CN111707822A - 一种鸡毒支原体抗体检测试剂及制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及家禽抗体检测试剂技术领域，尤其是一种鸡毒支原体抗体检测试剂及制备方法和应用，该试剂由鸡毒支原体培养液经过一系列处理，再进行灭活，灭活抗原菌液与冻干保护剂混合均匀，冷冻干燥，即得鸡毒支原体抗体检测试剂。该试剂可以直接进行血凝抑制试验；将该试剂4~8HA单位的抗原，添加甲基紫、琥珀红、结晶紫中任一染色剂，即可进行平板凝集试验。本发明检测试剂血凝价达26，本检测试剂不仅提高了鸡毒支原体抗原的血凝效价，而且能够做到一个检测试剂具有两种用途，试剂稳定、敏感、特异性强，保存期长，且操作简单，方便快捷，无需特殊设备仪器，可用于鸡毒支原体疫苗的效力检验、流行病学调查、临床样品检测等。

Description

一种鸡毒支原体抗体检测试剂及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及家禽抗体检测试剂领域，具体领域为一种鸡毒支原体抗体检测试剂。
背景技术
鸡毒支原体是家禽最常见的病原菌之一，鸡群感染该病后主要表现为咳嗽、流鼻涕，呼吸时有啰音，严重时张口呼吸等症状，该病能够导致肉鸡生长受阻、饲料报酬降低，产蛋鸡产蛋下降，种鸡孵化率低等。该病呈现缓慢流行，且造成的免疫抑制极易引起其它疾病的继发或伴发感染，近年来随着我国养殖业集约化程度的提高，鸡毒支原体的流行势头愈加猛烈，给养鸡业造成巨大的经济损失。
支原体致病株具有吸附动物(鸡、豚鼠、猴)红细胞的生物学特性而引起血球凝集，这种凝集反应能被特异性抗体所抑制，进而用于本病的血凝抑制试验诊断。
目前，用于本病的诊断技术主要为酶联免疫吸附试验（ELISA），此方法的应用虽然已经成熟，但操作时间长，过程繁琐，成本高。国内仅有中国兽药监察所在售鸡毒支原体虎红血清平板凝集试验抗原，其结果清楚易观察、操作简单、快速敏感、重复性好，但是该方法与HI方法（血凝抑制法）相比，特异性差，灵敏度高，可用于血清学诊断的初步筛选试验。
由于鸡毒支原体难以培养，虽然本身具有血凝性，但实际操作出现血凝价较低，敏感性低，无法应用到实际生产中，因此制备高敏感的血凝抗原就显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鸡毒支原体抗体检测试剂及制备方法和应用，该试剂既适用于检测血清样本抗体水平高低的血凝抑制，又适用于群体流行性筛查的平板凝集；对于大量临床样品检测、免疫水平监测和流行病学调查都是极为利好的血清学诊断方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种鸡毒支原体抗体检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）用鸡毒支原体菌种按1:10比例接种鸡毒支原体液体培养基，在37℃培养，待培养液pH值下降0.5，收获作为一级种子液；以同样方法将一级种子液按1:10的比例再接种传代1次收获作为二级种子液，测定其生长滴度不低于109CCU/mL；
（2）收获培养好的鸡毒支原体菌液，8000rpm，4℃离心20分钟；
（3）弃去上清，用生理盐水洗涤沉淀3次，最后根据菌体体积配成10~50倍浓缩抗原；
（4）冰浴中以超声波间歇破碎裂解20分钟，10000r/min离心30分钟，取上清液，加入浓度为0.4%的甲醛溶液，37℃灭活；
（5）将步骤（4）制备的抗原液与冻干保护剂混合，然后经真空冷冻干燥，制备成冻干型制剂。
其中，步骤（1）中所述鸡毒支原体菌种为鸡毒支原体灭活苗制备疫苗用菌株CR株。
其中，步骤（5）中所述冻干保护剂为明胶、蔗糖、聚乙二醇、壳聚糖和甘露寡糖中的至少一种。
其中，所述冻干保护剂的加入量为上述步骤（4）制备的抗原液的1/9~1/3。
采用上述制备方法制得的鸡毒支原体抗体检测试剂。
本发明的鸡毒支原体抗体检测试剂在血凝抑制试验中的应用，使用时，直接用试剂冻干量的2~3倍生理盐水稀释，按照OIE方法测定MG 的HA及待检血清的HI。
本发明的鸡毒支原体抗体检测试剂在平板凝集试验中的应用：用生理盐水配制成4~8HA单位的抗原，添加终浓度为0.9mg/mL甲基紫、琥珀红、结晶紫中的任意一种染色剂，即可进行平板凝集试验。
