将比对序列进行比较并且使用邻接聚类和1000个自引导复本(置信水平列于括号中)，在启发式搜索中使用系统发生分析，使用Parsimony v 4.10b软件(PAUP)生成系统树。
基因库登录号。从鸡分离株94594、94826以及96139获得的序列已经提交给基因库并且分别指定以下登录号：KJ803966、KJ803967、以及KJ803990。
结果和讨论
至今，呼肠孤病毒野生型分离株的两种原发性变种基因型已经在VA/腱鞘炎的临床病例中出现，并且由于与目前的呼肠孤病毒疫苗株(S1133、1733、2408、2177)和在数据库中的其他病毒(图7)缺乏相似性而被表征为变种基因型。多数的野生型分离株属于类群1(鉴定为类群1 2012VA变种)。当其与公共结构域和PDRC数据库(图8)中的序列相比时，属于该基因型的呼肠孤病毒的σC氨基酸序列具有彼此>99％的相似性和与疫苗株<50％的相似性。类群2中的呼肠孤病毒(鉴定为类群2 2012VA变种)具有彼此>99％的相似性和与类群12012VA变种(图8)<50％的相似性。类群2 2012VA变种和疫苗株之间的σC相似性是80％(图8)。尽管该类群共享高序列相似性，但是还不清楚的是，该80％相似性是否会转化成某种程度的与目前疫苗株的交叉保护。进行来自这两个类群的野生型分离株的血清学评估，以在病毒的血清学相关度上提供必要的信息。
在单向交叉中和测定中使用针对S1133、2408的抗血清评估来自类群1和类群2变种的代表性病毒并且制备对抗类群1 2012VA变种的高免疫血清。野生型分离株和血清板之间的VN效价在2和16之间，提供的证据表明该野生型分离株是非血清学地相关于S1133、2408或彼此的。
实例2
针对类群1变种呼肠孤病毒的致病性和子代保护研究
这个实例测定了鸡中的呼肠孤病毒变种类群1 2012VA分离株94826和94594的致病性。
实验#1
该实验要确定的是，公司A的种疫苗接种程序是否能提供足够的保护以对抗被呼肠孤病毒野生型分离株94826激发的子代中的变种类群1 2012VA分离株。
鸡。使用来自公司A的疫苗接种种畜的80只1日龄的商用肉仔鸡。
表1.处理组
雏鸡的数量 组ID 组处理
20只雏鸡 1 放血，用于呼肠孤病毒ELISA(IDEXX)
20只雏鸡 2 用S1133接种
20只雏鸡 3 用分离株94826接种
20只雏鸡 4 用无菌PBS接种
病毒。将野生型分离株94826在原发性鸡胚肝细胞中繁殖并且滴定，并且用于对日龄雏鸡在103TCID50/鸟的激发剂量下进行足垫接种。也在原发性鸡胚肝细胞中滴定的S1133原种将会用于对日龄雏鸡在103TCID50/鸟剂量下进行足垫接种。阴性对照将会用无菌PBS经足垫被模拟激发。
呼肠孤病毒激发。六十只商用肉仔鸡在孵化当天收到并且被分成20只每组的3组，并且置于Horsfall Bauer分离单元中。对来自组1的雏鸡进行放血以用于呼肠孤病毒ELISA(IDEXX)并且终止。经足垫用1)无菌PBS、2)S1133、或3)94826接种来自组2-4的雏鸡。这在表1中是详述的。每天观察这些鸟并且用数显卡尺测量每个处理组中的跗关节肿胀并且每2天记录一次。在第14天，所有的鸟使安乐死，称重并进行尸体剖检。对鸟检查任何肉眼可见的损伤并且检查跗关节肿胀、出血和/或破裂。保护参数包括孵化当天血清学、临床征象、死亡率、体重、肉眼可见的损伤以及贯穿研究进行的跗关节肿胀的评估/测量。
实验#2
该实验要确定的是，公司B的种疫苗接种程序是否能提供足够的保护以对抗子代中的被公司B饲养场的呼肠孤病毒野生型分离株激发的病毒性关节炎，并且日龄时的商用呼肠孤病毒疫苗的使用是否提供任何保护。
