CN104749368A - 鸭坦布苏病毒单克隆抗体及应用 - Google Patents

鸭坦布苏病毒单克隆抗体及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了鸭坦布苏病毒单克隆抗体及应用。用纯化的鸭坦布苏病毒免疫Balb/c小鼠，得到两株抗鸭坦布苏病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株1-E11，保藏编号CCTCC NO: C2014219和杂交瘤细胞株4-C3，保藏编号CCTCC NO：C2014220；利用该细胞株分泌的单抗制备胶体金试纸条，以1-E11作为标记单抗，4-C3作为包被单抗，获得的试纸条具有检测快速，灵敏，特异性好的特点。结果清晰易于判断。便于携带和使用，节约了疾病检测成本。

Description

鸭坦布苏病毒单克隆抗体及应用
技术领域
本发明涉动物病毒学与免疫学检测技术领域，具体涉及一种鸭坦布苏病毒单克隆抗体及应用。
背景技术
鸭坦布苏病毒病是黄病毒科黄病毒属坦布苏病毒(Duck tembus virus,DTMUV)引起的以鸭死亡和蛋鸭产蛋下降为特征的新发传染病。黄病毒属的其他类病毒有乙脑病毒、西尼罗病毒、登革热病毒等。
自2010年以来我国大部分种鸭和蛋鸭养殖地区相继发生了以减料、产蛋下降和伴有一定死淘率为特征的传染病。该病大范围爆发首先发生在2010年4-6月份，发病地点主要集中在种鸭和蛋鸭养殖比较密集的福建、浙江、安徽等地，随后又迅速波及河南、山东等地。感染鸭中以麻鸭最多，其次是樱桃谷种鸭，番鸭最少，肉鸭和鹅也有感染报道，部分人在蛋鸡中也分离到了鸡坦布苏病毒。该病主要为水平传播，特别是经呼吸道传播途径，动物的采食及饮水都成为了该病传播的可能。
鸭坦布苏病毒病主要引起蛋鸭及种鸭的产蛋急剧下降，同时伴有体温轻微上升，出现流泪、拉黄绿色稀便等临床症状，在感染该病3～5天后会出现采食量下降的症状，在发病后期会出现跛行、站立不稳甚至瘫痪等神经症状。鸭坦布苏病毒感染雏鸭后会引起雏鸭的死亡。
由于鸭坦布苏病是2010年新出现的疾病，目前还没有快速诊断技术，实验室诊断包括病毒分离鉴定、病原学和血清学试验，目前的诊断DTMUV方法有:RT-PCR法(快速、简单)、套式PCR(灵敏度高)、Real-time PCR(可定量,灵敏度闻)等。虽然这些检测技术给鸭坦布苏病在临床诊断上提供了准确可靠的数据，为鸭坦布苏病的防治做出了巨大的贡献，但是这些检测技术仍然耗时费力，切需要专门设备和具有专业技术的人才可操作，不适合大量的临床检测。因此，在此技术上北京市动物疫病预防控制中心发明了鸭坦布苏病毒单克隆抗体、抗原检测试剂盒及应用方法(201410314144.4)，解决了临床诊断需要批量操作的瓶颈，大大的提高了检测效率。但是ELISA检测技术仍然具有其局限性，因为ELISA检测技术仍然偏向于实验室检测，需要专业的人员和设备，仍然做不到快速检测。
因此本发明也是在基于此用鸭坦布苏病毒单克隆抗体制备免疫胶体金试剂盒。与申请号为201410314144.4的发明专利申请的技术方案不同的是，本发明在单克隆抗体的特异性和灵敏性上特别高。北京市动物疫病预防控制中心的申请中，将已测定毒价8.7×105pfu/0.1ml的鸭坦布苏病毒进行倍比稀释，最低检测浓度为1.09×104pfu/0.1ml(0.763×104TCID50/0.1ml)，即稀释至80倍。而本发明的胶体金试纸条在将鸭坦布苏病毒倍比稀释至8.14×103TCID50/0.1ml仍然检测的出来。(病毒粒子pfu和TCID50换算公式：PFUs＝0.7×TCID50)ELISA和胶体金检测技术的优缺点
ELISA检测技术的基本原理
