CN103055309B - 一种用于鸡传染性支气管炎病毒hi抗原的冻干保护剂及其在制备hi抗原中的应用 - Google Patents

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本发明涉及一种用于鸡传染性支气管炎病毒HI抗原的冻干保护剂及其在制备HI抗原中的应用，本发明所述的保护剂是由A液和B液等体积混合而成，其中A液中含有质量体积百分比为1%~10%的海藻糖以及质量体积百分比为2%~10%的明胶；B液中含有质量体积百分比为0.1%~1%的叠氮钠以及质量体积百分比为0.5%~1%的硫代硫酸钠。采用本发明的冻干保护剂制备得到的鸡传染性支气管炎病毒HI抗原相较于常规方法制备得到的HI抗原其保存期由1年延长至3年，并且提高了HI抗原的耐热性，具有广泛的应用前景。

Description

一种用于鸡传染性支气管炎病毒HI抗原的冻干保护剂及其在制备HI抗原中的应用
技术领域
本发明涉及一种传染性支气管炎病毒HI抗原的制备方法，具体涉及一种用于鸡传染性支气管炎病毒HI抗原的冻干保护剂及其在制备HI抗原中的应用。属于生物技术领域。
背景技术
鸡传染性支气管炎(Infectious Bronchitis，简称IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，简称IBV)引起的一种急性高度接触性传染病。表现为咳嗽、喷嚏、气管和罗音等症状。产蛋鸡产蛋下降，产畸形蛋，幼鸡表现特别严重。某些毒株引起肾脏和肠道疾病。鸡传染性支气管炎给世界养禽业带来了严重的经济损失。由于IBV具有高度的变异性，故其血清型众多，各种血清型间的交叉保护反应较低，疫苗免疫常常失去预期的效果。
多数IBV表面没有凝集原，对动物红细胞无自然血凝特性，病毒必须浓缩后经酶处理方能表现出血球凝集(HA)活性，并且这种HA活性能被特异性IBV抗血清所抑制。根据这一特性，国内外学者建立了检测IBV抗体血凝抑制(HI)试验的方法。该方法快速、简便、特异性强，已应用于IBV诊断及抗体检测。目前，制备的M41冻干HI抗原虽然检测结果与进口抗原的检测结果一致性很好，但保证期只有1年左右，如何延长保存期亟待研究人员的创新。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的用于鸡传染性支气管炎病毒HI抗原冻干过程中的保护剂，进而延长鸡传染性支气管炎病毒HI抗原的保存期，并且在此基础上提供了一种制备所述抗原的方法。
本发明的一种用于鸡传染性支气管炎病毒HI抗原的冻干保护剂，其特征在于所述保护剂是由A液和B液等体积混匀得到，其中，
A液：含有质量体积百分比为1%~10%的海藻糖以及质量体积百分比为2%~10%的明胶，去离子水定容，在116℃条件下，高压灭菌30min；
B液：含有质量体积百分比为0.1%~1%的叠氮钠以及质量体积百分比为0.5%~1%的硫代硫酸钠，去离子水定容，0.22μm滤膜除菌。
在本发明所述的用于鸡传染性支气管炎病毒HI抗原的冻干保护剂中，优选的，所述A液中海藻糖的质量体积百分比为5%，所述明胶的质量体积百分比为2%，所述B液中叠氮钠的质量体积百分比为0.1%，硫代硫酸钠的质量体积百分比为1%。
其中所述的“质量体积百分比”是指质量（g）与体积（毫升）的百分比。
进一步的，本发明还提出了所述的冻干保护剂在制备鸡传染性支气管炎病毒HI抗原中的应用。
更进一步的，本发明还提出了一种鸡传染性支气管炎病毒HI抗原的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）病毒增殖
将鸡肾型传染性支气管炎病毒M41株用无菌生理盐水按体积比1:50倍稀释后，经尿囊腔接种11日龄SPF鸡胚，每胚0.1mL，置37℃继续孵育，弃去24h前死胚，36h后取出所有胚放入4℃冰箱过夜，收集尿囊液，4℃保存备用。
（2）病毒液浓缩与A型产气荚膜梭菌培养液处理
产气荚膜梭菌培养液按以下方法制备：将产气荚膜梭菌菌株以3%（v/v）的接种量接种于厌气肉肝汤培养基后，放入37℃温箱中培养24小时。培养液以5000r/min离心30分钟，取上清液经0.22μm微孔滤器过滤后分装即得，-20℃保存。
将收集的新鲜尿囊液以5000rpm高速冷冻离心30min，取上清液以25000rpm高速冷冻离心60min后，弃去上清液，沉淀用支气管尿囊液充分悬浮，支气管尿囊液的添加量是第一次离心后所取上清液体积的1/200，透析袋进行浓缩，浓缩到原体积的1/2；然后向悬浮液中加入20%（v/v）产气荚膜梭菌培养液，充分混合置37℃水浴作用2h，每隔20min震荡一次，作用完毕后取出病毒液置4℃保存备用。
（3）抗原的灭活
将病毒液置56℃水浴灭活30min。
（4）抗原的冻干
将上述保护剂，等体积加入抗原液，震荡混匀后利用冷冻真空干燥技术冻干后即得到鸡传染性支气管炎病毒HI抗原。
（5）使用浓度为0.5%的红细胞悬液进行抗原凝集价测定，并于4℃中判定。
本发明可将鸡传染性支气管炎病毒HI抗原的保证期由1年延长至3年，并且提高了耐热性，可贮存于4℃。
具体实施例
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1冻干保护剂的制备（体积1L）
A液的制备：称取海藻糖50g、明胶20g，溶于少量去离子水中，之后用去离子水定容至1L，在116℃条件下，高压灭菌30min；
B液：称取叠氮钠1g、硫代硫酸钠10g，溶于少量去离子水中，之后用去离子水定容至1L，0.22μm滤膜除菌。
将A液和B液等体积混匀制备得到用于鸡传染性支气管炎病毒HI抗原冻干技术中的保护剂。
实施例2冻干保护剂的制备（体积1L）