鸡。使用来自公司B疫苗接种的种畜的100只1日龄的商用肉仔鸡。
表2.处理组
雏鸡的数量 组ID 组处理
20只雏鸡 1 放血，用于呼肠孤病毒ELISA(IDEXX)
20只雏鸡 2 用无菌PBS接种
20只雏鸡 3 在1d时VA ChickVac全剂量，然后激发w/94594
20只雏鸡 4 在1d时VA ChickVac1/2剂量，然后激发w/94594
20只雏鸡 5 用桑德森(Sanderson)野生型分离株94594激发
病毒。在研究前，将呼肠孤病毒野生型分离株94594在原发性鸡胚肝细胞中繁殖并且滴定。按照生产商的建议，VA ChickVac(硕腾公司(Zoetis))用于孵化当天疫苗接种。阴性对照使用无菌PBS进行模拟激发。
呼肠孤病毒激发。一百只商用雏鸡在孵化当天收到并且分成每组20只雏鸡的5等组。将组1放血，用于呼肠孤病毒ELISA(IDEXX)。在压力空气正压下，将剩下的4组雏鸡置于Horsfall Bauer分离单元中。在孵化当天，将组3通过皮下给予用VA ChickVac以全剂量进行疫苗接种同时将组4通过皮下给予用VA ChickVac以半剂量进行疫苗接种。这在表2中是详述的。在第10天，获得对所有雏鸡的足垫测量。在第10天，将组2经足垫用0.1ml无菌磷酸盐缓冲盐水接种，同时将组3-5中的雏鸡经足垫用野生型分离株94594以103TCID50/鸟激发。从10日龄开始，每天监测这些雏鸡并且每2天一次获得对跗关节的测量。在22日龄时，将该研究终止。用于保护的参数是孵化当天血清学、临床征象、死亡率、体重、肉眼可见的损伤。
结果和讨论
使用来自类群1 2012VA变种基因型的代表性菌株进行商用肉仔鸡中致病性和子代保护研究。在第一次研究中，孵化当天的雏鸡通过足垫用S1133或类群1 2012VA变种分离株激发并且将一组放置用于阴性对照。此外，将单独组的二十只孵化当天的雏鸡进行放血，用于呼肠孤病毒ELISA。将所有的雏鸡放于新鲜刨花上的各自分离的笼的围栏中并且给予能获得饲料和水的自由。每2天一次进行足垫测量并且每天监测鸟的临床征象直到在14天时实验终止(图9)。群组的呼肠孤病毒ELISA几何均值效价(GMT)是1,212，该值对于孵化当天的雏鸡被认为是低的。在S1133和变种呼肠孤病毒激发组两者中观察到临床腱鞘炎和显著体重下降抑制(图10和12)。当S1133雏鸡比那些用变种激发的雏鸡被跛行更严重地影响时，在变种激发的组中的指屈肌腱周围存在着肿胀的更高的发病率(图11)。在激发组中观察到其他的临床征象，包括心包积液和跗关节炎症(图12)。呼肠孤病毒孵化当天效价是较低的，并且因此来自公司A的疫苗接种程序的母源抗体不提供足够的保护以对抗类群1变种的激发。此外，该野生型分离株重现了在野生型中观察到的临床疾病并且被确认为是疾病的致病原。
在第二次研究中，商用肉仔鸡雏鸡通过足垫在12日龄时用类群1变种激发并且该研究在23日龄时终止。获得自孵化当天收集的血清的呼肠孤病毒ELISA GMT是4,900。在该研究中，与阴性对照相比，激发组中的平均体重仅轻微偏低(图13)。然而，该激发组表现出病毒性关节炎/腱鞘炎的临床征象和肉眼可见的损伤特征(图14)。正如在第一次研究中的，在激发的鸟中观察到指屈肌腱周围的肿胀连同心包积液(图12和图13)。从该研究得出结论，具有较高水平的母源呼肠孤病毒抗体的雏鸡不保护对抗类群1变种的激发。
