CN103513032B - 鸡鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒、制备方法及应用 - Google Patents

鸡鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鸡鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒、制备方法及应用，特别是一种鸡鼻气管鸟杆菌（Ornithobacterium rhinotracheale YN12091，菌株保藏号是：CCTCC No：M2013318，简称ORT），血凝抑制抗体检测试剂盒、制备方法及应用。本发明通过筛选ORT高血凝活性菌株，培养、洗涤制备ORT血凝抗原；通过采集绵羊血液，洗涤和离心方法制备绵羊红细胞，用戊二醛固定并用鞣酸鞣化制备醛化绵羊红细胞；通过ORT菌悬液 3次免疫鸡，采血离心制备ORT标准阳性血清；将制备的ORT血凝抗原、醛化绵羊红细胞和ORT标准阳性血清组装建立鸡鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒。该试剂盒不仅能对鸡血清中的ORT抗体进行检测，而且能对鸡卵黄中卵黄抗体进行检测。

Description

鸡鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒、制备方法及应用
技术领域
本发明专利涉及一种鸡鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒、制备方法及应用，鼻气管鸟杆菌YN12091（Ornithobacterium rhinotracheale YN12091，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国 武汉 武汉大学；保藏日期2013年7月6日；菌株保藏号是：CCTCC No.：M2013318，简称ORT），血凝抑制抗体检测试剂盒、制备方法及应用，特别是检测鸡鼻气管鸟杆菌血清抗体和卵黄抗体水平的半定量检测试剂盒。
背景技术
鼻气管鸟杆菌（Ornithobacterium  rhinotracheale  YN12091，简称ORT）是新命名的一种以家禽和野禽呼吸道疾病相关的病原体，ORT感染的主要症状为生长迟缓、死亡率增高、产蛋减少。肺炎，胸膜炎和气囊炎是本病的主要病理特征，该病呈世界分布，ORT可能引起原发性或继发性感染，其死亡率通常为1%～15%，协同感染和继发感染其它病菌时死亡率增加，在大部分严重感染的情况下，其死亡率高达50%，该病给养禽业带来巨大的经济损失。
ORT感染的血清学鉴定和免疫状况的评估均需检测血清或卵黄中的ORT抗体。
现有进口的鼻气管鸟疫杆菌间接ELISA抗体检测试剂盒只能检测鸡和火鸡血清中ORT抗体，在大规模检测和免疫状况监测时需要进行大批鸡只进行采血，容易造成应激影响鸡的生产；另外，该进口试剂盒不能检测卵黄中的ORT抗体，且价格昂贵使其大规模应用受到一定的限制。
发明内容
本发明目的在于克服上述现有进口ORT间接ELISA抗体检测试剂盒不能检测鸡卵黄中ORT抗体的不足，发明一种鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒。该试剂盒不仅能对鸡血清中的ORT抗体进行检测，而且能对鸡卵黄中卵黄抗体进行检测。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：鸡鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒包含有ORT血凝抗原、醛化绵羊红细胞和ORT标准阳性血清，其中所述ORT血凝抗原是通过筛选ORT高血凝活性菌株，培养、洗涤制备；所述醛化绵羊红细胞是通过采集绵羊血液，洗涤和离心方法制备绵羊红细胞，用戊二醛固定并 用鞣酸鞣化制备；所述ORT标准阳性血清是通过ORT菌悬液3次免疫健康鸡，第3次免疫后采集血液，离心制备。
一种鸡鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于工艺步骤为：
