CN107422117B - 一种检测猪乙型脑炎病毒抗体的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测猪乙型脑炎病毒抗体的试剂盒，该试剂盒为化学发光酶免疫试剂盒，包括抗原蛋白，所述抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示或在其N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；抗原蛋白的包被浓度为0.5‑2μg/mL，包被液为0.05mol/L pH9.6 NaCO₃‑NaHCO₃缓冲液。本发明的试剂盒能够用于临床样本中猪JEV NS1抗体的快速检测。与商品化ELISA试剂盒相比，本方法试剂盒较目前应用最为广泛的ELISA试剂盒灵敏度大幅提升，从而降低了漏检率，而且精密度也更高，为我国猪群中乙型脑炎的流行病学调查提供了敏感的检测手段，可用于猪乙型脑炎病毒感染的早期诊断。

Description

一种检测猪乙型脑炎病毒抗体的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种CLEIA检测试剂盒，具体地说是一种检测猪乙型脑炎病毒抗体试剂盒。

背景技术

乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)又称流行性乙型脑炎，日本乙型脑炎，由乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的一种严重的人畜共患虫媒疾病。三带喙库蚊为其主要的传播媒介。该病具有明显的季节性和地理分布，主要分布在东南亚各地区，流行区域有进一步扩大的趋势。乙型脑炎病毒为单股正链RNA病毒，属于黄病毒科黄病毒属。JEV可以感染人和多种动物，人类感染后主要引起中枢神经系统性疾病。猪为该病毒的主要贮藏宿主，在人类感染JEV的过程中，充当着隐性传染源及预警动物的职责。及时监测猪群中JEV的感染状况，能够为人类乙型脑炎防控措施的制定提供相应的参考。

目前没有有效的药物可用于治疗JEV感染的人或者动物。乙型脑炎的防治工作主要是灭蚊，避免蚊虫叮咬和免疫接种。由于控制蚊虫难度较大，疫苗免疫是预防乙型脑炎的主要措施。目前，国际上应用最多的乙脑疫苗为鼠脑纯化灭活疫苗，国内应用的为SA14-14-2乙脑减毒活疫苗。乙脑的临床诊断主要依靠血清学检测。一般的检测方法由于灵敏度差很难达到准确诊断的目的。

发明内容

针对上述不足，本发明提供一种用于检测猪乙型脑炎病毒抗体的试剂盒，其操作简单，灵敏度高，特异性强，稳定性和重复性好，避免漏检，具有良好的应用前景。

本发明提供的一种检测猪乙型脑炎病毒抗体的试剂盒，包括抗原蛋白或抗原蛋白溶液，所述抗原蛋白的氨基酸序列为如下a或b或c：

a.SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

b.在其N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c.SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质。

编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的NS1重组蛋白(SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列)是以pCMV-NS1质粒为模板，PCR扩增猪乙型脑炎病毒(JEV)SA14-14-2非结构蛋白NS1的基因序列，克隆入pGEX-6p-1载体，转化E.coli BL21(DE3)，PCR鉴定并筛选阳性重组菌，SDS-PAGE观察重组菌中目的蛋白的表达情况，质谱鉴定融合表达的目的蛋白，并应用谷胱甘肽琼脂糖凝胶(Glutathione-Sepharose beads 4B)购自美国GE公司对重组蛋白进行纯化得到。

pCMV-NS1质粒的构建方法为：以猪流行性乙型脑炎病毒疫苗株SA14-14-2株为模板，根据NCBI登录的基因组序列设计NS1的引物，上游引物序列：CCGGAATTCGGGACACTGGATGTGCCATTGACA，下游引物序列：CGGGGTACCAGCAGCGACTAGCACCACATAC，下划线为酶切位点。PCR反应条件：94℃2min；98℃10s，55℃30s，68℃45s，共35个循环，68℃7min。PCR产物回收纯化。将回收的目的片段与表达载体pCMV-myc进行双酶切，利用胶回收试剂盒回收酶切产物。之后，将酶切的PCR产物连接于同样酶切的载体上，转化Trans10感受态细胞，测序正确的质粒，即为pCMV-NS1。

本发明的试剂盒中，抗原蛋白的包被浓度为0.5-2μg/ml，优选0.5μg/ml。

本发明试剂盒还包括包被液、酶标二抗、封闭液、化学发光物质、化学发光检测仪和可读性载体；所述可读性载体上记载了利用所述抗原蛋白溶液和所述酶标二抗检测的CLEIA方法。

所述包被液为0.05mol/L pH9.6NaCO₃-NaHCO₃缓冲液。

所述封闭液为5％小牛血清；所述化学发光物质中，Tris-HCl缓冲液最佳pH为8.5，过氧化氢工作浓度为0.25mmol/L，鲁米诺Luminol工作浓度为0.1mmol/L、对碘苯酚PIP工作浓度为0.2mmol/L。

所述CLEIA方法中抗原蛋白的包被条件为4℃包被过夜，血清用NaCO₃-NaHCO₃缓冲液稀释；酶标二抗用0.5％脱脂乳稀释，酶标二抗的稀释度为1:10000。

在检测待测血清时，最佳血清稀释度为1:400。发光底物的最佳反应时间为5min。

本发明试剂盒的最佳封闭条件为37℃30min，血清加入后最佳作用条件为37℃反应45min；加入发光底物后，最佳读取时间是在发光底物反应5min后读数。

根据所述待测样本化学发光值判断待测样本是否感染猪乙型脑炎病毒：若待测样本化学发光值大于等于82538，则待测样本感染或候选感染猪乙型脑炎病毒；若待测样本化学发光值小于62798，则待测样本未感染或候选未感染猪乙型脑炎病毒；两者之间为可疑。