进一步的，所述任意一种染色剂在使用前，均先用100%乙醇溶液溶解。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
（1）本发明的抗体检测试剂中的抗原是鸡毒支原体灭活疫苗菌株CR株，因鸡毒支原体只有一个血清型，鸡毒支原体灭活疫苗菌株CR株是强毒株，更符合目前国内市场及生产需要。
（2）本发明制备方法制得的检测试剂通过了浓缩等一系列处理，具有很强的特异性和敏感性，对新城疫、禽流感、鸡传染性支气管炎和减蛋综合征阳性血清反应均呈阴性，能真实地检测出鸡毒支原体抗体。
（3）用本发明的鸡毒支原体抗体检测试剂血凝价高，血凝价达26，保存期长，等量分装，批量冻干，最大程度保证了检测试剂的稳定性。
（4）用本发明的鸡毒支原体抗体检测试剂，既适用于检测血清样本抗体水平高低的血凝抑制试验，又适用于群体流行性筛查的平板凝集试验。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一、制备鸡毒支原体抗体检测试剂
（1）用鸡毒支原体菌种按1:10比例接种鸡毒支原体液体培养基，在37℃培养，待培养液PH值下降0.5，收获作为一级种子液；以同样方法将一级种子液按1:10的比例再接种传代1次收获作为二级种子液，测定其生长滴度为1010CCU/mL；其中，鸡毒支原体菌种为鸡毒支原体灭活苗制备疫苗用菌株CR株；
其中，鸡毒支原体液体培养基采用中国专利申请CN108949606A中的培养基：
每升所述鸡毒支原体培养基按如下成分配制：
PPLO肉汤 20.0～25.5g
酵母浸出粉 3～7g
水解乳蛋白 4～8g
葡萄糖 7～9g
质量浓度为0.4%的酚红溶液 2mL
去离子水 余量。
以上成分在121℃温度条件下，高压灭菌15min，在4℃温度条件下保存。
鸡毒支原体培养基在培养时，再加150～200mL猪血清和1000单位/mL青霉素，加20%NaOH溶液调pH值至7.6～7.8。
（2）收获培养好的鸡毒支原体菌液，8000rpm，4℃离心20分钟；
（3）弃去上清，用生理盐水洗涤沉淀3次，最后根据菌体体积配成20倍浓缩抗原；（在其他有益实施例中，也可以配成10~50倍浓缩抗原）；
（4）冰浴中以超声波间歇破碎裂解20分钟，10000r/min离心30分钟，取上清液，加入浓度为0.4%的甲醛溶液，37℃灭活；
（5）将步骤（4）制备的抗原与冻干保护剂按照6:1比例混合，分装3mL/瓶，然后经真空冷冻干燥，制备成冻干型制剂。其中，冻干保护剂为明胶。（在其他有益实施例中，也可选用蔗糖、聚乙二醇、壳聚糖或甘露寡糖）。
二、成品检验
（1）性状检验：对制备的鸡毒支原体抗体检测试剂进行性状检测，结果均为淡黄或微白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。
（2）效价测定：鸡毒支原体血球凝集（HA）试验
1瓶3mL/瓶的鸡毒支原体抗体检测试剂，用6mL生理盐水复溶，取96孔V型微量反应板对上述复溶液进行血凝效价测定，每孔加25ul生理盐水，第一排加25ul抗原，并做2~4个重复孔，然后将抗原进行2倍系列稀释，稀释后每孔再加入25ul生理盐水，最后再加入1%鸡红细胞悬液25ul，用微量振荡器震荡均匀后于20~25℃下静置15分钟判定结果，以红细胞完全凝集的最高稀释倍数为该抗原的HA效价。结果制备的抗原的血凝价为6log2。以上结果说明，该鸡毒支原体抗体检测试剂血凝效价较高，解决了目前行业内用MG培养液制备成高血凝效价抗原的难题。
（3）待检血清的处理：将血清样品置于56℃水浴中灭活30min，3000r/min离心5min，取上清待检。
（4）平板凝集抗原的制备：将步骤（2）测得的血凝价为6log2的抗原，用生理盐水稀释为4HA抗原，添加终浓度为0.9mg/mL甲基紫（使用前，用100%乙醇溶液溶解），即可进行平板凝集试验。（在其他有益实施例中，也可把甲基紫替换为琥珀红或结晶紫）。
（5）特异性试验：分别用鸡毒支原体抗体检测试剂制备的血凝抑制抗原和平板凝集抗原检测阴性血清、鸡毒支原体、鸡新城疫、禽流感、减蛋综合征阳性血清效价。