制作ORT血凝抗原：筛选ORT高血凝活性菌株，通过培养、洗涤制备ORT血凝抗原； 
制作醛化绵羊红细胞：采集绵羊血液，通过洗涤和离心方法制备绵羊红细胞，用戊二醛固定并用鞣酸鞣化制备醛化绵羊红细胞；
制作ORT标准阳性血清：通过ORT菌悬液三次免疫健康鸡，第三次免疫后采集血液，离心制备ORT标准阳性血清；
将上述制备的ORT血凝抗原、醛化绵羊红细胞和ORT标准阳性血清组装建立鸡鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒。
所述鸡鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒的操作步骤即血凝抑制试验方法步骤为：
（1）根据血凝试验结果配制4单位抗原：
以能引起100%血凝的ORT血凝抗原最高稀释倍数代表1个血凝单位，4单位抗原的的配制方法如下：试剂盒提供的ORT血凝效价为1:1024，则4单位抗原的稀释倍数应是1:256，其中1024/4=256，稀释时，将20μL抗原加入到5 mL PBS中即为4单位抗原。但是，该4单位抗原必须经过验证后才可确定其实际稀释倍数，用于血凝抑制效价的测定；
4单位抗原的验证方法即血凝试验方法：取96孔V形微量反应板（为了便于以下描述96孔板中每个孔的具体位置，将96孔V形微量反应板的8行分别命名为A～H行，12列分别命名为1～12列。如：第1行的第5列孔，则表示为A5孔；第2行的第6列孔，则表示为B6孔。）；
 A.用移液器在A1～A6孔各加入25 μL PBS；
B. 吸取25 μL ORT血凝抗原加入到A1孔中，吹打3～5次充分混匀；
C. 从A1孔中吸取25 μL混匀后的抗原液加到A2孔中，混匀后吸取25μL加入到A3孔中，依次进行系列倍比稀释至A4孔，最后从A4孔各吸取25 μL弃之，A5和A6孔为红细胞对照；
D. 自右向左依次向A6～A1孔中加入25 μL 1%(v/v)醛化绵羊红细胞悬液；
E. 将反应板置于微量振荡器上振荡1 min，室温（20～25℃）静置60 min后观察结果，在醛化红细胞对照孔即A5和A6孔出现完全沉淀的情况下，其1×单位抗原孔（A2孔）的红血球必须达到100%凝集，同时0.5×单位抗原孔（A3孔）醛化红细胞达到50%凝集50%下沉孔底才符合要求，否则重新调配；
（2） 取96孔V形微量反应板，用移液器在A1～A11孔各加入25 μL PBS，A12孔加入50 μL PBS；
（3） 在A1孔加入25 μL被检血清或1/2倍稀释的卵黄液（取鸡蛋，将蛋壳敲出1小孔暴露卵黄，用不带针头的注射器吸取卵黄2 mL于玻璃瓶中，再加入2mL生理盐水，混匀即为1/2倍稀释的卵黄液），充分混匀后吸取25 μL加至A2孔，依次类推，倍比稀释至A10孔，最后从A10孔各吸取25 μL弃之，设A11孔为ORT抗原对照，A12孔为醛化红细胞对照；
（4） 在第A1～A11孔各加入25 μL 4单位抗原，置微量振荡器上160转/分钟震荡1分钟，使反应物混合均匀，室温静置30 min；
（5） 自右向左依次向A12～A1孔加入25 μL 1%(v/v)醛化绵羊红细胞悬液；
（6） 将反应板置于微量振荡器上振荡1 min，室温静置60 min后观察结果，在醛化红细胞对照出现完全沉淀、ORT抗原对照出现完全凝集的情况下，以完全抑制醛化红细胞凝集的血清或卵黄最大稀释倍数判为该血清或卵黄的血凝抑制效价，当被检血清或卵黄抗体效价大于等于16即4log2，判为ORT抗体阳性。
所述96孔V型微量反应板中每个孔的具体位置是，将96孔V形微量反应板的8行分别命名为A～H行，12列分别命名为1～12列，如：第1行的第5列孔，则表示为A5孔，第2行的第6列孔，则表示为B6孔。
在临床样品即鸡血清或卵黄检测中，当检测样品即鸡血清或卵黄中无ORT特异性抗体即ORT血清抗体或卵黄抗体时，ORT血凝抗原与醛化红细胞发生凝集，即血凝（hemagglutination, HA)；当检测样品中有ORT特异性抗体时，血凝抗原与抗体发生抗原-抗体反应，血凝被不同程度地抑制，即产生不同程度的血凝抑制（hemagglutination inhibition，HI）。
