CN106518990A

CN106518990A - 一种寨卡病毒抗原及其应用

Info

Publication number: CN106518990A
Application number: CN201611042331.7A
Authority: CN
Inventors: 曹健荣; 林小靖
Original assignee: Denuojie Billion (beijing) Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Denuojie Billion (beijing) Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2016-07-04
Filing date: 2016-11-24
Publication date: 2017-03-22
Anticipated expiration: 2036-11-24
Also published as: CN106518990B

Abstract

本发明提供了一种寨卡病毒抗原及其应用，属于蛋白质工程技术领域。本发明将经过DNA分析和蛋白结构分析确认的蛋白序列对应的DNA序列进行合成，并引入Nde I和Xho I酶切位点，以商品化pET30a质粒为基础载体，构建pZE400，所述蛋白序列如SEQ ID NO.1所示，所述DNA序列如SEQ ID NO.2所示，该表达载体表达的蛋白带HIS标签于蛋白C端，通过亲和层析纯化和蛋白复性，得到寨卡病毒蛋白。该蛋白免疫原性好，特异性强，可用于制备寨卡病毒检测试纸条或试剂盒，也可用于制备寨卡病毒疫苗，市场价值显著。

Description

一种寨卡病毒抗原及其应用

技术领域

本发明涉及病毒免疫领域，具体地，涉及寨卡病毒抗原及其应用。

背景技术

寨卡病毒(Zika Virus，ZIKV)属于黄病毒科黄病毒属，经由埃及伊蚊传播，能使受蚊叮咬的人罹患寨卡病毒感染症(亦称寨卡热)。该病毒最早在1947年从乌干达的寨卡森林中的猕猴体内分离得到，因而得名。依据基因型别分为亚洲型和非洲型两种型别，在中非、东南亚和印度等地都有发现的纪录。2015年起寨卡病毒疫情于中南美洲快速扩散，其中巴西甚至有超过4,100例新生儿小头畸形怀疑与寨卡病毒相关。寨卡病毒与登革热，黄热病，日本脑炎和西尼罗河病毒相近。它会导致一个类似温和形式的登革热的病情，目前还无法通过药物或疫苗来预防。寨卡病毒经由母亲传染给孩子，寨卡发烧可能和新生婴儿的小头畸形有关连，其对成人的感染能影响神经系统，而且可能也与格林－巴利综合征存在联系。

寨卡病毒呈球形，直径约为40-70nm，有包膜。ZIKV核酸为一条长度为10794碱基的单正链RNA，其编码基因顺序为5’-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3’。RNA翻译为一个多聚蛋白，然后通过蛋白酶裂解为结构蛋白衣壳蛋白(capsid，C)、前体膜蛋白(precursor membrane，prM)、膜蛋白(envelope，E)，以及数个非结构蛋白。现在研究发现黄病毒的囊膜蛋白(E蛋白)主要负责病毒与感染宿主的受体的识别，介导病毒的入侵，因此是该类病毒最主要的保护性抗原。黄病毒的中和抗体一般通过靶向E蛋白阻止病毒的入侵，进而帮助宿主清除病毒。

寨卡病毒E蛋白大约53kDa，是病毒的主要表面蛋白。无论是制作寨卡病毒检测试剂还是寨卡病毒疫苗，获得良好高纯度的活性抗原是必须解决的问题。因此有必要对寨卡病毒E蛋白进行研究，建立针对寨卡病毒E蛋白的原核表达及纯化表达工艺，获得生物学活性好的寨卡病毒抗原，以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的是通过寨卡病毒E蛋白进行分析和筛选，对寨卡病毒的天然序列进行片段化后人工再排列，通过对经过人工拼接后的寨卡病毒E蛋白序列进行原核表达及纯化表达工艺，进而获得生物学活性高的寨卡病毒抗原。

本发明的第一个方面提供了一种寨卡病毒抗原，具有：

(1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(2)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经缺失、插入或替换所获得的具有相同功能的氨基酸序列。

SEQ ID NO.1所示的抗原蛋白大小为69kDa，该设计并非完整的寨卡病毒E蛋白，而是对寨卡病毒的天然序列进行片段化后人工再排列，对特定序列进行了2次重复拼接，连接序列为GGGS。

本发明的第二个方面是提供编码所述寨卡病毒抗原的基因。优选的，所述基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

本发明的第三个方面是提供了所述寨卡病毒抗原的原核表达载体。优选的，所述原核表达载体是将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列与pET30a载体进行连接所获得的，优选的，所述原核表达载体为pZE400。

