CN110404063A - 采用非免鸡蛋制备鸡传染性支气管炎病毒抗原的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于疫苗抗原技术领域，公开了一种采用非免鸡蛋制备鸡传染性支气管炎病毒抗原的方法，包括以下步骤：采用鸡传染性支气管炎非免鸡蛋，控制前孵化条件进行前孵化；鸡传染性支气管炎病毒毒株接种于鸡胚，接种剂量为105.0EID50/枚；接种后控制后孵化条件进行后孵化，接种后24h照检，弃去死胚，接种后36h后将鸡胚放入2~8℃冷藏室，冷藏12h后收获病毒尿囊液；对收获的病毒尿囊液检验毒价，浓缩，纯化得到鸡传染性支气管炎病毒抗原。该方法用非免鸡蛋替换SPF鸡蛋，同时确定了鸡传染性支气管炎病毒在非免鸡蛋中繁殖的工艺条件，既保证了疫苗质量，又降低了疫苗研究及生产成本，可为疫苗生产企业提供巨大的参考价值，应用前景广阔。

Description

采用非免鸡蛋制备鸡传染性支气管炎病毒抗原的方法
技术领域
本发明属于疫苗抗原技术领域，涉及一种采用非免鸡蛋制备鸡传染性支气管炎病毒抗原的方法。
背景技术
鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis，IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病，可引起鸡呼吸道、输卵管、肾脏、肠道及腺胃等多组织器官的病变，主要引起10周龄以下的鸡发病，以气管罗音、咳嗽、打喷嚏为主要临床特征，蛋鸡恢复后将丧失产蛋功能，成为“假母鸡”，严重威胁我国养鸡业的发展。鸡传染性支气管炎由于血清型复杂，相互之间没有或仅有部分交叉免疫保护，给鸡传染性支气管炎病的预防和控制带来诸多不便。
疫苗免疫是预防鸡传染性支气管炎的有效方法。灭活疫苗安全性好，不存在散播病原和毒力返强的问题，且能激发良好的体液免疫反应。但是，由于病毒抗原增殖的病毒毒价不高，需要加大浓缩倍数来获得合格的病毒抗原；而且在灭活疫苗免疫时使用剂量大，需要配合佐剂，制备比较复杂，成本较高。因而，从鸡传染性支气管炎灭活疫苗生产工艺入手，寻找既能提高疫苗质量和产量，又能节约生产成本的工艺方法，是亟待解决的问题。
在疫苗生产中通常用鸡胚培养毒株，鸡胚中尿囊液量的多少直接影响着疫苗生产的数量和经济效益。生产实践证明，胚胎对湿度的适应范围比较广，不像温度那么严格，湿度有良好的导热作用，可以使孵化初期的胚胎受热良好，有利于胚胎后期生理散热及胚胎发育。现有研究报道未见关于获得最大量尿囊液湿度的研究，而实际生产中，尿囊液量的多少直接影响着疫苗的产量。高湿度可以获得较多的尿囊液，湿度较大时，胚胎水分蒸发较慢，温度的变化对蒸发影响不大，因而尿囊液变化不明显，而当湿度降低时，胚胎水分蒸发加快，温度对蒸发影响相对加大，因而影响了尿囊液量的变化。因此，探究温度与湿度两个因素对鸡胚孵化过程中尿囊液量的影响，从而获得最大量的鸡胚尿囊液，在疫苗生产中具有重要意义。
由于SPF鸡胚对各种病原微生物均有敏锐的感受性，且重复性好，是研制病毒性禽病的高标准原材料。相反，普通鸡生活在自然环境中，常常容易受到各种病原微生物的感染，其产的鸡蛋也易含有各种未知的病毒或抗体。但是，由于SPF鸡蛋成本较高，而对于生产灭活疫苗来说，最主要的问题是鸡胚对病毒的易感性，故筛选对鸡传染性支气管炎病毒易感的非免鸡蛋取代价格昂贵的SPF鸡蛋来探究传支灭活疫苗的质量和产量，对降低疫苗生产成本也具有重要意义。
另外，鸡传染性支气管炎病毒在鸡胚上繁殖时，鸡胚的收获时间对病毒的毒价及尿囊液收获量的影响也较大。接毒后收获时间越晚，收获的尿囊液量越多，但病毒毒价可能较低；接毒后收获时间越早，收获的病毒毒价可能较高，但尿囊液量较少。故研究鸡胚最佳收获时间，对提高传支灭活疫苗的质量和产量，提高产品经济效益至关重要。
