CN102391366A - 一种鸡传染性支气管炎病毒ha抗原的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鸡传染性支气管炎病毒HA抗原的制备方法，本发明方法中采用A型产气荚膜梭菌处理病毒液，解决了原有制备抗原成本高的问题。所使用的稳定剂为N-2羟丙基三甲基氯化氨壳聚糖能溶于水，解决了原有稳定剂壳聚糖不溶于水的问题。所用的灭活方法为水浴56℃灭活30min，解决了加灭活剂后会降低效价的问题。所用的鸡红细胞悬液为0.5％，使判定结果更稳定，解决了判定结果不准确的问题。由于采用透析袋浓缩，解决了抗原效价低的问题。因此，本发明提供了一种低成本、效价高且稳定、安全性好的鸡传染性支气管炎病毒HA稳定抗原的制备方法。制备的IBV HA抗原可成功应用于鸡群IBV疫苗免疫后血清HI抗体效价检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗原的制备方法，具体涉及一种鸡传染性支气管炎病毒HA抗原的制备方法。属于生物工程领域，
背景技术
鸡传染性支气管炎(IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(IBV)引起的一种急性高度接触性传染病。表现为咳嗽、喷嚏、气管罗音等症状。产蛋鸡产蛋下降，产畸形蛋，幼鸡表现特别严重。某些毒株引起肾脏和肠道疾病。鸡传染性支气管炎给世界养禽业带来了严重的经济损失。由于IBV具有高度的变异性，故其血清型众多，各种血清型间的交叉保护反应较低，疫苗免疫常常失去预期的效果。
多数IBV表面没有凝集原，对动物红细胞无自然血凝特性，病毒必须浓缩后经酶处理方能表现出血球凝集(HA)活性，并且这种HA活性能被特异性IBV抗血清所抑制。根据这一特性，国内外学者建立了检测IBV抗体血凝抑制(HI)试验的方法。该方法快速、简便、特异性强，目前已应用于IBV诊断及抗体检测。目前HA抗原液的制作方法大多仍是超速离心浓缩，采用磷脂酶C处理，灭活常用灭活剂来灭活，稳定剂加入壳聚糖等，原有这种方法主要存在的问题有：(1)由于磷脂酶C价格高，提高了HA抗原液的成本。(2)抗原液经灭活剂灭活后降低了抗原液的血凝价。(3)壳聚糖不溶于水。(4)超速离心抗原效价低。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述生产实际中存在的问题，提供一种低成本、效价高且稳定、安全性好的鸡传染性支气管炎病毒HA稳定抗原的制备方法。
为了实现上述目的，本发明的一种鸡传染性支气管炎病毒HA抗原的制备方法是按下述步骤进行的：
(1)病毒增殖
将病毒株用无菌生理盐水按体积比1∶50倍稀释后，经尿囊腔接种11日龄SPF鸡胚，每胚0.1mL，置37℃继续孵育，弃去24h前死胚，36h后取出所有胚放入4℃冰箱过夜，收集尿囊液，4℃保存备用；
(2)病毒液浓缩与A型产气荚膜梭菌培养液处理
将收集的尿囊液以3000-5000rpm高速冷冻离心30min，取上清液以20000-25000rpm高速冷冻离心50-60min后，弃去上清液，沉淀用支气管尿囊液充分悬浮，支气管尿囊液的添加量是第一次离心后所取上清液体积的1/200-1/100，悬浮液用透析袋进行浓缩；然后按浓缩后液体体积的10％-50％加入产气荚膜梭菌培养液，充分混合后置37℃水浴作用2-3h，每隔20min震荡一次，作用完毕后取出病毒液置4℃保存备用；
(3)抗原的灭活
(4)抗原的稳定
按病毒液与稳定剂体积比3-10∶1的比例加入稳定剂，震荡混匀后利用冷冻干燥技术冻干后即得到鸡传染性支气管炎病毒HA抗原；
(5)使用鸡红细胞悬液进行抗原测定，并于4℃中判定。
在本发明的具体实施例中，本发明所用的病毒株为鸡肾型传染性支气管炎病毒M41株，购自中国兽药监察所。
在本发明的具体实施例中，所述的产气荚膜梭菌培养液按以下方法制备：将产气荚膜梭菌菌株以3％的接种量接种于厌气肉肝汤培养基后，放入37℃温箱中培养24小时。培养液以5000r/min离心30分，取上清液经0.22μm微孔滤器过滤后分装即得，-20℃保存。
在本发明的具体实施例中，所述的病毒经上述步骤(2)处理后4℃要放置7天。
在本发明的具体实施例中，所述的灭活是将病毒液置56℃水浴灭活30min。
在本发明的具体实施例中，所述的鸡红细胞悬液浓度为0.5％。
在本发明的具体实施例中，所述的稳定剂为N-2羟丙基三甲基氯化氨壳聚糖。
N-2羟丙基三甲基氯化氨壳聚糖可按现有常规方法制备，作为参考，在本发明的具体实施例中，N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖是按以下方法制备得到的：
(1)壳聚糖的脱乙酰化处理
将脱乙酰度为80％壳聚糖50g分散在质量分数为20％NaOH的溶液中，110℃，压力0.2Mpa条件下回流搅拌反应3h，倾去上清液，去离子水洗至中性。