本发明的第四个方面是提供含有所述的寨卡病毒抗原、其编码基因或原核表达载体的宿主细胞。可选的，所述宿主细胞可以为BL21(de3)大肠杆菌株。

本发明的第五个方面提供所述所述寨卡病毒抗原的纯化方法，将经过DNA分析和蛋白结构分析确认的蛋白序列对应的DNA序列进行合成，并引入Nde I和Xho I酶切位点，以商品化质粒为基础载体，构建寨卡病毒表达载体，所述蛋白序列如SEQ ID NO.1所示，所述DNA序列如SEQ ID NO.2所示，通过亲和层析纯化和蛋白复性，得到寨卡病毒蛋白。

含有氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示寨卡病毒抗原的生物制品属于本发明的保护范围。

优选地，所述的生物制品为疫苗。

含有氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示寨卡病毒抗原的检测试剂属于本发明的保护范围。

本发明提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示寨卡病毒抗原在制备用于检测寨卡病毒的试剂盒或检测试剂中的用途。

可选的，所述试剂盒为ELISA试剂盒或胶体金法快检试剂盒。

本发明提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示寨卡病毒抗原在制备寨卡病毒疫苗中的用途。

本发明提供的上述寨卡病毒抗原免疫原性好，特异性强，可作为寨卡病检测的分子标记用于检测寨卡病毒，还能够用于制备检测寨卡病的试剂盒或试纸条或检测试剂，灵敏度高特异性强，有助于寨卡病毒抗原检测的规范化与标准化，还可用于制备寨卡病毒疫苗。

附图说明

图1为本发明寨卡病毒抗原蛋白表达载体pZE400图谱。

图2为纯化前后寨卡病毒抗原蛋白电泳图。箭头所指为纯化后的蛋白。蛋白大小是69kD。

图3为本发明寨卡病毒抗原蛋白用于ELISA检测的原始结果截图。

图中第一列为检测IgG的原始结果。其中第1孔为感染者阳性IgG血清，第2孔为十倍稀释阳性血清。其余为阴性血清。通过本实验判断寨卡病毒抗原蛋白能够与感染者IgG相结合。

第二列为检测IgM的原始结果。其中第1孔为感染者IgM阳性血清，第2孔为十倍稀释阳性血清。其余为阴性血清。通过本实验判断寨卡病毒抗原蛋白能够与感染者IgM相结合,但结合效果较IgG稍差。

图4为本发明寨卡病毒抗原蛋白制成胶体金试纸条的原始结果截图。左一是检测感染者IgG阳性血清，左二检测感染者IgM阳性血清，右一和右二均是阴性血清。T表示检测线，C表示控制线。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

实施例1寨卡病毒抗原蛋白的制备和纯化

分别用限制性内切酶Nde I和Xho I对SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列进行消化，收集目的片段与同样用限制性内切酶处理的pET30a载体进行连接，构建重组表达质粒pZE400；E蛋白表达，SDS-PAGE电泳和图像分析系统确定表达情况和产量。

1将重建完成的质粒pZE400转入BL21(de3)大肠杆菌株，涂布平板，挑取单克隆在5ml LB培养基(A+，50mg/ml)的中试管内，37℃240rpm过夜培养。

2将过夜培养的菌株，接种在含有300ml LB培养基(A+，50mg/ml)中，37℃240rpm继续培养，待菌液OD600约1的时候，加入终浓度为1mm的IPTG诱导3个小时。

3 4000rpm离心，收取菌体，用10mm Tris-Hcl pH 8.0，0.5％Triton X-10的缓冲液按照30ml缓冲液每升培养液的比例重悬，可在-20℃保存。

寨卡病毒蛋白的表达产物为包涵体，重悬后的菌体采用超声破碎，超声功率300w，20s工作，20s间隔，冰浴中破碎20次，不小于10000g离心10分钟，弃上清，保留沉淀，用8m/L尿素(10mm Tris ph8.0)溶解沉淀，随后采用亲和层析纯化。纯化时基液采用8m/L尿素(10mmtris ph8.0)，洗脱液添加终浓度为30mm/L，60mm/L，300mm/L的咪唑梯度洗脱。收取300mm/L的咪唑洗脱液流过的峰值，SDS-page电泳检测目的蛋白的浓度和纯度。

纯化后的蛋白用梯度降低的尿素溶液缓慢透析，最终用0.01×PBS透析，透析后的蛋白质溶液经冻干成粉状。以牛血清白蛋白(BSA)为标准，采用BIORAD公司蛋白质定量试剂(protein assay)比色测定蛋白质的含量。

