CN107589256A - 副猪嗜血杆菌病4型、5型二价灭活疫苗效力的检验方法 - Google Patents
副猪嗜血杆菌病4型、5型二价灭活疫苗效力的检验方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种副猪嗜血杆菌病4型、5型二价灭活疫苗效力的检验方法该方法使用副猪嗜血杆菌4型、5型代表性菌株作为抗原，制备副猪嗜血杆菌灭活疫苗，依据《中国兽药典》质量标准检验疫苗，合格疫苗作为参考品，试制疫苗与参考疫苗免疫豚鼠后采血，间接ELISA测定血清抗体效价，Rel Pot4.0分析试验疫苗与参考疫苗的相对效力，确定试验疫苗的效力。上述副猪嗜血杆菌灭活疫苗效力检验的方法，不使用强毒攻击，不产生任何生物安全隐患，缩短试验时间，相对效力测定使用动物为豚鼠，因豚鼠饲养环境稳定，消除了因使用靶动物(仔猪)、攻毒操作人员、攻毒菌液制备、饲养环境等条件导致攻毒保护试验批间差异较大的问题。
Description
技术领域
本发明涉及兽用生物制品技术领域，进一步涉及疫苗的效力评价技术，具体涉及副猪嗜血杆菌病4型、5型二价灭活疫苗效力的检验方法。
背景技术
副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)是猪上呼吸道的一种常在菌，为猪Glasser’s病(副猪嗜血杆菌病)的病原菌。常可在鼻腔、扁桃体和气管前段分离到，而不见任何临床症状，当环境发生变化时或引起免疫抑制的因素存在时，会导致该病发生。HPS只感染猪，可以侵害2周龄至4月龄的仔猪，多发于5～8周龄，发病率可达40％，严重时高达50％。
HPS血清型众多，按Kieletein-Rapp-Gabriedon(KRG)血清分型方法至少可将副猪嗜血杆菌分为15个血清型，由于一些菌株不表达足够多的型特异性抗原，大约有20％左右的分离株不能分型。不同血清型HPS菌株其毒力和致病力存在差异，其中血清型1、5、10、12、13、14毒力最强，血清型2、4、15为中等毒力，血清型3、6、7、8、9、11毒株感染症状较缓和或无临床表现，在我国HPS血清型4、5、12、13型较为流行。
目前，市场上有多家疫苗公司均在生产和销售副猪嗜血杆菌单价、多价灭活疫苗，副猪嗜血杆菌灭活疫苗传统效力检验方法为攻毒保护试验，猪只免疫疫苗后通过强毒攻击，与对照组相比，确定疫苗的保护效力。此方法评价疫苗的效力直观，但是历时时间长，试验进行期间需要攻毒，存在生物安全风险，同时试验成本较高，效力检验使用动物、操作人员、攻毒菌液制备、饲养环境等条件导致攻毒保护试验批间差异较大。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供副猪嗜血杆菌病4型、5型二价灭活疫苗效力的检验方法，以解决现有技术中通过攻毒保护试验评价疫苗效力的方法存在检验耗时长、成本高、结果不稳定等技术问题。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
副猪嗜血杆菌病4型、5型二价灭活疫苗效力的检验方法，包括以下步骤：
1)分别制备副猪嗜血杆菌4型单价灭活疫苗和副猪嗜血杆菌5型单价灭活疫苗，依据《中国兽药典》质量标准检验疫苗，合格品分别作为4型疫苗参照品和5型疫苗参照品；
2)取待测的4型、5型二价灭活疫苗，以及步骤1)所得的4型疫苗参照品和5型疫苗参照品，采用相同方法分别免疫豚鼠，而后采血，通过间接ELISA方法分别检测抗体滴度，比较待测的4型、5型二价灭活疫苗所免疫的血清抗体滴度与4型疫苗参照品、5型疫苗参照品所免疫的血清抗体滴度之间的数值关系。
作为优选，步骤2)所述的相同方法为：先对豚鼠进行首次免疫，2周后再次免疫接种1次，二免后2周，免疫结束。
作为优选，所述通过间接ELISA方法分别检测抗体滴度，包括以下操作：