(2)壳聚糖的浸泡处理
将2g脱乙酰处理的壳聚糖溶于体积分数为1％乙酸溶液中，搅拌溶解，真空抽滤，滤去不溶物。在500～1000r/min搅拌条件下逐滴加入0.1mol/L NaOH溶液，调节壳聚糖溶液pH≈9，逐渐有白色沉淀析出，浸泡8h，抽滤，去离子水洗至滤液呈中性，抽干水分；最后，向滤饼中加入15mL异丙醇，搅拌30min分散均匀，倒入三口烧瓶。
(3)壳聚糖与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵开环反应
在N2保护条件下，将三口烧瓶升温至80℃，将2，3-环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液分三次加入，每隔2小时加入一次，每次滴定时间控制在30min。反应12h把烧瓶冷却至室温，加入150mL冷藏处理的无水乙醇，浸泡0.5h，抽滤，冷冻干燥24h。
(4)N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的精制
将干燥后的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶于去离子水，应用3G砂芯漏斗过滤，除去不溶物，在真空条件下蒸馏出一半水，然后在在5倍体积冷藏处理的丙酮中浸泡沉淀；真空抽滤，滤饼分散后冷冻干燥24h；分装，充入N2密封室温保存。
本发明方法中所使用的稳定剂为N-2羟丙基三甲基氯化氨壳聚糖能溶于水，解决了原有稳定剂壳聚糖不溶于水的问题。所用的灭活方法为水浴56℃灭活30min，解决了加灭活剂后会降低效价的问题。所用的鸡红细胞悬液为0.5％，使判定结果更稳定，解决了判定结果不准确的问题。由于采用A型产气荚膜梭菌培养液处理病毒液，解决了原有制备抗原成本高的问题。由于采用透析袋浓缩，解决了抗原效价低的问题。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所涉及的试剂和材料：
材料：11日龄SPF鸡胚由本公司生产一部提供、5％红细胞悬液由本公司研发中心提供、透析袋规格：MD77购买自北京索宝莱科技有限公司、0.22μm微孔滤器购买自美国PALL公司。
菌株：A型产气荚膜梭菌购买自中国兽药监察所、鸡肾型传染性支气管炎病毒M41株，购自中国兽药监察所。
试剂：壳聚糖购买自美国Sigma公司、2，3-环氧丙基三甲基氯化铵购买自山东东营国丰化学制品有限公司；
肉肝汤培养基的制备：成分：牛肉200g；牛肝50g；胃蛋白酶3-4g；盐酸10-11ml；蛋白胨10g；糊精10g；蒸馏水1000ml。在65℃左右温水内加入盐酸和绞碎的牛肉、肝，充分搅均，再加入胃蛋白酶充分搅拌，混合后的温度应在56-58℃。置53-55℃消化22-24小时。前10小时每小时充分搅拌1次。提取上清液，加热至80℃，然后加入蛋白胨煮开，调pH至7.6-7.8。煮沸10分钟，滤过后取上清液，按量加入糊精溶解后分装。116℃灭菌40分钟。
实施例1N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的制备
方法：
(1)壳聚糖的脱乙酰化处理
将壳聚糖50g分散在质量分数为20％NaOH的溶液中，110℃，压力0.2Mpa条件下回流搅拌反应3h，倾去上清液，去离子水洗至中性；
(2)壳聚糖的浸泡处理
将2g脱乙酰处理的壳聚糖溶于体积分数为1％乙酸溶液中，搅拌溶解，真空抽滤，滤去不溶物。在800r/min搅拌条件下逐滴加入0.1mol/LNaOH溶液，调节壳聚糖溶液pH≈9，逐渐有白色沉淀析出，浸泡8h，抽滤，去离子水洗至滤液呈中性，抽干水分；最后，向滤饼中加入15mL异丙醇，搅拌30min分散均匀，倒入三口烧瓶；
(3)壳聚糖与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵开环反应
在N2保护条件下，将三口烧瓶升温至80℃，将2，3-环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液分三次加入，每隔2小时加入一次，每次滴定时间控制在30min。反应12h把烧瓶冷却至室温，加入150mL冷藏处理的无水乙醇，浸泡0.5h，抽滤，冷冻干燥24h；
(4)N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的精制
将干燥后的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶于去离子水，应用3G砂芯漏斗过滤，除去不溶物，在真空条件下蒸馏出一半水，然后在在5倍体积冷藏处理的丙酮中浸泡沉淀；真空抽滤，滤饼分散后冷冻干燥24h；分装，充入N2密封室温保存。