本发明还提供了上述试剂盒在检测或辅助检测待测猪乙型脑炎疫苗是否免疫合格中的应用。

本发明还提供了上述试剂盒在判断灭活疫苗免疫猪群中是否存在乙脑病毒野毒株感染情况中的应用。

本发明还提供了上述试剂盒在在猪乙型脑炎疫苗免疫猪群抗体水平监测中的应用。

本发明提供了猪乙型脑炎病毒NS1蛋白在制备检测猪只感染野毒或灭活疫苗毒试剂盒中的应用，所述NS1蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或其特异性序列。JEV NS1蛋白为病毒的非结构蛋白，仅在病毒增殖时才可以复制表达，在灭活疫苗免疫猪群中不会表达并产生相应的抗体。因此，检测JEV NS1蛋白抗体可以用于区分灭活疫苗免疫猪及野毒感染猪。

本发明NS1重组蛋白的纯度达到150.2472ug/mL。

优选地，本发明间接CLEIA的具体操作程序如下：用0.05mol/L pH9.6NaCO₃-NaHCO₃缓冲液为包被液稀释NS1蛋白至0.5μg/mL，每孔100μL加入聚乙烯板，置4℃过夜；以含0.05％吐温-20的PBS(PBST)为洗涤液洗板4次；每孔加300μL 5％小牛血清，37℃封闭30min，PBST洗4次；每孔加入100μL NaCO₃-NaHCO₃缓冲液稀释为1:400的待检血清，置37℃反应45min，洗板4次；加入100μL 0.5％脱脂乳稀释为1:10000的HRP-山羊抗猪IgG抗体，37℃1h，洗板4次；每孔加入发光液100μL(发光液需现用现配)，其中：Luminol工作浓度为0.1mmol/L、PIP工作浓度为0.2mmol/L；Tris-HCl pH为8.5，过氧化氢工作浓度为0.25mmol/L；室温避光反应5min；用化学发光检测仪测定425nm处的发光值。当检测样本的RLU大于等于82538时，判为阳性；小于62798时，判为阴性；处于两者之间时，判为可疑。

本发明试剂盒便于操作、使用成本低、重复性好，运用该检测试剂盒可检测出血清稀释度达1:25600的猪乙型脑炎抗体，灵敏度比商品化试剂盒(深圳市绿诗源生物技术有限公司生产的猪乙脑病毒JEV快速检测试剂盒(定性ELISA分析法，批号：20150701和20160401)提高近60倍，降低了漏检率，而且精密度也更高，为我国猪群中乙型脑炎的流行病学调查提供了敏感的检测手段，可用于猪乙型脑炎疫苗免疫猪群抗体水平监测以及判断灭活疫苗免疫猪群中是否存在乙脑病毒野毒株感染的情况。本方法结合了抗原抗体的高特异性反应和化学发光的高灵敏度，能够更加准确的检测出血清中的NS1蛋白抗体，为灭活疫苗使用猪群JEV感染检测提供了可靠的手段。

附图说明

图1为JEV NS1基因片段的PCR扩增电泳图，其中泳道1.Trans 2K DNA Marker；2.NS1基因的PCR扩增产物。

图2NS1蛋白重组表达的SDS-PAGE电泳图，1.蛋白Marker；2.未诱导的pGEX-6p-1；3.pGEX-6p-1诱导6h；4.重组菌未诱导；5-6.0.6mmol/L IPTG诱导6h的重组菌裂解上清和沉淀；7-8.0.8mmol/L IPTG诱导6h的重组菌裂解上清和沉淀；9-10.1.0mmol/L IPTG诱导6h的重组菌裂解上清和沉淀。

图3为重组NS1蛋白的Western blot鉴定图，M.蛋白Marker；1.未诱导的pGEX-6p-1空载体；2.IPTG诱导pGEX-6p-1载体6h；3.未诱导重组菌；4.0.8mmol/L IPTG诱导重组菌6h后的裂解沉淀。

图4目的条带的质谱测序图。

图5纯化蛋白的SDS-PAGE图，M.蛋白Marker；1.pGEX-6p-1空载体诱导6h；2.未纯化的重组NS1蛋白；3-4.透析后沉淀；5.流穿液；6-14.纯化蛋白。

图6 CLEIA血清最适稀释度的确定。

图7抗原最适包被条件的确定。

图8为抗原最佳包被液的确定。

图9为封闭液的选择。

图10封闭条件的优化。

图11血清最佳作用时间的确定。

图12二抗最佳稀释度的确定。

图13抗体最佳稀释液的确定。

图14 Luminol和PIP最佳工作浓度的确定。

图15 Tris-HCl pH及过氧化氢最佳工作浓度的确定。

图16发光底物最佳读数时间的确定。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例所用的生化试剂均为市售。

实施例1 pGEX-6P-1-NS1原核表达质粒的构建

1、引物设计与合成

以GenBank中登录的猪乙型脑炎病毒SA14-14-2非结构蛋白NS1的基因序列为模板，利用Prime5.0软件设计特异性引物(表1)。目的片段预期扩增长度为1245bp。引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。