Elisa的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体即保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，首检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体其反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相载体上的酶量与标本中受量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
Elisa的优点
(1)敏感性高，一般是胶体金产品的10倍的灵敏度。
(2)特异性取决于抗原抗体制备，特异性很高，假阳性和假阴性均比胶体金法低很多。
(3)重复性高，一般批内小于5％，批间小于10％。
(4)结果判断客观，并且是定量的分析样品的浓度。
(5)分析自动化可以，用大型的自动酶标仪，包括加样、洗涤、显色、读数等一系列过程可自动完成。
(6)主要设备酶标仪
(7)实验成本低，特别是检测大量样本时，明显降低单个的检测时间及成本。
(8)试剂稳定性低温保存一般可以保存一年
(9)应用范围主要应用于实验室诊断，需要专业人才才能做到
胶体金方法
免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。原理略
胶体金的主要特点
(1)操作简单无需专业知识或操作经验即可完成，也无需任何仪器。
(2)检测时间短通常加样后5—10分钟可得到结果
(3)便携方便携带，现场检测。
(4)保存方便通常在室温下可以稳定保存1年以上
免疫胶体金技术自问世以来得到了迅速的发展，在动物疫病检测领域应用广泛，特别是胶体金免疫技术具有操作简单、检测快速灵敏、结果清晰易于判断、无需仪器设备等优点，适合临床的快速诊断和基层流行病学调查大规模应用。将免疫胶体金技术应用于体外快速检测和诊断鸭坦布苏病毒在国内未见报道，本检测卡敏感性高，特异性好。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种鸭坦布苏病毒单克隆抗体，它们是分别由保藏号为C2014219或C2014220的细胞株的杂交瘤细胞株分泌的。保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心。本发明的另一个目的是在于提供了一种检测鸭坦布苏病毒的免疫胶体金试纸条，该试纸操作简单、检测快速、灵敏、结果清晰易于判断。
本发明的另一个目的是在于提供了一种检测鸭坦布苏病毒免疫胶体金试纸条的制备方法，试纸条制备过程简单，原辅料廉价易得，胶体金试纸条操作简单，临床使用中不需要任何设备，便于携带和使用。
本发明的最后一个目的在于提供了鸭坦布苏病毒单克隆抗体在制备鸭坦布苏病毒检测试剂盒中的应用，利用该单克隆抗体可以制备本领域常规的检测试剂盒，包括ELISA试剂盒，免疫胶体金试纸等。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
本发明提供了鸭坦布苏病毒单克隆抗体，该单克隆抗体由杂交瘤细胞株1-E11(保藏编号CCTCC NO:C2014219)或杂交瘤细胞株4-C3(保藏编号CCTCC NO：C2014220)分泌得到。
所述的杂交瘤细胞株由以下方法获得：
(1)制备纯化的鸭坦布苏病毒：将鸭坦布苏病毒XN株(鸭坦布苏病毒XN株的分离鉴定，晁行周等)在鸡胚上增值，72小时后收取尿囊液，提取病毒RNA鉴定，鉴定正确，超速离心，重悬后蔗糖梯度离心，用灭菌PBS重悬沉淀，再次取少量进行鉴定，鉴定正确后以此作为免疫原。
(2)筛选抗鸭坦布苏病毒阳性杂交瘤细胞株：
(a)制备脾细胞：用步骤(1)所得的鸭坦布苏病毒100μg/200μL与等体积的弗氏完全佐剂乳化后皮下注射免疫6～8周龄的雌性Balb/c小鼠；2周后，用纯化的鸭坦布苏病毒100μg/200μL与等体积的弗氏不完全佐剂乳化皮下注射免疫一次；再间隔2周，用纯化的鸭坦布苏病毒100μg/200μL与等体积的弗氏不完全佐剂乳化皮下注射免疫；10天后测定免疫效果；对免疫效价高的小鼠在融合前3天腹腔注射鸭坦布苏病毒抗原100μg/200μL；取小鼠脾脏，充分研磨，1640培养液洗涤，离心重悬后得到了脾细胞。