A液的制备：称取海藻糖50g、明胶60g，溶于少量去离子水中，之后用去离子水定容至1L，在116℃条件下，高压灭菌30min；
B液：称取叠氮钠5g、硫代硫酸钠8g，溶于少量去离子水中，之后用去离子水定容至1L，0.22μm滤膜除菌。
将A液和B液等体积混匀制备得到用于鸡传染性支气管炎病毒HI抗原冻干技术中的保护剂。
实施例3冻干保护剂的制备（体积1L）
A液的制备：称取海藻糖20g、明胶80g，溶于少量去离子水中，之后用去离子水定容至1L，在116℃条件下，高压灭菌30min；
B液：称取叠氮钠2g、硫代硫酸钠8g，溶于少量去离子水中，之后用去离子水定容至1L，0.22μm滤膜除菌。
将A液和B液等体积混匀制备得到用于鸡传染性支气管炎病毒HI抗原冻干技术中的保护剂。
实施例4冻干保护剂的制备（体积1L）
A液的制备：称取海藻糖90g、明胶10g，溶于少量去离子水中，之后用去离子水定容至1L，在116℃条件下，高压灭菌30min；
B液：称取叠氮钠8g、硫代硫酸钠8g，溶于少量去离子水中，之后用去离子水定容至1L，0.22μm滤膜除菌。
将A液和B液等体积混匀制备得到用于鸡传染性支气管炎病毒HI抗原冻干技术中的保护剂。
实施例5按照本发明方法制备鸡传染性支气管炎病毒HI抗原
1、材料来源
鸡肾型传染性支气管炎病毒M41株、A型产气荚膜梭菌菌株购买自中国兽药监察所。
2、厌气肉肝汤培养基的制备
成分：牛肉200g；牛肝50g；胃蛋白酶3-4g；盐酸10-11ml；蛋白胨10g；糊精10g；蒸馏水1000ml。
制备方法：在65℃左右温水内加入盐酸和绞碎的牛肉、肝，充分搅匀，再加入胃蛋白酶充分搅拌，混合后的温度应在56-58℃。置53-55℃消化22-24小时。前10小时每小时充分搅拌1次。提取上清液，加热至80℃，然后加入蛋白胨煮开，调pH至7.6-7.8。煮沸10分钟，滤过后取上清液，按量加入糊精溶解后分装。116℃灭菌40分钟。
3、方法
（1）病毒增殖
将鸡肾型传染性支气管炎病毒M41株用无菌生理盐水按体积比1:50倍稀释后，经尿囊腔接种11日龄SPF鸡胚，每胚0.1mL，置37℃继续孵育，弃去24h前死胚，36h后取出所有胚放入4℃冰箱过夜，收集尿囊液，4℃保存备用。
（2）病毒液浓缩与A型产气荚膜梭菌培养液处理
产气荚膜梭菌培养液按以下方法制备：将产气荚膜梭菌菌株以3%（v/v）的接种量接种于厌气肉肝汤培养基后，放入37℃温箱中培养24小时。培养液以5000r/min离心30分，取上清液经0.22μm微孔滤器过滤后分装即得，-20℃保存。
将收集的新鲜尿囊液以5000rpm高速冷冻离心30min，取上清液以25000rpm高速冷冻离心60min后，弃去上清液，沉淀用支气管尿囊液充分悬浮，支气管尿囊液的添加量是第一次离心后所取上清液体积的1/200，透析袋进行浓缩，浓缩到原体积的1/2；然后向悬浮液中加入20%（v/v）产气荚膜梭菌培养液，充分混合置37℃水浴作用2h，每隔20min震荡一次，作用完毕后取出病毒液置4℃保存备用。
（3）抗原的灭活
将病毒液置56℃水浴灭活30min。
（4）抗原的冻干
将实施例1中所述保护剂，等体积加入抗原液，震荡混匀后利用冷冻真空干燥技术冻干后即得到鸡传染性支气管炎病毒HI抗原。
（5）使用浓度为0.5%的红细胞悬液进行抗原凝集价测定，并于4℃中判定。
试验例1按照常规方法制备鸡传染性支气管炎病毒HI抗原
1、材料来源及厌气肉肝汤培养基的制备同实施例5
2、方法
(1)病毒增殖
将鸡肾型传染性支气管炎病毒M41株用无菌生理盐水按体积比1:50倍稀释后，经尿囊腔接种11日龄SPF鸡胚，每胚0.1mL，置37℃继续孵育，弃去24h前死胚，36h后取出所有胚放入4℃冰箱过夜，收集尿囊液，4℃保存备用。
(2)病毒液浓缩与A型产气荚膜梭菌培养液处理
产气荚膜梭菌培养液按以下方法制备：将产气荚膜梭菌菌株以3%（v/v）的接种量接种于厌气肉肝汤培养基后，放入37℃温箱中培养24小时。培养液以5000r/min离心30分钟，取上清液经0.22μm微孔滤器过滤后分装即得，-20℃保存。
将收集的新鲜尿囊液以5000rpm高速冷冻离心30min，取上清液以25000rpm高速冷冻离心60min后，弃去上清液，沉淀用支气管尿囊液充分悬浮，支气管尿囊液的添加量是第一次离心后所取上清液体积的1/200，透析袋进行浓缩，浓缩到原体积的1/2；然后向悬浮液中加入20%（v/v）产气荚膜梭菌培养液，充分混合置37℃水浴作用2h，每隔20min震荡一次，作用完毕后取出病毒液置4℃保存备用。
(3)抗原的灭活
将病毒液置56℃水浴灭活30min。
(4)抗原的稳定
按病毒液与稳定剂体积比10:1的比例加入稳定剂N-2羟丙基三甲基氯化氨壳聚糖，震荡混匀后利用冷冻真空干燥技术冻干后即得到鸡传染性支气管炎病毒HA抗原。
(5)使用浓度为0.5%的红细胞悬液进行抗原凝集价测定，并于4℃中判定。
试验例2采用本发明与常规方法制得的鸡传染性支气管炎病毒HI抗原在保存不同的时间、不同保存温度下效价及其保存期的比较
为了验证新方法的生产性能，利用新方法（实施例5所述的方法）以及常规方法（试验例1）各制备了10批抗原，现将其中一些指标的比较结果总结如下：
表1两种方法制备的抗原不同保存时间HA效价的比较（单位：log2）
表2两种方法制备的抗原不同保存温度保存30天HA效价的比较（单位：log2）
表3两种方法制备的抗原抗原保存期的比较（单位：log2）
抗原批次 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10
常规方法 1年 1年 1年 1年 1年 1年 1年 1年 1年 1年
本发明 3年 3年 3年 3年 3年 3年 3年 3年 3年 3年
结果显示：本发明生产的鸡传染性支气管炎病毒HI抗原的保证期延长至3年，且耐热性能较好，可贮存于4℃。