表1猪乙型脑炎病毒NS1序列扩增引物

注：下划线为限制性内切酶识别序列

2、目的基因的扩增

以实验室保存的质粒pCMV-NS1为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系如下：

PCR反应条件：94℃2min；98℃10s，55℃30s，68℃1min，共35个循环，68℃7min。

1.0％琼脂糖凝胶电泳结果显示，获得的基因片段大小约1200bp，与预期目标片段大小一致(图1)。

3、PCR产物的回收与纯化

取50uL PCR产物，加10μL 6×Loading Buffer混匀，进行琼脂糖凝胶电泳。待目的条带充分跑开后，将凝胶取出，在紫外灯下切下含目的基因片段的琼脂糖凝胶，置于1.5mL离心管中。按照Easy Pure Quick Gel Extraction Kit胶回收试剂盒说明书进行片段回收，具体步骤如下：

溶胶：按照100mg凝胶加入100μL膜结合液(Binding Buffer)的比例，加入膜结合液，置60℃金属浴中溶胶。1min摇晃一次，确保胶块全部溶化。

目的条带与吸附柱结合：待溶液温度降至室温，加入吸附柱中静置2min，12000r/min离心1min，弃掉离心下来的液体。将吸附柱重新置于收集管中，再次加入300uL的膜结合液，12000r/min离心1min，弃掉离心下来的液体。

洗涤：将吸附柱重新置于收集管中，加入700uL已经加入乙醇的膜漂洗液(SPWwash buffer)，12000r/min离心2min，弃掉离下来的液体，12000r/min空离2min，尽量除尽残留的洗液。

洗脱：将吸附柱置于一个干净的EP管中，打开吸附柱的盖子，室温干燥10min，防止残留的漂洗液影响后续实验。

在吸附膜中间位置悬空滴加30uL-50uL洗脱缓冲液(elution buffer)，静置2min，12000r/min离心2min，收集DNA溶液于离心管中，-20℃保存备用。

4、目的片段与载体的双酶切

将回收的目的片段与pGEX-6P-1表达载体进行双酶切，50uL酶切反应体系如下：BamHⅠ1.5uL，XholⅠ1.5uL，cutsmart Buffer 5.0uL，回收的PCR产物/pGEX-6P-1表达载体各2.0ug，ddH₂O补至50uL，37℃水浴，过夜。

5、双酶切产物的连接

将酶切产物瞬离，用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，利用胶回收试剂盒回收酶切的PCR产物以及载体。

设10uL连接体系如下：10×T₄Ligase buffer 1μL，载体pGEX-6P-12μL，酶切PCR产物6μL，T₄DNA连接酶1μL，混匀后，置16℃金属浴，连接时间大于6h。

6、转化

取Trans10感受态细胞100μL，冰中解冻至融化。吸取10uL的连接产物加入融化的Trans10感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热激60s，再次冰浴5min；向离心管中加入500uL无抗性的SOC培养基，轻轻混匀，置37℃摇床，200r/min 40min；3000-5000r/min离心5min，弃去大部分上清液，留下大约100uL液体，将沉淀重悬吹打混匀后，均匀的涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基表面，37℃温箱过夜培养，观察菌落的生长状况。

7、重组质粒的鉴定

吸取1mL LB/Amp+培养液于1.5mL灭菌EP管中，用枪头挑取单个生长状况良好的白色菌落置培养液中；37℃，180r/min振荡培养8h。PCR鉴定筛选阳性重组菌。

以菌液为模板，设20uL PCR鉴定体系，如下：2x Taq DNA聚合酶10uL，引物P1和P2各1.0uL，菌液2.0μL，加ddH₂O至20uL

PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃淬火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终末延伸10min；4℃保存。鉴定为阳性的细菌克隆送测序公司测序。

8、质粒中提

将测序正确的阳性克隆菌液扩大培养，37℃180r/min振荡培养20h。按Promega试剂盒的说明书进行质粒提取，具体操作如下：

将菌液分装于灭菌的100mL离心管中，8000r/min离心3min，弃上清；加入6mL细胞悬浮液(CRA)重悬沉淀，剧烈震荡后加入6mL细胞裂解液(CLA)，轻轻旋转离心管，静置3min；待液体由浑浊变澄清后，加入10mL中和溶液(NSB)，轻柔旋转离心管，使油状物在分层处消失，12000r/min离心15min；按蓝色在上白色在下的顺序将吸附柱组装于真空泵上，将离心后的上清轻轻倒入蓝柱中，防止沉淀重悬，打开真空泵，抽吸干净后弃去蓝管。在白管中加入5mL内毒素清除液(ETR)，打开真空泵，抽吸干净。加入20mL含有异丙醇的柱清洗液(column wash)，抽吸30min左右，尽量抽干；在吸附膜上加500μL Nuclease-Free Water，浸润整张膜，静置2min，抽真空，将质粒抽提到1.5mL EP管中，12000r/min离心5min，除去杂质，测量浓度，将中提质粒送公司测序。测序正确的质粒命名为pGEX-6P-1-NS1。