发明内容
本发明的目的在于针对鸡胚孵化过程中温度、湿度及鸡胚收获时间等因素难以确定，以及采用SPF鸡胚繁殖鸡传染性支气管炎病毒生产抗原时导致疫苗生产成本高的问题，提供一种采用非免鸡蛋制备鸡传染性支气管炎病毒抗原的方法。
为实现上述目的，本发明提供一种采用非免鸡蛋制备鸡传染性支气管炎病毒抗原的方法，包括以下步骤：
步骤1：采用鸡传染性支气管炎非免鸡蛋，控制前孵化条件进行前孵化；
步骤2：将鸡传染性支气管炎病毒毒株接种于鸡胚，接种剂量为105.0EID50/枚；
步骤3：接种后控制后孵化条件进行后孵化，接种后24h照检，弃去死胚，接种后36h后将鸡胚放入2～8℃冷藏室，冷藏12h后收获病毒尿囊液；
步骤4：对收获的病毒尿囊液检验毒价，浓缩，纯化得到鸡传染性支气管炎病毒抗原。
进一步地，步骤2中鸡传染性支气管炎病毒毒株为H120株或H52株。
进一步地，步骤1中所述前孵化条件具体为：前孵化温度为38.2℃，前孵化时间为10天，第1～7天孵化相对湿度为60％，第8～10天孵化相对湿度为70％。
进一步地，步骤3中所述后孵化条件具体为后孵化温度为37.8℃，后孵化相对湿度为70％。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明采用鸡传染性支气管炎非免鸡蛋，通过研究非免鸡蛋的前孵孵化条件、后孵孵化条件及鸡胚收获时间等因素，得到高产量、高毒价的鸡传染性支气管炎病毒抗原，极大地提高了鸡传染性支气管炎疫苗的质量和产量；该方法用非免鸡蛋替换SPF鸡蛋，同时确定了鸡传染性支气管炎病毒在非免鸡蛋中繁殖的工艺条件，既保证了疫苗质量，又降低了疫苗研究及生产成本，可为疫苗生产企业提供巨大的参考价值，应用前景广阔。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限定本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
本发明实施例中采用的鸡传染性支气管炎病毒毒株为H120株、H52株，均购自中国兽医药品监察所。
实施例一工艺条件确定
1.1、前孵化条件中温度及湿度确定
适当的温度和湿度条件可以促进鸡胚的发育，鉴于鸡胚21天发育过程的规律，第7天胎儿沉入卵黄中，卵黄体积达到最大，外形已经具备禽类特点，此后尿囊进入快速发育期。采用正交试验方法，温度的筛选分为37.8℃、38.0℃、38.2℃、38.4℃共计4个条件，湿度筛选分为两种方案筛选，第一种方案为前孵化10天选用65％、70％、75％共3个湿度条件；第二种方案是依据鸡胚的发育特点，第1～7天选用55％、60％、65％共3个湿度条件，第8～10天选用65％、70％、75％共3个湿度条件；鸡传染性支气管炎非免鸡蛋480枚，每组10枚，计算平均每胚的尿囊液收获量，筛选出收获量最高的组别，确定前孵化最优条件。试验结果详见表1。
表1前孵化条件中温度及湿度筛选试验结果(单位：ml)
由表1可知：第一种方案中最优组别为温度为38.2℃，湿度为70％，此时平均单胚尿囊液收获量为12.6ml；第二种方案中最优组别为温度为38.2℃，第1～7天湿度为60％，8～10天湿度为70％时，平均单胚尿囊液收获量为12.8ml。综合以上试验结果可以得出：前孵化最优条件为温度为38.2℃，第1～7天湿度为60％，8～10天湿度为70％。
1.2、后孵化条件中温度及湿度确定
利用鸡传染性支气管炎病毒毒株H120株接种于鸡胚，接种剂量为105.0EID50/枚，每组10枚，共计120枚；接种后进行后孵化，控制后孵化温湿度条件，接种后24h照检，弃去死胚，接种后36h后将鸡胚放入2～8℃冷藏室，冷藏12h后收获病毒尿囊液，计算死胚数量及尿囊液收获量，筛选最佳条件。结果详见表2。
