CN104383529A - 一种高效的鸡传染性支气管炎灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效的鸡传染性支气管炎灭活疫苗及其制备方法，每0.3ml灭活疫苗的病毒含量不低于(8.67±0.81)×10⁶EID₅₀，或不低于(7.48±0.45)×10⁷病毒粒子数。是通过将鸡传染性支气管炎病毒接种于鸡胚尿囊腔后，收获病毒液，病毒液浓缩后，测定浓缩后病毒液的含量，经甲醛溶液灭活，加入佐剂乳化配制制备得到的。本发明的高效的鸡传染性支气管炎灭活疫苗由于含有浓缩的病毒液，使得抗原的含量提高，对鸡传染性支气管炎呼吸型强毒M41毒株的攻毒保护率达到80％以上，说明本发明的灭活疫苗能对鸡传染性支气管炎毒株提供免疫保护，对鸡传染性支气管炎病具有良好的预防和控制效果。

Description

一种高效的鸡传染性支气管炎灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于兽医生物新医药技术领域，尤其涉及一种高效的鸡传染性支气管炎灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

传染性支气管炎病毒(IBV)属于冠状病毒科，可引起鸡传染性支气管炎(IB)，主要侵害鸡的呼吸系统、泌尿系统和消化系统，表现出广泛的组织嗜性和高度的遗传变异性，可导致不同日龄、性别和品种的鸡只发生不同程度的疾病，死亡率较高，有报道腺胃型IB导致的雏鸡死亡率可达95％。除此外，IBV还可侵害肾脏、生殖道、肠道、肌肉等，引起鸡的增重和饲料报酬率降低，产蛋鸡的产蛋量及产蛋品质下降。值得注意的是，该病还可引起其他病毒病的混合感染以及细菌性疾病的继发感染从而导致鸡群死亡率增高，给养鸡生产带来巨大的损失。该病广泛流行于世界各地，是严重危害世界养禽业的重大传染病之一。

迄今为止，疫苗免疫仍是对IB防控最有效的措施，其中最常用的是减毒活疫苗和灭活疫苗，另外还有现在比较热门的基因工程疫苗，然而使用的效果一直不够理想。由于IB血清型众多，各血清型之间仅有部分或完全没有交叉保护作用，单价疫苗只对同型毒株感染具有免疫力，对异型毒株仅提供部分保护甚至不提供保护；并且抗原易变异，导致新的变异毒株不断出现，从而给本病防治带来很大困难，该病的爆发时有发生。虽然现有IB减毒活疫苗免疫效果良好，但具有毒力返强的风险，可能具有传播力和致病性，甚至会引起潜伏感染；弱毒疫苗株还有可能会与野毒株发生重组，从而产生新的变异株。因此，IB弱毒活疫苗并不能从根本上控制该病的流行。

灭活疫苗是把完整的IBV病毒颗粒通过理化方法(常用福尔马林)进行灭活后所制备的疫苗，主要在种鸡、蛋鸡开产前使用。与活疫苗相比，灭活苗没有散播病原和毒力返强的风险，无副作用，可刺激机体产生良好的体液免疫反应。目前最常用的是Mass型疫苗，该血清型疫苗目前也是在世界范围内使用最广泛的疫苗，如常用的H120和H52均属于该血清型。但是，现有IB灭活疫苗的免疫效果不理想，对同血清型的毒株的攻毒保护率很少超过50％，主要原因是现有灭活疫苗不能诱导足够高的抗体。

目前，也有很多有关制备病毒液后进行浓缩的报道，但这些报道只是注明浓缩体积，并没有对浓缩后的病毒液含量进行测定，也没有一个固定的抗原含量标准，因此，灭活疫苗的免疫效果是不可预期的，因此，很有必要开发一种具有固定的抗原含量标准的高免疫效果的IB灭活疫苗。

发明内容

有鉴于此，有必要针对上述问题，提供一种高效的鸡传染性支气管炎病毒灭活疫苗及其制备方法。

为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种高效的鸡传染性支气管炎灭活疫苗，每羽份(0.3ml)灭活疫苗的病毒含量不低于(8.67±0.81)×10⁶EID₅₀，或不低于(7.48±0.45)×10⁷病毒粒子数。

