CN114409775A - 鸭坦布苏病毒单克隆抗体及其试纸条制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鸭坦布苏病毒单克隆抗体，是由保藏号为CCTCC NO：C202221的杂交瘤细胞株B9D10G10分泌产生的单克隆抗体B9D7B8G10，能与鸭坦布苏病毒囊膜糖蛋白结构域3蛋白特异性结合。杂交瘤细胞株B9D10G10的保藏号为CCTCC NO：C202221。本发明公开了上述鸭坦布苏病毒单克隆抗体在制备检测鸭坦布苏病毒的产品中应用。本发明公开了一种检测鸭坦布苏病毒的试纸条。本发明利用获得的特异性强、敏感性高的DTMUV ED3的单克隆抗体，制备的鸭坦布苏病毒胶体金免疫层析试纸条，试纸条灵敏度高，特异性强，重复性好，不容易出现漏检，是鸭坦布苏病毒检测方法上的创新。

Description

鸭坦布苏病毒单克隆抗体及其试纸条制备和应用
技术领域
本发明涉及动物病毒疫病诊断技术和免疫检测技术领域，尤其涉及一种特异性结合鸭坦布苏病毒囊膜糖蛋白结构域3(ED3)单克隆抗体，以及用于检测鸭坦布苏病毒的试纸条及其制备方法和应用。
背景技术
2010年我国部分地区爆发了一种感染鸭的新型黄病毒传染病，该病毒主要感染蛋鸭和种鸭，引起蛋鸭产蛋量急剧下降，严重者绝产甚至死亡，给我国养禽业造成了巨大经济损失，后经各实验室研究确定该病毒为鸭坦布苏病毒(DTMUV)。鸭坦布苏病毒为单股正链RNA病毒，属于黄病毒科、黄病毒属、恩塔亚病毒群。鸭坦布苏病毒发病率高，传播速度快，宿主种类广泛，可在鸡、鸭、鹅等群体中广泛传播，在早期的研究中，有报道指出可以在鸭场中工作人员体内检测到相关病毒抗体及RNA，以上研究表明，鸭坦布苏病毒对包括人类在内的哺乳动物的健康存在潜在威胁。因此，开展鸭坦布苏病毒的相关研究十分必要。
鸭坦布苏病毒粒子结构和基因组与其他黄病毒基本一致，病毒共编码3种结构蛋白[衣壳蛋白(capsid，C)、膜蛋白(membrane，M)、囊膜蛋白(envelope，E)]和7种非结构蛋白(nonstructural protein，NS)，包括NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5。
与其他黄病毒E蛋白类似，DTMUV E蛋白是位于病毒表面具有高度保守的病毒结构，在病毒与受体结合、宿主细胞进入过程中发挥关键作用，尤其是在病毒致病性和抗原性方面。E蛋白经过多肽链的折叠形成三个功能不同的结构域：结构域(domain I，EDI)、结构域2(domain II，ED2)和结构域3(domain III，ED3)。EDI结构域是E蛋白的中心结构，为特异性具有中和活性的抗原表位。ED2由不连续的氨基酸序列形成交叉反应表位，介导病毒与宿主细胞的膜融合，能够刺激机体产生中和和非中和抗体。ED3是黄病毒中和抗体的主要靶标抗原，属抗原表位富集区，具有典型的免疫球蛋白样结构，也是病毒识别受体的主要区域，能够诱导机体产生中和抗体和特异性免疫。
有多项研究表明，流行性乙型脑炎病毒、登革热病毒、西尼罗病毒等黄病毒的ED3蛋白在诊断，抑制病毒感染中具有较好的免疫原性。同时，在病原侵染时，ED3蛋白作为抗原能够刺激机体产生特异性抗体，对免疫机体能够产生一定保护作用。
建立高效特异的检测方法是预防与诊断疾病的重要手段。对于鸭坦布苏病毒的检测可以通过观察临床症状与病理变化做出初步诊断，确诊还需结合实验室相关检测方法。目前实验室的检测方法主要有病毒分离鉴定、分子生物学检测及血清学方法。病毒分离鉴定是最常规的检测方法，主要是从病鸭组织器官中收集病料，将病料处理后接种SPF鸡胚，收取死亡鸡胚的尿囊液进行连续传代后即可分离到鸭坦布苏病毒。分子生物学检测方法特异性强、敏感性高，已广泛应用于各个领域。针对鸭坦布苏病毒的检测方法主要有RT-PCR、套式PCR、荧光定量RT-PCR、环介导等温扩增技术等。对于黄病毒属的血清学检测方法国际上通用的主要有酶联免疫吸附试验、补体结合试验、琼脂扩散试验、中和试验等。
