CN103091484A - 鸡毒支原体灭活疫苗的效力检验方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及兽用生物制品技术领域。公开了一种鸡毒支原体灭活疫苗的效力检验方法，同时本发明还可应用于疫苗的质量控制，具体包括免疫攻毒保护率、疫苗质量标准的确定、免疫期限的测定和临床监测。实验证实发明使用血清学检测方法(包括ELISA和HI)替代本动物攻毒试验，方法简便、快速、结果准确、重复性强、特异性强，该方法的建立减少免后攻毒看气囊病变积分的主观性及避免散毒，也为建立合理的免疫程序提供依据，具有普遍推广的意义。

Description

鸡毒支原体灭活疫苗的效力检验方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种鸡毒支原体灭活疫苗的效力检验方法及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

鸡毒支原体是家禽最常见的病原菌之一。该病在规模化鸡场中经常缓慢流行，给养鸡业造成的主要损失是发病鸡群的死淘率明显上升；肉鸡和生长鸡的发育受阻、饲料报酬降低；产蛋鸡的产蛋下降；随着我国养鸡业集约化程度的提高，鸡毒支原体的流行势头愈加猛烈，继发感染其他疾病，近年来常有呼吸道疾病混合感染为主的疾病致使大量鸡死亡，且抗生素的频繁使用，使得耐药性增强，给本病的防治带来很大的困难，因此对该病的预防也越来越重要。

目前在生产中广泛应用灭活疫苗免疫是控制鸡毒支原体的有效办法。检验疫苗效力的方法是免疫攻毒保护试验，判断气囊病变积分情况。上述实验评价结果时常因主观因素偏差造成检验结果常有误差，并且强毒攻击也存在生物安全隐患，易散毒。本发明可用血清学测抗体效价的方法替代本动物攻毒试验，结果客观、准确、重复性强、操作简单，安全可靠，具有普遍推广的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种鸡毒支原体灭活疫苗的效力检验方法，包括如下步骤：

1)用鸡毒支原体灭活疫苗免疫鸡后25-35天后采血并分离血清；

2)用血清学方法(ELISA方法或HI方法)测定血清的抗体效价替代免疫攻毒保护。

优选地，本发明所述鸡毒支原体灭活疫苗免疫方法为皮下注射或肌肉注射。

优选地，本发明所述免疫剂量为1羽份，每羽份的量为0.2ml～0.6ml。

更优选地，本发明所述MG抗体ELISA(ELISA，MG Ab)试剂盒为美国IDEXX公司生产(试剂包括：包被的微量反应板、样品稀释液、阳性对照、阴性对照、酶标二抗、底物溶液和终止液)，购自北京爱德士世纪元亨有限公司。ELISA检测方法按IDEXX MG抗体ELISA(ELISA，MG Ab)试剂盒方法进行。

优选地，本发明所述血凝抑制效价的测定方法，包括如下步骤：

1)鸡毒支原体血球凝集试验：HA抗原二倍系列稀释。将30μl鸡红细胞悬液加入含有30μl稀释抗原的反应孔内，充分振荡，在室温静置30min，判定结果时将反应板倾斜与水平呈45℃角，对照孔内和HA阴性孔的红细胞完全沉淀到孔底中心，呈泪珠样流淌；HA阳性孔的红细胞均匀分布在孔底或呈锯齿样凝集，使红细胞凝集的最大稀释倍数为该抗原的HA效价；2)鸡毒支原体血凝抑制试验：在96孔V型微量反应板，每行第1孔开始，每孔加入30μl稀释液至12孔，分别在1、11孔加入待检血清30μl，从第一孔开始倍比稀释血清至第10孔，弃去30μl，向1～11孔加入4HA单位抗原30μl，充分振荡，37℃温箱静置15min，每孔加入1％V/V鸡红细胞悬液30μl，轻轻混匀，室温静置30min，判定结果时将反应板倾斜45℃角，红细胞完全沉淀到孔底中心呈泪珠样流淌为HI阳性，红细胞均匀分布在孔底不流动者为HI阴性，完全抑制红细胞凝集的最高稀释倍数为待检血清的HI抗体效价。