Claims (3)

1.一种用于鸡传染性支气管炎病毒HI抗原的冻干保护剂，其特征在于所述保护剂由A液和B液按照等体积混匀制得，其中，
A液：含有质量体积百分比为5％的海藻糖以及质量体积百分比为2％的明胶，去离子水定容，在116℃条件下，高压灭菌30min；
B液：含有质量体积百分比为0.1％的叠氮钠以及质量体积百分比为1％的硫代硫酸钠，去离子水定容，0.22μm滤膜除菌。
2.权利要求1所述的冻干保护剂在制备鸡传染性支气管炎病毒HI抗原中的应用。
3.一种鸡传染性支气管炎病毒HI抗原的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)病毒增殖
将鸡肾型传染性支气管炎病毒M41株用无菌生理盐水按体积比1:50倍稀释后，经尿囊腔接种11日龄SPF鸡胚，每胚0.1mL，置37℃继续孵育，弃去24h前死胚，36h后取出所有胚放入4℃冰箱过夜，收集尿囊液，4℃保存备用；
(2)病毒液浓缩与A型产气荚膜梭菌培养液处理
产气荚膜梭菌培养液按以下方法制备：将产气荚膜梭菌菌株以3％(v/v)的接种量接种于厌气肉肝汤培养基后，放入37℃温箱中培养24小时，培养液以5000r/min离心30分钟，取上清液经0.22μm微孔滤器过滤后分装即得，-20℃保存；
将收集的新鲜尿囊液以5000rpm高速冷冻离心30min，取上清液以25000rpm高速冷冻离心60min后，弃去上清液，沉淀用支气管尿囊液充分悬浮，支气管尿囊液的添加量是第一次离心后所取上清液体积的1/200，透析袋进行浓缩，浓缩到原体积的1/2；然后向悬浮液中加入20％(v/v)产气荚膜梭菌培养液，充分混合置37℃水浴作用2h，每隔20min震荡一次，作用完毕后取出病毒液置4℃保存备用；
(3)抗原的灭活
将病毒液置56℃水浴灭活30min；
(4)抗原的冻干
将权利要求1中所述的保护剂，等体积加入抗原液，震荡混匀后利用常规冷冻真空干燥方法冻干后即得到鸡传染性支气管炎病毒HI抗原；
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