A)将副猪嗜血杆菌抗原用包被液进行稀释，加至96孔板中，100μL/孔；
B)室温孵育30min，用PBS清洗96孔板3遍；
C)加入封闭液，100μL/孔；对照组血清、免疫组血清和标准血清分别加入至第一列，倍比稀释至第10列，第11和12列分别加入16倍稀释的标准阴性血清和标准阳性血清；
D)室温孵育1h，洗96孔板3次；
E)以100μL/孔的量向其中加入以封闭液进行了1:2000(v:v)倍稀释的HRP标记的抗豚鼠IgG，37℃孵育1小时；
F)洗液洗96孔板3次；
G)加入100μL/孔OPD底液，室温孵育15min；
H)50μL/孔终止液终止反应；
I)492nm条件下测定OD值。
作为优选，所述比较待测的4型、5型二价灭活疫苗所免疫的血清抗体滴度与4型疫苗参照品、5型疫苗参照品所免疫的血清抗体滴度之间的数值关系，是分别计算待测的4型、5型二价灭活疫苗所免疫血清中4型抗体滴度与4型疫苗参照品所免疫血清中抗体滴度之间比值，以及待测的4型、5型二价灭活疫苗所免疫血清中5型抗体滴度与5型疫苗参照品所免疫血清中抗体滴度之间比值；上述两个比值均大于或等于1时，检验结果为合格，否则检验结果为不合格。
作为优选，所述比较待测的4型、5型二价灭活疫苗所免疫的血清抗体滴度与4型疫苗参照品、5型疫苗参照品所免疫的血清抗体滴度之间的数值关系，是利用版本号为4.0的Rel Pot软件(U.S.Department of Agriculture,Center for Veterinary BiologicsProgram’s Relative Potency Calculation Software,May 22,2002)实现的，在此过程中，满足以下条件：标准阴性血清OD值小于0.1，标准阴性血清OD值与标准阳性血清OD值大于0.5；版本号为4.0的Rel Pot软件中斜率大于0.8。
作为优选，步骤1)中，副猪嗜血杆菌4型单价灭活疫苗或副猪嗜血杆菌5型单价灭活疫苗是通过以下方法制备的：
α)培养副猪嗜血杆菌单血清型菌株，制备得到活菌液；
β)利用甲醛将步骤α)制备的活菌液进行灭活；
γ)采用离心而PBS溶液后重悬的方式将步骤β)灭活后菌液中菌体浓度调整至109～1010CFU/mL，即得到抗原溶液；
δ)将步骤γ)所得抗原溶液与佐剂混合，即得到副猪嗜血杆菌单血清型灭活疫苗。
作为优选，待测的4型、5型二价灭活疫苗是通过以下方法制备的：
一)分别培养副猪嗜血杆菌4型菌株、5型菌株，制备得到活菌液；
二)利用甲醛将步骤一)制备的副猪嗜血杆菌4型菌液、5型菌液分别进行灭活；
三)采用离心而后PBS溶液重悬的方式分别将4型菌液中菌体浓度和5型菌液中菌体浓度调整至109～1010CFU/mL，即得到4型抗原溶液和5型抗原溶液；
四)将步骤三)所得的4型抗原溶液和5型抗原溶液以(1～2):(1～2)的体积比混匀，即得到混合的抗原溶液；
五)将步骤四)得到的混合抗原溶液与佐剂混合，即得到待测的4型、5型二价灭活疫苗。
作为优选，步骤1)中对疫苗的检验包括检验疫苗安全性以及采用攻毒保护试验所评价的疫苗效力。
作为优选，步骤1)中对疫苗的检验包括检验疫苗安全性以及采用攻毒保护试验所评价的疫苗效力；同时，还包括以下步骤3)：比较所述检验结果与所述采用攻毒保护试验所评价的疫苗效力之间的关系。
作为优选，所述疫苗佐剂为铝胶佐剂；对菌株的培养均利用发酵罐进行。
