CN107741496B - 一种检测鼻气管鸟杆菌的试剂盒及其制备方法与应用 - Google Patents

一种检测鼻气管鸟杆菌的试剂盒及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术和动物疫病诊断领域，具体公开了一种检测鼻气管鸟杆菌的试剂盒及其制备方法与应用。本发明提取B型鼻气管炎鸟杆菌的脂多糖作为包被抗原，该纯化的抗原对ORT具有很强的特异性、敏感性，可一次性实现对18个血清型ORT的检测，能真实准确地反应鸡群中ORT的抗体水平。本发明使用辣根过氧化物酶标记的兔抗禽IgG作为酶标抗体，可广泛针对禽类，如鸡、鸭和鹅等进行通用性的检测，提高了本试剂盒的通用性。

Description

一种检测鼻气管鸟杆菌的试剂盒及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术和动物疫病诊断领域，具体地说，涉及一种检测鼻气管鸟杆菌的试剂盒。
背景技术
鼻气管炎鸟杆菌病是由鼻气管鸟杆菌(Ornithobacterium rhinotracheale，ORT)引起的肉鸡和火鸡的一种急性、高度接触性呼吸道传染病。该病以呼吸道困难、生长障碍及严重的纤维素性化脓性肺炎和气囊炎为特征。而且易继发或并发大肠杆菌、副鸡嗜血杆菌、败血支原体及传染性支气管炎、新城疫、鸡传染性贫血病等细菌和病毒的感染，导致鸡群出现大量死亡。目前，该病在世界许多国家和地区的流行正呈上升趋势，严重危害养禽业的发展。
ORT与里默氏菌属相似，为rRNA超家族V科的一个新属，该菌从A～R有18个血清型，常见的为A、B、C和D型，不同血清型的菌株毒力有差异，高致病性菌株如A型和B型，主要引起鸡发生临床疾病，且广泛流行。
快速诊断该病是预防和控制ORT病的有效措施之一，对ORT的诊断目前已建立了常规的分离培养、PCR和地高辛标记探针诊断方法。但由于ORT有18个血清型，上述方法需要在事先明确检测目的的情况下，针对某个血清型进行检测，而检测结果仅能判断待检样品是否为该血清型，当待检样品为其他血清型时，无法在一次检测中被鉴定或判断出来。
中国专利申请CN201310340100.4公开了通过筛选ORT高血凝活性菌株，培养、洗涤制备ORT血凝抗原；通过采集绵羊血液，洗涤和离心方法制备绵羊红细胞，用戊二醛固定并用鞣酸鞣化制备醛化绵羊红细胞；通过ORT菌悬多次免疫鸡，采血离心制备ORT标准阳性血清；将制备的ORT血凝抗原、醛化绵羊红细胞和ORT标准阳性血清组装建立鸡鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒。但其在制备抗体过程中使用保藏编号为CCTCC No：M2013318的鸡鼻气管鸟杆菌制作ORT血凝抗原，血凝试验敏感性低，加之ORT血清型有18个之多，通过单一菌株实现对不同血清型的抗体进行检测，难度非常大。
因此，亟需提供一种高通量、高特异性、高灵敏度的检测鸡体内的ORT抗体水平的检测试剂盒。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种检测鼻气管鸟杆菌的试剂盒及其制备方法与应用。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供一种检测鼻气管鸟杆菌的试剂盒，可高通量、高特异性检测鸡体内的ORT抗体水平的检测试剂盒。
所述试剂盒包括：包被有鼻气管鸟杆菌脂多糖的固相载体、酶标抗体、鼻气管鸟杆菌阴性对照血清和阳性对照血清；所述鼻气管鸟杆菌脂多糖来自B型鼻气管炎鸟杆菌。
脂多糖(Lipopolysacchride，LPS)是脂质双层向细胞外伸出，包括类脂A、核心多糖、特异性多糖。类脂A为一种糖磷脂，为革兰氏阴性菌的致病物质，无种属特异性，可做为广谱抗原建立检测方法；核心多糖位于类脂的外层，具有属的特异性，同一属细菌的核心多糖相同；特异性多糖在脂多糖的最外层，是革兰氏阴性菌的菌体抗原(O抗原)，是决定细菌抗原特异性的成分。因此，以LPS为包被抗原建立通用型检测方法，可以最大程度地保证检测方法的特异性、敏感性和通用性，并且LPS抗原制备简单，能够很好地保证所制备抗原的均一性。若以其它膜蛋白为靶抗原建立检测方法，抗原制备工艺复杂，检测方法的通用性、敏感性将会有很大程度的降低，仅适合用于单一血清型抗体检测方法的建立。
其中，所述鼻气管鸟杆菌脂多糖的制备方法为：
(1)将B型鼻气管炎鸟杆菌菌株活化，采用牛肉膏蛋白胨固体培养基划线培养，转接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中摇床培养；