此外，评估于商用肉仔鸡孵化当天以全剂量和半剂量皮下给予、随后在12日龄时用类群1变种激发的商用呼肠孤病毒疫苗的用途。使用如在先前的研究中的参数，在全部激发的组中我们都观察到VA/腱鞘炎的临床征象和肉眼可见的损伤特征。有趣的是，在忽视剂量下，与仅激发的组相比，在疫苗接种并激发的组中，心包积液和肿胀的跗关节的发病率较高(图14)。
总之，变种呼肠孤病毒已经从病毒性关节炎/腱鞘炎的临床病例中分离出来并且遗传学地和抗原性地区别于目前的呼肠孤病毒疫苗株。基于遗传学的和血清学的表征，两种不同的类群已经被鉴定为类群1和类群2 2012变种VA呼肠孤病毒。体内研究表明，在具有母源呼肠孤病毒抗体的雏鸡中，目前商用的疫苗不提供保护以对抗类群1 2012变种的激发。使用代表性类群2分离株进行的体内研究给出于以下实例3中。类群1和类群2变种呼肠孤病毒已经从来自美国和加拿大内的许多个州的腱鞘炎的临床病例中分离出来或检测，其中属于类群1的分离株的数量超过类群2的分离株的数量。这些病毒的起源是未知的。
实例3
对类群2变种呼肠孤病毒的致病性研究
将在实例2中更详细描述的程序用于表征商用肉仔鸡中类群2变种呼肠孤病毒的致病性。使用来自类群2 2012VA变种基因型的代表性菌株(Ck/96139腱/GA/2012)。处理组详细描述于表3中。
表3.处理组
雏鸡经足垫用0.1ml无菌磷酸盐缓冲盐水或野生型分离株996139以103TCID50/鸟接种。用于保护的参数是孵化当天血清学、临床征象、死亡率、体重、以及肉眼可见的损伤。贯穿本研究，对足垫肿胀和腱肿胀进行评估和测量。
结果和讨论
呼肠孤病毒ELISA(IDEXX)的孵化当天血清学示出于图17中。具体地，均值是511，GMT是385，SD是343，并且％CV是66.8％。
如图18示出的，类群2激发降低了体重。具体地，在类群2激发的鸟中观察到8％的体重下降。
图19示出了第14天的呈体重的百分数的足垫肿胀测量，同时图20示出了针对类群2激发的鸟的呈体重的百分数的腱肿胀测量。
针对类群2激发的鸟的尸体剖检和组织学检查结果如下：2/10的鸟具有破裂的腱；5/10的鸟具有淋巴细胞腱鞘炎(腱鞘)；2/10的鸟具有心包积液；并且2/10的鸟具有淋巴细胞心外膜炎和心肌炎。在肝或十二指肠中未观察到显著损伤。
因此，类群2激发导致轻微的体重抑制。在类群2激发的鸟中观察到心包积液、肿胀的腱、以及几个破裂的腱。并且，在心脏和腱中观察到与呼肠孤病毒一致的组织损伤。
总之，类群1和类群2变种两者都从商用肉仔鸡中病毒性关节炎的临床病例中分离出来。类群1和类群2变种两者都再生腱鞘炎，包括总体观察到的心包积液和腱肿胀，并且在心脏和腱中观察到与呼肠孤病毒一致的组织变化。类群1变种是更流行的。目前商用的疫苗似乎不提供对肉仔鸡的足够的保护。因此，自体疫苗接种似乎是用于对照的目前唯一选择。
实例4
针对禽类呼肠孤病毒的噬菌斑测定
在35mm平板中接种鸡胚肝细胞：
-在做测定之前的前一天，在35个培养皿(2ml/培养皿)中添加鸡胚肝细胞(CELiC)。
-在37℃下，将这些35mm平板置于培养箱中(过夜，至少多于12小时)。
噬菌斑测定的程序：
-从这些融合的CELiC中去除培养基(M199/F10+10％FBS)。
-添加200μl的该病毒(102TCID50)至平板中。
-三十分钟后，添加2ml具有稀释的病毒的M199/F10+2％CS至该平板中并且将该平板温和地涡旋。
-在37℃下，温育该平板3-4小时。
-在那期间制备每板2ml：1ml(2x浓度的M199/F10+5％CS)+和在细胞培养梯度H2O中的1ml的3％SeaPlaque琼脂糖。
-3-4小时后，从培养箱中取出该板并且去除上清液(1,200μl)。