优选地，本发明所述免疫后的血清ELISA抗体水平，S/P值≥0.6时，疫苗判为合格。

优选地，本发明所述免疫后的血清HI抗体水平，HI值≥4Log2时，疫苗判为合格。

更优选地，本发明所述免疫后的血清HI抗体水平、ELISA抗体水平和免疫攻毒保护率三者相互之间均呈正相关。

优选地，本发明所述方法不但在鸡毒支原体灭活疫苗单苗中使用，而且在鸡毒支原体灭活疫苗所有联苗中也可使用。

本发明的另一方面在于本发明所述鸡毒支原体灭活疫苗的效力检验方法在鸡毒支原体灭活疫苗的质量控制中的应用。

优选地，本发明所述疫苗的质量控制包括免疫攻毒保护率、疫苗质量标准的确定、免疫期限的测定和临床监测。

技术效果

首先，本发明采用了血清学的方法替代免疫攻毒保护的方法来评价疫苗的免疫效力。该方法减少免后攻毒看气囊病变积分的主观性及避免散毒，结果准确、重复性强、批间差异小。其次，本发明检测方法不但在鸡毒支原体灭活疫苗单苗中使用，而且在鸡毒支原体灭活疫苗所有联苗中也可使用。该方法的建立为鸡毒支原体灭活疫苗联苗的研制开辟了绿色通道。最后，本发明首次公开了血清学方法测定鸡毒支原体灭活疫苗抗体效价跟免疫攻毒保护之间存在相关性。该方法为本病的免疫攻毒保护、疫苗质量标准的确定、免疫期限的测定和临床监测等提供了强有力的科学依据，对现实生产有重要的指导意义。

具体实施方式

实施例1

鸡毒支原体灭活疫苗的效力检验方法

一、疫苗免疫

用40日龄SPF鸡20只，其中10只颈背部皮下或大腿部肌肉注射免疫1羽份，另10只不免疫作对照。30天后采血，分离血清，测定ELISA抗体水平或HI抗体效价。

二、鸡毒支原体酶联免疫吸附试验(ELISA)和血凝抑制(HI)试验

1、鸡毒支原体ELISA试验

购买MG抗体ELISA(ELISA，MG Ab)试剂盒：美国IDEXX公司生产(试剂包括：包被的微量反应板、样品稀释液、阳性对照、阴性对照、酶标二抗、底物溶液和终止液)，北京爱德士世纪元亨有限公司。

ELISA检测方法按IDEXX MG抗体ELISA(ELISA，MG Ab)试剂盒方法进行。

2、鸡毒支原体血凝抑制(HI)试验：

1)、鸡毒支原体HI抗原血球凝集价测定

(1)吸取30μl浓度为0.01mol/LpH为7.2的PBS，加到V型微量反应板各孔；

(2)取30μl μμ鸡毒支原体抗原加入反应板第一孔中，并做4孔重复；

(3)将30μl抗原在反应板上横向作2倍倍比稀释；

(4)各孔加入30μl的1％(V/V)鸡红细胞；

(5)用微量振荡器混匀，室温静置30min。直到红细胞对照孔完全沉淀为止。以使100％红细胞凝集的抗原最高稀释倍数作为判定终点，表示一个血球凝集单位(1HA单位)。

2)、4HA单位抗原的配制

根据测定的抗原血球凝集(HA)效价，用PBS配制4HA单位抗原：

(1)将配置好的4HA单位抗原用PBS稀释，使4HA单位抗原的稀释度为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7；

(2)在每一稀释度的30μl抗原中加30μlPBS；

(3)再加入30μl的1％(V/V)鸡红细胞，混匀，室温静置30min后判定结果；

(4)结果判定

如果1∶4稀释为100％红细胞凝集终点，表明配制的是4HA单位抗原；如果100％红细胞凝集终点是1∶5或1∶6则表明配制的4HA单位抗原实际上是高于4个单位；如果100％红细胞凝集终点是1∶2或1∶3则表明配制的4HA单位抗原实际上是低于4个单位。应当适当的调整使抗原工作液为4HA单位。