上述实验结果如下：1)含pZE400的E.coli BL21(DE3)工程菌可有效表达E蛋白，产量可达细菌总蛋白的24.3％，；2)经过Ni-NTA亲和层析纯化，E蛋白纯度可达到95％-98％。见图2。

将亲和层析收集的含有目的蛋白的洗脱液转移至半透膜中，在4m/L尿素10mm/Ltris pH 8.0的缓冲液中搅拌透析3个小时，然后逐步降低尿素的浓度，依次为2m/L透析3个小时，1.5m/L透析3个小时，0m/L透析过夜。

实施例2寨卡病毒抗原蛋白的免疫效果

免疫佐剂用的是氢氧化铝浓度为500ug/ml，寨卡病毒抗原蛋白的抗原浓度调整为100ug/ml，两者等比例混合之后免疫兔子，肌肉注射，每只注射1ml，免疫程序为第0天,第10天,第20天三针免疫，检测兔血清中寨卡病毒中和抗体滴度，实验步骤如下：

1.细胞培养瓶培养Vero细胞，当培养瓶中细胞数量足够时，用0.25﹪胰酶消化所有细胞，接种到96孔板上继续培养，使用含有10﹪胎牛血清和1﹪抗生素的DMEM作为基础培养液，保持每孔接种细胞数目约5～8×10³个，接种细胞时按照下述方法进行计数：

吸取20ul细胞悬液，立即将细胞悬液移到血细胞计数板小室的边缘，挤出细胞悬液，利用毛细作用使之充满计数板和盖玻片间的空隙，小室内液体的体积以刚好流到计数板凹槽的边缘为准

细胞悬液的密度＝角上四个大方格的细胞数目之和×10⁴/4

2.培养两天后细胞生长至96孔板底部的80﹪，移去细胞培养液，之后加入200ul无血清的生长培养基洗细胞面三次，倍比稀释兔血清，分别1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512、1/1024稀释倍数进行微量中和试验。

3.取500ul各个稀释度的兔血清与攻击用的Zika病毒液(6.5TCID50/ml)等量混合后中和1小时，将混合液接种到八孔Vero指示细胞，每孔100ul，同时做正常细胞对照，4小时后弃去病毒血清混合液并更换成含有5﹪胎牛血清的DMEM作为维持培养液，培养三天后通过显微镜观察呈现细胞病变的孔数和未病变的孔数。中和实验结果见表1，表1表明寨卡病毒抗原蛋白具备优良的免疫原性。

表1

中和实验96孔板的细vero细胞病变结果。○未病变；●病变

实施例3寨卡病毒抗原蛋白的IgM/IgG ELISA方法和试剂盒

检测IgM时，方法是先预包被抗人IgM抗体(抗人μ链)于酶标板，然后加入感染者血清进行反应和漂洗，然后将标记辣根过氧化物酶的寨卡病毒抗原蛋白加入酶标板进行反应和漂洗，然后加入辣根过氧化物酶底物显色。一般检测流程如下：抗人IgM抗体(抗人μ链)用0.05M的碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释至2μg/ml，包被酶标板(每孔100μ1)置2℃－8℃过夜。弃包被液，加入封闭液(每孔300μ1)，37℃封闭1小时。弃封闭液，分别加入阴性对照品N1、N2、待检验的样品(稀释至20倍)，每孔100μl，37℃反应30分钟。弃反应液，用PBST缓冲液洗5次，每次每孔加入300μl。弃洗液，每孔加入寨卡病毒抗原蛋白-酶结合物2μg/ml(以A值在0.06－0.08之间为准)，37℃反应30分钟。弃反应液，用PBST缓冲液洗5次，每次每孔加入300μl。弃洗液，每孔加入底物A液、B液各50μl，37℃避光反应10分钟。每孔加入终止液50μl终止反应。450nm测定各孔A值(吸收值)。