本发明提供了一种副猪嗜血杆菌病4型、5型二价灭活疫苗效力的检验方法该方法使用副猪嗜血杆菌4型、5型代表性菌株作为抗原，制备副猪嗜血杆菌灭活疫苗，依据《中国兽药典》质量标准检验疫苗，合格疫苗作为参考品，试制疫苗与参考疫苗免疫豚鼠后采血，间接ELISA测定血清抗体效价，Rel Pot4.0分析试验疫苗与参考疫苗的相对效力，确定试验疫苗的效力。上述副猪嗜血杆菌灭活疫苗效力检验的方法，不使用强毒攻击，不产生任何生物安全隐患，缩短试验时间，相对效力测定使用动物为豚鼠，因豚鼠饲养环境稳定，消除了因使用靶动物(仔猪)、攻毒操作人员、攻毒菌液制备、饲养环境等条件导致攻毒保护试验批间差异较大的问题。本发明从根本上解决了现有技术中生物安全风险、结果不稳定、耗时长等问题，同时降低了试验成本，具有突出的推广前景。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
实施例1副猪嗜血杆菌4型灭活疫苗的制备方法
1生产种子制备
1.1生产种子繁殖
将副猪嗜血杆菌4型冻干菌种启封后，划线接种于TSA平板(新生牛血清终浓度10％和NAD终浓度100μg/ml)，37℃培养24小时-48小时，挑取单菌落划线于TSA平板(新生牛血清终浓度10％和NAD终浓度100μg/ml)，37℃培养24小时-48小时，做为一级种子。
1.2二级种子繁殖
挑取培养好的单菌落到含新生牛血清(终浓度10％)和NAD(终浓度100μg/ml)胰蛋白胨大豆肉汤培养基(Tryptic Soy Broth,TSB)的三角瓶中(100ml三角瓶，装30ml培养基)，37℃、180r/min摇床培养16小时。按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验，合格后作为二级种子。
2制苗用抗原制备
2.1菌液制备
按发酵罐容积装入5.4LTSB培养基及消泡剂(0.1％)，灭菌后加入10％的新生牛血清和0.002％的NAD，同时按培养基总量的1％接入二级种子液，以逐渐增大通气量和转速的方法在37℃培养13～15小时后收获菌液。培养期间分别在8、10和12小时进行流加补料。发酵完成后进行纯粹检验和活菌计数，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应纯粹。
2.2菌体抗原灭活
将检验合格的菌液，按菌液体积加0.3％甲醛溶液，37℃灭活18～24小时，期间每隔2～3小时搅拌一次，每次3～5分钟，灭活后取样，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌生长。
3疫苗制备
将灭活菌液经离心、PBS重悬，依据活菌计数结果将抗原浓度调整为109-1010CFU/mL，加入铝胶佐剂，制备稳定疫苗乳液。作为参考疫苗1。
4无菌检验
取上述疫苗按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌生长。
实施例2副猪嗜血杆菌5型灭活疫苗的制备方法
1生产种子制备
1.1生产种子繁殖
将副猪嗜血杆菌5型冻干菌种启封后，划线接种于TSA平板(新生牛血清终浓度10％和NAD终浓度100μg/ml)，37℃培养24小时-48小时，挑取单菌落划线于TSA平板(新生牛血清终浓度10％和NAD终浓度100μg/ml)，37℃培养24小时-48小时，做为一级种子。
1.2二级种子繁殖
挑取培养好的单菌落到含新生牛血清(终浓度10％)和NAD(终浓度100μg/ml)胰蛋白胨大豆肉汤培养基(Tryptic Soy Broth,TSB)的三角瓶中(100ml三角瓶，装30ml培养基)，37℃、180r/min摇床培养16小时。按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验，合格后作为二级种子。
2制苗用抗原制备
2.1菌液制备
按发酵罐容积装入5.4LTSB培养基及消泡剂(0.1％)，灭菌后加入10％的新生牛血清和0.002％的NAD，同时按培养基总量的1％接入二级种子液，以逐渐增大通气量和转速的方法在37℃培养13～15小时后收获菌液。培养期间分别在8、10和12小时进行流加补料。发酵完成后进行纯粹检验和活菌计数，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应纯粹。