以上检测方法特异性强、灵敏度高，结果准确、可靠，但都需要专业的实验室技术人员和相关实验仪器，检测时间长，工作量大，成本高，对于基层工作环境的临床样本检测有一定局限性。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种。
本发明以纯化的重组鸭坦布苏病毒(DTMUV)囊膜糖蛋白结构域3(ED3)蛋白作为免疫原，制备ED3蛋白的单克隆抗体并研究其中和活性。利用反转录PCR扩增DTMUV AH-F10株ED3基因，构建重组表达载体pET32a-ED3并转化至表达菌株Rosetta，诱导表达后利用镣柱亲和层析法纯化目的蛋白。以纯化的目的蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，取免疫后小鼠的脾细胞与Sp2/0细胞进行细胞融合，采取有限稀释法筛选杂交瘤细胞并大量制备单克隆抗体。利用Western blot法、间接免疫荧光法、ELISA及分型试剂盒对单克隆抗体进行鉴定并通过病毒中和试验检测抗体中和效价。
本发明获得所述抗DTMUV的单克隆抗体时免疫小鼠用的抗原为重组蛋白ED3，所述重组蛋白ED3由反转录PCR扩增DTMUV AH-F10株ED3基因，构建重组表达载体pET32a-ED3并转化至表达菌株Rosetta，诱导表达而获得。
本发明涉及一种杂交瘤细胞B9D7B8G10株，所述杂交瘤细胞B9D7B8G10株分泌所述的单克隆抗体B9D7B8G10。
杂交瘤细胞B9D7B8G10株能有效分泌单克隆抗体B9D7B8G10，分泌的B9D7B8G10纯度均高。
杂交瘤细胞株B9D10G10于2022年01月18日送中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉)进行保藏，保藏号为CCTCC NO：C202221。
本发明所述抗DTMUV的单克隆抗体B9D7B8G10为IgG2a亚型。
本发明所述抗DTMUV的单克隆抗体能够特异性的识别感染DTMUV的BHK-21细胞，不会与细胞中其他成分结合。
本发明所述抗DTMUV的单克隆抗体腹水效价可达1：51200，具有一定的病毒中和活性。
本发明还涉及一种试纸条，其中，所述试纸条包括有效量的所述单克隆抗体B9D7B8G10。
本发明的试纸条可通过胶体金检测试纸条实现抗原检测。
胶体金免疫层析技术是20年代发展起来的一项快速诊断技术。该技术是将胶体金标记试剂固定金标垫上，硝酸纤维素膜包被特异性抗原或抗体，待检样品滴加后利用微孔膜的毛细管作用慢慢向硝酸纤维素膜渗透，当待检样品到达检测线和质控线后分别与硝酸纤维素膜包被的抗原或抗体发生特异性结合，形成红色条带。若待检样品呈阳性，检测线与质控线均出现红色条带；若待检样品呈阴性，检测线无变化，质控线出现红色条带。
随着技术的不断进步，胶体金免疫层析技术日益成熟已广泛应用于各个领域，包括检测食品中的微生物，环境质量的监测以及病毒的诊断等方面。其优点表现为：①操作简便，无需专业技术人员操作；②检测时间短；③成本低廉；④胶体金试纸条能长久稳定保存；⑤适合大规模的筛选，适用于基层工作坏境的样本监测。
作为本发明的一种实施方式，所述用于胶体金试纸条的ED3蛋白单克隆抗体B9D7B8G10包被量所需浓度为0.17mg/mL。
本发明涉及检测鸭坦布苏病毒的胶体金免疫层析试纸条，包括试纸条和试纸壳，试纸条装在试纸壳内。试纸壳由上下盖组成，上盖左端设有特定加样孔，中间设有判定结果的视窗。试纸条由样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水纸、PVC底板组成，上述各部分依次按顺序无缝链接在PVC底板上，各部分要有一定重合。PVC底板中间粘有硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜中央包被有检测线和质控线，检测线包被抗鸭坦布苏病毒多克隆抗体，质控线包被HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体。硝酸纤维素膜两端分别设有金标垫和吸水纸，金标垫左端与样品垫相连接，待检样品通过试纸壳上盖特定加样孔进入样品垫，样品垫吸收后通过免疫层析作用依次经过金标垫和硝酸纤维素膜，最后由吸水纸吸收多余的样品，在硝酸纤维素膜可以清晰的判断检测结果。若待检样品呈阳性，检测线与质控线均出现红色条带；若待检样品呈阴性，检测线无变化，质控线出现红色条带。