(2)获取菌体培养物，离心，使用PBS重悬菌体沉淀；
(3)向重悬菌体中加入裂解缓冲液，加入氯仿，室温孵育，离心取上清，加入纯化裂解液，混匀孵育，离心，洗涤，干燥后加入Tris-HCL，即得。
进一步地，所述包被有鼻气管鸟杆菌脂多糖的固相载体的制备方法为：
(1)向微孔板的每孔加入含43±5ug/ml B型ORT抗原的包被液，4℃过夜包被10-16h；
(2)每孔加洗涤液进行洗板；
(3)向微孔板的每孔加入封闭液进行封闭；
(4)将微孔板放入恒温恒湿箱，37℃放置2h。
其中，所述封闭液优选为NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH2PO4 0.2g，胎牛血清100mL，蔗糖30g，明胶2.0g，酪蛋白2.0g，硫柳汞0.03g，加纯水定容至1L。
使用本发明所述的封闭液，可使ORT阴性对照及阴性血清OD值显著降低，消除样品中非特异性IgG结合微孔板底的干扰，较好的起到了封闭微孔板底空白位点的作用，4℃放置6个月稳定不沉底不变质。
进一步地，所述试剂盒中的酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗禽IgG。
能更进一步的，所述试剂盒还包括：洗涤缓冲液、样本稀释缓冲液、显色液、终止液和底物液。
所述洗涤缓冲液为：NaCl 80g，KCl 2g，Na2HPO4·12H2O 29g，KH2PO4 2g，吐温-2010ml，加纯水定容至5L；
所述样本稀释缓冲液为：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH2PO4 0.2g，吐温-20 8ml，甘油6ml，马血清50ml，硫柳汞0.03g，加纯水定容至1L。
通过对比本发明所述样本稀释缓冲液与PBS后发现，使用本发明所述样本稀释缓冲液的ORT阴性对照及阴性血清OD值显著降低，与巴氏杆菌、大肠杆菌O78、鸡毒支原体、副鸡嗜血杆菌、传染性法氏囊病毒、新城疫病毒、减蛋综合征病毒、禽流感H9N2和H5N1亚型病毒抗体，降低了非特异性结合，消除假阳性的作用。稳定性试验显示4℃放置6个月稳定不沉底不变质；用样本稀释缓冲液稀释阳性对照至工作浓度，加速破坏性试验显示37℃处理9dOD值降低30％以内。
进一步优选，所述酶标抗体在应用时，使用酶标抗体稀释液对其进行稀释，所述酶标抗体稀释液为NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH2PO4 0.2g，甘油10ml，马血清100ml，酪蛋白3g，蔗糖1.5g，Triton X-100 2.5ml，硫柳汞0.03g，加纯水定容至1L。
使用本发明所述酶标抗体稀释液稀释酶标结合物至工作浓度，经稳定性试验显示4℃放置6个月稳定不沉底不变质，加速破坏性试验显示37℃处理9d灵敏度降低25％以内。
本发明还提供了鼻气管鸟杆菌脂多糖在制备特异性检测鼻气管鸟杆菌抗体试剂或试剂盒中的应用，所述鼻气管鸟杆菌脂多糖来自B型鼻气管鸟杆菌。
进一步地，本发明提供所述试剂盒的使用方法，具体如下：
(1)在A1和A2孔中分别加入100μl阴性对照；在A3和A4孔中分别加入100μl阳性对照；
(2)取100μl经1：40稀释好的待检样品液加入相应孔中，并做好记录；37℃孵育30min；
(3)将各孔的液体弃入废液桶，每孔加300μl的洗涤液进行洗板，重复5次，每次30s；
(4)每孔加100μl酶标结合物；37℃孵育30min；
(5)重复步骤(3)；
(6)每孔加100μl底物液；
(7)室温(15℃-26℃)避光显色孵育10min；
(8)每孔加100μl的终止液；立刻于450nm波长处测定各孔的吸光度值，即OD450nm值；
(9)临界值(C.O.)的计算
正常情况下，阳性对照孔OD450值≥0.4；阴性对照孔OD450值≤0.2；阴性对照孔OD450值大于0.2时应舍弃，如所有阴性对照孔OD450值都大于0.2时须重复实验；
(10)结果判定
检测样品OD450值≥0.267，判定该检测样品为阳性；检测样品OD450值＜0.238，判定该检测样品为阴性；0.238≤检测样品OD450值<0.267为可疑，建议重新样品检测。
需要说明的是，在上述配方上进行的等比例的扩大或缩小与上述配方属于相同的发明构思。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明的有益效果在于：