2.2菌体抗原灭活
将检验合格的菌液，按菌液体积加0.3％甲醛溶液，37℃灭活18～24小时，期间每隔2～3小时搅拌一次，每次3～5分钟，灭活后取样，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌生长。
3疫苗制备
将灭活菌液经离心、PBS重悬，依据活菌计数结果将抗原浓度调整为109-1010CFU/mL，加入铝胶佐剂，制备稳定疫苗乳液。作为参考疫苗2。
4无菌检验
取上述疫苗按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌生长。
实施例3副猪嗜血杆菌4、5型二价灭活疫苗的制备方法
1生产种子制备
1.1生产种子繁殖
将副猪嗜血杆菌4、5型冻干菌种启封后，划线接种于TSA平板(新生牛血清终浓度10％和NAD终浓度100μg/ml)，37℃培养24小时-48小时，挑取单菌落划线于TSA平板(新生牛血清终浓度10％和NAD终浓度100μg/ml)，37℃培养24小时-48小时，做为一级种子。
1.2二级种子繁殖
挑取培养好的单菌落到含新生牛血清(终浓度10％)和NAD(终浓度100μg/ml)胰蛋白胨大豆肉汤培养基(Tryptic Soy Broth,TSB)的三角瓶中(100ml三角瓶，装30ml培养基)，37℃、180r/min摇床培养16小时。按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验，合格后作为二级种子。
2制苗用抗原制备
2.1菌液制备
按发酵罐容积装入5.4LTSB培养基及消泡剂(0.1％)，灭菌后加入10％的新生牛血清和0.002％的NAD，同时按培养基总量的1％接入二级种子液，以逐渐增大通气量和转速的方法在37℃培养13～15小时后收获菌液。培养期间分别在8、10和12小时进行流加补料。发酵完成后进行纯粹检验和活菌计数，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应纯粹。
2.2菌体抗原灭活
将检验合格的菌液，按菌液体积加0.3％甲醛溶液，37℃灭活18～24小时，期间每隔2～3小时搅拌一次，每次3～5分钟，灭活后取样，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌生长。
3疫苗制备
将灭活菌液经离心、PBS重悬，依据活菌计数结果将抗原浓度调整为109-1010CFU/mL，将副猪嗜血杆菌4型、副猪嗜血杆菌5型按体积1:2混匀，加入铝胶佐剂，制备稳定疫苗乳液。作为供试疫苗。
4无菌检验
取上述疫苗按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌生长。
实施例4疫苗的检验
1安全性检验
取参考疫苗1、参考疫苗2、供试疫苗，用3～4周龄健康易感仔猪(副猪嗜血杆菌微量凝集抗体效价不高于1∶4)各5头，各颈部肌肉注射疫苗4ml，观察14日，应无由疫苗引起的局部或全身不良反应。结果见表1(供试疫苗三批重复)。
表1疫苗安全性检验结果
安全性试验结果显示：副猪嗜血杆菌4型灭活疫苗、副猪嗜血杆菌5型灭活疫苗、副猪嗜血杆菌4、5型二价灭活疫苗对仔猪安全。
2利用攻毒保护试验评价疫苗效力
2.1疫苗免疫
取参考疫苗1、参考疫苗2、供试疫苗，按瓶签注明头份，每头份2mL，肌肉注射1头份3-4周龄健康易感仔猪，3周后，再按相同方法接种疫苗，免疫剂量及方法同一免，同时设对照10头。疫苗分组如下表。
表2疫苗免疫实验分组
2.2攻毒
在第2次接种后14日，各取1组接种猪和1组对照猪分别腹腔内注射H4L1株菌液5×109CFU、H5L3株菌液4×109CFU，逐日连续观察14日。攻毒分组如下表。