本发明利用获得的特异性强、敏感性高的DTMUV ED3的单克隆抗体，制备的鸭坦布苏病毒胶体金免疫层析试纸条，试纸条灵敏度高，特异性强，重复性好，不容易出现漏检，是鸭坦布苏病毒检测方法上的创新。
附图说明
图1为ED3目的基因的扩增图，其中M代表DNA marker，1代表ED3基因扩增产物。
图2为重组ED3可溶性分析和纯化的重组ED3的SDS-PAGE分析，其中A为重组ED3蛋白可溶性分析(M代表蛋白质标准，1代表沉淀，2代表上清)，B为纯化的重组ED3蛋白的SDS-PAG分析(M代表蛋白质标准，1代表纯化的重组ED3蛋白)。
图3为ELISA检测单克隆抗体腹水效价(A450)。
图4为单克隆抗体间接免疫荧光鉴定(IFA)结果，其中左侧代表未感染DTMUV的BHK-21细胞(一抗为鼠ED3多抗)；右侧代表感染DTMUV的BHK-21细胞(一抗为B9D7B8G10株mAb)。
图5为单克隆抗体Western blot鉴定，其中M代表蛋白质M标准，1代表未感染DTMUV的BHK-21细胞，2代表感染DTMUV的BHK-21细胞。
图6为单克隆抗体亚型鉴定及其中和试验结果，其中左侧图为单克隆抗体亚型鉴定，右侧图为单克隆抗体中和试验。
图7为试纸条结构主视图。
图8为试纸壳结构主视图。
图9为试纸条使用状态图。
图10为试纸条敏感性试验结果，其中1代表1：10稀释，2代表1：100稀释，3代表1：200稀释，4代表1：300稀释，5代表1：400稀释，6代表1：500稀释，7代表1：600稀释，8代表1：700稀释。
图11为试纸条特异性试验结果，其中1代表坦布苏病毒，2代表星状病毒，3代表细小病毒，4代表马立克病毒，5代表禽白血病毒，6代表鸡贫血病毒，7代表鸭瘟病毒。
图12为试纸条重复性试验结果，其中1代表8月30日，2代表8月30日，3代表9月15日，4代表9月15日，5代表10月30日，6代表10月30日。
图13为试纸条稳定性试验结果，其中1代表4℃保存15天，2代表37℃保存15天，3代表4℃保存30天，4代表37℃保存30天，5代表4℃保存50天，6代表37℃保存50天。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
实施例1
1.1引物的设计与合成
参考DTMUV AH-F10(GenBank登录号：KM102539.1)基因序列，利用引物设计软件设计一对特异性引物，
上游引物序列为5'-JCGCGGATCCCAGGGTITGAAGCTG-3'，下游引物序列为5'-CCGCTCGAGTTTTCCAATTGTGCTCCC-3'，将设计引物序列送由通用生物(安徽)公司合成。
1.2病毒RNA的提取与ED3基因的PCR扩增
按TIANGEN细胞总RNA抽提试剂盒说明书操作，提取AH-F10株细胞毒的总RNA，按FastKing RT Kit试剂盒说明书操作将提取的总RNA反转录成cDNA，并进行PCR扩增，PCR反应体系：2x Phanta Max Master Mix 10μL、上下游引物各0.5μL、cDNA模板1μL、ddH2O8μL。
PCR反应程序为：95℃预变性3min，(95℃变性20s，56℃退火20s，72℃延伸20s)×35个循坏，完全延伸5min PCR。如图1所示，产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳分析并纯化出现一条约342bp目的条带，与预期条带大小一致，ED3目的基因成功扩增。