实施例2鸡传染性支气管炎病毒HA抗原的制备
方法：
(1)病毒增殖
将鸡肾型传染性支气管炎病毒M41株用无菌生理盐水按体积比1∶50倍稀释后，经尿囊腔接种11日龄SPF鸡胚，每胚0.1mL，置37℃继续孵育，弃去24h前死胚，36h后取出所有胚放入4℃冰箱过夜，收集尿囊液，4℃保存备用。
(2)病毒液浓缩与A型产气荚膜梭菌培养液处理
产气荚膜梭菌培养液按以下方法制备：将产气荚膜梭菌菌株以3％的接种量接种于厌气肉肝汤培养基后，放入37℃温箱中培养24小时。培养液以5000r/min离心30分，取上清液经0.22μm微孔滤器过滤后分装即得，-20℃保存。
将收集的新鲜尿囊液以5000rpm高速冷冻离心30min，取上清液以25000rpm高速冷冻离心60min后，弃去上清液，沉淀用支气管尿囊液充分悬浮，支气管尿囊液的添加量是第一次离心后所取上清液体积的1/200，透析袋进行浓缩，浓缩到原体积的1/2；然后向悬浮液中加入20％产气荚膜梭菌培养液，充分混合置37℃水浴作用2h，每隔20min震荡一次，作用完毕后取出病毒液置4℃保存备用。
(3)抗原的灭活
将病毒液置56℃水浴灭活30min。
(4)抗原的稳定
按病毒液与稳定剂体积比10∶1的比例加入稳定剂N-2羟丙基三甲基氯化氨壳聚糖，震荡混匀后利用冷冻真空干燥技术冻干后即得到鸡传染性支气管炎病毒HA抗原。
(5)使用浓度为0.5％的红细胞悬液进行抗原凝集价测定，并于4℃中判定。
实施例3抗原效力检验
使用我公司所生产的鸡传染性支气管炎活疫苗产品按常规免疫程序给鸡群免疫后采集血清，使用按照实施例2的方法自制的三批抗原进行效力检验。采集鸡血清5份，按常规方法用白陶土处理后，进行血凝抑制试验进行抗体检测。结果见下表1-表3所示：
表1抗原批号：2011001
表2抗原批号：2011002
表3抗原批号：2011003
从上述结果可以得知：本发明制备的IBV HA抗原可成功应用于鸡群IBV疫苗免疫后血清HI抗体效价检测。
Claims (7)
1.一种鸡传染性支气管炎病毒HA抗原的制备方法，其特征在于：该方法是按下述步骤进行的：
(1)病毒增殖
将病毒株用无菌生理盐水按体积比1∶50倍稀释后，经尿囊腔接种11日龄SPF鸡胚，每胚0.1mL，置37℃继续孵育，弃去24h前死胚，36h后取出所有胚放入4℃冰箱过夜，收集尿囊液，4℃保存备用；
(2)病毒液浓缩与A型产气荚膜梭菌培养液处理
将收集的尿囊液以3000-5000rpm高速冷冻离心30min，取上清液以20000-25000rpm高速冷冻离心50-60min后，弃去上清液，沉淀用支气管尿囊液充分悬浮，支气管尿囊液的添加量是第一次离心后所取上清液体积的1/200-1/100，悬浮液用透析袋进行浓缩；然后按浓缩后液体体积的10％-50％加入产气荚膜梭菌培养液，充分混合后置37℃水浴作用2-3h，每隔20min震荡一次，作用完毕后取出病毒液置4℃保存备用；
(3)抗原的灭活
(4)抗原的稳定
按病毒液与稳定剂体积比3-10∶1的比例加入稳定剂，震荡混匀后利用冷冻干燥技术冻干后即得到鸡传染性支气管炎病毒HA抗原；
(5)使用鸡红细胞悬液进行抗原测定，并于4℃中判定。
2.根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒HA抗原的制备方法，其特征在于：所述的病毒毒株为M41。
3.根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒HA抗原的制备方法，其特征在于产气荚膜梭菌培养液按以下方法制备：将产气荚膜梭菌菌株以3％的接种量接种于厌气肉肝汤培养基后，放入37℃温箱中培养24小时培养液以5000r/min离心30分，取上清液经0.22μm微孔滤器过滤后分装即得，-20℃保存。
4.根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒HA抗原的制备方法，其特征在于：所述的病毒经上述步骤(2)处理后4℃要放置7天。
5.根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒HA抗原的制备方法，其特征在于：所述的灭活是将病毒液置56℃水浴灭活30min。
6.根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒HA抗原的制备方法，其特征在于：所述的稳定剂为N-2羟丙基三甲基氯化氨壳聚糖。
7.根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒HA抗原的制备方法，其特征在于：所述的鸡红细胞悬液浓度为0.5％。
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