表3疫苗攻毒实验分组
2.3效力检验结果
副猪嗜血杆菌攻毒后观察14日，记录免疫组合对照组临床症状及动物死亡头数。结果见下表。
表4疫苗效力检验结果
对照组攻毒试验结果显示，80％以上发病或死亡，攻毒试验成立，参考疫苗与供试疫苗效力检验结果表明，副猪嗜血杆菌4型灭活疫苗对副猪嗜血杆菌4型强毒攻击保护力达80％以上，副猪嗜血杆菌5型灭活疫苗对副猪嗜血杆菌4型强毒攻击保护力达80％以上，副猪嗜血杆菌4、5型二价灭活疫苗对副猪嗜血杆菌4型、5型强毒攻击保护力均达80％以上，供试疫苗的效力与参考疫苗的效力均在80％以上，基本一致。
实施例5供试疫苗相对效力检验
选取250-300g健康豚鼠50只，分为5组，供试疫苗3批重复，每只豚鼠背部皮下注射0.5mL供试疫苗和参考疫苗。所有试验动物首免后2周再次免疫接种1次，2免后2周所有试验动物采血，用ELISA检测抗体滴度并用Rel Pot 4.0软件分析相对效力。
ELISA检测副猪嗜血杆菌抗体方法如下：
1.将副猪嗜血杆菌抗原用包被液进行稀释，加至96孔板中，100ul/孔；
2.室温孵育30min，用PBS清洗板子3遍；
3.加入封闭液，100ul/孔。每个血清样品(对照组血清，免疫组血清，标准血清)加入至第一列，倍比稀释至第10列，第11和12列分别加入16倍稀释的标准阴性血清和标准阳性血清；
4.室温孵育1h，洗板子3次；
5.加入100ul/孔抗体(HRP标记的抗豚鼠IgG，封闭液进行1：2000倍稀释)，37℃孵育1小时；
6.洗液洗板子3次；
7.加入100ul/孔OPD底液，室温孵育15min；
8. 50ul/孔终止液终止反应；
9. 492nm条件下测定OD值，使用Rel Pot4.0软件计算相对效力值。
其中：标准阴性血清OD值应小于0.1，标准阴性血清OD值与标准阳性血清OD值应大于0.5；Rel Pot4.0软件：斜率应大于0.8。
相对效力值≥1.0，视为合格，以下为供试疫苗相对效力。
表5抗体相对效力值
三批供试疫苗相对效力值均大于1.0，表明相对效力检验合格。参考实施例4，3批供试疫苗与参考疫苗的攻毒保护试验均合格，表明相对效力检验合格(≥1.0)疫苗效力检验合格，相对效力检验可以代替攻毒保护效力检验，进行疫苗的效力检验。
实施例6
副猪嗜血杆菌病4型、5型二价灭活疫苗效力的检验方法，包括以下步骤：
1)分别制备副猪嗜血杆菌4型单价灭活疫苗和副猪嗜血杆菌5型单价灭活疫苗，依据《中国兽药典》质量标准检验疫苗，合格品分别作为4型疫苗参照品和5型疫苗参照品；
2)取待测的4型、5型二价灭活疫苗，以及步骤1)所得的4型疫苗参照品和5型疫苗参照品，采用相同方法分别免疫豚鼠，而后采血，通过间接ELISA方法分别检测抗体滴度，比较待测的4型、5型二价灭活疫苗所免疫的血清抗体滴度与4型疫苗参照品、5型疫苗参照品所免疫的血清抗体滴度之间的数值关系。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤2)所述的相同方法为：先对豚鼠进行首次免疫，2周后再次免疫接种1次，二免后2周，免疫结束。
所述通过间接ELISA方法分别检测抗体滴度，包括以下操作：
A)将副猪嗜血杆菌抗原用包被液进行稀释，加至96孔板中，100μL/孔；
B)室温孵育30min，用PBS清洗96孔板3遍；
C)加入封闭液，100μL/孔；对照组血清、免疫组血清和标准血清分别加入至第一列，倍比稀释至第10列，第11和12列分别加入16倍稀释的标准阴性血清和标准阳性血清；
D)室温孵育1h，洗96孔板3次；
E)以100μL/孔的量向其中加入以封闭液进行了1:2000(v:v)倍稀释的HRP标记的抗豚鼠IgG，37℃孵育1小时；
F)洗液洗96孔板3次；