1.3pET-32a-ED3的原核表达载体构建
PCR产物纯化后连接到PMD-19T克隆载体，转化至大肠杆菌DH5a，挑取单克隆，提取质粒，阳性克隆命名为PMD-19T-ED3O双酶切pMD-19T-ED3和pET-32a并回收目的片段进行连接，构建表达载体PET-32a-ED3，将其转化至大肠杆菌Rosetta中，挑取单克隆菌落。对构建成功的阳性质粒酶切鉴定重组转化子，岀现两条与预期大小一致的条带，分别为342bp和5400bp。测序结果经MegAlign软件比对，100％同源性，载体pET-32a-ED3构建成功。
1.4表达产物的分析和重组蛋白的纯化
将构建成功的阳性重组菌接种于LB培养基中扩大培养，在对数生长期时加入IPTG诱导表达16h后，离心PBS清洗并超声破碎。将细菌裂解物的上清和沉淀进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。如图2所示，通过Lasergene v7.1软件计算出表达载体pET-32a-ED3中的融合蛋白相对分子质量约为28000，SDS-PAGE显示出现一条(线)约28000的蛋白，蛋白成功表达且在上清沉淀中均有分布。
按His-tag蛋白纯化试剂盒说明书操作纯化目的蛋白，并通过36mm透析袋浓缩，浓缩后获得了高纯度的目的蛋白。
实施例2
2.1BALB/c小鼠的免疫
取100μL重组蛋白与等量的Freund佐剂混合，1mL注射器反复抽吸充分混合至其完全乳化，背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠，第1次免疫釆用完全弗氏佐剂免疫，随后用不完全Freund佐剂免疫，免疫3次每次间隔2周，并在第3次免疫后小鼠尾静脉采血，ELISA检测抗体效价合格达到1：40000以上。效价较高的小鼠，进行加强免疫(腹腔注射)。
小鼠脾细胞与Sp2/0细胞的融合取经过免疫后血清中抗体效价达到1：20000以上的小鼠，无菌操作取小鼠脾脏制备脾细胞悬液，融合时使骨髓瘤细胞达到对数生长期，制备SP2/0骨髓瘤细胞悬液。将Sp2/0细胞悬液与脾细胞按1：3比例混合，利用化学融合剂PEG1000进行细胞融合，融合后用200mL/L FBS的1×HAT培养液重悬，接种于饲养细胞的96孔板中，50ml/L CO2，37℃培养箱中培养10d，并观察记录。
2.2间接ELISA检测方法的建立
用纯化的蛋白作为包被抗原，设置1.25μg/mL～80μg/mL梯度的蛋白包被浓度，1：200～1：1600的梯度血清稀释度，采用棋盘法确定重组蛋白抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度分别为10μg/mL，l：800。
对其他条件进行优化，包被时间为37℃60min，封闭条件为37℃60min，小鼠抗ED3多克隆抗体条件为37℃30min，HRP标记山羊抗小鼠IgG的工作浓度为1：2000，反应条件为37℃60min，显色时间20min。
按上述优化的ELISA检测条件对24份阴性小鼠血清进行检测，24个样品的A450皿均值(X)为0.13675，标准差(s)＝0.08311，根据统计学公式临界值＝X+3s，临界值为0.386，即A450 nM值高于0.386可判断为阳性。
2.3杂交瘤细胞亚克隆
取成功融合的杂交瘤细胞培养上清进行抗体效价检测，选取检测结果为阳性的杂交瘤细胞孔，HT筛选培养基将其重悬并接种96孔细胞培养板；设置重复组6组，每组12倍梯度稀释，置于50mL/LCO2、37℃的培养箱中连续培养10d左右。出现聚集成团的杂交瘤细胞，再次对杂交瘤细胞进行抗体效价检测筛选；至少连续进行4次克隆化培养，直至杂交瘤细胞克隆阳性孔比率达到100％，同时出现单个的杂交瘤细胞团。
对所得阳性单个杂交瘤细胞团进行扩增培养及细胞冻存，并命名为B9D7B8G10。
2.4单克隆腹水的制备