(b)细胞融合：分别取1.0×108个脾细胞和1.0×107个骨髓瘤细胞悬液，合并加入到圆底离心管中1000rpm离心5min，弃上清液；沉淀细胞中缓缓加人50％(v/v)PEG4000混匀，融合后静置1分钟，加入不完全培养液1640终止融合；将反应终止后的细胞悬液1000rpm离心5min，弃上清液，加入HAT选择培养液轻轻重悬；以每孔100μL的量加入到已准备好的含饲养细胞的96孔细胞培养板中，置5％(v/v)CO2、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中培养，培养4天后换完全培养液培养。
(c)筛选单克隆抗体及克隆化：待杂交瘤细胞长满孔底1/10～1/5时，换液后取细胞培养上清液用间接ELISA进行检测。检测到有8个强阳性的孔，用有限稀释法进行亚克隆和克隆，经过3次克隆化操作后，所有的克隆化细胞孔检测阳性率为100％，即可确定已获得了分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将细胞株扩大培养并且冻存。
通过大量筛选工作，最终获得了两株杂交瘤细胞株，该两株杂交瘤细胞株已于2014年11月25号送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：杂交瘤细胞株1-E11，保藏编号CCTCC NO:C2014219；分类命名：杂交瘤细胞株4-C3，保藏编号CCTCC NO：C2014220；地址：中国武汉武汉大学。其中杂交瘤细胞株1-E11分泌的单抗1-E11为标记单抗，杂交瘤细胞株4-C3分泌的单抗为包被单抗。
所述的杂交瘤细胞株1-E11和杂交瘤细胞株4-C3可以在含有20％胎牛血清的RPMI-1640培养基中以半贴壁方式生长，生长环境为37℃，5％CO2的培养箱。该杂交瘤细胞株为浑圆透亮，成簇生长，并能稳定的分泌抗鸭坦布苏病毒的单克隆抗体。该细胞由骨髓瘤细胞SP2/0和免疫脾细胞融合而得，染色体计数结果显示该杂交瘤细胞株染色体为90条(介于骨髓瘤细胞SP2/0的染色体数目70条和BALB/c小鼠脾细胞的染色体数目40条之间)。
鸭坦布苏病毒单克隆抗体在制备鸭坦布苏病毒检测试剂盒中的应用，包括利用单克隆抗体1-E11和4-C3制备常规的鸭坦布苏病毒检测试剂盒，包括ELISA试剂盒，免疫胶体金试纸等，其中优选的，1-E11为标记单抗，4-C3为包被单抗。
一种能检测鸭坦布苏病毒免疫胶体金试纸条，所述的试纸条包括有硬质聚氯乙烯背衬板、硝酸纤维素膜、胶体金结合垫、样品垫、吸水垫。其特征在于：硝酸纤维素膜粘贴在硬质聚氯乙烯背衬板上面，在硝酸纤维膜的一端粘贴有胶体金结合垫，在胶体金结合垫上粘贴有样品垫，吸水垫置于硝酸纤维素膜的另一端上面。
所述的样品垫具体为缓冲液A处理过的吸水纸。缓冲液A配方为：0.4mol/L的Tris-Cl，pH 9.0。
所述的吸水垫具体为裁切过的吸水纸。
所述的胶体金结合垫喷涂有抗鸭坦布苏病毒的单克隆抗体1-E11-胶体金标记物。
所述的硝酸纤维素膜上分别喷涂有抗鸭坦布苏病毒的单克隆抗体4-C3检测线和兔抗鼠抗体的质控线。
一种能检测鸭坦布苏病毒的免疫胶体金试纸条的制备方法，它包括以下步骤：
(1)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金：已硅化的瓶子中入125mL注射用水，再加入1.2mL 1％(w/v)氯金酸，放入微波炉中火加热4min；迅速一次加入1.8mL的1.05％(w/v)柠檬酸三钠水溶液后中火加热5min，室温(20～25℃，)下自然冷却，即为胶体金溶液。
(2)胶体金的标记：将上述步骤(1)所得的胶体金用0.2mol/L碳酸钾调节pH值到8.0；加入单克隆抗体1-E11，每1mL胶体金溶液的最适当单克隆抗体的标记量为9.6μg，缓慢搅拌40min得到抗鸭坦布苏病毒单克隆抗体-胶体金标记物；在搅动下，加入10％BSA(w/v)溶液封闭40min；将标记好的胶体金溶液8800rpm离心30min后重悬喷涂在胶体金结合垫上。