表2后孵化条件中温度及湿度筛选试验结果
由表2可知：在湿度为65％时，4个温度条件下24h前共死亡鸡胚6枚；在湿度为70％时，4个温度条件下24h前共死亡鸡胚1枚；在湿度为75％时，4个温度条件下24h前共死亡鸡胚5枚；其中湿度为70％时，温度为37.8℃时尿囊液收获量最多，达到131ml。故后孵化的最优条件为湿度为70％，温度为37.8℃。
1.3最佳鸡胚收获时间的确定
依据鸡胚发育的规律，鸡胚尿囊发育至第16天时，尿囊液逐渐减少，鸡胚代谢产生的尿酸盐储存于尿囊中，致使尿囊液变浑，故试验设计为：将鸡传染性支气管炎病毒毒株H120株鸡胚尿囊液作10倍系列稀释，取10-6～10-8 3个稀释度，各尿囊腔内接种11日龄的SPF鸡胚5枚，每胚0.1ml，置37℃继续孵育，24小时前死胚不计，同时自24h起，每24h随机收获5个活胚尿囊液，将尿囊液装于灭菌容器内，检测收取的尿囊液的病毒含量ELD50。依据EID50筛选最佳收获时间。详细结果见表3。
表3鸡胚收获时间试验结果
由表3可知：在接种后48小时收获的鸡胚尿囊液病毒含量最高，可以达到107.2EID50/0.1mL，故鸡胚尿囊液的最佳收获时间为接种后48小时。
1.4抗原制备
1.4.1制苗用材料
选择低免疫易感鸡胚作为制苗用材料，前孵化温度为38.2℃，前孵化时间为10天，第1～7天孵化相对湿度为60％，第8～10天孵化相对湿度为70％。
1.4.2鸡胚接种
将鸡传染性支气管炎病毒毒株H120株鸡胚尿囊液毒种稀释10-3，接种易感鸡胚尿囊腔，每胚0.1ml，接种剂量为105.0EID50/枚，接种后密封针孔，后孵化温度为37.8℃，后孵化相对湿度为70％。
1.4.3孵育与观察
接种后24h照检，除去死胚，接毒后36h将鸡胚放入2-8℃冷藏室，冷藏12h左右收获病毒尿囊液。
1.4.4收获
将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌方法剥除气室部位卵壳，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(勿使蛋黄破裂)，吸取鸡胚液，每若干个胚的胚液混合为一组，置于灭菌桶中。在收获胚液的同时应逐个检查鸡胚，凡胎儿腐败，胚液混浊及有任何污染可疑者弃去不用。收获的胚液灭活前在2～8℃保存。
1.4.5鸡胚病毒液的检验
经处理后的鸡胚病毒液，按照《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长；胚液对1％鸡红细胞应无凝集；用10日龄SPF鸡胚测定病毒含量，病毒含量应不低于107.0EID50/0.1ml。符合以上规定的方可作为制苗用病毒液。在收获胚液的同时，应逐个检查鸡胚，如胎儿腐败，胚液浑浊及有任何污染可疑者弃去不用。
1.4.6分装将检验合格的若干组鸡胚液滤过，混合于同一容器中，按规定羽份加入适量的5％蔗糖脱脂奶粉做稳定剂，同时加适宜抗生素，充分摇匀，定量分装，每羽份病毒含量应≥105.0EID50。
1.4.7冻干分装后迅速进行冷冻真空干燥，500羽/瓶。
实施例二
2018.09.10从山东聊城购入鸡传染性支气管炎非免鸡蛋40000枚，抽检鸡蛋的HI(血凝抑制试验)，抗体效价均低于1：4；2018.09.11入孵，前孵孵化条件控制在温度38.2℃，孵化10天，第1～7d相对湿度为60％，第8～10d相对湿度为70％；2018.09.21按105.0EID50/枚的接种剂量，采用尿囊腔接种方式接种鸡传染性支气管炎病毒H120株；后孵孵化条件控制在温度37.8℃，相对湿度为70％；接种后24h照检，除去死胚，接毒后36h将鸡胚放入2-8℃冷藏室，冷藏12h左右收获病毒尿囊液。测得本批次鸡传染性支气管炎病毒抗原的病毒含量为107.3EID50/0.1mL，尿囊液收获平均量为13.2mL/枚，参照实施例1中的1.4抗原的制备方法制备鸡传染性支气管炎病毒抗原，命名为S01批。