实施例2重组蛋白的原核表达与纯化

1、重组表达菌的转化

感受态细胞BL21(DE3)2支，冰中解冻至融化。将pGEX-6P-1-NS1和空载体pGEX-6p-1各2uL分别加到BL21(DE3)中，用移液枪轻轻吹打混匀，冰浴30min；42℃热激60s，再次冰浴5min，取30uL均匀涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基表面。37℃过夜培养，观察菌落生长状况。

2、目的蛋白的诱导表达

分别挑取含重组质粒pGEX-6P-1-NS1和空载体pGEX-6p-1的单菌落，转接于1mL的Amp/LB培养基中，37℃180r/min过夜；按1：50的比例接种到5mL的Amp/LB液体培养基中，37℃180r/min振荡培养至生长对数期，即OD600介于0.4与0.6之间；分别加入终浓度为0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L的IPTG，于37℃180r/min摇床中诱导表达6h。

3、SDS-PAGE

收集诱导后菌液，8000r/min离心10min，弃上清；沉淀用适量PBS重悬，吹打混匀后在4℃冰浴条件下间断超声裂解，条件为：超声1.5s，间隔8.5s，振幅30％，至菌体相对清亮。4℃12000r/min离心10min，吸取100uL上清，沉淀用100uL PBS重悬，分别加入25uL 5×SDS上样缓冲液，煮沸8min。配置10％聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE。从图2可以看出，IPTG诱导重组菌在约70kD处出现一条蛋白带，与预期的重组NS1蛋白的分子量大小基本一致，且该蛋白主要存在于裂解后的沉淀中。说明，重组蛋白以包涵体形式表达，IPTG最佳工作浓度为0.8mmol/L。

聚丙烯凝胶的配制：清水洗净玻璃板，吹干后，夹紧两块板，加入1mL 1.0％的琼脂糖凝胶封底。按照操作说明配制10％分离胶，立即加到两块玻璃板中间(约7mL)，并用70％的乙醇压实。待分离胶凝固后，弃去酒精，并用滤纸吸干。配制5％的浓缩胶，加到玻璃板中间，约3mL。根据实验要求插上合适的梳子，室温静置15min，待浓缩胶充分凝固后，取下胶于4℃保存。

点样及电泳：将制备好的10％聚丙烯酰胺凝胶夹入电泳槽中，轻轻拔出梳子，将预先处理好的样品及蛋白Marker加入胶孔中，每孔上样量为20μL。电泳程序为：60V 30min；110V 90min。

考马斯亮蓝染色：电泳结束后，取下凝胶用蒸馏水轻轻冲洗，置考马斯亮蓝染液中。置摇床中浸泡染色40-60min，置蒸馏水中脱色，更换蒸馏水直至有清晰的条带出现。

Western blotting：电泳结束后，根据凝胶大小裁剪NC膜。NC膜置于甲醇中浸泡30s左右，放于转膜液中。将凝胶取下，转膜时从负极到正极，按照以下顺序放置：海绵垫、滤纸、聚丙烯凝胶、NC膜、滤纸、海绵垫，用滚轮轻轻赶走气泡，安装完毕后电泳槽置冰浴进行转膜，条件为100V 2h。

封闭：转膜结束后，取出NC膜，PBST洗涤后，用5％脱脂乳37℃封闭2h。

一抗孵育：根据目的蛋白大小切割NC膜，一抗稀释液与GST标签抗体按1:5000倍稀释，37℃孵育2h，NC膜用PBST洗涤，3min/次，洗涤3次，10min/次，洗涤2次。

二抗孵育：洗涤完毕后，将NC膜置于1:10000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG中，37℃摇床孵育1h，洗涤方法同上。

曝光显色：用吸水纸吸干膜上的PBST，将化学发光试剂A和B等体积混合，均匀滴加在NC膜上，避光反应4min。用吸水纸稍微吸一下多余的曝光液，置曝光仪中显色。

结果如下(图3)。图中，70kD左右的目的条带颜色较浅。进一步将目的条带进行质谱测序。测序分析结果见图4。证明，大小为70kD的条带确为NS1重组蛋白。

4、重组NS1蛋白的纯化

包涵体的洗涤：加入终浓度为0.8mM的IPTG，37℃180r/min条件下诱导表达400mL重组菌。收集菌体于100mL离心管中，12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用无菌PBS洗1次，再用10mL PBS重悬沉淀；将其置于冰上，用大探头超声裂解细菌，条件如下：工作2s，间歇8s，直至液体澄清；4℃12000r/min离心15min；沉淀用10mL PBS重悬，加入0.2mL 20％SKL，剧烈震荡后置4℃冰箱保存。

透析复性：将4℃过夜的10mL液体10000r/min离心15min，取上清，加入20％PEG4000至终浓度为0.2％，同时加入50mmol/L的氧化性谷胱甘肽至终浓度为1mmol/L，加入100mmol/L还原性谷胱甘肽至终浓度为2mmol/L，4℃静置2h。

处理透析膜：2％NaHCO3，1mM EDTA-Na₂(pH8.0)溶液煮沸10min；再用1mM EDTA-Na₂(pH8.0)溶液煮沸10min，蒸馏水冲洗干净。

透析：将纯化的蛋白加入透析膜，两端扎紧，放到4℃PBS溶液中进行透析，磁力搅拌器不断搅拌，12h换一次PBS溶液，透析48h。

还原性谷胱甘肽洗脱：将透析液10000r/min离心10min，收集上清，加入适量Glutathione Sepharose，置4℃混合器中过夜，使其充分结合。将混合液加到过滤柱，收集1mL流穿液。待液体流完后，beads用PBS洗涤，加入适量的GSH洗脱液，于4℃摇床充分混合30min。收集洗脱液，保存于-80℃冰箱。