(3)制备胶体金结合垫：
(a)配制包被液：0.05mol/L pH 9.0Tris缓冲液、0.5％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮K40(PVP K40)、3％(w/v)蔗糖、0.5％(w/v)吐温20搅拌均匀后滤纸过滤。
(b)制备胶体金结合垫：将玻璃纤维素膜浸泡在上述包被液中30min，37℃烘箱中烘干；上述步骤(2)制备的胶体金标记的抗鸭坦布苏病毒的单克隆抗体1-E11(杂交瘤细胞株1-E11分泌，保藏编号CCTCC NO:C2014219分泌)喷涂于处理过胶体金结合垫上，喷量为10μL/cm，于37℃烘箱中烘干，裁切成宽0.5cm条状备用。
(4)喷涂检测线和质控线：
(a)配制包被液：0.02mol/L pH 7.2磷酸盐缓冲液(PBS)、1.0％(w/v)海藻糖、1.0％(w/v)山梨醇、0.3％(w/v)吐温20、搅拌均匀后0.22μm滤膜过滤。
(b)将抗鸭坦布苏病毒的单抗4-C3(杂交瘤细胞株4-C3，保藏编号CCTCC NO：C2014220分泌)用上述包被液稀释后，喷涂于硝酸纤维素膜(Millipore HF135)上作为检测线，抗鸭坦布苏病毒单抗4-C3浓度为1.5mg/mL，喷量为1μL/cm；喷涂在硝酸纤维素膜上质控线上兔抗鼠抗体(购于武汉博士得生物工程有限公司)浓度为1.5mg/mL，喷量为1μL/cm，检测线和质控线的距离是5mm，于37℃烘箱中烘干备用。
(5)处理样品垫：将吸水纸浸泡在缓冲液中30min，37℃烘箱中烘干，裁切成宽为1.5cm条状备用。上述的缓冲液配方为：0.4mol/L的Tris-Cl，pH 9.0。
(6)试纸的组装：将处理好的样品垫、喷有抗鸭坦布苏病毒单克隆抗体-胶体金标记物的胶体金结合垫、喷有抗鸭坦布苏病毒抗体的检测线的硝酸纤维素膜、吸水垫按顺序依次粘贴在硬质聚氯乙烯上组成试纸条，即得。
本发明利用胶体金标记显色的免疫反应制备能检测鸭坦布苏病毒免疫胶体金试纸，结构合理，建立竞争免疫层析检测待检测样本中是否含有鸭坦布苏病毒。
与现有技术相比，本发明具有以下突出优点：
(1)适用于鸭坦布苏病毒的快速检测，本试纸条检测结果特异性强，灵敏度高。鸭坦布苏病毒倍比稀释至8.14×103TCID50/0.1ml仍然检测的出来。临床上鸭坦布苏病毒诊断常PCR，120份被检测鸭坦布苏病疑似病例鸭的眼泪、病死脏器的样本中，用PCR检测阳性为31份，阴性89份，用本发明的试纸条检测阳性为45份，阴性为75份，(用ELISA检测ELISA检测用4-C3细胞株分泌的抗体进行包被，用HRP标记1-E11细胞株分泌的抗体，建立常规的双抗体夹心ELISA)阳性36份，阴性84份。结果显示：鸭坦布苏病用本发明试纸条检测阳性率为37.5％，PCR检测阳性率为25.8％，ELISA检测阳性率为30％
(2)本发明的试纸条不需要任何仪器设备，携带方便，检测成本低。
(3)本发明的试纸条操作简单易于掌握，无需专业人员操作。
(4)本发明的试纸条保存方便，稳定性好。常温保存12个月试纸条与4℃保存的检测结果一致。
附图说明
图1为一种检测鸭坦布苏病毒的免疫胶体金试纸条的结构示意图。
其中：1为硬质聚氯乙烯背衬板、2为硝酸纤维素膜、3为样品垫、4为胶体金结合垫、5为吸水垫、6为检测线，7为质控线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为常规技术，所用试剂或原料，如未特别说明，均已公开。
实施例1：
鸭坦布苏病毒单克隆抗体制备，包括以下步骤：
(1)制备纯化的鸭坦布苏病毒：将将鸭坦布苏病毒XN株(鸭坦布苏病毒XN株的分离鉴定，晁行周等)在鸡胚上增值，72小时后收取尿囊液，提取病毒RNA鉴定，鉴定正确，超速离心，重悬后蔗糖梯度离心，用灭菌PBS重悬沉淀，再次取少量进行鉴定，鉴定正确后以此作为免疫原。
(2)筛选抗鸭坦布苏病毒阳性杂交瘤细胞株：