G)加入100μL/孔OPD底液，室温孵育15min；
H)50μL/孔终止液终止反应；
I)492nm条件下测定OD值。
所述比较待测的4型、5型二价灭活疫苗所免疫的血清抗体滴度与4型疫苗参照品、5型疫苗参照品所免疫的血清抗体滴度之间的数值关系，是分别计算待测的4型、5型二价灭活疫苗所免疫血清中4型抗体滴度与4型疫苗参照品所免疫血清中抗体滴度之间比值，以及待测的4型、5型二价灭活疫苗所免疫血清中5型抗体滴度与5型疫苗参照品所免疫血清中抗体滴度之间比值；上述两个比值均大于或等于1时，检验结果为合格，否则检验结果为不合格。
步骤1)中，副猪嗜血杆菌4型单价灭活疫苗或副猪嗜血杆菌5型单价灭活疫苗是通过以下方法制备的：
α)培养副猪嗜血杆菌单血清型菌株，制备得到活菌液；
β)利用甲醛将步骤α)制备的活菌液进行灭活；
γ)采用离心而PBS溶液后重悬的方式将步骤β)灭活后菌液中菌体浓度调整至109～1010CFU/mL，即得到抗原溶液；
δ)将步骤γ)所得抗原溶液与佐剂混合，即得到副猪嗜血杆菌单血清型灭活疫苗。
待测的4型、5型二价灭活疫苗是通过以下方法制备的：
一)分别培养副猪嗜血杆菌4型菌株、5型菌株，制备得到活菌液；
二)利用甲醛将步骤一)制备的副猪嗜血杆菌4型菌液、5型菌液分别进行灭活；
三)采用离心而后PBS溶液重悬的方式分别将4型菌液中菌体浓度和5型菌液中菌体浓度调整至109～1010CFU/mL，即得到4型抗原溶液和5型抗原溶液；
四)将步骤三)所得的4型抗原溶液和5型抗原溶液以2:1的体积比混匀，即得到混合的抗原溶液；
五)将步骤四)得到的混合抗原溶液与佐剂混合，即得到待测的4型、5型二价灭活疫苗。
所述疫苗佐剂为铝胶佐剂；对菌株的培养均利用发酵罐进行。
实施例7
副猪嗜血杆菌病4型、5型二价灭活疫苗效力的检验方法，包括以下步骤：
1)分别制备副猪嗜血杆菌4型单价灭活疫苗和副猪嗜血杆菌5型单价灭活疫苗，依据《中国兽药典》质量标准检验疫苗，合格品分别作为4型疫苗参照品和5型疫苗参照品；
2)取待测的4型、5型二价灭活疫苗，以及步骤1)所得的4型疫苗参照品和5型疫苗参照品，采用相同方法分别免疫豚鼠，而后采血，通过间接ELISA方法分别检测抗体滴度，比较待测的4型、5型二价灭活疫苗所免疫的血清抗体滴度与4型疫苗参照品、5型疫苗参照品所免疫的血清抗体滴度之间的数值关系。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.副猪嗜血杆菌病4型、5型二价灭活疫苗效力的检验方法，其特征在于包括以下步骤：
1)分别制备副猪嗜血杆菌4型单价灭活疫苗和副猪嗜血杆菌5型单价灭活疫苗，依据《中国兽药典》质量标准检验疫苗，合格品分别作为4型疫苗参照品和5型疫苗参照品；
2)取待测的4型、5型二价灭活疫苗，以及步骤1)所得的4型疫苗参照品和5型疫苗参照品，采用相同方法分别免疫豚鼠，而后采血，通过间接ELISA方法分别检测抗体滴度，比较待测的4型、5型二价灭活疫苗所免疫的血清抗体滴度与4型疫苗参照品、5型疫苗参照品所免疫的血清抗体滴度之间的数值关系。
2.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌病4型、5型二价灭活疫苗效力的检验方法，其特征在于步骤2)所述的相同方法为：先对豚鼠进行首次免疫，2周后再次免疫接种1次，二免后2周，免疫结束。
3.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌病4型、5型二价灭活疫苗效力的检验方法，其特征在于所述通过间接ELISA方法分别检测抗体滴度，包括以下操作：
A)将副猪嗜血杆菌抗原用包被液进行稀释，加至96孔板中，100μL/孔；
B)室温孵育30min，用PBS清洗96孔板3遍；