Bradford法测定蛋白浓度：完全溶解蛋白标准品，取10uL稀释至100uL，使其终浓度为0.5μg/mL。按照下表配置不同浓度的蛋白标准品。

表2蛋白标准品的配置

将不同浓度的标准品和样品加到96孔板中，每孔20uL，每种浓度做一个重复；各孔加入200uL G250染色液，室温放置5min；酶标仪测定562nm处的吸光值。根据标准曲线计算样品蛋白浓度。重组蛋白经GSH洗脱，收集流穿液以及洗脱液纯化后进行SDS-PAGE。结果如图5。如图所示，纯化后的重组蛋白在70kD处形成单一的蛋白条带，无明显杂带。表明，获得的重组蛋白纯度较高。Bradford法测定纯化蛋白的浓度为150.2472μg/mL。

实施例3化学发光酶免疫方法(CLEIA)的建立及条件优化

1、基本操作步骤

用0.05mol/L pH9.6的NaCO₃-NaHCO₃缓冲液稀释重组NS1蛋白至工作浓度，每孔100μL包被聚乙烯板，37℃1h；用洗板机以含0.05％吐温-20的PBS(PBST)为洗涤液洗板4次；每孔加300μL 5％小牛血清，37℃封闭1h，PBST洗4次；每孔加入100μL稀释后的待检血清，37℃1h，洗板4次；加入1:10000稀释的HRP标记的山羊抗猪IgG抗体，每孔100μL，37℃1h，洗板4次；加入发光液，A液与B液等体积混合(现配现用)，每孔100μL，室温避光反应3min；用化学发光检测仪测定425nm处的发光强度(relative light units，RLU)。

2、血清最适稀释度的确定

将阴、阳性血清分别进行1:40、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600稀释，按照前述步骤，在化学发光检测仪上读取化学发光值，计算P/N值，确定血清最适稀释倍数。

结果如图6所示。当阴、阳性血清稀释度为1:400时，P/N值最大。

3、抗原最佳包被浓度的确定

用方阵滴定法确定抗原最佳包被浓度。将抗原稀释为0.25μg/mL，0.5μg/mL和1μg/mL、2μg/mL，包被化学发光板，每孔100μL；血清稀释度分别为1:400、1:800、1:1600、1:3200；按前述操作步骤，在化学发光检测仪上读取化学发光值，确定抗原最佳包被浓度。

方阵法确定抗原最适包被浓度。结果如表3。当以0.5μg/mL包被抗原时，P/N值相对较高。

表3抗原最适包被浓度的确定

4、抗原最佳包被条件的确定

以0.05mol/L pH9.6的NaCO₃-NaHCO₃缓冲液为包被液，加入最佳包被浓度的抗原后，将化学发光板分别置4℃过夜及37℃1h；其他条件相同，比较RLU值和P/N，确定抗原最佳包被条件。将0.5ug/mL抗原分别在4℃过夜或37℃包被1h，结果如图7所示。4℃过夜包被时阳性血清发光值和P/N值均较大。

5、包被液的选择

分别以0.05mol/L pH9.6的NaCO₃-NaHCO₃缓冲液(CBS)、0.01mol/L pH7.4的PBS、0.05mol/L pH8.3的Tris-HCl缓冲液为包被液，稀释抗原至最佳包被浓度。在其他条件相同的情况下，比较RLU值和P/N，确定最佳包被液。结果如图8所示。可以看出，以0.05mol/LpH9.6NaCO3-NaHCO₃缓冲液为包被液时，P/N值最大。

6、最适封闭液的确定

分别以1％明胶、10％马血清、5％小牛血清、1％BSA+4％蔗糖、5％脱脂乳为封闭液，比较发光值RLU和P/N，确定最适封闭液。结果如图9显示，以5％小牛血清为封闭液时，RLU和P/N值均最大。

7、封闭时间的确定

封闭时，将化学发光板置37℃分别作用30min、1h、2h，比较发光值RLU和P/N，确定最适封闭时间。结果如图10。封闭条件为37℃30min时，P/N值最大。

8、血清最适工作时间的确定

稀释阳性血清，置37℃，分别作用30min、45min、60min，比较发光值RLU和P/N，确定血清最适工作时间。结果如图11所示。由图可见，血清加入后，置37℃反应45min时，阳性血清发光值及P/N值最大。

9、二抗最佳工作浓度的确定

将二抗稀释为1:4000、1:8000、1:10000、1:12000，在化学发光检测仪上读取化学发光值，计算P/N值，确定二抗最佳工作浓度。CLEIA结果如图12，当二抗稀释度为1:10000时，P/N值最大。

10、抗体最适稀释液的确定

采用方阵滴定法：血清用NaCO₃-NaHCO₃缓冲液(CBS)和5％小牛血清进行稀释；二抗用NaCO₃-NaHCO₃缓冲液(CBS)、5％小牛血清和0.5％脱脂乳进行稀释，检测RLU，确定抗体最适稀释液。结果如图13，当阴、阳性血清用CBS稀释，二抗用0.5％脱脂乳稀释时，P/N值最大。