(a)制备脾细胞：用步骤(1)所得的鸭坦布苏病毒100μg/200μL与等体积的弗氏完全佐剂乳化后皮下注射免疫6～8周龄的雌性Balb/c小鼠；2周后，用纯化的鸭坦布苏病毒100μg/200μL与等体积的弗氏不完全佐剂乳化皮下注射免疫一次；再间隔2周，用纯化的鸭坦布苏病毒100μg/200μL与等体积的弗氏不完全佐剂乳化皮下注射免疫；10天后测定免疫效果；对免疫效价高的小鼠在融合前3天腹腔注射鸭坦布苏病毒抗原100μg/200μL；取小鼠脾脏，充分研磨，1640培养液洗涤，离心重悬后得到了脾细胞。
(b)细胞融合：分别取1.0×108个脾细胞和1.0×107个骨髓瘤细胞悬液，合并加入到圆底离心管中1000rpm离心5min，弃上清液；沉淀细胞中缓缓加人50％(v/v)PEG4000混匀，融合后静置1分钟，加入不完全培养液1640终止融合；将反应终止后的细胞悬液1000rpm离心5min，弃上清液，加入HAT选择培养液轻轻重悬；以每孔100μL的量加入到已准备好的含饲养细胞的96孔细胞培养板中，置5％(v/v)CO2、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中培养，培养4天后换完全培养液培养。
(c)筛选单克隆抗体及克隆化：待杂交瘤细胞长满孔底1/10～1/5时，换液后取细胞培养上清液用间接ELISA进行检测。检测到有8个强阳性的孔，用有限稀释法进行亚克隆和克隆，经过3次克隆化操作后，所有的克隆化细胞孔检测阳性率为100％，即可确定已获得了分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将细胞株扩大培养并且冻存。
融合细胞筛选
1-E11 2-E8 3-D6 4-C3 5-G8 7-B8
第一次亚克隆 0.423 0.396 0.658 0.532 0.486 0.247
第二次亚克隆 0.618 0.994 1.107 1.738 0.865 0.759
第三次亚克隆 1.228 2.552 2.214 2.589 1.115 0.981
第四次亚克隆 1.758 2.744 2.911 3.086 1.432 1.509
经过4次亚克隆后，获得了6株高分泌抗体株杂交瘤细胞株，经过亚型鉴定1-E11、2-E8、3-D6、4-C3四株细胞为IGg,5-G8、7-B8为IGm
纯化后包被单抗与酶标单抗的配对实验
将4株IGg同过辛酸-硫酸铵纯化后，分别用HRP进行标记，通过包被单抗与酶标单抗的配对实验，筛选出两组最佳配对组合，4-C3HRP和包被1-E11、1-E11-HRP和包被4-C3，本发明选用的是包被4-C3(杂交瘤细胞株4-C3，保藏编号CCTCC NO：C2014220；地址：中国武汉武汉大学)和标记1-E11(保藏编号CCTCC NO:C2014219；地址：中国武汉武汉大学)的组合。
至此获得了两株杂交瘤细胞株，该两株杂交瘤细胞株已于2014年11月25号送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：杂交瘤细胞株1-E11，保藏编号CCTCC NO:C2014219；分类命名：杂交瘤细胞株4-C3，保藏编号CCTCC NO：C2014220；地址：中国武汉武汉大学。
(3)制备鸭坦布苏病毒单克隆抗体：取8周龄以上的雌性Balb/C小鼠，腹腔注射灭菌石蜡0.5mL；7天后，将所得的杂交瘤细胞株扩大培养，收集生长良好的杂交瘤细胞株，1000r/min离心5min，弃上清液，将沉淀重悬于无血清培养液中，并调整细胞密度为(2～5)×106个/mL，每只小鼠腹腔注射1mL细胞悬液；7～10天后，取小鼠腹部明显膨大，收取腹水，所得腹水效价可达到1:51200(杂交瘤细胞株1-E11，保藏编号CCTCC NO:C2014219)和1:102400(杂交瘤细胞株4-C3，保藏编号CCTCC NO：C2014220)；4℃放置过夜，12000rpm离心10min，取上清；用辛酸-硫酸铵两步沉淀法纯化腹水，测定浓度后分装冻存；获得的单抗仅与鸭坦布苏病毒发生特异性反应，而与其他病毒如流感病毒(H5N1)、流感病毒(H9N2)、鸭瘟病毒、亚肝炎病毒，鸭大肠杆菌、鸭沙门氏菌、鸭疫李氏杆菌都没有交叉反应。