本发明通过筛选ORT高血凝活性菌株，培养、洗涤制备ORT血凝抗原；通过采集绵羊血液，通过洗涤和离心方法制备绵羊红细胞，用戊二醛固定并用鞣酸鞣化制备醛化绵羊红细胞。通过ORT菌悬液3次免疫健康鸡，第3次免疫后采集血液，离心制备ORT标准阳性血清。将制备的ORT血凝抗原、醛化绵羊红细胞和ORT标准阳性血清组装建立鸡鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒。
在临床样品（鸡血清或卵黄）检测中，当检测样品中无ORT特异性抗体（ORT血清抗体或卵黄抗体）时，ORT血凝抗原与醛化红细胞发生凝集，即血凝（hemagglutination, HA）；当检测样品中有ORT特异性抗体时，血凝抗原与抗体发生抗原-抗体反应，血凝被不同程度地抑制，即产生不同程度的血凝抑制（hemagglutination inhibition，HI），抗体效价越高则血凝抑制效价越高，从而达到对样品中的ORT特异性抗体进行半定量检测的目的。
本发明不仅能对鸡ORT血清抗体进行半定量检测，而且能对鸡ORT卵黄抗体进行半定量检测，同时具有经济、简便、灵敏、快速，适于大批量样品检测等优点。
附图说明
下面结合附图所示实施例，对结构作进一步说明，但本发明保护范围不限于此实施例。
图1本发明实施例血凝抗原血凝效价测定。
图2本发明实施例4单位抗原的验证。
图3本发明实施例1～4号被检血清样品的血凝抑制抗体效价检测。
具体实施方式
实施例
（1）ORT血凝抗原的制备：将鸡鼻气管鸟杆菌（Ornithobacterium rhinotracheale YN12091，菌株保藏号是：CCTCC No.：M2013318，简称ORT）云南分离株YN12091（菌株保藏号是：CCTCC No：M2013318），菌种接种于营养琼脂培养基，放置于5% CO2培养箱37℃培养24h，用PBS（0.1M, Ph6.3）将营养琼脂培养基上的菌落洗下来，4000rpm离心10min弃上清，再用PBS将菌泥重悬，再离心。重复离心和重悬步骤将ORT菌体洗3次，第3次离心后弃上清，菌泥用PBS重悬，调整其浓度为15mg/mL（蛋白浓度用超微量紫外分光光度计测定），加入终浓度为0.01%(m/v) 的硫柳汞，4℃ 保存备用。
（2） 醛化绵羊红细胞的制备：采集绵羊血（20mL）与3倍体积（60mL）的阿氏液混合，4000rpm离心10min弃上清，沉淀用灭菌PBS (0.15M, pH7.2)（ 500mL）重悬再离心，重复离心和重悬步骤将ORT菌体洗3次，第3次离心后弃上清，红细胞泥用PBS（23mL）重悬使其浓度达到30%(v/v)，在4℃ 条件下缓缓滴加等体积(33mL)的2%(v/v)戊二醛，边滴加边震荡（100rpm）醛化50min后，4000rpm离心10min弃上清，沉淀用PBS(500mL)重悬后再离心，重复离心和重悬步骤将醛化红细胞洗3次，第3次离心后弃上清，红细胞泥用PBS(23mL)重悬并调整其浓度制成30%(v/v) 醛化红细胞，加入等体积(33mL)的1/20000鞣酸，37℃鞣化15min后，4000rpm离心10min弃上清，沉淀用PBS(500mL)重悬后再离心，重复离心和重悬步骤将醛化红细胞洗3次，第3次离心后弃上清，红细胞泥用PBS(1000mL)重悬并调整其浓度制成1%（v/v）醛化红细胞，加入1%(m/v)硫柳汞(10mL)使其终浓度为 0.01%(m/v)，4℃ 保存备用。
（3） ORT标准阳性血清的制备：将ORT云南分离株YN13091菌种接种于营养琼脂培养基，放置于5% CO2培养箱37℃培养24h，用生理盐水（0.9%(m/v)NaCl溶液）将营养琼脂培养基上的菌落洗下来，4000rpm离心10min弃上清，再用生理盐水将菌泥重悬，再离心。重复离心和重悬步骤将ORT菌体洗3次，第3次离心后弃上清，菌泥用生理盐水重悬，调整其浓度为10mg/mL（蛋白浓度用超微量紫外分光光度计测定），加入终浓度为0.05%(v/v)甲醛溶液，4℃放置24小时，使细菌灭活，即为免疫抗原，4℃ 保存备用。取0.5mL免疫抗原颈部皮下注射免疫1只健康成年鸡（第一次免疫），一免后15天后再取0.5mL免疫抗原对该鸡进行颈部皮下注射二次免疫，二免后8天后再取0.5mL免疫抗原对该鸡进行颈部皮下注射三次免疫。第三次免疫后第7天对该鸡进行翅膀下静脉采血，所采血液放置于50mL离心管中，放置于37℃温箱中5小时后，4000rpm离心30min后取上清，即为ORT标准阳性血清，-20℃ 保存备用。