3)、血凝抑制试验

(1)取96孔V型微量反应板，每孔加入30μlPBS；

(2)分别吸取30μl待检血清，加至每块板的第一排各相应孔内，并在每块板上设标准阳性血清和阴性血清对照，然后2倍系列稀释；

(3)分别向各孔中加入含4HA单位的抗原30μl，充分振荡，37℃温箱静置15min；

(4)每孔加入1％鸡红细胞悬液30μl，轻轻混匀，室温静置30min；

(5)结果判定

将反应板倾斜45℃角，凡血清反应孔与红细胞对照孔中红细胞以同样速度从孔底流淌者判为血球凝集抑制。当阴性血清HI效价≤2Log2、阳性血清HI效价与规定效价相比误差≤1Log2时，实验方可成立。

三、疫苗评价

1、酶联免疫吸附试验(ELISA)结果S/P值≥0.6时，疫苗判为合格；

2、血凝抑制试验HI抗体水平，HI值≥4Log2时，疫苗判为合格。

实施例2

鸡毒支原体灭活疫苗免疫试验动物的血清抗体效价与攻毒保护率之间的平行关系用3批疫苗，每批将60只40日龄的SPF鸡分为6组，每组10只，其中50只按照20μl、50μl、200μl、300μl、500μl进行颈背部皮下或大腿部肌肉注射免疫，另10只不免疫作对照。30天后采血，分离血清，测定ELISA抗体水平或HI抗体水平。同时连同对照鸡10只，在2～3m³的密室(室内温度为15℃～30℃，相对湿度为50％～70％)内喷雾攻击鸡毒支原体R株培养物500～600mL(每1.0ml含活菌数108～9CCU颜色变化单位)，喷雾持续时间应不少于5分钟，雾滴在2.0μm左右，观察14日，剖检，观察气囊病变，并进行病变记分。对照组应至少有4只鸡的气囊出现2分以上的病变，免疫鸡的平均气囊保护率应在60％以上，计算攻毒保护率。结果如下表1。

表1鸡毒支原体灭活疫苗不同免疫剂量免疫抗体与攻毒保护率相关性

由以上实验结果可知使用0.2ml/羽剂量作SPF鸡的血清抗体效价测定，ELISA S/P值大于0.6，或者HI值大于4Log2，攻毒保护率为60％以上；使用20μl/羽和50μl/羽的免疫剂量作SPF鸡的血清抗体效价测定，ELISA S/P值小于0.6，或者HI值小于4Log2，攻毒保护率为小于60％；使用300μl/羽和500μl/羽的免疫剂量作SPF鸡的血清抗体效价测定，ELISA S/P值或者HI值随着免疫剂量的增加而增加，攻毒保护率也随之增加；对照组攻毒后SPF鸡的气囊病变积分为2.9。由此可见，使用0.2ml/羽的剂量免疫，攻毒保护率为60％以上，证明疫苗合格；酶联免疫吸附试验(ELISA)结果S/P值≥0.6时，证明疫苗合格；血凝抑制试验HI抗体水平，HI值≥4Log2时，也说明疫苗合格。因此，鸡毒支原体血清HI抗体水平、ELISA抗体水平和免疫攻毒保护率三者相互之间均呈正相关。

实施例3

鸡毒支原体灭活疫苗单苗和联苗免疫实验动物的血清抗体与攻毒保护率的比较取鸡毒支原体灭活疫苗单苗和鸡毒支原体灭活疫苗联苗各3批疫苗，每批用10只40日龄SPF鸡分别免疫抗原含量相同的鸡毒支原体灭活疫苗单苗和鸡毒支原体灭活疫苗联苗，按照0.2ml/羽进行颈背部皮下或大腿部肌肉注射免疫，另10只不免疫作对照。30天后采血，分离血清，测定ELISA抗体水平或HI抗体水平。同时连同对照鸡10只，在2～3m³的密室(室内温度为15℃～30℃，相对湿度为50％～70％)内喷雾攻击鸡毒支原体R株培养物500～600mL(每1.0ml含活菌数108-9CCU颜色变化单位)，喷雾持续时间应不少于5分钟，雾滴在2.0μm左右，观察14日，剖检，观察气囊病变，并进行病变记分。对照组应至少有4只鸡的气囊出现2分以上的病变，免疫鸡的平均气囊保护率应在60％以上，计算攻毒保护率。结果如下表2。