-现在将制备的2ml/孔铺层，并且在37℃下培养2-3天。
2-3天后染色(通常培养2天后尝试染色，如果超过3天，细胞就会开始死亡并且噬菌斑可能不好)：
-制备稀释于细胞培养梯度水中的10％过滤的中性红。
-添加1ml/平板。
-在培养箱中培养至少2小时(2-4小时)。
-几小时后，将会清楚地出现噬菌斑。
结果：肝细胞将会染红。噬菌斑将保持未染色。
实例5
类群I和类群2σC蛋白序列
遵循实例1中更详细描述的程序，检测122个类群1和类群2变种禽类呼肠孤病毒的编码σC蛋白的核苷酸序列和编码的σC氨基酸序列。图21示出了针对122个分离株的基因库登录号、序列ID、分离株设计、来自分离的病毒的组织型、收集日期、分离的州和国家、以及分离来源。鸡胚肝细胞充当全部122个分离株的实验室宿主。
实例5
类群I和类群2变种禽类呼肠孤病毒的减毒
列于图21中的类群I和类群2禽类呼肠孤病毒分离株，包括但不限于94826和94594分离株(都是类群1分离株)以及96139分离株(类群2分离株)，将会在蛋中或细胞系(例如像，鸡胚肝细胞(CELiC))中通过传代进行减毒。克隆的、空斑纯化的病毒制品将会在每次传代后制备并且用于下一轮的减毒。约每25次传代后将会检测分离株的致病性和疫苗有效性，例如约25次、约50次、约75次、约100次、以及约125次传代后。可以获得该Cσ蛋白的氨基酸序列以用于减毒株。
在此引用的所有专利、专利申请、以及出版物和电子可得材料的完整披露(包括，例如，提交到例如，GenBank和RefSeq中的核苷酸序列，以及提交到例如，SwissProt数据库、PIR、PRF、PDB中的氨基酸序列，以及来自GenBank和RefSeq中的注释编码区的翻译)通过引用结合。在本申请的披露内容与通过引用结合在此的任何文献的一个或多个披露内容之间存在任何不一致性的情况下，将以本申请的披露内容为准。仅出于清楚理解起见给出以上详细说明和实例。不应将其理解成不必要的限制。本发明不限于所示和所述的精确细节，因为将在权利要求书限定的本发明内包含对于本领域技术人员而言显而易见的变体。
自由序列表
SEQ ID NO:1
来自类群1 2012VA变种野生型分离株94594的编码σC蛋白(碱基对1-931)的S1核苷酸序列
SEQ ID NO:2
来自类群1 2012VA变种野生型分离株94594的σC(氨基酸1-310)的S1氨基酸序列
SEQ ID NO:3
来自类群1 2012VA变种野生型分离株94826的编码σC蛋白(碱基对1-931)的S1核苷酸序列
SEQ ID NO:4
来自类群1 2012VA变种野生型分离株94826的σC(氨基酸1-310)的S1氨基酸序列
SEQ ID NO:5
来自类群2 2012VA变种野生型分离株96139的编码σC蛋白(碱基对1-931)的S1核苷酸序列
SEQ ID NO:6
来自类群2 2012VA变种野生型分离株96139的σC蛋白(氨基酸1-310)的S1氨基酸序列
SEQ ID NO:7P1PCR引物
SEQ ID NO:8P4PCR引物

Claims (40)

1.一种分离的禽类呼肠孤病毒，其中该禽类呼肠孤病毒包含：
(a)σC蛋白，包含与SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:4具有至少约80％序列一致性、至少约85％序列一致性、至少约90％序列一致性、至少约95％序列一致性、至少约96％序列一致性、至少约97％序列一致性、至少约98％序列一致性、或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