实施例2：
一种检测鸭坦布苏病毒的免疫胶体金试纸条：
它由硬质聚氯乙烯背衬板1、硝酸纤维素膜2、胶体金结合垫4、样品垫3、吸水垫5、检测线6，质控线7组成，其特征在于：硝酸纤维素膜2粘贴在硬质聚氯乙烯背衬板1上面，在硝酸纤维膜2上面靠左侧由下而上依次粘贴有胶体金结合垫4、样品垫3，吸水垫5，设置在硝酸纤维膜2上面靠右侧的位置。胶体金结合垫4由玻璃纤维素膜制成，该胶体金结合垫4上喷涂的是胶体金标记的抗鸭坦布苏病毒的单克隆抗体1-E11(杂交瘤细胞株1-E11，保藏编号CCTCC NO:C2014219分泌)，硝酸纤维素膜2为试纸条的检测膜，上面靠左侧的是检测线6，质控线7位于右侧，两条线的间隔距离是5mm，检测线6和质控线7分别喷涂的是鸭坦布苏病毒的单克隆抗体4-C3(杂交瘤细胞株4-C3，保藏编号CCTCC NO：C2014220分泌)和兔抗鼠抗体。当被检测样本中含有鸭坦布苏病毒时，病毒可分别先与金标抗鸭坦布苏病毒单克隆抗体结合，然后在层析作用下与相应检测线上的抗体结合而聚集后形成肉眼可见的色带，进而根据显色结果进行判定。
实施例3：
一种检测鸭坦布苏病毒免疫胶体金试纸条的制备方法，其步骤是：
(1)按照实施例1的方法制备鸭坦布苏病毒单克隆抗体。
(2)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金：已硅化的瓶子中入125mL注射用水，再加入1.2mL 1％(w/v)氯金酸，放入微波炉中火加热4min；迅速一次加入1.8mL的1.05％(w/v)柠檬酸三钠水溶液后中火加热5min，室温下自然冷却，即为胶体金溶液。制备的胶体金外观呈清亮透明的酒红色，通过分光光度计扫描在450-600nm处光谱，最大吸收波长为520nm，通过电镜观察颗粒大小均匀。
(3)鸭坦布苏病毒单克隆抗体胶体金标记：
(a)确定最佳标记量和最佳标记pH值：将上述步骤(2)所得的胶体金用0.2mol/L碳酸钾调节pH值分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0；取各pH的胶体金溶液l mL于一系列PE管中混匀，在以上各pH条件下用胶体金标记抗鸭坦布苏病毒单克隆抗体(杂交瘤细胞株1-E11，保藏编号CCTCC NO:C2014219分泌)(浓度调整为1.0mg/mL)，蛋白标记量分别为1μg、2μg、5μg、8μg、10μg、15μg、20μg，混匀后静置30min；离心去除沉淀后测各个试管的OD520nm，以OD520nm值最大时的pH(8.0)为最佳pH值。当胶体金标记的最佳pH值为8.0，胶体金中单克隆抗体添加量为8μg时，对应的吸收峰最大，在此基础上再加20％，即每1mL胶体金溶液的最适当单克隆抗体的标记量为9.6μg。
(b)鸭坦布苏病毒单克隆抗体胶体金标记：于广口瓶中加入100mL的胶体金，0.1mol/L碳酸钾调节pH为8.0后，边磁力搅拌边滴加单克隆抗体1-E11(杂交瘤细胞株1-E11分泌，保藏编号CCTCC NO:C2014219)加入0.96mg，搅拌40min；加入10％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)至终浓度为1％(BSA的量)，继续搅拌40min；分装于50mL离心管中，8800r/min离心30min，弃去上清，加入重悬液10mL。
(4)制备胶体金结合垫：
(a)配制包被液：0.05mol/L pH 9.0Tris缓冲液、0.5％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮K40(PVP K40)、3％(w/v)蔗糖、0.5％(w/v)吐温20搅拌均匀后滤纸过滤。