表2鸡毒支原体灭活疫苗单苗和联苗免疫抗体与攻毒保护率的比较

由以上实验结果可知鸡毒支原体灭活疫苗联苗与鸡毒支原体灭活疫苗单苗同时进行效力检验，鸡毒支原体联苗免疫后抗体水平S/P值在0.85左右，HI大于4.5Log2，攻毒保护率大于70％；鸡毒支原体单苗免疫后30天的抗体水平S/P值也在0.85左右，HI也大于4.5Log2，攻毒保护率大于70％。血清抗体水平和攻毒保护率均无明显差异。说明联苗的免疫效果与鸡毒支原体灭活疫苗单苗无明显差别，证明血清学方法替代免疫攻毒保护的方法不但在鸡毒支原体灭活疫苗单苗中使用，而且在鸡毒支原体灭活疫苗联苗中也可使用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种鸡毒支原体灭活疫苗的效力检验方法及其应用，其特征在于：包括如下步骤：

1)用鸡毒支原体灭活疫苗免疫鸡后25～35天后采血并分离血清；

2)用血清学方法(ELISA方法或HI方法)测定血清的抗体效价替代免疫攻毒保护。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述鸡毒支原体灭活疫苗免疫方法为皮下注射或肌肉注射。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述免疫剂量为1羽份，每羽份的量为0.2ml～0.6ml。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述MG抗体ELISA(ELISA，MGAb)试剂盒为美国IDEXX公司生产(试剂包括：包被的微量反应板、样品稀释液、阳性对照、阴性对照、酶标二抗、底物溶液和终止液)，购自北京爱德士世纪元亨有限公司。ELISA检测方法按IDEXX MG抗体ELISA(ELISA，MGAb)试剂盒方法进行。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述血凝抑制效价的测定方法，包括如下步骤：

1)鸡毒支原体血球凝集试验：HA抗原二倍系列稀释。将30ul鸡红细胞悬液加入含有30ul稀释抗原的反应孔内，充分振荡，在室温静置30min，判定结果时将反应板倾斜与水平呈45℃角，对照孔内和HA阴性孔的红细胞完全沉淀到孔底中心，呈泪珠样流淌；HA阳性孔的红细胞均匀分布在孔底或呈锯齿样凝集，使红细胞凝集的最大稀释倍数为该抗原的HA效价；2)鸡毒支原体血凝抑制试验：在96孔V型微量反应板，每行第1孔开始，每孔加入30ul稀释液至12孔，分别在1、11孔加入待检血清30ul，从第一孔开始倍比稀释血清至第10孔，弃去30ul，向1～11孔加入4HA单位抗原30ul，充分振荡，37℃温箱静置15min，每孔加入1％V/V鸡红细胞悬液30ul，轻轻混匀，室温静置30min，判定结果时将反应板倾斜45℃角，红细胞完全沉淀到孔底中心呈泪珠样流淌为HI阳性，红细胞均匀分布在孔底不流动者为HI阴性，完全抑制红细胞凝集的最高稀释倍数为待检血清的HI抗体效价。

6.根据权利要求1所述的鸡毒支原体灭活疫苗的效力检验方法，其特征在于，免疫后的血清ELISA抗体水平，S/P值≥0.6时，疫苗判为合格。

7.根据权利要求1所述的鸡毒支原体灭活疫苗的效力检验方法，其特征在于，免疫后的血清HI抗体水平，HI值≥4Log2时，疫苗判为合格。

8.根据权利要求1所述的鸡毒支原体灭活疫苗的效力检验方法，其特征在于，免疫后的血清HI抗体水平、ELISA抗体水平和免疫攻毒保护率三者相互之间均呈正相关。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述方法不但在鸡毒支原体灭活疫苗单苗中使用，而且在鸡毒支原体灭活疫苗所有联苗中也可使用。

10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述方法在鸡毒支原体灭活疫苗的质量控制中的应用。

11.根据权利要求10所述方法，其特征在于，所述疫苗的质量控制包括免疫攻毒保护率、疫苗质量标准的确定、免疫期限的测定和临床监测。