C)加入封闭液，100μL/孔；对照组血清、免疫组血清和标准血清分别加入至第一列，倍比稀释至第10列，第11和12列分别加入16倍稀释的标准阴性血清和标准阳性血清；
D)室温孵育1h，洗96孔板3次；
E)以100μL/孔的量向其中加入以封闭液进行了1:2000(v:v)倍稀释的HRP标记的抗豚鼠IgG，37℃孵育1小时；
F)洗液洗96孔板3次；
G)加入100μL/孔OPD底液，室温孵育15min；
H)50μL/孔终止液终止反应；
I)492nm条件下测定OD值。
4.根据权利要求3所述的副猪嗜血杆菌病4型、5型二价灭活疫苗效力的检验方法，其特征在于所述比较待测的4型、5型二价灭活疫苗所免疫的血清抗体滴度与4型疫苗参照品、5型疫苗参照品所免疫的血清抗体滴度之间的数值关系，是分别计算待测的4型、5型二价灭活疫苗所免疫血清中4型抗体滴度与4型疫苗参照品所免疫血清中抗体滴度之间比值，以及待测的4型、5型二价灭活疫苗所免疫血清中5型抗体滴度与5型疫苗参照品所免疫血清中抗体滴度之间比值；上述两个比值均大于或等于1时，检验结果为合格，否则检验结果为不合格。
5.根据权利要求4所述的副猪嗜血杆菌病4型、5型二价灭活疫苗效力的检验方法，其特征在于所述比较待测的4型、5型二价灭活疫苗所免疫的血清抗体滴度与4型疫苗参照品、5型疫苗参照品所免疫的血清抗体滴度之间的数值关系，是利用版本号为4.0的Rel Pot软件实现的，在此过程中，满足以下条件：标准阴性血清OD值小于0.1，标准阴性血清OD值与标准阳性血清OD值大于0.5；版本号为4.0的Rel Pot软件中斜率大于0.8。
6.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌病4型、5型二价灭活疫苗效力的检验方法，其特征在于步骤1)中，副猪嗜血杆菌4型单价灭活疫苗或副猪嗜血杆菌5型单价灭活疫苗是通过以下方法制备的：
α)培养副猪嗜血杆菌单血清型菌株，制备得到活菌液；
β)利用甲醛将步骤α)制备的活菌液进行灭活；
γ)采用离心而PBS溶液后重悬的方式将步骤β)灭活后菌液中菌体浓度调整至109～1010CFU/mL，即得到抗原溶液；
δ)将步骤γ)所得抗原溶液与佐剂混合，即得到副猪嗜血杆菌单血清型灭活疫苗。
7.根据权利要求6所述的副猪嗜血杆菌病4型、5型二价灭活疫苗效力的检验方法，其特征在于待测的4型、5型二价灭活疫苗是通过以下方法制备的：
一)分别培养副猪嗜血杆菌4型菌株、5型菌株，制备得到活菌液；
二)利用甲醛将步骤一)制备的副猪嗜血杆菌4型菌液、5型菌液分别进行灭活；
三)采用离心而后PBS溶液重悬的方式分别将4型菌液中菌体浓度和5型菌液中菌体浓度调整至109～1010CFU/mL，即得到4型抗原溶液和5型抗原溶液；
四)将步骤三)所得的4型抗原溶液和5型抗原溶液以(1～2):(1～2)的体积比混匀，即得到混合的抗原溶液；
五)将步骤四)得到的混合抗原溶液与佐剂混合，即得到待测的4型、5型二价灭活疫苗。
8.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌病4型、5型二价灭活疫苗效力的检验方法，其特征在于步骤1)中对疫苗的检验包括检验疫苗安全性以及采用攻毒保护试验所评价的疫苗效力。
9.根据权利要求4所述的副猪嗜血杆菌病4型、5型二价灭活疫苗效力的检验方法，其特征在于步骤1)中对疫苗的检验包括检验疫苗安全性以及采用攻毒保护试验所评价的疫苗效力；
同时，还包括以下步骤3)：比较所述检验结果与所述采用攻毒保护试验所评价的疫苗效力之间的关系。
10.根据权利要求7所述的副猪嗜血杆菌病4型、5型二价灭活疫苗效力的检验方法，其特征在于所述疫苗佐剂为铝胶佐剂；对菌株的培养均利用发酵罐进行。
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