本发明提取B型鼻气管炎鸟杆菌的脂多糖作为包被抗原，该纯化的抗原具有很强的特异性、敏感性，可一次性实现对18个血清型ORT的检测，能真实准确地反应鸡群中ORT的抗体水平。本发明所述试剂盒，建立了间接ELISA诊断方法，并对实际血清样品进行了检测。本发明使用辣根过氧化物酶标记的兔抗禽IgG作为酶标抗体，可广泛针对禽类，如鸡、鸭和鹅等进行通用性的检测，提高了本试剂盒的通用性。
附图说明
图1为测定包被抗原浓度的标准曲线。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：鼻气管鸟杆菌抗原成分(脂多糖，LPS)的制备
1、鼻气管鸟疫杆菌B型为ORT-SD株，经鉴定为鼻气管鸟疫杆菌(Ornithobacteriumrhinotracheale)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏日期为2017年8月16日，保藏编号为CGMCC No.14529。
2、在37℃菌株活化半小时，采用牛肉膏蛋白胨固体培养基划线培养18h；转接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中摇床培养(200r/min)18小时。
3、菌体培养物，6000g/min离心15分钟，原培养体积1/10的PBS(0.01mol/L，pH值7.4)重悬菌体沉淀。
4、重悬菌体加入1mL裂解缓冲液(Lysis Buffer)，剧烈涡旋混匀；加入200μL氯仿，剧烈涡旋混匀15s，室温孵育5min；4℃，1000g/min离心10min，取上清液加入新1.5mL离心管，加入800μL纯化裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)，混匀，-20℃孵育10min；4℃，1000g/min离心15min，用1mL70％乙醇洗涤2次，待完全干燥后加入70μL Tris-hcl(10mM，Ph8.0)即为脂多糖(LPS)抗原成分。
5、包被抗原成分(脂多糖LPS)含量测定
用蒽酮试剂定量测定提取的抗原成分(脂多糖LPS)进行浓度测定：
①取100mg/L葡萄糖溶液，分别吸取0.05，0.1，0.2，0.4和0.8mL等，然后用蒸馏水补足到1mL，再加入3mL蒽酮试剂，迅速浸入冰水中冷却，待每只试管均加完后，一起浸入沸水浴中维持10min，取出，用自来水冲冷，在室温中平衡10min左右，取200μL加入酶标板孔中，620nm测定，然后用蒸馏水为空白，记录吸光度，绘制标准曲线.
②测定糖含量吸取0.1mL LPS加入0.3mL蒽酮试剂，迅速浸入冰水中冷却，然后浸入沸水浴中维持10min，取出用自来水冲冷，在室温中平衡10min左右，取200μL加入酶标板孔中，620nm测定，记录吸光度。
实施例2：包被有鼻气管鸟杆菌脂多糖(LPS)抗原包被板的制备
1、包被缓冲液稀释的抗原负载于微孔板上
具体的，所述的包被方法包括0.05M pH 9.6碳酸缓冲液做包被液，向微孔板的每孔加入含B型ORT抗原(实施例1制备得到)的包被液0.1ml(包被液中抗原浓度为43±5ug/ml)，4℃过夜包被10-16h。
2、洗板
将各孔的液体弃入废液桶，每孔加300μl的洗涤液(试剂盒内浓缩洗涤液需用蒸馏水或去离子水稀释后方可使用。如有结晶，需先溶解后，方可进行稀释)进行洗板，重复5次，每次30s；最后拍干微孔板。
3、封闭
向微孔板的每孔加入0.25ml封闭液，室37℃放置2h，把孔内封闭液甩掉，最后拍干微孔板。
所述封闭液为NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH2PO4 0.2g，胎牛血清100mL，蔗糖30g，明胶2.0g，酪蛋白2.0g，硫柳汞0.03g，加纯水定容至1L。
4、干燥
具体的，将微孔板放入恒温恒湿箱，37℃放置2h。
5、包装
具体的，将96孔板放入铝箔袋，加防潮剂，真空包装机封口4℃保存。
实施例3：试剂盒的制备
本实施例所用的鼻气管鸟杆菌B型菌株，为实施例1所述的保藏编号为CGMCCNo.14529的鼻气管鸟杆菌B型菌株。
一、阳性血清和阴性血清的制备
1、阳性血清制备
21日龄SPF鸡10只，颈部皮下注射B型鼻气管鸟杆菌油佐剂疫苗0.5mL(疫苗均由自山东绿都生物科技有限公司配制)，一免后10d进行第二次免疫，剂量同前；二免后7d，采血分离血清，用琼脂凝胶扩散沉淀试验测定其抗体效价；抗体效价≥1：16，则进行大量采血并制备血清，于-20℃保存备用。