(b)制备胶体金结合垫：将玻璃纤维素膜浸泡在上述包被液中30min，37℃烘箱中烘干；上述步骤(3)制备的胶体金标记的抗鸭坦布苏病毒的单克隆抗体1-E11(杂交瘤细胞株1-E11分泌，保藏编号CCTCC NO:C2014219分泌)喷涂于处理过胶体金结合垫上，喷量为10μL/cm，于37℃烘箱中烘干，裁切成宽0.5cm条状备用。
(5)喷涂检测线和质控线：
(a)配制包被液：0.02mol/L pH 7.2磷酸盐缓冲液(PBS)、1.0％(w/v)海藻糖、1.0％(w/v)山梨醇、0.3％(w/v)吐温20、搅拌均匀后0.22μm滤膜过滤。
(b)将抗鸭坦布苏病毒的单抗4-C3(杂交瘤细胞株4-C3，保藏编号CCTCC NO：C2014220分泌)用上述包被液稀释后，喷涂于硝酸纤维素膜(Millipore HF135)上作为检测线，抗鸭坦布苏病毒的单抗4-C3浓度为1.5mg/mL，喷量为1μL/cm；喷涂在硝酸纤维素膜上质控线上兔抗鼠抗体(购于武汉博士得生物工程有限公司)浓度为1.5mg/mL，喷量为1μL/cm，检测线和质控线的距离是5mm，于37℃烘箱中烘干备用。
(6)处理样品垫：将吸水纸浸泡在缓冲液中30min，37℃烘箱中烘干，裁切成宽为1.5cm条状备用。上述的缓冲液配方为：0.4mol/L的Tris-Cl，pH 9.0。
(7)试纸的组装：将处理好的样品垫、喷有抗鸭坦布苏病毒单克隆抗体-胶体金标记物的胶体金结合垫、喷有抗鸭坦布苏病毒抗体的检测线的硝酸纤维素膜、吸水垫按顺序依次粘贴在硬质聚氯乙烯上组成试纸条。
本发明检测鸭坦布苏病毒免疫胶体金试纸条的使用方法如下：
(1)样品的预处理：将收集到的鸭的组织如鸭的眼泪，脑组织，卵巢组织，肝脏组织或病死鸭的组织样品，各有阴性样本作对照。将样本每份取约1g(mL)左右，加生理盐水约1mL，制成混悬液(粪便样本充分混匀后静置5min，或者离心)。
(2)检测：分别取上清液约120μL滴在本发明试纸上，15min后观察结果。同时分别取120μL生理盐水和已知的(8.14×106 TCID50/0.1ml)的鸭坦布苏病毒培养液1:1000倍稀释滴加在试纸上做阴性和阳性对照试验。
(3)结果判定：在质控线、检测线上均出现红色时，为鸭坦布苏病毒阳性，即样本中含有鸭坦布苏病毒，检测线不出现红色为鸭坦布苏病毒阴性，即样本中不含有鸭坦布苏病毒。若质控线未出现红色线，则试纸无效。
实施例3：
鸭坦布苏病毒单克隆抗体在制备鸭坦布苏病毒检测试剂盒中的应用：
本实施例使用的是实施例2制备的免疫胶体金试纸条。
(1)特异性试验：用生理盐水对已知的如流感病毒(H5N1)、流感病毒(H9N2)、鸭瘟病毒、亚肝炎病毒培养液及大肠杆菌、鸭疫李氏杆菌、鸭沙门氏菌，分别取120μL滴加在样品垫上，另外设生理盐水做阴性对照，设已知的鸭坦布苏病毒细胞培养液(8.14×106TCID50/0.1ml)的1:1000倍稀释做阳性对照。除鸭坦布苏病毒细胞培养液呈阳性反应外，其他的样本皆为阴性反应，重复3次后结果相同，说明该方法有较高的特异性。
结果如下：
(2)敏感性试验：用生理盐水对(8.14×106 TCID50/0.1ml)鸭坦布苏病毒作倍比稀释至1:1000，分别取120μL滴加在样品垫上，试纸仍呈阳性反应，重复3次后结果相同，本发明试纸敏感性强。
将鸭坦布苏病毒进行倍比稀释1:1000倍后的结果仍为阳性。
(3)稳定性试验：将本发明的3批试纸条分别放置在在37℃恒温培养箱、常温、4℃，每隔1个月取出同时检测10份鸭坦布苏病毒样本、10份阴性鸭坦布苏病毒阴性样本，结果显示：37℃作用6个月对本发明的试纸条无破坏作用，证明该试纸条在高温下较为稳定；本发明的试纸条常温放置12个月仍较为稳定。
第一个月检测结果
第三个月检测结果
第6个月检测结果
(4)与酶联免疫吸附试验和PCR比较：鸭坦布苏病毒实验室常用PCR检测。120份被检测鸭坦布苏病疑似病例鸭的眼泪、病死脏器的样本中，用PCR检测阳性为31份，阴性89份，用本发明的试纸条检测阳性为45份，阴性为75份，用ELISA检测用4-C3细胞株分泌的抗体进行包被，用HRP标记1-E11细胞株分泌的抗体，建立常规的双抗体夹心ELISA阳性36份，阴性84份。结果显示：鸭坦布苏病用本发明试纸条检测阳性率为37.5％，PCR检测阳性率为25.8％，ELISA检测阳性率为30％本发明试纸条比PCR和ELISA都要高。