优选地，每羽份(0.3ml)灭活疫苗的病毒含量为(8.67±0.81)×10⁶EID₅₀-(8.34±0.56)×10⁷EID₅₀，或(7.48±0.45)×10⁷-(8.21±0.03)×10⁸病毒粒子数。

更优选地，每羽份(0.3ml)灭活疫苗的病毒含量为(1.87±0.95)×10⁷-(8.34±0.56)×10⁷EID₅₀，或(1.58±0.29)×10⁸-(8.21±0.03)×10⁸病毒粒子数。

更优选地，每羽份(0.3ml)灭活疫苗的病毒含量为(3.76±0.76)×10⁷-(8.34±0.56)×10⁷EID₅₀，或(3.5±0.16)×10⁸-(8.21±0.03)×10⁸病毒粒子数。

更优选地，每羽份(0.3ml)灭活疫苗的病毒含量为(3.76±0.76)×10⁷-(7.11±0.78)×10⁷EID₅₀，或(3.5±0.16)×10⁸-(7.34±0.04)×10⁸病毒粒子数。

本发明还提供了上述高效的鸡传染性支气管炎灭活疫苗的制备方法，包括步骤：将鸡传染性支气管炎病毒接种于鸡胚尿囊腔后，收获病毒液，病毒液浓缩后，经甲醛溶液灭活，加入佐剂乳化配制，即得。

优选地，浓缩前和浓缩后的病毒液中的病毒含量采用EID₅₀试验和病毒计数仪进行测定。

优选地，所述佐剂为Montanide ISA71VG，所述灭活后的病毒液与所述佐剂的质量比为14：6。所述乳化的具体方法为：将佐剂Montanide ISA71VG置于高型烧杯，将剪切头浸至佐剂中，控制病毒液与佐剂的温度在20℃以下，向正在剪切的佐剂中缓慢加入病毒液，混合均匀，剪切头上的溢流孔部分应处于乳液页面以上；以剪切速度级别为B-14000×g进行剪切，沿搅拌头移动烧杯，确保乳化均匀，每隔30min吸出少量液体，滴于水面，观察液滴散开情况，以滴落液滴完全不散开判断为乳化完全。

在灭活疫苗的制备方法中，病毒液依次经差速离心、过滤、超速离心后，用PBS溶解沉淀，即得浓缩病毒液。所述差速离心为：4℃，5000-7000g，15-20min，取上清，接着4℃，10000g-12000g，15-20min，取上清；差速离心优选为：4℃，5000g，15min，取上清；接着4℃，10000g，15min，取上清。差速离心去除了病毒液中的红细胞和鸡胚中的细胞碎片及较大蛋白。采用4层灭菌纱布进行过滤，以除去尿囊液中不易离心去除的脂质体成分。所述超速离心为：4℃，70,000-100,000g，离心1-2h。如果转速高于100,000×g，使用电镜观察，可以明显看到病毒粒子表面的纤突脱落消失。所述超速离心优选为：4℃，80,000g，离心2h。采用甲醛溶液37℃灭活16-24小时，甲醛溶液的终浓度为0.1％。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的高效的鸡传染性支气管炎灭活疫苗由于含有浓缩的病毒液，使得抗原的含量提高，因此，能诱导产生更高的抗体，试验结果显示，当每羽份(0.3ml)灭活疫苗的病毒含量不低于(8.67±0.81)×10⁶EID₅₀，或不低于(7.48±0.45)×10⁷病毒粒子数时，灭活疫苗对鸡传染性支气管炎呼吸型强毒M41毒株的攻毒保护率达到80％以上，远远超出商用的鸡传染性支气管炎灭活疫苗的攻毒保护率(53％)，说明本发明的灭活疫苗能诱导足够高的抗体，能对鸡传染性支气管炎毒株提供免疫保护，对鸡传染性支气管炎病具有良好的预防和控制效果。

附图说明

图1为实施例2中利用高效的鸡传染性支气管炎灭活疫苗免疫SPF鸡血清中特异性IgG的检测结果，其中，图中3-8分别代表实施例1制备得到的6种疫苗(未浓缩的病毒原液及不同浓缩比例的病毒液)，2为商业灭活疫苗对照，1为PBS对照。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以下实施例中使用的试剂、生物材料，除非特别说明，均是本领域的常规试剂、材料。