11、Luminol和PIP最佳工作浓度的确定

采用方阵滴定法：将发光液中Luminol分别稀释为0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L；PIP分别稀释为0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L，检测RLU，确定Luminol和PIP最佳工作浓度。

分析结果如图14。由图可见，当Luminol工作浓度为0.1mmol/L、PIP工作浓度为0.2mmol/L时，P/N值最大。

12、H₂O₂最佳工作浓度的确定

将H₂O₂分别稀释为0.25mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、4mmol/L，检测RLU，确定H₂O₂的最佳工作浓度。

13、Tris-HCl缓冲液最适pH值的确定

检测Tris-HCl缓冲液pH值分别为8.1、8.3、8.5、8.8时的发光强度，根据RLU，确定Tris-HCl缓冲液的最适工作pH值。结果如图15所示。可见，当Tris-HCl pH为8.5，过氧化氢工作浓度为0.25mmol/L时，P/N值最大。

14、发光底物最佳反应时间的确定

在已确定的最佳条件下，于加入发光底物后1min、3min、5min、7min、10min、15min、25min开始读数，测定RLU，以发光值最高时的反应时间为最佳反应时间。由图16可见，加入发光底物后5min读数，P/N值最大。

15、间接CLEIA阴阳性临界值的确定

选择商品化试剂盒检测为JEV抗体阴性的血清21份，用间接CLEIA方法进行检测。计算血清样本发光值的平均值

和标准差(SD)，确定阴阳性临界值。

收集经商品化试剂盒检测为JEV抗体阴性的血清样本21份，用建立的CLEIA进行检测，RLU值如表4所示。

表4间接CLEIA检测阴性血清样本RLU值

21份血清样本发光值的平均值

为23318，标准偏差(SD)为19740。根据统计学原理，大于等于

定为阳性，小于

定为阴性，两者之间定为可疑。

实施例4本发明间接CLEIA试剂盒特异性与敏感性实验

本发明以原核表达并纯化的猪乙型脑炎NS1蛋白(实施例2制得)为抗原，建立了用于JEV抗体检测的间接CLEIA方法以及基于此方法的检测猪乙型脑炎病毒抗体的试剂盒。通过一系列工作条件优化，间接CLEIA的具体操作程序如下：用0.05mol/L pH9.6NaCO₃-NaHCO₃缓冲液为包被液稀释NS1蛋白至0.5μg/mL，每孔100μL加入聚乙烯板，置4℃过夜；以含0.05％吐温-20的PBS(PBST)为洗涤液洗板4次；每孔加300μL 5％小牛血清，37℃封闭30min，PBST洗4次；每孔加入100μL NaCO₃-NaHCO₃缓冲液稀释为1:400的待检血清，置37℃反应45min，洗板4次；加入100μL 0.5％脱脂乳稀释为1:10000的HRP-山羊抗猪IgG抗体，37℃1h，洗板4次；每孔加入发光液100μL，其中：Luminol工作浓度为0.1mmol/L、PIP工作浓度为0.2mmol/L；Tris-HCl pH为8.5，过氧化氢工作浓度为0.25mmol/L；室温避光反应5min；用化学发光检测仪测定425nm处的发光值。当检测样本的RLU大于等于82538时，判为阳性；小于62798时，判为阴性；处于两者之间时，判为可疑。

1、间接CLEIA的特异性实验

用包被好的化学发光板，同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、JEV阳性血清，检测结果如表5。

PRRSV、CSFV、PRV阳性血清的CLEIA检测结果均为阴性。表明，所建立的间接CLEIA具有较好的特异性。

表5间接CLEIA的检测特异性验证

2、间接CLEIA的敏感性实验

将5份已知JEV感染的阳性血清进行倍比稀释，用商品化JEV抗体检测试剂盒(深圳市绿诗源生物技术有限公司生产的猪乙脑病毒JEV快速检测试剂盒(定性ELISA分析法)批号：20150701和20160401)和间接CLEIA同时进行检测，结果如下表(表6)。

用商品化试剂盒检测5份阳性血清，血清最高稀释度为1:400；而用间接CLEIA检测该5份血清的最高稀释度可达1:25600。表明本发明所建立的间接CLEIA能够检测更低水平的抗体，临床检测敏感性更高。

表6间接CLEIA敏感性实验

3、间接CLEIA的重复性实验

3.1板内重复性实验

用同一批次纯化的NS1重组蛋白包被化学发光板，在同一块板上检测已知背景的5份血清样本，且每块板做5个样本重复，结果见表7。5份血清检测结果的板内变异系数均小于10％。说明本发明的CLEIA试剂盒板内重复性较好。

表7 CLEIA板内重复性实验结果

3.2板间重复性实验

用NS1重组蛋白包被3块化学发光板，检测已知背景的5份血清，每份血清做2个板间重复，结果见表8。5份血清检测结果的板间变异系数小于7％。表明，该CLEIA的板间重复性较好。

表8 CLEIA板间重复性实验结果

本研究建立的间接CLEIA特异性高，重复性好，检测敏感性较商品化试剂盒提高近60倍，降低了漏检率，而且精密度也更高，为我国猪群中乙型脑炎的流行病学调查提供了敏感的检测手段，可用于猪乙型脑炎疫苗免疫猪群抗体水平监测以及判断灭活疫苗免疫猪群中是否存在乙脑病毒野毒株感染的情况。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 一种检测猪乙型脑炎病毒抗体的试剂盒