2、阴性血清制备
采集分离30日龄SPF鸡血清，琼脂凝胶扩散沉淀试验测定抗体为阴性，进行大量采血并制备血清，于-20℃保存备用。
二、试剂盒的制备与组成
所述试剂盒包括：
1、实施例2制备的抗原包被板；
2、酶标抗体：抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗禽IgG，抗体的稀释液为：NaCl8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH2PO4 0.2g，甘油10ml，马血清100ml，酪蛋白3g，蔗糖1.5g，Triton X-100 2.5ml，硫柳汞0.03g，加纯水定容至1L；
3、洗涤缓冲液：NaCl 80g，KCl 2g，Na2HPO4·12H2O 29g，KH2PO4 2g，吐温-20 10ml，加纯水定容至5L；
4、样本稀释缓冲液：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH2PO4 0.2g，吐温-20 8ml，甘油6ml，马血清50ml，硫柳汞0.03g，加纯水定容至1L；
5、显色液；
6、终止液：1M HCl，4℃保存；
7、底物液：可溶型单组份型TMB底物溶液；
8、阴性对照和阳性对照：
阴性对照：以样本稀释缓冲液将不含ORT特异性抗体的阴性鸡血清做40倍稀释，每一试剂盒装有1支体积为1ml的阴性对照，4℃保存；
阳性对照：以样本稀释缓冲液将含ORT特异性抗体的阳性鸡血清做40倍稀释，每一试剂盒装有1支体积为1ml的阳性对照，4℃保存；
所述阴性鸡血清和阳性鸡血清为本实施例步骤一制备的阳性血清和阴性血清。
实施例4：鼻气管鸟杆菌酶联免疫检测试剂盒的应用
1、A1和A2孔中分别加入100μl阴性对照；在A3和A4孔中分别加入100μl阳性对照；
2、取100μl经1：40稀释好的待检样品液加入相应孔中，并做好记录；37℃孵育30min；
3、将各孔的液体弃入废液桶，每孔加300μl的洗涤液(试剂盒内浓缩洗涤液需用蒸馏水或去离子水稀释后方可使用。如有结晶，需先溶解后，方可进行稀释)进行洗板，重复5次，每次30s；
4、每孔加100μl酶标结合物；37℃孵育30min；
5、重复步骤3；
6、每孔加100μl底物液；
7、室温孵育10min(避光显色)；
8、每孔加100μl的终止液；立刻于450nm波长处测定各孔的吸光度值，即OD450nm值。
9、临界值(C.O.)的计算
正常情况下，阳性对照孔OD450值≥0.4；阴性对照孔OD450值≤0.2；阴性对照孔OD450值大于0.2时应舍弃，如所有阴性对照孔OD450值都大于0.2时须重复实验；
10、结果判定
检测样品OD450值≥0.267，判定该检测样品为阳性；检测样品OD450值＜0.238，判定该检测样品为阴性；0.238≤检测样品OD450值<0.267为可疑，建议重新送样品检测。
实施例5：试剂盒敏感性试验
本实施例对实施例3制备的试剂盒进行敏感性检测。
结果如表1所示，所述试剂盒对强阳性血清样品的最低检出限量为1:2560倍，对阳性血清样品的最低检出限量为1:1280倍，对弱阳性血清样品的最低检出限量为1:640倍。对阴性血清样品的检测结果均为阴性。
表1试剂盒敏感性检测试验数据
实施例6：试剂盒特异性试验
本实施例对实施例3制备的试剂盒进行特异性检测。
具体的，检测山东绿都生物科技有限公司提供的禽巴氏杆菌(Avian Pasteure，AP)大肠杆菌O78(E.coli O78)、鸡毒支原体(Mycoplasma Galliscepticum，MG)、副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum，HP)、传染性法氏囊病毒(Infectious bursaldisease virus，IBDV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、减蛋综合征病毒(Egg drop syndrome virus，EDS)、禽流感H9N亚型(Avian influenza virus，AIV H9N2)和H5亚型病毒(AIV H5H1)的特异性抗体；德国Hafez教授友情馈赠的C-R等16种ORT的阳性血清。检测结果如表2所示，山东绿都生物科技有限公司提供的相关抗体检测结果均为阴性，而馈赠的16种ORT阳性血清检测均为阳性，表明所述试剂盒具有好的特异性。
表2 ORT试剂盒特异性实验检测数据