实施例1高效的鸡传染性支气管炎灭活疫苗的制备方法

在本实施例中，所述高效的鸡传染性支气管炎灭活疫苗的制备方法包括以下步骤：

步骤1：传染性支气管炎病毒H120株病毒液的制备

制备用毒种为传染性支气管炎病毒H120毒株(购自青岛易邦生物工程有限公司)，由中山大学生命科学学院本实验室保存于-70℃。将IBV H120株毒种作100倍稀释接种于10日龄SPF鸡胚尿囊腔，每胚0.2ml，接种后用蜡封闭针孔，置37℃继续孵化，弃去24h内死亡鸡胚，分别于接种后36h-48h收获尿囊液，即为传染性支气管炎病毒H120株病毒液。

步骤2：病毒液的浓缩、灭活及定量

采用差速离心法去除尿囊液中的红细胞和鸡胚中的细胞碎片及较大蛋白，差速离心法具体为：4℃，5000g，15min，取上清；接着10000g，4℃15min，取上清，即得病毒上清液。病毒上清液用4层灭菌纱布过滤，以除去尿囊液中不易离心去除的脂质体成分。将过滤后的病毒液转移至Beckman超速离心机对应浓缩管中，每个浓缩管加入尿囊液，超速离心80,000g(转子型号:Type70Ti)，4℃，离心2h；沉淀用PBS溶解后分装，得到5种不同浓缩比例(本实施例中，浓缩比例分别为10倍、20倍、40倍、80倍、100倍)的病毒液。然后通过EID₅₀试验和病毒计数仪分别对不同浓缩比例的病毒液和未经浓缩的病毒原液进行病毒含量测定，其中第3组为未经浓缩的病毒原液，第4组为10倍浓缩的病毒液，第5组为20倍浓缩的病毒液，第6组为40倍浓缩的病毒液，第7组为80倍浓缩的病毒液，第8组为100倍浓缩的病毒液，测定结果见表1(EID50试验测定病毒的含量为(9.11±0.26)×10⁵～(8.34±0.56)×10⁷，病毒计数仪测定病毒的含量为(8.30±0.03)×10⁶～(8.21±0.03)×10⁸。最后采用灭活剂甲醛溶液福尔马林对病毒液灭活，使灭活剂福尔马林终浓度为0.1％，37℃灭活16～24小时。其中，

(1)、使用EID₅₀试验测定各实验组病毒的含量的方法具体为：

将不同浓缩比例的病毒悬液10倍系列稀释，每个稀释度接种6枚10日龄SPF鸡胚后，连续观察7d，记录鸡胚的死亡数或病变情况。剖检发现部分鸡胚出现胚体卷曲、矮小化，尿囊液增多，卵黄囊收缩，鸡胚中肾部分有尿素盐，羊膜及附近覆盖着矮小胚的尿囊膜增厚，并粘连于胚体上等病变，将这些胚和24h后死亡的胚确定为感染IBV的胚，记录各稀释度感染胚的数量，并用Reed-Muench方法计算病毒的EID₅₀。

(2)、使用病毒计数仪测定各实验组病毒的含量的方法具体为：

首先根据病毒计数仪说明书准备好病毒样品，染料与样品体积比为1：2，然后室温静置30分钟，按照操作步骤测定病毒含量并记录。实验过程中用阳性对照试剂(PVS)和阴性对照试剂(CVF)校正测试程序。

步骤3：油乳化灭活疫苗的制备

油乳化疫苗的制备选用法国赛比克公司Montanide ISA71VG佐剂，按照其说明书制备疫苗，油相与水相比例为140g/60g。

准备适量的佐剂Montanide ISA71VG置于400mL高型烧杯，将剪切头浸至佐剂中，控制两相温度在20℃以下。向正在剪切的油相中缓慢加入水相(即不同浓缩比例的病毒液)，确保混合均匀，剪切头上的溢流孔部分应处于乳液液面以上。以剪切速度级别为B-14000×g进行剪切，沿搅拌头移动烧杯，确保乳化均匀。每隔30min用移液器吸出少量液体，滴于水面，观察液滴散开情况，以滴落液滴完全不散开判断为乳化完全。即得本实施例所述的高效的鸡传染性支气管炎灭活疫苗，将疫苗样品存放于4℃保存备用。