（4）血凝抑制试验检测鸡血清和卵黄中ORT抗体的具体步骤：
① 血凝试验确定ORT血凝抗原的血凝效价（血凝试验方法）：A. 取96孔V形微量反应板，用微量移液器在A1～A12孔每孔加25 μL PBS。B. 吸取25 μL ORT血凝抗原加入到A1孔中，吹打3～5次充分混匀。C. 从A1孔中吸取25 μL混匀后的抗原液加到A2孔中，混匀后吸取25μL加入到A3孔中，依次进行系列倍比稀释至A11孔，最后从A11孔各吸取25 μL弃之，A12孔为醛 化红细胞对照。D. 自右向左依次向A12～A1孔中加入25 μL 1%(v/v)醛化绵羊红细胞悬液。E. 将反应板置于微量振荡器上振荡1 min，室温（20～25℃）静置60 min后观察结果：醛化红细胞对照孔(A12孔)出现完全沉淀，该次试验有效，能使醛化红细胞完全凝集的ORT抗原最大稀释倍数为1:1024(见图1)，因此将该ORT血凝抗原的血凝效价判定为1:1024。
② 根据血凝试验结果配制4单位血凝抗原。将上述血凝效价为1:1024的血凝抗原稀释1:256倍（即血凝效价1024/4=256）即为4单位血凝抗原。稀释时，将20μL抗原加入到5 mL PBS中即为4单位抗原。但是该4单位抗原必须经过验证后才可确定其实际稀释倍数，用于血凝抑制效价的测定。
4单位抗原的验证步骤：取96孔V形微量反应板, A.用移液器在A1～A6孔各加入25 μL PBS；B. 吸取25 μL ORT血凝抗原加入到A1孔中，吹打3～5次充分混匀；C. 从A1孔中吸取25 μL混匀后的抗原液加到A2孔中，混匀后吸取25μL加入到A3孔中，依次进行系列倍比稀释至A4孔，最后从A4孔各吸取25 μL弃之，A5、A6孔为醛化红细胞对照；D. 自右向左依次向A6～A1孔中加入25 μL 1%(v/v)醛化绵羊红细胞悬液。E. 将反应板置于微量振荡器上振荡1 min，室温静置60 min后观察结果：醛化红细胞对照孔(A5、A6孔)出现完全沉淀， 1×单位抗原孔（A2孔）的醛化红细胞100%凝集，同时0.5×单位抗原孔（A3孔）醛化红细胞达到50%凝集50%下沉（见图2），所以经验本次试验所配制的4单位抗原可作为本次血凝抑制试验中的“4单位血凝抗原”，即试剂盒中的ORT血凝抗原稀释1:256倍即为本次血凝抑制试验中的4单位血凝抗原。
③ 取96孔V形微量反应板，用移液器在A1～E11孔各加入25 μL PBS，A12～E12孔加入50 μL PBS。
④ 在A1～E1孔中分别加入25 μL 1～4号被检血清和标准阳性血清，用多道移液器将A1～E1孔分别充分混匀后移出25 μL分别加至A2～E2孔，依次类推，倍比稀释至A10～E10孔，第A10～E10孔分别弃去25 μL，设A11～E11孔为ORT抗原对照，A12～E12孔为醛化红细胞对照。
⑤ 在A1～E11孔中各加入25 μL 4单位抗原，置微量振荡器上160转/分钟震荡1分钟，使反应物混合均匀，室温静置30 min。
⑥ 自右向左依次向E12～A1各孔中加入25 μL 1%(v/v)醛化绵羊红细胞悬液。
⑦ 将反应板置于微量振荡器上振荡1 min，室温静置60 min后观察结果：醛化红细胞对照（A12～E12孔）出现完全沉淀， 且ORT抗原对照孔（A11～E11）出现完全凝集，阳性血清血凝抑制效价为1:128，该次试验有效。A1～E1孔中的各血清样品能完全抑制醛化红细胞凝集的最大稀释倍数为分别为1:128、1:32、1:128、1:128（见图3），因此1～4号被检血清的血凝抑制效价分别判定为1:128、1:32、1:128、1:128。又因为1～4号血清血凝抑制效价均大于16，所以1～4号被检血清均判定为ORT抗体阳性。
试剂盒应用的操作步骤(血凝抑制试验方法)：
（1）根据血凝试验结果配制4单位抗原。以能引起100%血凝的ORT血凝抗原最高稀释倍数代表1个血凝单位，4单位抗原的的配制方法如下：试剂盒提供的ORT血凝效价为1:1024，则4单位抗原的稀释倍数应是1:256（1024/4=256），稀释时，将20μL抗原加入到5 mL PBS中即为4单位抗原。但是该4单位抗原必须经过验证后才可确定其实际稀释倍数，用于血凝抑制效价的测定。