实施例三
2018.10.22从河南商丘购入鸡传染性支气管炎非免鸡蛋52000枚，抽检鸡蛋的HI(血凝抑制试验)，抗体效价均低于1：4；2018.10.23入孵，前孵孵化条件控制在温度38.2℃，孵化10天，第1～7d相对湿度为60％，第8～10d相对湿度为70％；2018.11.02按105.0EID50/枚的接种剂量，采用尿囊腔接种方式接种鸡传染性支气管炎病毒H52株；后孵孵化条件控制在温度37.8℃，相对湿度为70％；接种后24h照检，除去死胚，接毒后36h将鸡胚放入2-8℃冷藏室，冷藏12h左右收获病毒尿囊液。测得本批次鸡传染性支气管炎病毒抗原的病毒含量为107.12EID50/0.1mL，尿囊液收获平均量为12.8mL/枚，参照实施例1中的1.4抗原的制备方法制备鸡传染性支气管炎病毒抗原，命名为S02批。
实施例四
从市场上分别购买鸡传染性支气管活疫苗(H120株)两瓶，规格500羽/瓶，批号：190040805，暂命名为市售苗1；鸡传染性支气管活疫苗(H52株)两瓶，规格500羽/瓶，批号：190101，暂命名为市售苗2。用鸡胚法进行效力检验，按瓶签注明的羽份将疫苗用生理盐水稀释成1羽份/0.1ml，再继续做10倍系列稀释，取3个适宜的稀释度，各尿囊腔内接种按实施例1中的前孵孵化条件孵化的10日龄鸡胚5个，每胚0.1ml，后孵孵化条件控制在温度37.8℃，相对湿度为70％；接种后24h照检，除去24h前死胚，接毒后36h将鸡胚放入2-8℃冷藏室，冷藏12h左右收获病毒尿囊液，计算EID50，市售疫苗的标准为每羽份≥103.5EID50，判为合格。结果详见表4。
表4效力检验结果
由表4可知：四种鸡传染性支气管活疫苗均符合效力检验的要求，但是利用本发明制备的抗原S01批、S02批的病毒含量均高于市售疫苗，说明本发明的方法是高效、可行的。
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

Claims (4)

1.一种采用非免鸡蛋制备鸡传染性支气管炎病毒抗原的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：采用鸡传染性支气管炎非免鸡蛋，控制前孵化条件进行前孵化；
步骤2：将鸡传染性支气管炎病毒毒株接种于鸡胚，接种剂量为105.0EID50/枚；
步骤3：接种后控制后孵化条件进行后孵化，接种后24h照检，弃去死胚，接种后36h后将鸡胚放入2~8℃冷藏室，冷藏12h后收获病毒尿囊液；
步骤4：对收获的病毒尿囊液检验毒价，浓缩，纯化得到鸡传染性支气管炎病毒抗原。
2.根据权利要求1所述的采用非免鸡蛋制备鸡传染性支气管炎病毒抗原的方法，其特征在于，步骤2中鸡传染性支气管炎病毒毒株为H120株或H52株。
3.根据权利要求1所述的采用非免鸡蛋制备鸡传染性支气管炎病毒抗原的方法，其特征在于，步骤1中所述前孵化条件具体为：前孵化温度为38.2℃，前孵化时间为10天，第1~7天孵化相对湿度为60%，第8~10天孵化相对湿度为70%。
4.根据权利要求1所述的采用非免鸡蛋制备鸡传染性支气管炎病毒抗原的方法，其特征在于，步骤3中所述后孵化条件具体为后孵化温度为37.8℃，后孵化相对湿度为70%。
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