(b)S1基因，包含与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:3具有至少约80％序列一致性、至少约85％序列一致性、至少约90％序列一致性、至少约95％序列一致性、至少约96％序列一致性、至少约97％序列一致性、至少约98％序列一致性、或至少约99％序列一致性的核苷酸序列；
(c)σC蛋白，包含与SEQ ID NO:6具有至少约85％序列一致性、至少约90％序列一致性、至少约95％序列一致性、至少约96％序列一致性、至少约97％序列一致性、至少约98％序列一致性、或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；或者
(d)S1基因，包含与SEQ ID NO:5具有至少约85％序列一致性、至少约90％序列一致性、至少约95％序列一致性、至少约96％序列一致性、至少约97％序列一致性、至少约98％序列一致性、或至少约99％序列一致性的核苷酸序列。
2.一种类群1禽类呼肠孤病毒，包含如权利要求1(a)或1(b)所述的分离的禽类呼肠孤病毒。
3.如权利要求2所述的类群1禽类呼肠孤病毒，其中该禽类呼肠孤病毒包含σC蛋白，该σC蛋白包含与SEQ ID NO:2具有至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
4.如权利要求2所述的类群1禽类呼肠孤病毒，其中该禽类呼肠孤病毒包含σC蛋白，该σC蛋白包含与SEQ ID NO:4具有至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
5.一种类群2禽类呼肠孤病毒，包含如权利要求1(c)或1(d)所述的分离的禽类呼肠孤病毒。
6.如权利要求4所述的类群2禽类呼肠孤病毒，其中该禽类呼肠孤病毒包含σC蛋白，该σC蛋白包含与SEQ ID NO:6具有至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
7.如权利要求1至5中任一项所述的类群1或类群2禽类呼肠孤病毒，其中该禽类呼肠孤病毒通过在蛋或宿主细胞系中至少25个传代进行减毒。
8.如权利要求2所述的类群1禽类呼肠孤病毒，其中该类群1禽类呼肠孤病毒包括禽类呼肠孤病毒株94594以及其衍生物和子代。
9.如权利要求7所述的禽类呼肠孤病毒株94594，其中该禽类呼肠孤病毒株94594通过在蛋或宿主细胞系中至少25个传代进行减毒。
10.如权利要求2所述的类群1禽类呼肠孤病毒，其中该类群1禽类呼肠孤病毒包括禽类呼肠孤病毒株94826以及其衍生物和子代。
11.如权利要求9所述的禽类呼肠孤病毒株948264，其中该禽类呼肠孤病毒株948264通过在蛋或宿主细胞系中至少25个传代进行减毒。
12.如权利要求4所述的类群2禽类呼肠孤病毒，其中该禽类呼肠孤病毒包括禽类呼肠孤病毒株96139以及其衍生物和子代。
13.如权利要求11所述的禽类呼肠孤病毒株96139，其中该禽类呼肠孤病毒通过在蛋或宿主细胞系中至少25个传代进行减毒。
14.如权利要求1至12中任一项所述的禽类呼肠孤病毒，其中该禽类呼肠孤病毒是减毒的、灭活的、或杀死的。
15.如权利要求13所述的禽类呼肠孤病毒，其中该禽类呼肠孤病毒包括灭活的或杀死的禽类呼肠孤病毒株94594。
16.如权利要求13所述的禽类呼肠孤病毒，其中该禽类呼肠孤病毒包括灭活的或杀死的禽类呼肠孤病毒株94826。