取8～10周龄雌性BALB/c小鼠，取500μL灭菌液体石蜡油腹腔注射小鼠，7d后，腹腔注射无血清的杂交瘤细胞悬液，细胞数目约50万～100万个，每只小鼠的细胞数目不宜过多或过少。约7d左右小鼠出现腹腔膨大，精神沉郁时，收集小鼠腹水，离心收集上清分装，放于-80℃下保存备用。
实施例3
3.1间接ELISA测定单克隆抗体的效价
按照建立的间接ELISA检测方法操作，对制备的单克隆抗体腹水进行抗体效价检测，根据P/N比值法，P/N≥2.1为阳性。如图3检测结果显示，制备的单克隆抗体腹水效价在1：51200以上，表明制备的单克隆抗体效价较高。
3.2单克隆抗体的间接免疫荧光鉴定
采用间接免疫荧光检测方法，将BHK-21小鼠肾细胞铺6孔板，待细胞生长至80％。100μL病毒滴度为105×[病毒50％组织细胞感染量(median tissue culture infectivedose，TCID50)]/mL DTMUV病毒液孵育2h后，更换维持液。48h后，甲醇固定细胞；一抗采用阳性杂交瘤细胞的培养上清孵育1h，加FITC标记的山羊抗小鼠IgG(1：1000)，避光孵育1h，DAPI核染10min。
如图4所示，荧光显微镜观察单克隆抗体均能使感染DTMUV的BHK-21细胞产生明显的绿色荧光，而空白对照组BHK-21细胞未出现绿色荧光，表明单克隆抗体够特异性结合DTMUV E蛋白，具有良好的反应原性和特异性。
3.3单克隆抗体的Western blot鉴定
将BHK-21细胞铺6孔板，待细胞生长至60％时，接种35μLDTMUV液(病毒滴度为105TCID50/mL)。孵育2h后，更换维持液；48h后，消化细胞取细胞沉淀；RIPA裂解液裂解细胞进行SDS-PAGE，转PVDF膜进行Western blot鉴定。
一抗采用筛选成功的阳性杂交瘤细胞上清培养液进行孵育1h，二抗采用1：7500稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG，孵育1h后，PBST洗膜。如图5所示，ECL显色显示制备的单克隆抗体能够特异性识别DTMUV，出现约为Mr 54300的E蛋白条带，表明单克隆抗体的特异性强，反应灵敏，能够作为检测DTMUV的有效抗体工具。
3.4单克隆抗体的亚类鉴定
按照小鼠单克隆抗体分型试剂盒说明书操作，对制备的mAb进行分型鉴定。将制备单抗腹水1：100进行稀释作为一抗，二抗采用1：2000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG，孵育1h，TMB显色20min后终止显色，酶标仪检测450nm处的吸光度(A)值。
如图6所示，单克隆抗体B9D7B8G10为IgG2a亚型。
3.5单克隆体中和试验
将单克隆抗体腹水56℃灭活30min，DMEM培养基按1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128、1：256、1：512稀释度对其进行倍比稀释，同时用培养基将AH-F10株DTMUV(病毒滴度为104TCID50/100μL)病毒液稀释至200×TCID50/100μL。取100μL不同稀释度的单克隆抗体腹水与100μL 200×TCID50 DTMUV病毒液混合，37℃孵育1h中和病毒。取铺好BHK-21细胞的96孔微量细胞培养板，将不同稀释度的抗体与病毒中和的混合液每孔加入100μL重复8孔，并设置病毒梯度为100×TCID50/100μL、10×TCID50/100μL、1≧TCID50/100μL、0.5×TCID50/100μL的对照组，每个梯度重复8孔，6d后观察结果。
单克隆抗体B9D7B8G10的中和效价分别1：15.8，具有一定的病毒中和活性。
实施例4鸭坦布苏病毒的胶体金免疫层析试纸条的制备
4.1单克隆抗体的纯化