<130> KHP171112369.1

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1245

<212> DNA

<213> NS1

<400> 1

gacactggat gtgccattga catcacaaga aaagagatga gatgtggaag tggcatcttc 60

gtgcacaacg acgtggaagc ctgggtggat aggtataaat atttgccaga aacgcccaga 120

tccctagcga agatcgtcca caaagcgcac aaggaaggcg tgtgcggagt cagatctgtc 180

actagactgg agcaccaaat gtgggaagcc gtaagggacg aattgaacgt cctgctcaaa 240

gagaatgcag tggacctcag tgtggttgtg aacaagcccg tgggaagata tcgctcagcc 300

cctaaacgcc tatccatgac gcaagagaag tttgaaatgg gctggaaagc atggggaaaa 360

agcatcctct ttgccccgga attggctaac tccacatttg tcgtagatgg acctgagaca 420

aaggaatgcc ctgatgagca cagagcttgg aacagcatgc aaatcgaaga cttcggcttt 480

ggcatcacat caacccgtgt gtggctgaaa attagagagg agagcactga cgagtgtgat 540

ggagcgatca taggcacggc tgtcaaagga catgtggcag tccatagtga cttgtcgtac 600

tggattgaga gtcgctacaa cgacacatgg aaacttgaga gggcagtctt tggagaggtc 660

aaatcttgca cttggccaga gacacacacc ctttggggag atgatgttga ggaaagtgaa 720

ctcatcattc cgcacaccat agccggacca aaaagcaagc acaatcggag ggaagggtat 780

aagacacaaa accagggacc ttgggatgag aatggcatag tcttggactt tgattattgc 840

ccagggacaa aagtcaccat tacagaggat tgtagcaaga gaggcccttc ggtcagaacc 900

actactgaca gtggaaagtt gatcactgac tggtgctgtc gcagttgctc ccttccgccc 960

ctacgattcc ggacagaaaa tggctgctgg tacggaatgg aaatcagacc tgttatgcat 1020

gatgaaacaa cactcgtcag atcacaggtt catgctttca aaggtgaaat ggttgaccct 1080

tttcagctgg gccttctggt gatgtttctg gccacccagg aagtccttcg caagaggtgg 1140

acggccagat tgaccattcc tgcggttttg ggggtcctac ttgtgctgat gcttgggggt 1200

atcacttaca ctgatttggc gaggtatgtg gtgctagtcg ctgct 1245

<210> 2

<211> 415

<212> PRT

<213> NS1重组蛋白

<400> 2

Asp Thr Gly Cys Ala Ile Asp Ile Thr Arg Lys Glu Met Arg Cys Gly

1 5 10 15

Ser Gly Ile Phe Val His Asn Asp Val Glu Ala Trp Val Asp Arg Tyr

20 25 30

Lys Tyr Leu Pro Glu Thr Pro Arg Ser Leu Ala Lys Ile Val His Lys

35 40 45

Ala His Lys Glu Gly Val Cys Gly Val Arg Ser Val Thr Arg Leu Glu

50 55 60

His Gln Met Trp Glu Ala Val Arg Asp Glu Leu Asn Val Leu Leu Lys

65 70 75 80

Glu Asn Ala Val Asp Leu Ser Val Val Val Asn Lys Pro Val Gly Arg

85 90 95

Tyr Arg Ser Ala Pro Lys Arg Leu Ser Met Thr Gln Glu Lys Phe Glu

100 105 110

Met Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys Ser Ile Leu Phe Ala Pro Glu Leu

115 120 125

Ala Asn Ser Thr Phe Val Val Asp Gly Pro Glu Thr Lys Glu Cys Pro

130 135 140

Asp Glu His Arg Ala Trp Asn Ser Met Gln Ile Glu Asp Phe Gly Phe

145 150 155 160

Gly Ile Thr Ser Thr Arg Val Trp Leu Lys Ile Arg Glu Glu Ser Thr

165 170 175

Asp Glu Cys Asp Gly Ala Ile Ile Gly Thr Ala Val Lys Gly His Val

180 185 190

Ala Val His Ser Asp Leu Ser Tyr Trp Ile Glu Ser Arg Tyr Asn Asp

195 200 205

Thr Trp Lys Leu Glu Arg Ala Val Phe Gly Glu Val Lys Ser Cys Thr

210 215 220

Trp Pro Glu Thr His Thr Leu Trp Gly Asp Asp Val Glu Glu Ser Glu

225 230 235 240

Leu Ile Ile Pro His Thr Ile Ala Gly Pro Lys Ser Lys His Asn Arg

245 250 255

Arg Glu Gly Tyr Lys Thr Gln Asn Gln Gly Pro Trp Asp Glu Asn Gly

260 265 270

Ile Val Leu Asp Phe Asp Tyr Cys Pro Gly Thr Lys Val Thr Ile Thr

275 280 285

Glu Asp Cys Ser Lys Arg Gly Pro Ser Val Arg Thr Thr Thr Asp Ser

290 295 300

Gly Lys Leu Ile Thr Asp Trp Cys Cys Arg Ser Cys Ser Leu Pro Pro

305 310 315 320

Leu Arg Phe Arg Thr Glu Asn Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg

325 330 335

Pro Val Met His Asp Glu Thr Thr Leu Val Arg Ser Gln Val His Ala

340 345 350

Phe Lys Gly Glu Met Val Asp Pro Phe Gln Leu Gly Leu Leu Val Met

355 360 365

Phe Leu Ala Thr Gln Glu Val Leu Arg Lys Arg Trp Thr Ala Arg Leu

370 375 380

Thr Ile Pro Ala Val Leu Gly Val Leu Leu Val Leu Met Leu Gly Gly

385 390 395 400

Ile Thr Tyr Thr Asp Leu Ala Arg Tyr Val Val Leu Val Ala Ala

405 410 415

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccggaattcg ggacactgga tgtgccattg aca 33

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cggggtacca gcagcgacta gcaccacata c 31

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgcggatccg acactggatg tgccattgac 30

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccgctcgaga gcagcgacta gcaccacata c 31

Claims (3)

1.一种试剂盒在非疾病诊断目的的检测猪乙型脑炎病毒抗体中的应用，其特征在于，

所述的试剂盒包括抗原蛋白或抗原蛋白溶液，所述抗原蛋白的包被浓度为0.5μg/mL，所述抗原蛋白为在

SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

其中，SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白是以pCMV-NS1质粒为模板，PCR扩增猪乙型脑炎病毒SA14-14-2非结构蛋白NS1的基因序列，克隆入pGEX-6p-1载体，转化E.coliBL21(DE3)，PCR鉴定并筛选阳性重组菌，SDS-PAGE观察重组菌中目的蛋白的表达情况，质谱鉴定融合表达的目的蛋白，并应用谷胱甘肽琼脂糖凝胶Glutathione-Sepharose beads 4B对重组蛋白进行纯化得到的NS1重组蛋白；具体纯化步骤为：

包涵体的洗涤：加入终浓度为0.8mM的IPTG，37℃180r/min条件下诱导表达400mL重组菌；收集菌体于100mL离心管中，12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用无菌PBS洗1次，再用10mL PBS重悬沉淀；将其置于冰上，用大探头超声裂解细菌，条件如下：工作2s，间歇8s，直至液体澄清；4℃12000r/min离心15min；沉淀用10mL PBS重悬，加入0.2mL 20％SKL，剧烈震荡后置4℃冰箱保存；

透析复性：将4℃过夜的10mL液体10000r/min离心15min，取上清，加入20％PEG 4000至终浓度为0.2％，同时加入50mmol/L的氧化性谷胱甘肽至终浓度为1mmol/L，加入100mmol/L还原性谷胱甘肽至终浓度为2mmol/L，4℃静置2h；

处理透析膜：2％NaHCO₃，1mM pH8.0的EDTA-Na₂溶液煮沸10min；再用1mM pH8.0的EDTA-Na₂溶液煮沸10min，蒸馏水冲洗干净；

透析：将纯化的蛋白加入透析膜，两端扎紧，放到4℃PBS溶液中进行透析，磁力搅拌器不断搅拌，12h换一次PBS溶液，透析48h；

还原性谷胱甘肽洗脱：将透析液10000r/min离心10min，收集上清，加入适量Glutathione Sepharose，置4℃混合器中过夜，使其充分结合；将混合液加到过滤柱，收集1mL流穿液，待液体流完后，beads用PBS洗涤，加入适量的GSH洗脱液，于4℃摇床充分混合30min，收集洗脱液，得到纯化的NS1重组蛋白；

所述试剂盒还包括包被液、酶标二抗、封闭液、化学发光物质、化学发光检测仪和可读性载体；

所述包被液为0.05mol/L、pH9.6的NaCO₃-NaHCO₃缓冲液；

所述封闭液为5％小牛血清；

化学发光物质中鲁米诺Luminol工作浓度为0.1mmol/L、对碘苯酚PIP工作浓度为0.2mmol/L，过氧化氢工作浓度为0.25mmol/L，Tris-HClpH为8.5；

所述可读性载体上记载了利用所述抗原蛋白溶液和所述酶标二抗检测的CLEIA方法；

所述CLEIA方法中抗原蛋白的包被条件为4℃包被过夜，血清用NaCO₃-NaHCO₃缓冲液稀释，稀释度为1:400；发光底物最佳反应时间为5min；酶标二抗用0.5％脱脂乳稀释，酶标二抗的稀释度为1:10000；

所述试剂盒的封闭条件为37℃30min；

血清加入后作用条件为37℃反应45min；根据待测样本化学发光值判断待测样本是否感染猪乙型脑炎病毒：若待测样本化学发光值大于等于82538，则待测样本感染或候选感染猪乙型脑炎病毒；若待测样本化学发光值小于62798，则待测样本未感染或候选未感染猪乙型脑炎病毒；两者之间为可疑。

2.权利要求1所述的应用，其特征在于，用于检测或辅助检测待测猪乙型脑炎疫苗是否免疫合格；

所述试剂盒中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列是如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列所表达的非结构蛋白NS1；

由于该蛋白为病毒的非结构蛋白，仅在病毒增殖时才可以复制表达，在灭活疫苗免疫猪群中不会表达并产生相应的抗体；

从而，猪乙型脑炎病毒NS1蛋白抗体的检出可以用于区分灭活疫苗免疫猪及野毒感染猪。

3.权利要求1所述的应用，其特征在于，可用于猪乙型脑炎疫苗免疫猪群的抗体水平监测。

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