17.如权利要求13所述的禽类呼肠孤病毒，其中该禽类呼肠孤病毒包括灭活的或杀死的禽类呼肠孤病毒株96139。
18.一种组合物，包含如权利要求1至16中任一项所述的禽类呼肠孤病毒。
19.一种疫苗，包含如权利要求1至16中任一项所述的禽类呼肠孤病毒。
20.一种用于在家禽中培育抗体的免疫学组合物，该组合物包含如权利要求1至16中任一项所述的禽类呼肠孤病毒。
21.如权利要求17至19中任一项所述的组合物或疫苗，进一步包含佐剂。
22.如权利要求17至20中任一项所述的组合物或疫苗，进一步包含来自感染家禽的一种或多种另外的病原体的抗原决定簇。
23.一种诊断试剂盒，包含如权利要求1至16中任一项所述的病毒。
24.一种在家禽中产生抗呼肠孤病毒抗体的方法，该方法包括向该鸟给予如权利要求1至16中任一项所述的分离的禽类呼肠孤病毒或如权利要求17至21中任一项所述的组合物或疫苗。
25.一种保护鸡形目的鸟对抗由禽类呼肠孤病毒诱导的病变或疾病的方法，该方法包括向该鸟给予如权利要求1至16中任一项所述的分离的禽类呼肠孤病毒或如权利要求17至21中任一项所述的组合物或疫苗。
26.一种降低鸡形目的鸟对由禽类呼肠孤病毒诱导的病变或疾病的易感性的方法，该方法包括向该鸟给予如权利要求1至16中任一项所述的分离的禽类呼肠孤病毒或如权利要求17至21中任一项所述的组合物或疫苗。
27.一种在鸡形目的鸟中降低病毒性关节炎和/或腱鞘炎的方法，该方法包括向该鸟给予如权利要求1至16中任一项所述的分离的禽类呼肠孤病毒或如权利要求17至21中任一项所述的组合物或疫苗。
28.一种在鸡形目的鸟中预防病毒性关节炎和/或腱鞘炎的方法，该方法包括向该鸟给予如权利要求1至16中任一项所述的分离的禽类呼肠孤病毒或如权利要求17至21中任一项所述的组合物或疫苗。
29.如权利要求23至27中任一项所述的方法，其中该鸟是鸡或火鸡。
30.如权利要求23至28中任一项所述的方法，其中给予包括孵化前或孵化后给予。
31.如权利要求23至28中任一项所述的方法，其中给予包括卵内给予。
32.如权利要求29所述的方法，其中卵内给予包括在约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、或其任何范围时给予。
33.如权利要求23至28中任一项所述的方法，其中给予包括向种母鸡给予。
34.一种抗体，该抗体与如权利要求1至16中任一项所述的禽类呼肠孤病毒结合并且不与禽类呼肠孤病毒株S1133、1733、2408、和/或2177结合。
35.如权利要求33所述的抗体，其中该抗体是单克隆抗体。
36.一种在鸟中检测禽类呼肠孤病毒暴露的方法，该方法包括测定从该鸟中获得的抗血清样本与如权利要求1至16中任一项所述的禽类呼肠孤病毒或其组分的特异性结合。
37.一种如权利要求1所述的禽类呼肠孤病毒的分离的σC蛋白或其片段。
38.一种在鸟中检测禽类呼肠孤病毒暴露的方法，该方法包括测定从该鸟中获得的抗血清样本与如权利要求36所述的分离的σC蛋白或其片段的特异性结合。
39.一种在样本中检测禽类呼肠孤病毒感染原的方法，该方法包括检测包含SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO5的多核苷酸或其片段与该样本的杂交。
40.一种在样本中检测禽类呼肠孤病毒的方法，该方法包括用衍生自SEQ ID NO:1、SEQID NO:3、或SEQ ID NO:5的至少一种引物产生聚合酶链式反应(PCR)扩增产物。
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