血凝抑制方法：取96孔V型微量反应板，每孔加入25ul生理盐水，将待检血清倍比稀释，加入4HA单位鸡毒支原体抗原稀释液，加等体积鸡红细胞悬液，震荡混匀，在室温静置15min，同时设置抗原对照孔和血清对照孔，结果判定时，以完全抑制4HA单位鸡毒支原体抗原的血清最高稀释度为HI效价。
平板凝集方法：在玻璃板上滴加平板凝集抗原25ul，然后滴入等量的待检血清，与抗原充分混合，涂成直径为1.5~2cm液面，轻轻晃动玻璃板，在2分钟内判定结果，发生50%以上凝集，为阳性。
结果显示：鸡毒支原体血清血凝抑制效价为
Figure 102607DEST_PATH_IMAGE001
以上，新城疫、禽流感和减蛋综 合征阳性血清反应均呈阴性。
表1 特异性试验结果
Figure 380880DEST_PATH_IMAGE002
注：阳性判断标准为血凝抑制效价为4log2，“#”表示平板凝集结果为阳性，“-”表示检测结果为阴性。
从以上结果可以看出，用本发明制备的鸡毒支原体抗体检测试剂，血凝抑制效价和平板凝集试验结果特异性强，对新城疫、禽流感和减蛋综合征阳性血清反应均呈阴性。
三、临床样品检测
利用本实施例制备的鸡毒支原体抗体检测试剂，进行临床样品检测如下：
分别从南京江宁、河南商丘、江苏东台、安徽合肥、四川成都等地疑似鸡毒支原体感染的鸡场采集血清样品，利用制备的上述批次鸡毒支原体抗体检测试剂进行检测。具体操作程序按血凝抑制方法、平板凝集方法进行。检测结果如表2。
表2 鸡场样品检测结果
Figure 854717DEST_PATH_IMAGE003
结果显示，5家鸡场均检测出不同数量的阳性血清样品，与临床观察结果一致，说明5家鸡场均有不同程度的鸡毒支原体感染；平板凝集阳性率高于HI阳性率，说明平板凝集敏感性确实稍好于血凝抑制方法；另外，也进一步说明了本发明制备的鸡毒支原体抗体检测试剂可用于大量临床样品检测、免疫水平监测和流行病学调查。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种鸡毒支原体抗体检测试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）用鸡毒支原体菌种按1:10比例接种鸡毒支原体液体培养基，在37℃培养，待培养液pH值下降0.5，收获作为一级种子液；以同样方法将一级种子液按1:10的比例再接种传代1次收获作为二级种子液，测定其生长滴度不低于109CCU/mL；
（2）收获培养好的鸡毒支原体菌液，8000rpm，4℃离心20分钟；
（3）弃去上清，用生理盐水洗涤沉淀3次，最后根据菌体体积配成10~50倍浓缩抗原；
（4）冰浴中以超声波间歇破碎裂解20分钟，10000r/min离心30分钟，取上清液，加入浓度为0.4%的甲醛溶液，37℃灭活；
（5）将步骤（4）制备的抗原液与冻干保护剂混合，然后经真空冷冻干燥，制备成冻干型制剂。
2.根据权利要求1所述的鸡毒支原体抗体检测试剂的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述鸡毒支原体菌种为鸡毒支原体灭活苗制备疫苗用菌株CR株。
3.根据权利要求2所述的鸡毒支原体抗体检测试剂的制备方法，其特征在于：步骤（5）中所述冻干保护剂为明胶、蔗糖、聚乙二醇、壳聚糖和甘露寡糖中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的鸡毒支原体抗体检测试剂的制备方法，其特征在于：所述冻干保护剂的加入量为上述步骤（4）制备的抗原液的1/9~1/3。
5.权利要求1-4任一所述制备方法制得的鸡毒支原体抗体检测试剂。
6.权利要求5所述的鸡毒支原体抗体检测试剂在血凝抑制试验中的应用，其特征在于：直接用试剂冻干剂量的2~3倍生理盐水稀释，按照OIE方法测定MG 的HA及待检血清的HI。
7.权利要求5所述的鸡毒支原体抗体检测试剂在平板凝集试验中的应用，其特征在于：用生理盐水配制成4~8HA单位的抗原，添加终浓度为0.9mg/mL甲基紫、琥珀红、结晶紫中的任意一种染色剂，即可进行平板凝集试验。
8.根据权利要求7所述的鸡毒支原体抗体检测试剂在平板凝集试验中的应用，其特征在于：所述任意一种染色剂在使用前，均先用100%乙醇溶液溶解。
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