实施例7：试剂盒重复性试验
本实施例对实施例3制备的试剂盒进行重复性检测。
具体的，检测6份ORT抗体水平不同的临床鸡血清，每份血清平行做5个重复，得出批内重复性实验的变异系数为4.54％，小于5％(见表3)；选择5个不同批次的所述试剂盒分别检测6份临床鸡血清，数据显示批间重复性实验的变异系数为8.41％，小于10％(见表4)。由此可见，所述试剂盒具有良好的重复性。
表3试剂盒批内重复性试验数据
表4试剂盒批间重复性试验数据
实施例8：鼻气管鸟杆菌酶联免疫检测试剂盒临界值确定
1、临界值的建立：选取30阴性血清(包含15份鸡血清、15份鸭血清)，用所建立的ELISA方法进行检测，测定OD450nm值，进行统计学分析，计算出血清样本平均OD值和标准差SD，根据公式计算其判定标准的临界值(结果见表5)。
表5 30份阴性血清检测OD值
2、检测结果判定标准：统计分析，30份血清样品的平均值为0.147，标准差为0.025，平均值+2倍标准差＝0.197，平均值+3倍标准差＝0.222，即样品的OD450值大≥0.222判定为阳性，＜0.197判定为阴性，在二者之间为可疑，建议重新送检样品。
实施例9：试剂盒稳定性试验
本实施例对实施例3制备的试剂盒进行稳定性检测。
具体的，选择4个相同批次的所述试剂盒分别37℃放置0d、37℃放置3d、37℃放置6d、37℃放置9d，同时检测20份临床鸡血清；37℃放置3d敏感性下降6.77％，37℃放置6d敏感性下降9.97％，小于10％，37℃放置9d敏感性下降16.02％，小于20％(见表6)。加速破坏性试验显示，所述的ELISA试剂盒具有好的稳定性。
表6试剂盒稳定性试验数据
应当理解的是，对上述实施例所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述实施例的实质相同。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.B型鼻气管炎鸟杆菌脂多糖在制备用于检测多种血清型鼻气管鸟杆菌的试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括：包被有鼻气管鸟杆菌脂多糖的固相载体、酶标抗体、鼻气管鸟杆菌阴性对照血清和阳性对照血清；所述鼻气管鸟杆菌脂多糖来自B型鼻气管炎鸟杆菌；
所述鼻气管鸟杆菌脂多糖的制备方法为采用脂多糖提取试剂盒提取：
(1)将B型鼻气管炎鸟杆菌菌株活化，采用牛肉膏蛋白胨固体培养基划线培养，转接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中摇床培养；
(2)获取菌体培养物，离心，使用PBS重悬菌体沉淀；
(3)向重悬菌体中加入裂解缓冲液，加入氯仿，室温孵育，离心取上清，加入纯化裂解液，混匀孵育，离心，洗涤，干燥后加入Tris-HCL，即得；
所述包被有鼻气管鸟杆菌脂多糖的固相载体的制备方法为：
(1)向微孔板的每孔加入含43±5ug/ml B型ORT抗原的包被液，4℃过夜包被10-16h；
(2)每孔加洗涤液进行洗板；
(3)向微孔板的每孔加入封闭液进行封闭；
(4)将微孔板放入恒温恒湿箱，37℃放置2h；
所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗禽IgG。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述封闭液为NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH2PO4 0.2g，胎牛血清100mL，蔗糖30g，明胶2.0g，酪蛋白2.0g，硫柳汞0.03g，加纯水定容至1L。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括：洗涤缓冲液、样本稀释缓冲液、显色液、终止液、底物液。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，使用酶标抗体稀释液稀释酶标抗体，所述酶标抗体稀释液为NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH2PO4 0.2g，甘油10ml，马血清100ml，酪蛋白3g，蔗糖1.5g，Triton X-100 2.5ml，硫柳汞0.03g，加纯水定容至1L。
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