检测IgG时，方法是先预包被寨卡病毒抗原蛋白于酶标板，然后加入感染者血清进行反应和漂洗，然后将标记辣根过氧化物酶的抗人抗体加入酶标板进行反应和漂洗，然后加入辣根过氧化物酶底物显色。一般检测流程如下：寨卡病毒抗原蛋白用0.05M的碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释至1μg/ml，包被酶标板(每孔100μ1)置2℃－8℃过夜。弃包被液，加入封闭液(每孔300μ1)，37℃封闭1小时。弃封闭液，分别加入阴性对照品N1、N2、待检验的样品(稀释至40倍)，每孔100μl，37℃反应30分钟。弃反应液，用PBST缓冲液洗5次，每次每孔加入300μl。弃洗液，每孔加入酶结合物稀释液稀释的羊抗人·HRP100μl(以A值在0.06－0.08之间为准)，37℃反应30分钟。弃反应液，用PBST缓冲液洗5次，每次每孔加入300μl。弃洗液，每孔加入底物A液、B液各50μl，37℃避光反应10分钟。每孔加入终止液50μl终止反应。450nm测定各孔A值(吸收值)。这里使用的是辣根过氧化物酶显色系统，也可以是其他显色系统，如生物素和亲和素显色系统。

结果见图3。本发明寨卡病毒抗原蛋白用于ELISA包被，能够检测对阳性血清进行检测，第一列为检测IgG的原始结果。其中第1孔为感染者阳性IgG血清，第2孔为十倍稀释阳性血清。其余为阴性血清。通过本实验判断寨卡病毒抗原蛋白能够与感染者IgG相结合。

实施例4利用本发明寨卡病毒抗原蛋白的金标快检方法和试剂盒

寨卡病毒IgM抗体检测试剂盒(胶体金法)采用胶体金免疫层析技术，在玻璃纤维纸上预包被金标记Zika重组抗原，在硝酸纤维膜上检测线和对照线处分别包被抗人IgM抗体(抗人μ链)和抗Zika抗体。检测阳性样本时，样本中Zika IgM抗体与胶体金标记Zika重组抗原(Au-Zika-Ag)结合形成复合物，由于层析作用复合物沿试纸条向前移动，经过检测线时与预包被的抗人IgM抗体(抗人μ链)形成“Au-Zika-Ag-抗Zika抗体-抗人IgM-固相材料”夹心物而凝聚显色，游离金标抗原则在对照线处与抗Zika抗体结合而富集显色。阴性标本则仅在对照线处显色。检查时把经过适当稀释的血清标本加到检测卡的加样处，20分钟内观察结果即可。

寨卡病毒IgG抗体检测试剂盒(胶体金法)采用胶体金免疫层析技术，在玻璃纤维纸上预包被金标记Zika重组抗原，在硝酸纤维膜上检测线和对照线处分别包被抗人IgG抗体(羊抗人)和抗Zika抗体。检测阳性样本时，样本中Zika IgG抗体与胶体金标记Zika重组抗原(Au-Zika-Ag)结合形成复合物，由于层析作用复合物沿试纸条向前移动，经过检测线时与预包被的抗人IgG抗体(羊抗人)形成“Au-Zika-Ag-抗Zika抗体-抗人IgG-固相材料”夹心物而凝聚显色，游离金标抗原则在对照线处与抗Zika抗体结合而富集显色。阴性标本则仅在对照线处显色。检查时把经过适当稀释的血清标本加到检测卡的加样处，20分钟内观察结果即可。

结果见图4。图4显示本发明寨卡病毒抗原蛋白制成胶体金试纸条能够特异地检测到寨卡病毒感染者IgG阳性血清和感染者IgM阳性血清。检测准确，特异性良好。

以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种寨卡病毒抗原，其特征在于，具有：

(1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列

2.编码权利要求1所述的寨卡病毒抗原的基因，其特征在于，具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所获得的核苷酸序列。

3.含有权利要求2所述基因的表达载体。

4.含有权利要求1所述的寨卡病毒抗原或权利要求2所述的基因或权利要求3所述的表达载体的宿主细胞。

5.权利要求1所述寨卡病毒抗原的表达纯化方法，将经过DNA分析和蛋白结构分析确认的蛋白序列对应的DNA序列进行合成，并引入Nde I和Xho I酶切位点，以商品化质粒为基础载体，构建寨卡病毒表达载体，所述蛋白序列如SEQ ID NO.1所示，所述DNA序列如SEQ IDNO.2所示，通过亲和层析纯化和蛋白复性，得到寨卡病毒蛋白。

6.含有权利要求1所述的寨卡病毒抗原的生物制品。

7.含有权利要求1所述的寨卡病毒抗原的检测试剂。

8.权利要求1所述的寨卡病毒抗原或权利要求2所述的基因在制备用于检测寨卡病毒的试剂盒中的用途。

9.权利要求1所述的寨卡病毒抗原或权利要求2所述的基因在制备用于检测寨卡病毒的诊断试剂中的用途。

10.权利要求1所述的寨卡病毒抗原或权利要求2所述的基因在制备寨卡病毒疫苗中的用途。