本实施例共制备出未经浓缩的病毒原液和5种不同病毒含量(分别为10倍、20倍、40倍、80倍、100倍浓缩后的病毒液)的鸡传染性支气管炎灭活疫苗，制备的疫苗物理性状检验、安全检验、效力检验等均合格。

试验例利用实施例1制备的灭活疫苗对SPF鸡的免疫试验

135只SPF鸡购自新兴大华农禽蛋有限公司，于广东温氏食品集团股份有限公司动物实验中心隔离器中饲养。

(1)试验方法：

免疫：将10日龄的SPF鸡随机分成8个试验组，每组15只，阴性对照组为15只。其中商用灭活疫苗为鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗(La Sota株+M41株)(购自青岛易邦生物工程有限公司)。疫苗进行颈部皮下接种，每羽份接种剂量见表1；免疫二次，间隔14天。用实施例1制备的6组疫苗(不同病毒含量)免疫动物，具体免疫实施方式见表1。

表1鸡传染性支气管炎高效疫苗免疫SPF鸡的实验方案

鸡血清中IgG抗体水平的测定：二次免疫14天后用间接ELISA检测鸡血清中IgG抗体水平，对各组间进行差异显著性分析，*：p<0.05；**：p<0.01。

攻毒试验：试验组鸡免疫4周后进行攻毒，对各实验组的鸡用2×10⁴EID₅₀剂量的M41毒株(购自中国兽医药品监察所)通过点眼、滴鼻途径进行攻毒。从攻毒后第二天开始每日观察并记录各组试验鸡的发病和死亡情况，试验过程中所有死亡鸡只立即进行剖检并观察大体病变。在攻毒后2d、4d、6d、8d、10d、12d等6个时间点，每组随机抽取10只试验鸡采集气管棉拭样品进行排毒检测。采集的气管棉拭子样品反复冻融3次后弃去棉拭子，再1000×g离心10min取上清备用。处理好的样品经尿囊腔途径接种10日龄SPF鸡胚，每份样品接种3只鸡胚，弃去24h之内的死亡鸡胚，每日观察并记录鸡胚的死亡情况。接种后96h将所有活胚置于4℃冰箱冻死，无菌收获接种鸡胚尿囊液，打开鸡胚观察胚体病变，如出现充血、出血、水肿、尿酸盐沉积、发育不良等典型的病变特征则判定为病毒分离阳性；对于病毒分离阴性的鸡胚，取尿囊液用IBV M41株引物对其进行RT-PCR检测，对于检测阳性的也判定为病毒分离阳性。对于既无特征性病变，RT-PCR检测结果也为阴性的样品用10日龄SPF鸡胚继续盲传2代。统计最终的病毒分离结果。

(2)试验结果

用实施例1制备的不同疫苗对10日龄的SPF鸡进行免疫，用ELISA试验检测免疫鸡血清中IgG抗体水平结果见图1。

图1结果显示：一免14天，28天后第4组的抗体滴度极显著高于第3组；一免14天后第7组的抗体滴度极显著高于第5组，且一免28天后第7组的抗体滴度显著高于第5组。

试验组鸡免疫4周后，对各实验组的鸡用2×10⁴EID₅₀剂量的M41毒株(呼吸型标准强毒株)通过点眼、滴鼻途径进行攻毒。

从攻毒后第二天开始每日观察并记录各组试验鸡的发病率和死亡率至攻毒后14d，试验过程中所有死亡鸡只立即进行剖检并观察大体病变。试验鸡发病的判定标准应包括以下一种或几种表现：(1)喘气或呼吸困难；(2)甩头；(3)羽毛逆立、精神沉郁。统计结果见表2显示：

表2IBV M41毒株攻毒后各组发病率和死亡率

从表2结果可知，第6、7、8组的鸡均未出现明显的临床症状(15/15)，死亡率为0％(0/15)；第4组80％的试验鸡未出现明显的临床症状(12/15)，第5组93％的试验鸡未出现明显的临床症状(14/15)，且两组的死亡率均为0％(0/15)；第2组53％的鸡未出现轻微的临床症状(8/15)，第3组47％的鸡未出现轻微的临床症状(7/15)，且两组鸡的死亡率均为13％(2/15)；而PBS空白对照组有93％试验鸡表现特征性临床症状，死亡率达到20％(3/15)。攻毒后死亡鸡的死亡时间均发生于攻毒后3-5d。