4单位抗原的验证方法(血凝试验方法)：取96孔V形微量反应板（为了便于以下描述96孔V形微量反应板中每个孔的集体位置，将96孔V形微量反应板的8行分别命名为A～H行，12列分别命名为1～12列。如：第1行的第5列孔，则表示为A5孔，第2行的第6列孔，则表示为B6孔。）, A.用移液器在A1～A6孔各加入25 μL PBS；B. 吸取25 μL ORT血凝抗原加入到A1孔中，吹打3～5次充分混匀；C. 从A1孔中吸取25 μL混匀后的抗原液加到A2孔中，混匀后吸取25μL加入到A3孔中，依次进行系列倍比稀释至A4孔，最后从A4孔中吸取25 μL弃之，A5和A6孔为醛化红细胞对照；D. 自右向左依次向A6～A1孔中加入25 μL 1%(v/v)醛化绵羊红细胞悬液。E. 将反应板置于微量振荡器上振荡1 min，室温静置60 min后观察结果，在醛化红细胞对照孔(A5和A6孔)出现完全沉淀的情况下，其1×单位抗原孔（A2孔）的醛化红细胞必须达到100%凝集，同时0.5×单位抗原孔（A3孔）红血球达到50%凝集50%下沉孔底才符合要求，否则重新调配。
（2） 取96孔V形微量反应板，用移液器在A1～A11孔各加入25 μL PBS，A12孔加入50 μL PBS。
（3） 在A1孔加入25 μL被检血清或1/2倍稀释的卵黄液（取鸡蛋，将蛋壳敲出1小孔暴露卵黄，用不带针头的注射器吸取卵黄2 mL于玻璃瓶中，再加 入2mL生理盐水，混匀即为1/2倍稀释的卵黄液），充分混匀后吸取25 μL加至A2孔，依次类推，倍比稀释至A10孔，最后从A10孔各吸取25 μL弃之，设A11孔为ORT抗原对照，A12孔为醛化红细胞对照。
（4） 在第A1～A11孔各加入25 μL 4单位抗原，置微量振荡器上160转/分钟震荡1分钟，使反应物混合均匀，室温静置30 min。
（5） 自右向左依次向A12～A1孔加入25 μL 1%(v/v)醛化绵羊红细胞悬液。
（6） 将反应板置于微量振荡器上振荡1 min，室温静置60 min后观察结果，在醛化红细胞对照出现完全沉淀、ORT抗原对照出现完全凝集的情况下，以完全抑制醛化红细胞凝集的血清或卵黄最大稀释倍数判为该血清或卵黄的血凝抑制效价。当被检血清或卵黄抗体效价大于等于16（4log2），判为ORT抗体阳性。

Claims (4)

1.鸡鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒，其特征在于：所述鸡鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒的鸡鼻气管鸟杆菌（Ornithobacterium rhinotracheale ）为云南分离株YN12091，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，菌株保藏号是CCTCC No：M2013318，简称ORT，该试剂盒包含有ORT血凝抗原、醛化绵羊红细胞和ORT标准阳性血清，其中所述ORT血凝抗原是通过筛选ORT高血凝活性菌株，培养、洗涤制备；所述醛化绵羊红细胞是通过采集绵羊血液，洗涤和离心方法制备绵羊红细胞，用戊二醛固定并用鞣酸鞣化制备；所述ORT标准阳性血清是通过ORT菌悬液三次免疫健康鸡，第3次免疫后采集血液，离心制备。
2.一种鸡鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于工艺步骤为：
制作ORT血凝抗原：将鸡鼻气管鸟杆菌（Ornithobacterium rhinotracheale ）为云南分离株YN12091，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，菌株保藏号是CCTCC No：M2013318，简称ORT，菌种接种于营养琼脂培养基，筛选ORT高血凝活性菌株，通过培养、洗涤制备ORT血凝抗原；
制作醛化绵羊红细胞：采集绵羊血液，通过洗涤和离心方法制备绵羊红细胞，用戊二醛固定并用鞣酸鞣化制备醛化绵羊红细胞；
制作ORT标准阳性血清：通过ORT菌悬液三次免疫健康鸡，第三次免疫后采集血液，离心制备ORT标准阳性血清；