采用rProtein G琼脂糖凝胶亲和层析法对实验室保存一株单克隆腹水进行纯化，将rProtein G Beads装入合适的层析柱，层析用5倍柱体积的结合Buffer进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用。将样品加到平衡好的rProteinG Beads中，收集流出液。用10～15倍柱体积的洗杂Buffer进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。使用5～10倍柱体积的洗脱Buffer，收集洗脱液，即目的蛋白组分。
依次使用3倍柱体积的结合Buffer和5倍柱体积的去离子水平衡填料，最后再用5倍柱体积的20％的乙醇平衡，然后保存在等体积的20％的乙醇中，置于4度保存，防止填料被细菌污染。将纯化后样品透析除盐，每隔4小时更换一次透析液。
4.2胶体金溶液的制备
以柠檬酸三钠为还原剂，制备胶体金溶液。将所用玻璃器皿置于次强酸中浸泡24h，取出后超纯水反复清洗，烘干备用。取已处理过的洁净锥形瓶置于磁力加热搅拌器上，加入100mL超纯水和磁性搅拌粒子，随即加入1.0mL制备好1％HAuCl4溶液，开启搅拌功能混匀液体，搅拌均匀后，开启加热模式煮至沸腾，一次性加入2mL1％柠檬酸三钠溶液。继续加热至溶液变为酒红色，自然冷却至室温，超纯水定容至100mL，4℃冰箱避光保存备用。用分光光度计检测波长400～700nm范围内吸收峰的变化。
4.3胶体金与单抗最佳结合pH值的确定
取9管洁净的EP管置于EP管板中，每管加入等量(1mL)已制备好的胶体金溶液，其中8管分别加入1μL、3μL、5μL、7μL、9μL、11μL、13μL、15μL的0.2mol/L K2CO3溶液调节pH值，剩余1管作为空白对照。
充分混匀后各管加入20μL纯化后的ED3蛋白单克隆抗体B9D7B8G10，再次混匀后放入4℃冰箱静置15min。每管再分别加入100μL10％氯化钠溶液，混匀后放入4℃冰箱静置，待其充分反应3h。用仪器检测OD值在400～700nm范围内的最大吸收波长和吸光值，出现最大吸收峰值所对应的pH即为最佳。
4.4最佳抗体用量的确定
取9管洁净的EP管置于EP管板中，每管加入等量(1mL)的已制备好的胶体金溶液，用0.2mol/L K2CO3溶液调节至最佳pH值。按表1所示加入纯化后的ED3蛋白单克隆抗体B9D7B8G10，4℃条件下反应15min。每管再分别加入100μL 10％氯化钠溶液，混匀后放入4℃冰箱静置，待其充分反应3h。用仪器检测OD值在400～700nm范围内的最大吸收波长和吸光值，出现最大吸收峰值所对应的抗体用量即为最佳。
表1胶体金标记单抗最佳抗体用量的确定
管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9
胶体金(mL) 1 1 1 1 1 1 1 1 1
单抗(μg) 0 0.7 1.4 2.1 2.8 3.5 4.2 4.9 5.6
10％NaCl(μL) 0 100 100 100 100 100 100 100 100
4.5胶体金探针制备及纯化
(1)将预先处理干净的磁性搅拌粒子放入锥形瓶中，加入10mL已制备的胶体金溶液，开启搅拌模式。滴加适量0.2mol/L K2CO3溶液调节溶液至最佳pH值，混匀后加入最佳结合量的纯化后ED3蛋白单克隆抗体B9D7B8G10，持续搅拌30min，使胶体金粒子与抗体充分结合。
(2)加入适量10％BSA溶液封闭未与胶体金粒子结合的抗体，持续搅拌20min，加入适量10％PEG-20000溶液，持续搅拌10min。
(3)将溶液等量分装于洁净的EP管中，通过分光光度计测溶液在400-700nm的OD值。然后4℃条件下离心，2000r/min，10min。离心后EP管底部有少量未结合的胶体金粒子，小心的吸取上层溶液至新的洁净EP管中，切勿触及底部沉淀。
(4)4℃条件下离心，9000r/min，30min，离心完全后吸取上清，保留沉淀。每管加入1mL0.01mol/LpH8.0Tris-HCl溶液，吹打混匀沉淀，4℃条件下离心，9000r/min，30min。