对于攻毒后死亡的鸡均进行剖检，观察大体病变以确定是否死于IBV感染。攻毒后2-12d，每隔2d从每组分别采集气管棉拭子样品进行病毒分离，病毒分离结果见表3。

表3攻毒后试验鸡气管排毒情况

注：分母为接种鸡的数量，分子为病毒分离阳性鸡的数量。

表3结果显示：第6组、第7组和第8组于攻毒后4d可从气管分离到病毒；第5组于攻毒后4-6d可从气管分离到病毒；第4组免疫组于攻毒后4-8d可从气管分离到病毒；而第2、3组与PBS空白对照组于攻毒后4-10d可从气管分离到病毒。

总结：从IgG抗体水平和攻毒保护率来看，本发明研制的鸡传染性支气管炎灭活疫苗的免疫效果显著优于商用鸡传染性支气管炎灭活疫苗(2)；其中，第6、7、8实验组的IgG抗体水平较高，攻毒保护率较好，优于第5组，更优于第3、4实验组。结果表明，病毒液浓缩比例越大的实验组，免疫相同剂量的疫苗，抗体水平越高，攻毒保护率越好，其中第4组疫苗免疫后试验鸡的攻毒保护率达到80％，第5组疫苗免疫后试验鸡的攻毒保护率达到93％，第6、7、8组疫苗免疫后试验鸡的攻毒保护率达到100％。综合分析表明第5、6、7、8实验组是最优的鸡传染性支气管炎高效疫苗。

在本说明书中所谈到的“一个实施例”、“另一个实施例”、“实施例”、“优选实施例”等，指的是结合该实施例描述的具体特征、结构或者特点包括在本申请概括性描述的至少一个实施例中。在说明书中多个地方出现同种表述不是一定指的是同一个实施例。进一步来说，结合任一实施例描述一个具体特征、结构或者特点时，所要主张的是结合其他实施例来实现这种特征、结构或者特点也落在本发明的范围内。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种高效的鸡传染性支气管炎灭活疫苗，其特征在于，每0.3ml灭活疫苗的病毒含量不低于(8.67±0.81)×10⁶EID₅₀，或不低于(7.48±0.45)×10⁷病毒粒子数。

2.根据权利要求1所述的高效的鸡传染性支气管炎灭活疫苗，其特征在于，每0.3ml灭活疫苗的病毒含量为(8.67±0.81)×10⁶EID₅₀-(8.34±0.56)×10⁷EID₅₀，或(7.48±0.45)×10⁷-(8.21±0.03)×10⁸病毒粒子数。

3.根据权利要求2所述的高效的鸡传染性支气管炎灭活疫苗，其特征在于，每0.3ml灭活疫苗的病毒含量为(1.87±0.95)×10⁷-(8.34±0.56)×10⁷EID₅₀，或(1.58±0.29)×10⁸-(8.21±0.03)×10⁸病毒粒子数。

4.根据权利要求3所述的高效的鸡传染性支气管炎灭活疫苗，其特征在于，每0.3ml灭活疫苗的病毒含量为(3.76±0.76)×10⁷-(8.34±0.56)×10⁷EID₅₀，或(3.5±0.16)×10⁸-(8.21±0.03)×10⁸病毒粒子数。

5.根据权利要求4所述的高效的鸡传染性支气管炎灭活疫苗，其特征在于，每0.3ml灭活疫苗的病毒含量为(3.76±0.76)×10⁷-(7.11±0.78)×10⁷EID₅₀，或(3.5±0.16)×10⁸-(7.34±0.04)×10⁸病毒粒子数。

6.权利要求1-5任一项所述的高效的鸡传染性支气管炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于，将鸡传染性支气管炎病毒接种于鸡胚尿囊腔后，收获病毒液，病毒液浓缩后，经甲醛溶液灭活，加入佐剂乳化配制，即得。

7.根据权利要求6所述的高效的鸡传染性支气管炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于，浓缩前和浓缩后的病毒液中的病毒含量采用EID₅₀试验和病毒计数仪进行测定。

8.根据权利要求6所述的高效的鸡传染性支气管炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述佐剂为Montanide ISA 71VG。