与ELISA比较结果如下：
胶体金检测结果

Claims (5)

1.一种抗鸭坦布苏病毒的单克隆抗体，所述的单克隆抗体由杂交瘤细胞株1-E11，保藏编号CCTCC NO: C2014219或杂交瘤细胞株4-C3，保藏编号CCTCC NO：C2014220分泌得到。
2.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测鸭坦布苏病毒的免疫胶体金试纸条中的应用。
3.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测鸭坦布苏病毒的ELISA试剂盒中的应用。
4.根据权利要求2或3所述的应用，所述的试纸条或试剂盒中所用的标记单抗为1-E11，包被单抗为4-C3；其中， 1-E11由保藏编号为CCTCC NO: C2014219的杂交瘤细胞株1-E11分泌得到；4-C3由保藏编号为CCTCC NO：C2014220的杂交瘤细胞株4-C3分泌得到。
5.一种检测鸭坦布苏病毒的免疫胶体金试纸条的制备方法，包括：
（1）用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金：已硅化的瓶子中入125 mL注射用水，再加入1.2 mL 1 %氯金酸，放入微波炉中火加热4 min；迅速一次加入1.8 mL的1.05%柠檬酸三钠水溶液后中火加热5 min，室温下自然冷却，即为胶体金溶液；
（2）胶体金的标记：将上述步骤（1）所得的胶体金用0.2 mol/L碳酸钾调节pH值到8.0；加入单克隆抗体1-E11，每1 mL胶体金溶液的最适当单克隆抗体的标记量为9.6 μg，缓慢搅拌40 min得到抗鸭坦布苏病毒单克隆抗体-胶体金标记物；在搅动下，加入10% BSA溶液封闭40 min；将标记好的胶体金溶液8800 rpm离心30 min后重悬喷涂在胶体金结合垫上；
（3）制备胶体金结合垫：
（a）配制包被液：0.05mol/L pH 9.0 Tris缓冲液、0.5%聚乙烯吡咯烷酮K40、3%蔗糖、0.5%吐温20搅拌均匀后滤纸过滤；
（b）制备胶体金结合垫：将玻璃纤维素膜浸泡在上述包被液中30 min，37℃烘箱中烘干；上述步骤（2）制备的胶体金标记的抗鸭坦布苏病毒的单克隆抗体1-E11喷涂于处理过胶体金结合垫上，喷量为10 μL/cm，于37℃烘箱中烘干，裁切成宽0.5cm条状备用；
（4）喷涂检测线和质控线：
（a）配制包被液：0.02 mol/L pH 7.2磷酸盐缓冲液、1.0%海藻糖、1.0%山梨醇、0.3%吐温20、搅拌均匀后0.22 μm滤膜过滤；
（b）将抗鸭坦布苏病毒的单抗体4-C3用上述包被液稀释后，喷涂于硝酸纤维素膜上作为检测线，抗鸭坦布苏病毒的单抗4-C3浓度为1.5 mg/ mL，喷量为1 μL/cm；喷涂在硝酸纤维素膜上质控线上兔抗鼠抗体浓度为1.5 mg/ mL，喷量为1 μL/cm，检测线和质控线的距离是5 mm，于37℃烘箱中烘干备用；
（5）处理样品垫：将吸水纸浸泡在缓冲液中30 min，37℃烘箱中烘干，裁切成宽为1.5 cm条状备用；上述的缓冲液配方为：0.4 mol/L的Tris-Cl，pH 9.0；
 （6）试纸的组装：将处理好的样品垫、喷有抗鸭坦布苏病毒的单克隆抗体-胶体金标记物的胶体金结合垫、喷有抗鸭坦布苏病毒的单克隆抗体的检测线的硝酸纤维素膜、吸水垫按顺序依次粘贴在硬质聚氯乙烯上组成试纸条，即得；
所述的单克隆抗体4-C3由杂交瘤细胞株4-C3，保藏编号CCTCC NO：C2014220分泌；
所述的单克隆抗体1-E11杂交瘤细胞株1-E11，保藏编号CCTCC NO: C2014219分泌。
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