(5)离心后弃上清液，保留底部沉淀，每管加入1mL0.01mol/LpH8.0Tris-HCl溶液，轻柔的混匀沉淀。4℃条件下离心，9000r/min，30min，离心弃上清后留存的沉淀用100μL0.01mol/L pH8.0Tris-HCl混匀，4℃避光保存备用。
4.6胶体金试纸条的组装
如图7-9所示，将PVC底板和硝酸纤维素膜剪成合适的尺寸，在硝酸纤维素膜检测线位置包被抗鸭坦布苏病毒多克隆抗体，在硝酸纤维素膜质控线位置包被HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体，包被后的硝酸纤维素膜紧密粘贴于PVC底板固定位置，将已制备好的胶体金金标垫紧密贴于硝酸纤维素膜左端，金标垫左端与已制备好的样品垫紧密压实，在硝酸纤维素膜右端粘贴吸水纸，各部分连接处要紧密压实，不留缝隙，将已组装好的胶体金试纸条装入试纸壳中，之后放入铝箔袋，每个铝箔袋放入一包干燥剂后封口备用。
4.7胶体金试纸条敏感性试验
将DTMUV细胞病毒上清液分别按照1：10、1：100、1：200、1：300、1：400、1：500、1：600、1：700比例稀释，稀释后的细胞毒样品分别加入胶体金试纸条加样孔，每个试纸条滴加150μL细胞毒样品，室温静置反应15min。如图10所示，该试纸条在DTMUV细胞病毒稀释1：100后在质控线和检测线均出现红色条带，表明该试纸条具有良好的敏感性。
4.8胶体金试纸条特异性试验
将实验室保存的不同禽类病毒样品适当稀释，离心后取上清，取已制备好的胶体金试纸条，每个试纸条滴加150μL样品，室温静置15min。如图11所示，只有滴加DTMUV细胞病毒的试纸条检测线和质控线同时出现两条红色条带，其他试纸条只有质控线出现红色条带，表明该试纸条特异性好。
4.11胶体金试纸条重复性试验
取不同批次制备的胶体金试纸条，每个试纸条滴加150μLDTMUV细胞病毒上清液，室温静置15min。如图12所示，每一批次的试纸条均在检测线和质控线出现红色条带，表明该试纸条重复性好。
4.12胶体金试纸条稳定性试验
将已制备好的胶体金试纸条放入铝箔袋，每个铝箔袋放入一包干燥剂后封口备用。将包装好的胶体金试纸条分别存放于4℃和37℃，分别于不同时间取出，每个胶体金试纸条滴加150μLDTMUV细胞病毒。如图13所示，不同时间保存的试纸条均在检测线和质控线同时出现两条红色条带，表明该试纸条稳定性好。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种鸭坦布苏病毒单克隆抗体，其特征在于，是由保藏号为CCTCC NO：C202221的杂交瘤细胞株B9D10G10分泌产生的单克隆抗体B9D7B8G10。
2.根据权利要求1所述鸭坦布苏病毒单克隆抗体，其特征在于，为IgG2a亚型。
3.根据权利要求1所述鸭坦布苏病毒单克隆抗体，其特征在于，其与鸭坦布苏病毒囊膜糖蛋白结构域3蛋白特异性结合。
4.根据权利要求1所述鸭坦布苏病毒单克隆抗体，其特征在于，其腹水效价≥1：51200；其腹水效价中和效价为1：15.8。
5.杂交瘤细胞株B9D10G10，保藏号为CCTCC NO：C202221。
6.如权利要求1-4中任一项所述鸭坦布苏病毒单克隆抗体在制备检测鸭坦布苏病毒的产品中应用。
7.一种检测鸭坦布苏病毒的试纸条，其特征在于，含有有效量的如权利要求1-4中任一项所述鸭坦布苏病毒单克隆抗体。
8.根据权利要求7所述检测鸭坦布苏病毒的试纸条，其特征在于，所述试纸条为胶体金试纸条，如权利要求1-4中任一项所述鸭坦布苏病毒单克隆抗体包被所需浓度为0.17mg/mL。
9.根据权利要求7所述检测鸭坦布苏病毒的试纸条，其特征在于，检测线包被抗鸭坦布苏病毒多克隆抗体，质控线包被HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体。
10.如权利要求7-9任一项所述检测鸭坦布苏病毒的试纸条用于判断试样中是否含有鸭坦布苏病毒的应用。
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