将上述制备的ORT血凝抗原、醛化绵羊红细胞和ORT标准阳性血清组装建立鸡鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒；
所述鸡鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒的操作步骤即血凝抑制试验方法步骤为：
（1）根据血凝试验结果配制4单位抗原：
以能引起100%血凝的ORT血凝抗原最高稀释倍数代表1个血凝单位，4单位抗原的的配制方法如下：试剂盒提供的ORT血凝效价为1:1024，则4单位抗原的稀释倍数应是1:256，其中1024/4=256，稀释时，将20μL抗原加入到5 mL PBS中即为4单位抗原，但是，该4单位抗原必须经过验证后才可确定其实际稀释倍数，用于血凝抑制效价的测定；
4单位抗原的验证方法即血凝试验方法：取96孔V形微量反应板，为了便于以下描述96孔板中每个孔的具体位置，将96孔V形微量反应板的8行分别命名为A～H行，12列分别命名为1～12列；如：第1行的第5列孔，则表示为A5孔；第2行的第6列孔，则表示为B6孔；
 A.用移液器在A1～A6孔各加入25 μL PBS；
B. 吸取25 μL 4单位抗原加入到A1孔中，吹打3～5次充分混匀；
C. 从A1孔中吸取25 μL混匀后的抗原液加到A2孔中，混匀后吸取25μL加入到A3孔中，依次进行系列倍比稀释至A4孔，最后从A4孔各吸取25 μL弃之，A5和A6孔为红细胞对照；
D. 自右向左依次向A6～A1孔中加入25 μL 1%(v/v)醛化绵羊红细胞悬液；
E. 将反应板置于微量振荡器上振荡1 min，室温20～25℃静置60 min后观察结果，在醛化红细胞对照孔即A5和A6孔出现完全沉淀的情况下，其1×单位抗原孔的红血球必须达到100%凝集，同时0.5×单位抗原孔醛化红细胞达到50%凝集50%下沉孔底才符合要求，否则重新调配；
所述1×单位抗原孔为A2孔；所述0.5×单位抗原孔为A3孔；
（2） 取96孔V形微量反应板，用移液器在A1～A11孔各加入25 μL PBS，A12孔加入50 μL PBS；
（3） 在A1孔加入25 μL被检血清或1/2倍稀释的卵黄液，充分混匀后吸取25 μL加至A2孔，依次类推，倍比稀释至A10孔，最后从A10孔各吸取25 μL弃之，设A11孔为ORT抗原对照，A12孔为醛化红细胞对照；
所述卵黄液是取鸡蛋，将蛋壳敲出1小孔暴露卵黄，用不带针头的注射器吸取卵黄2 mL于玻璃瓶中，再加入2mL生理盐水，混匀即为1/2倍稀释的卵黄液；
（4） 在第A1～A11孔各加入25 μL 4单位抗原，置微量振荡器上160转/分钟震荡1分钟，使反应物混合均匀，室温静置30 min；
（5） 自右向左依次向A12～A1孔加入25 μL 1%(v/v)醛化绵羊红细胞悬液；
（6） 将反应板置于微量振荡器上振荡1 min，室温静置60 min后观察结果，在醛化红细胞对照出现完全沉淀、ORT抗原对照出现完全凝集的情况下，以完全抑制醛化红细胞凝集的血清或卵黄最大稀释倍数判为该血清或卵黄的血凝抑制效价，当被检血清或卵黄抗体效价大于等于16即4log2，判为ORT抗体阳性。
3.根据权利要求2所述的一种鸡鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述96孔V型微量反应板中每个孔的具体位置是，将96孔V形微量反应板的8行分别命名为A～H行，12列分别命名为1～12列，如：第1行的第5列孔，则表示为A5孔，第2行的第6列孔，则表示为B6孔。
4.使用权利要求1所述的鸡鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒作为鸡血清或卵黄检测的应用，其特征在于：在临床样品即鸡血清或卵黄检测中，当检测样品即鸡血清或卵黄中无ORT特异性抗体即ORT血清抗体或卵黄抗体时，ORT血凝抗原与醛化红细胞发生凝集，即血凝（hemagglutination, HA)；当检测样品中有ORT特异性抗体时，血凝抗原与抗体发生抗原-抗体反应，血凝被不同程度地抑制，即产生不同程度的血凝抑制（hemagglutination inhibition，HI）。
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